Cargados positivamente (bsicos) Grupos R El ms hidrfilos grupos R son aquellos

que son ya sea positiva o negativamente cargado. Los aminocidos en la que los grupos
R tienen carga positiva significativa a pH 7,0 son lisina , que tiene un segundo grupo
amino primario en la posicin de en su cadena aliftica ; arginina , que tiene una forma
positiva grupo guanidino cargada ; e histidina , que tiene un grupo imidazol. La
histidina es el nico comn de aminocido que tiene una cadena lateral ionizable con un
pKa cerca de la neutralidad. En muchas reacciones catalizadas por enzimas , una Su
residuo facilita la reaccin sirviendo como un protn donador / aceptor . Cargados
negativamente (cidos) Grupos R Los dos aminocidos que tienen grupos R con una
carga neta negativa a pH 7,0 son aspartato y glutamato , cada uno de los cuales tiene un
segundo grupo carboxilo.
Poco frecuentes Aminocidos tambin han Funciones importantes Adems de los 20
aminocidos comunes, protenas pueden contener residuos creados por la modificacin
de comn residuos ya incorporados en un polipptido (Fig. 3-8a). Entre estos
aminocidos no comunes son 4-hidroxiprolina, un derivado de prolina, y 5hidroxilisina, derivado de lisina. El primero es encontrado en las protenas de la pared
celular de la planta, y ambos se encuentran en colgeno, una protena fibrosa de tejido
conectivo. 6-NMethyllysine es un constituyente de la miosina, una contrctil protena de
msculo. Otra importante amino raro cido es -carboxyglutamate, que se encuentra en el
bloodclotting protrombina protena y en ciertas otras protenas que se unen Ca2 como
parte de su funcin biolgica. Ms complejo es desmosina, un derivado de cuatro Lys
residuos, que se encuentra en la protena elastina fibrosa. Selenocysteine es un caso
especial. Esta rara amino residuo de cido se introduce durante la sntesis de protenas
en lugar de creado a travs de una modificacin postsynthetic. Contiene selenio en lugar
del azufre de la cistena. En realidad derivado de serina, es un seleniocistena
constituyente de unas pocas protenas conocidas. Alrededor de 300 aminocidos
adicionales se han encontrado en las clulas. Tienen una gran variedad de funciones,
pero no son constituyentes de las protenas. Ornitina y citrulina
La absorcin de luz por las molculas:
La Ley de Lambert-Beer Una amplia gama de biomolculas absorben luz a
caracterstico longitudes de onda, tal como triptfano absorbe luz a 280 nm (vase la
Fig. 3-6). La medicin de la absorcin de la luz mediante un espectrofotmetro se
utiliza para detectar e identificar molculas y para medir su concentracin en solucin.
La fraccin de la luz incidente absorbida por una solucin a una longitud de onda dada
se relaciona con el espesor de la capa absorbente (longitud del camino) y la
concentracin de las especies absorbentes (Fig. 1). Estos dos relaciones se combinan en
la ley de Lambert-Beer, cl log donde I0 es la intensidad de la luz incidente, I es la
intensidad de la luz transmitida, es la extincin molar coeficiente (en unidades de litros
por mol-centmetro), c es la concentracin de la especie absorbente (en moles por litro),
y L es la longitud del camino de la lightabsorbing de la muestra (en centmetros). El de
Lambert-Beer ley supone que la luz incidente es paralelo y monocromtica (de una
nica longitud de onda) y que la molculas de disolvente y de soluto estn orientados al
azar. El registro de la expresin (I0 / I) se llama la absorbancia, designado A. Es
importante sealar que cada milmetro sucesiva de longitud de la trayectoria de la
solucin de absorcin en un 1,0 cm clula no absorbe una cantidad constante, sino que
una fraccin constante de la luz que incide sobre ella. Sin embargo, con una capa

absorbente de la longitud de trayectoria fija, la absorbancia, Una, es directamente

proporcional a la concentracin del soluto absorbente. El coeficiente de extincin molar
vara con el naturaleza del compuesto absorbente, el disolvente, y la longitud de onda, y
tambin con el pH si el absorbente de luz especies est en equilibrio con un estado de
ionizacin que tiene diferentes propiedades de absorbencia.
Amino cidos tienen curvas de valoracin Caracterstico titulacin cido-base implica la
adicin gradual o eliminacin de protones (Captulo 2). La figura 3-10 muestra el curva
de valoracin de la forma diprtico de glicina. la trama tiene dos etapas distintas, que
corresponden a la desprotonacin de dos grupos diferentes en glicina. Cada uno de los
dos etapas se asemeja en forma de la curva de valoracin de un cido monoprtico, tal
como cido actico (vase Fig. 2-17), y puede ser analizado de la misma manera. A un
pH muy bajo, la especie inica predominante de glicina es el totalmente protonada
formar, H3NOCH2 OCOOH. En el punto medio en la primera etapa de la valoracin, en
la que el OCOOH grupo de glicina pierde sus protones, concentraciones equimolares
del donador de protones (H3NOCH2OCOOH) y protn-aceptor (H3NOCH2OCOO)
son las especies presente. En el punto medio de cualquier titulacin, un punto de
inflexin se alcanza en el que el pH es igual al pKa de el grupo protonado se valora
(vase Fig. 2-18). Por glicina, el pH en el punto medio es 2,34, de este modo su COOH
grupo tiene un pKa (con la etiqueta pK1 en la Fig. 3-10) de 2,34.
(Recuerde del Captulo 2 que el pH y pKa son simplemente conveniente notaciones para
la concentracin de protones y la constante de equilibrio de ionizacin, respectivamente.
Los pKa es una medida de la tendencia de un grupo que renunciar un protn, con la
tendencia a la disminucin de diez veces como el pKa aumenta en una unidad.) A
medida que avanza la titulacin,
Otro punto importante que se alcanza un pH de 5,97. Aqu hay otro punto de inflexin,
en el que la eliminacin de la primera de protones es esencialmente completa y la
eliminacin de el segundo acaba de comenzar. A este pH la glicina es presentar en gran
parte como la H3N-CH2-COO ion dipolar. Volveremos sobre el significado de esta
inflexin punto de la curva de valoracin (con la etiqueta pI en la Fig. 3-10) dentro de
poco.
La segunda etapa de la valoracin corresponde a la eliminacin de un protn del grupo
NH3 de glicina. El pH en el punto medio de esta etapa es 9,60, igual a el pKa (con la
etiqueta pK2 en la Fig. 3-10) para el grupo NH3. La titulacin se completa
esencialmente a un pH de aproximadamente 12, momento en el que la forma
predominante de la glicina es
H2N CH2 COO.
Las curvas de valoracin Predecir la carga elctrica de Aminocidos
Otra pieza importante de la informacin derivada de la curva de titulacin de un
aminocido es la relacin entre su carga elctrica neta y el pH de la solucin. A pH 5,97,
el punto de inflexin entre la dos etapas de su curva de valoracin, la glicina est
presente predominantemente como su forma dipolar, totalmente ionizado, pero sin carga
elctrica neta (Fig. 3-10). El pH caracterstico en el que la carga elctrica neta es cero se
llama el punto isoelctrico o pH isoelctrico, pI designado. Para la glicina, que no tiene
un grupo ionizable en su lado cadena, el punto isoelctrico es simplemente la media
aritmtica de los dos valores de pKa: pI
1
2 (pK1 pK2)

1
2 (2,34 9,60) 5,97
Como es evidente en la figura 3-10, la glicina tiene una neta negativa cobrar a cualquier
pH por encima de su pI y por lo tanto se mover hacia el electrodo positivo (el nodo)
cuando se coloca en una campo elctrico. En cualquier pH por debajo de su pI, la
glicina tiene una red de carga positiva y se mover hacia el electrodo negativo (El
ctodo). Cuanto ms el pH de una solucin de glicina es desde su punto isoelctrico,
mayor ser la red carga elctrica de la poblacin de molculas de glicina. A pH 1,0, por
ejemplo, existe glicina casi en su totalidad como la forma H3N-CH2-COOH, con un
neto positivo cargar de 1,0. A pH 2,34, donde hay una mezcla igual de H3N-CH2COOH y H3N-CH2-COO, la carga positiva neta promedio o es de 0,5. El signo y la
magnitud de la carga neta de cualquier aminocido en cualquier pH puede predecirse de
la misma manera. Los aminocidos difieren en sus propiedades cido-base
Las propiedades comunes de muchos aminocidos permiten que algunos la
simplificacin de las generalizaciones acerca de su comportamiento cido-base. En
primer lugar, todos los aminocidos con un nico grupo amino, un solo grupo carboxilo,
y un grupo R que no lo hace ionizar tener curvas de valoracin parecida a la de la
glicina (Fig. 3-10). Estos aminocidos tienen muy similar, aunque no idnticos, los
valores de pKa: pKa de la COOH grupo en el rango de 1.8 a 2.4, y pKa de la NH3
grupo en el rango de 8,8 a 11,0 (Tabla 3-1).
En segundo lugar, los aminocidos con un grupo R ionizable tienen ms curvas de
valoracin complejos, con tres etapas correspondientes a los tres posibles pasos de
ionizacin ; as tienen tres valores de pKa . La etapa adicional para el la titulacin del
grupo R ionizable se funde en cierta medida con los otros dos. Las curvas de valoracin
para dos amino cidos de este tipo, glutamato e histidina , se muestran en la Figura 312.
Los puntos isoelctricos reflejan la naturaleza de los grupos R ionizante presentan. Por
ejemplo, el glutamato tiene un pI de 3,22, considerablemente menor que la de la glicina.
Esto es debido a la presencia de dos grupos carboxilo, que, en el promedio de sus
valores de pKa (3,22 ) , contribuir una carga neta de 1 que equilibra el 1 contribuy por
el grupo amino . Del mismo modo, el pI de la histidina, con dos grupos que estn
cargados positivamente cuando protonada , es 7,59 ( la media de los valores de pKa de
la amino y grupos imidazol ), mucho mayor que la de glicina. Por ltimo , como se ha
sealado anteriormente , en virtud de que el general condiciones de exposicin libre y
abierto al entorno acuoso, solamente histidina tiene un grupo R (pKa 6.0) proporcionar
energa de tamponamiento significativo cerca del neutro pH normalmente se encuentra
en el intracelular y extracelular fluidos de la mayora de animales y bacterias (Tabla 31).
3.2 Pptidos y Protenas
Pasamos ahora a polmeros de aminocidos, los pptidos y protenas. que ocurren
biolgicamente van polipptidos en tamao, desde pequeos hasta muy grandes, que
consta de dos o tres a miles de residuos de aminocidos enlazados. Nuestra atencin se
centra en las propiedades qumicas fundamentales de estos polmeros. Los pptidos son
cadenas de aminocidos. Dos molculas de cido amino se pueden unir covalentemente
a travs de un enlace amida sustituido, un pptido denominado esclavos, se les di un
dipptido. Dicha articulacin est formado por eliminacin de los elementos de agua
(deshidratacin) de el grupo carboxilo de un aminocido y el amino grupo de otro (Fig.
3-13). la formacin del enlace pptido se un ejemplo de una reaccin de condensacin,
una clase comn de reacciones en las clulas vivas. Bajo bioqumica estndar

condiciones, el equilibrio para la reaccin mostrada en la figura 3-13 favorece a los

aminocidos ms de dipptido. A hacer que la reaccin termodinmicamente ms
favorable, el grupo carboxilo debe ser modificado o activado qumicamente de modo
que el grupo hidroxilo puede ser ms fcilmente eliminado. se describe un mtodo
qumico para este problema ms adelante en este captulo. El enfoque biolgico para
formacin del enlace peptdico es un tema importante del captulo 27. Tres aminocidos
pueden estar unidos por dos pptido bonos para formar un tripptido; Del mismo modo,
los aminocidos pueden ser ligado para formar tetrapptidos, pentapptidos, y as
adelante. Cuando unos pocos aminocidos se unen de esta manera, la estructura se
denomina un oligopptido. cuando muchos aminocidos se unen, el producto se llama
un polipptido. Las protenas pueden tener miles de aminocido residuos. Aunque los
trminos "protena" y "polipptido" a veces se utilizan indistintamente, las molculas
que se refiere como polipptidos tienen generalmente molecular peso inferior a 10.000,
y esas llamadas protenas tienen pesos moleculares ms altos. Figura 3-14 muestra la
estructura de un pentapptido.
Como ya se seal, una unidad de aminocido en un pptido es a menudo llamado un
residuo (la parte que queda despus de la prdida de un hidrgeno tomo de su grupo
amino y el resto hidroxilo de su grupo carboxilo). En un pptido, el amino residuo de
cido en el extremo con un grupo amino libre es la amino-terminal (o N-terminal) de
residuos; el residuo en el otro extremo , que tiene un grupo carboxilo libre, es el
carboxilo -terminal ( C -terminal) de residuos. Aunque la hidrlisis de un enlace
peptdico es un exergnica reaccin, se produce lentamente debido a su alta activacin
energa. Como resultado, los enlaces peptdicos de las protenas son bastante estables,
con un promedio de vida media ( t1 / 2 ) de aproximadamente 7 aos bajo la mayora de
condiciones intracelulares. Los pptidos se pueden distinguir por su Comportamiento de
ionizacin Pptidos contienen slo un grupo amino libre y uno grupo carboxilo libre ,
en los extremos opuestos de la cadena de (Fig. 3-15). Estos grupos se ionizan como lo
hacen en amino libre cidos , aunque las constantes de ionizacin son diferentes porque
un grupo con carga opuesta ya no est vinculado al carbono . Los grupos -amino y
carboxilo de todos los aminocidos no terminales estn unidos de forma covalente en el
enlaces peptdicos , que no se ionizan y por lo tanto no contribuyen para el
comportamiento total de cido-base de los pptidos. Cmo Sin embargo, los grupos R
de algunos aminocidos pueden ionizar (Tabla 3-1), y en un pptido stos contribuyen a
la general propiedades cido-base de la molcula (Fig. 3-15). As el comportamiento
cido-base de un pptido se puede predecir de sus grupos -amino y carboxilo libres, as
como la naturaleza y el nmero de sus grupos R ionizables. Al igual que los
aminocidos libres, pptidos tienen caracterstica curvas de valoracin y un pH
isoelctrico caracterstica (PI) en la que no se mueven en un campo elctrico. Estas
propiedades son explotados en algunas de las tcnicas utilizadas para separar pptidos y
protenas, como veremos ms adelante en el captulo. Debe hacerse hincapi en que el
pKa valor para un grupo R ionizable puede cambiar un poco cuando un aminocido se
convierte en un residuo de un pptido. Los prdida de carga en los grupos carboxilo y
amino, las interacciones con otros grupos de pptidos R, y otra los factores ambientales
pueden afectar a la pKa. Los valores de pKa para los grupos R enumeradas en la Tabla
3-1 pueden ser una gua til al intervalo de pH en el que un grupo dado se ionizar, pero
que no pueden aplicarse estrictamente a pptidos. Los pptidos biolgicamente activos y
polipptidos Ocurrir en un rango extenso de tamaos No se pueden hacer
generalizaciones acerca de lo molecular pesos de pptidos y protenas biolgicamente
activos en relacin a sus funciones. pptidos de origen natural variar en longitud de dos
a muchos miles de amino residuos de cido. Incluso los pptidos ms pequeos pueden

tener biolgicamente efectos importantes. Tenga en cuenta el comercio dipptido

sintetizado L-aspartil-L-fenilalanina metil ster, el edulcorante artificial ms conocido
como aspartamo o NutraSweet.
Muchos pequeos pptidos ejercen sus efectos a muy baja concentraciones. Por
ejemplo, un nmero de vertebrados hormonas (Captulo 23) son pequeos pptidos .
stas incluyen oxitocina (residuos de nueve aminocidos ) , que es secretada por la
hipfisis posterior y estimula uterino contracciones; bradicinina (nueve restos), que
inhibe inflamacin de los tejidos; y el factor de liberacin de tirotropina (tres residuos),
que se forma en el hipotlamo y estimula la liberacin de otra hormona, tirotropina, de
la glndula pituitaria anterior. Algunos extremadamente venenos de hongos txicos,
tales como amanitin, tambin son pequeos pptidos, al igual que muchos antibiticos.
Un poco ms grande son pequeos polipptidos y oligopptidos tales como la hormona
insulina pancretica, que contiene dos cadenas de polipptidos, uno de 30 aminocidos
que tienen residuos y el otro 21. El glucagn, otro de pncreas hormona, tiene 29
residuos; se opone a la accin de insulina. Corticotropina es una hormona de 39
residuos de la anterior glndula pituitaria que estimula la corteza suprarrenal. Por
cunto tiempo son las cadenas de polipptidos en las protenas? Como La tabla 3-2
muestra, longitudes varan considerablemente. citocromo humana c tiene 104 residuos
de aminocidos unidos en una sola cadena; chymotrypsinogen bovina tiene 245
residuos. A el extremo es titina, un componente de msculo de los vertebrados, que
tiene casi 27.000 residuos de aminocidos y un molecular en peso de aproximadamente
3.000.000. La gran mayora de protenas naturales que se producen son mucho ms
pequeos que ste, que contiene menos de 2.000 residuos de aminocidos. Algunas
protenas se componen de una nica cadena polipeptdica,pero otros, llamados protenas
de mltiples subunidades, tienen dos o ms polipptidos asociados de forma no
covalente (Tabla 3-2). Las cadenas de polipptidos individuales en un multisubunit
protena puede ser idntico o diferente. Si al menos dos son idnticas se dice que la
protena a ser oligomrica, y las unidades idnticas (que consta de uno o ms
polipptido cadenas) se conocen como protmeros. Hemoglobina, por ejemplo, tiene
cuatro subunidades polipeptdicas: dos cadenas idnticas y dos cadenas idnticas, los
cuatro se mantienen unidos por interacciones no covalentes. cada subunidad se empareja
de forma idntica con una subunidad dentro de la estructura de esta protena de
mltiples subunidades, por lo que la hemoglobina se puede considerar ya sea un
tetrmero de cuatro subunidades polipeptdicas o un dmero de protmeros.
Unos protenas contienen dos o ms polipptido cadenas unidas covalentemente. Por
ejemplo, los dos polipptido cadenas de insulina estn unidas por enlaces disulfuro. En
tales casos, los polipptidos individuales no se consideran subunidades, pero
comnmente se conocen simplemente como cadenas. Podemos calcular el nmero
aproximado de amino residuos de cidos en una protena sencilla contienen ningn otro
componentes qumicos dividiendo su peso molecular por 110. Aunque el peso molecular
medio del 20 aminocidos comunes es de aproximadamente 138, el amino menor cidos
predominan en la mayora de las protenas. Si tenemos en cuenta las proporciones en
que los diversos aminocidos ocurrir en protenas (Tabla 3-1), el promedio molecular
peso de los aminocidos de la protena est ms cerca de 128. Debido una molcula de
agua (Mr 18) se retira para crear cada enlace peptdico, el peso molecular promedio de
un amino residuo de cido en una protena es de aproximadamente 128 18 110.
Polipptidos tienen Caracterstico Las composiciones de aminocidos La hidrlisis de
pptidos o protenas con cido produce una mezcla de-aminocidos libres. Cuando est
completamente hidrolizado, cada tipo de protena produce una proporcin caracterstica

o mezcla de los diferentes aminocidos. El 20 comn aminocidos casi nunca se

producen en cantidades iguales en una protena. Algunos aminocidos pueden
producirse slo una vez o no en absoluto en un tipo dado de protena; otros pueden
ocurrir en nmeros grandes. Tabla 3-3 muestra la composicin de la mezclas de
aminocidos obtenidos en la hidrlisis completa de bovina citocromo cy
chymotrypsinogen, los inactivos precursor de la quimotripsina enzima digestiva. Estas
dos protenas, con funciones muy diferentes, tambin diferir significativamente en el
nmero relativo de cada tipo de cido amino que contienen. La hidrlisis completa por
s sola no es suficiente para una anlisis exacto de composicin de aminocidos, sin
embargo, porque algunas reacciones secundarios se producen durante el procedimiento.
Por ejemplo, los enlaces amida en las cadenas laterales de asparagina y la glutamina se
escinden por tratamiento cido, produciendo aspartato y glutamato, respectivamente. El
lado cadena de triptfano est casi completamente degradado por hidrlisis cida, y
pequeas cantidades de serina, treonina, y tambin se pierden tirosina. Cuando un
aminocido precisa composicin que se requiere, los bioqumicos utilizan
procedimientos adicionales para resolver las ambigedades que se conservan de cido
hidrlisis. Algunas protenas contienen grupos qumicos Aparte de Aminocidos
Muchas protenas, por ejemplo las enzimas de ribonucleasa A y quimotripsingeno,
contienen slo aminocido residuos y no hay otros componentes qumicos; estos son
protenas simples considerados. Sin embargo, algunas protenas contener componentes
qumicos asociados permanentemente Adems de los aminocidos; stos se llaman
conjugado protenas. La parte de cido no amino de una protena conjugada por lo
general se llama su grupo prosttico. conjugado protenas se clasifican sobre la base de
la naturaleza qumica de sus grupos prostticos (Tabla 3-4 ); por ejemplo, lipoprotenas
contienen lpidos, glicoprotenas contienen grupos de azcar y metaloprotenas
contienen una especfica metal. Un nmero de protenas contienen ms de una prtesis
grupo. Por lo general, el grupo prosttico juega un importante papel en la funcin
biolgica de la protena. Hay varios niveles de la estructura proteica Para las grandes
macromolculas como las protenas, las tareas de describir y comprender la estructura
se aproxim en varios niveles de complejidad, dispuestas en una especie de conceptual
jerarqua. Cuatro niveles de la estructura de protenas son comnmente definida (Fig. 316). Una descripcin de todos covalente bonos (principalmente enlaces peptdicos y
disulfuro bonos) enlazan los residuos de aminocidos en un polipptido cadena es su
estructura primaria. El elemento ms importante de la estructura primaria es la
secuencia de amino residuos de cido. Estructura secundaria se refiere a particular
disposiciones estables de residuos de aminocidos que dan la altura de patrones
recurrentes estructurales. Estructura terciaria describe todos los aspectos del
plegamiento tridimensional de un polipptido. Cuando una protena tiene dos o ms
subunidades de polipptidos, se refiere a su disposicin en el espacio a la estructura
como cuaternario. Estructura primaria es el foco de la seccin 3.4; los niveles ms altos
de la estructura se discuten en el captulo 4.
RESUMEN 3.2 Pptidos y Protenas
Los aminocidos se pueden unir covalentemente a travs de enlaces peptdicos para
formar pptidos y protenas. Las clulas contienen generalmente miles de diferente
protenas , cada una con una actividad biolgica diferente.
Las protenas pueden ser cadenas polipeptdicas muy largas de 100 a varios miles de
residuos de aminocidos. Sin embargo, algunos pptidos de origen natural tener slo
unos pocos residuos de aminocidos. Algunos protenas se componen de varios de
forma no covalente cadenas de polipptidos asociados , llamados subunidades. protenas

simples producen cidos amino solamente en hidrlisis; protenas conjugadas contienen

en Adems algn otro componente, tal como una metal o grupo prosttico orgnica.
La secuencia de aminocidos en una protena es caracterstica de esa protena y se
llama su estructura primaria. Este es uno de los cuatro generalmente niveles reconocidos
de la estructura de protenas.
3.3 Trabajar con protenas
Nuestra comprensin de la estructura y funcin de protenas tiene ha derivado del
estudio de muchas protenas individuales. Para el estudio de una protena en detalle, el
investigador debe ser capaz para separarla de otras protenas y debe tener la las tcnicas
para determinar sus propiedades. Lo necesario mtodos provienen de la qumica de
protenas, como una disciplina antigua como la bioqumica en s y uno que conserva un
centro posicin en la investigacin bioqumica. Las protenas se pueden separar y
purificar Una preparacin pura es esencial antes de las propiedades de una protena y las
actividades se pueden determinar. Dado que las clulas contener miles de diferentes
tipos de protenas, cmo se puede purificar una protena? Los mtodos para la
separacin de protenas aprovechar las propiedades que varan de una protena a la
siguiente, incluyendo el tamao, la carga y la unin propiedades. La fuente de una
protena es generalmente de tejido o microbiana Clulas. El primer paso en cualquier
purificacin de protenas procedimiento es romper abiertas estas clulas, liberando su
protenas en una solucin llaman un extracto crudo. Si necesario, centrifugacin
diferencial puede ser utilizado para preparar fracciones subcelulares o para aislar
orgnulos especficos (Vase Fig. 1-8).
Una vez que el extracto de preparacin u orgnulo est listo, Estn disponibles diversos
mtodos para la purificacin de uno o ms de las protenas que contiene. Comnmente,
el extracto se somete a los tratamientos que separan las protenas en diferentes
fracciones en base a una propiedad como el tamao o carga, un proceso conocido como
fraccionamiento. Temprano etapas de fraccionamiento en una purificacin utilizan
diferencias en solubilidad de la protena, que es una funcin compleja de pH, la
temperatura, la concentracin de sal, y otros factores. Los solubilidad de las protenas es
generalmente baja a alta sal concentraciones, un efecto llamado "desplazamiento
salino." La adicin de una sal en la cantidad correcta puede precipitar selectivamente
algunas protenas, mientras que otros permanecen en solucin. El sulfato de amonio
((NH4) 2SO4) se utiliza a menudo para este propsito debido a su alta solubilidad en
agua. Una solucin que contiene la protena de inters a menudo debe ser alterado ms
antes de la purificacin posterior medidas son posibles. Por ejemplo, la dilisis es un
procedimiento que separa las protenas de disolventes, aprovechando de mayor tamao
de las protenas. El parcialmente purificado la afinidad de unin, y otras propiedades
(Fig. 3-17). UN material slido poroso con propiedades qumicas apropiadas (La fase
estacionaria) se lleva a cabo en una columna, y una solucin tamponada (la fase mvil)
se filtra a travs eso. La solucin que contiene protenas, en capas en la parte superior de
la columna, se filtra a travs de la matriz slida como una banda cada vez mayor dentro
de la fase mvil ms grande (Fig. 3-17). Las protenas individuales migran ms rpido o
ms lentamente a travs de la columna en funcin de sus propiedades. Por ejemplo, en
la cromatografa de intercambio de cationes (Fig. 3-18a), la matriz slida tiene
negativamente grupos cargados. En la fase mvil, las protenas con una red de carga
positiva migran a travs de la matriz ms lentamente que los que tienen una carga neta
negativa, debido a que la migracin de la primera es ms retardado por la interaccin
con la fase estacionaria. Los dos tipos de protena puede separar en dos bandas distintas.
La expansin de la banda de protena en la fase mvil (la solucin de protena) es

causada tanto por la separacin de protenas con diferentes propiedades y mediante la

difusin de difusional. Como la longitud de los aumentos de columna, la resolucin de
dos tipos de protena con diferentes cargas netas en general mejora. Sin embargo, la
velocidad a la que la solucin de protena puede fluir a travs de la columna por lo
general disminuye con la columna extracto se coloca en una bolsa o tubo hecho de un
semipermeable membrana. Cuando esto se suspende en un mucho mayor volumen de
solucin tamponada de inica apropiada la fuerza, la membrana permite el intercambio
de sal y tampn pero no protenas. Por lo tanto la dilisis retiene grandes protenas
dentro de la bolsa membranosa o tubo al tiempo que permite la concentracin de otros
solutos en la protena preparacin para cambiar hasta que entran en equilibrio con la
solucin fuera de la membrana. La dilisis podra utilizarse, por ejemplo, para eliminar
el sulfato de amonio a partir de la preparacin de protena. Los mtodos ms poderosos
para el fraccionamiento de las protenas hacer uso de la cromatografa de columna, que
se aprovecha de las diferencias en la carga de protenas, el tamao, longitud. Y a medida
que la cantidad de tiempo gastado en la columna aumenta, la resolucin puede disminuir
como resultado de difusional la difusin dentro de cada banda de protena. La figura 3
18 muestra otras dos variantes de la columna cromatografa, adems de intercambio
inico. Exclusin de tamao cromatografa separa las protenas de acuerdo medir. En
este mtodo, las grandes protenas emergen de la columna antes que las pequeas-a algo
resultado contrario a la intuicin. La fase slida se compone de perlas con poros de
ingeniera o cavidades de un particular, tamao. Protenas grandes no pueden entrar en
las cavidades, y as tomar un camino corto (y rpido) a travs de la columna, alrededor
de los granos. Las protenas pequeas entran en las cavidades, y migrar a travs de la
columna ms lentamente como resultado (Fig. 3-18b). La cromatografa de afinidad se
basa en la afinidad de una protena de unin. Las perlas de la columna tener un grupo
qumico unido covalentemente. Una protena con afinidad por este grupo qumico
particular se unir a las perlas en la columna, y su migracin se retarda como resultado
(Fig. 3-18c).
Un refinamiento moderno en mtodos cromatogrficos es HPLC o cromatografa
lquida de alta resolucin. HPLC hace uso de bombas de alta presin que acelerar el
movimiento de las molculas de protena por la columna, as como materiales
cromatogrficos de mayor calidad que puede soportar la fuerza de aplastamiento de la
presin fluir. Al reducir el tiempo de trnsito en la columna, HPLC puede limitar
difusional difusin de protenas bandas y por lo tanto mejorar en gran medida la
resolucin. El enfoque a la purificacin de una protena que tiene no hubieran sido
previamente aislado se gua tanto por establecido precedentes y por el sentido comn.
En la mayora de los casos, varios mtodos diferentes deben ser utilizados
secuencialmente para purificar una protena completamente. La eleccin del mtodo es
un tanto emprica, y muchos protocolos pueden ser juzgados antes de encontrar el ms
eficaz. Prueba y error a menudo se pueden minimizar al basar el procedimiento de la
purificacin tcnicas desarrolladas para protenas similares. protocolos de purificacin
publicados estn disponibles para muchos miles de protenas. El sentido comn dicta
que barata procedimientos tales como precipitacin salina se utilizaron por primera vez,
cuando el volumen total y el nmero de contaminantes son mayores. Los mtodos
cromatogrficos son a menudo poco prctico en las primeras etapas, porque la cantidad
de cromatogrfico aumenta medio necesarios con la muestra tamao. A medida que se
completa cada etapa de purificacin, la muestra tamao generalmente se hace ms
pequea (Tabla 3-5), por lo que es factible utilizar ms sofisticados (y caros)
procedimientos cromatogrficos en fases posteriores.

Las protenas pueden separarse y caracterizado por electroforesis Otra tcnica

importante para la separacin de protenas se basa en la migracin de las protenas
cargadas en un campo elctrico, un proceso llamado electroforesis. Estos
procedimientos no se utilizan generalmente para purificar protenas en grandes
cantidades, porque alternativas ms simples son generalmente disponibles y
electroforticas menudo mtodos afectar negativamente a la estructura y por lo tanto la
funcin de protenas. La electroforesis es, sin embargo, especialmente til como un
mtodo analtico. Su ventaja es que las protenas puede ser visualizado, as como
separados, permitiendo una investigador para estimar rpidamente el nmero de
diferentes protenas en una mezcla o el grado de pureza de un particular, preparacin de
protena. Adems, permite la electroforesis determinacin de propiedades cruciales de
una protena tal como su punto isoelctrico y peso molecular aproximado. La
electroforesis de protenas se lleva a cabo generalmente en geles compuestos de la
poliacrilamida polmero reticulado (Fig. 3-19). El gel de poliacrilamida acta como un
molecular tamiz, disminuyendo la migracin de las protenas de aproximadamente en
proporcin a su relacin de carga a masa. La migracin tambin puede verse afectada
por la forma de la protena. En la electroforesis, la fuerza motriz de la macromolcula es
el potencial elctrico, E. La movilidad electrofortica de la molcula,, es la relacin de
la velocidad del partcula molcula, V, para el potencial elctrico. Electrofortica La
movilidad tambin es igual a la carga neta de la molcula, Z, dividido por el coeficiente
de friccin, f, lo que refleja en parte la forma de una protena. As:
E
V
Z
F
La migracin de una protena en un gel durante la electroforesis por lo tanto, es una
funcin de su tamao y su forma. Un mtodo electrofortico emplea comnmente para
estimacin de la pureza y el peso molecular hace uso de el detergente dodecil sulfato de
sodio (SDS). SDS se une a la mayora de las protenas en cantidades ms o menos
proporcionales al peso molecular de la protena, alrededor de una molcula de SDS por
cada dos residuos de aminocidos. Los cota SDS aporta una gran carga neta negativa, lo
que hace la carga intrnseca de la protena insignificante y confiere a cada protena una
carga a masa similar proporcin. Adems, la conformacin nativa de una protena se
altera cuando se une SDS, y la mayora de las protenas asumen una forma similar. La
electroforesis en presencia de SDS por lo tanto, separa las protenas casi exclusivamente
en el base de la masa (peso molecular), con polipptidos ms pequeos migrar ms
rpidamente. Despus de la electroforesis, el las protenas se visualizaron mediante la
adicin de un colorante tal como Azul de Coomassie, que se une a las protenas, pero no
a la propio gel (Fig. 3-19b). Por lo tanto, un investigador puede controlar el progreso de
un procedimiento de purificacin de protenas como el nmero de bandas de protenas
visibles en las disminuciones gel despus de cada nueva etapa de fraccionamiento.
Cuando se compara con las posiciones a las que las protenas de la conocida molecular
migrate peso en el gel, la posicin de un no identificado protena puede proporcionar
una excelente medida de su molecular de peso (Fig. 3-20). Si la protena tiene dos o ms
diferentes subunidades, generalmente se separarn las subunidades por el tratamiento de
SDS y una banda separada aparecer para cada. El enfoque isoelctrico es un
procedimiento utilizado para determinar el punto isoelctrico (pI ) de una protena (Fig.
3-21). Un gradiente de pH se establece por lo que permite una mezcla de cidos y bases
orgnicos de bajo peso molecular ( Anfolitos ; p 81 . ) A distribuirse en una elctrica

campo generado a travs del gel. Cuando una mezcla de protenas se aplica, cada
protena migra hasta que alcanza el pH que coincide con su pI (Tabla 3-6). Las protenas
con diferentes puntos isoelctricos son as distribuidos de manera diferente en todo el
gel. La combinacin de enfoque isoelctrico y electroforesis en SDS secuencialmente en
un proceso llamado de dos dimensiones electroforesis permite la resolucin del
complejo mezclas de protenas (Fig. 3-22). Esta es una ms sensible mtodo analtico
que cualquiera electrofortica como nico mtodo. Dos dimensiones de electroforesis
separa protenas de peso molecular idntica que difieren En PI, o protenas con valores
de pI similares pero diferentes molecular pesos. Las protenas no separadas se pueden
cuantificar Para purificar una protena, que es esencial tener una forma de detectar y
cuantificar que la protena en presencia de muchas otras protenas en cada etapa del
procedimiento. A menudo, la purificacin debe proceder en ausencia de cualquier
informacin acerca de las propiedades de tamao y fsicas de la protena o sobre la
fraccin de la masa total de protenas se representa en el extracto. Para las protenas que
son enzimas, la cantidad en un extracto de solucin o tejido dado se puede medir, o
ensayar, en trminos de la cataltico efectuar la enzima produce, es decir, el aumento de
la velocidad a la que su sustrato se convierte en la reaccin productos cuando la enzima
est presente. Para este propsito hay que saber (1) la ecuacin general de la reaccin,
(2) un procedimiento analtico para la determinacin catalizada la desaparicin del
sustrato o la aparicin de un producto de reaccin, (3) si la enzima requiere cofactores
tales como iones metlicos o coenzimas, (4) la dependencia de la actividad enzimtica
de la concentracin de sustrato, (5) el pH ptimo, y (6) una temperatura zona en la que
la enzima es estable y tiene una alta actividad. Las enzimas generalmente se ensayaron a
su pH ptimo y en algn temperatura conveniente dentro de la gama 25 a 38 C. Adems,
las concentraciones muy altas de sustrato son utiliza generalmente para que la velocidad
de reaccin inicial, mide experimentalmente, es proporcional a la concentracin de
enzima (Captulo 6). Por acuerdo internacional, 1.0 unidad de actividad enzimtica se
define como la cantidad de enzima que causa la transformacin de 1,0 mol de sustrato
por minuto a 25 C en condiciones ptimas de medida. El termino la actividad se refiere
a las unidades totales de enzima en una solucin. La actividad especfica es el nmero
de enzima unidades por miligramo de protena total (Fig. 3-23). Lo especifico la
actividad es una medida de la pureza de la enzima: aumenta durante la purificacin de
una enzima y se convierte en mximo y constante cuando la enzima es puro (Tabla 35).
Los puntos isoelctricos de algunas protenas
Proteina
pl
pepsina
1.0
albmina de huevo 4,6
albmina srica
4,9
5.0 ureasa
lactoglobulina
5.2
hemoglobina
6,8
mioglobina
7.0
9.5 chymotrypsinogen
El citocromo c 10,7
11.0 lisozima
Despus de cada etapa de purificacin, la actividad de la preparacin (en unidades de
actividad de la enzima ) se ensaya, la cantidad total de protena se determina de forma
independiente, y la relacin de los dos da la actividad especfica. Actividad y protenas

totales generalmente disminuyen con cada uno paso. La actividad disminuye porque se
produce siempre una cierta prdida debido a la inactivacin o no ideales interacciones
con materiales cromatogrficos u otras molculas en la solucin. La protena total
disminuye debido a que el objetivo es eliminar la mayor cantidad de protenas no
deseadas o no especfica como posible. En un paso exitoso, la prdida de protena no
especfica es mucho mayor que la prdida de actividad; por lo tanto, actividad especfica
aumenta incluso cuando cae la actividad total . los los datos son ensamblados en una
tabla de purificacin similares con la Tabla 3-5. Una protena se considera generalmente
pura despues de Cada Etapa de Purificacin, La Actividad de la Preparacin (en
unidades de Actividad de la enzima ) se ENSAYA, la Cantidad Total de protein s
Determina de forma independiente, y La Relacin de los dos da la Actividad Especfica
Actividad Protenas Totales y generalmente disminuyen con Cada Uno Paso. La
Actividad Disminuye Porque se producir siempre Una Cierta loss DEBIDO a la
inactivacin o no Ideales Interacciones con Materiales cromatogrficos u Otras
Molculas en La Solucin . La protein total de Disminuye DEBIDO una Que El
objetivo m it ELIMINAR la Mayor Cantidad de Protenas no Deseadas o no Como
Especfica Posible . En un paso exitoso , La Perdida de protein sin Especfica Mucho
Mayor Que es La Perdida de Actividad ; por lo del tanto, Actividad Especfica Aumenta
INCLUIDO Cuando cae la Actividad total. Los Datos hijo ensamblados En Una tabla de
Purificacin SIMILARES Con La Tabla 3-5 . Una protein se considera generalmente
pura

RESUMEN 3.3 Trabajar con protenas

Las protenas se separaron y se purificaron mediante la adopcin de ventaja de las
diferencias en sus propiedades. Las protenas se pueden precipitar selectivamente por la
adicin de ciertas sales. Una amplia gama de procedimientos cromatogrficos hace uso
de diferencias de tamao, las afinidades de unin, carga, y otras propiedades. Estos
incluyen intercambio inico, de exclusin por tamao, afinidad y de alto rendimiento
cromatografa lquida.
electroforesis separa protenas sobre la base de masa o carga . electroforesis en gel de
SDS y isoelectroenfoque se pueden utilizar por separado o en combinacin para una
mayor resolucin .
Todos los procedimientos de purificacin requieren un mtodo para cuantificar o
ensayo de la protena de inters en presencia de otras protenas. Purificacin se puede
controlar mediante el ensayo de actividad especfica.
3.4 La estructura covalente de protenas
La purificacin de una protena es por lo general slo un preludio a una diseccin
bioqumica detallada de su estructura y funcin. Qu es lo que hace que una protena
de una enzima, otro una hormona, otra una protena estructural, y todava otro un
anticuerpo? En qu difieren qumicamente? Las distinciones ms evidentes son
estructurales, y estos distinciones pueden ser abordados en todos los niveles de la
estructura definido en la figura 3-16. Las diferencias en la estructura primaria pueden
ser especialmente informativo. Cada protena tiene un nmero distintivo y la secuencia
de residuos de aminocidos. Como veremos ver en el captulo 4, la estructura primaria
de una protena determina la forma en que se pliega en una nica tridimensional

estructura, y esto a su vez determina la funcin de la protena. Estructura primaria es el

foco de el resto de este captulo. Consideremos en primer lugar emprica pistas que la
secuencia de aminocidos y la funcin de protenas se estrechamente vinculados, a
continuacin, describir cmo secuencia de cido amino est determinado; Finalmente,
describimos los muchos usos a los que se esta informacin se puede poner. La funcin
de una protena depende de Su secuencia de aminocidos La bacteria Escherichia coli
produce ms de 3.000 protenas diferentes; un humano produce 25.000 a 35.000. En
ambos casos, cada tipo de protena tiene un nico estructura tridimensional y esta
estructura confiere una funcin nica. Cada tipo de protena tambin tiene un nico
secuencia de aminocidos. La intuicin sugiere que el amino secuencia de cido debe
desempear un papel fundamental en la determinacin la estructura tridimensional de la
protena, y en ltima instancia su funcin, pero es correcta esta suposicin? Una
encuesta rpida de las protenas y cmo varan en secuencia de aminocidos
proporciona una serie de emprica pistas que ayude a corroborar la importante relacin
entre la secuencia de aminocidos y la funcin biolgica.
En primer lugar, como ya hemos sealado, las protenas con diferente funciones siempre
tienen diferentes secuencias de aminocidos. En segundo lugar, miles de enfermedades
genticas humanas han sido relacionados con la produccin de protenas defectuosas.
Tal vez un tercio de estas protenas son defectuosos a causa de un solo cambio en su
secuencia de aminocidos; Por lo tanto, si la estructura primaria se altera, la funcin de
de la protena tambin puede ser cambiado. Por ltimo, en la comparacin protenas
funcionalmente similares de diferentes especie, nos encontramos con que estas protenas
tienen a menudo similares secuencias de aminocidos. Un caso extremo es la ubiquitina,
una la protena de 76 residuos que participan en la regulacin de la degradacin de otras
protenas. La secuencia de aminocidos de la ubiquitina es idntico en especies tan
dispares como las moscas de la fruta y los seres humanos. Es la secuencia de
aminocidos absolutamente fijo, o invariante, para una protena particular? No; cierta
flexibilidad es posible. Se estima que un 20% a 30% de las protenas en los seres
humanos son polimrficos, que tiene la secuencia de aminocidos variantes en la
poblacin humana. Muchas de estas variaciones en secuencia tienen poco o ningn
efecto sobre la funcin de de la protena. Adems, las protenas que llevan a cabo una
funcin muy similares en especies alejadas posible diferir mucho en tamao y secuencia
total de aminocidos. Aunque la secuencia de aminocidos en algunas regiones de la
estructura primaria puede variar considerablemente sin que afecta a la funcin
biolgica, la mayora de las protenas contienen regiones cruciales que son esenciales
para su funcin y por lo tanto, cuya secuencia se conserva. La fraccin de la secuencia
general que es crtica vara de protenas a la protena, lo que complica la tarea de
secuencia relativa a estructura tridimensional, y la estructura para funcionar. Antes de
que podamos considerar este problema adicional, sin embargo, debemos examinar cmo
la informacin de secuencia se obtiene.
El cido secuencias de aminocidos Millones de protenas se han determinado Dos
descubrimientos ms importantes en 1953 fueron de importancia fundamental en la
historia de la bioqumica. En ese ao, James D. Watson y Francis Crick dedujeron la
doble hlice estructura del ADN y propuesto una base estructural para su rplica exacta
(captulo 8 ) . Su propuesta iluminado la realidad molecular detrs de la idea de un gen.
En ese mismo ao , Frederick Sanger funcion la secuencia de residuos de aminocidos
en las cadenas polipeptdicas de la hormona insulina (Fig . 3-24), sorprendiendo a
muchos los investigadores que haban pensado durante mucho tiempo que la

elucidacin de la secuencia de aminocidos de un polipptido sera una

irremediablemente tarea difcil. Pronto se hizo evidente que la secuencia de nucletidos
en el ADN y el aminocido secuencia de protenas se relaciona de alguna manera.
apenas una dcada despus de estos descubrimientos , el papel del nucletido secuencia
de ADN en la determinacin de la secuencia de aminocidos de molculas de protena
fue revelado (Captulo 27) . Un enorme nmero de secuencias de protenas puede ser
ahora derivada indirectamente de las secuencias de ADN en el rpido creciente de bases
de datos del genoma. Sin embargo , muchos todava deduce por los mtodos
tradicionales de la secuenciacin de polipptidos. Las secuencias de aminocidos de
miles de diferentes protenas de muchas especies se han determinado utilizando
principios desarrollaron por primera vez por Sanger . estos mtodos todava estn en uso
, aunque con muchas variaciones y mejorasnen detalle. la secuenciacin de protenas
qumica ahora Secuencia de ADN en la determinacion de la Secuencia de Aminocidos
de Molculas de protein FUE revelado ( Captulo 27 ) . Un norme Nmero de
Secuencias de Protenas Puede Ser Ahora derivada indirectamente de las Secuencias de
ADN en El Rpido Creciente de Bases de Datos del Genoma . Sin embargo , el Muchos
todava deducir Por los Mtodos Tradicionales de la secuenciacin de polipptidos . Las
Secuencias de Aminocidos de millas de Diferentes Protenas de los muchas species se
han de Determinado utilizando Principios desarrollaron Por Primera Vez por Sanger .
Mtodos de Ests todava estan en la USO , AUNQUE con los muchas Variaciones y
Mejoras en detalle . La secuenciacin de Protenas Qumica Ahora
Para secuenciar un polipptido entero, un producto qumico por lo general se emplea
mtodo ideado por Pehr Edman. Las etiquetas y elimina procedimiento de degradacin
de Edman nicamente el residuo amino-terminal de un pptido, dejando el resto de
enlaces peptdicos intacta (Fig. 3-25b). los pptido se hace reaccionar con isotiocianato
de fenilo bajo condiciones ligeramente alcalinas, que convierte el aminoterminal amino
cido a una feniltiocarbamoil (PTC) efectuar la aduccin. El enlace peptdico al lado del
aducto de PTC es luego escindido en una etapa llevada a cabo en trifluoroactico
anhidro cido, con eliminacin de la amino amino-terminal cido como un derivado
anilinothiazolinone. el derivado cido amino se extrae con disolventes orgnicos, se
convirti al derivado ms estable feniltiohidantona por tratamiento con cido acuoso, y
luego identificado. El uso de reacciones secuenciales lleva a cabo bajo primero
condiciones bsicas y luego cidas proporciona control sobre todo el proceso. Cada
reaccin con el aminoterminal aminocido puede ir fundamentalmente a la finalizacin
sin afectar a cualquiera de los otros enlaces peptdicos en el pptido. Despus de la
separacin e identificacin de la aminoterminal residuo, el nuevo residuo aminoterminal por lo expuestos pueden ser etiquetados, retirado, e identificaron a travs de la
misma serie de reacciones. Este procedimiento es repite hasta que se determin la
secuencia completa. Los degradacin de Edman se lleva a cabo en una mquina,
llamada un secuenciador, que mezcla los reactivos en las proporciones adecuadas, que
separa a los productos, los identifica, y registra los resultados. Estos mtodos son
extremadamente sensibles. A menudo, la secuencia completa de aminocidos puede ser
determinada a partir de slo unos pocos microgramos de protena. La longitud del
polipptido que puede ser precisa secuenciado por la degradacin de Edman depende de
la eficiencia de las etapas qumicas individuales. Considere una pptido que comienza
con la secuencia Gly-Pro-Lys-a su extremo amino terminal. Si glicina se eliminaron con
un 97% eficiencia, 3% de las molculas de polipptido en la solucin retendra un
residuo Gly en su extremo amino terminal.

En el segundo ciclo de Edman, 97% de la amino liberado cidos seran prolina, glicina y
3%, mientras que 3% de la molculas de polipptido conservaran Gly (0,1%) o Pro
(2,9%) Los residuos en su extremo amino terminal. En cada ciclo, pptidos que no
reaccionan en ciclos anteriores contribuiran aminocidos a un fondo cada vez mayor,
finalmente lo que es imposible determinar qu aminocido es el siguiente en la
secuencia del pptido originales. secuenciadores modernos alcanzan eficiencias de
mejor que 99% por ciclo, permitiendo la secuenciacin de ms de 50 residuos de
aminocidos contiguos en un polipptido. Los estructura primaria de la insulina,
elaborado por Sanger y colegas durante un perodo de 10 aos, ahora podra ser
completamente determinado en un da o dos.
Grandes protenas deben ser secuenciados en segmentos ms pequeos
La precisin global de la secuenciacin de aminocidos en general disminuye a medida
que la longitud de los incrementos de polipptidos. Los polipptidos muy grandes que
se encuentran en las protenas deben ser roto en pedazos ms pequeos para ser
secuenciados de manera eficiente. Hay varios pasos en este proceso. Primero el protena
se escinde en un conjunto de fragmentos especficos de procedimientos qumicos o
enzimticos. Si alguna enlaces disulfuro estn presentes, deben ser roto. Cada fragmento
es purificado, a continuacin, se secuencian mediante el procedimiento de Edman.
Finalmente, el orden en que los fragmentos aparecen en el original protena se
determina y enlaces disulfuro (si los hay) son situado. La ruptura de enlaces disulfuro
enlaces disulfuro interfieren con el procedimiento de secuenciacin. Un residuo de
cistina (Fig. 3-7) que tiene uno de sus enlaces peptdicos escindida por la Edman
procedimiento puede permanecer unido a otro polipptido hebra a travs de su enlace
disulfuro. Los enlaces disulfuro tambin interfieren con la escisin enzimtica o
qumica de la polipptido. Dos enfoques a la rotura irreversible de enlaces disulfuro se
resumen en la figura 3-26. La escisin de la cadena del polipptido Varios mtodos
pueden ser utilizado para la fragmentacin de la cadena de polipptido. Las enzimas
llamadas proteasas catalizan la escisin hidroltica de enlaces peptdicos . Algunas
proteasas escinden slo el pptido enlace adyacente a residuos particulares de
aminocidos (Tabla 3-7) y por lo tanto un fragmento de la cadena de polipptido en una
predecible y de forma reproducible. Un nmero de producto qumico Tambin reactivos
escindir el enlace peptdico adyacente especfica residuos. Entre las proteasas , la
enzima digestiva tripsina cataliza la hidrlisis de los enlaces peptdicos slo en que el
grupo carbonilo es aportado por cualquiera de una Lys o un residuo de Arg,
independientemente de la longitud o cido amino secuencia de la cadena. El nmero de
pptidos ms pequeos producida por escisin con tripsina de este modo se puede
predecir a partir del nmero total de residuos de Lys o Arg en el original polipptido,
segn lo determinado por hidrlisis de un intacta muestra (Fig. 3-27). Un polipptido
con cinco Lys y / o Arg residuos generalmente producir seis pptidos ms pequeos en
la escisin con tripsina. Por otra parte, todos excepto uno de stos tendr un Lys
carboxilo-terminal o Arg. los fragmentos producidos por la tripsina (u otra enzima o
qumica) la accin se separ despus de cromatografa o mtodos electroforticos. La
secuenciacin de los pptidos Cada fragmento de pptido resultante de la accin de la
tripsina se secuencia por separado el procedimiento de Edman. Ordenar fragmentos
peptdicos El fin de la "tripsina fragmentos "en la cadena de polipptido original debe
ahora ser determinado. Otra muestra del polipptido intacto se escinde en fragmentos
utilizando una enzima diferente o reactivo, que escinde enlaces peptdicos en puntos
distintos de los escindido por tripsina. Por ejemplo, el bromuro de ciangeno escinde
nicamente los enlaces peptdicos en que el grupo carbonilo es aportado por Met. los

fragmentos resultantes de este segundo procedimiento son entonces separado y

secuenciado como antes.
Las secuencias de aminocidos de cada fragmento obtenido por los dos procedimientos
de escisin son examinados, con el objetivo de encontrar pptidos a partir de la segunda
procedimiento cuyas secuencias establecer la continuidad, porque de empalme, entre los
fragmentos obtenidos por el primer procedimiento de escisin (Fig. 3-27). La
superposicin pptidos obtenidos a partir de la segunda rendimiento fragmentacin el
orden correcto de los fragmentos peptdicos producidos en el primero. Si el aminocido
amino-terminal se ha identificado antes de la escisin original de la protena, esta
informacin puede ser utilizado para establecer que fragmento es derivado del extremo
amino terminal. Los dos conjuntos de fragmentos puede ser comparado de los posibles
errores en la determinacin de la secuencia de aminocidos de cada fragmento. Si el
segundo procedimiento de escisin no logra establecer la continuidad entre todos los
pptidos de la primera hendidura, una tercio o incluso un cuarto mtodo de
desdoblamiento debe ser usado para obtener un conjunto de pptidos que puede
proporcionar la necesaria superposicin (s).
Localizacin de los enlaces disulfuro
Si la estructura primaria incluye enlaces disulfuro, se determinan sus ubicaciones en una
etapa adicional despus de la secuenciacin se ha completado. UN muestra de la
protena se escinde de nuevo con un reactivo tal como tripsina, esta vez sin romper el
primero enlaces disulfuro. Los pptidos resultantes se separan por electroforesis y se
compara con el conjunto original de pptidos generados por la tripsina. Para cada enlace
disulfuro, dos de los pptidos originales sern desaparecidos y una nueva, aparecer
pptido ms grande. Los dos pptidos que faltan representar las regiones del polipptido
intacto que son unidos por el enlace disulfuro. Las secuencias de aminocidos puede
deducirse tambin por otros mtodos El enfoque descrito anteriormente no es la nica
manera de determinar secuencias de aminocidos. Nuevos mtodos basados en
espectrometra de masas permite la secuenciacin de corta polipptidos (de 20 a 30
residuos de aminocidos) en slo una pocos minutos (Recuadro 3-2). Adems, con el
desarrollo de mtodos rpidos de secuenciacin de ADN (captulo 8), la elucidacin del
cdigo gentico (captulo 27), y el desarrollo de tcnicas para el aislamiento de genes
(Captulo 9), los investigadores pueden deducir la secuencia de una polipptido
mediante la determinacin de la secuencia de nucletidos en el gen que (Fig. 3-28)
cdigos para ello. las tcnicas Se utiliza para determinar las secuencias de protenas y
ADN son complementarias. Cuando el gen est disponible, la secuenciacin del ADN
puede ser ms rpido y ms preciso que la secuenciacin la protena. La mayora de las
protenas son ahora secuenciados en este indirecta camino. Si no se ha aislado el gen, la
secuenciacin directa de pptidos es necesario, y esto puede proporcionar informacin
(la ubicacin de enlaces disulfuro, por ejemplo) no est disponible en una secuencia de
ADN. Adems conocimiento de la secuencia de aminocidos de incluso una parte de un
polipptido puede facilitar enormemente el aislamiento de la gen correspondiente
(captulo 9).
La variedad de mtodos ahora disponibles para analizar tanto protenas y cidos
nucleicos est marcando el comienzo de una nueva disciplina de " la bioqumica clula
entera . " La secuencia completa de ADN de un organismo , su genoma , ya est
disponible para los organismos que van desde virus a las bacterias a eucariotas
multicelulares ( vase la Tabla 1-4 ) . Los genes se estn descubierta por los millones,
incluyendo muchos que codifican protenas con funcin conocida. Para describir la toda

complemento protena codificada por un organismo de ADN, los investigadores han

acuado el trmino proteoma. como se describe en el captulo 9, las nuevas disciplinas
de la genmica y la protemica estn complementando el trabajo llevado a cabo en el
metabolismo intermediario celular y el cido nucleico metabolismo para proporcionar
un nuevo y cada vez ms completa la imagen de la bioqumica a nivel de las clulas e
incluso organismos.
TRABAJO EN BIOQUMICA
La investigacin de protenas con espectrometra de masas El espectrmetro de masas
ha sido durante mucho tiempo un elemento indispensable herramienta en la qumica.
Las molculas a analizar, que se refiere como analitos, se ionizan primero en un vaco.
Cuando se introducen las nuevas molculas cargadas en un campo elctrico y / o
magntico, sus caminos a travs del campo estn en funcin de su relacin masa-carga
relacin, m / z. Esta propiedad medido de la ionizado especies se pueden utilizar para
deducir la masa (M) de la analito con una precisin muy alta. Aunque la espectrometra
de masas ha estado en uso durante muchos aos, no se podran aplicar a las
macromolculas tales como protenas y cidos nucleicos. Las mediciones M / Z se
realizan en las molculas en la fase de gas, y el calentamiento u otro tratamiento
necesario para transferir una macromolcula a la fase de gas causada generalmente su
descomposicin rpida. En 1988, dos tcnicas diferentes se han desarrollado para
superar este problema. En uno, las protenas se colocan en una matriz de absorcin de
luz. Con un breve pulso de luz lser, las protenas se ionizan y luego desorbido de la
matriz en el vaco sistema. Este proceso, conocido como matriz asistida por lser de la
espectrometra de masas de desorcin / ionizacin, o MALDI MS, se ha utilizado con
xito para medir la masa de una amplia gama de macromolculas. En un segundo y el
mismo xito mtodo, macromolculas en solucin son forzados directamente desde el
lquido a fase gaseosa. Una solucin de analitos se hace pasar a travs de una aguja
cargada que se mantiene a un alto potencial elctrico, dispersar la solucin en una fina
niebla de microgotas cargadas. El disolvente que rodea a la macromolculas
rpidamente se evapora, y el resultante iones macromoleculares multiplican cargadas
son as introducidos no destructiva en la fase gas. Esta tcnica se llama electrospray
espectrometra de masas de ionizacin, o ESI MS. Los protones aaden durante el paso
a travs de la aguja dar cargo adicional para el macromolcula. El m / z de la molcula
puede ser analizado en la cmara de vaco. La espectrometra de masas proporciona una
gran cantidad de informacin para la investigacin protemica, enzimologa, y
protenasla qumica en general. Las tcnicas slo requieren minsculas cantidades de
muestra, de manera que puedan ser fcilmente aplicada a las pequeas cantidades de
protena que se puede extrado de un gel de electroforesis bidimensional. La masa
molecular medido con precisin de una protena es uno de los parmetros crticos de su
identificacin. Una vez que la masa de una protena se conoce con precisin, la masa
espectrometra es un mtodo conveniente y preciso para detectar cambios en la masa
debido a la presencia de cofactores unidos, iones metlicos unidos, modificaciones
covalentes, y as.
El proceso para determinar la masa molecular de una protena con ESI MS se ilustra en
la Figura 1. Como se inyecta en la fase de gas , una protena adquiere una nmero
variable de protones , y por lo tanto las cargas positivas , a partir del disolvente . Esto
crea un espectro de especies con diferentes relaciones masa -carga . cada sucesiva pico

corresponde a una especie que difiere de la de su vecina por un pico de diferencia de

carga de 1 y una diferencia de masa de 1 ( 1 protn). La masa de la protena puede
determinarse a partir de cualquiera de los dos vecinos picos . El m / z medido de un pico
es
(m/z)=M+nX
n
donde M es la masa de la protena
n2 es el nmero de los cargos
X es la masa de los grupos agregadosm(protones en este caso). Del mismo modo para
los vecinos pico,
(m/z) = M+(n+1)X
n
(Ahora tenemos dos incgnitas (M y n2) y dos ecuaciones. Podemos resolver primero
para n2 y luego para M :
n2 = (m/z) - X
(m/z) - (m/z)
M = n ((m/z) - X)
Este clculo utilizando los valores de m / z para cualquier dos picos en un espectro tal
como la mostrada en la Figura 1b por lo general proporciona la masa de la protena ( en
este caso, aerolisina k; 47.342 Da) con un error de slo 0,01 %. Generacin de varios
conjuntos de picos, repetir el clculo, y promediando los resultados generalmente
proporciona una Incluso valor ms exacto para los algoritmos informticos M. puede
transformar el espectro m / z en un solo pico que Tambin proporciona una medicin
muy precisa de masas ( Fig .1b , recuadro) .
La espectrometra de masas tambin se puede utilizar para secuenciar tramos cortos de
polipptido, una aplicacin que tiene convertido en una valiosa herramienta para
identificar rpidamente protenas desconocidas . La informacin de secuencia se extrae
usando una tcnica llamada tndem MS o MS / MS. La solucin que contiene la
protena est bajo investigacin tratados primero con un reactivo de la proteasa o
qumica para hidrolizar a una mezcla de pptidos ms cortas. La mezcla A continuacin
se inyecta en un dispositivo que es esencialmente dos espectrmetros de masas en
tndem ( Fig. 2a , arriba) . En la primera , la mezcla de pptidos se clasifica y el
ionizado fragmentos son manipulados de modo que slo una de las varios tipos de
pptidos producidos por escisin emerge en el otro extremo .
La muestra de la seleccionada pptido, cada molcula de los cuales tiene una carga en
alguna parte a lo largo de su longitud, luego se desplaza a travs del vaco cmara entre
los dos espectrmetros de masas. En esto celda de colisin, el pptido se fragmenta an
ms por impacto de alta energa con un "gas de colisin," una pequea cantidad de un
gas noble tal como helio o argn que es sangrado en la cmara de vaco. Este
procedimiento est diseado fragmentar muchas de las molculas de pptidos en la
muestra, con cada pptido individual roto en un solo lugar, en promedio. La mayora de
las roturas se producen en pptido cautiverio. Esta fragmentacin no implica la adicin
de agua (que se realiza en un vaco casi), por lo que la productos pueden incluir
radicales de iones moleculares tales como radicales carbonilo (Fig. 2a, abajo). La carga
de la pptido original se conserva en uno de los fragmentos generado a partir de ella. El
segundo espectrmetro de masas mide despus la proporciones m / z de todos los

fragmentos cargados (sin cargafragmentos no se detectan). Esto genera una o ms

conjuntos de picos. Un conjunto dado de picos (Fig. 2b) consiste de todos los
fragmentos cargados que se generaron rompiendo el mismo tipo de enlace (pero en
diferentes los puntos en el pptido) y se derivan de la misma lado de la rotura del
enlace, o bien el carboxilo o amino-terminal lado. Cada pico sucesivo en un dado
conjunto tiene uno menos aminocidos que el pico antes. Los diferencia en la masa de
pico a pico identifica el cido amino que se perdi en cada caso, lo que revela la
secuencia del pptido. Las nicas ambigedades implican leucina e isoleucina, que
tienen la misma masa.
La carga en el pptido puede ser retenido en ambos el carboxilo o un fragmento aminoterminal, y bonos que no sean el enlace peptdico se pueden dividir en el proceso de
fragmentacin, con el resultado de que mltiples conjuntos de picos normalmente se
generan. Los dos ms conjuntos prominentes generalmente consisten en fragmentos
cargados derivada de la rotura de los enlaces peptdicos. El conjunto que consiste de los
fragmentos carboxilo-terminal puede ser sin ambigedad distingue de la que consiste en
los fragmentos amino-terminal. Debido a que el vnculo roturas generadas entre los
espectrmetros (en el celda de colisin) no dan plena carboxilo y amino grupos en los
sitios de las pausas, la nica intacta - amino y grupos carboxilo en los fragmentos
peptdicos son los que estn en los confines (Fig. 2A). Los dos conjuntos de fragmentos
de este modo se pueden identificar por la resultante ligeras diferencias en la masa. La
secuencia de aminocidos derivado de un conjunto pueden ser confirmadas por el otra,
la mejora de la confianza en la informacin de la secuencia adquirido. Incluso una
secuencia corta es a menudo suficiente para permitir asociacin inequvoca de una
protena con su gen, si la secuencia del gen se conoce. La secuenciacin en masa
espectrometra no puede sustituir a la degradacin de Edman procedimiento para la
secuenciacin de polipptidos largos, pero es ideal para la investigacin protemica
cuyo objetivo es catalogar los cientos de protenas celulares que podran ser se
separaron en un gel de dos dimensiones. En los prximos dcadas, detalladas secuencia
genmica de datos estarn disponibles cientos de miles, eventualmente, de los
organismos. La capacidad de asociar rpidamente protenas con genes utilizando la
espectrometra de masas facilitar en gran medida la explotacin de esta informacin
extraordinaria recurso.
Pequeos pptidos y protenas se pueden qumicamente sintetizado.
Muchos pptidos son potencialmente tiles como farmacolgico
agentes, y su produccin es de considerable comercial importancia. Hay tres maneras de
obtener una pptido: (1) la purificacin a partir de tejido, una tarea a menudo hace
difcil por las infinitamente bajas concentraciones de algunos pptidos; (2) la ingeniera
gentica (captulo 9); o (3) dirigir sntesis qumica. tcnicas de gran alcance ahora hacen
qumica dirigir la sntesis de una opcin atractiva en muchos casos. Adems de las
aplicaciones comerciales, la sntesis partes de pptido de especficos de protenas ms
grandes es una herramienta cada vez ms importante para el estudio de protenas
estructura y funcin. La complejidad de las protenas hace que el tradicional enfoques
sintticos de la qumica orgnica poco prctico para pptidos con cido ms de cuatro o
cinco amino residuos. Un problema es la dificultad de la purificacin de la producto
despus de cada paso. El gran avance en esta tecnologa era proporcionado por R. Bruce
Merrifield en 1962. Su innovacin involucrados sntesis de un pptido mientras que lo
mantiene unido en un extremo a un soporte slido. El soporte es una polmero insoluble

(resina) contenida dentro de una columna, similar a la utilizada para los procedimientos
cromatogrficos. El pptido se construye sobre este soporte de un aminocido a la vez
utilizando un conjunto estndar de reacciones en una repeticin ciclo (Fig. 3-29). En
cada paso sucesivo de la ciclo, grupos qumicos protectores bloquean no deseado
reacciones. La tecnologa para la sntesis qumica de pptidos es Ahora automatizado.
Al igual que en las reacciones de secuenciacin ya considerado, la limitacin ms
importante del proceso de es la eficiencia de cada ciclo qumico, como se puede ver
mediante el clculo de los rendimientos globales de los pptidos de diferentes
longitudes cuando el rendimiento para la adicin de cada nuevo amino cido es 96,0 %
frente a 99,8 % (Tabla 3-8). reaccin incompleta en una fase pueden conducir a la
formacin de una impureza (En la forma de un pptido ms corto) en el siguiente. Los
la qumica ha sido optimizado para permitir la sntesis de protenas de 100 residuos de
aminocidos en un par de das en rendimiento razonable. Un enfoque muy similar se
utiliza para sintetizar cidos nucleicos (ver Fig. 8-38) . Vale la pena sealar que esta
tecnologa , impresionante, ya que es , todava palidece cuando se compara con los
procesos biolgicos. Lo mismo protena de 100 aminocidos se sintetiza con exquisita
fidelidad en unos 5 segundos en una clula bacteriana. Una variedad de nuevos mtodos
para la ligacin eficiente (Unin) de los pptidos ha hecho posible el montaje de
pptidos sintticos en protenas ms grandes. Con estos mtodos, formas novedosas de
protenas se pueden crear con grupos qumicos posicionado precisamente, incluyendo
los que no podran normalmente ser encontrado en una protena celular. Estas nuevas
formas de proporcionar nuevas maneras de probar las teoras de la catlisis enzimtica ,
para crear protenas con nuevo propiedades qumicas , y para disear secuencias de
protenas que se pliegan en estructuras particulares. Esta ltima aplicacin proporciona
la prueba definitiva de nuestra creciente capacidad relacionar la estructura primaria de
un pptido a la Tridimensional estructura que ocupa en solucin.
Las secuencias de aminocidos proporcionan importantes informacin bioqumica El
conocimiento de la secuencia de aminocidos en una protena puede ofrecer una visin
de su estructura tridimensional y su funcin, localizacin celular, y la evolucin. Ms de
estas ideas se derivan mediante la bsqueda de similitudes con otras secuencias
conocidas. Miles de secuencias son conocidos y disponibles en bases de datos
accesibles a travs de Internet. Una comparacin de un recin secuencia obtenida con
este gran banco de secuencias almacenadas a menudo revela las relaciones a la vez
sorprendente y esclarecedor. Exactamente cmo la secuencia de aminocidos determina
estructura tridimensional no se entiende en detalle, ni podemos predecir siempre la
funcin de la secuencia. Sin embargo, las familias de protenas que han compartido
algunos estructural o caractersticas funcionales se pueden identificar fcilmente en la
base de similitudes de secuencia de aminocidos. Individual protenas se asignan a las
familias en funcin del grado de similitud en la secuencia de aminocidos. Los
miembros de una familia son generalmente idnticos a travs de 25% o ms de sus
secuencias, y las protenas en estas familias comparten en general al menos algunas
caractersticas estructurales y funcionales. Algunas familias se definen, sin embargo, por
las identidades que implican slo unos pocos residuos de aminocidos que son crticos
a una cierta funcin. Un nmero de subestructuras similares (Que se define en el
captulo 4 como "dominios") se producen en muchas protenas funcionalmente
relacionadas. Estos dominios menudo doblar en configuraciones estructurales que tienen
una inusual grado de estabilidad o que estn especializados para un determinado
ambiente. Las relaciones evolutivas tambin pueden ser inferidas de las similitudes
estructurales y funcionales dentro de las familias de protenas. Ciertas secuencias de

aminocidos sirven como seales que determinar la localizacin celular, modificacin

qumica, y la vida media de una protena. una secuencia de seales especiales, por lo
general en el extremo amino, se utilizan para orientar cierta protenas para la
exportacin de la clula; otras protenas estn dirigidos para su distribucin al ncleo, la
superficie celular, el citosol, y otras localizaciones celulares. otras secuencias actuar
como sitios de unin para grupos prostticos, tales como grupos de azcar en las
glicoprotenas y lpidos en lipoprotenas. Algunas de estas seales estn bien
caracterizados y son fcilmente reconocido en la secuencia de un recin caracterizado
protenas (Captulo 27)
.
RESUMEN 3.4 La estructura covalente de protenas
Las diferencias en resultado de la funcin de protenas a partir de las diferencias en la
composicin de aminocidos y secuencia. Algunas variaciones en la secuencia son
posible para una protena particular , con poca o ningn efecto sobre la funcin.
Las secuencias de aminocidos se deducen por fragmentar polipptidos en pptidos
ms pequeos utilizando reactivos conocidos, para escindir el pptido especfico
cautiverio; la determinacin de la secuencia de aminocidos de cada fragmento por el
Edman automatizada procedimiento de degradacin ; a continuacin, se ordena la
fragmentos de pptidos mediante la bsqueda de la secuencia de superposiciones entre
los fragmentos generados por diferentes reactivos. Una secuencia de la protena tambin
puede ser deducida de la secuencia de nucletidos de su gen correspondiente en el
ADN.
protenas y pptidos cortos (hasta aproximadamente 100 residuos) se puede sintetizar
qumicamente. los pptido se construye , un residuo de aminocido en un tiempo, sin
dejar de ser atado a un slido apoyo.
3.5 Secuencias de Protenas y Evolucin
El simple cadena de letras que denotan la secuencia de aminocidos de una protena
dada contradice la gran cantidad de informacin esta secuencia se mantiene. A medida
que ms secuencias de protenas se han vuelto disponibles, el desarrollo de ms potente
mtodos para extraer informacin de ellos tiene convertido en una empresa bioqumica
importante. Cada protena de la funcin se basa en su estructura tridimensional, la cual a
su vez a su vez, est determinada en gran parte por su estructura primaria . Por lo tanto,
la informacin bioqumica transportado por una protena secuencia es , en principio,
limitado slo por nuestra propia comprensin de los principios estructurales y
funcionales . En un nivel diferente de la investigacin , las secuencias de protenas estn
empezando para decirnos cmo evolucionaron las protenas y, en ltima instancia, cmo
evolucion la vida en este planeta
Las secuencias de protenas puede Dilucidar Historia de la vida en la Tierra El campo de
la evolucin molecular a menudo se remonta a Emile Zuckerkandl y Linus Pauling,
cuyo trabajo en el mediano 1960 avanz el uso de secuencias de nucletidos y protenas
para explorar la evolucin. La premisa es engaosamente sencillo. Si dos organismos
estn estrechamente relacionados, la secuencias de sus genes y las protenas deben ser
similares. Las secuencias divergen cada vez ms como el evolutivo la distancia entre
dos organismos aumenta. Los promesa de este enfoque comenz a realizarse en el 1970,
cuando Carl Woese utiliza secuencias de ARN ribosomal para definir arqueobacterias
como un grupo de organismos vivos distinta de otras bacterias y eucariotas (vase la fig.
1-4). Secuencias de protenas ofrecen una oportunidad de gran refinar la informacin
disponible. Con el advenimiento de proyectos genoma que investigan los organismos de

bacterias a los seres humanos, el nmero de secuencias disponibles est creciendo a una
velocidad enorme. Esta informacin puede ser utilizada para trazar la historia biolgica.
El reto est en el aprendizaje leer los jeroglficos genticos. La evolucin no ha tomado
un camino lineal simple. Complejidades abundan en intento de explotar la evolucin
informacin almacenada en las secuencias de protenas. Para una dada protenas, los
residuos de aminocidos esenciales para la actividad de la protena se conservan durante
el tiempo evolutivo. Los residuos que son menos importantes para la funcin puede
variar con el tiempo, es decir, un aminocido puede sustituir para otro y estos residuos
variables pueden proporcionar La informacin utilizada para rastrear la evolucin. Las
sustituciones de aminocidos no siempre son aleatorios, sin embargo. En algunas
posiciones en la estructura primaria, la necesidad de mantener funcin de la protena
puede significar que solo aminocido particular, sustituciones de aminocidos pueden
ser toleradas. Algunas protenas tienen ms residuos de aminocidos variables que otros.
Para stos y otras razones, las protenas pueden evolucionar a un ritmo diferente.