INACTIVACIN FOTODINMICA DE

Candida
INMOVILIZADAS SOBRE UNA SUPERFICIE

albicans

M. Paula Cormick,a Marisa Roverab y Edgardo N. Durantinia

a

Departamento de Qumica, bDepartamento de Microbiologa e Inmunologa, Universidad Nacional de

Ro Cuarto, Agencia Postal N 3, X5804BYA Ro Cuarto, Argentina. E-mail: edurantini@exa.unrc.edu.ar

Las prcticas mdicas, que producen una profunda inmunosupresin del paciente, trajo
aparejado un incremento notable en la frecuencia y gravedad de afecciones fngicas,
causadas no slo por los agentes ya conocidos, sino tambin por patgenos emergentes.
En este sentido en los ltimos aos el grupo de pacientes de riesgo aument
dramticamente debido a la pandemia del HIV. Las infecciones fngicas sistmicas
emergieron tanto en individuos inmunocomprometidos como inmunocompetentes,
convirtindose en una causa importante de morbimortalidad. Sus agentes etiolgicos
son hongos saprfitos o comensales que se encuentran normalmente en el suelo,
animales, vegetales y no forman parte de la flora humana normal, a excepcin de
Candida albicans, Candida parapsilosis y Malassezia spp. Las especies del gnero
Candida estn emergiendo como el principal patgeno fngico nosocomial.
Actualmente, la candidiasis sistmica ocurre en 20-40% de los pacientes con
enfermedades hematolgicas malignas y en el 10-20% de los pacientes con transplante
de mdula sea. La candidiasis es una infeccin primaria o secundaria causada por
diferentes especies del gnero Candida, aunque ms frecuentemente por C. albicans,
con manifestaciones clnicas agudas, subagudas, crnicas o episdicas, en las cuales el
hongo puede producir lesiones cutneas, mucocutneas o sistmicas. Estas afecciones
causadas por hongos han conducido a la bsqueda de modalidades antifngicas
alternativas. La terapia fotodinmica (TFD) originalmente desarrollada para el
tratamiento de tumores, puede ser modificada para la erradicacin de microorganismos
patgenos. Esta metodologa, denominada inactivacin fotodinmica (IFD), se
fundamenta en la acumulacin preferencial del fotosensibilizador en las clulas
microbianas. Posteriormente, la irradiacin del cultivo con luz visible induce la
actividad fotodinmica. Estos fotoprocesos afectan a las macromolculas del sistema
celular conduciendo a un dao letal en las clulas fngicas. En este trabajo, la IFD de C.
albicans inmovilizadas sobre una superficie de agar fue investigada utilizando porfirinas
catinicas, con diferente patrones de sustitucin (Esquema).
R1

A3B3+

NH

R2

R1
N

HN

TMAP

R1:-N+(CH3)3
4+

TPPS4-

R2:-CF3

R1=R2:-N (CH3)3
R1=R2:-SO3-

R1

Esquema
En los estudios in vitro se utiliz la levadura C. albicans, recogida de material clnico
urogenital. La levadura fue aislada e identificada de acuerdo a los procedimientos

convencionales. Las clulas de C. albicans fueron crecidas aerbicamente durante toda

la noche a 37C en caldo Sabouraud. Las clulas provenientes del cultivo en fase
estacionario fueron centrifugadas a 3000 rpm durante 15 min, luego fueron lavadas con
buffer fosfato salino (PBS, pH=7.0). Una alcuotas de (~400 L) de cultivo fueron
transferidos aspticamente a 10 mL de PBS y diluida a una concentracin final de ~106
unidades formadoras de colonias (UFC)/mL, lo cual corresponder a una absorbancia de
~0,12 a 630 nm. En todos los experimentos fueron usados 2 mL de esta suspensin
celular y el sensibilizador fue agregado a la concentracin correspondiente de una
solucin stock. Los cultivos crecidos bajo las mismas condiciones sin la adicin del
fotosensibilizador y expuestos a la luz, y cultivos con el sensibilizador en condiciones
de oscuridad sirvieron como control. En un novedoso diseo experimental, una dilucin
apropiada de la suspensin de clulas C. albicans en PBS fue sembrada sobre las placas
con medio de cultivo Sabouraud para obtener aproximadamente diez colonias
separadas. Los cultivos fueron luego incubados por 18 h a 37 C para formar colonias
pequeas de 0,5 mm de dimetro. Las colonias fueron tratadas con cantidades
diferentes de las porfirinas (0, 5, 10 y 20 nmol). Los agentes sensibilizadores fueron
distribuidas homogneamente sobre la colonia desde una solucin acuosa de reserva
(1x10-3 M). Los cultivos se mantuvieron en la oscuridad por 15 min a 37 C. Durante
este periodo, tiene lugar la unin de los sensibilizadores a las clulas de C. albicans. Las
placas de cultivo fueron iluminados con luz visible (90 mW/cm2) por 3 h. Luego de
esto, las placas fueron incubadas por distintos tiempos a 37 C en la oscuridad. Los
resultados indican que la porfirina aninica TPPS4- no produce un efecto significativo
con respecto a las colonias control. Por otro lado, ambas porfirinas catinicas, TMAP4+
y A3B3+, inactivan eficientemente el crecimiento de las colonias. Cuando las colonias
fueron tratadas con 5, 10 y 20 nmol de TMAP4+ e irradiadas por 3 h, no se observ
desarrollo de la colonia an despus de 6 das posteriores al tratamiento. Estos estudios
sugieren que la presencia de cargas positivas en la estructura de la porfirina incrementa
la eficiencia en la inactivacin de las clulas impidiendo el desarrollo de las colonias.
Estos sensibilizadores presentan propiedades interesantes como agente fototeraputicos
para su aplicacin en la IFD de levaduras creciendo como colonias sobre una superficie.