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Manual de Bacteriologia
Manual de Bacteriologia
de bacteriologa clnica
Manual prctico de
bacteriologa clnica
Judith Velasco Coordinadora
Mara del Carmen Araque
Emma Araujo
Aurora Longa
Beatriz Nieves
Ana Carolina Ramrez
Kiralba Snchez
Elsa Velazco
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Editorial Venezolana C. A.
Prohibida la reproduccin
total o parcial de esta obra
sin la autorizacin escrita
del autor y el editor
Impreso en Venezuela
Printed in Venezuela
Prefacio
Las enfermedades infecciosas en los ltimos tiempos han mantenido un lugar preferencial en el rea mdica, sobre todo por la aparicin de enfermedades virales como
el SIDA y el resurgimiento de cuadros infecciosos que se crean controlados como la
tuberculosis. Por otra parte, el uso indiscriminado de antibiticos de amplio espectro
ha incrementado la resistencia a los antimicrobianos y la circulacin de cepas multirresistentes en los ambientes hospitalarios, situacin que dificulta el manejo de pacientes
hospitalizados.
Es por ello, que el clnico recurre al laboratorio de Microbiologa con el nico propsito de obtener resultados confiables y en el menor tiempo posible. En tal sentido, el
presente manual se ha diseado de manera que sirva de texto gua para los estudiantes
de Bioanlisis que cursan la asignatura Microbiologa clnica y aplicada e, igualmente,
de texto de consulta rpida de los profesionales del laboratorio de Microbiologa. Tiene por objetivo mostrar los recursos y tcnicas convencionales para el diagnstico de
algunas de las enfermedades infecciosas ms frecuentes; se hace nfasis en los procedimientos a seguir de acuerdo a la impresin clnica inicial, aislamiento, identificacin,
pruebas de susceptibilidad de los microorganismos involucrados, interpretacin y reporte de los resultados.
Las metodologas descritas se presentan en una forma clara y sencilla, su presentacin grfica en forma de figuras a color facilita la comprensin global de las tcnicas utilizadas para el diagnstico microbiolgico.
La elaboracin del presente manual es producto del conocimiento y experiencia de
varios profesionales del rea de microbiologa adscritos al Departamento de Microbiologa y Parasitologa de la Facultad de Farmacia y Bioanlisis de la Universidad de Los
Andes.
Es importante mencionar, que en los ltimos aos se han desarrollado nuevas
tecnologas que escapan al objetivo de este manual, pero que pueden ser consultadas
en otras bibliografas especializadas.
prctica 1
Principios diagnsticos
de las enfermedades infecciosas
Mara del Carmen Araque
Objetivo general
Introducir al estudiante en la aplicacin de conocimientos tcnico-cientficos para
el diagnstico microbiolgico de las enfermedades infecciosas.
Objetivos especficos
1. Describir la importancia clnica y microbiolgica de las diferentes etapas que conforman el procesamiento microbiolgico de una muestra clnica y su relacin con
el xito o fracaso en el diagnstico de las enfermedades infecciosas.
2. Reforzar las destrezas prcticas adquiridas en Microbiologa general, en cuanto a la
realizacin de tcnicas de coloracin e inoculacin de medios slidos para aislamientos primarios.
Aspectos tericos
El diagnstico de las enfermedades infecciosas se realiza sobre la base de los signos
y sntomas clnicos que presenta el paciente, los datos epidemiolgicos y la demostracin del agente causal o las huellas que ste ha dejado en el sistema inmunolgico del
individuo. (1)
El papel del laboratorio de microbiologa clnica consiste en determinar la presencia de patgenos potenciales en los tejidos, los lquidos corporales o las secreciones de
los pacientes, e identificarlos en caso de que estn presentes. Este servicio es indispensable para el mdico tratante, porque la informacin acerca de la identidad del patgeno
Prctica 1
La extensin y la confiabilidad de la informacin que puede proporcionar el laboratorio varan de acuerdo con la naturaleza del patgeno. Algunos de ellos son fciles de
detectar, cultivar, identificar y caracterizar (Escherichia coli); otros requieren medidas
extraordinarias tan slo para detectar su presencia (Helicobacter pylori). Sin embargo,
las capacidades del laboratorio de microbiologa clnica se estn ampliando y perfeccionando aceleradamente, gracias a los avances tecnolgicos y cientficos en el campo de
la biologa molecular, han permitido introducir, cada vez ms rpido, nuevos mtodos
diagnsticos en la prctica clnica.
La principal conexin entre el mdico y el laboratorio de microbiologa clnica es
la muestra que se recolecta y se enva para su procesamiento.(1-3) Es por ello, que la
recoleccin correcta de una muestra clnica para su cultivo es la etapa ms importante
en el aislamiento exitoso de un microorganismo responsable de una determinada enfermedad infecciosa (Fig. 1).
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Prctica 1
Fuente de contaminacin
Vejiga
Uretra y perineo
Sangre
Sitio de puncin
Vagina
Fstula
Tracto gastrointestinal
Odo medio
Piel y mucosas
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Alternativa o comentario
Biopsia o aspirado
Biopsia o aspirado
Biopsia o aspirado
Biopsia o aspirado
Biopsia o aspirado
Biopsia o aspirado
Vmitos No procesar
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Prctica 1
El principal objetivo del transporte de muestras clnicas dentro y fuera de un hospital, es la preservacin del material biolgico lo ms semejante a su estado original,
con un mnimo de deterioro y sin riesgos de contaminacin para quien manipula estas
muestras (Tabla 3).
Sin preservar
Condiciones de almacenamiento
4C
25C
Tejido de autopsia, lavado bronquial,
catter endovenoso, fluido pericrdico, esputo, biopsia de pulmn, orina,
muestras con sospecha de agentes virales.
Transporte para
anaerobios
Muestras inoculadas
directamente en el
medio de cultivo
Medio de
transporte
Tejido seo, hisopado cervical, hisopado conjuntival, secrecin de odo
externo, hisopado vaginal, hisopado
nasofarngeo, exudado de tracto respiratorio superior.
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Prctica 1
Muestra clnica
TABLA
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Exudado
farngeo
Impresin diagnstica
Difteria.
Muestras
clnicas y examen directo
Examen directo
Azul de metileno de
Leffler
Gram
Ulceras orofarngeas
Angina de Vincent.
Gram
Esputo aspirado
transtraqueal
Lavado bronquial
Gram
Ziehl Neelsen
Micosis pulmonar.
Azul de Lactofenol
Gram
Solucin Salina.
Micetoma.
Kinyoun
Azul de Lactofenol
Lquido
cefalorraqudeo
Meningitis bacteriana.
Meningitis criptocccica.
Gram
Tinta china
Orina
Gram
Campo oscuro
Gonorrea.
Infeccin no gonoccica.
Candidiasis.
Gram
Giemsa
Al fresco o
Azul de lactofenol
Exudado de lcera
en genitales
(chancro)
Sfilis.
Campo oscuro
Secrecin ocular o
raspado corneal
Conjuntivitis purulenta.
Tracoma.
Gram
Giemsa
Raspados de piel,
fragmentos de
uas o pelos
Dermatofitosis.
Pitiriasis versicolor.
Candidiasis.
KOH al 40%
Azul de lactofenol
Heridas cutneas
o secreciones
purulentas de
piel o mucosas
Secrecin uretral o
cervical purulenta
El examen en fresco de materiales clnicos sin colorear, por microscopa de contraste de fase o campo oscuro, es til para demostrar la presencia y movilidad de bacterias
como las espiroquetas (Treponema pallidum). Muchos patgenos fngicos tambin tienen
aspectos morfolgicos caractersticos. De manera notable, la meningitis por Cryptococcus
neoformans se diagnostica con mayor rapidez por el hallazgo de la levadura encapsulada en
lquido cefalorraqudeo. Mediante la tincin de fondo con tinta china se visualiza la cpsula
transparente de la levadura. Si bien los virus no pueden verse con el microscopio ptico,
los cambios inducidos por ellos en la morfologa de las clulas hospederas pueden ser diagnsticos. Ejemplos de ello son las clulas gigantes multinucleadas observadas en el material
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de raspado de las lesiones producidas por el virus herpes simple o el virus de la varicella
zoster (frotis de Tzanck) y los cuerpos de inclusin intracelular especficos observados en
los tejidos activamente infectados por citomegalovirus.
Los patgenos bacterianos pueden ser visualizados y agrupados de forma morfolgica y funcional utilizando tinciones especiales como la de Gram o la coloracin de
Ziehl Neelsen.
La tincin de Gram es rpida y simple de llevar a cabo y puede emplearse en casi
todos los lquidos o tejido corporal (el fundamento y los pasos de la tincin pueden consultarse en el Manual prctico de microbiologa general). Esta tincin proporciona tres
tipos de informacin bsica:
Puede confirmar la presencia de bacterias en un lquido o tejido corporal normalmente estril (LCR, sangre, entre otros).
Las propiedades tintoriales y la morfologa de los microorganismos en la muestra
o en el cultivo permiten establecer las estrategias de identificacin definitiva del
patgeno y la seleccin de los antibiticos a probar en el antibiograma.
La observacin de algunos tipos morfolgicos puede ser diagnstica en algunos
casos por ejemplo; diplococos gramnegativos intracelulares en polimorfonucleares
en muestras de secrecin uretral es altamente sugestivo de Neisseria gonhorroeae.
Las micobacterias poseen una pared celular gruesa y cerosa, de manera que cuando
son teidas, por ejemplo, con la coloracin de Ziehl Neelsen, estas son resistentes a la
decoloracin al someterse al tratamiento con potentes solventes orgnicos tales como
el alcohol cido. En consecuencia, los microorganismos que tienen esta propiedad se
llaman acidorresistentes. Un ejemplo caracterstico de este grupo de bacterias son las
pertenecientes al gnero Mycobacterium.
Aislamiento e identificacin bacteriana por mtodos convencionales
El crecimiento e identificacin del agente etiolgico in vitro casi siempre es el recurso diagnstico ms sensible y especfico, y por eso es el mtodo ms usual. Casi todas
las bacterias de importancia mdica pueden cultivarse fuera del hospedador, en medios
artificiales de cultivo.
Las muestras destinadas al cultivo de microorganismos se pueden dividir en dos
tipos, segn su procedencia de sitios estriles o de lugares normalmente contaminados
con flora saprfita. Es importante tener un conocimiento profundo de los microorganismos aislados comnmente en muestras clnicas no estriles y de los contaminantes
frecuentes en muestras provenientes de sitios estriles, para asegurar que todas esas
muestras sern tratadas adecuadamente y los resultados interpretados correctamente.
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Prctica 1
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Prctica 1
tes de que puedan detectarse en el suero del paciente las IgG producidas como respuesta a
la infeccin. Por otra parte, un resultado positivo slo indica que el paciente ha estado en
contacto con la infeccin en algn momento del pasado. Sin embargo, las IgM se pueden
detectar en perodos ms tempranos de la infeccin (7-10 das), indicando infeccin activa.
En este contexto, es importante destacar que la respuesta inmunolgica observada en un
paciente depender de la integridad de su sistema inmunolgico. El inmunodiagnstico es
el principal mtodo utilizado para el diagnstico de laboratorio de enfermedades virales.
Las pruebas para la deteccin de antgenos son como pruebas serolgicas invertidas, en lugar de emplear antgenos microbianos para capturar los anticuerpos especficos en el suero de un paciente, en este caso se emplean anticuerpos de captura
para detectar en las muestras clnicas antgenos especficos del microorganismo. En la
mayor parte de estas pruebas los anticuerpos de captura se encuentran unidos a un
soporte slido, tal es el caso del uso de bolitas de ltex recubiertas con anticuerpos especficos (aglutinacin con ltex) para detectar el material capsular de los meningococos,
Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae y Cryptococcus neoformans, entre
otros (Fig. 2). En muchas ocasiones, este panel de pruebas es utilizado en muestras de
lquido cefalorraqudeo para establecer el diagnstico precoz de meningitis.(1,4,5)
Las pruebas serolgicas usadas ms frecuentemente en el laboratorio para el diagnstico de enfermedades infecciosas son:
Precipitacin
Aglutinacin
Hemaglutinacin
ELISA
Inhibicin de la hemaglutinacin
Fijacin de complemento
Tcnicas de anticuerpos fluorescentes
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Prctica 1
1 Actividad prctica
1. Realizar la tincin de Gram en frotis de muestras clnicas asignadas a cada equipo de
trabajo.
2. Observar e interpretar los frotis coloreados.
3. A partir de las muestras clnicas asignadas a cada equipo de trabajo, los estudiantes realizarn la inoculacin de las mismas en medios de cultivo slidos
para aislamiento primario.
4. En el segundo perodo de prctica, el estudiante evaluar e interpretar los resultados obtenidos en los cultivos primarios.
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Autoevaluacin
1. Por qu se considera importante conocer la flora habitual del organismo en el momento de realizar estudios microbiolgicos?
2. Existen circunstancias en las que la flora habitual se convierte en patgena?
3. Cules consideraciones previas deberan tenerse en cuenta a la hora de realizar la
toma de una muestra clnica?
4. Cul es la importancia estratgica que tiene el examen directo al momento de procesar una muestra clnica?
5. Cul es el fundamento de las pruebas convencionales en el diagnstico de enfermedades infecciosas?
6. Cules son las ventajas y desventajas que tienen los mtodos no convencionales en
el diagnstico de las enfermedades infecciosas?
Bibliografa
(1) Drew LW., Cockerill FR, Henry NK. In: Wilson Wr, Sande MA. Current. Diagnosis &
treatment in infectious diseases. International Edition. United States: McGraw-Hill
Companies; 2001. p. 43-64.
(2) Engleberg NC. Principios diagnsticos. En Schaechter M, Medoff G, Eisenstein BI, Guerra H. Mecanismos de las enfermedades infecciosas. 2 ed. Argentina: Editorial Mdica
Panamericana; 1994. p. 691-708.
(3) Mims CA, Playfair JHL, Roitt IM, Wakelin D, Williams R, Anderson RM. Microbiologa
mdica. Espaa: Mosby/Doyma; 1995. p. 17.1-18.15.
(4) Murray PR, Rosethal KS, Kobayashi GS, Pfaller MA. Microbiologa mdica. 4 ed. Espaa: Mosby Elsevier Science; 2002. p. 153-170.
(5) Montiel F, Lam M. Seleccin, recoleccin y transporte de muestras para el estudio microbiolgico. En Montiel F, Lam M. Manual de microbiologa clnica. Chile: Publicaciones Tcnicas Mediterrneo; 2001. p. 17-52.
(6) Podest O, Sturba E, Casimir L. Mtodos moleculares de diagnstico y seguimiento. En
Stamboulian D. Temas de infectologa clnica. Colombia McGraw-Hill Interamericana;
2002. p. 139-58.
(7) Ryan KJ, Ray, CG. Principios de diagnstico por laboratorio de las enfermedades infecciosas. En Ryan KJ, Ray CG. Sherris Microbiologa mdica. 4 ed. Mxico: McGraw-Hill
Interamericana; 2004. p. 251-82.
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prctica 2
Objetivo general
Determinar la importancia clnica y microbiolgica de las pruebas de susceptibilidad.
Objetivos especficos
1. Elaborar correctamente un antibiograma de acuerdo al mtodo de difusin del disco.
2. Conocer los criterios que permiten la escogencia adecuada de los discos de antibiticos a probar en un antibiograma.
3. Interpretar y elaborar correctamente el reporte de un antibiograma.
Aspectos tericos
El aislamiento e identificacin de un agente infeccioso a partir de una muestra
clnica proveniente de un paciente, no es suficiente para impartir una terapia antiinfecciosa adecuada. Actualmente, numerosos microorganismos han desarrollado mltiples
mecanismos que les permiten resistir a la accin de los ms nuevos y potentes agentes
antimicrobianos.
Como no se puede predecir la susceptibilidad de las bacterias a los antimicrobianos, en la actualidad se dispone de varios mtodos para determinar el patrn de susceptibilidad de una bacteria a los antibiticos. Entre los mtodos ms utilizados podemos
mencionar: (1)
1. Mtodo de difusin del disco en agar (prueba de Kirby-Bauer).
2. Antibiograma ATB Rapid (bioMrieux).
3. Mtodo de dilucin en caldo o en agar (Concentracin Inhibitoria Mnima [CIM]).
4. Mtodo de la cinta o Epsilmetro EtestR (AB BIODISK).
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Prctica 2
Otro aspecto importante que se debe tener en cuenta en la realizacin de las pruebas
de susceptibilidad, es la eleccin correcta de los antibiticos a probar. A continuacin
se sealan algunos criterios que pueden ayudar a seleccionar adecuadamente dichos
agentes: (1-3)
1. Microorganismo aislado.
2. Mecanismo de accin del antibitico.
3. Espectro de accin del antibitico.
4. Biodisponibilidad del antibitico en rganos y sistemas (localizacin de la infeccin).
5. Origen o fuente de la infeccin (hospitalaria o extrahospitalaria).
6. Estados fisiolgicos del paciente (edad, embarazo, entre otros).
7. Estados patolgicos subyacentes (inmunosupresin, tratamiento previo con antibiticos, insuficiencia renal o heptica, entre otros).
La prescripcin de algunos medicamentos est sujeta en muchas ocasiones a factores o circunstancias inherentes al hospedero. Los antibiticos no son la excepcin. Es
por ello, que el microbilogo deber conocer las restricciones que tiene el uso clnico de
algunos antibiticos, con el fin de elaborar pruebas de susceptibilidad que proporcionen
una valiosa informacin. A continuacin, se muestran algunos de los casos en los que el
uso clnico de los antibiticos debe evitarse:
Insuficiencia heptica
Insuficiencia renal
Neonato
Cloranfenicol
Cloranfenicol
Cloranfenicol
Cloranfenicol
Colistina
Isoniacida
cido nalidxico
Clindamicina
Dapsona
Piracinamida
Nitrofurantona
Quinolonas
Nitrofurantoina
Rifampicina
Tetraciclina
Sulfonamidas
Sulfonamidas
Tetraciclinas
Vancomicina
Aztreonam
Aminoglucsidos
Tetraciclinas
Tetraciclinas
Rifampicina
Vancomicina
Metronidazol
Vancomicina
Aminoglucsidos*
* Si se indican, deben vigilarse los niveles sricos.(4)
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patgeno, seleccionando la droga menos txica para el paciente, y con las caractersticas
farmacocinticas ms apropiadas segn la naturaleza y gravedad de la infeccin.(4)
Fuentes de error ms comunes en la realizacin de un antibiograma
1. Falta del control de calidad de los medios de cultivo a utilizar, patrn de McFarland y los discos de antibiticos.
2. Trabajar con cepas bacterianas que no estn puras.
3. Inadecuada estandarizacin de la concentracin del inculo.
4. Utilizacin de un nmero excesivo de discos de antibiticos por placa.
5. Utilizacin de medios de cultivo no aptos para las pruebas de susceptibilidad.
6. Lectura prematura o extempornea de las pruebas de susceptibilidad.
7. Medicin incorrecta de los halos de inhibicin por una iluminacin deficiente o
reglilla inadecuada.
8. Incubacin en atmsfera inadecuada.
9. Error en la transcripcin de los resultados en la hoja de reporte.
2 Actividad prctica
El antibiograma
El mtodo utilizado con mayor frecuencia para evaluar la sensibilidad de las bacterias a los agentes antimicrobianos es el denominado prueba de difusin del disco. Esta
tcnica fue estandarizada por Kirby y Bauer en 1966, de all que dicho mtodo tambin
se le conozca con el nombre de prueba de Kirby-Bauer. Es un mtodo sencillo y fcil
de realizar en los laboratorios de rutina que slo brinda informacin cualitativa o semicuantitativa sobre la sensibilidad de un microorganismo a un antibitico determinado.
Sin embargo, los resultados obtenidos son de gran valor clnico para iniciar, mantener o
modificar una antibioticoterapia.(1-3, 7)
Materiales
Discos de antibiticos
Regla milimetrada
Tablas de los criterios estandarizados
del CLSI.
Hisopos estriles
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Prctica 2
Procedimiento
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mdico tratante tendr en cuenta algunos factores tales como biodisponibilidad del
antibitico en el tejido o sistema afectado, presentacin del medicamento, edad del
paciente, condiciones patolgicas subyacentes o fisiolgicas, entre otras.
Intermedia (I): indica que el antibitico tiene aplicabilidad clnica en sitios corporales donde el antibitico alcance concentraciones teraputicas adecuadas, como es
el caso de -lactmicos y quinolonas en el tracto urinario. En otros casos, puede utilizarse el medicamento con seguridad en dosis elevadas que no alcancen los niveles
de toxicidad pero que garanticen actividad teraputica. Sin embargo, es recomendable evitar el uso de la categora intermedia cuando sea posible.
Resistente (R): la bacteria aislada no es inhibida por el antibitico a las concentraciones teraputicas ideales o la bacteria ha generado mecanismos de resistencia que
evaden la actividad del antibitico, por lo tanto, la eficacia clnica de ste no es confiable. Es recomendable que ante el aislamiento de un microorganismo multirresistente clnicamente significativo se ensayen otras pruebas de susceptibilidad adicionales (CIM), tal es el caso de cepas de Staphylococcus resistentes a la vancomicina.
8. El reporte de los resultados del antibiograma debe ser realizado en forma clara y
precisa y enviados en forma inmediata al mdico tratante.
Utilice la siguiente tabla para registrar los resultados obtenidos en el antibiograma:
Microorganismo aislado: ________________________________________________________
Disco de antibitico
Dimetro en
milmetros
Interpretacin
Observaciones: __________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
Autoevaluacin
1. De acuerdo a los datos suministrados por el profesor y los registrados en la tabla
anterior, elabore el reporte del antibiograma:
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Prctica 2
Bibliografa
(1) Baquero E. El antibiograma: bases microbiolgicas para su interpretacin. [serie en lnea] disponible en http//www.OCENETmedicinaysalud.com. Cdigo de documento:
1015491.
(2) Cona E. Condiciones para un buen estudio de susceptibilidad mediante test de difusin
en agar. Rev Chil Infect 2002; 19 (Supl.2): S77-81.
(3) Garca JA, Cantn R, Garca JE, Gmez-Lus ML, Martnez L, Rodrguez-Avial C, Vila J.
Mtodos bsicos para el estudio de la sensibilidad a los antimicrobianos 2000. [serie en
lnea] disponible en http://www.seimc.org/protocolos/cap11.htm#A.
(4) Linares N.C., Devoto F.M., Estrn M.A., Serra H.A., Tessler J. Quimioantibioticoterapia.
2 ed. Argentina: Editor Luis Mara Zieher; 2002.
(5) Martnez-Martnez L. El futuro de las pruebas de sensibilidad a los antimicrobianos.
Enferm Infecc Microbiol Clin 2003; 21 (supl. 2): 64-71.
(6) Clinical Laboratory Standards Institute CLSI (formerly National Committee Laboratory
Standards NCCLS). M2-A5 Performance standards for antimicrobial disk susceptibility
test. Approved Standard. NCCLS, Wayne. 17 (17), 2007.
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prctica 3
Objetivo general
Desarrollar la estrategia metodolgica para el diagnstico microbiolgico de infecciones del tracto respiratorio superior
Objetivos especficos
1. Reconocer los microorganismos de la flora habitual y los principales patgenos del
tracto respiratorio superior.
2. Esquematizar los pasos para la obtencin y procesamiento de muestras del tracto
respiratorio superior.
3. Obtener y procesar muestras de exudado farngeo y secrecin nasal.
4. Identificar los patgenos implicados en procesos infecciosos del tracto respiratorio superior.
5. Detectar la presencia de eosinfilos en moco nasal.
6. Registrar y reportar los resultados.
Aspectos tericos
El tracto respiratorio (TR) est en contacto directo con el medio ambiente y se encuentra expuesto continuamente a los microorganismos suspendidos en el aire que respiramos. El aparato respiratorio est divido anatmicamente en superior (TRS) e inferior
(TRI). EL TRS comprende: la boca, fosas nasales, orofaringe, nasofaringe y senos paranasales. Otra clasificacin incluye al odo medio por la comunicacin estrecha que existe
entre ste y la nasofaringe a travs de la trompa de Eustaquio, sin embargo, los procesos
infecciosos de odo medio sern considerados en un captulo separado.(1)
Diversos mecanismos no especficos protegen el tracto respiratorio de las infecciones, entre ellos, se sealan: los pelos, pasaje contorneado, mucus, inmunoglobulina
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Prctica 3
Patgenos definitivos
Estreptococos beta-hemolticos
Corynebacterium diphtheriae
Haemophilus influenzae
Bordetella pertussis
Micrococos
Haemophilus parainfluenzae
Mycoplasma pneumoniae
Corynebacterium sp.
Streptococcus pneumoniae
Moraxella catarrhalis
Veillonella sp.
Enterobacterias
Espiroquetas
Fusobacterium sp.
Bacteroides sp.
Actinomyces sp.
Manifestaciones clnicas
Rinitis: es la manifestacin clnica caracterstica del resfro comn, se presenta
con aumento de la secrecin nasal, la cual suele ser clara y acuosa al inicio, conforme avanza el cuadro puede sobreagregarse una infeccin bacteriana; en estos casos
la secrecin se vuelve espesa o purulenta, requiriendo tratamiento con antibiticos.
La rinitis alrgica cursa igualmente con aumento de secrecin nasal, necesitndose
el diagnstico diferencial que oriente el tratamiento adecuado.(3)
Faringitis o amigdalitis: se manifiestan con dolor farngeo, eritema y edema de los
tejidos afectados; puede existir exudado, petequias hemorrgicas y placas de clulas inflamatorias, presentes frecuentemente en la infeccin bacteriana. La observacin de vesculas y lesiones ulcerativas son comunes en las infecciones virales y la
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Kiralba Snchez
formacin de aftas o placas blanquecinas con base erosionada son compatibles con
candidosis farngea.(3)
Sinusitis: Posterior a una infeccin nasofarngea, por contigidad puede afectarse
una o mas cavidades paranasales. La sintomatologa cursa con obstruccin nasal,
rinorrea, dolor facial, cefaleas y fiebre. En los nios el sntoma caracterstico es la
rinorrea, que simula un resfriado comn. Se debe sospechar de una sinusitis cuando los sntomas perduran por ms de 10 das.(1)
Epiglotitis: es una inflamacin difusa de la epiglotis y de las estructuras adyacentes, de
progresin rpida; en nios la obstruccin es brusca, completa y fulminante de la va
area (en un lapso de 30 min.), se acompaa de disnea y cianosis que pone en riesgo la
vida del paciente. La epiglotis se visualiza edematosa y de color rojo cereza.(1)
Otras manifestaciones menos frecuentes incluyen la formacin de pseudomembranas,
constituidas por tejido necrtico, clulas inflamatorias y bacterias. Estas formaciones pueden orientar el diagnstico de la difteria farngea o hacia una Angina de Vincent.(3)
Etiologa de las infecciones del tracto respiratorio superior
El 80% de las ITRS son de etiologa viral. El resfriado comn es causado principalmente por el grupo de los rinovirus y coronavirus.
La faringitis aguda en su gran mayora es causada por rinovirus, adenovirus, parainfluenza y coxsackie. La causa bacteriana ms frecuente de faringoamigdalitis y, por lo
tanto, susceptible de ser tratada con antimicrobianos es Streptococcus pyogenes, responsable de 15 a 30% de las faringitis agudas en nios y de 5 a 10% en adultos.(1)
En la tabla 7 se sealan otras bacterias causantes de faringitis, entre stas tenemos a
los Estreptococos beta-hemolticos de los grupos C y G que se han asociado a brotes epidmicos de faringitis transmitidas por alimentos, a faringitis endmica en comunidades
cerradas donde concurren jvenes y adultos.(4)
Otros agentes etiolgicos poco frecuentes lo constituyen: Arcanobacterium
haemolyticum, Yersinia enterocolitica, Franciscella tularensis y Neisseria gonorrhoeae,
esta ltima debe ser considerada entre los jvenes y adultos como consecuencia del contacto buco-genital.(1) Existen microorganismos que forman parte de la microbiota habitual de la faringe, algunos participan en la etiologa de infecciones del tracto respiratorio
bajo, sin embargo, no se consideran patgenos en faringoamigdalitis aguda en pacientes
inmunocompetentes; es el caso de H. influenzae, S. pneumoniae, M. catarrhalis y S.
aureus. H. influenzae es un agente causal de faringitis en nios.(1)
En pacientes inmunocomprometidos, se debe informar el hallazgo de Candida sp.,
bacilos gramnegativos y S. aureus.(1)
Tanto en la sinusitis como en otitis media, entre los microorganismos etiolgicos
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Prctica 3
Diagnstico
clnico
Virus
Bacterias y hongos
Rinitis
Raros
Faringitis o
amigdalitis
Streptococcus pyogenes
Estreptococos beta hemolticos grupos B,C,G,
Neisseria gonorrhoeae,
Arcanobacterium haemolyticum
Sinusitis
Raros
Streptococcus pneumoniae
Haemophilus influenzae
Moraxella catarrhalis
Streptococcus pyogenes
Bacterias anaerbicas
Pseudomembranas
farngeas
Ninguno
Corynebacterium diphtheriae
Fusobacterium nucleatum y
Borrelia vincenti
Epiglotitis
Ninguno
Haemophilus influenzae
serotipo b
Estomatitis
Especies de Candida
Fusobacterium sp, espiroquetas
Ninguno
Streptococcus pyogenes
Anaerobios bucales
como Fusobacterium sp.
Staphylococcus aureus.
Abscesos
periamigdalino
o retrofarngeo
Tosferina o
coqueluche
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Bordetella pertussis
Kiralba Snchez
Diagnstico
El objetivo primordial del diagnstico de los ITRS consiste en distinguir los casos
de etiologa viral (80-90% de los casos) de los producidos por bacterias para los que se
dispone de tratamiento. La investigacin de agentes virales involucrados en ITRS no se
practica de rutina, debido a los altos costos y como no son susceptibles de tratamiento
no se justifica su diagnstico, el cual se reserva para la investigacin de brotes epidmicos.(5)
En la tabla 8 se presentan las muestras tiles para el diagnstico de los diferentes
cuadros respiratorios.
Muestra a cultivar
Rinitis
Hisopado nasofarngeo
Faringitis
Exudado farngeo
Secrecin obtenida
Sinusitis
por puncin de senos
paranasales
Investigacin de virus
Principalmente se justifica en pacientes sintomticos para la bsqueda de S. pyogenes. Algunas excepciones de esta conducta se relacionan
con las condiciones del hospedero como inmunosupresin, hospitalizacin, antecedentes de
intercurso buco-genital.
Indicado en pacientes inmunocomprometidos,
en infecciones nosocomiales, mala respuesta antimicrobiana y en casos de complicaciones como: meningitis, osteomielitis, celulitis
periorbitaria.
Se recomienda la toma de hemocultivos
Epiglotitis
Sangre seriados (3 muestras)
Est contraindicada la toma de muestras farngeas o nasofarngeas.
Exudado farngeo
Difteria y Angina de
Raspado
de
Vincent
pseudomembrana
Son muy raros los casos, por lo tanto,
Tosferina
Hisopado nasofarngeo no se practica de rutina su investigacin,
salvo solicitud clnica.
35
Prctica 3
Etapa pre-analtica
Los antecedentes del paciente y los factores epidemiolgicos son tiles para
orientar el diagnstico etiolgico. Entre stos se deben considerar los datos filiatorios: nombre, edad, ocupacin, residencia; la evolucin clnica del proceso (ver
manifestaciones clnicas), estado inmunolgico del paciente, procedencia (hospitalizacin o de la comunidad), condiciones socio-econmicas, estilo de vida, exposicin reciente a caso clnico de ITR, tratamientos previos con antimicrobianos, entre
otros.(5)
Etapa analtica
La validez de los resultados del diagnstico microbiolgico depende entre otros
factores, de que se sigan correctamente las normas de obtencin y transporte de la
muestra y que la solicitud del estudio, sea acompaada de un breve informe con los
datos clnicos y epidemiolgicos, que orienten al bioanalista en la seleccin de las tcnicas ms adecuadas, segn el microorganismo que se vaya a investigar.
Tanto la obtencin como el transporte de las muestras al laboratorio constituyen
un punto clave para conseguir un resultado satisfactorio.
Procedimiento:
36
Kiralba Snchez
La siembra realizada en los medios de cultivo AS y AMS se revisarn en busca de colonias sugestivas de S. aureus, y se proceder a la identificacin bioqumica y determinacin
de la susceptibilidad antimicrobiana por el mtodo de Kirby-Bauer (Anexo 3 y 4).
37
Prctica 3
Exudado nasal
AS
Gram
Hansel
AMS
en microaerofilia
Estudio macroscpico
de colonias
Si no se observan colonias de
inters, reincubar hasta 48 h en
las mismas condiciones
Colonias sospechosas
de un patgeno
Gram
Pruebas bioqumicas
Antibiograma
Negativo o
flora habitual
Reporte
38
Kiralba Snchez
Procedimiento
Inspeccionar las placas de AS en busca de colonias pequeas de 1 a 1,5 mm de dimetro, rodeadas de un halo de hemlisis completa (beta-hemlisis).
A partir de las colonias sugestivas realizar extendidos para teir al Gram; si se observan cocos grampositivos dispuestos en cadenas, se repican de 4 a 6 colonias en
AS y en tubos de caldo Todd-Hewitt e incubar a 36 C por 24 h.
39
Prctica 3
Exudado farngeo
AS
Gram
Hansel
Incubar a 36C por 18-48 h
en microaerofilia
Si no se observan
colonias de inters
Negativo o
flora habitual
Gram
Subcultivar en AS y
caldo BHI TH
Identificacin
(anexos 3, 7 y 8)
Reporte
Para diferenciar S. pyogenes de otros beta-hemolticos, se pueden utilizar diferentes pruebas, siendo la de uso comn la prueba de la bacitracina (Anexo 7). Esta prueba
se basa en la susceptibilidad de S. pyogenes frente a una concentracin relativamente
baja de bacitracina. Para ello se inocula la cepa pura en AS, mediante hisopo estril extendiendo en cuatro direcciones; se coloca el taxo A (bacitracina 0,04 U) y el disco de
trimetoprim-sulfametoxazol (SXT) sobre el cultivo. Al cabo de 18-20 h de incubacin
a 36C, se detectar la presencia de un halo de inhibicin del crecimiento de cualquier
tamao, que indica la susceptibilidad del microorganismo.(7)
40
Kiralba Snchez
Esta tcnica tiene un 5% de falsos negativos y entre 10 y 20% de falsos positivos ya que otros Streptococcus (grupos C y G) tambin pueden dar sensibles.(1)
Otra prueba disponible en muchos laboratorios es la hidrlisis del PYR, sta se
fundamenta en la actividad de la enzima pirrolidonil aminopeptidasa producida
por S. pyogenes, sobre un sustrato el L-pirrolidonil-beta-naftilamida (PYR), con
formacin de beta-naftilamida libre, que se combina con el reativo cinamaldehdo
formando un producto final de color rojo.(6)
Los laboratorios que utilizan las pruebas bacitracina o PYR deben informar: Hubo
desarrollo presuntivo de Streptococcus pyogenes
La identificacin definitiva se lleva a cabo mediante la deteccin del antgeno especfico de grupo, tambin llamado carbohidrato de Lancefield; sta se realiza a travs
de mtodos de aglutinacin con partculas de ltex o coaglutinacin, directamente
sobre la colonia aislada. Solo los estreptococos beta-hemolticos, A , B , C , F , G y los
alfa o no hemolticos del grupo D pueden clasificarse con esta prueba. Para su realizacin se procede a una extraccin previa de los antgenos de pared, que dependiendo
del mtodo, se emplear: cido, calor o enzimas. Luego se hace reaccionar la cepa pura
de 24 h de desarrollo con cada uno de los antisueros para cada serogrupo. La reaccin
positiva se evidenciar dependiendo de la interpretacin de cada protocolo: ya sea por
aglutinacin, coaglutinacin, entre otros.(6)
Deteccin directa de Streptococcus del grupo del A en hisopado de garganta
41
Prctica 3
42
Kiralba Snchez
En el tem Cultivo: Registre el microorganismo aislado tomando en cuenta su significancia clnica y los aspectos relacionados con el paciente, considerados en el
contenido terico de esta prctica.
Si estn presentes microorganismos indgenas y se ha determinado que son contaminantes para el caso, incluir el siguiente comentario Desarrollo de microbiota
habitual de la regin.
En el caso de cultivos negativos, indicar No hubo crecimiento bacteriano en 48 ( 72)
horas de incubacion
Reporte el Antibiograma (en los casos que aplique).
En Observaciones, se debe sealar la lista de microorganismos investigados y otros
datos que se consideren de inters para la interpretacin clnica del resultado.
Datos y firma de la persona encargada de la investigacin: Nombre y apellido en forma
legible. Nmero de registro ante el Ministerio de Salud y ante el Colegio de Bioanalistas. Firma y sello del laboratorio o institucin de adscripcin.
3 Actividad prctica
Primer perodo: Obtencin y siembra de secrecin nasal y exudado farngeo
Materiales
Hisopos estriles
Bajalenguas estriles
Lminas porta objetos
Medios de cultivo: Agar Sangre de carnero (AS) y agar manitol salado (AMS)
Coloracin de Gram
Coloracin de Hansel
Asa de platino
Solucin salina fisiolgica
Procedimiento
43
Prctica 3
6. Realizar 2 frotis con cada muestra: uno para teir con la tcnica de Gram y el otro
para la coloracin de Hansel. Prepare el frotis, aplicando al hisopo movimientos
rotativos sobre la lmina portaobjeto, procurando que el extendido quede fino. Deje
secar al aire.
7. Fijar los extendidos y siga los pasos para las tcnicas de Gram y Hansel. Observar
al microscopio.
Coloracin de Hansel
Lminas portaobjeto
Asa de platino
Gotero con solucin salina fisiolgica
Placas de AS y caldo Tood-Hewitt (TH) o
infusin cerebro corazn (BHI)
Agua oxigenada 3%
Plasma citratado
Palillos de madera
Pipetas Pasteur
Propipeteador
Coloracin de Gram
Procedimiento
1. Evaluar cada placa de cultivo segn las caractersticas morfolgicas de las colonias,
la presencia o no de hemlisis y valorar el desarrollo bacteriano en escaso, moderado o abundante. En el caso de AMS observe si hubo la fermentacin del manitol.
Registre todas las caractersticas observadas.
2. Realizar el anlisis microscpico de las colonias de inters microbiolgico, segn
el tipo de muestra. Para ello preparar frotis con las colonias a investigar y teir con
la coloracin de Gram. Observar y registrar los resultados.
3. Las colonias de valor diagnstico deben ser purificadas, en AS y en caldo TH o BHI.
44
Kiralba Snchez
4. A partir del crecimiento en AMS, se procede a la investigacin de S. aureus, siguiendo el esquema de identificacin propuesto (Anexos 3,4).
5. Incubar los medios AS, TH y las pruebas bioqumicas inoculadas.
Placas de AS
Placas de Mueller Hinton sin sangre y
con 5% sangre de carnero
Solucin salina fisiolgica estril
Patrn de Mc Farland 0.5
Viales con discos de antibiticos
Asa de platino
Agua oxigenada al 3%
Palillos de madera
Lminas portaobjeto
Taxos de bacitracina
Coloracin de Gram
Procedimiento
1. Revisar y verificar la pureza de los repiques realizados en el perodo anterior mediante la tcnica de Gram.
2. A partir de este repique realizar un inculo con las colonias sospechosas de S. pyogenes sobre un AS fresco. Aplicar un taxo de bacitracina sobre la siembra e incubar
en microaerofilia.
3. Realizar la prueba de la catalasa a partir del caldo TH. Registre el resultado.
4. Interpretar las pruebas bioqumicas inoculadas en el perodo anterior e identificar
el microorganismo.
5. Realizar la prueba de sensibilidad antimicrobiana, en el caso que aplique.
45
Prctica 3
Autoevaluacin
1. Por qu en el cultivo de un exudado farngeo se debe utilizar sangre de carnero?
2. Clasifique los medios de cultivo empleados en la prctica segn su utilidad en el
laboratorio.
3. Cul es la importancia de los portadores nasales de S. aureus?
4. Enumere los patgenos respiratorios y los cuadros clnicos que producen.
5. Explique el fundamento de las pruebas: catalasa, coagulasa y PYR.
6. Cul es la utilidad de la coloracin de Hansel en una faringitis?
7. Mencione las pruebas no convencionales para el diagnstico de una faringitis estreptoccica y discuta sus ventajas y desventajas.
Bibliografa
(1) Braun S. Estudio microbiolgico del tracto respiratorio superior. Rev Chil Infect 2003;
20:193-198.
(2) Murray P, Rosenthal K, Kobayashi G, Pfaller M. Microbiologa mdica. Texto Atlas Color. 4 ed. Espaa: Mosby Elsevier Science; 2002.
(3) Ryan K, Ray C. Sherris Microbiologa mdica. 4 ed. Mexico: McGraw-Hill Interamericana; 2004.
(4) Mandell G, Bennett J, Dolin R. Enfermedades infecciosas. Principios y prctica. 5 ed.
Argentina: Mdica Panamericana; 2002.
(5) Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. Diagnstico microbiolgico.
Texto y Atlas Color. 5 ed. Espaa: Mdica Panamericana; 2001.
(6) Montiel F, Lam M. Manual de microbiologa clnica. Chile: Mediterrneo; 2001.
(7) Reyes M. Rinitis alrgica en nios. Su relacin con alergenos en el ambiente. (serial on
line) 1996 (citado 17 may 2005). Disponible en: http://colombiamedica.univalle.edu.
co/Vol27no3-4/rinitis.pdf.
(8) Universidad Central de Venezuela. Gua de Trabajos prcticos de microbiologa. Caracas: FEPUVA-UCV; 2000.
46
prctica 4
Objetivo general
Aplicar el procesamiento microbiolgico de las diferentes muestras para el diagnstico
etiolgico de las infecciones de las vas respiratorias inferiores ocasionadas por bacterias.
Objetivos especficos
1. Mencionar los principales agentes etiolgicos causantes de infecciones del tracto
respiratorio inferior.
2. Relacionar los datos epidemiolgicos y clnicos necesarios para la orientacin del
diagnstico microbiolgico (etapa pre-analtica).
3. Realizar los diferentes pasos que comprende la etapa analtica del procedimiento
para el cultivo de muestras provenientes del tracto respiratorio inferior.
4. Analizar, interpretar y reportar los resultados obtenidos (etapa post-analtica).
Aspectos tericos
El aire que inhalamos contiene millones de partculas suspendidas, incluidos algunos microorganismos que en su mayora son inocuos, sin embargo, el aire constituye un
vehculo para la transmisin de patgenos importantes.(1)
Aunque la va respiratoria es un todo continuo desde la nariz a los alvolos, es conveniente distinguir entre infecciones de las vas respiratorias superiores e inferiores. En
esta seccin estudiaremos estas ltimas, las cuales tienden a ser infecciones ms graves
y la eleccin de un tratamiento antimicrobiano adecuado es importante para salvar la
vida del enfermo.(1)
El tracto respiratorio inferior es un rea normalmente estril, la afeccin puede
ocurrir por extensin de una infeccin de las vas respiratorias medias, aspiracin
47
Prctica 4
La bronquitis aguda es una inflamacin del rbol traqueobronquial, que se caracteriza desde el punto de vista clnico por tos, grado de fiebre variable y produccin de
esputo. Este ltimo (material expulsado desde los bronquios, pulmones y trquea, por la
boca) a menudo es lmpido al comienzo, pero puede tornarse purulento si la enfermedad
persiste. La bronquitis puede manifestarse como crup (cuadro clnico caracterizado por
una tos perruna o ronquera, o ambas).(5)
48
Bacterias Virus
Bordetella pertusis, Bordetella parapertusis,
Frecuentes
Poco frecuentes
Raros
Bacterias:
Streptococcus pneumoniae
Coxiella burnetii
M. pneumoniae
Legionella sp
C. pneumoniae
Microorganismos anaerobios
Coccidioides inmitis
Hongos:
Blastomyces dermatitidis
Histoplasma capsulatum
Cryptococcus neoformans
Virus:
VSR
Virus Influenza
Parsitos:
Ascaris lumbricoides
49
Prctica 4
Frecuencia
< 1 mes
1 mes- 5 aos
Bacterias:
Escherichia coli
Virus:
Virus sincitial
respiratorio (VSR)
S. pneumoniae
Frecuentes
> 5 aos
C. trachomatis
VSR
Adenovirus
Virus influenza
Virus parainfluenza
Bacterias:
Klebsiella sp.
H. influenzae
Coxiella burnetii
Menos frecuentes
Otras Enterobacterias
Moraxella catarrhalis
Anaerobios de la
Enterococcus sp.
Staphylococcus aureus
M. pneumoniae
Bacterias:
B. pertusis
Mycoplasma hominis
S. pyogenes
S. aureus
H. influenzae
Raros
Enterobacterias
Legionella sp.
M. tuberculosis
M. tuberculosis
Virus:
Citomegalovirus
Enterovirus
Rubola
VSR
Virus parainfluenza
Las neumonas pueden clasificarse segn distintos criterios: a) de acuerdo a la etiologa (segn el microorganismo causal); b) segn el lugar de adquisicin (dentro o fuera
del hospital), este ltimo criterio es el ms til a la hora de establecer el tratamiento
inicial de un paciente determinado.(2)
Los sntomas que sugieren neumona son fiebre, escalofros, dolor en el pecho y tos
con produccin o no de esputo, dolor torcico, disnea, consolidacin pulmonar: estertores,
ruidos respiratorios disminuidos, infiltrados radiogrficos y empiema. Es importante tener
en cuenta que algunos pacientes con neumona no muestran signos y sntomas relaciona-
50
dos con el tracto respiratorio. Por lo tanto, el examen fsico del paciente, los hallazgos en
la radiografa de trax, los antecedentes del paciente y los resultados del laboratorio clnico
son importantes. Del 10 al 30 % de los individuos con neumona, adems de los sntomas
respiratorios, manifiestan dolor de cabeza, nuseas, vmitos, dolor abdominal, diarrea y
mialgias.(5)
Una vez establecido el diagnstico clnico-radiogrfico de infecciones del tracto respiratorio inferior es recomendable precisar el diagnstico etiolgico mediante pruebas de laboratorio
adecuadas que permitan establecer la terapia antimicrobiana adecuada.(5)
El diagnstico etiolgico puede efectuarse de diferentes maneras: en forma directa, con
la identificacin del agente causal; indirectamente, a travs del hallazgo de un metabolito en
particular y, ms recientemente, utilizando tcnicas inmunolgicas y de biologa molecular
como herramientas en reacciones consideradas rpidas no convencionales.(6,7)
Etapa pre-analtica
a) Datos epidemiolgicos: Las infecciones del tracto respiratorio inferior se presentan
a cualquier edad, aunque son ms frecuentes en nios y ancianos. Estn especialmente predispuestas las personas que viven con un bajo nivel socioeconmico y en
condiciones de hacinamiento.
Los factores que interfieren con las defensas normales del husped son alteracin de
la conciencia, humo de cigarrillo, hipoxemia, acidosis, alcoholismo, inhalaciones
txicas, edema de pulmn, desnutricin, infecciones virales previas, uremia, obstruccin mecnica y utilizacin de agentes inmunosupresores (corticoides y drogas
citotxicas). Asimismo, pueden interferir con las defensas normales, enfermedades
de base como diabetes, fibrosis qustica, enfermedad pulmonar obstructiva crnica,
enfermedad cardiaca congestiva y enfermedades inmunosupresoras como el SIDA.
Estos datos son fundamentales para orientar al microbilogo hacia la bsqueda de
determinados agentes, (2,4) por ejemplo:
Fibrosis qustica: P. aeruginosa, S. aureus, H. influenzae y en menor medida
Burkholderia cepacia y otros bacilos gramnegativos.
Infecciones virales previas: S. aureus.
Contacto con aves: Chlamydophila psittaci.
Viajes a reas endmicas: C. immitis, Paracoccidioides brasiliensis, Legionella
pneumophila, Francisella tularensis.
Riesgo ocupacional y/o contacto con animales: C. burnetti, Bacillus anthracis,
Brucella sp., Yersinia pestis.
Antecedente de macroaspiracin: anaerobios
Epidemias de influenza: Influenza, S. pneumoniae, S. aureus, S. pyogenes, H. influenzae.
51
Prctica 4
b) Datos clnicos del paciente: signos y sntomas, enfermedades subyacentes y, adems, en la orden debe sealarse la impresin diagnstica del mdico tratante.
Etapa analtica
a) Tipo de muestras: esputo o expectoracin, aspirado transtraqueal, muestras obtenidas por broncofibroscopia, lavado bronquial, cepillado bronquial, lavado broncoalveolar y biopsia pulmonar. En algunas oportunidades las infecciones pulmonares
se acompaan de derrame pleural por lo que es necesario recolectar y estudiar una
muestra de lquido pleural obtenida por puncin.(7)
b) Toma de muestra: independientemente del mtodo a escoger para el procesamiento
microbiolgico, la muestra a seleccionar juega un papel importante en el xito esperado, ya que toda informacin diagnstica que el laboratorio pueda proporcionar, depende de la calidad de la muestra recibida.(6,7,8,9)
El esputo o expectoracin en las condiciones habituales de la clnica diaria, no es una
muestra representativa de la situacin existente en el tracto respiratorio inferior por su
mezcla con secreciones procedentes de todo el rbol traqueo-bronquial y con la flora
saprfita de la orofaringe. No obstante, es una muestra de fcil obtencin cuya utilidad
o relacin entre resultado obtenido y verdadera etiologa depende en gran medida de
su correcta obtencin, control de calidad antes de iniciar su procesamiento, tipo de
agente que se pretenda detectar y valoracin adecuada del resultado.(10)
La recoleccin de esta muestra es sencilla y consiste en solicitar al paciente seguir
las siguientes indicaciones:
Colocar en las paredes exteriores del envase la identificacin del paciente (nombre).
Cepillarse los dientes con agua (no usar pasta de dientes).
Obtener el esputo tras una expectoracin profunda, preferentemente matinal. Para ello,
debe inspirar profundamente, reteniendo por un instante el aire de los pulmones y expelindolo violentamente por un esfuerzo de tos, repetir la operacin hasta obtener no
menos de tres esputos. Este procedimiento deber realizarlo en un lugar ventilado.
52
La recoleccin la realizar en un envase que debe ser de boca ancha con tapa de
rosca, con capacidad para 30 50 mL, transparente porque permite ver la cantidad
y la calidad de la muestra y desechable (Fig. 7).
De no producirse expectoracin espontnea, puede inducirse el esputo con nebulizaciones de suero fisiolgico estril (15 mL durante 10 minutos), siendo til adems realizar un drenaje postural o fisioterapia respiratoria.
Enviar de inmediato al laboratorio, y si esto no es posible, conservar a 4 C.(10,11)
53
Prctica 4
que el sistema de graduacin del esputo no puede ser empleado si se sospecha de infecciones pulmonares causadas por micobacterias, la mayora de los hongos y virus.(8)
25
10
25
10-25
25
25
10-25
25
< 10
25
La baciloscopa es una tcnica rpida, econmica, que permite lograr una amplia
cobertura de la poblacin, por lo cual constituye un aporte importante para los programas de control de la tuberculosis, sin embargo, la visualizacin de BAR en esputo
no es afirmativa de M. tuberculosis porque otras micobacterias pueden tambin causar
enfermedad pulmonar, as como especies del gnero Nocardia que tambin pueden ser
cido alcohol resistentes. Sin embargo, una baciloscopa positiva en conjuncin con la
clnica y hallazgos radiolgicos puede utilizarse para un diagnstico presuntivo de micobacteriosis.(7,13)
La lectura de la baciloscopa debe ser hecha de manera sistemtica, leyendo de
izquierda a derecha el extendido, tomando en cuenta slo los campos microscpicos
tiles que son aquellos en los que se observan elementos celulares de origen bronquial
(leucocitos, fibras mucosas y clulas ciliadas); en aquellos campos en que no aparezcan
dichos elementos no deben contabilizarse en la lectura.(11)
El nmero de campos que se debern observar vara segn la cantidad de bacilos
que contenga la muestra:
54
Para anotar el recuento de bacilos se utilizar la hoja de recuento semicuantitativo (Fig. 8) en la cual cada cuadro representa un campo microscpico til y se colocar
el nmero de BAR observados, luego en la columna 11 se anotar la sumatoria correspondiente a cada lnea y el recuento de bacilos corresponder a la suma de los resultados registrados en la columna 11.
Columna 11
LMINA N
RESULTADO
TOTAL
55
Prctica 4
Muestra de esputo
Examen directo
Examen directo
Gram
Cultivo
Proceso de
descontaminacin
Ziehl-Neelsen
Agar Lowenstein-Jensen
KOH 10%
AS
ACH
AMK
Incubar hasta 6
semanas a 36C
Positivo
Identificacin
Positivo
Pruebas
bioqumicas
Prueba de
susceptibilidad
Reincubar 24 h a 36C
el ACH
Para el aislamiento de micobacterias antes de realizar la siembra en el medio de cultivo se debe realizar un proceso de descontaminacin debido a que es necesario eliminar
de las muestras los microorganismos contaminantes que interfieren en el desarrollo de
estas bacterias. Tambin es importante conseguir la licuefaccin de los restos orgnicos
(tejidos, moco y otros materiales) que rodean a los microorganismos, para que los agentes descontaminantes puedan destruir las bacterias no deseadas.
Pero si stas no se utilizan adecuadamente pueden afectar, tambin la viabilidad
de las micobacterias presentes en la muestra y dar lugar a falsos cultivos negativos (por
56
g) Identificacin: de acuerdo a la correlacin obtenida en el Gram directo de la muestra y el cultivo se procede a la identificacin, realizando la seleccin de las pruebas
de acuerdo con la orientacin preliminar.
En los anexos 4, 6, 7, 14, 22, 23, 25, 26 y 27 se muestran los esquemas de identificacin de algunos los agentes etiolgicos que causan infecciones del tracto respiratorio
inferior.
Procedimiento para el cultivo de otros tipos
de muestras provenientes del tracto respiratorio inferior
57
Prctica 4
b) Cultivo: se utilizan los mismos medios primarios que para esputo. Para estos tipos
de muestras se recomienda cultivos cuantitativos que son imprescindibles para poder comprender el significado del o de los patgeno/s aislado/s.(14)
Catter telescopado: El volumen de secreciones respiratorias que se recoge con
este dispositivo es de aproximadamente 0,01 a 0,001 mL. Despus de obtener
la muestra, el cepillo se coloca en 1 mL de suero fisiolgico estril, consiguindose de esta forma una solucin de secreciones respiratorias diluidas entre 100
y 1.000 veces. Posteriormente, se realizar un cultivo cuantitativo de esta solucin. Cuando la neumona es clnicamente manifiesta, habitualmente las secreciones respiratorias contienen al menos 104 UFC por gramo de tejido y 105 o ms
bacterias por mililitro de exudado.(14)
Lavado broncoalveolar (LBA): en este caso, el volumen de secreciones respiratorias recuperadas se estima en algo ms de 1 mL diluido en el lquido que
se aspira (entre 10 y 100 mL), lo que viene a suponer un factor de dilucin de
1/10-1/100 de las secreciones respiratorias originales. Los puntos de corte han
variado entre 103 y 105 UFC/mL. No obstante, el umbral diagnstico generalmente aceptado es el de 104 UFC/mL de al menos uno de los microorganismos
aislados en el cultivo.(14)
Tcnicas ciegas: en el caso del aspirado bronquial ciego y mini lavado broncoalveolar se han considerado como significativas concentraciones entre 103 y 104
UFC/mL. Para el catter telescopado no broncoscpico se acepta el mismo punto
de corte que para el procedimiento guiado.(14)
Aspirado endotraqueal: El umbral diagnstico mayoritariamente aceptado es de
106 UFC/mL. Algunos autores han recomendado un valor de 105 UFC/mL como
mejor punto de corte para esta muestra.(14)
Factores a considerar en la interpretacin
de los cultivos cuantitativos de muestras respiratorias
A pesar de establecer estos umbrales diagnsticos para cada una de las muestras
respiratorias, la carga bacteriana debe interpretarse en el contexto clnico especfico de
cada paciente. No obstante, el anlisis de los recuentos bacterianos requiere tener en
cuenta la existencia de factores que puedan influir en la concentracin de microorganismos en las muestras respiratorias:
1. Tiempo de evolucin de la infeccin: Un recuento bajo de microorganismos puede
representar un estadio evolutivo precoz de la infeccin respiratoria.
2. Antibioterapia previa: La exposicin previa a antibiticos es la variable ms importante y la que ms a menudo reduce la concentracin bacteriana en las muestras
58
respiratorias, particularmente en pacientes que han iniciado un tratamiento antibitico en las 24 horas previas a la recogida de muestras.
3. Existen subgrupos de pacientes con recuentos bacterianos relativamente altos pero sin
los cambios inflamatorios que definen la existencia de una neumona, como ocurre con
frecuencia en pacientes con Enfermedad Pulmonar Obstructiva Crnica.
4. Variabilidad de las tcnicas: Aunque la reproducibilidad cualitativa es alta, se puede observar una variabilidad en el recuento bacteriano que supone un cambio en la
categora diagnstica (por encima o por debajo del punto de corte) de un 25-30%,
tanto en LBA como en catter telescopado.
5. Factor dilucional: Cambios en el volumen en el que se introduce el cepillo del catter telescopado (universalmente admitido de 1 mL) pueden producir variaciones
dilucionales de la muestra respiratoria recogida e influir en el recuento de colonias.
En el caso del LBA el problema es mayor debido a la falta de estandarizacin de
la tcnica, en la que se usan distintos volmenes segn los autores. Se desconoce
el efecto del volumen de lquido instilado y del porcentaje recuperado sobre el recuento bacteriano.
6. Otros aspectos tcnicos: Errores en la toma de muestras o retrasos en el envo de las
mismas al laboratorio de microbiologa pueden ser causa de descensos significativos en los recuentos bacterianos o de sobrecrecimientos inespecficos.(15)
Etapa post-analtica
Una vez realizado el anlisis e interpretacin de los resultados, se procede al reporte de los mismos:
a) Baciloscopa:
(-): No se encuentran BAR en 100 campos observados.
(+): Menos de 1 BAR por campo en 100 campos observados.
(++): 1 a 10 BAR por campo en 50 campos observados
(+++): Ms de 10 BAR por campo en 20 campos observados.
En caso de encontrar slo uno a cuatro bacilos en cien campos observados debe
ampliarse la lectura a otros 100 campos utilizando una nueva lnea. Al examinar 200
campos y persistir el nmero de bacilos en 1 a 4, realizar un nuevo extendido y si persiste el nmero de bacilos, reportar el nmero de bacilos observados y solicitar otra
muestra. (11,12)
b) Cultivo: se realiza el reporte como se seala en el anexo 2.
59
Prctica 4
4 Actividad prctica
Materiales
Guantes
Tapaboca
Aplicadores de madera
Lminas portaobjetos
Equipo para coloracin de Gram y
Ziehl-Neelsen
Asa en aro
Placas: agar sangre, agar chocolate y
agar Mac Conkey.
Frasco para microaerofilia
Reactivos para catalasa y oxidasa.
Procedimiento
Etapa pre-analtica
El estudiante recibir dos hojas de solicitud de examen con los datos clnicos y
epidemiolgicos del paciente.
Etapa analtica
Cada grupo de trabajo recibir un frotis para la realizacin de baciloscopa y una
muestra de esputo, el profesor dar las indicaciones y condiciones de trabajo necesarias
para el procesamiento.
Primer perodo
Esputo
60
Segundo perodo
a) Evaluar la flora bacteriana.
b) Practicar anlisis microscpicos utilizando la coloracin de Gram de las colonias
sospechosas de inters clnico.
c) Seleccionar la(s) colonia(s) de inters y purificarlas en el medio de cultivo utilizado
en el aislamiento primario e incubar en las mismas condiciones.
d) Realizar algunas pruebas preliminares como catalasa, oxidasa, etc., de acuerdo a lo
observado en los cultivos y examen microscpico.
Tercer perodo
a) Realizar la identificacin de el o los microorganismos de inters clnico utilizando
los esquemas de identificacin (ver anexos) de acuerdo a la orientacin.
b) Realizar el antibiograma por el mtodo de Kirby-Bauer.
Cuarto perodo
a) Lectura de las pruebas bioqumicas y pruebas de susceptibilidad.
Etapa post-analtica
Cultivo
61
Prctica 4
Frotis
Autoevaluacin
1. Seale la utilidad de la coloracin de Gram en el procesamiento de una muestra de
esputo.
2. Seale tres agentes etiolgicos bacterianos ms frecuentemente implicados en infecciones del tracto respiratorio inferior.
3. Seale los objetivos de la baciloscopa.
4. Si en una baciloscopa se observan de 1 a 4 bacilos en promedio por campo. Seale
la conducta a seguir.
5. Qu conducta se debe seguir si al procesar una muestra de esputo se observan 25
clulas epiteliales y 10-25 leucocitos por campo de bajo aumento (10X)?
6. Cmo se explica el siguiente resultado: Baciloscopa: Negativa (no se observan
BAR en 100 campos observados); Cultivo: Positivo para M. tuberculosis?
7. Se puede establecer el diagnstico etiolgico cuando se observan BAR en el examen directo de esputo?
8. Seale la importancia del proceso de decontaminacin para el cultivo de micobacterias.
9. Al procesar una muestra de esputo se obtienen los siguientes resultados:
Examen directo (Coloracin de Gram): 5-10 clulas epiteliales y 25-30 PMN por
campo de bajo aumento. Se observ predominio de cocos grampositivos en pares y cadenas cortas.
Coloracin de Zielh-Neelsen: No se observaron BAR en 100 campos observados.
Cultivo: colonias pequeas, circulares, transparentes, brillantes, -hemolticas
hasta el tercer cuadrante.
Catalasa negativa, LAP negativa y al Gram se observa la misma morfologa observada en el examen directo.
a) Seale las pruebas que se le realizaran para hacer la identificacin definitiva
del microorganismo.
b) Qu valor diagnstico Ud. le dara a los hallazgos obtenidos?
62
Bibliografa
(1) Mims C, Playfair J, Roitt I, Wakelin D, Willians R. Microbiologa mdica 2 ed. Espaa:
Harcourt Brace; 1999.
(2) Va salud [en lnea] 2001 [fecha de acceso 18 de Abril de 2005]; URL disponible en:
http://www.viasalud.com/documento.asp?
(3) Ryan K, Ray G. Sherris. Microbiologa mdica. Una introduccin a las enfermedades
infecciosas. Mxico: McGraw-Hill Interamericana; 2004.
(4) Lopardo H, Hernndez C, Soloaga R. Diagnstico microbiolgico de las Infecciones
Respiratorias Bacterianas [en lnea] 1999 [fecha de acceso 18 de Abril de 2005]; URL
disponible en www.ifcc.org/ria/div/britanis/az_19.htm
(5) Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. Bailey & Scout diagnstico microbiolgico.11a ed.
Argentina: Editorial Panamericana; 2004.
(6) Jimnez P, Calvo M. Diagnstico microbiolgico en neumona comunitaria [en lnea]
2005 [fecha de acceso 18 de abril de 2005]; URL disponible en:
www.scielo.ch/
63
Prctica 4
(15) lvarez, F., Torres A., Rodrguez F. Recomendaciones para el diagnstico de la neumona asociada a ventilacin mecnica [en lnea] 2000 [fecha de acceso 15 de Abril
de 2005]; URL disponible en: http://www.ceimc.org/geih/doc3.htm
(16) Finegold S., Baron E. Bailey Scout diagnstico microbiolgico. 7 ed. Argentina: Mdica Panamericana; 1989.
64
prctica 5
Diagnstico microbiolgico
de las infecciones ticas
Emma Araujo y Aurora Longa
Objetivo general
Aplicar los mtodos convencionales para el diagnstico microbiolgico de las infecciones ticas.
Objetivos especficos
1. Describir las condiciones adecuadas para la toma de muestra en los sitios anatmicos relacionados con el cuadro clnico.
2. Analizar macroscpicamente y microscpicamente la muestra en estudio.
3. Cultivar la muestra obtenida para el aislamiento de los agentes patgenos.
4. Valorar el crecimiento obtenido en los distintos medios de cultivo.
5. Identificar los microorganismos de inters clnico.
6. Realizar pruebas de susceptibilidad antimicrobiana a los agentes etiolgicos bacterianos.
7. Analizar los resultados obtenidos.
8. Elaborar el reporte de los resultados.
Aspectos tericos
La mayor parte de las infecciones del odo afectan el conducto auditivo externo
(otitis externa) o la cavidad media (otitis media) que contiene los huecesillos y est rodeada por otras estructuras seas y la membrana timpnica. La otitis es una enfermedad
del odo caracterizada por inflamacin de la mucosa del odo externo, medio o interno
(mastoides), perforacin de la membrana timpnica y otorrea. Esta patologa se puede
clasificar sobre la base de consideraciones clnicas o histopatolgicas. Segn su duracin se puede subdividir en fase aguda y crnica. La fase aguda se refiere a la infiltracin
65
Prctica 5
66
67
Prctica 5
tan serias, anatmicas y funcionales, en el paciente que la padece. Es por esto que se le
denomina sndrome silencioso. Por este motivo gran cantidad de episodios de otitis
medias secretorias pasan sin ser diagnosticadas con las consecuentes alteraciones fsicas
y de desarrollo intelectual como: retraso en la adquisicin del lenguaje, retraso escolar y
alteraciones del comportamiento.
Todas estas caractersticas hacen que la incidencia real de la enfermedad sea desconocida, aunque muchos autores han tratado de establecer porcentajes aproximados.(4)
La OMA es una de las enfermedades que se diagnostican con mayor frecuencia en nios menores de 5 aos en todo el mundo. Un reporte mostr que se identifica desde 22,7%
de los nios durante el primer ao de vida hasta 40% en nios de 4 a 5 aos de edad.(3)
La prevalencia de infecciones recurrentes del odo medio parece ir en aumento debido
a una asistencia cada vez mayor de nios a guarderas, o a problemas alrgicos. Algunos
estudios prospectivos han demostrado que en nios de 3 meses a 3 aos de edad con infecciones agudas de vas respiratorias superiores, una tercera parte llegan a complicarse con
OMA, y que los nios menores de 2 aos que asisten a guarderas tienen episodios de OMA
y sntomas de vas respiratorias persistentes con una frecuencia aun mayor.
Otros factores de riesgo conocidos para el desarrollo de OMA temprana en nios son
el tabaquismo pasivo, el uso del chupn y la alimentacin con bibern en posicin horizontal.(3)
En algunos casos hay persistencia de secrecin estril posterior a la resolucin de la
infeccin aguda, sta puede variar entre 1 y 3 meses. Existen factores de riesgo implicados
en esta persistencia como: bajo peso al nacer y prematuridad, sexo masculino, condiciones
socioeconmicas desfavorables, asistencia a guarderas, polucin y tabaco, tipo de lactancia,
la edad del primer episodio, factores genticos e inmunitarios y cambios en la climatologa;
adems, influyen en la aparicin, recurrencia y evolucin de la enfermedad. Estas mltiples
causas van a dar lugar a una disfuncin de la trompa de Eustaquio, esta situacin es tambin
favorecida por las diferencias entre la trompa infantil y la adulta.(4)
Una de las complicaciones ms frecuentes de la OMA es el desarrollo de OM serosa
con la consiguiente disminucin de la audicin. Cuando sta se prolonga, se acompaa
de una afectacin potencial en el aprendizaje y en la expresin del lenguaje. Otras menos
frecuentes, que si no son reconocidas a tiempo pueden poner en riesgo la vida de los nios,
son la mastoiditis y los abscesos intracerebrales. Aunque estudios con controles histricos
indican que estas complicaciones supurativas parecan ocurrir con mayor frecuencia en la
era preantibitica, 13 de los casos reportados en la era postantibitica con frecuencia se asocian a un manejo inapropiado del episodio de OMA.
De acuerdo con una estimacin de la Organizacin Mundial de la Salud en pases en
vas de desarrollo, el nmero de muertes asociadas a las complicaciones de la OMA en nios
menores de cinco aos llega a 50.000 al ao. Esto podra estar asociado a un reconocimiento
tardo de dichas complicaciones o al efecto de un estado nutricional precario.(3)
68
Manifestaciones
La otitis externa se caracteriza por inflamacin del conducto auditivo y drenaje
purulento, que puede ser muy doloroso con extensin de la celulitis a los tejidos blandos adyacentes. Una forma frecuente se vincula con la natacin en agua tal vez contaminada por microorganismos aerobios gramnegativos como especies de Pseudomonas.
La otitis externa maligna es una forma considerablemente ms grave de infeccin del
conducto auditivo externo, que puede llevar a la invasin del cartlago y hueso adyacentes y en ocasiones a la parlisis de nervios craneales y la muerte. Se observa con mayor
frecuencia en ancianos con diabetes mellitus y en pacientes de cualquier edad con inmunosupresin. El agente patgeno causal ms frecuente es P. aeruginosa.
La otitis media aguda, casi siempre producida por bacterias, suele ser una complicacin de las enfermedades virales agudas de las vas respiratorias superiores. Se
manifiesta frecuentemente con fiebre, irritabilidad y dolor agudo y el estudio otoscpico
revela protrusin de la membrana timpnica, mala movilidad y ocultamiento de los
puntos de referencia anatmicos normales por la presencia de lquido y clulas inflamatorias bajo presin. En algunos casos la membrana timpnica est inflamada de manera
aguda y presenta ampollas en su superficie externa (miringitis). Si se trata de forma
inadecuada, la infeccin puede avanzar hasta afectar estructuras adyacentes, como las
clulas areas mastoideas (mastoiditis), o causar la perforacin con drenaje espontneo
a travs de la membrana timpnica. Las posibles secuelas supurativas agudas incluyen
extensin hacia el sistema nervioso central y septicemia.
Como ya se haba mencionado antes, la otitis media crnica suele ser producto de
una infeccin aguda que no se resolvi de modo apropiado.
La otitis media serosa puede representar una forma de otitis media o inflamacin
relacionada con alergia crnica. Tiende a ser crnica, produce dficit auditivo y se vincula con secreciones espesas en el odo medio que por lo general no son purulentas.1
Flora habitual del odo externo
La microbiota general del odo externo es similar a la de la piel, predominando
Staphylococcus (coagulasa-negativo) y miembros del gnero Corynebacterium. Con
menos frecuencia se observan especies de Bacillus, Micrococcus y Neisseria. En esta
localizacin se han aislado tambin otros microorganismos que colonizan la piel en
forma transitoria como Streptococcus pneumoniae, P. aeruginosa y especies de la familia Enterobacteriaceae, entre ellos, los gneros Proteus, Escherichia, Enterobacter
y Klebsiella. Estudios micolgicos demuestran que los siguientes gneros de hongos
pertenecen a la microbiota normal: Aspergillus, Alternaria, Penicillium, Candida y
Saccharomyces.(5,6)
69
Prctica 5
Agentes etiolgicos
> 3 meses de edad
Flora mixta en 40% de los casos con cultivo. Los microorganismos frecuentes incluyen P. aeruginosa, Haemophilus influenzae,
S. aureus, especies de Proteus, K. pneumoniae, Moraxella
catarrhalis y bacterias anaerobias grampositivas y gramnegativas.
Sin embargo, slo en el 58 a 75% de los casos se logra aislar alguna bacteria. Estudios realizados para la identificacin de agentes virales en el lquido del odo medio de
pacientes con OMA han demostrado su presencia en 41% de ellos, pudiendo coexistir
hasta tres virus de manera simultnea, que por orden de frecuencia son: Virus sincicial
respiratorio, virus parainfluenza e influenza. La coexistencia bacterias-virus en el lquido del odo medio es una causa de otitis media aguda persistente y un retraso de 2 a 4
das en la esterilizacin del lquido por los antimicrobianos.(1,3)
70
Diagnstico
El diagnstico de las infecciones ticas se establece con base a la exploracin
clnica. En casos de sospecha de otitis media se puede hacer timpanometra para detectar la presencia de lquido en el odo medio y valorar la funcin de la membrana
timpnica. La causa especfica de la otitis externa puede determinarse por cultivo
de material obtenido del conducto auditivo afectado; no obstante, debe tenerse en
cuenta que la contaminacin superficial y la flora cutnea normal pueden originar
cultivos mixtos que son origen de confusin. Por ello, es recomendable tomar muestra del material de ambos conductos auditivos.
En la otitis media, el mtodo diagnstico ms preciso es la aspiracin cuidadosa
con una aguja estril a travs de la membrana timpnica, despus de descontaminar
el conducto auditivo. La tincin de Gram y el cultivo de tales aspirados son muy
confiables; empero, dichos procedimientos se reservan para pacientes en los que
las posibles causas son muy variadas, como en lactantes pequeos o cuando existe
inadecuada respuesta clnica al tratamiento antimicrobiano usual. No se puede confiar en los cultivos del aparato respiratorio ni en los de nasofaringe para emitir un
diagnstico causal.(1)
Para el anlisis de secrecin tica, se debe tomar en cuenta el tipo de otitis que
presente el paciente: otitis externa, otitis media serosa con o sin ruptura timpnica.
Una vez hecho esto se tomar la muestra dependiendo del caso. Si se trata de una
otitis externa se limpia el canal externo con solucin salina fisiolgica estril y se
introduce un hisopo estril en el conducto auditivo externo. Los cultivos de canal
auditivo externo generalmente no reflejan la causa bacteriana de la otitis media, a
menos que haya habido una ruptura reciente de membrana del tmpano.
Con respecto a la secrecin tica de odo medio, sta es una muestra que debe
ser obtenida a travs de un procedimiento mdico; posterior a la limpieza del canal
auditivo externo con un antisptico suave, se recolecta la muestra mediante aspiracin, desde el tmpano o ms atrs.(7)
Si las muestras no son tomadas en el laboratorio stas pueden ser transportadas
en frasco estril o en medio de transporte Stuart, mantenindose a temperatura ambiente hasta 2 horas luego de la toma.
Para investigar hongos es necesario incluir exmenes en fresco que permitan
observar sus estructuras caractersticas as como medios de cultivo que permitan su
desarrollo y posterior identificacin.
Si se requiere la realizacin de pruebas de susceptibilidad antimicrobiana tener
en cuenta la eleccin del agar Mueller Hinton (Mueller Hinton bsico, Mueller Hinton con 5% de sangre y Mueller Hinton con 2% de cloruro de sodio) dependiendo
del microorganismo identificado.
71
Prctica 5
Tratamiento
Excepto en casos graves, la otitis externa puede tratarse mediante limpieza suave con soluciones tpicas. Las bacterias gramnegativas ms a menudo referidas son
susceptibles a un ambiente cido y suelen ser eficaces las soluciones ticas amortiguadas a un pH bajo (3.0 o menos), como aquellas con cido actico al 0,25%. Se dispone de varios preparados, de los cuales un gran porcentaje de los mismos tambin
contienen antimicrobianos.
La otitis media aguda requiere de antimicrobianos y vigilancia cuidadosa de
la evolucin para asegurar su resolucin. La seleccin del antimicrobiano suele ser
emprica, ideada de forma especfica para cubrir a los patgenos bacterianos ms
frecuentes, porque la aspiracin directa para fines diagnsticos casi nunca es necesaria. En el caso habitual, esos microorganismos patgenos son S. pneumoniae y H.
influenzae. Si hay presin extrema con dolor intenso, tal vez sea necesario el drenaje
de los exudados del odo medio mediante incisin cuidadosa de la membrana timpnica. En pacientes con otitis media serosa o crnica, el tratamiento tal vez sea ms
complejo y suele aconsejarse buscar interconsulta otorrinolaringolgica para determinar procedimientos diagnsticos adicionales, as como planear posibles medidas
teraputicas mdicas y quirrgicas.(1)
5 Actividad prctica
Etapa pre-analtica
Aspectos a considerar del paciente
72
Etapa analtica
Primer perodo
Materiales
Hisopos estriles
KOH al 10%
Solucin salina fisiolgica estril (SSF) En caso de haber observado estructuras
fngicas: Agar saboraud dextrosa con y sin
Medios de cultivo: agar sangre, agar
antibiticos, agar actidione, bilis-agar.
chocolate suplementado, agar Mac En caso de que la muestra sea tomada
Conkey y agar manitol salado.
a distancia del laboratorio debe trans Equipos para tincin de Gram
portarse en el medio Stuart.
Lminas y laminillas
Procedimiento
Toma de muestra del conducto auditivo externo:
1. Limpiar el canal auditivo externo con un hisopo impregnado con SSF.
2. Humedecer varios hisopos estriles con solucin salina igualmente estril y tomar la muestra del conducto auditivo externo de cada odo. Introducir el hisopo
siguiendo una direccin oblicua de atrs hacia delante y de abajo hacia arriba.
Obtener la muestra del margen activo, incluyendo la secrecin fresca de reas profundas.
3. Realizar un examen directo y colorearlo con la tincin de Gram con muestra proveniente de cada odo, los hisopos se descartan una vez utilizados.
4. Preparar exmenes en fresco con SSF y KOH si se sospecha de hongos.
Describa lo observado:
Gram de odo derecho
SSF
KOH 10%
73
Prctica 5
5. Sembrar la muestra de cada odo por separado en una misma placa. Hacer este procedimiento con cada uno de los agares (Fig. 10).
6. Diseminar e incubar bajo condiciones de microaerofilia a 37 oC por 24-72 horas los
medios de agar sangre y agar chocolate suplementado y en aerobiosis el agar MacConkey y el agar manitol salado
Muestra
(Conducto auditivo externo)
Gram
SSF
KOH al 10 % *
AS
Observacin de elementos
fngicos
Sembrar
Sembraren
enagar
agarSaboraud
Saboraud
dextrosa
dextrosacon
conyysin
sinantibitico,
antibitico,
bilis
esculina,
agar
actidione.
agar bilis, agar actidione.
ACH
36 C
C
Incubar a 36
por 24 h en
microaerofilia
Incubar
AMK
AMS
36 C
C
Incubar a 36
por 24 h en
aerobiosis
Positivo
3-8 das
a TA
Estudio macroscpico
de colonias
Identificacin
Pruebas bioqumicas
Antibiograma
Colonias sospechosas
de un patgeno
36 C
C
Incubacin 36
x 18-24 h
Si no se observan colonias de
inters reincubar hasta 48 h en
las mismas condiciones.
Gram
Identificacin bioqumica y
lectura del antibiograma
Reporte
Segundo perodo
Materiales
Hisopos estriles
Solucin salina fisiolgica estril (SSF)
Medios de cultivo: Agar Mueller Hinton,
agar Mueller Hinton ms 5% de sangre.*,
Mueller Hinton ms 2% de cloruro de sodio*
* Depende del microorganismo aislado.
74
Patrn de McFarland.
Discos de antibiticos.
Equipos para tincin de Gram
Lminas
Pruebas bioqumicas dependiendo de la bacteria en estudio.
Procedimiento
1. Revisin de los cultivos sembrados cada 24 horas hasta las 72 horas de incubacin.
Describa las caractersticas observadas en cada medio de cultivo:
Agar sangre
75
Prctica 5
Tercer perodo
Materiales
Reactivo para prueba de oxidasa.
Reactivo para prueba de catalasa.
(Perxido de hidrgeno).
Papel de filtro.
Palillos de madera.
Etapa post-analtica
Realizar el reporte final (Anexo 2).
Autoevaluacin
1. Cules son los diferentes tipos de muestra para el diagnstico microbiolgico de
una infeccin tica?
2. Qu medios de cultivo utilizara usted en una secrecin tica?
76
Bibliografa
(1) Ryan K, Ray C. Sherris. Microbiologa mdica. 4 ed. Mxico: Mc Graw Hill; 2004.
(2) Bernldez P, Morales G, Quantin L, Hernndez C, Litterio M. Otitis media crnica
supurada en nios. Arch. Argent Pediatr 2004; 102(3):174-179.
(3) Villaseor Sierra, A. Actualidades en el diagnstico, tratamiento y prevencin de la
otitis media aguda. Enferm Infec Microbiol 2004; 24 (3). Disponible en red: www.amimc.org.mx/revista/2004/vol_24-3/actualidades.htm
(4) Prez-Piero B, Campos M, Castro-Conde J, Lpez-Aguado D. Otitis media serosa.
Canarias Peditrica 2000; 24 (1): 65-76.
(5) Murray P, Rosenthal K, Kobayashi G, Pfaller M. Microbiologa mdica. 4 ed. Espaa:
Mosby; 2004.
(6) Prescott L, Harley J, Klein D. Microbiologa. 4 ed. Madrid: McGraw-Hill; 2000.
(7) Montiel F, Lam M. Manual de microbiologa clnica. Chile: Publicaciones Mediterrneo;
2001.
77
prctica 6
Objetivo general
Desarrollar la estrategia metodolgica para el diagnstico de infecciones oculares.
Objetivos especficos
1. Enumerar los microorganismos de la flora habitual y los principales patgenos
del rgano de la visin.
2. Describir los principales cuadros infecciosos que afectan al rgano de la visin.
3. Describir las condiciones del paciente y la tcnica adecuada para la obtencin
de secrecin y raspado conjuntival.
4. Obtener y procesar muestras de secrecin y raspado conjuntival para la investigacin de agentes productores de conjuntivitis.
5. Identificar los microorganismos de inters clnico segn los esquemas convencionales del diagnstico microbiolgico.
6. Distinguir un proceso infeccioso de un proceso alrgico a travs de la deteccin
de eosinfilos.
Aspectos tericos
El rgano de la visin en su conjunto cuenta con un sistema altamente especializado para hacerle frente a las injurias del medio ambiente externo, como una
capa resistente de colgeno que recubre las estructuras intraoculares y membranas
conjuntivales que tapizan los prpados y se extienden sobre la superficie del globo
ocular. Las pestaas previenen la entrada de cuerpos extraos en el ojo durante el
parpadeo (aproximadamente de 5 a 20 veces por minuto). Las secreciones de las
79
Prctica 6
Caractersticas
de la secrecin
Tipo celular
predominante
Edema
palpebral
Prurito
Adenopata
Bacteriana
purulenta
leucocitos polimorfonucleares
Moderado
no
no
clara
mononucleares
mnimo
no
frecuente
eosinfilos
Moderado
a intenso
intenso
no
Viral
Alrgica
80
Kiralba Snchez
81
Prctica 6
Diagnstico
El diagnstico etiolgico de las infecciones oculares requiere de un cuidado minucioso en el momento de la obtencin de la muestra. Es de resaltar que la muestra
a seleccionar juega un papel muy importante para la deteccin de algunos microorganismos fastidiosos y complejos para su deteccin.
Etapa pre-analtica
El estudio epidemiolgico del paciente incluye, adems de los datos filiatorios
del paciente, la impresin diagnstica, evolucin clnica del proceso infeccioso (ver
cuadros clnicos), antecedentes de traumatismos, enfermedades subyacentes, usos
de lentes de contacto, uso de corticoesteroides tpicos, entre otros.(2)
Etapa analtica
La obtencin de la muestra constituye un punto clave para la consecucin de
un resultado confiable. En la tabla 15 se especifican los tipos de muestras que son
requeridos segn el cuadro clnico, asimismo, los microorganismos patgenos y potencialmente patgenos que se asocian a cada caso.(3,7)
82
Kiralba Snchez
Tipo de muestra
Patgenos a investigar
C. trachomatis1
H. influenzae biogrupo aegyptius
S. aureus
Conjuntivitis aguda
Secrecin conjuntival
S. pneumoniae
Raspado conjuntival
N. gonorrhoeae
Moraxella lacunata
Enterobacterias2
P. aeruginosa2
S. aureus
P. aeruginosa
Streptococcus del grupo viridans
Staphylococcus coagulasa negativo
Aspergillus niger
Fusarium sp.
Acanthamoeba sp. 4
S. aureus
S. pneumoniae
Endoftalmitis
P. aeruginosa
B. subtilis5
Mycobacterium sp.
Streptococcus sp.
S. aureus
Celulitis orbital
S. pyogenes
Secrecin purulenta
S. pneumoniae
Aspirado de lesin
H. influenzae
S. aureus
Blefaritis
Raspado palpebral
Staphylococcus sp.
Pestaas6
Corynebacterium sp.
Demodex folliculorum
En pacientes inmunocomprometidos.
Tomado de: Beers y Berkow, 1999; Mandell y col., 2002; Ryan y Ray, 2005.
83
Prctica 6
Procedimiento
En el caso de conjuntivitis, la muestra se obtendr del ngulo interno del ojo.
1. Utilizar hisopos estriles de algodn o alginato de calcio
2. Humedecer el hisopo en solucin salina fisiolgica estril
3. Rotar suavemente el hisopo en el ngulo interno del ojo
4. Cultivar cada ojo por separado en una misma placa AS y ACHs (Fig. 11).
5. Incubar a 36 C, bajo condiciones microaerfilas por 24 h hasta 72 h.
6. Obtener muestras de cada ojo para realizar los preparados directos en lminas para
teir con Gram y Hansel.
7. Obtener raspado conjuntival del borde interno del prpado superior e inferior para
la investigacin de C. trachomatis, realizar el frotis siguiendo las instrucciones del
docente y teir con la coloracin de Giemsa.
Observacin: Para la investigacin de otros microorganismos poco frecuentes en
infecciones oculares se recomiendan los siguientes medios de cultivo:(2)
Anaerobios: caldo tioglicolato, agar sangre con base Schaedler
Micobacterias: Lowestein-Jensen
Corynebacterium diphtheriae: medio inclinado de Loeffler, agar telurito de potasio
Hongos: Saboraud-glucosa con y sin antibiticos, agar bilis semislido.
84
Kiralba Snchez
Gram
Hansel
Giemsa
Inmunoflluorescencia
directa (C. trachomatis)
Medio AMIES
AS
AMS
ACH
TM
Incubacin
36 C
CO2
24-48 h
Reporte
Identificacin bioqumica y
lectura del antibiograma
CO2
4 das
aerobiosis
x 24 h
X
CO2
24-48 h
Estudio macroscpico
de colonias
Pruebas bioqumicas
Antibiograma
Gram
85
Prctica 6
Etapa post-analtica
Describir los hallazgos al examen directo (Gram): tincin y morfologa de todos los
microorganismos con significancia clnica. As mismo, registrar si los microorganismos se encuentran intra o extracelularmente y la presencia de clulas inflamatorias. A partir de Hansel reportar los eosinfilos; del extendido teido con Giemsa,
los hallazgos positivos se reportan: Se observaron cuerpos de inclusin sugestivos
de Chlamydia trachomatis.
Reportar la cantidad (escasa, moderada o abundante) del microorganismo aislado
en cultivo puro o aquel que se le haya dado valor por su crecimiento predominante.
Si estn presentes microorganismos indgenas y se ha determinado que son contaminantes para el caso, incluir el siguiente comentario: Presencia de microbiota
indgena conjuntival o Desarrollo de microbiota habitual de la regin.(6)
6 Actividad prctica
Primer perodo: Obtencin y siembra de secrecin ocular y raspado conjuntival
Materiales
Hisopos estriles
Lminas portaobjetos
Medios de cultivo: agar Sangre,
agar chocolate suplementado,
agar manitol salado.
86
Kiralba Snchez
Procedimiento
1. Elaborar la ficha clnico-epidemiolgica del paciente (Anexo1).
2. Preparar todo el material necesario para la obtencin de la muestra. Rotular las
placas que contienen los medios de cultivo y las lminas portaobjetos con el cdigo
correspondiente.
3. Recolectar la secrecin del ngulo interno del ojo afectado. Proceder a inocular
los medios de cultivo y estriar la muestra por agotamiento. Se recomienda obtener
secrecin del ojo no afectado para tener un patrn de referencia acerca de la microbiota habitual ocular del paciente. Incubar bajo las condiciones mencionadas.
4. Con un hisopo realice dos lminas, una, para teir con Gram, y otra, para teir con Hansel.
5. Practicar la obtencin de raspado conjuntival, para ello retire con un hisopo estril
el exceso de secrecin, proceda al raspado de la conjuntiva inferior y superior luego
de la eversin del prpado.
6. Realizar el frotis con la muestra obtenida, distribuyendo la misma siguiendo un
patrn en zig-zag, tratando de que la muestra quede bien extendida sin formar acmulos (Fig. 12).
7. Fijar las lminas segn las indicaciones para cada tcnica de coloracin.
Coloracin de Giemsa
Fije la lmina con metanol absoluto por 5
min.
Cubra la lmina con una solucin de Giemsa
(3 gotas del colorante comercial para 1 ml de
agua de chorro) durante 1 h.
Materiales
Lminas portaobjeto
Asa de platino
Agua oxigenada al 3%
87
Prctica 6
Procedimiento
1. Evaluar cada placa de cultivo segn el desarrollo bacteriano (escaso, moderado o
abundante), las caractersticas morfolgicas de las colonias y la presencia o no de
hemlisis.
2. Seleccionar el microorganismo que desarrolle en cantidad moderada o abundante,
cuidando que se corresponda con lo observado en el examen directo. Proceder a la
purificacin de la o las colonias de inters microbiolgico en AS ATS y en caldo
BHI.
3. Inocular la batera bioqumica adecuada segn las caractersticas morfolgicas y
tintoriales del microorganismo.
4. Realizar el antibiograma (mtodo Kirby-Bauer).
Palillos de madera
Lminas portaobjeto
Procedimiento
1. Leer las pruebas bioqumicas inoculadas en el perodo anterior.
2. Practicar (si aplica) la prueba de la catalasa a partir del caldo BHI, segn el caso.
3. Cotejar con las tablas de identificacin bacteriana.
4. Leer e interpretar el antibiograma.
5. Registrar y elaborar el reporte respectivo (Anexo 2).
Autoevaluacin
1. Enumerar los microorganismos que forman parte de la microbiota habitual del rgano de la visin.
2. Seale los agentes infecciosos ms importantes productores de infecciones oculares y mencione para cada caso el tipo de muestra a seleccionar.
3. Explique la importancia de la coloracin de Hansel en el diagnstico de una conjuntivitis.
4. Esquematice el diagnstico de una conjuntivitis por C. trachomatis.
5. Cul es la importancia de los mtodos moleculares en el diagnstico de las infecciones oculares?
88
Kiralba Snchez
Bibliografa
(1) Mandell G, Bennett J, Dolin R. Enfermedades infecciosas. Principios y prctica. 5 ed.
Argentina: Mdica Panamericana; 2002.
(2) Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. Diagnstico microbiolgico.
Texto y atlas color. 5 ed. Espaa: Mdica Panamericana; 2001.
(3) Beers M, Berkow R. El Manual Merck. 10 ed. Espaa: Harcourt; 1999.
(4) Murray P, Rosenthal K, Kobayashi G, Pfaller M. Microbiologa mdica. Texto Atlas
Color. 4 ed. Espaa: Mosby Elsevier Science; 2002.
(5) Ryan K, Ray C. Sherris Microbiologa mdica. 4 ed. Mxico: McGraw-Hill Interamericana;
2005.
(6) Isenberg H, editor. Clinical Microbiology Procedures Handbook. Washington (DC):
American Society for Microbiology;1992.
(7) Araque M, Nieves B, Snchez, K, Velsquez A, Velazco E, Vizcaya L. Manual prctico
de bacteriologa. Universidad de Los Andes. Venezuela; 1999.
(8) Di Bartolomeo S, Janer D, Rodrguez F, Sauka D, Margarinas T. Incidente of Chlamydia
trachomatis and other potencial pathogens in neonatal conjuntivitis. Int J Infect Dis
2001; 5:139-143.
89
prctica 7
Objetivo general
Aplicar los mtodos convencionales para el diagnstico microbiolgico de infecciones del tracto urinario (ITU).
Objetivos especficos
1.
2.
3.
4.
5.
Aspectos tericos
El trmino ITU define la presencia de microorganismos en las vas urinarias, siendo
las patologas ms frecuentes cistitis (infeccin de la vejiga) y pielonefritis (infeccin del
rin y su pelvis).(1)
Epidemiologa
Las ITU son de las enfermedades ms frecuentes, en particular en mujeres. Su prevalencia es dependiente de la edad y el gnero. Casi 1% de los nios, muchos con
91
Prctica 7
Patogenia
La orina, producida en el rin y descargada a travs de la pelvis renal y los urteres hacia la vejiga, es estril en el individuo sano. Se desarrolla infeccin cuando las
bacterias logran ingresar a ese ambiente y pueden persistir en l, sobre todo a travs de
una va ascendente de bacterias residente de la flora perineal, provenientes de la flora
del intestino grueso. Entre los factores que favorecen el acceso de las bacterias el ms
importante es el coito, que desplaza bacterias de forma transitoria al interior de la vejiga
y pone en riesgo a la mujer por la corta longitud de la uretra. Otro es la manipulacin
de la uretra como el sondeo. Las bacterias tambin pueden alcanzar las vas urinarias
desde la corriente sangunea, lo cual es menos frecuente y requiere una infeccin en otro
sitio. La persistencia se favorece por factores del hospedero que interrumpen o retardan el flujo urinario, como instrumentacin, obstruccin o anomalas estructurales. Los
factores bacterianos incluyen la capacidad de adherirse al uroepitelio y producir otros
factores como las exotoxinas. Los miembros del gnero Proteus, productores de ureasa,
se vinculan con clculos urinarios, que por s mismos son factores que predisponen a la
infeccin.(3)
Diagnstico
El diagnstico de laboratorio de una ITU se realiza a travs del urocultivo, el cual
consiste en el cultivo bacteriolgico de la orina para determinar la presencia y cuantificacin de grmenes patgenos. Para la evaluacin de estos grmenes y de su potencial
importancia en un proceso infeccioso de las vas urinarias es imperativo conocer los
siguientes aspectos:(1)
Flora habitual de los genitales externos y la uretra anterior
Estafilococos coagulasa negativa, Corinebacterias no patgenas (difteroides), Enterobacterias: Escherichia sp., Proteus sp., Klebsiella sp., Enterobacter sp. entre otras.
92
Urocultivo
Etapa pre-analtica
Antes de iniciar el estudio de la muestra, el microbilogo debe conocer algunos
datos concernientes al paciente: edad, gnero, factores predisponentes, sntomas, antecedentes de ITU, tratamiento actual o previo con antibiticos. El paciente no debe haber
recibido terapia antimicrobiana durante los tres das anteriores a la recoleccin, excepto
en los casos de control de tratamiento y pacientes gravemente enfermos.
93
Prctica 7
94
Etapa analtica
Procesamiento de la muestra: antes de iniciar el estudio de la muestra, el microbilogo debe conocer algunos datos concernientes a la misma.
Muestra: tipo de recoleccin: chorro medio, puncin suprapbica, sonda (puncin,
sonda nueva). Conservacin.
1.
2.
Examen directo
Examen macroscpico: olor, color, aspecto, pH, densidad.
Examen microscpico: estudio del sedimento (en fresco): se centrifuga entre 10 15 ml de orina a 3000 rpm durante 10 min, el sedimento obtenido se coloca entre
lmina y laminilla y se observa al microscopio con objetivo de 40X.
Interpretacin
La observacin de una o ms clulas microbianas por campo de inmersin se presenta en muestras con contajes mayores de 100.000 colonias/ml de orina, acompaadas generalmente por al menos un leucocito cuando existe piuria.
En las muestras que contienen contajes menores de 100.000 colonias/ml de orina,
generalmente no se observan microorganismos ni clulas.
95
Prctica 7
3.
96
Anlisis cualitativo
La identificacin de los agentes se hace mediante el estudio de las caractersticas
microscpicas de las colonias y la utilizacin de los sustratos del medio, ejemplo: lactosa, hemlisis y la identificacin final a travs de pruebas fisiolgicas diferenciales, como
la prueba de la oxidasa, accin sobre azcares.
Anlisis cuantitativo
Contar el nmero de colonias y multiplicar por el factor 1000 o 100, de acuerdo a
la capacidad del asa utilizada, para determinar las unidades formadoras de colonia por
mililitro de orina (UFC/ml).
Pruebas de sensibilidad a los antimicrobianos
Generalmente se usa el mtodo de Kirby Bauer, tomando en cuenta para la eleccin
de los antibiticos el agente aislado y aquellos que ms se utilizan en el tratamiento de
las ITU.
Etapa post-analtica
Informe de resultados
Datos personales del paciente: Nombre y apellidos, cdula de identidad.
Nombre del mdico tratante
Fecha de recepcin de la muestra y emisin del reporte.
Tipo de muestra: Orina (especificar mtodo de recoleccin)
Examen realizado: Urocultivo o cultivo y antibiograma
Resultados del examen directo: fresco o frotis
Agente microbiano aislado (gnero y especie) y recuento de colonias:
Recuento de colonias:
Generalmente un recuento de 10.000 o menos colonias por ml de orina indica contaminacin y un recuento de 100.000 o ms, indica infeccin.
Cuando se obtienen valores intermedios, el examen debe ser repetido, ya que existen factores como, por ejemplo, la obstruccin uretral, diuresis, infecciones crnicas e
infecciones por cocos grampositivos, que pueden explicar recuentos bajos en infecciones urinarias verdaderas.
Antibiograma.
97
Prctica 7
Mtodo de recoleccin
Microorganismo
(s) presentes
Pasos a seguir
Puncin suprapbica
10.000 100.000
Cualquier mtodo
y condicin
Identificar microorganismo
Identificar microorganismo
1.000
Control post-tratamiento
10.000
Cultivo puro
de probables patgenos
Identificar microorganismo
Identificar microorganismo
Identificar microorganismo
Identificar microorganismo
Sintomtica
Tres o ms especies
Identificar microorganismo
7 Actividad prctica
Urocultivo
Primer perodo
Materiales
Muestra de orina
Asa calibrada
Coloracin de Gram
1. Llenar la planilla de registro del laboratorio con los datos personales, epidemiolgicos y clnicos del paciente.
2. Realizar el examen macroscpico y microscpico (Sedimento y Gram) de una muestra de orina y describir lo observado en cada caso.
3. Sembrar la muestra de orina en AS y CLED o MK o EMB, utilizando el asa calibrada
e incubar en las condiciones ya sealadas (Fig. 13 y 14).
98
Muestra de orina
AS
Examen al fresco
AMK
Microaerofilia
Reincubar 48 h
Negativo
CLED
Incubar a 36 C
por 18-24 h
(Sedimento)
Gram
Aerobiosis
Negativo
Positivo
Recuento de colonias
Pruebas bioqumicas
Antibiograma
Positivo
Incubar a 36 C por 24 h
Reporte
El inculo se extiende en
forma de una lnea (como
indica la figura) a lo largo del
dimetro de la placa
99
Segundo perodo
Materiales
Pruebas bioqumicas
Reactivo de oxidasa
Hisopos estriles
Papel de filtro
Discos de antibiticos
Palillos de madera
Procedimiento
1. Observar las placas sembradas en el perodo anterior, describa las caractersticas
observadas en cada medio y realice el contaje de colonias.
2. De acuerdo a las caractersticas macroscpicas y microscpicas observadas, sospecha de un agente en particular? Escriba el nombre.
3. Con base en la morfologa y tincin observada en el examen directo de la muestra
de orina coloreada con Gram y el estudio de las caractersticas de las colonias y su
efecto sobre el medio del agente etiolgico, seleccione y siembre las pruebas fisiolgicas que le permitirn identificar el microorganismo, as como los antibiticos
para la prueba de sensibilidad de acuerdo al agente presuntamente identificado y
los datos clnicos y epidemiolgicos.
4. Incubar a 37 C durante 24 horas.
Tercer perodo
Materiales
Reactivo de Kovacs
Reactivo de oxidasa
Reactivo FeCl3
Procedimiento
1. Realizar la prueba de la oxidasa si es el caso.
2. Realizar la lectura de las pruebas fisiolgicas montadas en el perodo anterior e
identifique el agente aislado.
3. Realizar la lectura de la prueba de susceptibilidad antimicrobiana.
4. Elaborar el informe definitivo de los resultados.
Cultivos negativos: Negativo a las 48 horas de incubacin o no se observ desarrollo bacteriano hasta las 48 horas de incubacin.
Cultivos positivos: Desarrollo de nmero de UFC/ml de orina de nombre del microorganismo.
Ejemplo: Desarrollo de ms de 100.000 de UFC/ml de orina de Escherichia coli.
Autoevaluacin
1. Mencionar en orden de frecuencia las especies bacterianas productoras de ITU.
2. Describir la tcnica ms utilizada para el diagnstico microbiolgico de una ITU.
3. Sealar las condiciones de conservacin y transporte de una muestra de orina para
urocultivo, justificar la respuesta.
4. Mencionar los antibiticos ms utilizados para el tratamiento de una ITU.
5. Definir los siguientes trminos: disuria, poliaquiuria, piuria, cistitis, pielonefritis.
6. Mencionar la ventaja de incorporar el medio CLED en el urocultivo.
Bibliografa
(1) Vizcaya L. En Araque M, Nieves B, Snchez K, Velsquez A, Velazco E, Vizcaya L. Manual
prctico de bacteriologa. Universidad de Los Andes, Facultad de Farmacia, Escuela de
Bioanlisis, Departamento de Microbiologa y Parasitologa, Ctedra de Bacteriologa
Clnica. 1.999.
(2) Zorc J, Kiddoo D, Shaw K. Diagnosis and management of pediatric urinary tract
infections. Clin Microbiol Rev 2005, 18(2): 417-422.
(3) Ryan K, Ray C. Sherris, Microbiologa mdica. 4 ed. Mxico: Mc GrawHill
Interamericana; 2004.
(4) Alcoba J, Gutirrez I, Batista N, Garca V. Infeccin urinaria por Haemophilus influenzae
como manifestacin inicial de alteracin renal. Enferm Infec Microbiol Clin 2004;
22(2):125-127.
(5) Universidad Central de Venezuela, Facultad de Medicina, Escuela de Medicina Luis
Razetti, Ctedra de Microbiologa. Gua de trabajos prcticos, Caracas 2000.
(6) Delgado A, Amich S, Prieto S, Salve M. Manual de laboratorio clnico bsico:
Microbiologa. Colombia: McGraw-Hill; 2000.
(7) Montiel F, Lam M. Manual de microbiologa clnica. Chile: Publicaciones Tcnicas
Mediterrneo Ltda.; 2001.
prctica 8
Objetivo general
Aplicar los mtodos convencionales para el diagnstico microbiolgico de la Enfermedad Diarreica Aguda (EDA).
Objetivos especficos
1.
2.
3.
4.
Aspectos tericos
Enfermedad diarreica
Las infecciones del tracto gastrointestinal representan un grave problema de salud
pblica. La diarrea es la manifestacin ms comn de esas infecciones, las cuales constituyen una de las causas ms importantes de morbilidad y mortalidad en lactantes y
nios menores de cinco aos, con el mayor nmero de casos en los pases en vas de
desarrollo de Asia, frica y Latinoamrica.(1,2)
La terapia de rehidratacin oral, se ha identificado como la medida ms eficaz para
la reduccin de la mortalidad por diarrea. Una mayor reduccin de la misma se alcan-
103
Prctica 8
104
Las bacterias anaerobias que se encuentran en mayor proporcin son las siguientes:
Bacteroides 100%, Peptococcus, Fusobacterium, Peptostrepotococcus, Lactobacillus y
Clostridium.
Las bacterias anaerobias facultativas o aerobias son las siguientes: E. coli 100%,
Klebsiella y Enterobacter 40 80%, Proteus 5-50%, Citrobacter sp., Pseudomonas sp.,
Enterococccus sp. 100%, Staphylococcus 30-50%.
Esta flora se mantiene en equilibrio por diferentes mecanismos tales como: produccin de bacteriocinas y sustancias txicas como cidos grasos, entre otras.
Etiologa y patogenia
En la trascendencia del proceso diarreico, interviene no solo la patogenicidad del
agente, sino la respuesta particular del husped y de su propio ecosistema microbiano,
esto trae como consecuencia que el espectro de respuestas clnicas vare de un individuo a otro, manifestndose en unos, con enfermedades clnicas graves, en otros, con
sntomas leves, y en otros, con infeccin intestinal subclnica, de all que algunas veces
al realizar coprocultivos en personas sin diarrea, se aislen enteropatgenos.
En la Tabla 17, se exponen los microorganismos relacionados ms a menudo con procesos diarreicos, el posible mecanismo de patogenicidad del agente y el sitio de accin.
Localizacin
anatmica
Diarrea acuosa
Intestino grueso
ECET
Diarrea acuosa
Enterotoxina(s)
Intestino delgado
ECEP
Diarrea acuosa
Intestino delgado
ECEH
Colitis hemorrgica
Citotoxina
Intestino grueso
GR
ECEI
Diarrea disentrica
Invasin de la mucosa
Intestino grueso
PMN (85%), GR
Serotipos de
Salmonella
Disentera
Invasin de la mucosa
Intestino delgaPMN
do/grueso
Salmonella typhi
Shigella sp.
Diarrea disentrica
Fiebre entrica
Microorganismo
Sndrome clnico
Microscopa
de heces
Virus
Rotavirus
Bacterias
Yersinia
enterololitica
Adherencia y destruccin
de microvellosidades
Intestino grueso
PMN (84%), GR
-
105
Prctica 8
Sndrome clnico
Mecanismo de patogenicidad
Plesiomonas
Diarrea acuosa
Enterotoxina
shigelloides
Diarrea disentrica
Invasin de la mucosa
Campylobacter
Diarrea disentrica
jejuni
Diarrea acuosa
Enterotoxina
Diarrea
Localizacin
anatmica
Intestino delgado
/ grueso
Microscopa
de heces
-
PMN, GR
Intestino delgado
PMN, GR
/grueso
Intestino delgado
-
Invasin de la mucosa
Intestino delgado
PMN, GR
/grueso
Diarrea acuosa
Enterotoxina
Intestino delgado
Vibrio cholerae
Diarrea acuosa
Enterotoxina
Intestino delgado
Vibrio
parahaemolyticus
Diarrea acuosa
Se desconoce
Intestino delgado
Diarrea disentrica
Invasin de la mucosa
Intestino grueso
Giardia lamblia
Diarrea acuosa
Irritacin de la mucosa
Intestino delgado
Cryptosporidium sp.
Diarrea acuosa
Enterotoxina?
Intestino delgado
Desconocido
Intestino delgado/grueso
Aeromonas sp.
disentrica
Parsitos
Entamoeba
histolytica
Blastocystis
hominis
Monocitos
ECET: Escherichia coli enterotoxignica; ECEP: Escherichia coli enteropatgena; ECEH: Escherichia coli
enterohemorrgica; ECEI: Escherichia coli enteroinvasiva; PMN: Leucocitos polimorfonucleares; GR: Glbulos rojos.
Tomado de: Vizcaya y col, 1999; Romero y Herrera, 2002; Ryan y Ray, 2004.
Coprocultivo
Etapa pre-analtica
Muestra: La muestra de heces o hisopado rectal debe ser recolectada durante el
perodo agudo de la enfermedad, antes de iniciar el tratamiento antimicrobiano. Utilizar
un envase de boca ancha, tapa hermtica, preferiblemente estril, en caso de muestras
lquidas se recomienda recolectarla en un envase para recoleccin de orina.
Conservacin y transporte de la muestra: Si la muestra no se cultiva de inmediato,
antes de las dos horas, se recomienda colocarla en un medio de transporte: Cary Blair y
mantenerla a temperatura ambiente por un lapso no mayor a 5 das.
Datos clnicos y epidemiolgicos del paciente: Edad, sntomas, tiempo de evolucin del cuadro diarreico, tipo de alimentos ingeridos, contacto con animales y cules,
procedencia, ocupacin.
106
Etapa analtica
Examen directo
Examen macroscpico: consistencia, color, olor, presencia o ausencia de moco y/o
sangre.
Examen microscpico: para determinar rpidamente la naturaleza de una enfermedad diarreica es de gran ayuda y tiene un alto grado de confiabilidad la Investigacin de
leucocitos fecales, que consiste en determinar el tipo de clulas inflamatorias presentes
en las heces; esta informacin orienta sobre la naturaleza del proceso infeccioso, ejemplo, en la shigelosis hay abundancia de neutrfilos polimorfonucleares.
Deteccin de leucocitos fecales
1. Colocar una pequea cantidad de moco o de heces en una lmina y mezclar con 2-3
gotas de azul de metileno al 1%.
2. Cubrir con una laminilla y esperar 2 a 3 minutos con la finalidad de obtener una
buena coloracin nuclear.
3. Observar al microscopio con los objetivos secos (10X y 40X).
Nota: Tambin se puede realizar un frotis y colorearlo con una coloracin simple o
compuesta.
Interpretacin
La presencia de 5 o ms leucocitos por campo microscpico sugiere la presencia
de un agente enteroinvasor. La ausencia de clulas inflamatorias sugiere la presencia de
un agente toxignico (Tabla 17).
Aislamiento bacteriano
En las muestras de heces, las bacterias entricas patgenas se encuentran siempre
asociadas a una gran variedad de bacterias comensales, es por ello, que para facilitar el
aislamiento y posterior identificacin de estas bacterias, se emplean diferentes medios
de enriquecimiento, selectivos y selectivos diferenciales (Fig. 15).(1)
107
Prctica 8
Muestra de heces
o hisopado rectal
Examen macroscpico
Medio Cary
Blair
Gram
Azul de metileno
%
Suspensin fecal
en SSF
Caldo selenito
APA
Incubar 6-8 h a 36 C
y subcultivar
AMK
AMK
XLD
SS
XLD
SS
TCBS
Incubar a 36 C por 24 h
en aerobiosis
CIN
TCBS
PM
PM
Incubar
48 h
Pruebas bioqumicas
42 C en
microaerofili
TA
(25 C)
E. coli
diarreognica
Shigella sp.
Salmonella sp .
Aeromonas sp .
Plesiomonas shigelloides
CIN
Pruebas bioqumicas
Vibrio sp .
Campylobacter sp.
AMK
AMK
XLD
XLD
SS
SS
TCBS
TCBS
Incubar a 36 C en
aerobiosis
Pruebas bioqumicas
Shigella sp .
Salmonella sp .
Aeromonas sp .
Plesiomonas shigelloides
Vibrio sp .
Yersinia enterocolitica
108
Identificacin
Escherichia coli diarreognicas:
Se investigan cuatro tipos: E. coli enteropatgena (ECEP), E. coli enteroinvasiva (ECEI)
E. coli enterotoxignica productora de la toxina termolbil (ECET-TL), E. coli enterohemorrgica O:157 H:7 (ECEH). Para ello se seleccionan del agar MK, de la siembra directa con
la materia fecal, 5 colonias fermentadoras de la lactosa sugestivas de E. coli, las colonias
seleccionadas se identifican como E. coli mediante las pruebas de: oxidasa, Kligler, Indolmotilidad, citrato. A esta bioqumica inicial se le adiciona el medio lisina-hierro-agar (LIA),
cuando se sospecha de ECEI (particularmente cuando el recuento de leucocitos es superior
a 5 x campo microscpico), la cual no decarboxila la lisina. Cuando se sospecha de ECEH
serotipo O:157 H:7, se adiciona caldo sorbitol, la cual no fermenta el sorbitol, tambin se recomienda el uso de agar MK con sorbitol para la recuperacin de este serotipo (Fig. 16).(1)
MK
siembra
coloniasLactosa
Lactosa(+)
55colonias
Purezas
en TS 3%
Pruebas bioqumicas:
Kligler
Indol-motilidad
Citrato
LIA (decarboxilacin lisina negativa
sospecha de ECEI)
Sorbitol (negativo: sospecha de
ECEH O:157 H:7)
Oxidasa
Positiva
Negativa
E. coli
Identificacin
de Aeromonas
Pruebas
bioqumicas:
Kligler
LIA
MIO
Citrato
Urea
Inositol
Serologa para
ECEP, ECET-TL,
ECEI, ECEH,
segn el cuadro
clnico y la edad
dell paciente
d
FiguraFigura
16. Investigacin
dedeEschericha
colidiarreognicas
diarreognicas
16. Investigacin
Eschericha coli
109
Prctica 8
Purezas en
TS 3%
Pruebas
bioqumicas:
Kligler
LIA
MIO
Citrato
Urea
Oxidasa
Positiva
Negativa
Identificacin de
Aeromonas y
Plesiomonas shigelloides
Shigella
Serologa
Salmonella
Serologa
Salmonella
Grupos A, B, C, D,
EyF
110
Incubar 22 C
(TA Mrida)
48 horas
Colonias sospechosas
Colonias puntiformes
Manitol + (rosadas)
Purezas en
TS 3%
Oxidasa
Pruebas
bioqumicas:
Kligler:
(K/A, A/A)
Urea
Motilidad a :
36 C y 22 C
Negativa
Gnero Aeromonas (Fig. 16, 17): La bsqueda de este gnero bacteriano se realiza
Figura 18. Investigacin de Yersinia enterocolitica
en los medios MK, XLD, y SS, sembrados directamente con la materia fecal o a partir
del caldo selenito. En algunas oportunidades se puede recuperar del agar TCBS. En los
primeros medios se recupera como una colonia no fermentadora de la lactosa, pero algunas especies son fermentadoras de este carbohidrato. Del medio TCBS, puede aislarse
como fermentadora o no de la sacarosa. En el caso del ADN-AMP, la bsqueda se facilita
porque adems del carcter selectivo del medio, la mayora de las cepas hidrolizan el
ADN, lo cual se evidencia por el viraje del indicador de pH azul de toluidina, de azul a
111
Prctica 8
rosado. La identificacin bioqumica se realiza mediante las pruebas de oxidasa (positiva), fermentacin de glucosa y se debe realizar la diferenciacin con el gnero Vibrio y
Plesiomonas shigelloides (Anexo 15, 16, 17).
Plesiomonas shigelloides: Se investiga en los medios MK, XLD y SS de la siembra
directa o a partir del caldo selenito (Fig. 17). Se seleccionan colonias no fermentadoras de la lactosa que deben ser positivas a las pruebas de oxidasa y fermentacin de la
glucosa; al igual que en el gnero Aeromonas, realizar diferenciacin con los gneros
relacionados (Anexo 15, 16).
Vibrio cholerae: Del medio TCBS de la siembra directa o a partir del APA, se seleccionan colonias fermentadoras de la sacarosa (Fig. 19). Con la coloracin de Gram de las
colonias sugestivas se confirma que sean bacilos gramnegativos para continuar la identificacin. Luego se comprueba que sean oxidasa positiva, fermentadoras de la glucosa,
no productoras de gas, crecimiento en caldo nutritivo con cloruro de sodio 1% pero no
al 6,5%. Se deben realizar otras pruebas bioqumicas para diferenciar a V. cholerae de
otros gneros relacionados (Anexo 15, 16).
TCBS
Siembra
directa
a partir
Siembra
directa
o a opartir
del del
APA
Colonias fermentadoras o
no de la sacarosa
Purezas
en TS
%
Pruebas bioqumicas:
Kligler
LIA
MIO
Fermentacin inositol
Crecimiento en NaCl, otras
Oxidasa
Positiva
V. cholerae
Otros Vibrio
Serologa O1 y O139
V. cholerae O1
Serotipos: Owaga,
Inaga o Hikojima
V. cholerae O1
Biotipos:
Clsico o El Tor
112
Oxidasa (+)
Catalasa
Negativa
1,2,3,4
Positiva
5
Nitratos: +
Hipurato: AN: R
C :R
Nitratos
Positivo
1,3,4
Negativo
2
Hipurato
Positivo
1
AN: S
C :R
Negativo
3y4
AN
S: 3
C: R
R: 4
C: R
1: Campylobacter jejuni
2: C. jejuni subsp. doylei
3: C. coli
4: C. lari
5: C. concicus
AN: cido nalidxico
C: Cefalotina
S: Sensible
R: Resistente
problemas
diarreicos ms asociadas a problemas diarreicos
Figura 20. Investigacin de Campylobacter
sp., especies
113
Prctica 8
Etapa post-analtica
Informe de resultados
Datos personales del paciente: Nombre y apellidos, cdula de identidad.
Nombre del mdico tratante
Fecha de recepcin de la muestra y emisin del reporte.
Tipo de muestra: Heces completas o hisopado rectal
Examen realizado: Coprocultivo o cultivo y antibiograma
Resultados del examen directo: fresco o frotis: Azul de metileno al 1% o Gram:
Observacin o no de leucocitos mononucleares o polimorfonucleares (cantidad
x campo microscpico).
Agente microbiano aislado (gnero y especie):
Antibiograma: Solo se debe realizar en aquellos casos que se mencionaron anteriormente.
Observaciones: Mencionar solo los microorganismos investigados.
114
8 Actividad prctica
Coprocultivo
Primer perodo
Materiales
Muestra de heces
Azul de metileno al 1%
Procedimiento
1. Llenar la planilla de registro del laboratorio con los datos personales, epidemiolgicos y clnicos del paciente.
2. Realizar el examen macroscpico y microscpico (leucocitos fecales) de una muestra de heces y describir lo observado en cada caso.
3. Preparar una suspensin fecal en SSF y sembrar con pipeta Pasteur en los diferentes medios selectivos-diferenciales, selectivos y de enriquecimiento, diseminar
por agotamiento en las placas de agar e incubar en las condiciones ya sealadas
(Fig.16).
Segundo perodo
Materiales
Agar Tripticasa Soya (TS) al 3%
Pruebas bioqumicas: Kligler, LIA, MIO, IM, Urea, Cit
Procedimiento
1. Observar las placas sembradas en el perodo anterior,
describa las caractersticas observadas en cada medio
y seleccione las colonias de inters, realizar la purificacin correspondiente en agar TS 3%, inocular las
pruebas bioqumicas segn el caso, incubar a 37 C en
aerobiosis durante 12-18 horas.
115
Prctica 8
Tercer perodo
Materiales
Reactivo de oxidasa
Reactivo de Kovacs
Papel de filtro y palillos de madera
Antisueros
Procedimiento
1. Realizar la prueba de oxidasa de las colonias purificadas y ubicar la bacteria segn
el resultado obtenido, utilizando el anexo 15.
2. Realizar la lectura de las pruebas bioqumicas montadas en el perodo anterior e
identificar la(s) bacteria(s) presente(s), utilizando las tablas y esquemas.
3. Realizar las pruebas serolgicas en caso necesario.
4. Realizar el antibiograma si el caso lo amerita, de lo contrario realizar el reporte
Cuarto perodo
Realizar la lectura del antibiograma
Etapa post-analtica
Realizar el reporte del resultado (Anexo 2)
Autoevaluacin
1. Mencionar en orden de frecuencia los microorganismos productores de EDA.
2. Sealar las condiciones de conservacin y transporte de una muestra de heces para
coprocultivo.
3. Mencionar la importancia del examen directo de una muestra de heces en el coprocultivo.
4. Explicar la utilidad de cada uno de los medios utilizados en el coprocultivo.
5. Explicar la importancia de la etiologa y patogenia en el diagnstico microbiolgico
de la EDA.
116
Bibliografa
(1) Vizcaya, L. En Araque M, Nieves B, Snchez K, Velsquez A, Velazco E, Vizcaya L.
Manual prctico de bacteriologa. Universidad de Los Andes, Facultad de Farmacia,
Escuela de Bioanlisis, Departamento de Microbiologa y Parasitologa, Ctedra de
Bacteriologa Clnica. 1.999.
(2) Ryan K, Ray C. Sherris, Microbiologa mdica. 4 ed. Mxico: Mc GrawHill
Interamericana; 2004.
(3) Cheng A, McDonald J, Thielman N. Infectious diarrhea in developed and developing
countries. J Clin Gastroenterol 2005; 39(9): 757-773.
(4) Delgado A, Amich S, Prieto S, Salve M. Manual de laboratorio clnico bsico:
Microbiologa. Colombia: McGraw Hill; 2000.
(5) Romero R, Herrera I. Sndrome diarreico infeccioso. Espaa: Editorial Mdica
Panamericana; 2002.
(6) Montiel F, Lam M. Manual de microbiologa clnica. Chile: Publicaciones Tcnicas
Mediterrneo; 2001.
(7) Universidad Central de Venezuela, Facultad de Medicina, Escuela de Medicina Luis
Razetti, Ctedra de Microbiologa. Gua de trabajos prcticos, Caracas, 2000.
(8) Vizcaya L, Bravo L, Fonte L, Velasco J, Flores A. Diagnstico de laboratorio de la
Enfermedad Diarreica Aguda (EDA). Curso terico-prctico. Sociedad Venezolana de
Microbiologa, Captulo de Mrida. XXII Jornadas Venezolanas de Microbiologa Dr.
Jos A. Serrano. MridaVenezuela. 1994.
(9) Castro G, Aguilera M, Hernndez C, Arteaga R, Carmona A, Prez A, Giono S, Figueras
M, Aparicio G. La identificacin gentica de Aeromonas, una realidad y una necesidad
para la microbiologa diagnstica. Bioquimia 2003; 28(4): 11-18.
(10) Velasco J, Vizcaya L, Nieves B,
117
prctica 9
Objetivo general
Determinar mediante el hemocultivo el diagnstico microbiolgico de una infeccin del aparato circulatorio.
Objetivos especficos
1. Reconocer y aplicar los pasos a seguir en la toma adecuada de muestra de sangre
para la realizacin del hemocultivo.
2. Aplicar las tcnicas microbiolgicas convencionales para el aislamiento e identificacin de bacterias involucradas en infecciones del aparato circulatorio.
3. Determinar el patrn de susceptibilidad antimicrobiana de las bacterias aisladas en sangre.
Aspectos tericos
119
Prctica 9
Elsa Velazco
Catter infectado
Enterobacter, Klebsiella
Nutricin parenteral
Candida, enterobacterias
Enterobacter, Salmonella.
Aparato circulatorio
Aparato digestivo
Intestino grueso
Hepato biliar
Peritonitis espontnea
Sistema cardiovascular
Endocarditis
Injertos vasculares
Aparato genitourinario
Infeccin urinaria
Paciente inmunodeprimido
121
Prctica 9
Hemocultivo (8)
Toma de muestra de sangre
El momento ideal para la toma de muestra es durante el ascenso de la curva febril,
sin esperar que se presente el pico mximo de temperatura, ya que en este momento hay
mayor destruccin de los microorganismos.(9)
1. Seleccionar el sitio. Seleccionar los posibles sitios de los cuales se pueda obtener
la muestra. Es importante destacar que cada sitio de venopuncin representa un
hemocultivo, independientemente del nmero de frascos que se inoculen.
2. Preparacin del sitio para la venopuncin. Lavar vigorosamente con agua y jabn.
Limpiar con alcohol etlico o isoproplico al 70%. Si el paciente no es alrgico al
yodo, lavar en forma concntrica con tintura de yodo por 30 segundos con solucin
de yodopovidona por un minuto. Si existe alguna duda despus de la preparacin
el personal entrenado slo podr palpar con guantes estriles.
3. Desinfectar las tapas de las botellas para el hemocultivo con alcohol o yodo.
4. Proceder a la venopuncin con la jeringa en un ngulo no mayor de 45, extraer el
volumen de sangre necesario para obtener una dilucin en una proporcin de 1:5 o
1:10 de acuerdo al volmen y nmero de medios de cultivo a utilizar.
5. Dispensar el volmen de sangre obtenido rpida y suavemente en el medio de cultivo lquido con anticoagulante, previo al flameo con el mechero del orificio del
envase que contiene el medio de cultivo.
6. Limpiar con alcohol al 70% para remover el yodo el cual puede causar irritacin en
algunos pacientes.
Transportes de muestras: Los medios de cultivos deben ser transportados inmediatamente al laboratorio evitando una agitacin vigorosa.
Incubacin de los medios: Deben ser incubados en aerobiosis y anaerobiosis a una
temperatura de 36 C por un perodo mximo de 7 das (para detalles del cultivo anaerbico referirse a la prctica correspondiente). La metodologa a seguir en el diagnstico
microbiolgico de bacteremia y septicemia por hemocultivos se detalla en la Figura 21
y la Tabla N 19.
122
Elsa Velazco
Toma de muestra
Volmen de la muestra
Nmero de cultivos
Medios de cultivo
Anticoagulante
Inhibe la fagocitosis
Su efecto inhibitorio puede ser contrarrestado
por la gelatina al 1,2%.
SAS (Amilato Sulfato de Sodio)
Inhibe algunas bacterias aerbicas y anaerbicas.
Interpretacin de resultados
123
Prctica 9
Incubacin a 36 C
Inoculacin del
medio proporcin 1/10
Caldo nutriente,
caldo tioglicolato
o
caldo BHI
+ anticoagulante
x 24 h
Transparente
Transparent
Sin desarrollo
Reporte preliminar
Observar
hemocultivo
Turbide
Turbidez
Subcultivo a ciegas en
AS a los 3,5 y 7 das
Tincin de Gram
Reporte
Preliminar
Prelimina
Subcultivo en
AS
Desarrollo bacteriano
Tincin de Gram de
subcultivo y hemocultivo
Repetir subcultivo
No existe correlacin
Negativo
Positivo
x Pruebas bioqumicas
x Antibiograma
Existe correlacin
Incubar a 36 C x 24 h
Reporte de finitivo
Reincubar por 24 h
Negativo
Repetir subcultivo
124
Elsa Velazco
9 Actividad prctica
Etapa pre-analtica
1. Seleccione los datos clnicos y epidemiolgicos a considerar en una bacteremia o
septicemia de la solicitud del mdico tratante.
2. Registre los datos del paciente en la hoja de consumo interno del laboratorio diseada para tal fin.
Etapa analtica
Primer perodo
Materiales
Torniquete
Agua jabonosa
Tapaboca
Mechero
Procedimiento
Realizar la toma de muestra de sangre, transporte e incubacin de los medios de
cultivo de acuerdo a lo descrito previamente.
125
Prctica 9
Segundo perodo
Materiales
Lminas porta y cubreobjeto
Equipo de coloracin de Gram
Asa de platino, pipetas Pasteur estriles
Agar Tripticasa Soya.
Procedimiento
Observar el aspecto del hemocultivo (transparente o turbio) y de acuerdo a ello seguir la metodologa descrita en la figura 21.
En la realizacin del frotis para la coloracin de Gram es importante considerar:
1. Se debe abrir cuidadosamente el recipiente cerca del mechero, introducir el asa de
platino en anillo previamente esterilizada por el calor directo de la llama o en su
defecto utilizar una pipeta Pasteur estril con el propsito de minimizar el riesgo
de contaminacin del medio.
2. Colocar la gota del lquido y dejarla secar al aire sin esparcirla por la lmina portaobjeto. El propsito es concentrar el mayor nmero posible de microorganismos
presentes en el volumen de muestra tomada.
3. Si en la coloracin de GRAM se observa morfologa bacteriana se debe realizar un
reporte preliminar y notificarlo inmediatamente al mdico tratante.
Tercer perodo
Materiales
Equipo para la coloracin de Gram
Papel de filtro
Palillos de madera
Procedimiento
1. Observar el desarrollo bacteriano en los diferentes medios de cultivo utilizados.
2. Realizar la coloracin de Gram.
3. Realizar la prueba de la oxidasa o catalasa del agar tripticasa soya
4. De acuerdo a las pruebas de identificacin preliminares, selecccionar e inocular en
los medios de cultivo diferenciales para la identificacin bacteriana definitiva.
126
Elsa Velazco
Cuarto perodo
Materiales
Hisopos estriles
Patrn 0,5 y 2 de Mac Farland
Reactivos: Kovas y tricloruro frrico.
Discos de antibiticos
Procedimiento
Realizar la lectura de los medios de cultivo diferenciales para la identificacin bacteriana (ver anexos). De acuerdo al microorganismo aislado seleccionar el tipo de agar
MH y los discos de antibiticos para realizar el antibiograma (ver prctica de pruebas de
susceptibilidad antimicrobiana).
Quinto perodo
Materiales
Regla milimetrada
Tablas de la NCCLS para la interpretacin de los halos de inhibicin de los antibiticos ensayados (ver
prctica de pruebas de susceptibilidad antimicrobiana).
Procedimiento
Lectura de antibiograma e interpretacin de los resultados obtenidos en todas las
etapas del diagnstico microbiolgico.
Etapa post-analtica
Elaborar el reporte definitivo de los resultados (Anexo 2).
Autoevaluacin
1. Establezca la diferencia entre un sitio anatmico naturalmente estril y naturalmente contaminado
2. Cules son los hallazgos clnicos y epidemiolgicos que se deben considerar en
una infeccin del aparato circulatorio de origen nosocomial?
127
Prctica 9
Bibliografa
(1) Martnez J. Infecciones sistmicas: Septicemia y endocarditis infecciosa. En: Garca
Rodrguez y Picazo. Microbiologa mdica. (ed) Tomo 2. Ediciones Mosby/Doyma 1996.
p. 131-152.
(2) Stanford S., Phair J., Peterson,L., Warren J. Enfermedades infecciosas. Bases clnicas y
biolgicas. 5a ed. Mxico: Editorial McGraw-Hill Interamericana; 1999.p. 526-542.
(3) Nieto, J. Fisiopatologa de la infeccin. En Infecciones intrahospitalarias. Malagn G.,
Hernandez E. 2a ed. Colombia: Editorial Mdica Panamericana; 1999. p. 61-74.
(4) Reimer,L. Update on Detection of Bacteremia and Fungemia. Clin Microbiol Rev 1997;
10 (3): 444-465.
(5) Wenzel. Current understanding of sepsis. Clin Infect Dis 1996; 22: 407-413.
(6) Koneman E, Allen S, Dowell V, Janda W, Sommers H, Winn W. Diagnstico
microbiolgico. 3a ed. Argentina: Editorial Mdica Panamericana; 1998. p.119-195.
(7) Prescott L, Harley J, Klein D. Microbiologa. 5a ed. Espaa: Editorial McGraw-Hill.
Interamericana; 2004. p.852, 1012-1013.
(8) Velazco E. Infecciones del Aparato Circulatorio. En Araque M, Nieves B, Snchez K,
Velsquez A, Velazco E, Vizcaya L. Manual prctico de bacteriologa. Universidad de Los
Andes, Facultad de Farmacia, Escuela de Bioanlisis, Departamento de Microbiologa y
Parasitologa, Ctedra de Bacteriologa Clnica. 1.999.
(9) Ballows A, Hausler W, Herrmann K, Isenberg H and Shadomy H. Manual of clinical
microbiology. 5a. ed. Washington D.C.: Americam Society for Microbiology; 1991.
128
prctica 10
Objetivos generales
Determinar mediante el cultivo del Lquido Cefalorraqudeo (LCR) el diagnstico
microbiolgico de una infeccin del Sistema Nervioso Central (SNC).
Objetivos especficos
1. Conocer los pasos a seguir en la toma adecuada de muestras de LCR para la realizacin de estudios microbiolgicos.
2. Analizar macroscpica y microscpicamente una muestra de LCR y realizar el reporte adecuado de este estudio.
3. Aplicar las tcnicas microbiolgicas convencionales para el aislamiento e identificacin de bacterias involucradas en las infecciones del SNC.
4. Determinar el patrn de susceptibilidad de las bacterias aisladas en el LCR a los
agentes antimicrobianos.
5. Elaborar y reportar correctamente los resultados del cultivo y el antibiograma de
patgenos aislados en LCR.
Aspectos tericos
El estudio del Lquido Cefalorraqudeo (LCR) en pacientes sospechosos de tener un
proceso infeccioso del Sistema Nervioso Central (SNC), representa uno de los ms importantes procedimientos de urgencia que debe realizar el laboratorio de microbiologa
clnica. Esto se debe a la urgente necesidad de instalar una terapia antimicrobiana eficaz
cuando se identifica el agente infeccioso involucrado.
Las patologas infecciosas del SNC son variadas y pueden involucrar ms de una
estructura anatmica o tejido cerebral, es por ello que debemos realizar una revisin de algunos trminos comnmente utilizados:(1-3)
M a nual p rctic o de bacteri ol og a cl nica
129
Prctica 10
Diagnstico microbiolgico...
Agente
Lactantes y nios
Streptococcus pneumoniae,
Haemophilus influenzae.
Adultos
Neisseria
meningitidis,
Circunstancias especiales
Meningitis o abscesos intracraneales vincula- Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis,
dos con traumatismos, intervenciones neuro- S. pneumoniae, bacterias anaerobias gramnegativas y
quirrgicas o cuerpos extraos intracraneales. grampositivas, especies de Pseudomonas.
Abscesos intracraneales no vinculados con Estreptococos microarfilos o anaerobios,
traumatismos o intervencin quirrgica.
gramnegativas anaerobias y flora mixta.
130
bacterias
10
131
Prctica 10
Diagnstico microbiolgico...
TABLA 21. Patrn habitual del LCR y en diversas infecciones del SNC
Situacin clnica
Leucocitos/mm3
% polimorfonucleares
Glucosaa
Protenas(mg/dl)
Nios y adultos
> 60
< 30
< 50
> 60
30-80
5-5000 (800)
> 60
< 45
> 60
5-2000 (100)
< 60
< 45
> 60
Normales a trmino
0-32 (8)
< 60
> 60
20-170 (90)
Normales pretrmino
0-29 (9)
< 60
> 60
65-150 (115)
Normal
0-5
Infeccin viral
2-2000 (80)b
Infeccin bacteriana
Tuberculosis y micosis
Recin nacidos
10 Actividad prctica
Estudio microbiolgico del lquido cefalorraqudeo
(Aislamiento de bacterias comunes)
Materiales
Muestra de LCR a estudiar.
Asa de platino.
Lminas portaobjeto.
Toma de la muestra
Las muestras de LCR deben ser coleccionadas antes de la terapia antimicrobiana y
por el mdico tratante.
Puncin lumbar
1. Limpiar el sitio de puncin con solucin antisptica y alcohol antes de la insercin
de la aguja.
2. Insertar una aguja biselada de calibre y tamao adecuado en los interespacios vertebrales L3-L4, L4-L5 o L5-S1, hasta alcanzar el espacio subaracnoideo (Fig. 22).
132
10
Figura 22. Posicin correcta para la toma de muestra de LCR por puncin lumbar
Primer perodo
Anlisis macroscpico de la muestra, examen directo e inoculacin en medios de
cultivo (Fig. 23).
1. Registre los datos personales del paciente y elabore una ficha de laboratorio con los
datos epidemiolgicos y clnicos del paciente, segn anexo 1 (consulte la historia
clnica del paciente o comunquese con el mdico tratante).
2. Registre el volumen, apariencia y/o color del LCR.
3. Recuerde que de acuerdo al volumen del LCR, usted decidir si se debe centrifugar o
no muestra (volumen mayor de 1 ml centrifugar a 3.000 rpm durante 10 minutos)
133
Prctica 10
Diagnstico microbiolgico...
4. Con una gota de la muestra obtenida en el punto 3, prepare un frotis sin extender
para ser teido con la coloracin de Gram.
Recomendacin:
Deje secar la lmina al aire o sobre una superficie caliente (evitar el calor directo o
secar con la llama del mechero). Se recomienda fijar la muestra con metanol porque
previene la lisis de los eritrocitos y permite obtener un frotis ms limpio. Deje secar
el metanol y luego coloree con la tincin de Gram (deje secar al aire).
5.
6.
7.
8.
Segundo perodo
1. Examine todos los medios de cultivo para evidenciar si hay o no desarrollo de microorganismos:
Si no se observa crecimiento sobre los medios slidos stos deben ser reincubados
por 72 horas antes de ser descartados. Los caldos deben ser revisados diariamente
por 5 a 7 das antes de ser descartados.
Si hay desarrollo de microorganismos sobre los medios de cultivo slidos realice
la coloracin de Gram, de acuerdo a lo observado, proceda a montar las pruebas
de identificacin definitivas. Si el desarrollo de microorganismos se observa en
los medios lquidos se realizar el Gram y se inocular en medios slidos en forma
semicuantitativa. Simultneamente se pueden montar las pruebas de identificacin
definitivas.
1.1. Describa y dibuje lo observado al Gram.
1.2. Todos estos hallazgos deben ser notificados inmediatamente al mdico tratante. Elabore el reporte.
2. De acuerdo a lo observado en el o los frotis coloreados con Gram, y las reacciones
observadas en los medios de cultivo slidos, proceda a montar las pruebas bio-
134
10
Tercer perodo
Lectura de la pruebas de identificacin y antibiograma.
1. Registre y analice los resultados observados en las pruebas de identificacin. Proceda a realizar la identificacin definitiva del microorganismo.
Resultado
135
Prctica 10
Diagnstico microbiolgico...
2. Realice la lectura del antibiograma y proceda a registrar los resultados en la siguiente tabla:
Disco de antibitico
Dimetro en mm
Interpretacin
Recomendacin:
Si el microorganismo aislado es un Haemophilus influenzae o Neisseria meningitidis
es importante realizar la prueba de deteccin de -lactamasas (prueba de la cefinasa).
En el caso de que se aisle una enterobacteria o un microorganismo no fermentador
de la glucosa, la deteccin de -lactamasas se realizar con la prueba del doble disco
(segn las indicaciones del profesor).
3. Elabore el reporte definitivo (Anexo 2)
Lquido Cefalorraqudeo
Sedimento
Sobrenadante
Gram
AS
Reporte
ACH
Caldo tioglicolato
o Tripticasa de soya
Incubar
a 36x24
C xh24
h
Incubar
a 36C
microaerofilia
Negativo
Negativo
Pruebas inmunolgicas y
moleculares
Reporte
Positivo
Reincubar
Reincubar
36 C xx 24
24 h
aa 36C
h
microaerofilia
Positivo
x Tincin de Gram
x Pruebas bioqumicas
x Antibiograma
Incubar a 36 C
x 24 h
136
Identificacin de la
bacteria aislada y lectura
del antibiograma
10
Autoevaluacin
1. Por qu se considera el estudio microbiolgico del LCR una emergencia para el
microbilogo clnico?
2. Mencione algunas contraindicaciones para la toma de muestra de LCR por puncin
lumbar.
3. Mencione algunos casos en los cuales una muestra de LCR debe ser rechazada para
estudio microbiolgico.
4. Por qu es importante conocer la citologa del LCR cuando se realizan estudios
microbiolgicos de esta muestra?
Bibliografa
(1) Corts A. Infecciones del sistema nervioso central. En: Gmez A, lvarez CA, Len A.
Enfermedades infecciosas en UCI. 1a ed. Bogot: Distribuna Editorial Mdica; 2004. p.
370-386.
(2) Palmieri OJ. Meningitis infecciosa. En: Palmieri, OJ. Enfermedades infecciosas. 1era
ed. Santiago de Chile: McGraw-Hill Interamericana; 2001. p. 128-45.
(3) Ray, CG. Infecciones del sistema nervioso central. En: Ryan KJ, Ray CG. Sherris Microbiologa mdica. 4ta. ed. Mxico: McGraw-Hill Interamericana; 2004. p. 949-56.
(4) Montiel F, Lam M. Procedimientos para realizar cultivos aerobios segn la muestra.
En: Montiel F, Lam M. Manual de microbiologa clnica. Chile: Publicaciones Tcnicas
Mediterrneo; 2001. p. 53-86.
137
prctica 11
Diagnstico microbiolgico
de las infecciones del tracto genital
Kiralba Snchez
Objetivo general
Desarrollar la estrategia metodolgica para el diagnstico de infecciones del tracto genital.
Objetivos especficos
1. Distinguir los microorganismos de la microbiota habitual y los principales patgenos del tracto genital tanto femenino como masculino.
2. Clasificar los procesos infecciosos que afectan al tracto genital.
3. Describir las condiciones del paciente y las tcnicas adecuadas para la obtencin de
muestras genitales.
4. Aplicar la metodologa microbiolgica convencional para el anlisis de muestras
vaginales, cervicales y uretrales.
5. Reconocer la importancia del examen directo como una herramienta til para el
diagnstico diferencial de infecciones del tracto genital.
Aspectos tericos
La mucosa genital es una regin vulnerable a la infeccin producida tanto por microorganismos constitutivos de la microbiota habitual como por los adquiridos de forma
exgena a travs del contacto sexual. La primera porcin de la uretra en el hombre, la
vulva y la vagina en la mujer estn normalmente colonizadas por diferentes microorganismos, que incluyen estafilococos coagulasa negativo, corinebacterias, estreptococos,
micoplasmas, bacterias anaerobias y, con menos frecuencia, levaduras (Tabla 22).
En el caso de la mujer en edad reproductiva destaca la presencia de cantidades
significativas de Lactobacillus acidophilus, este agente ejerce un control biolgico
M a nual p rctic o de bacteri ol og a cl nica
139
Prctica 11
sobre otros microorganismos, constituyndose en un mecanismo de defensa muy importante para el epitelio vaginal. En ocasiones las infecciones del tracto genital femenino pueden ser de origen endgeno, causadas principalmente por: Gardnerella vaginalis,
Streptococcus agalactiae o Candida sp.(1)
Tanto en el hombre como en la mujer las infecciones genitales mas relevantes desde
el punto de vista clnico, epidemiolgico y de salud pblica son las infecciones de transmisin sexual (ITS). Dentro de stas tenemos las ITS clsicas: gonorrea, sfilis, chancro
blando, linfogranuloma venreo y granuloma inguinal. Las ITS de nueva generacin
comprenden las infecciones producidas por Chlamydia trachomatis (serovariedades D
hasta la K), Virus Herpes Simplex, Virus Papiloma Humano y el Virus de la Inmunodeficiencia Humana.(2)
Producto de las infecciones genitales se genera un variado espectro clnico con
manifestaciones o sin ellas, que pueden derivar en complicaciones graves como la enfermedad inflamatoria plvica, problemas ginecoobsttricos, esterilidad, cncer e incluso
la muerte.(3)
En los ltimos aos ha habido avances sustanciales en el diagnstico de las infecciones de transmisin sexual, entre ellos, el uso de nuevas muestras para el anlisis
como orina o saliva y la aparicin de nuevos mtodos diagnsticos. Particularmente el
diagnstico de las ITS ha cambiado histricamente, debido a las dificultades que existen
para la obtencin de muestras representativas; por otra parte, los microorganismos como
C. trachomatis, Treponema pallidum y los virus no se pueden detectar por metodologas
convencionales. As tenemos los mtodos inmunolgicos, aun cuando adolecen de baja
sensibilidad, son utilizados ampliamente en el diagnstico de algunos microorganismos fastidiosos, debido a su disponibilidad comercial y costo accesible. Actualmente se
cuenta con mtodos sofisticados y econmicamente ms costosos, de amplificacin de
cidos nucleicos (AAN) como la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR), la reaccin
en cadena de la ligasa (LCR) o la amplificacin mediada por transcriptasa (TMA) que
mejoran la sensibilidad (90-95%) y la especificidad (95%) al detectar hasta 10 organismos.(4)
Microorganismos
Uretra
Vagina
140
11
Kiralba Snchez
Cuadros clnicos
En la mujer sexualmente activa las infecciones vaginales y cervicales son causa frecuente de consulta mdica. Bajo la influencia de los estrgenos, el epitelio vaginal normal
se cornifica, adquiriendo una resistencia relativa a la infeccin por algunos patgenos. No
obstante, el ecosistema vaginal es dinmico y est sometido a cambios constantes, dados
por factores endgenos y exgenos, entre los que se sealan: el estado hormonal, uso de
contraceptivos orales, tratamientos genitales tpicos, embarazo, duchas vaginales, relaciones sexuales, uso de dispositivos intrauterinos (DIU), infecciones, stress, cambio de parejas
sexuales, entre otros. (5,6) Los cuadros clnicos que con frecuencia se presentan en la mujer
se especifican a continuacin:
Vaginitis: es la inflamacin de la vagina que se acompaa comnmente con secrecin vaginal o leucorrea. Los sntomas no son especficos, lo que implica que el diagnstico
debera ser confirmado por pruebas de laboratorio y as evitar los tratamientos empricos.
La etiologa generalmente es infecciosa, aunque tambin puede estar originada por
causas no infecciosas: iatrognicas causada por agentes qumicos, reaccin a un cuerpo
extrao o lavado muy frecuente; puede haber vaginitis alrgica a los componentes de
espermicidas, semen, o productos de higiene sanitaria, ropa interior, entre otros. La
vaginitis atrfica se presenta frecuentemente en la mujer postmenopusica, siendo producto del adelgazamiento del epitelio vaginal y la falta de glucgeno, lo que conlleva a
una reduccin de la produccin de cido lctico y un incremento del pH vaginal. Estos
cambios producen un sobrecrecimiento de bacterias coliformes no acidfilas; la leucorrea no es profusa.(7)
Las vaginitis infecciosas comnmente padecidas por la mujer sexualmente activa son:
la candidosis y la tricomoniasis. En algunos casos pueden ser ocasionadas por G. vaginalis,
Mycoplasma sp., Staphylococcus aureus o Escherichia coli.(5,8)
Otras manifestaciones que pueden estar presente en los casos de vaginitis son: ardor,
prurito, dolor durante las relaciones sexuales (coitalgia), sangramiento, entre otros.
Vaginosis bacteriana (VB): es la causa ms frecuente de infeccin vaginal entre las
mujeres en edad frtil. Se caracteriza por la presencia de un flujo homogneo, blanquecino o
grisceo, que puede estar presente en cantidad escasa, moderada o abundante; la secrecin
se adhiere fcilmente a la pared vaginal y puede expeler un olor ftido. El hallazgo mas resaltante es el reemplazo de los lactobacilos por microbiota bacteriana, predominantemente
anaerbica, representada por G. vaginalis y especies de Mobiluncus, Prevotella, Porphyromonas y Mycoplasma. Otro aspecto importante es la ausencia de inflamacin. Es de destacar
que aproximadamente el 50% de las mujeres que cursan con VB son asintomticas. Los
siguientes se consideran factores de riesgo: duchas vaginales, embarazo, uso de DIU, promiscuidad, nuevo compaero sexual, entre otros.(8)
141
Prctica 11
142
11
Kiralba Snchez
VIRUS
HONGOS
PARSITOS
Neisseria gonorrhoeae
Inmunodeficiencia humana
Candida albicans
Trichomonas vaginalis
Chlamydia trachomatis
Trichophyton sp
Phthirus pubis
Treponema pallidum
Papiloma humano
Microsporum sp
Sarcoptes scabiei
Haemophilus ducreyi
Molusco contagioso
Giardia lamblia
Klebsiella granulomatis
Citomegalovirus
Entamoeba histolytica
Gardnerella vaginalis
Hepatitis B
Mycoplasmas sp.
Hepatitis A
Ureaplasma sp.
Tomado de: Drew, 2004
ITS supurativas
Enfermedad
Gonorrea no
complicada
Gonorrea complicada
Sndrome de artritis-dermatitis,
perihepatitis, endocarditis
Uretritis no gonoccica
Uretritis,
endocervicitis
Vaginitis
Tricomoniasis
Candidiasis
Sfilis 1
Herpes genital
Ulceras genitales
Granulomas
Verrugas genitales
Condiloma o papiloma
Molusco contagioso
Ectoparasitosis
Pediculosis pbica
Escabiosis
ITS Sistmicas
Chancro blando
Granuloma inguinal
Linfogranuloma venreo
Tomado de: Morbility and Mortality Weekly Report, 2002; Mandell y col., 2002
143
Prctica 11
Diagnstico
El xito del diagnstico de las infecciones genitales, depende primordialmente de
que la muestra a procesar sea representativa del proceso infeccioso, que la misma sea
recolectada en condiciones ptimas y transportadas adecuada y rpidamente al laboratorio. As mismo, es necesario el conocimiento de la microbiota habitual, los patgenos
potenciales y de los diferentes factores que conforman el ecosistema genital. Todos estos
aspectos repercuten en la validez del diagnstico microbiolgico.(6)
El diagnstico de la mayora de las infecciones genitales, y particularmente de las
ITS, se fundamenta en el cuadro clnico, ya que los anlisis de laboratorio no estn disponibles o son demasiado costosos. Es por ello que desde 1990, la organizacin mundial
de la salud (OMS), recomienda el manejo de las ITS con base en el diagnstico sindrmico, que recae sobre el mdico.(12)
No obstante, el mtodo tradicional por anlisis de laboratorio, se sigue fomentando
en la resolucin de casos que no se resuelven con el tratamiento emprico y en las pacientes que acuden a las consultas de ginecologa y obstetricia para el manejo adecuado
y no exponerlas a tratamientos excesivos.
Etapa pre-analtica
La valoracin de un paciente con sntomas genitales requiere de una exploracin
fsica y una anamnsis detallada. Adems de los datos filiatorios y clnicos, es preciso
obtener otros datos que pueden orientar el diagnstico microbiolgico, entre los que se
citan:
En el caso de la mujer: uso de productos de higiene femenina, tcnica anticonceptiva, uso de antibiticos que pueden alterar el ecosistema vaginal, antecedentes
familiares de diabetes, ciclo menstrual, uso de duchas vaginales, entre otros.
En caso de hombre y mujer: investigar sobre el nmero de parejas sexuales, fecha de
contacto sospechoso, nuevo compaero sexual, inicio de los sntomas, antecedentes de ITS, estilo de vida, hbitos sexuales (relaciones genito-oral, genito-anal), uso
de antibiticos, sintomatologa genital (dolor, prurito, dispareunia, ardor, disuria).
Etapa analtica
En la Tabla 25 se sealan las muestras requeridas segn el cuadro clnico o sndrome y los microorganismos a investigar.
144
11
Kiralba Snchez
Uretritis
Muestra clnica
Patgeno
N. gonorrhoeae
Hisopado uretral
C. trachomatis
Cervicitis
C. trachomatis
Hisopado de endocrvix
Vulvo-vaginitis
Trichomonas vaginalis
Enterobacterias
Lactobacillus sp.
Gardnerella vaginalis
T. pallidum
Ulceras
H. ducreyi
Virus del Herpes simple
Sfilis
Suero
T. pallidum
145
Prctica 11
Procedimiento: Para la obtencin de la muestra vaginal y/o cervical, se debe emplear un espculo; la maniobra puede ser realizada por el mdico en la consulta o por
el microbilogo en el laboratorio, siempre que se disponga de una camilla ginecolgica.
Por lo general, las muestras son enviadas al laboratorio, por ello es importante la instruccin del personal que recolectar las mismas.(13)
Observacin: si la muestra es recolectada en el laboratorio de microbiologa, se
debe disponer adems de los medios de cultivo necesarios, segn el tipo de muestra a
obtener.
Olor
Consistencia
pH
Color
146
11
Kiralba Snchez
Gardnerella
Bacilos
Prevotella/Porphyromonas
gramvariables curvos
4+
3+
1+
1+ 2+
2+
2+
3+ 4+
1+
3+
4+
Cuantificacin: 0: ningn organismo; 1+: < 1 morfotipo; 2+: 1 a 5 morfotipos; 3+: 6 a 30 morfotipos; 4+:
> 30 morfotipos.
Interpretacin: Puntaje total: 0-3: Negativo para VB; 4-6: flora vaginal alterada; 7-10: Vaginosis bacteriana.
Tomado de: Nugent y col., 1991
3. Cultivo de secrecin vaginal: En la figura 24 se presenta el protocolo para la investigacin microbiolgica de una secrecin vaginal. Es de destacar que el cultivo es
requerido en casos particulares: en mujeres embarazadas y en mujeres con leucorreas inespecficas o resistentes al tratamiento. En VB no se recomienda el cultivo
de G. vaginalis por cuanto forma parte del ecosistema vaginal normal, no obstante,
se dispone de una serie de criterios clnicos y microscpicos bien establecidos que
orientan al diagnstico hacia una VB (Tabla 27 y 28).(15,16) Se recomienda la siembra de la secrecin en un agar bilis semislido para la recuperacin de Candida sp.
147
Prctica 11
Candidiasis
Tricomoniasis
Vaginosis bacteriana
Vaginosis citoltica
Caractersticas
del flujo
Moderado a
abundante, blanco,
como leche cortada, olor cido
Escaso, moderado o
abundante, adherente, homogneo,
blanco a grisceo,
olor a pescado
Moderado a
abundante, blanco
homogneo, olor
cido o inodoro
pH del flujo
4-4.5
5-6
> 4.5
3.5-4.5
Test de aminas
Negativo
Variable
PMN
Escasos
Moderado a
abundante
Presentes
Escasos
(< 30xc)
Presencia de
blastoconidias
y pseudohifas
Positivo
(70-80%)
Negativo
< 1xcampo
Escasos
Abundantes
(< 10xc)
Ausentes o disminuidos
Positivo (70%)
Negativo
Negativo
Negativo
Trofozoitos de
T. vaginalis
Negativo
Positivo (60%)
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Positivo (90%)
Negativo
Citlisis
Leve
Ausente
Ausente
Intensa
Lactobacilos
(> 30xc)
PMN: polimorfonucleares
Tomado de: Sobel, 1997; Navarrete y col., 2000
4. Anlisis de los cultivos: Revisar los cultivos entre las 24, 48 o 72 horas de incubacin. Correlacionar la cantidad y variedad de morfotipos coloniales con los resultados observados en el Gram. La valoracin de la cantidad de crecimiento, sigue los
criterios de interpretacin que hasta ahora se han manejado con otras secreciones,
es decir, por cuadrantes. As tenemos que si el desarrollo se observa en primer y
segundo cuadrante, se estima crecimiento escaso; la observacin de colonias hasta
el tercer y cuarto cuadrante se considera un crecimiento moderado o abundante
respectivamente.(13)
El desarrollo moderado o abundante de microorganismos indgenas debe ser considerado y repetirse la obtencin de la muestra. En caso de persistir el mismo patrn,
se le dar importancia siempre que: se descarte la presencia de patgenos, persistan los
signos y sntomas de infeccin y al examen microscpico el posible patgeno se observe
en forma predominante sobre las otras bacterias, disminucin de los lactobacilos y asociado a clulas inflamatorias.(5,7,14)
148
11
Kiralba Snchez
A partir del medio agar-bilis se realiza una preparacin hmeda para la bsqueda de estructuras levaduriformes, primordialmente clamidoconidias que nos daran el
diagnstico de Candida albicans.
Medio de transporte Stuart
Muestra
(Secrecin vaginal)
Cultivo aerbico
Gram
x Morfotipos bacterianos
x Clulas inflamatorias
x Clulas levaduriformes
x Clulas claves
Incubar a 36 C
por 24 h en
microaerofilia
Gram
Cocobacilos
gramvariables
AMK
x Pruebas bioqumicas
x Antibiograma
Incubar a 36 C
por 24 h en
aerobiosis
Desarrollo significativo
de algn morfotipo colonial
(entre 3 4 cuadrante)
Agar
bilis
Incubar a 36 C
por 24-48 h
Mycoplama y
Ureaplasma
Observacin de
Observacin
de
clamidoconidia
clamidoconidia
C. albicans
albicans
Gram
Sospechar de G. vaginalis
Identificacin bioqumica y
lectura del antibiograma
Identificacin
28
Anexo 21
Reporte
Materiales
Hisopos masculinos, buferados y estriles
Medios de cultivo: agar sangre (AS), agar ThayerMartin (ATM) y agar Mac Conkey (AMK)
149
Prctica 11
Procedimiento
Se recomienda obtener la muestra en la maana. Previa retraccin del prepucio,
inspeccionar la presencia de la gota matinal, en su defecto, practicar la asepsia del meato urinario con un hisopo y solucin salina fisiolgica estril. Indicar al paciente previo
lavado de manos que presione el glande para estimular la salida de la secrecin. Introducir y rotar el hisopo dentro de la uretra aproximadamente 2 centmetros y obtener la
muestra.
Otro espcimen recomendado con este propsito es la orina de primer chorro, para
lo cual se solicita al paciente que evacue los primeros 10 mL de orina en un recolector
estril.
150
11
Kiralba Snchez
Gram
Giemsa*
Cuerpos de inclusin
sugestivos de
C. trachomatis
x Morfotipos bacterianos
x Clulas inflamatorias
x Clulas levaduriformes
Incubar a 36 C
por 24 h en
microaerofilia
Incubar a 36 C
por 24 h en
aerobiosis
Desarrollo significativo
de algn morfotipo colonial
(entre 2, 3 4 cuadrante)
ATM
AMK
AS
Incubar a 36 C
por 24-48 h, 6% CO2
en cmara hmeda
Colonias pequeas,
grisceas, brillantes
Gram
xPruebas bioqumicas
xAntibiograma
Gram
Diplococos gramnegativos
Reporte
Identificacin bioqumica y
lectura del antibiograma
Identificacin de
(Anexo 7)
12)
N. gonorhoeae (Anexo
151
Prctica 11
Etapa post-analtica
Para el reporte de los resultados se debe seguir el formato del Anexo 2. Es importante resaltar que a diferencia de otros informes, los de las muestras genitales, en ocasiones
debe ir acompaado con algunas interpretaciones relevantes.
Informe del examen directo: del fresco, Gram y Giemsa (en los casos que aplique).
Detallando semicuantitativamente los diferentes morfotipos microbianos y la presencia de clulas (epiteliales e inflamatorias). Del examen al fresco se puede reportar directamente la presencia de tricomonas: Se observaron trofozoitos de Trichomonas vaginalis
A partir de una muestra de secrecin vaginal, siguiendo los criterios de Nugent, informar: Negativo para vaginosis bacteriana, o Microbiota bacteriana alterada o Vaginosis Bacteriana
En los cuadros de uretritis aguda con secrecin purulenta o mucopurulenta donde se observe la morfologa tpica de neiseria, es decir diplococos gramnegativos,
reportar su presencia intra o extracelular. En estos casos, el Gram constituye un
diagnstico presuntivo de N. gonorrhoeae y se debe emitir el resultado del Gram
sin esperar el cultivo.
La observacin de cuerpos de inclusin dentro del citoplasma de las clulas del
epitelio escamo-columnar, a travs de la coloracin de Giemsa se reportar: Se
observaron cuerpos de inclusin intracitoplasmticos sugestivos de Chlamydia trachomatis.
Reporte el microorganismo aislado de manera semicuantitativa si se trata de microorganismos potencialmente patgenos.
En el caso de cultivos positivos para gonococo, se reporta Desarrollo de Neisseria gonorrhoeae.
En el caso de cultivos negativos o desarrollo de microorganismos habituales, reportar: No hubo crecimiento microbiano en 72 h de incubacin o Desarrollo de
microbiota habitual de la regin, respectivamente.
152
11
Kiralba Snchez
11 Actividad prctica
Primer perodo: Procesamiento de muestras vaginales, cervicales y uretrales
Materiales
Muestra en medio de transporte y en solucin
salina fisiolgica.
Hisopos estriles
Asa de platino
Lminas porta objeto
Procedimiento
1. Elaborar la ficha clnico-epidemiolgica del paciente
2. Realizar el examen al fresco lo ms pronto posible, entre lmina y laminilla y observarlo con objetivo de 10X y 40X
3. Proceder a la siembra de las muestras cervical y uretral por la tcnica de agotamiento en AS, ATM y AMK
4. Incubar AS y ATM en microaerofilia, a 36 C hasta por 72 horas, con revisin peridica cada 24 h. AMK en aerobiosis por 24-48 h.
5. La secrecin vaginal se sembrar en AS, AMK y en agar bilis. Incubar AS en microaerofilia, los dems en aerobiosis por 24 a 48 h.
6. Fije las lminas suministradas con calor para proceder a teirlas con la tcnica de
Gram.
7. Los extendidos de secrecin vaginal teidos al Gram, se analizarn e informarn
siguiendo los criterios de Nugent.(15)
8. Uno de los frotis de secrecin cervical y uretral se fijar con metanol absoluto para
proceder a realizar la tcnica de Giemsa (ver Prctica N 6). Observe al microscopio
con objetivos de 10X y 40X.
9. Registre los resultados de la observacin de los exmenes directos.
Materiales
Asa de platino
Coloracin de Gram
153
Prctica 11
Procedimiento
1. Revisin de los cultivos sembrados en el primer perodo, evaluar semicuantitativamente el desarrollo bacteriano. Realizar Gram a cada colonia diferente que desarrolle en cada uno de los medios de cultivo (esto con el fin de reconocer la microbiota
habitual).
2. Las colonias de valor diagnstico se analizarn siguiendo los esquemas de identificacin propuestos, dependiendo de la morfologa y reaccin al Gram. Para la
identificacin de G. vaginalis ver anexo 28.
3. Inocular las pruebas bioqumicas suministradas a partir de purezas de las cepas de
inters clnico.
4. Realizar una preparacin hmeda a partir del agar bilis entre lmina y laminilla,
para investigar la presencia de blastoconidias, hifas y clamidoconidias.
5. Registre los resultados de los exmenes microscpicos.
Autoevaluacin
1. Explique la utilidad del Gram en el diagnstico microbiolgico de infecciones del
tracto genital
2. Cul es la importancia de la microbiota habitual en el tracto genital femenino?
3. Enumere los patgenos clsicos del tracto genital
4. Elabore un cuadro donde seale para cada ITS los microorganismos etiolgicos y el
mtodo de diagnstico a emplear
5. En las secreciones genitales, hacia qu diagnstico clnico orienta la presencia de:
a) clulas gua: _____________________________________________________________
b) citlisis: _______________________________________________________________
c) diplococos gramnegativos intracelulares: ___________________________________
d) pH mayor de 4.5: ________________________________________________________
e) polimorfonucleares mayor de 10 x c de inmersin:__________________________
6. Mencione los factores de riesgo para adquirir una ITS y para el desarrollo de una VB.
7. Seale las diferencias entre vulvovaginitis y vaginosis bacteriana.
8. Segn la utilidad en el laboratorio cmo se clasifica el medio ATM y explique las
ventajas para su uso.
154
11
Kiralba Snchez
Bibliografa
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155
prctica 12
Objetivo general
Describir el procedimiento convencional para aislar e identificar bacterias anaerobias a partir de muestras clnicas.
Objetivos especficos
1. Describir las caractersticas clnicas que sugieren una infeccin anaerbica
2. Describir los hallazgos bacteriolgicos que sugieren una infeccin por bacterias
anaerobias.
3. Nombrar las infecciones anaerbicas ms frecuentes y sus posibles agentes etiolgicos
4. Explicar el procedimiento a seguir para la coleccin, transporte y cultivo adecuado
de la muestra para el diagnstico de una infeccin anaerbica y establecer las diferencias con el procedimiento a seguir para la investigacin de bacterias aerobias.
5. Sealar los mtodos utilizados para la identificacin de bacterias anaerobias.
Aspectos tericos
Las bacterias anaerobias son patgenos importantes en una amplia variedad de infecciones en el hombre. Ellas pueden estar involucradas en esencialmente cualquier tipo de
infeccin bacteriana en humanos, desempeando un papel importante en la mayora de las
categoras de infecciones de piel y tejidos blandos, osteomielitis, infecciones pleuropulmonares, intra-abdominales y del tracto genital femenino (Tabla 29) (1,2,3,7,8). Del amplio nmero de bacterias anaerobias que forman parte de la flora normal, solo unos pocos gneros
estn involucrados como agentes etiolgicos de infecciones en humanos. (4)
Los anaerobios varan en su requerimientos nutricionales y en su sensibilidad al oxigeno, por lo que una apropiada coleccin, cultivo e incubacin es vital para su recuperacin.
157
Prctica 12
Principios generales
Prevotela bivia,
Prevotella disiens
Fusubacterium sp
LCR
Cabeza y cuello
3.
Torcica
Abdominal
Gineco-obsttrica
fragilis
Grupo Bacteroides
sp.
Peptostreptococcus sp.
Sangre
Clostridium
INFECCIN
0: Ninguno
1: Raro (1% - 33%)
2: Comn (34% - 66%)
3: Muy comn (67% - 100%)
158
12
Beatriz Nieves
En caso de infecciones de las vas urinarias, la orina debe obtenerse por puncin suprapbica, en caso de infecciones del tracto respiratorio inferior, la aspiracin
transtraqueal o puncin pulmonar es la forma ms adecuada para obtener la muestra
(Tabla 30) (1, 5, 10).
No apropiadas
Aspirado pulmonar
Esputo expectorado
Lquido articular
Lavado broncoalveolar
Lquido peritoneal
Contenido gstrico
Contenido de abscesos
Transporte
Cultivo
159
Prctica 12
Uso
Aislamiento de C difficile.
Aislamiento de C. perfringens
.
* Con cualquiera de las bases mencionadas anteriormente: Agar Schaedler, Agar CDC, Agar Wilkin
Shaedler, Agar Brucella.
160
12
Beatriz Nieves
Identificacin posible
Corroe el agar.
Grupo Bacteroides
urealyticus
Pigmentacin negra.
Porphyromonas, Prevotella
Fluorescencia azul.
Fusobacterium sp.
Clostridium perfringens
Huevo Frito
Fusobacterium varium.
Enverdece el agar
Fusobacterium spp.
Clostridium spp.
Cabeza de medusa
Clostridium septicum
Diente molar
Actinomyces spp.
Migas de pan
Fusobacterium nucleatum
Clostridium
161
Prctica 12
Mtodos bioqumicos rpidos miniaturizados: API 20: utiliza 20 sustratos: 15 carbohidratos, rea, gelatina, esculina, medio para detectar indol.
Requiere incubacin anaerbica durante 48 horas.
Mtodos enzimticos: RAPID ID32 detecta enzimas preformadas en unas pocas horas despus de la inoculacin, se incuba aerbicamente. Al igual que el API, este sistema
posee como base de datos un libro codificado.
Identificacin por mtodos moleculares: Se han utilizado sondas para la toxina
A en la identificacin de aislados de C. difficile, tambin se ha usado la PCR para amplificar el gen de la enterotoxina A de este microorganismo. Igualmente se ha aplicado
esta tcnica en la deteccin de otros anaerobios, como P. gingivalis, Mobiluncus sp, B.
fragilis.(6, 11)
En la figura 26 se resumen los pasos a seguir para el aislamiento e identificacin de
bacterias anaerobias.
Dependiendo de la muestra
Examen directo
(Gram)
Muestra
AS-Sch
AS-Sch-AN
BE
AS-Sch-ANV
AYH
Colonias aisladas
Aerotoleranciaa
Aerotolerancia
Gram
Caldo carne o
caldo Schaedler
Incubacin
aerbica
48
Identificacin
Pruebas bioqumicas
El diagnstico de las infecciones anaerbicas se puede predecir por el reconocimiento de ciertos signos clnicos, los cuales se resumen en la tabla 33. Aunque mucho
de estos indicios no son especficos, la presencia de ms de uno de ellos en un paciente
162
12
Beatriz Nieves
puede ser sugestivo de una infeccin anaerbica. Las condiciones predisponentes e indicios bacteriolgicos alertaran al clnico, quien puede entonces, verificar la naturaleza
del patgeno y la extensin de la infeccin.
Un nmero de hallazgos bacteriolgicos son tambin sugestivos de infeccin anaerbica, los cuales se resumen en la Tabla 34. Casi todas las infecciones anaerbicas se
originan de la propia microflora del paciente.
163
Prctica 12
164
12
Beatriz Nieves
Indol
Catalasa
Lipasa
Ureasa
Motilidad
Grupo B. urealyticus
-+
B. gracilis
B. urealyticus
-+
Wolinella /
Campylobacter
Bilophila sp.
-+
Fusobacterium sp.
-+
F. necrophorum
SR
F. nucleatum
F. mortiferum/varium
-+
-+
Porphyromonas sp.
Prevotella sp.
Pigmentada
P. intermedia
-+
-+
-+
-+
Cocos gramnegativos
Veillonella sp.
-+
-+
(5 mg)
(1 mg)
Grupo B. fragilis
Microorganismo
pigmento
Nitrato
Requerimiento F/F
Crecimiento en
bilis 20%
Colistin (10 g)
Vancomicina
Kanamicina
165
Prctica 12
Vancomicina (5 mg)
SPS
Indol
Nitrato
Catalasa
Forma de carro
Ureasa
P. anaerobius
C/
CB
RS
P. assaccharolyticus
-+
P. hydrogenalis
Clostridium sp.
Naegler-positiva
SR
Clostridium sp.
C. perfringens
C. bifermentans
C. sordelli
Naegler-negativa
Clostridium sp.
SR
C. difficile
Bacilos no esporulados
CB/
B
SR
P. acnes
+-
E. lentum
CB/
B
-+
Col. Amarillas
sobre CCFA
Kanamicina (1mg)
Fluorescencia roja
Test espora
Cocos anaerobios GP
Microorganismos
Lecitinasa
Morfologa celular
Estimulacin arginina
C: Cocos; CB: Cocobacilos; B: Bacilos; V: Variable; S: Sensible; R: Resistente; CCFA: cicloserina cefoxitin
fructosa agar; SPS: Sodio Polianetol sulfonato.
12 Actividad prctica
Materiales
Cultivo primario de una muestra proveniente de una paciente con infeccin periodontal
inoculada en agar sangre base Schaedler.
Cultivo primario de una muestra proveniente de un paciente con una infeccin abdominal
inoculada en agar sangre Schaedler selectivo y en agar bilis esculina
Coloracin de Gram.
Pruebas bioqumicas y reactivos para la lectura.
Cultivo en agar sangre base agar Schaedler de especies conocidas de anaerobios.
166
12
Beatriz Nieves
Procedimiento
Inspeccione y anote las caractersticas morfolgicas y microscpicas de las distintas colonias desarrolladas en el cultivo primario.
Caractersticas de cultivo
a) ___________________________________________________________________________
b) ___________________________________________________________________________
c) __________________________________________________________________________
d) ___________________________________________________________________________
Caractersticas microscpicas
Caractersticas microscpicas
167
Prctica 12
Caractersticas macroscpicas
a) ___________________________________________________________________________
b) ___________________________________________________________________________
c) ___________________________________________________________________________
d) ___________________________________________________________________________
Siga las instrucciones del profesor, proceda a la lectura de las pruebas bioqumicas
de las cepas en estudio. Registre los resultados.
Pruebas
Resultados
Identificacin___________________________________________________________________
Reporte de resultados (Anexo 2).
Autoevaluacin
1. Nombre, por los menos, 6 indicios clnicos que sugieren una infeccin anaerbica.
2. Nombre, por lo menos, 6 infecciones asociadas a bacterias anaerobias asociada frecuentemente a infecciones en humanos
3. Describa, por lo menos, 4 gneros de bacterias anaerobias asociadas frecuentemente
a infecciones en humanos.
4. Nombre, por lo menos, 5 hallazgos bacteriolgicos sugestivos de una infeccin anaerbica.
168
12
Beatriz Nieves
Bibliografa
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169
Anexos
171
Anexos
REPORTE DE RESULTADOS:
Nombre y apellidos: __________________________________ Edad: _________ Sexo: ________
Fecha de toma de muestra: ___________________ Fecha de emisin: _____________________
Tipo de muestra: ______________________________ Examen realizado: __________________
______________________________________ Mdico tratante: ___________________________
Examen directo (tcnica utilizada): __________________________________________________
___________________________________________________________________________________
Cultivo: ___________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________________
Antibiograma: _____________________________________________________________________
___________________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________________
Observaciones: ____________________________________________________________________
___________________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________________
Firma y sello
172
Anexos
Cocos
grampostivos
Cocos grampositivos
Prueba
clave
Catalasa
Positiva
Negativa
Disposicin al
Gram
Racimos
Cadenas o pares
Staphylococcus
Streptococcus y Enterococcus
Hemlisis
Identificin
Anexo 4 y 5
S. pneumoniae
S. grupo D
S. grupo viridans
Enterococcus sp.
Identificacin
Anexos 6 y 89
S. pyogenes
S. grupo B,C,F,G
Enterococcus sp.
Identificacin
Anexos 7 y 98
S. grupo viridans
Enterococcus sp.
Otros Streptococcus
Identificacin
Anexo 10
173
Anexos
Cocos grampositivos
Catalasa positivo
Staphylococcus
Micrococcus
Bacitracina
0.04 U
O/F glucosa
Sensible (=10mm)
Oxida glucosa
Resistente ( 10mm)
Fermenta la glucosa
Micrococcus
Staphylococcus
Coagulasa
Positiva
Negativa
S. aureus
Staphylococcus
coagulasa-negativa
Identificacin
Anexo 5
174
Lactosa
S. cohnii
R
R
Manosa
Manos
S. capitis
Ureasa
S
S. warneri
+
S. cohnii
S. haemolyticus
S. hominis
Manosa
S. simulans
+
+
Ureasa
Ureas
Nitratos
S. saprophyticus
Novobiocina
S. capitis
Ureas
Ureasa
+
Maltosa
S. haemolyticus
+
+
Fructosa
Fructos
Clave dicotmica para la identificacin de los estafilococos humanos coagulasa negativa ms frecuentes
S. saprophyticus
S.simulans
S. capitis
Reduccin
de nitratos
Fosfatasa
Fosfatas
+
+
S. capitis
S. hominis
S. epidermidis
S. cohnii
Maltosa
+
Trehalosa
Sacarosa
Sacaros
Trehalosa
S. xylosus
Xilosa
Anexos
175
Anexos
Muestra clnica
Cultivo:
Agar sangre de carnero 5%, agar
chocolate.
Incubar 36C x 18-24 h, en
microaerofilia
Colonias aisladas:
Lisas, pequeas,
redondas, mucoides,
transparente,
brillantes
-hemolticas
ANEXO 6
Coloracin de Gram:
Cocos Gram positivos
en cadenas cortas o
pares
Prueba de la catalasa:
Negativa
Optoquin
Optoquina
Resistente
Solubilidad en bilis
Sensible
Positiva
Negativa
S. pneumoniae
Prueba de LAP:
Positiva
Hidrlisis de PYR
Bilis Esculina
Tolerancia a NaCl 6,5 %
Enterococcus sp.
Streptococcus grupo D
Streptococcus grupo
viridans
viridans
176
Anexos
Cocos grampositivos
Catalasa positivo
Hemlisis en agar sangre
- hemoltico
Streptococcus
Enterococcus
Bacitracina
0,04 U
Sensible
Resistente
Diagnstico presuntivo
Streptococcus grupo A
Streptococcus grupo B, C, D, F, G
Enterococcus sp.
Pruebas diferenciales
(Anexo 8)
Diagnstico confirmatorio
Aglutinacin con
partculas de ltex.
177
Anexos
AB
SXT
CAMP
Hidrlisis
del hipurato
PYR
Bilis
Esculina
Des. en
NaCl
6,5%
Streptococcus
Grupo A
Streptococcus
Grupo B
Streptococcus
Grupo C,F,G
Enterococcus
Solubilidad
en bilis
Bilis
Esculina
NaCl 6,5%
PYR
S. pneumoniae
Enterococus sp
Streptococcus
grupo D
Streptococcus
grupo viridans*
178
R
R
Streptococcus
Grupo B
Streptococcus
Grupo C,F,G
Enterococcus
Anexos
-hemolticos.
O
Oa
Solubilidad
en bilisb
Bilis
Esculina
NaCl 6,5%
PYR
S. pneumoniae
Enterococus sp.
Streptococcus
grupo D
Streptococcus
viridans*
grupo viridans*
R
R
Microorganismo
Bilis
NaCl 6,5 %
Streptococcus
grupo D
Otros Streptococcus
179
Enterococus sp
Streptococcus
grupo D
Streptococcus
grupo viridans*
Anexos
NaCl 6,5 %
Enterococus sp.
Streptococcus
grupo D
Otros Streptococcus
Microorganismo
+ = positivo; - = negativo.
Positiva
Neisseria y Moraxella
Identificacin
Anexos 12, 13 y 14
180
Anexos
Gram
Diplococos gramnegativos
Oxidasa
Positiva
Utilizacin de
carbohidratos
Glucosa (+)
Maltosa (-)
Lactosa (-)
Sacarosa (-)
Neisseria gonorrhoeae
Determinacin de beta-lactamasa
181
Identificacin
Anexos 12, 13 y 14
Anexos
Reduccin
de nitratos
N. meningitidis
M. catarrhalis
DNasa
Lactosa
Maltosa
Fructosa
Sacarosa
N. gonorrhoeae
Microorganismo
Glucosa
Crecimiento
AN
+ = positivo; - = negativo; AN = agar nutriente. Para los azcares se utiliza el agar CTA.
182
Anexos
Reaccin
Diplococos gramnegativos
Catalasa
Oxidasa
Motilidad
Lactosa
Maltosa
Sacarosa
DNasa
Butirato-esterasa
- galactosidasa
183
184
Identificacin
Anexos 16 y 17
BGNNF
Identificacin
Anexos 16, 19 y 20
Vibrio sp.
Identificacin
Anexo 16
Plesiomonas
shigelloides
Oxidasa
Identificacin
Anexos 16 y 17
Enterobacterias
excepto
Plesiomonas
shigelloides
Negativa
Identificacin
Anexos 16 y 17
BGGNNF
BGNNF
Identificacin
Anexos 16 y 18
Aeromonas sp.
Positiva
Prueba clave
BGNNE
Anexos
Anexos
Lact +
H2S +
Lact H2S +
Oxi +
Oxi
O/F glucosa
O/F glucosa
Oxi
+
1
+
1, 3
(3.2)
O/129
R
1
+
1,2,
3,6
4.1
+
1
Nitratos - Nitritos
Inositol
S
3
(3.2)
+
5,6
6.1
+
2
1,3,6,
+
5
6.1
NaCL 0 %
1 Aeromonas
2 Plesiomonas. shigelloides
3 Vibrios no halfilos
3.1 Vibrio cholerae
3.2 Vibrio mimicus
4 Bacilo gramnegativo no
fermentador de glucosa
4.1 Shewanella sp.
5 Enterobacteriaceae
6 Vibrios halfilos
6.1 Vibrio metschnikovii
Lact: Fermentacin de lactosa
Oxi: Oxidasa
O/F: Oxidacin/Fermentacin
H2S: Sulfuro de hidrgeno
S: Sensible
R: Resistente
+
1,3
3,2
O/129
R
1
Sacarosa
S
3
+
3.1
Serologa
O1 y O139
Tomado yy modificado:
modificado Vizcaya
de: Vizcaya
y col.,
Tomado
y col.,
1994.1994.
185
186
+
+
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-/+
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
+
+
+
+
+/+
-
+
+
+
+
-
+
+
-
+
+
+
+
+
+
-
+
+
+
+
+/+
-
+
+
+
+/-
+
+
+
+/+
-
+
+
+
+
+
+
-
+
+
+
+
+
+
-
+/+/+/+/-
+
+
+
-
C. en
Deam. Deca.
42 O/F O/F O/F
Oxi. Lact Gluc Gas H2S
Mot. Ind. Orn Cit. Urea
MK
Lis.
Lis.
C Gluc Xil Mal
MK: Agar
Conkey;
Oxi:Oxi:
Oxidasa;
Lact: Fermentacin
de lactosa;de
Gluc:
Fermentacin
de glucosa; Deam
Deaminacin
Lisina;
MK:
AgarMac
Mac
Conkey;
Oxidasa;
Lact: Fermentacin
lactosa;
Gluc: Fermentacin
deLis:
glucosa;
DeamdeLis:
Deaminacin de LisiDeca Lis: Decarboxilacin de Lisina; Mot: Motilidad; Ind: Produccin de Indol; Orn: Decarboxilacin de Orinitina; Cit: Utilizacin
na; Deca Lis: Decarboxilacin de Lisina; Mot: Motilidad; Ind: Produccin de Indol; Orn: Decarboxilacin de Orinitina; Cit: Utilizacin
del citrato; 42 C: Crecimiento a 42 C; O/F: Oxidacin/Fermentacin; Xil: Fermentacin de xilosa; Mal: Fermentcin de maltosa;
del
citrato; 42 C: Crecimiento a 42 C; O/F: Oxidacin/Fermentacin; Xil: Fermentacin de xilosa; Mal: Fermentacin de maltosa;
BGNNF: Bacilos gramnegativos no fermentadores.
BGNNF: Bacilos gramnegativos no fermentadores.
Enterobacterias
Escherichia coli
Klebsiella pneumoniae
Enterobacter arogenes
Proteus mirabilis
Proteus vulgaris
Citrobacter freundii
Salmonella typhi
Shigella sonnei
Shigella flexneri
BGNNF
Pseudomonas aeruginosa
Pseudomonas fluorescens
Acinetobacter baumannii
Acinetobacter calcoaceticus
Microorganismo
Anexos
Anexos
A.. jandaei
A. schubertii
+
+
+
-
+
+
+
+
+
-
+
-
+
-
+
+
+
+
V
+
+
+
+
+
+
+
+
V
+
+
+
V
ND
-
ND
+
+
+
-
+
-
+
-
A.. trota
Indol
Gas de glucosa
Arginina
dihidrolasa
Decarboxilacin
de:
Lisina
Ornitina
Voges-Proskauer
cido de:
L-arabinosa
Lactosa
Sacarosa
Inositol
D-manitol
Salicina
Celobiosa
Hidrlisis de
Esculina
Beta hemlisis en
sangre de carnero
Sensibilidad a:
Cefalotina
Ampicilina
Susceptibilidad a
O/129
10 g
150 g
A.. caviae
Caracterstica
A.. hydrophila
187
V. cholerae
+
+
+
+
+
+
+
+
V. mimicus
+
+
+
+
+
+
+
+
V. metschnikovii
+
--V
V
V
-
V. hollisae
+
+
+
----
+
+
+
+
V
-
+
+
+
+
-
+
+
+
+
-
+
+
+
+
+
V
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
V
+
+
+
+
+
-
Grupo 2
V. cincinatiensis
+
+
+
+
V
-
Grupo 3
V. damsela
V. fluvialis
Sin NaCl
Con 1% NaCl
Oxidasa
Nit
Nit
Inositol
Arginina
Lisina
Ornitina
Prueba
Grupo 6
Grupo 5
Grupo 4
V. furnissii
V. alginolitycus
Grupo 1
V. parahaemolyticus
V. vulnificus
188
V. carchariae
Anexos
Anexo 19. Ocho pruebas diferenciales clave para divir las 12 especies
clnicamente significativas de Vibrio en seis grupos.
Anexos
Prueba
Prueba
Clsico
Clsico
Tor
ElElTor
Betahemlisis
agarsangre
sangrede
decarnero
carnero
Betahemlisis
enenagar
--
++
Prueba
CAMP
Prueba
CAMP
--
++
Prueba
Voges-Proskauer
Prueba
dede
Voges-Proskauer
--
++
Aglutinacin
eritrocitosde
depollo
pollo
Aglutinacin
dedeeritrocitos
--
++
Sensibilidad a 50 U de Polimixina B
Sensibilidad al fago IV
Sensibilidad a 50 U de Polimixina B
Sensibilidad al fago IV
R
R
R: Resistente;
S: Sensible; - : Prueba negativa; + : Prueba positiva.
Tomado de: Koneman y col., 1999.
Tomado de: Koneman y col., 1999.
Morfologa
reaccin
Nombre deyla prueba
Gram
Morfologa
reaccin
Reaccin
al
al
BacilosReaccin
grampositivos
Bacilos grampositivos
Hemlisis
Gram
Beta
Catalasa
Hemlisis
Beta
CAMP reverso
Hidrlisis de la Esculina
Reduccion de nitratos
DNAsa
Glucosa
Maltosa
Sucrosa
Maltosa
Manitol
-+
Sucrosa
Xilosa
-V
Manitol
Ureasa
--
Xilosa
+: positivo; -: negativo; V: variable
Catalasa
CAMP reverso
Hidrlisis de la Esculina
Reduccion de nitratos
DNAsa
Glucosa
+
-
Ureasa
189
190
Prueba de catalasa:
Variable
Prueba de la oxidasa:
Negativa
Coloracin de Gram:
Cocobacilos
gramnegativos
pleomrficos
Colonias asisladas:
Transparentes o grises,
hmedas, lisas,
convexas, de tamao
variable
Cultivo:
Agar chocolate con suplemento
Agar chocolate con suplemento y
bacitracina
Incubar 35-37 C x 24-48 h, en
microaerofilia
Requerimientos
de
factores V y X
Produccin de indol
Ureasa
Produccin de cidos a
partir
de
glucosa,
lactosa
Inmunodiagnstico
Muestra clnica
Anexos
Factor X
+
+
+
+
Factor V
+
+
+
+
+
-
+/+/+
+
-
Ureasa
+/+/-
Indol
Requerimiento
de factor V; Requerimiento
de factor Xde factor X
Requerimiento
de factor V; Requerimiento
Tomado de: Finegold S. y Baron E., 1989
H. influenzae
H. parainfluenzae
H. haemolyticus
H. aphrophilus
H. paraphrophilus
H. segis
H. aegypticus
H. ducreyi
Especie
cido a partir de
Glucosa Lactosa
+
+
+
+
+
+
+
+
+/+
-
-hemlisis
+
+/- (lento)
+
+/- (lento)
+
-
Catalasa
Anexos
191
Anexos
Muestra: Pseudomembrana
exudado farngeo o nasofarngeo
Gram
Coloracin de
Leffler
AS
Incubar a 36 C
por 18-48 h
en microaerofilia
Estudio macroscpico
de las colonias
Predominio de bacilos
fusiformes y espiroquetas
Incubar 36 C
por 4-8 h
ATP
Colonias gris-negras
con halo marrn
Gram y
Catalasa
ML
Diagnstico presuntivo
presuntivo
Diagnstico presuntivo
Diagnstico
de
deVincent
Vincent de especies de Corynebacterium
de Angina
angina de
Incubar a 36 C
8-12 h
Coloracin de Lffler
Pruebas bioqumicas
Enviar a laboratorio
de referencia
192
ML
Coloracin de
de Lffler
Negativo
Positivo
Reincubar
18 h
Pruebas bioqumicas
Pruebas
ATP
bioqumicas
Anexos
Examen directo
Inmunofluorescencia directa
Cultivo
- Agar Bordet-Gengou
- Agar Regan-Lowe
(selectivos y no selectivos)
Incubacin 36C,
cmara hmeda, 4-5 das.
Gram
Bacilos cortos
gramnegativos
Pruebas presuntivas
Catalasa V
Oxidasa +
Motilidad Ureasa Citrato Reduccin de
nitratos -
Prueba confirmatoria
Prueba de aglutinacin con
anticuerpos fluorescentes
anti-Bordetella pertussis.
193
Anexos
Cultivo:
Agar BCYE
Caldo extracto de levadura
Incubar 35-37C x 24-48 h, en
microaerofilia
Colonias aisladas:
blanco-grisceas a
verdes azuladas,
brillantes,
convexas,
circulares
Coloracin de
Gram:
Cocobacilos
Cocosbacilos
Gramnegativos
pleomrficos
Licuefaccin de
gelatina
Inmunofluorescencia
Diagnstico serolgico
Prueba de la oxidasa:
Variable
Prueba de la catalasa:
Positiva (dbil)
Produccin de
pigmento
fluorescente
194
Coloracin de
Zielh-Neelsen:
bacilos cido
resistentes
Colonias aisladas:
beige, tamao
variable, rugosas,
secas, opacas
Tcnicas moleculares
Nitrato reductasa
Niacina
Catalasa a 68 C
Ureasa
Arilsulfatasa
Pirazinamidasa
Hidrlisis del Tween-80
Captacin de hierro
Mtodos de cultivo no
convencionales:
Sistema Bactec
Cultivo convencional:
Agar Lnenstein-Jensen o
Agar Ogawa Kudoh o
Middlebrook 7H10 7H11
Incubar 35-37 C x 4-6 sem. en
aerobiosis
Descontaminacin *
Muestra clnica
Anexos
195
Anexos
Resultado
Morfologa y reaccin al
Cocobacilos gramvariable
Gram
Hemlisis
- hemoltico
Oxidasa
Catalasa
Glucosa
Maltosa
Sacarosa
Manitol
Inhibicin con:
Metronidazol (50ug)
Trimetroprim (5 ug)
Sensible
Sulfonamida (1ug)
Polianetol sulfonato
de sodio (SPS)
+: positivo; -: negativo
Tomado de: Koneman y col., 1999; Montiel y Lam, 2001.
196
Anexos
Bibliografa
(1) Koneman E., Allen S., Jandon W., Schreckenberger P., Winn W. Diagnstico microbiolgico. Texto y atlas a color. 5 ed. Argentina: Mdica Panamericana; 1999.
(2) Lopardo H., Hernndez C., Soloaga R. Diagnstico microbiolgico de las Infecciones
Respiratorias Bacterianas [en lnea] 1999 [fecha de acceso 18 de Abril de 2005]; URL
disponible en www.ifcc.org/ria/div/britanis/az_19.htm
(3) Montiel F, Lam M. Manual de microbiologa clnica. Chile: Publicaciones Tcnicas
Mediterrneo; 2001.
(4) Vizcaya L, Bravo L, Fonte L, Velasco J, Flores A. Diagnstico de laboratorio de la Enfermedad Diarreica Aguda (EDA). Curso terico-prctico. Sociedad Venezolana de Microbiologa, Captulo de Mrida. XXII Jornadas Venezolanas de Microbiologa Dr. Jos A.
Serrano. MridaVenezuela. 1994.
(5) Castro G, Aguilera M, Hernndez C, Arteaga R, Carmona A, Prez A, Giono S, Figueras
M, Aparicio G. La identificacin gentica de Aeromonas, una realidad y una necesidad
para la microbiologa diagnstica. Bioquimia 2003; 28(4): 11-18.
(6) Finegold S, Baron E. Diagnstico microbiolgico Bayley Scout. 7a ed. Argentina: Editorial mdica Panamericana; 1989.
197
Glosario
A/A: cido/cido, Fermentacin de lactosa y glucosa
AMK: Agar MacConkey
AMS: Agar manitol salado
AMT: Amplificacin mediada por transcriptasa
AN: Agar nutritivo
APA: Agua peptonada alcalina
AS: Agar sangre
AS-Sch: Agar sangre base Schaedler
ATM: Agar Thayer-Martin
ATP: Agar telurito de potasio
AYH: Agar yema de huevo
BHI: Infusin cerebro corazn
BE: Agar bilis-esculina
CH: Agar chocolate
CIN: Agar Cefsulodin-Irgasan-Novobiocina
CLED: Agar cistina-lactosa-electrolito-deficiente
DIU: Dispositivo intrauterino
DNA-AMP: Agar DNA-ampicilina
EIA: Enzimoinmunoanlisis
IFD: Inmunofluorescencia directa
ITRS: Infecciones del tracto respiratorio superior
K/A: Alcalino/cido, no fermenta la lactosa/fermentacin de la glucosa
MH: Mueller Hinton
MIO: Agar motilidad-indol-ornitina
ML: Medio Leffler
LCR: Lquido cefalorraqudeo
LIA: Agar Lisina hierro
PM: Agar Preston modificado
PMN: Polimorfonucleares
PYR: L-pirrodil-beta-naftilamida
RCP: Reaccin en cadena de la polimerasa
Glosario
200
Los autores
Judith Velasco................................................................ 1
Licenciada en Bioanlisis. Especialidad en Microbiologa Clnica. Profesora asociada,
adscrita a la Ctedra de Bacteriologa Dpto. de Microbiologa y Parasitologa, Escuela
de Bioanlisis, Facultad de Farmacia y Bioanlisis, Universidad de Los Andes.
Emma Araujo................................................................... 1
Licenciada en Bioanlisis. Bioanalista al Servicio adscrita al Dpto. de Microbiologa y
Parasitologa, Escuela de Bioanlisis, Facultad de Farmacia y Bioanlisis, Universidad
de Los Andes.
Beatriz Nieves................................................................. 1
Kiralba Snchez............................................................. 1
Licenciada en Bioanlisis. Especialidad y Magister Scientiae en Microbiologa Clnica.
Profesora asociada, adscrita a la Ctedra de Bacteriologa Dpto. de Microbiologa y
Parasitologa, Escuela de Bioanlisis, Facultad de Farmacia y Bioanlisis, Universidad
de los Andes.
ndice
7 Prefacio
1 prctica
2 prctica
3 prctica
4 prctica
5 prctica
6 prctica
7 prctica
8 prctica
9 prctica