LABORATORIO DE BACTERIOLOGIA MDICA 2010.

TINCIN DE GRAM
OBJETIVO: Clasificar a las bacterias en Gram positivas o en Gram negativas.
La tincin de Gram es uno de los mtodos de tincin ms importantes en el laboratorio bacteriolgico y con el
que el estudiante debe estar perfectamente familiarizado. Su utilidad prctica es indiscutible y en el trabajo
microscpico de rutina del Laboratorio es una tcnica cotidiana ya que adems de clasificar a las bacterias en
Gram positivas o en Gram negativas se puede observar bien: la morfologa celular bacteriana ( cocos, bacilos)
y la agrupacin de las bacterias (cadenas, racimos, ttradas).
FUNDAMENTO BIOQUMICO: Las capas de la envoltura celular que se ubican entre la membrana
citoplsmica y la cpsula se conocen colectivamente como pared celular; en las bacterias Gram positivas est
constituida principalmente por peptidoglicana que constituye del 40 al 80 % del peso seco de la pared y por
cidos teicoicos; en las Gram negativas, la pared celular incluye capas de la peptidoglicana con 5-10% del
peso, lipoprotenas, lipopolisacridos y la membrana externa.
La peptidoglicana es la responsable de la rigidez y de la forma que presentan las bacterias y
qumicamente es muy semejante tanto en las Gram negativas como de las Gram positivas, esta compuesto de
dos derivados de carbohidrato, la N-acetilglucosamina y el cido N-acetilmuramnico, as como de un pequeo
grupo de aminocidos que constan fundamentalmente de L-alanina, D-alanina, D-cido glutmico y ya sea
lisina o cido diaminopimlico.
Para explicar el fundamento de la tincin de Gram se han propuesto las teoras qumica y la de la
permeabilidad de la pared celular. Los constituyentes protoplasmticos de las clulas Gram positivas y Gram
negativas se combinan con el cristal violeta por un enlace inico entre sus grupos cidos y los grupos bsicos
del colorante. El yodo en solucin acuosa entra a la clula y reacciona con el colorante, formando un complejo
insoluble al agua y poco soluble en alcohol. En la decoloracin, el alcohol al 95% deshidrata a las bacterias
Gram positivas que poseen una pared celular muy gruesa, dando como resultado el cierre de los poros de la
pared impidiendo la salida del complejo de cristal violeta-yodo insoluble, eliminando nicamente el colorante
que qued fuera de la clula. En las bacterias Gram negativas, el alcohol penetra en la capa externa que es
rica en lpidos sin que la capa de peptidoglicana evite el paso del solvente, permitiendo de este modo la
eliminacin del complejo cristal violeta-yodo insoluble.
La reaccin de Gram no est relacionada directamente con la qumica de la pared celular bacteriana
puesto que las levaduras, que tienen una gruesa pared celular de una composicin qumica totalmente
diferente tambin son organismos Gram positivos. En consecuencia, no son los constituyentes qumicos de la
pared celular sino la estructura fsica de sta, la que confiere la caracterstica de ser Gram positivo.
PREPARACIN DE LOS REACTIVOS EMPLEADOS EN LA TCNICA:
COLORANTE PRIMARIO: Cristal violeta
Cristal violeta
20g
Etanol al 95%
200 mL
Oxalato de amonio
8g
Agua destilada
800 mL
Disolver el cristal violeta en el alcohol. Disolver el oxalato en una cantidad de agua. Mezclar las dos soluciones
y aforar con agua destilada a 1,000 mL. Dejar reposar durante 24 horas, filtrar y colocar en un frasco mbar
con tapn de rosca. Almacenar a temperatura ambiente.
MORDENTE: lugol
Solucin concentrada
Iodo
5g
Ioduro de potasio
10 g
Agua destilada
100 mL
Disolver el iodo en 20 mL de agua. Disolver el ioduro en 20 mL de agua. Mezclar las dos soluciones y aforar a
100 mL. Colocar en un frasco mbar con tapn de rosca. Almacenar a temperatura ambiente.
Solucin de trabajo
Solucin concentrada 1 volumen
Agua destilada
4 volmenes
Mezclar las dos soluciones y aforar a 100 mL. Colocar en un frasco mbar con tapn de rosca. Almacenar a
temperatura ambiente.

Dra en C Graciela Castro Escarpulli/Dra en C Ma. Guadalupe Aguilera Arreola

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DECOLORANTE: Alcohol etlico al 95%

Colocar en alcohol en un frasco mbar con tapn de rosca. Almacenar a temperatura ambiente.
COLORANTE SECUNDARIO: Safranina
Safranina
0.5 g
Agua destilada.
100.0 mL
Disolver la safranina en el agua. Colocar en colorante en un frasco mbar con tapn de rosca. Almacenar a
temperatura ambiente.
MTODO DE COLORACION:
1. Cubrir el frote con cristal violeta y dejarlo actuar durante un minuto. Escurrir el colorante y lavar con un
chorro suave de agua.
2. Cubrir el frote con la solucin de lugol durante un minuto y enjuagar con un chorro suave de agua.
3. Colocar el frote en forma vertical y decolorar aadiendo gota a gota el alcohol durante 45 a 60 segundos.
4. Cubrir el frote con safranina y dejarla actuar durante un minuto. Escurrir el colorante y lavar con un chorro
suave de agua. Dejar secar al aire.
Esta tcnica de coloracin tiene algunas variantes en cuanto a la solucin para la decoloracin en
donde se puede utilizar una mezcla volumen a volumen de alcohol-acetona, este es un decolorante mucho
ms rpido que el alcohol etlico. La decoloracin rpida puede ser desventajosa en ciertas bacterias o cuando
los microorganismos escasean en el frote, o bien en manos de tcnicos inexpertos.
El uso de otro colorante de contraste, con el propsito de lograr una mejor diferenciacin, como la
carbolfucsina, (empleada como colorante primario en la tincin de Ziehl-Neelsen) es de gran utilidad para
contrastar a las bacterias Gram negativas que se tien dbilmente con la safranina como es el caso del gnero
Campylobacter, Brucella y Helicobacter. El rojo neutro, (un gramo de rojo neutro, 2 mL de cido actico al 1% y
1000 mL de agua destilada), es ventajoso para teir microorganismos intracelulares y no enmascara los Gram
positivos dbiles. Sin embargo, el color que deja este colorante es ligeramente caf rojizo, por lo que no resalta
tanto como la carbolfucsina.
LECTURA:
La lectura del frote se hace al microscopio, utilizando el objetivo de inmersin. Se observa el color de las
clulas anotando el color que tienen estas (MORADO O ROJO), su forma: BACILOS O COCOS y agrupacin:
aisladas, en pares, en cadenas, en racimo o en ttradas.
INTERPRETACIN:
COLOR DE LA CLULA
MORADO
ROJA

GRAM
POSITIVO
NEGATIVO

NOTA: La edad del cultivo a partir del cual se hace el frote es determinante, ya que en cultivos viejos, las
enzimas autocatalticas atacan la pared celular de las bacterias Gram positivas lo cual las hace teirse como
Gram negativas.
BIBLIOGRAFA:
1.- Baron EJ and Finegold SM. 1990. Bailey & Scott's Diagnostic microbiology, 8 th ed. the C.V Mosby Co,. St.
Louis, Missouri, U.S.A.
2.- Barrow GI and Feltham RKA. 1993. Cowan an Steels Manual for the identification of medical bacteria. 3rd
Ed. Cambridge University Press. p214-218

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TINCIN DE ZIEHL-NEELSEN
OBJETIVO: Identificar bacterias cido-alcohol resistentes.
FUNDAMENTO BIOQUMICO: Los gneros Mycobacterium y Nocardia son bacterias que cuando se tien con
colorantes como la carbolfucsina son resistentes a la decoloracin con una solucin alcohol-cido por lo que se
les conoce como Bacilos cido-Alcohol Resistentes (BAAR).
Esta tcnica se basa en que el alto contenido de cidos grasos constituidos en ceras, presentes en la
estructura de algunos gneros bacterianos interviene en la coloracin, ya que al calentar el frote con el
colorante primario (fucsina fenicada) hasta la emisin de vapores, favorece la fusin de las ceras, aumentando
as la cintica de las molculas, lo cual permite la penetracin del colorante a las clulas, y al enfriar, stos
solidifican, evitando as la salida del colorante.
Otro aspecto importante de la mezcla fucsina-fenol es su solubilidad en los lpidos bacterianos, lo cual
permite su permanencia en el interior de las clulas.
PREPARACIN DE LOS REACTIVOS EMPLEADOS EN LA TCNICA:
COLORANTE PRIMARIO: Carbolfucsina
Solucin concentrada
Fucsina bsica
15g
Etanol al 95%
250 mL
Fenol
85 g
Agua destilada
1,200 mL
Disolver la fucsina en el etanol, disolver el fenol en el agua, mezclar el fenol y la fucsina. Filtrar y colocar en un
frasco mbar con tapn de rosca. Almacenar a temperatura ambiente.
Solucin de trabajo
Solucin concentrada 1 volumen
Agua destilada 10-20 volmenes
Mezclar y colocar en un frasco mbar con tapn de rosca. Almacenar a temperatura ambiente.
DECOLORANTE: Alcohol cido
Acido clorhdrico concentrado 3 mL
Etanol al 95%
97 mL
Agregar el cido al etanol, mezclar y colocar en alcohol en un frasco mbar con tapn de rosca. Almacenar a
temperatura ambiente.
COLORANTE SECUNDARIO: Azul de metileno de Loeffler
Solucin concentrada
Azul de metileno
1 g
Etanol al 95%
100 mL
Disolver el colorante con el alcohol, colocar la solucin en un frasco mbar con tapn de rosca. Almacenar a
temperatura ambiente.
Solucin de trabajo
Solucin concentrada
30 mL
Hidrxido de potasio al 1% 1 mL
Agua destilada
99 mL
Juntar el hidrxido con el agua, agregar el colorante, mezclar y colocar la solucin en un frasco con tapn de
rosca. Almacenar a temperatura ambiente.
MTODO DE COLORACIN:
1.-Cubrir el frote con la carbolfucsina y calentar a emisin de vapores durante 5 minutos, cuidando que no se
seque el colorante. Escurrir el colorante y lavar con un chorro suave de agua.
2.- Colocar el frote en forma vertical y decolorar aadiendo gota a gota el alcohol-cido durante 60 segundos.
Lavar con un chorro suave de agua.
3.- Cubrir el frote con azul de metileno y dejarlo actuar durante un minuto. Escurrir el colorante y lavar con un

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chorro suave de agua. Dejar secar al aire libre.

Esta tcnica de coloracin tiene algunas variantes; en cuanto a la solucin para la decoloracin, se
puede utilizar cido sulfrico al 0.5-1 % en sustitucin del cido clorhdrico, cuando se sospecha de Nocardia,
ya que este gnero es dbil o parcialmente cido alcohol resistente cuando se utiliza el alcohol-cido
clorhdrico. Adems, se puede realizar la tincin en fro, a este mtodo se le conoce con el nombre de
Kinyoun, en donde el frote con el colorante primario (que lleva 4 g de fucsina bsica, 20 mL de etanol al 95%,
8 g de fenol y 100 mL de agua destilada y la carbolfucsina) se deja actuar durante 5 minutos sin calentar a
emisin de vapores. Para frotes de pacientes con diagnstico de lepra, se utiliza calentamiento a emisin de
vapores durante 15 minutos. La tincin de Tin-Shwe para M. leprae utiliza carbol fucsina con tween 80 durante
5 minutos y azul de metileno durante 4 minutos.
LECTURA:
La lectura del frote se hace al microscopio, utilizando el objetivo de inmersin. Se observa el color de las
clulas anotando el color que tienen stas (rojo o azul).
INTERPRETACIN:
COLOR DE LA CLULA
ROJO
AZUL

SIGNIFICADO
Presencia de bacilos acido-alcohol resistentes (BAAR)
Ausencia de bacilos acido-alcohol resistentes

Con esta tcnica, entre el 50 y el 75 % de las muestras clnicas en las que se asla Mycobacterium, muestran
bacilos cido-alcohol resistente en los frotes directos.

TINCION DE SHAEFFER Y FULTON

Dra en C Graciela Castro Escarpulli/Dra en C Ma. Guadalupe Aguilera Arreola

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OBJETIVO: Demostrar la presencia de esporas bacterianas.

FUNDAMENTO BIOQUMICO: Las bacterias que pertenecen a los gneros Bacillus y Clostridium, Coxiella
burnetii y los cocos Gram positivos del gnero Sporosarcina presentan endosporas. Las endosporas se forman
cuando las condiciones nutricionales en particular la disminucin de la fuente de nitrgeno o de carbono se ven
disminuidas. Las esporas estn constituidas por el centro que contiene el ncleo, ribosomas, diversas enzimas
y dipicolinato de calcio que constituye del 5 al 15% del peso en seco y que le confiere la resistencia al calor; el
centro esta rodeado por una membrana interna, una capa gruesa de peptidoglicano llamada corteza y una
cubierta o capa externa de naturaleza proteica rica en puentes disulfuro y que constituye hasta el 80% de la
protena total de una espora y es la responsable de la resistencia de las esporas a la desecacin, al calor y a
diversos agentes qumicos y fsicos. La composicin qumica de las diversas cubiertas que la conforman, le da
la caracterstica de ser impermeables y extraordinariamente deshidratada, por lo que al emplear algunos
colorantes las endosporas se observan como cuerpos altamente refringentes y sin teir.
Las endosporas se pueden teir aplicando calor, el cual provoca que las capas de la cubierta se hagan
permeables. En la tcnica de Shaeffer y Fulton, el frote cubierto con verde de malaquita se calienta a emisin
de vapores lo que favorece la entrada del colorante, al solidificarse nuevamente las ceras el colorante queda
atrapado. El lavado con agua remueve el colorante que no penetr a las clulas vegetativas; la aplicacin del
colorante de contraste -safranina- permite distinguir claramente a las esporas del soma bacteriano.
PREPARACIN DE LOS REACTIVOS EMPLEADOS EN LA TCNICA:
COLORANTE PRIMARIO: Verde de malaquita
Verde de malaquita
5.0 g
Agua destilada
100.0 mL
Disolver el colorante en el agua, filtrar y colocar en un frasco mbar con tapn de rosca. Almacenar a
temperatura ambiente.
COLORANTE SECUNDARIO: Safranina
Safranina
0.5 g
Agua destilada.
100.0 mL
Disolver la safranina en el agua. Colocar en colorante en un frasco mbar con tapn de rosca. Almacenar a
temperatura ambiente.
MTODO DE COLORACION:
1.-Cubrir el frote con el verde de malaquita y calentar a emisin de vapores durante 5 minutos, cuidando que
no se seque el colorante. Escurrir el colorante y lavar con un chorro suave de agua.
2.- Colocar el frote en forma vertical y lavar con un chorro suave de agua.
3.- Cubrir el frote con la safranina y dejarla actuar durante 15 segundos. Escurrir el colorante y lavar con un
chorro suave de agua. Dejar secar al aire libre.
Esta tcnica de coloracin tiene algunas variantes; el verde de malaquita se puede deja actuar durante
30 minutos sin calentar a emisin de vapores.
LECTURA:
La lectura del frote se hace al microscopio, utilizando el objetivo de inmersin. Se observan las esporas de
color verde y el soma bacteriano rojo-naranja. Las esporas se pueden encontrar en forma libre o aun en el
soma bacteriano. Adems de la presencia de la espora se determina la forma de misma (oval o redonda) y la
posicin dentro del soma bacteriano: terminal, subterminal o central.
SIGNIFICADO
ENDOSPORA
SOMA BACTERIANO

COLOR
VERDE
ROJO

INTERPRETACIN: La observacin de esporas, nos indica que en el frote hay bacterias que pertenecen a los
gneros Bacillus o Clostridium.
BIBLIOGRAFA:
1.- Baron EJ and Finegold SM. 1990. Bailey & Scott's Diagnostic microbiology, 8 th ed. the C.V Mosby Co,. St.
Louis, Missouri, U.S.A.

2.- Barrow GI and Feltham RKA. 1993. Cowan an Steels Manual for the identification of medical
bacteria. 3rd Ed. Cambridge University Press. p214-218

Dra en C Graciela Castro Escarpulli/Dra en C Ma. Guadalupe Aguilera Arreola

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AGAR BHI
OBJETIVO: Conocer la morfologa colonial de la mayora de las bacterias de inters mdico.
FUNDAMENTO: El BHI es un medio slido rico, entre sus ingredientes tiene una infusin de cerebro y de
corazn, lo cual lo hace adecuado para el desarrollo de muchas bacterias, siempre y cuando se incuben a la
temperatura y a la atmsfera adecuada.
COMPOSICIN DEL MEDIO DE CULTIVO:
Frmula en gramos por litro de agua destilada
Infusin de cerebro de ternera
Infusin de corazn de res
Peptona
Cloruro de sodio
Fosfato de potasio
Glucosa
Agar
pH final 7.4

200.0 g
250.0 g
10.0 g
5.0 g
2.5 g
2.0 g
15.0 g

MTODO:
1.- Tomar una colonia con el asa.
2.- Sembrar por estra cruzada.
3.- Incubar a 37C durante 24 horas en atmsfera normal para bacterias aerobias estrictas y para anaerobias
facultativas. Para anaerobios estrictos se debe utilizar alguna MTODOloga que proporcione una atmsfera
libre de oxgeno e incubando durante 48 horas.
LECTURA:
Observar si hubo desarrollo bacteriano y describir las caractersticas morfolgicas.
INTERPRETACIN:
Desarrollo bacteriano.
NOTAS:
1.- En este medio, las bacterias puede ser sembradas por estra cerrada o en forma masiva con un hisopo con
el propsito de tener abundante desarrollo bacteriano para la conservacin del microorganismo o para la
obtencin de biomasa.
2.- Para hacer que el medio de cultivo sea selectivo para hongos, se puede adicionar penicilina y
estreptomicina para inhibir el crecimiento bacteriano.
BIBLIOGRAFA:
Jean F. McFadin. Medio for Isolation Cultivation. 1985. Baltimore London. Editorial Williams & Wilks . Volumen

Dra en C Graciela Castro Escarpulli/Dra en C Ma. Guadalupe Aguilera Arreola

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GELOSA SANGRE
OBJETIVO: Determinar la produccin de hemolisinas.
FUNDAMENTO BIOQUMICO: Algunas bacterias producen enzimas extracelulares (hemolisina "s" y "o"), que
actan hidrolizando la membrana celular de los eritrocitos. Se le denomina hemlisis alfa o incompleta cuando
se produce una decoloracin verdosa alrededor de la colonia debido a la hidrlisis de los enlaces ester-fosfato
con la acumulacin extracelular de diglicridos insolubles. La hemlisis beta se pone de manifiesto por un halo
transparente alrededor de la colonia debido a la lisis completa de los eritrocitos, esto se debe a la hidrlisis de
los enlaces ster y la utilizacin de los productos de los cidos grasos por los microorganismos. Cuando el
microorganismo no sintetiza hemolisinas hay ausencia de halo y se denomina hemlisis gama.
De los dos tipos de hemolisinas, las hemolisinas "s" son estables al oxgeno, pero las hemolisinas "o" son
lbiles en presencia de oxgeno y slo se ponen de manifiesto cuando las condiciones de oxgeno estn
reducidas en el medio.
COMPOSICION DEL MEDIO DE CULTIVO:
Infusin de corazn de ternera
Triptosa
Cloruro de sodio
Agar
Agua
pH

500 g.
10 g
5g
15 g
1000 ml
6.8

Se disuelven todos los ingredientes en el agua y se esteriliza a 121C por 15 min, posteriormente se
deja enfriar a 45-50C y mientras an est lquido, se agrega sangre desfibrinada al 5% en condiciones de
esterilidad.
MTODO:
1.- Tomar una asada de la muestra o cepa problema.
2.- Sembrar por estra cruzada.
3.- Realizar pequeas incisiones en algunas partes de la primera estra.
4.- Incubar a 37C por 24 horas.
LECTURA:
Presencia de un halo verdoso alrededor de la colonia = hemlisis alfa o parcial.
Presencia de un halo transparente alrededor de la colonia = hemlisis beta o total.
Sin presencia de halo = Hemlisis gama o colonia no hemoltica.
Nota: nicamente se observa hemlisis alrededor de las incisiones realizadas en la primera estra en presencia
de la hemolisina "o".
INTERPRETACIN:
Las bacterias que producen lisis completa alrededor de las colonias se denominan beta hemolticas, las que
producen una hemlisis parcial que se observa como una decoloracin verdosa del medio que rodea a la
colonia se denominan alfa hemolticas mientras que las que no tienen ningn efecto sobre el medio son no
hemolticas o gama hemolticas.
BIBLIOGRAFA:
Finegold M. Sydney.,1990., Bailey y Scotts Diagnostic Microbiology.,Eighth edition, The C.V. Mosby
Company.,U.S.A.
Cowan, S.T. and K.T. Steel. 1965. Manual for the identification of Medical Bacteria. Cambridge at the
University Press.

Manual Difco. 1984. Medios de cultivo deshidratados y reactivos para Microbiologa.

Dra en C Graciela Castro Escarpulli/Dra en C Ma. Guadalupe Aguilera Arreola

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PRUEBA DE LA CATALASA
OBJETIVO: Demostrar la presencia de la enzima catalasa.
FUNDAMENTO: La mayora de las bacterias que presentan citocromos presentan la enzima catalasa, la cual
es una hemoprotena, su grupo prosttico esta formado por cuatro tomos de hierro trivalente, molcula que
retiene su estado oxidado durante la actividad enzimtica. La catalasa es una enzima que descompone el
perxido de hidrgeno formando agua y oxigeno gaseoso. En la descomposicin del oxgeno del perxido de
hidrgeno, una molcula acta como el sustrato y otra como el donador.
2 H2O2

CATALASA

2H2O + 2O2 (GAS)

REACTIVO: Perxido de hidrgeno al 3 %

MTODO:
La prueba de la catalasa se puede realizar de dos formas rutinariamente: en portaobjetos o agregando el
reactivo sobre el desarrollo bacteriano, una alternativa a estos procedimientos, es determinar la catalasa en
tubo, el cual es aplicado al gnero Mycobacterium y se describe al final de este tema.
Mtodo del portaobjetos:
1.- Tomar una colonia bacteriana y colocarla en un portaobjetos.
2.- Aadir sobre la colonia una gota de perxido de hidrgeno al 3%.
3.- Observar si hay la formacin de burbujas.
Mtodo en placa:
1.- Aadir sobre una colonia una gota de perxido de hidrgeno al 3%.
3.- Observar si hay la formacin de burbujas.
Mtodo en tubo.
Este mtodo se utiliza para poner de manifiesto si el gnero Mycobacterium produce la enzima catalasa que es
termoestable.
1.- Colocar una asada del cultivo por probar en un tubo con tapn de rosca que contenga 0.5 ml una solucin
amortiguadora de fosfatos M/15.
2.- Incubar a 68C de 20 a 30 minutos
3.- Enfriar al chorro de agua.
4.- Agregar 0.5 ml de una solucin recin preparada en partes iguales de Tween 80 al 10% y perxido de
hidrgeno al 30%.
5.- Observar si hay la formacin de burbujas.
LECTURA: La produccin de burbujas se lee como una prueba positiva.
INTERPRETACIN: La formacin de burbujas indica que la bacteria sintetiza la enzima catalasa (positiva).
Una prueba negativa indica que la enzima catalasa no se produce, dado a que no hay descomposicin del
perxido de hidrgeno.
NOTAS:
1.- No se debe utilizar ningn medio de cultivo que contenga eritrocitos dado a que los eritrocitos tienen la
enzima catalasa por lo que pueden leerse falsos positivos.
2.- Cuando sea necesario realizar la prueba de catalasa a partir de cepas aisladas en medios de cultivo que
contengan sangre, el asa al ser flameada debe dejarse enfriar al aire o enfriar en medio libre de sangre. La
colonia debe tomarse superficialmente para evitar arrastrar eritrocitos, que pueden dar una prueba falsa
positiva.
3.- El reactivo debe prepararse y probarse peridicamente, debe colocarse en un frasco ambar ya que se
descompone fcilmente cuando se expone a la luz y mantenerse en refrigeracin mientras no se utilice.
BIBLIOGRAFA.
MacFaddin F. Jean PRUEBAS BIOQUIMICAS PARA LA IDENTIFICACIN DE BACTERIAS DE
IMPORTANCIA CLNICA. Edit . Panamericana, primer edicin , Mxico, D.F. 1990, pp 39-43 , 275.

Dra en C Graciela Castro Escarpulli/Dra en C Ma. Guadalupe Aguilera Arreola

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PRUEBA DE OXIDASA.
OBJETIVO:
Determinar la presencia de la enzimas oxidasas.
FUNDAMENTO:
La prueba de la oxidasa se basa en la produccin bacteriana de una enzima oxidasa intracelular. Est reaccin
de oxidasa se debe a un sistema de citocromo oxidasa que activa la oxidacin del citocromo reducido por el
oxgeno molecular, el que a su vez acta como un aceptor de electrones en la fase terminal del sistema de
transferencia de electrones.
El oxgeno es el aceptor de hidrgeno final producido a partir del hidrgeno del agua o del perxido de
hidrgeno, segn la especie bacteriana y su sistema enzimtico.
El sistema cromforo slo se encuentra en los organismos aerobios, lo que los hace capaces de utilizar el
oxgeno como aceptor final de protones para reducir el O 2 molecular en perxido de hidrgeno, el ltimo enlace
de la cadena de respiracin aerbica.
Los organismos obligatoriamente anaerobios carecen de actividad oxidasa porque no pueden vivir en
presencia de oxgeno atmosfrico y no poseen el sistema citocromo oxidasa.
Un resultado oxidasa positiva esta formado por una serie de reacciones en la cual un componente autooxidable del sistema citocromo oxidasa es el catalizador final que puede sustituir a los aceptores de electrones
naturales por sustratos artificiales, en cualquier sitio de la cadena de transporte de electrones, donde actan
como reductantes del sistema citocromo C - citocromo oxidasa.
La enzima citocromo oxidasa es capaz de oxidar el sustrato tetrametil-p-fenilendiamina dihidroclorado
formando un producto final colorido, el indofenol.
El producto final prpura es visible si una pequea cantidad del cultivo de una cepa produce la enzima.
O2
Dimetil-p-fenilendiamina + naftol

azul de indofenol + 2H 2O

COMPOSICION DE LOS REACTIVOS:

Existen diversos reactivos para realizar la prueba:
1.- Reactivo de Kovacs: diclorohidrato de tetrametil- p-fenilendiamina (TPD)* al 1%.
2.- Reactivo de Gordon y McLevo: clorhidrato de dimetil p-fenilendiamina (denominado tambin N,N-dimetil-pfenilendiamina o monoclorhidrato de p-aminodimetilanilina) al 1-1.5%.
3.- Reactivo de Carpenter-Suhrland y Morrison: Oxalato de p-aminodimetilanilina al 1%.
4.- Discos comerciales impregnados con oxidasa.
MTODO.
Esta prueba se puede realizar de dos formas:
1.- Mtodo directo en placa.
Agregar directamente 2 a 3 gotas de reactivo* sobre algunas colonias que se desarrollan en el medio de
cultivo.
NOTA:
Evitar inundar la caja con el reactivo.
No debe invertir la caja una vez agregado el reactivo
No realizar esta prueba en medios de cultivo con eritrocitos, ni en medios con carbohidratos.
2.- Mtodo indirecto con papel filtro.
a) tiras de papel filtro
Colocar tiras de papel filtro en una caja de Petri estril, humedecer con el reactivo*.
Tomar una pequea porcin de la colonia con un asa de platino o un aplicador de madera (preferente) y
frotar el cultivo en el papel filtro hmedo.
b) tiras comerciales o discos.

Dra en C Graciela Castro Escarpulli/Dra en C Ma. Guadalupe Aguilera Arreola

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Se realiza igual que el anterior, pero sin humedecer las tiras con el reactivo porque ste ya viene
impregnado.
Nota: Para frotar la colonia no emplear asa de alambre de acero inoxidable o nicromel porque los productos de
oxidacin superficial formados al esterilizar el asa dan como resultado reacciones falsas positivas.
LECTURA E INTERPRETACIN.
La lectura es positiva si se produce un color prpura en la colonia o sobre el papel frotado con la colonia.
En las colonias oxidasa negativas no se produce cambio de color en las colonias o slo adquieren un color
rosado plido por el reactivo.
Nota: Cuando emplea tiras comerciales con una mezcla de reactivo dimetil-p-fenilendiamina y alfa- naftol, la
reaccin oxidasa positiva se observa por un color azul.
BIBLIOGRAFA.
MacFaddin, J. F. 1990 Pruebas Bioqumicas para la identificacin de bacterias de importancia clnica. Editorial
Mdica Panamericana. Mxico, D. F. pp 154-159.

PRUEBA DEL HIDRXIDO DE POTASIO

OBJETIVO: Contar con una prueba auxiliar no tintorial que nos permita diferenciar a las bacterias Gram
positivas de las Gram negativas.
FUNDAMENTO BIOQUMICO: Las bacterias Gram negativas presentan una pared celular compuesta por una
delgada de peptidoglicana (5-10 nm), la cual es degradada fcilmente al ponerla en contacto con hidrxido de
potasio al 3%, liberando el material cromosomal. Las bacterias Gram positivas presentan una pared celular
relativamente ms gruesa (20-80 nm) la cual es menos susceptible de degradar por el lcali.
REACTIVO: Hidrxido de potasio al 3%.
MTODO:
1.- Depositar una gota del KOH AL 3% sobre un portaobjetos.
2.- Tomar una colonia con el asa y emulsionarla con agitacin continua por 60 segundos.
3.- Separar suavemente el asa del portaobjetos.
LECTURA: Al separar el asa, observar a formacin de un hilo viscoso.
INTERPRETACIN: La formacin de un hilo viscoso indica la liberacin del material cromosomal, por la
degradacin de la pared celular de las bacterias Gram negativas. Las bacterias Gram positivas dan una
suspensin homognea sin la formacin del hilo viscoso.
BIBLIOGRAFA:
BARON EJ AND SM FINEGOLD. 1990. Bailey & Scotts Diagnostic microbiology, 8th ed. the C.V Mosby Co,.
St. Louis, Missouri, U.S.A.

Dra en C Graciela Castro Escarpulli/Dra en C Ma. Guadalupe Aguilera Arreola

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DETERMINACION DEL METABOLISMO DE CARBOHIDRATOS EN MEDIO DE HUGH Y LEIFSON (O/F)

OBJETIVO:
Determinar el metabolismo oxidativo o fermentativo de un azcar.
Ayuda a la diferenciacin entre los gneros de las Micrococcaceae. Ayuda a la identificacin de organismos
oxidantes. Determina la reaccin oxidacin-fermentacin (OF), ayudando a la identificacin de bacterias
aerbicas.
FUNDAMENTO BIOQUMICO:
Algunas bacterias son capaces de metabolizar algn hidrato de carbono (manifestado por la produccin de
cido) slo en condiciones aerbicas, mientras que otras producen cido tanto en aerobiosis como en
anaerobiosis. La fermentacin es un proceso anaerbico y las bacterias fermentadoras son por lo general
anaerobios facultativos. Por medio del proceso de fermentacin un hidrato de carbono es metabolizado y
desdoblado en dos molculas de triosa de carbono que a su vez son convertidas en cierto nmero de
compuestos con 1, 2, 3, 4 carbonos; el intermediario clave es el cido pirvico.
Todos los azcares de seis, cinco y cuatro tomos de carbono en un principio son degradados a cido pirvico
un intermediario inicial. La glucosa es la fuente principal de azcares para las bacterias y la degradacin ocurre
por tres vas:
Embden-Meyerhof-Parnas
Entner-Douderoff

Warbury Dickens
La glucosa es convertida en cido pirvico en cada una de estas vas por un conjunto diferente de pasos de
degradacin. Las bacterias utilizan una o ms de estas vas para metabolizar la glucosa, segn su composicin
enzimtica y la presencia o ausencia de oxgeno, las tres vas requieren como paso inicial la fosforilacin de la
glucosa.

Embden-Meyerhof-Parnas
CIDO LCTICO

GLUCOSA

CIDO PIRUVICO
CIDOS MIXTOS

Entner-Douderoff

GLUCOSA

CIDO PIRVICO

CICLO DE KREBS

H2O

Warbury Dickens
GLUCOSA

CIDO PIRVICO

CICLO DE KREBS

H2O
CIDOS MIXTOS

La oxidacin de la glucosa por una de las vas de derivacin es un proceso aerbico y los oxidadores
bacterianos son por lo general aerobios obligados.
La oxidacin requiere oxgeno o un compuesto inorgnico como aceptor de electrones final. En el metabolismo
oxidativo la glucosa es oxidada a cido glucnico y como producto final 2 molculas de cido pirvico.

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GLUCOSA

ACIDO GLUCNICO

CIDO-2-CETO-6- FOSFOGLUCNICO

ACIDO 2-CETOGLUCONICO
2 MOLES DE CIDO PIRVICO

COMPOSICIN MEDIO BASE

FRMULA g/L
Peptona (triptona)
Cloruro de sodio
Fosfato de potasio
Agar
Azul de bromotimol
Agua destilada

2
5
0.3
2.3
0.03
1000

Agregar un hidrato de carbono a la vez (por ejemplo: sol. acuosas de glucosa, sacarosa, lactosa maltosa) al
10%, PH 7.1 + 0.2.
MTODO:
1.- Inocular por el mtodo de picadura (hasta 5 mm del fondo) dos tubos (uno con sello y sin sello de aceite
mineral)
2.- Incubar a 37C durante 48 h ms (puede necesitar de 3 o hasta 14 das de incubacin).
LECTURA:
Observar si hubo desarrollo bacteriano y vire del indicador
INTERPRETACIN:
METABOLISMO
F
O
NO UTILIZA EL
CARBOHIDRATO

Tubo
SIN SELLO
AMARILLO (A)
AMARILLO (A)

Tubo
CON SELLO
AMARILLO (A)
VERDE (-)

VERDE (-)

VERDE (-)

NOTA:
La base de O/F puede adicionarse de otros carbohidratos para identificar hasta especie gneros bacterianos
con metabolismo oxidativo por ejemplo Pseudomonas.
BIBLIOGRAFA:
Jean F. Mac Faddin. Pruebas bioqumicas para la identificacin de bacterias de importancia clnica . Editorial
Mdica Panamericana. 1990. Mxico D.F.

BASE ROJO DE FENOL CON GLUCOSA

OBJETIVO:

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Determinar la capacidad de un microorganismo de utilizar los carbohidratos en forma fermentativa.

FUNDAMENTO BIOQUMICO:
El tipo de productos finales producidos por la fermentacin de los hidratos de carbono depende de varios
factores: el tipo de organismo que lleva a cabo el proceso de fermentacin; la naturaleza del sustrato que debe
ser fermentado, y en ocasiones, los factores ambientales como la temperatura y la acidez. Los productos
finales de la fermentacin de los hidratos de carbono y los alcoholes, denominados colectivamente azcares,
son: hidrgeno y anhdrido carbnico; algunos pocos cidos; algunos alcoholes y una cetona.
Algunas bacterias pueden fermentar anaerbicamente la glucosa, otras la oxidan y algunas pueden
metabolizarla por ambos mtodos, mientras que otras, an son incapaces de utilizar la glucosa. Algunas
bacterias son capaces de metabolizar algn hidrato de carbono (manifestado por la produccin de cido) slo
en condiciones aerbicas, mientras que otras producen cido tanto en aerobiosis como en anaerobiosis. La
fermentacin es un proceso anaerbico y las bacterias fermentadoras son por lo general anaerobios
facultativos.
Por medio del proceso de fermentacin un hidrato de carbono es metabolizado y desdoblado en dos molculas
de triosa de carbono que a su vez son convertidas en cierto nmero de compuestos con 1, 2, 3, 4 carbonos;
el intermediario clave es el cido pirvico.
Es importante mencionar que antes de la descomposicin del azcar glucosa, sta es fosforilada en un
compuesto glucosa 6-fosfato. La fermentacin requiere un compuesto orgnico como aceptor de electrones
terminal. El ms importante ciclo fermentativo de la degradacin de la glucosa es el ciclo de EmbdenMeyerhof, aun cuando tambin ella puede producirse por la derivacin pentosa o el ciclo de Entner-Doudoroff o
en combinacin con ellos. No obstante, los tres ciclo requieren la fosforilacin de la glucosa como paso inicial
antes de que pueda producirse la degradacin. El cido pirvico (CH 3CO.COOH) es el intermediario clave en la
degradacin de la glucosa, y la desasimilacin del cido pirvico pasa por muchos mecanismos diferentes que
forman una variedad de productos terminales caractersticos de las fermentaciones bacterianas. Como
consecuencia de la oxidacin los monosacridos son catabolizados en cido pirvico a travs de una serie de
procesos graduales, en cada uno de los cuales intervienen enzimas especficas .

Embden-Meyerhof-Parnas
CIDO LCTICO

GLUCOSA

CIDO PIRUVICO
CIDOS MIXTOS

Entner-Douderoff

GLUCOSA

CIDO PIRVICO

CICLO DE KREBS

H 2O

Warbury Dickens

GLUCOSA

CIDO PIRVICO

CICLO DE KREBS

H 2O

CIDOS MIXTOS
COMPOSICIN DEL MEDIO BASE:
FRMULA g/L
Caldo bsico rojo de fenol, pH: 7,4.

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Peptona de casena
Extracto de carne
Cloruro de sodio
Rojo de fenol
Agua
Glucosa

10 g
1g
5g
0.018 g
1000 ml
5g

Colocar una campana de Durham previo a la esterilizacin 10 lb/10 min

MTODO:
1. Inocular una asada de cada uno de los microorganismos a probar.
2. Incubar a 37C durante 24 hrs.
3. Observar el resultado
LECTURA:
Observar el vire del indicador de rojizo a amarillo y la presencia de gas dentro de la campana de Durham.
INTERPRETACINES:
A) Medio de caldo con hidratos de carbono y rojo de fenol
Color amarillo indica la utilizacin de carbohidrato y produccin de cido a partir de ste
Color anaranjado. Cambio de pH seguir incubando.
Color rosa-rojizo alcalinizacin del medio por no utilizacin del carbohidrato
Positiva de gas: presencia de burbujas de gas que se observan como un desplazamiento del lquido en
la campana de Durham.
Negativo de gas: no hay burbujas de gas ni descomposicin del medio.

BIBLIOGRAFA:
Mac Faddin, J. F. 1993, PRUEBAS BIOQUIMICAS PARA LA IDENTIFICACION DE BACTERIAS DE
IMPORTANCIA CLINICA, Ed. Panamericana. Mxico. Pg: 27 35.

MOVILIDAD EN MEDIO SIM

OBJETIVO:
Determinar si un organismo es mvil o no mvil y poner de manifiesto la produccin de cido sulfhdrico y la
presencia de triptofanasa.

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FUNDAMENTO BIOQUMICO:
Las bacterias tienen movilidad por medio de sus flagelos, stos se encuentran principalmente entre los bacilos;
por su parte, la mayora de los cocos son no mviles. Las bacterias mviles pueden tener un solo flagelo
(monotricas) o varios flagelos en toda la periferia (pertricas), flagelos en los extremos (anfitricas), etc.
Dependiendo del gnero y la especie, las bacterias que no tienen flagelos son no mviles o muchos; adems
su localizacin vara con la especie bacteriana y las condiciones de cultivo. Los organismos no mviles
carecen de flagelos.
El SIM es un medio semislido que se utiliza para determinar la produccin de: ac. sulfhdrico e indol a partir
del triptfano y la produccin de flagelos en un medio que contiene una cantidad mnima de agar que facilita la
movilidad de los microorganismos.
COMPOSICIN DEL MEDIO DE MOVILIDAD (FRMULA POR g/L)
Componente
Peptona de carne
Peptona de caseina
Sulfato ferroso de amonio
Agar
Tiosulfato de sodio
Agua
pH

Cantidad
6.1 g
20 g
0.2 g
3.5 g
0.2 g
1000 ml
7.3

MTODO:
1) Inocular hasta 5 mm del fondo del tubo con asa recta y por picadura el medio semislido del
microorganismo a probar.
2) Incubar a 37C durante 24 horas.
3) Tener cuidado de sacar el asa por la misma lnea
LECTURA:
Observar si hay desarrollo bacteriano en la lnea de siembra o si se observa turbiedad en todo el medio.
Observar si existe un precipitado negro en el medio
Agregar al medio el reactivo Kovacs y ver coloracin que se presenta.
Produccin de cido sulfhdrico:
Los diferentes microorganismos utilizan distintos compuestos o aminocidos como fuente de azufre (peptonas,
cistena, cistina y tiosulfato) para producir cido sulfhdrico.
Un organismo que produzca cido sulfhdrico cultivado en un medio orgnico como la peptona, reduce el
azufre por hidrogenacin, produciendo el gas cido sulfhdrico. Este reacciona con los iones frricos presentes
en el medio para formar un precipitado negro.
Bacteria (medio cido) + tiosulfato de sodio
H 2S (gas)
H2S + iones frricos
sulfuro ferroso
precipitado negro insoluble
Produccin de Indol:
El triptfano es un amino cido que puede ser oxidado por ciertas bacterias para formar 3 metabolitos
indlicos principales: indol, escatol (metilindol) e indolactico, las enzimas intracelulares que intervienen en
este proceso reciben el nombre de triptofanasas. El principal intermediario en la degradacin del triptofano es
el cido piruvico, del cual puede formarse indol por desaminacin, y escatol por descarboxilacin del cido
indolactico.

L- triptfano

Triptofanasa

Indol + cido pirvico + amonaco

El indol, desdoblado de la molcula de triptfano puede ser detectado por el reactivo de Kovacs o de Ehrlich,
que produce un anillo de color rojo.

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Indol
Indol

+
+ ter

Reactivo de Kovacs
+ Reactivo de Ehrlich

Anillo color rojo

Anillo color rojo

INTERPRETACIN
Produccin de cido sulfhdrico:
Prueba positiva: Coloracin negro-pardusca o precipitado negro en el tubo.
Prueba negativa: No hay ennegrecimiento.
Movilidad
Movilidad positiva: Los organismos que presentan flagelos migran de la lnea de siembra y se difunden en el
medio provocando turbiedad.
Movilidad negativa: Desarrollo en la lnea de siembra indica que la bacteria no presenta flagelos, el medio
circundante se mantiene claro.
Indol
Produccin de indol: Un anillo rojo en la capa alcohlica del reactivo nos indica que hubo produccin de indol.
Un color anaranjado en la superficie del medio debido al desarrollo de escatol (compuesto metilado que puede
ser precursor de la formacin de indol).
No-produccin de indol: No hay produccin de color en la capa alcohlica, se mantiene el color del reactivo.
BIBLIOGRAFA:
Mac Faddin, J. F., 1990, PRUEBAS BIOQUIMICAS PARA LA IDENTIFICACION DE BACTERIAS DE
IMPORTANCIA CLINICA, ed. Panamericana, Mxico; pgs.: 61-69,
Mac Faddin. 1985. Media for Isolation-Cultivation-Identification-Mantenance of Medical Bacterias. Ed. Williams
& Wilkins, U.S.A. Vol. I.

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SENSIBILIDAD A LA VANCOMICINA
OBJETIVO: Diferenciar con base a una prueba sencilla y rpida a las bacterias Gram positivas de las Gram
negativas por su sensibilidad a la vancomicina
FUNDAMENTO BIOQUMICO: La vancomicina es un glucopptido (PM 1450) producido por Streptomyces
orientalis. Es un bactericida potente para estafilococos, algunos clostridios y bacilos.
Inhibe las etapas iniciales de la sntesis de mucopptido de la pared celular, bloqueando la reaccin de la
transpeptidasa, ya que acta directamente sobre el pptido D-alanina-D-alanina de los precursores del
peptidoglicana. Es efectiva contra muchas bacterias Gram positivas incluyendo bacterias anaerobias, la
mayora de las bacterias Gram negativas anaerobias son resistentes a vancomicina.
MTODO:
1.- Sembrar en gelosa sangre por estra cruzada la cepa a estudiar.
2.- Colocar un disco de vancomicina (5g) sobre la estra inicial.
3.- Incubar en aerobiosis a 37C de 24 horas.
LECTURA: Observar si hubo o no desarrollo bacteriano alrededor del disco.
INTERPRETACIN:
1.- La observacin de cualquier halo de inhibicin (ausencia de crecimiento), es considerado como sensibilidad
e indica que la cepa es una bacteria Gram positiva.
2.- El crecimiento alrededor del disco indica resistencia y que la cepa corresponde a una bacteria Gram
negativa.
Precauciones: Para bacterias que no desarrollan en gelosa sangre como Haemophillus y Legionella deben
emplearse medios adecuados para su crecimiento.
BIBLIOGRAFA:
Brooks, Butel, Ornston, Microbiologia Mdica De Jawetz, Meinick y Adelberg, 15va edicin, Ed Manual
moderno, 1996, Mxico D.F. pag 191, 245, 246.
Brock. Biologa de los microorganismos, 8va edicin, Ed Prentice Hall, Madrid 1997, pag 416, 417, 427.
Davis B.D Microbiology 4th edicin, Lippicott Company, 1990, pag 36, 210.
Baron E.J. Diagnostic Microbiology 8th edition, The C.V. Mosby Company ,1990, pag 179, 485, 486.

SISTEMAS DE ANAEROBIOSIS.

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OBJETIVO: Obtener desarrollo de bacterias anaerobias asociadas a enfermedades.

Para obtener un mximo de efectividad en el aislamiento es necesario cumplir con, una toma de muestra como
del transporte apropiado para cada muestra clnica y evitar al mximo el contacto del oxigeno con la muestra.
Los sistemas ms utilizados hoy en da son:
Jarra de anaerobiosis
Cmara anaerobia con guante
La jarra de anaerobiosis.- existen diversas jarras (marcas) y su funcionamiento varia muy poco, la jarra
consiste en un recipiente regularmente de vidrio (o polietileno) que se cierra hermticamente. Dentro de la jarra
se realiza una remocin de oxgeno por diferentes mtodos: a) crear vaci e inyectar N 2 al 85%, b) CO 2 al 5% y
c) H2 10%. Otros como el GasPak contienen una sustancia qumica como: el cido ctrico, el bicarbonato de
sodio y el borohidruro de sodio, que al reaccionar con agua desprende H 2 Y CO2.
H2+O2----- Pd ----- (2H2O)
El paladio funciona como catalizador y el azul de metileno como indicador de xido reduccin del medio.
Modo de empleo:
Se colocan las cajas a incubar en el cilindro.
Colocar en un lugar visible el indicador y el catalizador se fija en la tapa de la jarra.
Colocar el sobre generador con 10 ml de agua.
Cerrar hermticamente al tope de los tornillos para evitar romper el recipiente.
Incubar de 35 a 37C por 48 h.
CMARA DE ANAEROBIOSIS CON GUANTE.
Es un sistema autoabastecido que permite procesar muestras y mayor parte de las tcnicas bacteriolgicas sin
exposicin al aire. Esta cmara puede ser plstica o gabinetes rgidos de metal o acrlico o fibra de vidrio.
Conteniendo una atmsfera de los siguientes gases 90% de N 2, 5% de H2 Y 5% de CO 2. Otra ventaja de este
sistema es que puede funcionar como incubadora.
Existen otros mtodos que pueden proporcionar anaerobiosis, eliminando oxgeno y reduciendo el potencial
REDOX de los cultivos, pero stos son utilizados para organismos no muy exigentes. Estas estrategias pueden
utilizarse solas o en conjunto:

La adicin de sustancias reductoras a los medio lquidos como la cisteina HS-CH 2CH(NH2)COOH y el
tioglicolato de sodio SH-CH2COONa que contiene grupos sulfhdrico que fcilmente seden sus
hidrgenos a otros compuestos orgnicos.
Uso de tapones de rosca, sellos de aceite mineral o vaselina evitan el intercambio atmosfrico al
cultivo.
El calentamiento del medio cultivo previo a su inoculacin para eliminar el oxigeno disuelto.
Indicadores azul de metileno o la resarzurina.

BIBLIOGRAFA:
Elmer W. Koneman M.D. DIAGNOSTICO MICROBIOLGICO texto y atlas de color, 3 edicin, editorial
mdica panamericana. Buenos Aires Argentina 1992. pp503-507.

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