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Lab Oratorio 1 Rev Guia 03
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ESPECTROFOTOMETRA: CUANTIFICACIN
1. Aspectos tericos de espectrofotometra cuantitativa
La absorcin de luz por parte de una sustancia es una propiedad caracterstica de ella,
que puede ser utilizada para su identificacin y cuantificacin.
Todas las sustancias absorben luz en alguna regin del espectro electromagntico (VIS,
UV, IR, etc.).
La absorcin de luz depende de la estructura qumica del compuesto absorbente, y en
especial de ciertos grupos funcionales, de modo que es posible identificar un
compuesto por medio de las caractersticas de su espectro de absorcin.
NAD+
NADH
260
Figura 1.
300
340
nm
Ley de Lambert-Beer
Lambert y Beer demostraron que la absorbancia (A), tambin llamada densidad ptica
(D.O.) de una sustancia es directamente proporcional a la concentracin (c) de la
sustancia absorbente, la longitud del paso de luz (l) (espesor de la solucin) y una
constante denominada coeficiente de extincin o coeficiente de absorcin (a), que es
caracterstico para cada sustancia a una longitud de onda () determinada.
A = a l c
Ecuacin 1.1
Para medir la absorbancia de una sustancia se utiliza el espectrofotmetro, instrumento
destinado a medir la absorcin por especies inorgnicas y orgnicas de luz
monocromtica en la regin ultravioleta / visible del espectro.
1
Ecuacin 1.2
Anlisis espectrofotomtrico:
Todo mtodo espectrofotomtrico se basa en la comparacin de la absorbancia de una
sustancia de concentracin desconocida con la de una solucin de la misma sustancia
cuya concentracin se conoce y a la cual se denomina solucin patrn o estndar.
La absorbancia de una solucin es la resultante de la absorbancia del soluto cuya
concentracin se desea conocer y la de otros componentes del sistema (solventes,
reactivos) que absorben tambin a esa longitud de onda. Estos compuestos se
denominan interferencias. Se debe descartar la absorbancia de las interferencias, para
ello es necesario hacer siempre una muestra que contenga todas los componentes del
sistema menos aquel que se desea medir. Esta muestra se llama blanco y la
absorbancia de ste debe restarse a las muestras problema y a los patrones, o bien,
con el blanco se calibra el instrumento a absorbancia igual a 0, o sea 100% de
transmisin.
Curva de Calibrado :
Se obtiene la curva de calibrado midiendo la absorbancia de una serie de soluciones de
concentraciones conocidas de una misma sustancia tratadas con un mismo mtodo y
medidas a igual longitud de onda en el mismo instrumento. Para medir la concentracin
de una sustancia se elige por lo general, la regin de mxima absorcin del espectro,
denominada longitud de onda analtica.
El resultado se expresa en una grfica de la absorbancia (A) en funcin de la
concentracin (c). Si el sistema sigue la ley de Lambert-Beer se obtiene una lnea recta
que pasa cerca del origen; de cuya pendiente se puede obtener el coeficiente de
extincin (a) (Ecuacin 1.3).
Es posible determinar grficamente la concentracin de una muestra desconocida (cx)
midiendo la absorbancia de la muestra (Ax) e interpolando en la curva de calibrado.
Normalmente la concentracin se estima, a partir de la ecuacin de la curva de
calibrado.
A = a l c + Ao
Ecuacin 1.3
A =
+ Ao
Ecuacin 1.4
cx
A X Ao
Ecuacin 1.5
vf * cf
Ecuacin 1.6
v
v
AS cmp
f mp
v
v
AMP CS
Ecuacin 1.7
s
Unidades.
Absorbancia (A): Adimensional (sin unidades)
Longitud (l):
cm
Concentracin (c):
molar,
milimolar,
g/100 mL
Coeficiente de extincin (a)
molar ()
M-1 cm-1
L moles-1 cm-1
mL milimoles-1 cm-1
milimolar ()
mM -1 cm-1
L mmoles-1 cm-1
mL moles-1 cm-1
Especfico (E1%)
dL g-1 cm -1
(g/100mL) 1 cm-1
Cuantificacin de protenas de solucin:
En general, no hay un mtodo completamente satisfactorio para medir la concentracin
de protenas en una muestra. La eleccin del mtodo depende de la naturaleza de la
protena, de los otros componentes de la muestra problema, de la rapidez y sensibilidad
deseada. En este trabajo prctico se vern dos de los mtodos que se usan
corrientemente para medir concentraciones de protenas, Biuret y Lowry.
Mtodo Biuret
Los compuestos que tienen dos o ms uniones peptdicas (pptidos y protenas) dan
color prpura caracterstico cuando se tratan con una solucin alcalina de sulfato de
cobre diluida. El color se debe aparentemente al complejo de coordinacin del Cu con
cuatro tomos de nitrgeno, que participan en el enlace peptdico. Este mtodo es
reproducible, pero requiere una alta concentracin de protenas para la formacin de
color. La sensibilidad del mtodo es de 0,25 200 mg de protenas por mL de solucin.
Mtodo de Lowry
Los aminocidos pueden dar reacciones caractersticas con ciertos reactivos de
acuerdo a la naturaleza de sus cadenas laterales. Muchas reacciones de este tipo se
caracterizan por la formacin de productos coloreados. La tirosina por ejemplo, debido
4
espectrofotmetro (visible)
celdas para espectrofotmetro
1 bao termostatizado
1 termmetro.
16 tubos de ensayo
2 gradillas
2 pipetas graduadas de 5 ml
2 pipetas graduadas de 1 ml
1 pizeta.
1 vaso precipitado de 250 ml
1 vaso precipitado de 100 ml
3.2 Reactivos.
Reactivo de Biuret:
Solucin estndar de ovoalbmina al 5% en NaCl 9%.
5
TUBO
1B
2S
3S
4S
5S
6S
7 MP
8 MP
9 MP
Ovoalbmina
(mL)
5%
MP
0,0
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
---
-----
------------1,0 MP1
1,0 MP2
1,0 MP3
H2O
(mL)
1,0
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
0,0
0,0
0,0
R.
BIURET
(mL)
4,0
4,0
4,0
4,0
4,0
4,0
4,0
4,0
4,0
Absorbancia Concentracin
%
TUBO
1B
2S
3S
4S
5S
6S
7MP
8MP
9MP
BSA
(mL)
0,4 mg/mL
MP
-----0,1
--0.2
--0,3
--0,4
--0,5
----0,5 MP1
--0,5 MP2
--0,5 MP3
R.F.
H2O
(mL)
1,0
0,9
0,8
0,7
0,6
0,5
0,5
0,5
0,5
R.C.A.
(mL)
1,0
1,0
1,0
1,0
1,0
1,0
1,0
1,0
1,0
(mL)
4,0
4,0
4,0
4,0
4,0
4,0
4,0
4,0
4,0
Conc.
%
Bibliografa
7