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DE MXICO
FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES ZARAGOZA
CONTENIDO
Pgina
Introduccin
Generalidades de bacterias
Morfologa y estructura
Nutricin
Quimiohetertrofos
Auttrofos
Fotoauttrofos
Fotohetertrofos
Reproduccin
Transformacin
Conjugacin
Transduccin
9
9
10
12
12
12
12
13
14
14
15
Identificacin bacteriana
Medios de cultivo
Medios bsicos
Medios enriquecidos
Medios selectivos, diferenciales y
de enriquecimiento
Medios especiales
Clasificacin por consistencia
Slidos
Semislidos
Lquidos
Clasificacin por composicin
Sintticos
No sintticos
16
16
18
19
20
22
23
23
Tcnicas de inoculacin
En placa
Estra cruzada
Estra en Z
Estra simple
Siembra masiva
Vaciado en placa
En tubo: medio semislido
Siembra en medios lquidos
En tubo: medios slidos
24
26
27
28
29
30
Morfologa colonial
31
35
35
42
48
52
59
63
69
73
78
82
87
92
102
112
116
Metabolismo
Produccin de energa
Va de degradacin de las hexosas
Gluclisis
Entner-Duodoroff
Pentosa fosfato
Ciclo de Krebs
Fermentacin
Lctica
Heterolctica
Alcohlica
Propinica
cido mixta (frmica)
De metano
Butilenglucoltica (acetonica)
Respiracin anaerbica con aceptores
inorgnicos de hidrgeno
Fijacin de nitrgeno
Reduccin de sulfatos
125
128
130
134
135
139
142
143
144
144
146
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148
148
149
149
151
153
155
157
158
160
162
163
164
Referencias
Direcciones electrnicas
165
168
NDICE DE FIGURAS
No.
1
2
3
4
5
6
11
12
13
14
15
16
17
18
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20
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26
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29
30
Figura
Morfologa bacteriana
Formas de nutricin de bacterias
Reproduccin bacteriana
Reproduccin bacteriana: Transformacin
Reproduccin bacteriana: Conjugacin
Superficie de placas de agar EMB que ilustra el brillo verde
producido por miembros de las Enterobacterias que fermentan
vidamente lactosa: Escherichia coli.
Placa de agar soya - tripticasa, inoculado con una bacteria que
produce un pigmento amarillo. La produccin de pigmento es una
importante caracterstica diferencial para identificar bacilos
Gram negativos no fermentadores.
Superficie de placas de agar EMB que ilustra cultivo mixto de
Escherichia coli y Shigella sp.
Morfologa colonial en agar sangre.
Superficie de placas de agra EMB que ilustra el brillo verde
producido por Escherichia coli.
Agar BCYE
Streptococcus sp.
Pruebas bioqumicas: Fermentacin de carbohidratos
Pruebas bioqumicas: Citrato
Pruebas bioqumicas: Licuefaccin de gelatina
Micrococcus sp
Pruebas bioqumicas: Leche con tornasol
Pruebas bioqumicas: Leche con azul de metileno
Salmonella sp.
Pruebas bioqumicas: Oxidacin/fermentacin
Interpretacin O/F
Pruebas bioqumicas: Urea
Salnonella typhi
Pruebas bioqumicas: Voges - Proskauer
Escherichia coli
Pruebas bioqumicas: Rojo de metilo
Escherichia coli, observese pili
Pruebas bioqumicas: Reduccin de nitratos
Pruebas bioqumicas: Fenilalanina desaminasa
Salmonella typhi
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
Produccin de quesos
Produccin de vino
8
9
10
Referencia
Enciclopedia Encarta, 2002
Enciclopedia Encarta, 2002
Enciclopedia Encarta, 2002
Enciclopedia Encarta, 2002
Enciclopedia Encarta, 2002
Koneman, 1992
Koneman, 1992
18
Koneman, 1992
19
20
21
Koneman,1992
Museun of History Natural
31
37
38
45
50
51
57
61
62
66
67
71
72
76
77
80
81
85
91
96
Sullivan, 2002
Pfeizer, 2002
Koneman, 2002
Pg.
9
11
13
14
15
16
99
101
101
107
107
110
114
121
124
144
145
ndice de Tablas
No.
Tabla
Pg.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
68
98
101
111
115
123
124
154
157
159
161
ndice de Esquemas
No.
1
2
3
4
5
6
7
8
Esquema
Gluclisis
Va de Hexosa monofosfato
Ciclo de Krebs
Coprocultivo
Aislamiento de bacterias patgenas de heces
Aislamiento de Staphylococcus
Urocultivo
Exudado faringeo
Pgina
133
138
141
155
156
158
162
164
Introduccin
Como estudiante la licenciatura de Q.F.B. la cual abarca en
gran parte el estudio bacteriolgico he observado que la
mayora de las veces, los alumnos al realizar las pruebas
bioqumicas para la identificacin de bacterias no tienen un
conocimiento real o suficiente de los principios o bases para
realizarlas as como las precauciones e inconvenientes que se
presentan en cada prueba bioqumica.
Para poder conocer los principios, bases bioqumicas, mtodos,
aplicaciones, interpretacin y precauciones as como los
resultados esperados en cada prueba es necesario a menudo
recurrir a muchas referencias bibliogrficas y publicaciones
que no siempre se encuentran a disposicin de los alumnos o
microbilogos en general.
En este atlas de pruebas bioqumicas se han seleccionado las
pruebas que se utilizan a lo largo de la licenciatura de Qumico
Farmacutico Bilogo en la Facultad de Estudios Superiores
Zaragoza. Por lo tanto el usuario encontrar la informacin
suficiente y necesaria pero sobre todo, sencilla y amena de
cada prueba, su principio fundamental, bases bioqumicas,
medios de cultivo, reactivos empleados, resultados,
interpretacin, reporte de resultados, precauciones y
observaciones, tcnicas de inoculacin y condiciones de
incubacin as como referencias bibliogrficas. Estas han sido
reunidas al final para permitir, cuando se desee una
profundizacin acerca de un aspecto determinado de algn
7
Morfologa y estructura.
Las bacterias son microorganismos procariotas de
organizacin muy sencilla. La clula bacteriana consta
de:
!"Citoplasma. Presenta un aspecto viscoso, y en
su zona central aparece un nucleoide que
contiene la mayor parte del ADN bacteriano, y
en algunas bacterias aparecen fragmentos
circulares de ADN con informacin gentica,
dispersos por el citoplasma: son los plsmidos.
membrana
plasmtica
!"La
presenta
invaginaciones, que son los mesosomas, donde
se encuentran enzimas que intervienen en la
y
los
pigmentos
sntesis
de
ATP,
fotosintticos en el caso de bacterias
fotosintticas. En el citoplasma se encuentran
inclusiones de diversa naturaleza qumica.
!"Muchas bacterias pueden presentar flagelos
generalmente rgidos, implantados en la
membrana mediante un corpsculo basal.
Pueden poseer tambin, fimbrias o pili muy
numerosos y cortos, que pueden servir como
pelos sexuales para el paso de ADN de una
clula a otra.
!"Poseen ARN y ribosomas caractersticos, para
la sntesis de protenas.
!"Pared celular rgida y con molculas exclusivas
de bacterias.
2.
Nutricin
10
11
quimiohetertrofas,
utilizan
un
bacterias
1. Las
compuesto qumico como fuente de carbono, y a su vez,
este mismo compuesto es la fuente de energa. La
mayor parte de las bacterias cultivadas en laboratorios
y las bacterias patgenas son de este grupo.
12
3.
Reproduccin
Generalmente las bacterias se reproducen
biparticin, como se ve en el siguiente esquema:
por
Tras la duplicacin del ADN, que esta dirigida por la ADNpolimerasa que se encuentra en los mesosomas, la pared
bacteriana crece hasta formar un tabique transversal
separador de las dos nuevas bacterias.
Pero adems de este tipo de reproduccin asexual, las
bacterias poseen unos mecanismos de reproduccin sexual o
parasexual, mediante los cuales se intercambian fragmentos
de ADN. Este tipo de reproduccin puede realizarse por:
13
!"TRANSFORMACION:
Consiste
en
el
intercambio gentico
producido cuando una
bacteria es capaz de
captar fragmentos de
ADN, de otra bacteria
que
se
encuentran
dispersos en el medio
donde vive.
14
!"
TRANSDUCCIN: En este caso la transferencia
15
16
17
1. Medios bsicos
Solo contienen algn extracto de carne u otra infusin
simple, peptona, sal y agua.
El extracto o la infusin de carne proporcionan al organismo
los aminocidos, vitaminas, sales, y pequeas cantidades de
carbono, nitrgeno, hidrgeno y otros elementos.
Las sales (usualmente cloruro de sodio) sirven para obtener
isotonicidad requerida para el mantenimiento de presiones
osmticas constantes.
El agua sirve como disolvente, como medio de transporte, o
para ambos fines (siempre se debe usar agua destilada para
preparar los medios de cultivo).
Los medios de cultivo que solo contienen extracto de carne,
peptona, sal y agua, son lquidos; para el estudio de las
caractersticas de las colonias es indispensable el uso de
medios slidos.
La solidificacin se consigue
agregando agar, gelatina, albmina
de suero o de huevo, a los otros
ingredientes.
18
2. Medios enriquecidos
Son aquellos medios bsicos que han sido complementados
con lquidos corporales, vitaminas especficas, aminocidos,
protenas y otros nutrientes claramente definidos como
tales.
19
Ejemplos:
1. Agar proteosa
2. Agar sangre
3. Agar chocolate
4. Caldo de suero
5. Agar con suero
6. Suero de Loeffler con
sangre
3.
Medios
selectivos,
enriquecimiento
diferenciales
de
20
lactosa, desoxicolato)
11. Agar sangre con azida
12. Agar con sal y manitol
13. Agar de Mc Conkey
14. Agar Salmonella Shigella
15. Agar con eosina y azul
de metileno (EMB)
16. Agar de bilis y rojo de
violeta
dextrosa
y
17. Agar
tripticaseina
18. Agar entrico Hektoen
19. Agar S-110
20. Agar tergitol 7
21. Agar verde brillante
22. Agar Vogel Jhonson
23. Agar Baird-Parker
21
4. Medios especiales
Son los medios que no pueden ser fcilmente agrupados
bajo alguno de los anteriores grupos.
La mayora de ellos sern medios empleados
comprobar una o ms a caractersticas bioqumicas.
para
Ejemplos:
Pruebas bioqumicas
1. Fermentacin de carbohidratos
2. Prueba de citrato
3. Prueba de leche con tornasol
4. Reduccin de leche con azul de metileno
5. Prueba de oxidacin y fermentacin: Hugh-Leifson
(O/F)
6. Prueba de ureasa
7. Prueba de Voges Proskauer
8. Prueba con rojo de metilo
9. Reduccin de nitratos
10. Prueba de fenilalanina
11. Prueba de Sulfuro, indol, movilidad: SIM
12. Agar hierro y triple azcar: TSI
13. Descarboxilacin de la arginina y lisina: LIA
14. Descarboxilacin de la ornitina: MIO
22
De acuerdo a la consistencia
1. Medios slidos. Son tiles para el crecimiento, aislamiento y
obtencin de cultivos puros de bacterias y hongos.
2. Medios semislidos. tiles para la observacin de
metabolismo, as como la propagacin y obtencin de cultivos
de bacterias anaerbicas.
3. Medios lquidos. Permiten la difusin del microorganismo.
De acuerdo a la composicin
1. Medios sintticos
Es aquel en el que se conoce la composicin qumica exacta
de los ingredientes.
2. Medio no sinttico
No se conoce de una manera definida la composicin
precisa de alguna o de todas las sustancias nutritivas.
23
26
27
28
30
3. Observar cambios en el
medio que rodea las colonias, que reflejan actividades
metablicas especficas de las bacterias recuperadas.
Figura 11. Agar BCYE
31
33
34
1. FERMENTACIN DE CARBOHIDRATOS
$"
Medio de cultivo: Caldo bsico rojo de fenol
Composicin:
a) Peptona 10g.
b) Extracto de carne 1g.
c) Cloruro de sodio 5g
d) Agua destilada 1000 ml.
e) Indicador de pH: Rojo de fenol
!"cido: Color amarillo (pH = 6.8)
!"Alcalino : Color rojo ( pH = 8.4)
!"Medio no inoculado: Rojo (pH = 7.4)
35
$"
Fundamento
La fermentacin es un proceso metablico de oxido-reduccin
que ocurre en un medio ambiente anaerobio y, en lugar de
oxgeno, un sustrato orgnico sirve como el aceptor final de
hidrgeno (electrones). En los sistemas de prueba
bacteriolgicos, este proceso se detecta observando cambios
de color en indicadores de pH a medida que se forman
productos cidos.
Las bacterias que fermentan un hidrato de carbono son por
lo general anaerobios facultativos. Por medio del proceso de
fermentacin un hidrato de carbono es degradado y
descompuesto en dos molculas de carbono (triosas) que son
nuevamente degradadas en un nmero de compuestos de 1,
2, 3 y 4 carbonos. Los productos finales varan con cada
especie bacteriana y depende del sistema enzimtico
existente en la especie y las condiciones del medio
ambiente.
El ms importante ciclo fermentativo de la degradacin de
la glucosa es el ciclo de Embden - Meyerhof aun cuando
ste tambin puede producirse por la derivacin de pentosa
o el ciclo de Entner - Duodoroff. Pueden utilizarse diversos
hidratos de carbono. La bacteria usada depende de las
dificultades que se presenten para identificar un organismo
determinado.
36
Indicador de pH + CHO
(aldehdos)
Bacteria
gluclisis
H2CO2
+
cambio de color
$"
Consistencia del medio
Lquido
$"
Inoculacin
Por difusin, inculo denso
$"
Condiciones de incubacin
Tiempo: 24 - 48 horas
Figura 12. Streptococcus
Temperatura: 35 - 37 C
37
$"
Resultados
NEGATIVO
MEDIO NO INOCULADO
POSITIVO
Figura 13. Pruebas bioqumicas de Fermentacin de Carbohidratos
$"
Interpretacin
Positiva = Color amarillo (cido)
Negativa = Color rosa - rojizo (alcalina)
Color naranja
38
$"
Observaciones
Existen ocasiones que con algunas especies de bacterias es
necesaria la incubacin ms prolongada, esto se recomienda
cuando aparece un color naranja, se incuban bajo las
mismas condiciones 24 horas ms. S aun as se presenta
este color la prueba se reporta como negativa ya que lo
ms probable es que el microorganismo est formando
productos metablicos que no necesariamente son por
fermentacin por ello no alcanza el color rojo esperado.
El hecho de incubar por 24 horas ms es poco prctico ya
que la mayor parte de las ocasiones se tiene el tiempo
necesario para la incubacin de 24 horas, por ello en este
manual se considera que la prueba se tome como negativa si
presenta un color naranja.
$"
Reporte de resultados
A = cido
K = alcalino
G = gas
39
$"
Aplicaciones
$"
Microorganismos fermentadores de carbohidratos:
Fermentadores de glucosa: Todos los miembros
de las Enterobacteriaceae.
Fermentadores de glucosa y lactosa:
Escherichia coli, Klebsiella y grupos
Enterobacter.
Fermentadores de manitol: Staphylococcus
aureus
Fermentadores de inositol: Proteus rettgeri
Fermentadores de lactosa: Neisseria lactamica
Fermentadores de adonitol: Providencia
alcaligenes.
Fermentadores de inulina: Streptococcus
salivarius y Streptococcus sanguis.
Yersinia
Fermentadores
de
sacarosa:
enterocolitica.
Listeria
Fermentadores
de
salicina:
monocytogenes.
40
$"
Microorganismos no fermentadores de Carbohidratos:
No
fermentadores
de
lactosa:
Enterobacterias patgenas como Salmonella y
Shigella.
No fermentadores de manitol: Staphylococcus
epidermidis.
No fermentadores de salicina: Especies de
Corynebacterium.
No fermentadores de rafinosa: Otras especies
de Aeromonas.
No fermentadores de inositol: Proteus
morganii.
No fermentadores de adonitol: Providencia
stuartii.
No fermentadores de inulina: Streptococcus
del grupo D.
No fermentadores de sacarosa: Otras
especies de Yersinia.
41
2. PRUEBA DE CITRATO
$"
Medio de cultivo: Citrato de Simmons
Composicin:
a) Sulfato de magnesio
b) Monofosfato de amonio
c) Fosfato dipotsico
d) Citrato de sodio
e) Cloruro de sodio
f) Agar
g) Agua destilada
h) Indicador de pH: Azul de bromotimol (pH= 6)
Alcalino: color azul de Prusia intenso (pH = 7.6)
Medio no inoculado: Color verde (pH = 6.9)
$"
Fundamento
Determina si un microorganismo es capaz de utilizar citrato
como nica fuente de carbono para el metabolismo y
crecimiento, provocando alcalinidad.
El medio incluye citrato de sodio, un anin como nica
fuente de carbono y fosfato de amonio como nica fuente
de nitrgeno.
42
Citrato
Oxalacetato
acetato
Piruvato + CO2
pH cido:
2 Piruvato
2 Piruvato
acetona + 2CO2
43
$"
Consistencia del medio
Slido inclinado (pico de flauta)
$"
Inoculacin
Se toma una colonia bien aislada de la superficie del medio
de aislamiento primario y se inocula como una estra nica
en la superficie del pico de flauta.
$"
Incubacin
Tiempo = 24 - 48 horas
Temperatura = 35 - 37 C
$"
Precauciones
El inculo debe ser liviano.
S ste es demasiado grande, compuestos orgnicos
preformados dentro de la pared celular de las bacterias
que estn muriendo pueden liberar suficiente carbono y
nitrgeno como para dar un resultado falso positivo.
44
$"
Resultados
MEDIO NO INOCULADO
POSITIVO
NEGATIVO
POSITIVO
Figura 14. Pruebas bioqumicas de citrato
45
POSITIVO
$"
Interpretacin
Positivo: Crecimiento aunque no exista cambio de color.
Crecimiento y el medio de color azul intenso en
pico de flauta.
Negativo: No se observa crecimiento y medio de color
verde.
Si se utiliza carbono a partir de citrato de sodio, tambin
se extrae nitrgeno del fosfato de amonio contenido en el
medio, liberndose amoniaco. En ocasiones se detecta un
crecimiento visible a lo largo de la lnea de siembra antes
de la aparicin de color. Este crecimiento visible tambin
indica resultado positivo.
$"
Reporte de resultados
Negativo
(-)
Positivo
(+)
46
$"
Aplicaciones
$"
Microorganismos positivos
Especies de:
Salmonella
Arizona
Citrobacter
Enterobacter
Klebsiella
Serratia licuefaciens
Pseudomonas cepacia
$"
Microorganismos negativos
Edwarsiella
Yersinia enterocoltica
Escherichia coli
Shigella
Yersinia pseudotuberculosis
Otras especies de Moraxella
Proteus morganii
47
3.
PRUEBA
GELATINA
DE
LICUEFACCIN
DE
$"
Medio de cultivo: Gelatina nutritiva
Composicin:
a) Extracto de carne
b) Peptona
c) Gelatina
d) Agua destilada
$"
Fundamento
Determinar la capacidad de un organismo de producir
enzimas de tipo proteoltico (gelatinasas) que licuan la
gelatina.
Las protenas que se producen naturalmente son demasiado
grandes para entrar en una clula bacteriana; por lo tanto,
para que una clula utilice las protenas, primero deben ser
catabolizadas en componentes ms pequeos. Las enzimas
exonucleares de tipo proteltico, gelatinasas, son
secretadas por ciertas bacterias para desdoblar a las
protenas y esta capacidad ayuda a la identificacin
bacteriana.
48
gelatinasas
Protena + H2O
polipptidos
Proteasas
gelatinasas
Polipptidos + H2O
Peptidasas
aminocidos
individuales
$"
Consistencia del medio
Semislido
$"
Inoculacin
Picadura en posicin vertical hasta una profundidad de 2 2.5 cm, inculo denso.
$"
Condiciones de incubacin
Tiempo: 18 - 24 horas
Temperatura: 35 - 37 C
Al trmino de la incubacin se coloca el tubo en un
refrigerador o bao de hielo durante dos horas para
determinar si se ha producido o no la digestin de la
gelatina (licuefaccin).
49
$"
Resultados
MEDIO NO
INOCULADO
NEGATIVO
POSITIVO
$"
Interpretacin
Positivo: Medio licuado (estado lquido)
Negativo: Medio slido
$"
Reporte de resultados
Positivo
(+)
Negativo (-)
$"
Aplicaciones
$"
Microorganismos positivos
Staphylococcus aureus
Staphylococcus epidermidis (lenta)
Serratia liquefaciens
Serratia marcescens
Pseudomonas aeruginosa
Especies de Flavobacteriumm
$"
Microorganismos negativos
Listeria monocytogenes
51
1. Fermentacin de lactosa
Cuando un organismo es capaz de fermentar lactosa,
produce principalmente cido lctico, con una condicin
cida indicada por el cambio de color del medio que se
vuelve rojo rosado. A veces el cido butrico es el producto
final.
Ciertas bacterias que forman lcalis no fermentan
lactosa, pero actan sobre las sustancias nitrogenadas que
se encuentran en la leche liberando amoniaco, y dando en
consecuencia un pH alcalino que se manifiesta por un color
prpura azulado.
Lactosa
Glucosa
glucosa + galactosa
cido pirvico
cido lctico
cido butrico
CO2 + H2
3. Formacin de cogulo
Las enzimas proteolticas provocan la hidrlisis de las
protenas de la leche lo que da como resultado su
coagulacin. La principal enzima responsable de la formacin
de cogulo es la renina.
La formacin del cogulo es causada por la precipitacin de
la casena, por la formacin de cidos o por la conversin de
la casena en paracasena por la enzima renina. La casena es
una fosfoprotena compleja y es la protena ms importante
de la leche.
Formacin de un cogulo cido
La precipitacin de la casena provocada por los cidos
orgnicos a partir de lactosa en condiciones cidas produce
un cogulo firme y gelatinoso que no se separa de las
paredes del tubo.
Lactosa
cido lctico
caseinasa
c. Lctico + casenato de Ca
54
caseingeno (pp)
paracasena (pp)
Ca
4. Peptonizacin (digestin)
La hidrlisis de la casena por la actividad enzimtica
produce una conversin final del precipitado caseingeno en
un lquido claro; el proceso se denomina peptonizacin y se
manifiesta por una aclaracin acuosa del medio causada por
una digestin del precipitado (cogulo) y las protenas de la
leche por las enzimas proteolticas de las bacterias. Sin
embargo, solo se produce una peptonizacin cuando la
bacteria que se desarrolla en la leche tornasolada contiene
la enzima proteoltica caseinasa.
55
5. Formacin de gas
Los gases CO2 y H2 se forman como resultado final de la
fermentacin de la lactosa.
$"
Consistencia del medio
Lquido
$"
Inoculacin
Difusin
$"
Condiciones de incubacin
Tiempo: 18-48 horas
Temperatura: 35 - 37 C
56
$"
Resultados
Medio no
inoculado
Fermentacin
de lactosa
Digestin
Reduccin
de tornasol
No fermentacin
de lactosa
$"
Interpretacin
Rojo rosado: cido; fermentacin de lactosa
Azul purpreo: No fermentacin de lactosa; sin cambio del
indicador de pH.
Azul: Alcalino; Ausencia fermentacin de lactosa. El
organismo ataca las sustancias nitrogenadas que se
encuentran en el medio.
Blanco: Reduccin del tornasol a una leucobase.
Formacin de cogulo: Coagulacin de la protena de la
leche.
Aclaracin del medio: Digestin; se a ingerido la protena de
la leche.
Gas: Produccin de burbujas en la campana de Durham.
57
Cogulo
$"
Reporte de resultados
En la tabla de resultados solo se escribirn las letras que
aparecen dentro del parntesis.
Rojo rosado (A)
Azul purpreo (SC)
Azul (K)
Blanco (Red)
Cogulo (C)
Digestin (D)
Gas (G)
$"
Aplicaciones
Ayuda a la diferenciacin de especies sobre todo del
gnero Clostridium.
Sin crecimiento:
Clostridium cochlearium
C. difficile
C. putrefaciens
C. tetanomorphum
Streptococcus equinus
Con crecimiento:
Streptococcus bovis
58
$"
Fundamento
Permite diferenciar organismos por su capacidad de reducir
el azul de metileno en un medio con leche. El sistema
citocromo oxidasa activa la oxidacin del citocromo
reducido por el oxgeno molecular que a su vez acta como
un aceptor de electrones en el periodo terminal del sistema
de transferencia de electrones. Cuando existen condiciones
aerbicas el oxgeno es el aceptor final del hidrgeno,
produciendo agua o perxido de hidrgeno segn la especie
bacteriana y su sistema enzimtico.
59
N(CH3)2
(CH3)2N
N(CH3)2
(CH3)2N
S
$"
Consistencia del medio
Lquido
$"
Inoculacin
Difusin, inculo denso
60
$"
Condiciones de incubacin
Tiempo: 18-24 horas
Temperatura: 35 - 37 C
$"
Resultados
MEDIO NO
INOCULADO
NEGATIVO
$"
Interpretacin
Positiva: Incoloro; reduccin
Negativa: Azul; no hay reduccin
61
POSITIVO
$"
Reporte de resultados
R = Reduccin
(-) = Negativo, sin cambio de color
$"
Aplicaciones
Esta capacidad enzimtica se utiliza fundamentalmente
para
diferenciar
los
enterococos
(especies
de
Streptococcus del grupo D) de otros miembros del gnero
Streptococcus.
$"
Microorganismos positivos
Enterococos (Streptococcus del grupo D)
$"
Microorganismos negativos
Especies de Streptococcus que por lo general no son
enterococos.
62
$"
Fundamento
Determina el metabolismo oxidativo o fermentativo de un
hidrato de carbono.
63
$"
Consistencia del medio
Semislido (tambin permite la observacin de movilidad).
$"
Inoculacin
Picadura, inculo poco denso. Picar
aproximadamente hasta 0.6 mm de fondo.
65
ambos
tubos
$"
Condiciones de incubacin:
Tiempo: 18 - 24 horas
Temperatura: 35-37 C
$"
Resultados
MEDIO NO INOCULADO
FERMENTADOR
OXIDANT E NO FERMENTADOR
NO OXIDANT E NO FERMENTADOR
66
$"
Interpretacin
Amarillo: cido
Burbujas: Gas
Verde: alcalino
Incubacin
Fermentador
Oxidativo
No
fermentador
No
oxidativo
No
fermentador
$"
Aplicaciones
1. Fundamentalmente para diferenciar gneros
intestinales no entricos, Gram negativos de la Familia
Enterobacteriaceae.
67
$"
Reporte de resultados
Metabolismo
Oxidacin (O)
Fermentacin (F)
Fermentacin (F)
Tubo
c/reaccin
Abierto
Cubierto
Cubierto
Ni
fermentacin
ni oxidacin (-)
Ninguno
Fermentacin
y
oxidacin (O+F)
Ambos
68
Amarillo (A)
Amarillo (A)
Amarillo (AG)
Azul o verde (-)
Verde (-)
Amarillo (A)
Amarillo (AG)
Verde (-)
Amarillo (A
AG)
Amarillo (A
AG)
6. REACCIN DE LA UREASA
$"
Medio de cultivo: Agar urea de Christensen
Composicin:
a) Peptona
b) Cloruro de sodio
c) Fosfato monopotsico
c) Glucosa
d) Urea
e) Agar
f) Agua destilada
g) Indicador de pH: Rojo de fenol
!"cido: Amarillo (pH = 6.8)
!"Alcalino : Rojo rosado (pH = 8.4)
!"Medio no inoculado: Amarillo (pH = 6.8)
$"
Fundamento
Determina la capacidad de un organismo de desdoblar la
urea formando dos molculas de amoniaco por la accin de la
enzima ureasa produciendo un cambio de color rojo en el
medio.
La hidrlisis de la urea es catalizada por la ureasa, para dar
dos molculas de amoniaco. La ureasa es una importante
enzima microbiana vinculada con la descomposicin de los
compuestos orgnicos.
69
H2N
H2 N
C=O + 2 HOH
Urea
$"
Consistencia del medio
Slido en pico de flauta (cola de pescado)
$"
Inoculacin
Estra en pico de flauta (no hacer puncin).
$"
Condiciones de incubacin
Tiempo: 18-24 horas
Temperatura: 35-37 C
70
(XH4)2CO2
$"
Resultados
MEDIO NO INOCULADO
NEGATIVO
POSITIVO
POSITIVO
$"
Interpretacin
Positivo: Rojo rosado intenso en el pico de flauta
Negativo: Amarillo
$"
Reporte de resultados
Positivo (+)
Negativo (-)
71
$"
Observaciones
En muchas especies, la reaccin positiva de ureasa se
detecta primero por un cambio de color rojo en la parte de
pico de flauta, el cual, al principio se vuelve rojo porque la
accin alcalina, resultado de la degradacin de pequeas
cantidades de urea, es aumentada por las aminas formadas
a partir de la descarboxilacin oxidativa de los aminocidos
en la parte del medio expuesta al aire.
$"
Aplicaciones
1. Se usa para diferenciar los organismos Proteus
rpidamente ureasa positivos de otros miembros de las
enterobacterias, otros gneros pueden ser positivos
retardados.
-
Klebsiella (+)
Escherichia coli (-)
Proteus (+ rpido)
Providencia (-)
72
Composicin:
a) Polipeptona
b) Dextrosa
c) Fosfato de potasio
d) Agua destilada
$"
Fundamento
Determina la capacidad de algunos organismos de producir
un producto final neutro, la acetona a partir de la
fermentacin de glucosa.
La reaccin de VP se basa en la deteccin de acetona como
producto final neutro derivado del metabolismo de la
glucosa. sta es metabolizada en cido pirvico,
intermediario clave en la gluclisis. A partir del cido
pirvico, una bacteria puede seguir muchas vas. La
produccin de acetona (precursor de la produccin de 2,3butanediol) que es uno de los ciclos para la degradacin de
la glucosa en las bacterias. La formacin de acetona y
butilenglicol es una va alternativa del metabolismo del cido
pirvico. Las bacterias que utilizan esta va producen solo
pequeas cantidades de cidos mixtos que son insuficientes
73
para disminuir
bastante como
motivo muchas
positivas, con
viceversa.
O H
C H 3
C H 3
O2 OXIDADO
+
KOH
C H O H
Alfa-naftol (catalizador)
C H 2
C H 2
Diacetilo
Acetona
+
N H 2
N H
C
N H
condensacin
Color rojo rosado
Ncleo de guanidina
74
$"
Consistencia del medio
Lquido
$"
Inoculacin
Difusin
$"
Condiciones de incubacin
Tiempo: 24 - 48 horas
Temperatura: 35-37 C
$"
Reactivos adicionales
a) Alfa naftol al 5%, intensificador del color
b) Hidrxido de potasio 40%, agente oxidante
Agregar directamente los reactivos al tubo despus de la
incubacin en el siguiente orden:
1) 0.6ml de alfa naftol
2) 0.2ml de KOH
3) Agitar el tubo suavemente, dejar reposar de 10 a
15 minutos antes de la interpretacin.
75
$"
Precauciones
El orden de adicin de los reactivos es importante, ya que la
inversin de incorporacin dar como resultado un dbil
positivo o falso negativo.
No debe excederse un volumen exacto de KOH ya que el
exceso puede ocultar una reaccin VP dbilmente positiva.
$"
Resultados
POSITIVO
NEGATIVO
MEDIO NO
INOCULADO
$"
Interpretacin
Positivo: Rojo rosado en la superficie del medio (presencia
de acetona).
Negativo: Amarillo. Puede formarse un color cobrizo pero
an as la reaccin es negativa.
76
$"
Reporte de resultados
Positivo (+)
Negativo (-)
$"
Aplicaciones
$"
Microorganismos positivos
- Klebsiella pneunoniae
- Yersinia enterocolitica
$"
Microorganismos
negativos
-Escherichia coli
-K. ozaenae
77
$"
Fundamento
Comprobar la capacidad de un organismo de producir y
mantener estables los productos terminales cidos de la
fermentacin de la glucosa y vencer la capacidad
amortiguadora del sistema. Es una prueba cualitativa de la
produccin de cido (determinacin de pH). Las bacterias
que principalmente siguen la va de fermentacin de cidos
mixtos a menudo producen suficiente cido para mantener
un pH menor de 4.4.
78
$"
Consistencia del medio
Lquido
$"
Inoculacin
Difusin
79
$"
Condiciones de incubacin
Tiempo: 48 horas
Temperatura: 35-37 C
$"
Reactivos adicionales para Rojo de Metilo
Rojo de metilo. Adicionar 5 gotas al tubo previamente
incubado.
Interpretar el resultado del color inmediatamente.
Conservacin: Guardar el reactivo en refrigeracin (4 C)
mientras no se usa.
$"
Resultados
NEGATIVO
MEDIO NO INOCULADO
POSITIVO
80
$"
Interpretacin de rojo de metilo
No debe intentarse interpretar un resultado con el rojo de
metilo despus de menos de 48 horas de incubacin.
Positiva: Rojo en la superficie del medio (pH = 4.4)
Algunas bacterias pueden producir menores cantidades de
cido a partir del sustrato por ello es posible que aparezca
un color naranja. Esto indica una prueba positiva.
Negativo: Amarillo (pH = 6) naranja
$"
Reporte de resultados
Positivo (+)
Negativo (-)
$"
Aplicaciones
!"Microorganismos positivos
- Escherichia coli
- Especies de Yersinia
Figura 27.
!"Microorganismos negativos
Enterobacter aerogenes
Enterobacter cloacae
Klebsiella
81
$"
Fundamento
Determinar la capacidad de un organismo de reducir el
nitrato en nitritos o en nitrgeno libre.
La reduccin de nitrato en nitrito y en gas nitrgeno tiene
lugar generalmente en condiciones anaerobias, en las cuales
un organismo obtiene su oxgeno del nitrato. El oxgeno
sirve como un aceptor de hidrgeno.
Reduccin del nitrato en nitrito
NO3 + 2 e 2 H+
Nitrato
NO2 + H2O
nitrito
82
N2 + 6 H2O
NH2
+ HNO2
NH2
SO2H
SO2H
cido sulfanilico
(incoloro)
NH2
P-sulfobenceno-azo-affa-naftilamina
(rojo)
Alfa-naftilamina
Zn
+
CH2COOH
cido actico
SO2H
NH2
83
(C6H3NHNH3) OSO3H
Arilhidracina
$"
Consistencia del medio
Lquido
$"
Inoculacin
Difusin, inculo denso.
$"
Condiciones de incubacin
Tiempo: 18-24 horas
Temperatura 35 - 37 C
Raramente es necesaria una incubacin prolongada de hasta
5 das. La mayora de los organismos capaces de reducir el
nitrato, lo hacen dentro de las 24 horas.
$"
Reactivos adicionales
1. Alfa - naftilamina 0.05 %
2. cido sulfanilico 0.8 %
Adicionar directamente al tubo de reaccin en el siguiente
orden:
1. Alfa - naftilamina 1 ml.
2. cido sulfanilico 1 ml.
84
$"
Resultados
MEDIO NO INOCULADO
POSITIVO
NEGATIVO
$"
Interpretacin
Se interpretan los resultados un minuto despus de adicionar
los reactivos.
Positivo: rosa a rojo intenso
Negativo: Amarillo
85
$"
Precauciones
Una prueba negativa indica que los nitratos, no han sido
reducidos o que han sido reducidos a otros productos, como
amoniaco, nitrgeno molecular, oxido ntrico u xido nitroso
e hidroxilamina.
Dado que los reactivos de prueba detectan solo nitritos, este
ltimo proceso llevara a una lectura falsa negativa. Por
ende es necesario agregar una pequea cantidad de polvo de
zinc a todas las reacciones negativas.
Los iones zinc reducen nitratos a nitritos y la aparicin de
color rojo despus del agregado de zinc indica una reaccin
positiva.
$"
Reporte de resultados
Positivo (+)
Negativo (-)
$"
Aplicaciones
Ayuda a la identificacin de Enterobacterias que por lo
general son positivas.
Todas las Enterobacterias, con excepcin de ciertos tipos de
Enterobacter agglomerans y especies de Erwinia, reducen
nitratos a nitritos.
86
$"
Fundamento
Determina la capacidad de un organismo de desaminar la
fenilalanina en cido fenilpirvico por su actividad
enzimtica, con la consiguiente acidez resultante.
El aminocido aromtico fenilalanina sufre una desaminacin
oxidativa catalizada por un aminocido oxidasa para producir
el cido cetnico.
La desaminacin oxidativa da como resultado la extraccin
del grupo amino del aminocido para formar un doble enlace
alfa-cetocido y libre de amoniaco.
87
CH2
CH
COOH
- 2H
NH2
1/2 O
FLAVOPROTENA
FENILALANINA
CH2
COOH
NH2
AMONIACO
CIDO FENILPIRVICO
COOH
CH2
N
O + RNH
NH2
Hidracina
cido fenilpirvico
Fenilhidrazona
$"
Consistencia del medio
Slido en pico de flauta
$"
Inoculacin
Estra en pico de flauta, inculo denso.
89
COOH
NHR
$"
Condiciones de incubacin
Tiempo: 18-24 horas
Temperatura 35 - 37 C
$"
Reactivos adicionales
Cloruro frrico 10%
Adicionar de 4-5 gotas a un tubo incubado
Hacer rotar suavemente el tubo para que el crecimiento se
separe.
Esperar de 1 a 5 minutos para leer la reaccin.
Conservacin: Guardar los reactivos en refrigeracin y
colocarlos
en
frascos
oscuros
para
evitar
la
descomposicin.
$"
Aplicaciones
Esta actividad enzimtica es caracterstica de todas las
especies de Proteus y del grupo Providencia, y se usa para
separar estos dos gneros de otros miembros de las
Enterobacterias.
90
$"
Resultados
MEDIO NO
INOCULADO
POSITIVO
NEGATIVO
NEGATIVO
$"
Interpretacin
Positiva: Rojo claro a intenso en el pico de flauta.
Negativo: Amarillo
$"
Reporte de resultados
Positivo (+)
Negativo (-)
91
$"
Fundamento
Determinar si un organismo es mvil o inmvil, si es capaz de
liberar cido sulfhdrico por accin enzimtica de los
aminocidos que contienen azufre produciendo una reaccin
visible de color negro y por ltimo la capacidad de
desdoblar el indol de la molcula triptfano, adems que la
consistencia del medio permite la observacin de la
movilidad de algunas bacterias.
1. Produccin de cido sulfhdrico
2. Produccin de indol
3. Movilidad
92
Primera etapa:
La bacteria reacciona con el tiosulfato de sodio por medio
de una reaccin de reduccin que da un sulfito y un sulfato.
Este es un proceso de respiracin anaerbica donde el
tomo de azufre sirve como aceptor de electrones para la
oxidacin de los sustratos orgnicos. El tiosulfato
reemplaza al sulfato como aceptor de electrones y es una
fuente de azufre para el organismo.
Segunda etapa:
El gas incoloro SH2 reacciona con una sal pesada, citrato
frrico de amonio para producir un precipitado negro
insoluble, sulfuro ferroso.
93
gas SH2
$"
Agar sulfito de bismuto
$"
Agar citrato sulfuro
$"
Agar desoxicolato - citrato
$"
Medio LIA
$"
Medio TSI
$"
Agar acetato de plomo
$"
Agar S-S
$"
Agar XLD
$"
Medio SIM
95
COOH
NH
T rip to fa n a s a
H 2O
D e s a m in a c i n
L - T r ip t f a n o
+
H
N H
COOH
H
In d o l
c id o P ir v ic o
A m o n ia c o
3. Movilidad
Determina si un organismo es mvil o inmvil. Las bacterias
tienen movilidad por medio de sus flagelos, que se
encuentran principalmente entre los bacilos; sin embargo
algunas formas de cocos son inmviles.
Las bacterias mviles pueden contener un solo flagelo o
muchos; adems su localizacin vara
con su especie bacteriana y las
condiciones de cultivo. A veces, las
bacterias con movilidad producen
variantes no mviles que parecen ser
estables y raramente se revierten en
formas mviles.
Figura 30. Salmonella typhi
96
$"
Consistencia del medio
Semislido en forma vertical
$"
Inoculacin
Picadura en forma vertical
$"
Condiciones de incubacin
Tiempo: 24 - 48 horas
Temperatura 35 - 37 C
Los cultivos que van a someterse a pruebas de indol debern
ser incubados aerbicamente el descenso de la tensin de
oxgeno disminuye la produccin de indol.
97
$"
Reactivos adicionales
Prueba de indol
Reactivo de Kovacs
Adicionar 5 gotas y agitar suavemente el tubo
Interpretar inmediatamente.
Conservacin: Los reactivos debern guardarse en el
refrigerador (4 C) mientras no se usan, su estabilidad es
variable, por lo tanto se har todas las semanas un control
de calidad, desechndolos si muestran una reaccin dbil o
negativa con un organismo positivo conocido.
$"
Reporte de resultados
PRUEBA
Sulfuro
Indol
Movilidad
POSITIVO
+
+
+
98
NEGATIVO
-
$"
Resultados
INDOL
NEGATIVO
INDOL
POSITIVO
MEDIO SIN
INOCULAR
H2S
POSITIVO
GAS
Figura 31. Pruebas bioqumicas del medio SIM
$"
Interpretacin
1.
cido sulfhdrico
H2S
NEGATIVO
2.
Indol
3.
Movilidad
100
$"
Aplicaciones
Bacterias
Produccin de
H2 S
Produccin de Movilidad
indol
Salmonella
typhi
+o-
Salmonella
+o-
E. coli
+o-
Klebsiella
+o-
Enterobacter
Citrobacter
Shigella
+o-
+o-
101
12.
$"
Medio de cultivo: Agar hierro triple azcar (agar hierro
de Kligler, AHK)
Composicin:
f) Extracto de carne
g) Extracto de levadura
h) Peptona
i) Proteasa
j) Lactosa
k) Dextrosa
l) Sulfato ferroso
m) Cloruro de sodio
n) Tiosulfato de sodio
o) Agar
p) Agua destilada
q) Indicador: Rojo de fenol
!"cido: amarillo
!"Alcalino: rojo
!"Medio no inoculado: naranja rojizo (pH =7.4)
102
$"
Fundamento
Determina la capacidad de un organismo de atacar un hidrato
de carbono especfico incorporado en un medio de
crecimiento bsico, con produccin o no de gases, junto con la
determinacin de posible cido sulfhdrico.
El agar AHK es un medio diferencial que determina tanto la
fermentacin de los hidratos de carbono y la produccin de
cido sulfhdrico. Las bacterias pueden utilizar cualquiera de
los sustratos incorporados en el medio y ser metabolizados,
caractersticas que son utilizadas para la diferenciacin de
stas, principalmente para las Enterobacterias.
Este medio contiene lactosa con una concentracin de 1% y
glucosa 0.1%, lo cual permite la observacin de la
fermentacin de uno o de ambos carbohidratos por parte de
las bacterias, adems de la produccin de gas y de cido
sulfhdrico.
La fermentacin es un proceso que se lleva acabo en
condiciones aerbicas (pico de flauta) y anaerbicamente
(capa inferior). En el pico de flauta la glucosa (monosacrido)
es catabolizada inicialmente por medio del ciclo anaerbico de
Embden-Meyerhof, utilizado tanto por los aerobios como por
los anaerobios para dar cido pirvico, y posteriormente ste
ser degradado a travs del ciclo de Krebs para dar CO2, H2O
y energa.
103
Beta-galactosidasa
Lactosa
glucosa + galactosa
Ciclo de Krebs
Glucosa o galactosa
105
106
$"
Resultados
K/A
K/A
MEDIO
MEDIO
NO INO CULADO
NO INO CULADO
K/K
K/K
A/A
A/A
107
GAS
GAS
H2S
H2S
$"
Interpretacin
1. Rojo en pico de flauta: alcalino; degradacin aerbica de
glucosa.
Amarillo en capa profunda: cido; degradacin anaerbica
de la glucosa.
2. Amarillo en pico: cido
Amarillo en capa profunda: cido
3. Rojo en pico de flauta: alcalino
Sin cambio de color en capa profunda: alcalina.
4. Produccin de H2S: precipitado negro
5. Produccin de gases: Produccin de burbujas,
descomposicin del medio, ligera muesca del medio sobre
el costado del tubo o desplazamiento del medio del fondo,
dejando un espacio libre.
$"
Observaciones
Una bacteria productora de H2S puede dar tal cantidad de
precipitado negro de sulfuro ferroso que oculte
completamente la acidez producida en la capa profunda. Sin
embargo, si se forma H2S es que existe en la capa profunda
una condicin cida, aun cuando no se observe, y debe ser
registrada como tal.
Es esencial que se interprete la fermentacin al trmino de
18 24 horas de incubacin, ya que una interpretacin
prematura o demorada dar formas de fermentacin no
vlidas que llevarn a errores en el agrupamiento del gnero
o especie.
108
$"
Reporte de resultados
1. K / A (Fermentacin de glucosa solamente)
2. A / A (Fermentacin de glucosa y lactosa)
3. K / K (No fermentacin de glucosa y lactosa).
Los resultados se escriben siempre siguiendo un patrn.
Primero la reaccin del pico de flauta seguida por la reaccin
de la capa profunda, separadas por una barra.
$"
Reacciones de TSI
Pico de flauta alcalino / profundidad alcalina (K/K). No
fermentacin de hidratos de carbono. Caracterstico de
bacterias no fermentadoras como Pseudomonas aeruginosa.
Pico de flauta alcalino / profundidad cida (K/A). Glucosa
fermentada, lactosa no fermentada. Caracterstico de
bacterias no fermentadoras de lactosa como especies de
Shigella.
Pico de flauta alcalino / profundidad cida (negra)
(K/A/H2S). Glucosa fermentada, lactosa no fermentada;
produccin de H2S. Caracterstico de bacterias no
fermentadoras de lactosa y productoras de H2S como:
Salmonella, Arizona, Citrobacter y algunas especies de
Proteus.
109
No fermentador
No fermentacin
pH = 7.4
Aminas
Pptidos
O2
No fermentador de lactosa
Dextrosa
cidos mixtos
Dextrosa
cidos mixtos
Aminas
Aminas
Pptidos
Pptidos
O2
O2
O2
Aminas
Pptidos
$"
Aplicaciones
Este tipo de pruebas se utilizan principalmente para la
identificacin primaria de los miembros de las
Enterobacterias.
110
Especie
bacteriana
Enterobacter
Hafnia
Klebsiella
E. coli
Shigella
Salmonella
typhi
S. paratyphi
S.
choleraesuis
Otras
Salmonellas
Citrobacter
Edwarsiella
Serratia
Proteus
vulgaris
P. mirabilis
P. morganii
P. rettgeri
Providencia
A
K
A
A
K
K
K
A
A
A
A
A
++
+
++
+
-
K
K
A
A
+
+
+++
K
K
K
K
A
A
A
A
+
+
+
+++
+++
+++
K
K
K
K
A
A
A
A
111
+
+++
+o-
$"
Fundamento
Mide la capacidad enzimtica de un organismo para
descarboxilar un aminocido (lisina y arginina) para formar
una amina, con la consiguiente alcalinidad.
112
$"
Consistencia del medio
Slido en pico de flauta
$"
Reporte
resultados
$"
Inoculacin
Por picadura y estra, inculo liviano.
$"
Condiciones de incubacin
Temperatura: 35 37 C
Tiempo: 18 24 horas
113
de
A = cido
K = Alcalino
N = Neutra
R = Rojo (desaminacin
oxidativa)
$"
Resultados
K/K
K/K
H2S
H2S
K/A
K/A
GAS
GAS
MEDIO
MEDIO
NO INOCULADO
H2S
H2S
K/K
K/K
NO INOCULADO
$"
Interpretacin
K/K = azul de Prusia /azul de Prusia
Desaminacin oxidativa / descarboxilacin
K/A= azul de prusia / lila
No desaminacin
Produccin de H2S = Ennegrecimiento del medio
Produccin de gas = Burbujas o levantamiento del
medio de cultivo de las paredes del tubo.
114
$"
Aplicaciones
Especie
bacteriana
Superficie
inclinada
Fondo
Gas
H2S
E. coli
KoN
-o+
Shigella
Salmonella
typhi
+o-
S. paratyphi
+o-
-o+
Otras
Salmonellas
KoN
Arizona
KoN
Citrobacter
-o+
+o-
Edwarsiella
-o+
Klebsiella
KoN
+o-
Enterobacter
cloacae
+o-
E. aerogenes
KoN
E. hafniae
KoN
-o+
Proteus
vulgaris
P. mirabilis
P. morgarnii
KoR
P. rettgeri
Providencia
115
$"
Fundamento
El medio MIO se utiliza para la identificacin de
Enterobacterias sobre la base de movilidad, la produccin de
ornitina descarboxilasa y de indol.
1. Descarboxilacin de ornitina
2. Produccin de indol
3. Movilidad
116
1. Descarboxilacin de ornitina
Mide la capacidad enzimtica de un organismo para
descarboxilar un aminocido (ornitina) para formar una
amina, con la consiguiente alcalinidad.
La descarboxilacin es el proceso mediante el cual las
bacterias que poseen enzimas descarboxilasas especficas
son capaces de atacar a los aminocidos en su grupo
carboxilo dando una amina o una diamina y anhdrido
carbnico. La descomposicin de los aminocidos se produce
anaerbicamente. El proceso de descarboxilacin es
irreversible, no oxidativo y requiere una coenzima comn, el
fosfato de piridoxal.
El aminocido L-lisina sufre la descarboxilacin para dar
cadaverina y CO2 por accin de la enzima especfica lisinadescarboxilasa.
El aminocido L-ornitina es descarboxilado por la enzima
ornitina descarboxilasa para dar la diamina putrescina y CO2,
producidos en condiciones anaerobias.
117
118
3. Movilidad
Determina si un organismo es mvil o inmvil. Las bacterias
tienen movilidad por medio de sus flagelos, que se
encuentran principalmente entre los bacilos; sin embargo
algunas formas de cocos son inmviles.
Las bacterias mviles pueden contener un solo flagelo o
muchos; adems su localizacin vara con su especie
bacteriana y las condiciones de cultivo. A veces, las
bacterias con movilidad producen variantes no mviles que
parecen ser estables y raramente se revierten en formas
mviles. Los organismos no mviles carecen de flagelos.
$"
Consistencia del medio
Semislido en forma vertical
$"
Inoculacin
Por picadura, en forma vertical
119
$"
Condiciones de incubacin
Tiempo: 24 48 horas
Temperatura: 35 37 C
$"
Reactivos adicionales
Prueba de indol
Reactivo de Kovacs
Adicionar 5 gotas y agitar suavemente el tubo
Interpretar inmediatamente.
Conservacin: Los reactivos debern guardarse en el
refrigerador (4 C) mientras no se usan su estabilidad es
variable, por lo tanto se har todas las semanas un control
de calidad, desechndolos si muestran una reaccin dbil o
negativa con un organismo positivo conocido.
120
$"
Resultados
ORNITINA POSITIVO
MOTILIDAD NEGATIVO
ORNITINA NEGATIVO
MOTILIDAD POSITIVO
INDOL
NEGATIVO
INDOL
POSITIVO
MEDIO NO
INOCULADO
$"
Interpretacin
1.
Ornitina descarboxilasa
121
2.
Indol
3.
Movilidad
122
$"
Reporte de resultados
Prueba
Positivo
Negativo
Movilidad
Indol
Ornitina
+
-
+
-
+
-
$"
Aplicaciones
$"
Microorganismos ornitina positivos
Especies de Enterobacter
Proteus mirabilis
Proteus morganii
Yersinia enterocolitica
$"
Microorganismos ornitina negativos
Especies de Klebsiella
Enterobacter aglomerans
Proteus vulgaris
Proteus rettgeri
Yersinia pestis
Yersinia pseudotuberculosis
123
Bacterias
Produccin
de indol
Movilidad
Produccin
de H2S
Salmonella
typhi
+o-
Otras
Salmonellas
+o-
E. coli
+o-
+o-
Enterobacter
Citrobacter
+o-
+o-
Klebsiella
Shigella
124
macromolculas
(cpsulas,
125
127
PRODUCCIN DE ENERGA
Las clulas en crecimiento requieren una provisin constante
de energa metablica, en una forma que pueda ser usada
para la biosntesis. El mundo microbiano ha desarrollado
modelos productores de energa extraordinariamente
128
129
I. Gluclisis
Se refiere a la degradacin de la glucosa hasta piruvato. La
gluclisis puede ocurrir en condiciones aerobias o anaerobias.
En aerobiosis generalmente funciona en conjunto con el ciclo
de Krebs en el cual el piruvato se oxida hasta CO2 y agua. En
anaerobiosis el piruvato se lleva a la fermentacin.
En la gluclisis ocurren dos fosforilaciones a nivel del
sustrato:
1) En el paso de 3-fosfoglicerato a 2-fosfoglicerato en
donde se sintetiza un ATP.
2) En el ltimo paso de la va, en la transformacin de
fosfoenilpiruvato a piruvato, en donde se forma otro
ATP.
130
132
GLUCLISIS
2 ADP
Glucosa
fosfoenolpiruvato
2 ATP
ADP
ATP
piruvato
H2O
2 2-fosfoglicerato
Glucosa-6-fosfato
2 3-fosfoglicerato
Fructosa-6-fosfato
ATP
2 ADP
ADP
2 ATP
2 1,3-bifosfoglicerato
Fructosa-1,6-bifosfato
2 NAD
2 PO4
3-fosfogliceraldehdo
Dihidroxiacetona fosfato
Esquema 1. Gluclisis
133
2 NADH
134
136
137
VA HEXOSA FOSFATO
Fructosa -5-P
Eritrosa -4-P
Fructosa -5-P
N ADPH
Sedoheptulosa -7-P
N ADP
Xilusa -5-P
Glucosa-6-fosfato
Gliceraldehdo -3-P
GL UC OL I S I S
Glucosa
5-P-gluconato
N ADPH
138
Gliceraaldehdo
Ribulosa-5-P
-3-P
CO2
Ribosa -5-p
N ADP
CICLO DE KREBS
Es el proceso de la respiracin mediante el cual, las clulas
aerbicas obtienen energa a partir de la oxidacin de las
molculas combustibles por el oxgeno molecular.
El ciclo de los cidos tricarboxlicos es una secuencia de
reacciones que tiene efecto en los organismos aerbicos.
Esta catalizada por un sistema multienzimtico que acepta el
grupo acetilo del acetil CoA como combustible degradndolo
hasta CO2 y H+. Estos ltimos son conductores a travs de
una secuencia de protenas transportadoras de electrones
hasta el oxgeno molecular, que se reduce para formar agua.
El piruvato ocupa una posicin clave en las diferentes rutas
de degradacin de carbohidratos, es el principal producto de
la gluclisis y puede sufrir una gran variedad de
transformaciones, dependiendo de s el organismo se
encuentra en un ambiente aerobio o anaerbico:
1. En aerobiosis el piruvato pasa al ciclo de Krebs.
2. En anaerobiosis puede ser transformado en alcoholes o
cidos.
Mediante la descarboxilacin del cido pirvico se forman
compuestos con dos tomos de carbono que se unen a
continuacin con la molcula aceptora adecuada (cido
oxalactico) y entrar a formar parte del ciclo de los cidos
tricarboxilicos (TCC) y mediante una serie de reacciones
139
NAD
CoA
Piruvato
CoA
CO2
Acetil CoA
oxalacetato
citrato
NADH
NAD
malato
isocitrato
NAD
H2O
CO2
NADH
fumarato
Alf a-cetoglutarato
FADH2
NAD
NADH
FAD
succinato
CO2
CoA
Succinil CoA
CoA
141
GTP
GDP
FERMENTACIONES
En sentido estricto se designan fermentaciones aquellos
procesos de consecucin de energa en los que el hidrgeno
pasa finalmente a un aceptor orgnico de electrones. El
oxgeno no interviene en los procesos fermentativos.
El trmino fermentacin hace referencia al metabolismo
anaerobio de los hidratos de carbono.
En la fermentacin el aceptor de electrones es un compuesto
orgnico, mientras que en la respiracin suele ser el oxigeno
(respiracin aerobia).
Cierto nmero de fermentaciones estn basadas en la va
glucoltica (Embden Meyerhof). Esta va genera ATP dos
veces: primeramente a travs de la oxidacin del
gliceraldehido-3-fosfato y de nuevo a travs de la
conversin del fosfoenolpiruvato.
142
1. Fermentacin lctica
Es la fementacin ms simple: Una reaccin en un solo paso
catalizado por la lacticodeshidrogenasa ligada a ADN reduce
el piruvato a lactato. No se forma gas. Dado que se consumen
dos molculas de ATP en la formacin de hexosa difosfato a
partir de glucosa y que se producen cuatro molculas de
ATP, el rendimiento neto son dos ATP por hexosa.
La fermentacin homolctica que forma solamente lactato.
Streptococcus lactis
$"
S. faecalis
$"
S. salivarius
$"
S. pyogenes
$"
S. cremoris
$"
S. thermophilus
$"
S. diacetilactis
$"
Lactobacillus lactis
$"
L. acidophilus
$"
L. bulgaricus
$"
L. casei
$"
L. plantarum
$"
L. inulinus
$"
143
Leuconostoc mesenteroides
$"
Leuconostoc cirovorum
$"
Lactobacillus brevis
$"
Lactobacillus viridescens
$"
C6H12O6
2. Fermentacin alcohlica
El piruvato se convierte en CO2 ms acetaldehdo que
despus se reduce a etanol en una reaccin ligada a NAD.
Esta fermentacin es rara en las bacterias como va
principal, es ms bien caracterstica en las levaduras.
144
2 C6H12O6 + H2O
CH3-CH2OH + CH3-COOH
+
2CO2 + 2 C3H8O3
145
3. Fermentacin propinica
Esta va extrae energa adicional del substrato. El piruvato
es carboxilado para producir oxalacetato, que es reducido
para proporcionar succinato y despus es descarboxilado
para proporcionar propionato.
$"
Gnero Propionibacterium
Clostridium propionicum
$"
Selenomonas ruminantium
$"
La produccin de cido propinico a partir de cido lctico se
efecta de acuerdo a la siguiente reaccin:
3CH3-CHOH-COOH
2CH3-CH2-COOH + CH3-COOH
+
CO2 +H2O
147
CH4 + 2 H2O
NH2OH
HIDROXILAMINA
NO3
NO2
NITRATO
NITRITO
NH3
AMONIACO
NO
XIDO DE
NITRGENO
N2O
XIDO
NITRSO
150
N2
NITRGENO
REDUCCIN DE SULFATOS
Varios Compuestos inorgnicos de azufre son aceptores de
electrones en la respiracin anaerbica.
El sulfato la forma ms oxidada del azufre, es uno de los
aniones principales en el agua de mar y se utiliza por las
bacterias reductoras de sulfato.
El producto final de la reduccin del sulfato es el sulfito, un
importante producto natural que participa en muchos
procesos bioqumicos.
La mayora de las plantas y los microorganismos utilizan el
sulfato como fuente de azufre y obtienen el sulfuro
necesario para la sntesis de los aminocidos sulfurados por
reduccin asimilatoria de sulfato. Como producto secundario
de esta reduccin
del sulfato aparece el sulfuro de
hidrgeno:
8 H+ + SO4
H2S + 2 H2O + 2 OH
151
Desulfovibrio desulfuricans
$"
D. vulgaris
$"
Desulfotomaculum nigrificans
$"
D. orientis
$"
D. ruminis
$"
152
ENTEROBACTERIAS
Las enterobacterias ms importantes se incluyen en la
familia Enterobacteriaceae, la cual est constituida por
bacilos Gram negativos. Hay especies mviles e inmviles.
Todas fermentan glucosa con produccin de cido y gas,
reducen los nitratos a nitritos y dan resultado negativo en la
prueba de indofenol oxidasa. Esta familia comprende
bacterias patgenas y no patgenas. Conviene recalcar que
las caractersticas de patogenicidad relativa en las
enterobacterias en su hbitat natural, que es el tracto
gastrointestinal, se modifican radicalmente cuando estas
bacterias alcanzan una localizacin extra intestinal, en sitios
como el tracto genitourinario, lquido cefalorraqudeo,
torrente sanguneo, mdula sea o la cavidad peritoneal.
En vista de lo anterior, es posible aislar y cultivar miembros
de la familia Enterobacteriaceae tanto a partir de muestras
fecales y productos que pudieron haber sufrido una
contaminacin fecal como el agua, alimentos, utensilios, etc.
153
BACTE RIA
O XIDASA
INDO L
VP
RM
CITRATO
SH2
E. Coli
Shigella
Edwardsiella
Salmonella
Arizona
--
C itr obacter
Klebsiella
Enter obacter
Serratia
Pr oteus
vulgar is
Pr ovidencia
154
ARGIN I
NA
DESC.
COPROCULTIVO
En cualquier caso, es importante contar con procedimientos
de laboratorio bien controlados que permitan detectar la
presencia de agentes patgenos o bien dar alguna
informacin sobre alteraciones en el equilibrio de la forma
normal.
El esquema que se propone en ste atlas para aislamiento e
identificacin de enterobacterias patgenas figura entre
numerosas variantes de trabajo utilizadas por diferentes
autores. Se considera que este esquema es uno de los ms
usuales y que puede dar resultados consistentes y
satisfactorios.
COPROCULTIVO
MEDIOS
PARA AISLAMIENTO
Agar entrico Hektoen
Agar de eosina y azul de metileno
Agar ENDO
Agar XLD
Agar Salmonella Shi gella
Agar verde brillante
PARA ENRIQUECIMIENTO
Base de caldo tetrationato
Caldo de selenito y cistina
AISLAMIENTO
ENRIQUECIMIENTO
PLACAS: Agar S-S,
ver de brillante, sulfito de
bismuto.
TUBOS: Caldo
tetrationato y/o
caldo s elenit o
Agar sangre
INCUBACIN
24 h 37 C
PLACA: Agar EMB
ENDO, XLD, Mac
Conkey
IDENTIFICACIN
BIOQUMICA
TSI, MIO, LI A, SIM,
fenilalanina,
RMVP,Citrato de
Simmons , urea
Esquema 4. Coprocultivo
155
PLACAS: Agar
ver de brillante,s ulfito
de
bismuto, XLD,EMB,
ENDO, Mac
Conkey.
Materia fecal
Mac Conkey
EMB o XLD
Sulfito de bismuto
Caldo de selenito
Sulfito de
Certifique Y. enterocolitica
Colonia negra
Salmonella
Salmonella
typhi
156
XLD, VB
Colonia lactosa
(-) =
FAMILIA MICROCOCACEAE
CARACTERSTICA MICROCOCCUS STOMATOCOCCUS PLANOCOCCUS STAPHYLOCOCCUS
Racimos
irregulares
Ttradas
Cpsula
Movilidad
Crecimiento Gfurazolidona
Fermentacin
de glucosa
Oxidasa
No
desarrolla
de
Glicina
de
pptido-glicana
cidos
teicoicos
en
pared celular
Resistencia
lisostafina
157
ESTAFILOCOCOS
El estafilococo es un microorganismo poco exigente y de
fcil desarrollo. En los medios no selectivos sus colonias son
grandes, opacas, lisas, circulares y enteras. A veces pueden
presentar bordes ligeramente ondulados, coloracin amarilla
o blanca.
En agar sangre las colonias tienen los caracteres
anteriormente mencionados y pueden adems presentar
hemlisis. La mayor parte de las cepas virulentas son
hemolticas,
fermentan
manitol,
resisten
altas
concentraciones de cloruro de sodio y generalmente
producen pigmento dorado, aunque otras cepas virulentas son
blancas carecen de pigmento.
La mejor prueba de virulencia es la facultad que tiene de
coagular el plasma (estafilococos coagulasa positivos).
MEDIOS
PARA AISLAMIENTO
Agar S-110
Agar sal y manitol
Agar de Vogel Johnson
PARA IDENTIFICACIN
Medio CTA
Caldo rojo de fenol
Caldo SF
Ti ncin de Gram
Agar S-110
Agar sal y manitol
Agar de Vogel Johnson
158
3. Froti s
4. Prue ba s bioqumica s
Coagulasa
Catalasa
Fermentacin de
manitol
Susceptibilidad a
novobicina
PRUEBA
Pigmento colonial
Coagulasa
Factor de agregacin
Nucleasa termoestable
Fosfatasa alcalina
Ornitina descarboxilasa
Ureasa
Beta-galactosidasa
Produccin de acetona
Resistencia a novobiocina
Resistencia a polimixina
Trehalosa
Manitol
Manosa
Xilosa
Celulosa
Maltosa
Sacarosa
S. aureus
S. epidermidis
S. saprophyticus
10-90% cepas +
+
+
+
+
10-90% cepas +
+
+
+
+
+
+
+
+
10-90% cepas +
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
10-90% cepas +
+
+
159
ESTREPTOCOCOS
El estreptococo puede estar presente en grandes nmeros
como componentes de la flora normal, pero bajo ciertas
circunstancias puede estar asociado con infecciones o ser el
responsable principal de las mismas.
Los estreptococos ms importantes generalmente pueden
demostrarse por la produccin de hemlisis en los medios
que contienen sangre.
Los Streptococcus del grupo A son beta hemolticos y se
aslan generalmente de exudados farngeos. Sin embargo,
entre la flora existen diversos tipos de estreptococos, los
cuales pueden ser alfa o beta hemolticos es necesario
efectuar otras pruebas para identificarlos, tales como la
composicin antignica y la prueba de sensibilidad de
bacitracina.
En agar sangre las colonias de esta bacteria son pequeas,
elevadas, de color blanco a gris, duras y secas con un halo
claro bien definido de hemlisis completa (hemlisis beta).
160
Especie
Estreptococos
betahemolticos
Grupo A
Grupo B
S
R
R
R
+
-
Enterococos
No
enterococos
S. viridans
S.
pneumoniae
161
UROCULTIVO
MEDIOS
PARA AISLAMIENTO
Agar sangre
Agar EMB
Agar S-110
Agar sal y manitol
Agar Biggy
PARA IDENTIFICACIN
TSI, Caldo rojo de fenol
Urea, SIM, MIO, LIA, Citrato
de simmons
PARA SENSIBILIDAD A
ANTIBITICOS
Agar de Mueller Hinton
Agra soya tripticasena
Orina
AISLAMIENTO E
IDENTIFICACIN
Tincin de Gram
Agar sangre,
identificacin de:
Estafilococos
Estreptococos
Neumococos
Observacin de
hemlisis
Agar EMB
Identificacin de:
Enterobacterias
Pseudomonas
Salmonella y
Shigella
Esquema 7. Urocultivo
162
HEMOCULTIVO
En el paciente con fiebre, con o sin signos o sntomas de
localizacin el hemocultivo es la prueba ms til y ms usada
para demostrar la frecuencia de infeccin sistmica. La
demostracin de bacteremia es tambin esencial en las
personas en que se sospecha endocarditis bacteriana.
Es importante conocer las infecciones en las que se pueden
aislar microorganismos de la sangre. Entre estos se
encuentran la fiebre tifoidea, neumonas, meningitis,
endocarditis bacteriana, osteomielitis, peritonitis, etc.
La posibilidad de obtener cultivos positivos depende de la
etapa de la enfermedad en que se tome la muestra y el
grado de evolucin de la misma. En la mayora de los casos,
por lo general es conveniente tomar varias muestras a
intervalos apropiados ya que un solo cultivo puede ser
insuficiente.
163
EXUDADO FARINGEO
MEDIOS
PARA AISLAMIENTO
Agar sangre
Agar eosina y azul de metileno
Agar sal y manitol
Agar S-110
Medio de transporte Stuart
Agar BIGGY
Tincin de Gram
Hemoltico grupo A
Disco de bacitracina
Agar sangre
Streptococcus
Neumococos
Agra eosina y
azul de metileno
Enterobacterias
Staphylococcus
aureus y otros
Micrococos
Catalasa y coagulasa
Candida albicans
Tubos germinales y
clamidiosporas
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Disco de optoquina
Solubilidad de bilis
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