Acidosis metablica en ovejas que altera la expresin del

musculo esqueltico renal de enzimas aminocidas y

trasportadoras
INTRODUCCIN
La alimentacin de alta dietas de granos aumenta la fermentacin
ruminal
Consecuentemente, el aumento de la absorcin de propionato ruminal
y el lactato en la sangre a menudo conduce a la acidosis metablica
(acidosis),que es caracterizada por una disminucin en el pH de
sangre y la concentracin de bicarbonato.
El rin responde a la acidosis por absorbiendo y la l-Gln de sangre
catabolizando a sus 2 iones de amonio constitutivos y el esqueleto de
carbn, el glutamato es sacado como CO2 entonces es convertido al
ion carbono, que disocia a la H + y HCO3-. EL HCO3 - entonces es
secretado en la sangre. As, el metabolismo renal de l-Gln para
excretar 2 NH4 + en la orina y 2 HCO3 - en la sangre causa un
aumento neto de pH de sangre.
En contraste, para las ovejas lo acido de todo el cuerpo se reduce la
sntesis de protenas(a diferencia de catabolismo), urea y heptica lGln la produccin de la sntesis, no se altera, y es L-Gln desviada
desde el hgado hasta los riones
Sin embargo, poco se sabe acerca de los cambios putativos en la expresin de
Las protenas de los tejidos responsables del equilibrio cido-base de
La acidosis de las ovejas.

El objetivo del estudio era el de presentar los supuestos cambios en

mRNA,, o mRNA y la expresin de protena por el rin, tejidos de
hgado de la oveja Un suplemento aninico (HCl-trat la comida
canola) fue usado inducir la acidosis metablica, ms bien que una
induccin tpica de produccin de acidosis metablica por la
alimentacin de una dieta sumamente fermentable, para reducir la
variabilidad en el modelo que es resultado de variables asociadas con
la fermentacin de comn.
Animales, Diseo Experimental y Tratamientos, y Coleccin de Tejido
Los tejidos se obtuvieron de ovejas en las que acidosis haba sido inducida,
Brevemente, 12 corderos (6,7 kg de peso corporal) fueron bloqueados por BW
y luego, dentro de un bloque, se asignaron al azar a un control de tratamientos
de acidosis Sin embargo, durante el curso de el ensayo, 1 animal del bloque 1
(asignado al control tratamiento) y 1 desde el bloque 2 (asignado a la acidosis
de tratamiento) se enfermaron y fueron retirados de el ensayo, lo que resulta en
n = 5 para cada tratamiento.

Todos corderos se le dieron 2 porciones iguales de alfalfa deshidratada (pellets)

que seria la dieta a base de (1,2 kg / d total que contiene 90% DM, 22% de
PC, 1,2 Mcal de EN g / Kg de MS) en 1000 y 1300 h diaria durante el perodo
pre-experimental. Durante el perodo experimental, los pellets que se ofrecieron
a los corderos fueron suplementado con harina de canola (tratamiento de
control) o HCl tratado con pasta de canola (tratamiento de la acidosis).
Los corderos fueron alimentados desde d 0 hasta 10, recibiendo 0 g (d 0), 50 g
(d 1), 100 g (d 2), 150 g (d 3), y 200 g / d (d 4 a 10) en porciones iguales
mezclado con melaza y este se dividen por igual entre 2 ofertas (0700 y 1100
h), mientras que la alfalfa se ofreci en 1000 y 1500 horas al da durante el
perodo experimental. Todo el suplemento era con- consumida por todos los
animales.
Los tratamientos se suspendieron en el da 11, y corderos fueron sacrificados
por pistolas de pistola de aturdimiento y exanguinacin posterior.
Se tomaron muestras de Hgado (en el centro del lbulo derecho), rin
(seccin transversal en INCLUYENDO corteza y mdula) y msculo
esqueltico (secciones de msculo sternomandibularis) las muestras de tejido
fueron recogidos en y congeladas en nitrgeno lquido, y se almacenaron a -70
C.

El anlisis por inmunotransferencia

1 g de tejido se homogeneiz en 7,5 ml de una solucin 4 C que contiene 0,25 M de
sacarosa m, 10 m MHEPES-KOH (PH 7,5), 1 m MEDTA, y 50l de proteasa inhibicin, Los
homogenados se almacenaron a -80 C hasta su posterior anlisis. La concentracin de
protenas del homogeneizado se determin utilizando el mtodo de Lowry con albmina de
suero bovino como estndar, se visualizaron mediante un kit de quimioluminiscencia.

La extraccin de ARN y la transcripcin inversa

400 mg de rin, hgado, y muestras de msculo se homogeneizaron en 4 ml de TRIzol, se
coloco en tubos de microcentrifuga 1 ml por tubo de 1,5 ml, un tubo homogeneizado se utiliz
para la extraccin de ARN Despus de que se extrajo el ARN Se hizo un procedimiento de
purificacin, se llev a cabo utilizando RNeasy Mini Kit, 1 muestra de ARN ya purificado se
combin con 1 l de 10 tampn de reaccin, 1 l de DNasa I (1 U / l), y DNasa / RNasa
libre de agua de hasta 10 l, se incubaron a temperatura durante 15 min, y luego 1 l de EDTA
25 m M se aadi para detener la reaccin por incubacin a 65 C durante 10 min. Las
muestras tratadas con DNasa ARN fueron luego a transcripcin inversa a ADNc usando
SuperScript III First-Strand Synthesis System. Brevemente, se paso por una solucin de
hexmeros (50 ng / l) y Oligo (dT) 20 (50 M) cebadores (1 l cada uno) se aadi a uno de
DNasa muestra tratada ( l en volumen), se incub a 70 C durante 10 min, y despus se
enfri en hielo durante 1 min. Despus, una solucin que contiene 2 l de transcripcin inversa
(RT) buffer (10 ), 2 l de ditiotreitol (0,1 M), 4 l de 5'-trifosfato de desoxinucletido (10 m M de
cada uno), 4 l de MgCl 2 (25 m M), y 1 l de RNasa de salida se aadi a la reaccin. Despus
de incubacin a 37 C durante 2 min, la reaccin se incub con transcriptasa inversa (1 l) a
temperatura ambiente durante 10 min, y luego se incubaron a 37 C durante 50 min. Para
detener la reaccin, la mezcla de reaccin- tura se incub a 70 C durante 10 min y
posteriormente almacenado a -80 C hasta su utilizacin en tiempo real de RT-PCR anlisis de
contenido de ARNm.
El anlisis PCR en tiempo real
La reaccin de 25-l PCR fue com- puesto por DNasa / RNasa libre de agua (3,25 a 10,75 l),
molde de ADNc (0,5 a 8 l), el cebador y la sonda conjunto (1,25 l), y TaqMan Universal PCR

Master Mix- No AmpErase UNG (12,5 l). Las condiciones de PCR usado para la amplificacin y
cuantificacin fueron una ini- cial etapa de desnaturalizacin (95 C durante 10 min), seguido
por 40 2 ciclos de etapas de amplificacin de desnaturalizacin (95 C para 15 s) y recocido /
extensin (60 C durante 1 min), con una programa de fusin curva (60 a 95 C), una
velocidad de calentamiento de 0,15 C / s, y continuas mediciones de fluorescencia.
Cuantificacin relativa de la expresin del ARNm del gen diana se llev a cabo utilizando un
mtodo relativo curva estndar y una serie de dilucin de cDNA RT. Todas las muestras fueron
realizaron por triplicado. Un fondo comn de cDNA, gen- utilizar desde alcuotas iguales de los
productos de la RT, se utiliz como molde para la generacin de estndar cuantitativo curvas
para los genes diana y 18S La niveles cuantificados de 18S se utilizaron como endgeno
controlar para normalizar las variaciones en las entradas de mRNA y RT eficacias de reaccin

Se tomaron muestras especificas de rin, msculo, hgado y ADNc fueron

serialmente diluido 2,5 , 5 , 25 , 125, 625 , 3,125, 15.625, 78.125 x, y
390.625, y el intervalo lineal para objetivo cuantificacin se estableci para
determinar una cantidad apropiadas de ADNc que se usa para el estndar
curva determinacin. El ciclo umbral (CT) valores para 18S a travs de
muestras dentro de un tejido fueron estadsticamente analizados para
determinar si haba cualquier tratamiento efecto sobre la expresin de 18S.
Para el control de error del sistema durante la preparacin de la muestra, las
cantidades relativas de una gen diana expresin de mRNA se normalizaron a la
18S cantidades relativas en el clculo de los ratios de tar- obtener genes: 18S
cantidades relativas. Estos 18S-normalizada cocientes se utilizaron luego para
el anlisis estadstico de destino gen de expresin del ARNm. Las secuencias
resultantes se suman a la secuencias que se espera validar en tiempo real RTPCR metodologa empleada para este estudio.

RESULTADOS Y DISCUSIN
El objetivo primario fue determinar el efecto de la acidosis metablica en la
expresin de estos protenas por el rin, msculo esqueltico, y tejidos del
hgado. Un HCl tratado por el suplemento de harina de canola fue utilizado para
inducir acidosis metablica a travs de hipercloremiadando lugar a la acidosis
metablica inducida por la elevacin de Las concentraciones de lactato en
sangre debido a un aumento de la produccin de AGCC ruminal de la
fermentacin de alta dietas de grano, para evitar la variabilidad inherente en la
severidad de desafo aninico resultante de la fermentacin ruminal.
Suplementos de cloruro de amonio no se utiliz para inducir acidosis
metablica para evitar la adicional NH 3 carga de NH 4 Ingesta de Cl, que, a su
vez, altera tasas de ureagenesis heptica. Sin embargo, es probable que las
diferencias inherentes pueden existir en variables de respuesta.
Los animales de tratamiento de acidosis utilizados en la presente estudio haba
disminuido plasma pH (7,47 vs 7,39), orina pH (8,13 vs 6,09), y HCO
concentraciones en plasma (27,3 vs 23,3 m M) en comparacin con el control
de grupo de tratamiento, lo que indica que el modelo indujo con xito un
cambio significativo en el cambio cido-base en las ovejas.

Conclusiones

La acidosis aument el contenido de AST Protenas en msculo

esqueltico

La acidosis no afect la expresin heptica Las enzimas de AA y

Transportadores

El hgado juega un papel importante en la regulacin sistmica

de cido-base homeostasis a travs del control de l-Gln en el
metabolismo.