Universidad Central de Venezuela

Facultad de Ciencias
Escuela de Biologa
Laboratorio Avanzado de Biologa Celular

Papel de la orina de roedores (Mus musculus) como

componente epidemiolgico en la transmisin de T. cruzi.

Tutor:

Autor:

Lcdo. Arturo Muoz Caldern

Seccin de Inmunologa
Instituto de Medicina Tropical Dr. Flix Pifano
Universidad Central de Venezuela

Caracas, julio de 2015

Ricardo Romero
C.I. 20.090.640

Introduccin

La Tripanosomiasis Americana es una infeccin parasitaria causada por

Trypanosoma cruzi, un protozoario que infecta mamferos silvestres y domsticos
transmitida por vectores reduvdeos, denominados coloquialmente chipos o pitos
en Venezuela, cuya transmisin natural hasta ahora se ha restringido al continente
americano (Noya y col, 2010). Este parsito se caracteriza por la presencia de un
solo flagelo y una sola mitocondria; su genoma se encuentra ordenado en una
compleja y compacta regin (dentro de la propia mitocondria, y cerca de la base
del flagelo), denominada kinetoplasto. El reservorio natural del parsito lo
constituyen los armadillos, marsupiales, murcilagos y primates silvestres, adems
de ciertos animales domsticos como perros, gatos e incluso ratas y cobayos. La
importancia de esta enfermedad radica en su elevada prevalencia, su baja tasa de
curacin, las grandes prdidas econmicas por incapacidad laboral, y la muerte
repentina de personas aparentemente sanas. Adems, la OMS la contempla
dentro de la lista de las principales "enfermedades desatendidas" (WHO. 2010).
Esta parasitosis se desarrolla en tres fases definidas: la aguda, que se
presenta con fiebre, dolores de cabeza, agrandamiento de ganglios, hgado y
bazo; la indeterminada, fase asintomtica, de duracin variable sin parasitemia
detectable; y la crnica, en la que se presentan alteraciones del sistema nervioso
de diversos rganos, particularmente el corazn y vsceras donde se originan los
denominados megasndromes (Diaz-Limay y col, 2004).
Para explicar el complejo ciclo de vida de este parsito empezaremos en el
momento en que ocurre la contaminacin del hospedador vertebrado. Esto se
lleva a cabo cuando un triatomino infectado defeca sobre la piel del vertebrado
luego de alimentarse de su sangre. En la heces del insecto se haya la forma
infectante del parsito, el tripamastigote metacclico. Este se caracteriza por una
gran movilidad que le permite entrar al organismo por escoriaciones, lesiones en la
piel o por las mucosas y llegar al torrente sanguneo. Una vez all pueden invadir a
la mayora de las clulas del hospedador donde se trasforman a la forma
amastigote (forma replicativa dentro del hospedero vertebrado); presenta forma
redondeada, y con un flagelo externo muy corto o inexistente. El amastigote se
convierte en tripomastigote sangucola, los cuales por procesos mecanicos son
capaces de romper las clulas que los contienen y liberarse al medio externo
donde los tripomastigote son capaces de infectar otras clulas, repitindose el
ciclo de multiplicacin. Durante la fase sangucola puede ser ingerido por el vector.
Una vez dentro del vector, estas formas se transforman en epimastigotes, forma
mvil y replicativa a nivel de intestino medio.
Otras formas alternativas de transmisin al ser humano son las siguientes:

Por transfusin: Producida por la presencia de tripomastigotes sangucolas

en el producto a transfundir, sangre o sus derivados, proveniente de
donantes con infecciones ignoradas o sin adecuado diagnstico en bancos
de sangre.
Por trasplante: Formas amastigotes tisulares de T. cruzi contenidos en
rganos trasplantados a un receptor, quien adems recibe inmunosupresin
para evitar el rechazo del rgano.
Transplacentaria: La infeccin al recin nacido puede suceder por el paso
de formas tripomastigotes, desde la madre con infeccin aguda o crnica.
Accidental: Ocurre por el contacto de la piel herida o de mucosas con
material contaminado (sangre de enfermos, animales contaminados o sus
secreciones como sangre).
Va oral: Ocurre por la ingestin de bebidas o alimentos contaminados con
heces o con todo el triatomino infectado o eventualmente por las
secreciones nebulizadas de las glndulas odorparas perianales de
marsupiales (Didelphis spp.) en los cuales se ha descrito la presencia de
tripomastigotes metaclclicos (Noya y col, 2010).

Entre los reservorios vertebrados de esta enfermedad, Didelphys

marsupialis (conocido en Venezuela como Rabipelado) es de suma importancia
epidemiolgica, por su amplia distribucin geogrfica en el neotrpico, por su
elevada frecuencia de infeccin natural con T. cruzi, y por la comunicacin que
establece entre los focos domsticos y selvticos de la enfermedad. ste es un
animal frecuente en el peridomicilio y que incluso penetra en las viviendas (Pifano,
1986), actuando tanto como reservorio o como transmisor directo de la
enfermedad.
Est bien descrito en la literatura la presencia de tripomastigotes
metaciclcos en las glndulas perianales de los rabipelados (Urdaneta-Morales,
1996; Deane y col, 1984), incluso se sabe que dada la cercana anatmica de esta
glndula con los rganos urogenitales pueden encontrase tripomastigotes
metaciclcos en la orina (Urdaneta-Morales, 1996). Sin embargo, los estudios
enfocados en determinar la presencia de tripomastigotes en la orine de roedores
son ms bien escasos. Algo curioso, dado la importancia epidemiolgica de las
ratas en la infeccin en ambientes urbanos, debido a su alta prevalencia de
T.curzi, entre 30% y 57 %, (en el gnero Rattus) y alta parasitemia (Alarcn y col,
2006).
Estos hechos motivaron la necesidad de realizar en presente estudio; que
aunque no se trabaj directamente con ratas, sirve como un trabajo preliminar, que
tiene como objetivo ms cercano, abrir el camino a prximas investigaciones en el
tema.

Objetivo general:
Determinar la existencia de Trypanosoma cruzi en la orine de ratones
infectados experimentalmente.
Objetivos especficos:

Describir la curva de
experimentalmente con T.cruzi.

parasitemia

de

los

ratones

infectados

Evaluar la presencia de Trypanosoma cruzi mediante inmunoensayos enzimticos,

pruebas de biologa molecular y cultivos in vitro a partir de muestras de sangre.

Determinar la existencia de Trypanosoma cruzi en la orine de los ratones a

travs del conteo directo de parsitos, anlisis por biologa molecular y cultivos in
vitro.

Marco terico

Mtodo de Brener
Es un mtodo basado en la tcnica de Pizzi para contar tripanosomas. El
mtodo de Brener, consiste en tomar 5 centmetros cbicos de sangre de la cola
del ratn y colocarlos entre un portaobjetos y un cubreobjetos de 22x22 mm,
tratando de formar una sola capa de clulas sanguneas. Se estima previamente el
nmero de campos del cubre objeto ajustando el microscopio a 45x en el objetivo
y 10x en el ocular. Por ltimo el nmero de tripanosomas en 5 L de sangre se
estima contando los parsitos presentes en 100 campos y luego multiplicando el
nmero de tripanosomas por un factor que depende de las caractersticas del
microscopio (Brener, 1962).
Se fundamente en la capacidad de inferir la concentracin de parsitos a
partir de una muestra pequea usando como estimador un valor ajustado a las
caractersticas del microscopio empleado. Ese valor de ajuste se halla de la
siguiente manera:

Se determina el radio del campo visual.

Hallamos el rea del campo visual a partir del radio.
Hallamos el rea del cubreobjetos.
Hallamos el rea total contada, que no es ms que el rea del campo visual
por el nmero de campos contados (100 campos).
Se divide el rea del cubreobjetos entre el rea total contada.
El resultado del paso previo se divide al volumen de sangre aadido en el
portaobjetos (5 cc).

Cultivo de parsitos en medio bifsico

Un medio de cultivo es un sustrato o una solucin de nutrientes que permite

el desarrollo de parsitos. En las condiciones de laboratorio para realizar un
cultivo, se debe sembrar sobre el medio de cultivo elegido las muestras en las que
los parsitos van a crecer y multiplicarse. Los medios bifsicos conteniendo una
fase slida de medio agar-sangre y una fase lquida constituida por medio LIT con
suero fetal bovino. Este tipo de ensayo tiene la finalidad de demostrar la presencia
de parsitos en la muestra a cultivar.

ELISA
El ELISA se basa en el uso de antgenos o anticuerpos marcados con una
enzima, de forma que los conjugados resultantes tengan actividad tanto
inmunolgica como enzimtica. Al estar uno de los componentes (antgeno o
anticuerpo) marcado con una enzima e insolubilizado sobre un soporte
(inmunoadsorbente) la reaccin antgeno-anticuerpo quedar inmovilizada y, por
tanto, ser fcilmente revelada mediante la adicin de un substrato especifico que
al actuar la enzima producir un color observable a simple vista o cuantificable
mediante el uso de un espectrofotmetro o un colormetro (Guzmn-Vzquez,
2004).
En cuanto a los pasos generales de un ELISA primero se tapizada el
antgeno o anticuerpo, luego se agrega la muestra problema con la mezcla de
antgenos o anticuerpos, se une el antgeno o anticuerpo especfico al anticuerpo
o antgeno ya tapizado, lavado para eliminar el exceso no unido. Se aade el
anticuerpo secundario marcado con la enzima, esto conlleva a la unin del
anticuerpo secundario al antgeno o anticuerpo. Lavado del pocillo para eliminar el
exceso de enzima no adherida, se adiciona del substrato, para que ocurra la unin
del substrato a la enzima, para luego obtener la coloracin (Voller y col, 1978).
Las fases slidas ms usadas son las microplacas de 96 pocillos (con un
volumen de 350L). La mayora son de poliestireno, para aumentar su capacidad
de adsorcin (en su superficie) de molculas, y con fondos de pocillo pticamente
claros que permitan realizar las medidas de densidad ptica en instrumentos
especficos, espectrofotmetros de lectura de placas que han recibido el nombre
de lectores ELISA. Estas son especialmente ventajosas para procesar un elevado
nmero de muestras y una vez tapizadas, el material inmovilizado permanece
reactivo mucho tiempo siempre que se mantenga seco y a baja temperatura.
Los anticuerpos utilizados en el mtodo ELISA son de origen monoclonal o
policlonal que se suministran como antisuero no fraccionado o fracciones de
inmunoglobulina purificada, pueden ser solubles o estar inmviles en la
microplaca, son empleados como conjugados no marcados o enzimticos y por
ultimo reaccionan con determinante antignico especfico de un antgeno o de un
anticuerpo ligando-especfico (anticuerpo primario) segn el protocolo de anlisis
(Guzmn-Vzquez, 2004).
Los antgenos se purifican o se producen con tecnologa recombinante, y
al igual que los anticuerpos se utilizan como conjugados marcados o enzimticos y

son inmviles o solubles, dependiendo del protocolo de anlisis. Como se puede

deducir los conjugados enzimticos son antgenos o anticuerpos unidos en forma
covalente a la enzima de eleccin. As pues, el reactivo que se forma de la unin
covalente entre enzima y antgeno o anticuerpo es el conjugado (GuzmnVzquez, 2004).
Las combinaciones de enzima y sustrato que se emplean incluyen:
peroxidasa de rbano y su sustrato, perxido dehidrgeno que en presencia de
cromgeno o-fenilendiamina produce un producto color amarillo-naranja medible;
galactosidasa beta y su sustrato o-nitrofenil-beta-D-galactopiransido que se
transforma en un producto nitrofenolado amarillento medible; o fosfatas alcalina y
su sustrato p-nitrofenilfosfato que tambin se transforma en nitrofenolato. Se utiliza
cido sulfrico o hidrxido de sodio para inhibir la actividad enzimtica y estabilizar
el producto final de reaccin que tiene color (Guzmn-Vzquez, 2004).
Existen diferentes tipos de pruebas ELISA, las cuales desarrollaremos a
continuacin:

ELISA directo: En este se fija el antgeno al soporte, se lava para

eliminar los no fijados, luego se adicionan los anticuerpos marcados con
la enzima para que reaccin con el antgeno y que solubilizado el
complejo, se lava para eliminar anticuerpos que no reaccionaron y se
agrega un sustrato especfico para la enzima, al final se observa la
coloracin (Voller y col, 1978). Es necesario incluir controles negativos
que sern muestras del mismo tipo que las analizadas, pero en las que
se tenga la certeza de la ausencia del antgeno buscado. Asimismo se
incluyen controles positivos (soluciones donde se encuentra el antgeno
buscado).

ELISA indirecto: En este la diferencia viene dada a nivel que el elemento

marcado por la enzima es un anti-anticuerpo (anticuerpo secundario)
que va a reaccionar con el anticuerpo, que reaccion junto al antgeno
previamente fijado (anticuerpo primario); finalmente se agrega un
sustrato especfico para la enzima, se lava y se observa la coloracin
(Voller y col, 1978). La deteccin tiene mayor sensibilidad por presentar
una amplificacin de seal debida a la unin de dos o ms anticuerpos
secundarios por cada primario. La dilucin de la solucin que contiene el
anticuerpo primario por ejemplo, suero sanguneo es un factor muy
importante a tener en cuenta para evitar la aparicin de falsos negativos,
ya que si la muestra est muy diluida, no saldr positiva si la titulacin
de anticuerpos es muy baja.

ELISA sndwich: Se fija al soporte el anticuerpo especfico del antgeno

en el suero problema, posteriormente se aade el suero problema y los
antgenos de fijan a los anticuerpo, luego se lava para eliminar
elementos no fijados, posteriormente se aaden anticuerpos conjugados
con una enzima (de diferente eptopo a los previamente fijados) estos

reaccionan con los antgenos de la muestra problema que se

encuentran fijados a los otros anticuerpos, se lava la muestra y se
aade un sustrato a la enzima marcadora y se observa el color visual o
por colorimetra. En cuanto al ELISA sndwich triple la diferencia viene
dada por que los segundos anticuerpos que se colocan no son
marcados con la enzima, si no que luego se coloca anti-anticuerpos
conjugados con la enzima que reaccionaran con los anticuerpo que se
colocaron luego, posteriormente se lava y se coloca el sustrato
especfico para la enzima (Voller y col, 1978).

PCR
La Reaccin en Cadena de la Polimerasa (por sus siglas en ingles PCR) es
un ensayo enzimtico, que permite la amplificacin de fragmentos especficos de
ADN. Kary Mullis, quien conceptualiz en ensayo de PCR la explic diciendo que
te permite partir de un poco del ADN del que estas interesando y tener tanto como
quieras (Mullis, 1990). Ya que slo pequeas cantidad de ADN son necesarias
para generar suficiente copias para ser analizadas usando mtodos
convencionales.
La tcnica de PCR se basa en el mecanismo de la replicacin in vivo del
ADN: el ADN bicatenario se desenrolla y pasa a ADN monocatenario, se duplica y
se vuelve a enrollar.
Esta tcnica consiste en ciclos repetitivos de: Desnaturalizacin del ADN
por fusin a temperatura elevada, a fin de convertir el ADN bicatenario en ADN
monocatenario; hibridacin de dos oligonucletidos, utilizados como cebadores,
al ADN diana; extensin de la cadena de ADN por adicin de nucletidos a partir
de los cebadores utilizando ADN polimerasa como catalizador, en presencia de
iones Mg+2. (Soma y Querci, 2000).
Tras cada ciclo, las hebras de ADN recin sintetizadas pueden servir de
ADN molde para el ciclo siguiente. El producto principal de esta reaccin
exponencial, es un segmento de ADN bicatenario cuyos extremos vienen definidos
por los extremos 5 de los oligonucletidos cebadores y cuya longitud viene dada
por la distancia entre los cebadores. Los productos de una primera ronda de
amplificacin efectiva son molculas de ADN de diferentes tamaos, cuyas
longitudes pueden superar la distancia entre los sitios de unin de los dos
cebadores. En la segunda ronda, estas molculas generan hebras de ADN de
longitud definida que se acumulan de forma exponencial en rondas posteriores de
amplificacin y constituyen los productos dominantes de la reaccin (Soma y
Querci, 2000).
Para llevarla a cabo se necesitan los siguientes reactivos:

Los cuatro dNTPs, en exceso, como sustrato para la sntesis de

innumerables copias de DNA. Estos deben utilizarse a concentraciones
equivalentes para minimizar los errores de incorporacin (Innis y col.,

1988). Para ser reconocidos por la polimerasa, los dNTPs deben estar
acompaados por iones divalentes (comnmente Mg+2), que permiten la
formacin de un complejo soluble.

Dos oligonucletidos (tambin llamados cebadores, iniciadores, primers u

oligos) de cadena sencilla. Sus secuencias han de ser complementarias,
respectivamente, a los dos extremos 3 de la regin diana; uno a cada
hebra. Por esta razn no se puede amplificar una regin de ADN si no se
conoce la secuencia de sus extremos (Luke y Herrez, 2006). Se debe
procurar que los cebadores no tengas tramos secuenciales con poli-bases
ni motivos repetidos, ya que podran hibridarse de forma inadecuada con el
ADN (Soma y Querci, 2000).

Una ADN polimerasa termoestable, es decir, enzimticamente activa a

temperaturas relativamente altas. Esta caracterstica permite su actuacin
en sucesivos ciclos sin inactivarse; adems, la replicacin a temperaturas
elevadas impide la formacin de hbridos parcialmente desapareados y
contribuye a la especificidad y rendimiento del proceso (Luke y Herrez,
2006). La primera ADN polimerasa termoestable utilizada fue la ADN
polimerasa Taq, aislada de la bacteria Thermus aquaticus (Saiki y col,
1988). Aunque esta enzima es probablemente la ms utilizada a efectos de
la PCR, en el comercio pueden encontrarse algunas otras ADN
polimerasas. Con una frecuencia de errores inferior (Soma y Querci, 2000).

Una solucin tampn que mantiene el pH adecuado para el funcionamiento

de la ADN polimerasa. El tampn de reaccin ms comn utilizado con la
ADN polimerasa contiene: Tris 10 mM, pH 8,3; KCl 50 mM.

Etapas del proceso

Cada ciclo de una PCR consta de 3 etapas:

Desnaturalizacin: Calentamiento para la separacin de las dos hebras del

AND, mediante una incubacin breve (30-120s) a una temperatura de entre
68 C y 97 C, que debe ser superior a la temperatura de fusin de la regin
que se quiere amplificar. Llamamos temperatura de fusin a la temperatura
en la cual la mitad del ADN bicatenario ha pasado a monocatenario. El
proceso de desnaturalizacin depende del tipo de disolvente, de la
concentracin salina y del pH utilizado; por ejemplo, la temperatura de
fusin desciende al bajar la concentracin salina, al subir el pH y en
presencia de disolventes orgnicos como el formaldehdo. El valor de la
temperatura de fusin tambin se puede ver afectado por la concentracin
de G/C y T/A. La temperatura de fusin de una estructura de ADN que

contiene una elevada proporcin de G/C es ms alta que la de un ADN ms

rico en T/A. (Carson y col, 2012).

Templado o hibridacin: Enfriamiento rpido por debajo de la temperatura

de Melting, de forma que se permite la hibidacin de las hebras sencillas
del ADN de inters con los oligos cebadores. Definimos la temperatura de
Melting de un primer unido a su cido nucleico diana como la temperatura a
la cual el 50% de los primers estn unidos y el 50% estn en solucin
(McPherson y Moller, 2006).

Elongacin o replicacin: Es la etapa de amplificacin propiamente dicha

(73-75 C, 1-9 min), en la que la DNA polimerasa termoestable elonga los
cebadores, empleando como moldes ambas hebras originales. La
replicacin transcurre en direccin 5->3 a partir del extremo 3-OH, hasta
terminar la lectura del molde o hasta que se comience una nueva etapa de
desnaturalizacin (Luke y Herrez, 2006).

Comnmente se aaden a estas 3 faces del ciclo una etapa previa, a

elevada temperatura que sirve para inactivar proteasas o activar determinadas
Taqs (hotstars); una etapa de elongacin final, para asegurar que cualquier ADN
de cadena simple restante sea totalmente ampliado; y una etapa de conservacin
que se lleva a cabo a 4-15 C durante un tiempo indefinido para preservar la
reaccin a corto plazo.

Electroforesis en geles de agarosa

La electroforesis en gel es una tcnica muy utilizada para separar
molculas o fragmentos de molculas de cidos nucleicos. Los materiales ms
comunes para separar molculas de cidos nucleicos son polmeros como la
poliacrilamida o la agarosa (Pea y col, 2009). La agarosa es un polisacrido
lineal (con un peso molecular medio de ~12 000 Da) formado por la repeticin de
la unidad bsica, la agarobiosa, que comprende unidades alternadas de galactosa
y 3,6-anhidrogalactosa. Los geles de agarosa poseen grandes poros y se
emplean fundamentalmente para separar las molculas grandes con un peso
molecular de ms de 200 kDa (Soma y Querci, 200).
Los geles de agarosa se obtienen por suspensin de agarosa seca en polvo
en un tampn acuoso, tras lo cual se hace hervir la mezcla hasta que la agarosa
se funde y se convierte en una solucin transparente. A continuacin, se vierte
esta solucin en un molde para gel y se deja enfriar a temperatura ambiente hasta
que se forma un gel rgido. Al endurecerse, la agarosa forma una matriz cuya
densidad viene determinada por su concentracin (Soma y Querci, 200).
Estos geles se colocan en la cubeta de electroforesis, sumergidos en un
tampn de pH alrededor de 8. Se dispone de varios tipos de tampones para la
electroforesis de ADN nativo bicatenario. Contienen EDTA (pH 8,0) y tris-acetato
(TAE), tris-borato (TBE) o trisfosfato (TPE) a una concentracin de

aproximadamente 50 mM. De esta forma, las molculas de DNA o RNA sometidas

a electroforesis se desplazarn al polo positivo ya que a pH superiores a 5 poseen
carga negativa. Los geles se comportan como un tamiz molecular y permiten
separar molculas cargadas en funcin de su tamao y forma. As, molculas de
DNA de diferente tamao, van a emigrar de forma distinta en un gel de
electroforesis. La distancia recorrida por cada fragmento de DNA va a ser
inversamente proporcional al logaritmo de su peso molecular. Es importante la
utilizacin de marcadores de tamao conocido porque nos permitirn calcular los
pesos moleculares de las muestras de DNA problema (Pea y col, 2009).
En el caso de los geles de agarosa, se le aade bromuro de etidio,
sustancia que se intercala entre las bases del DNA y es fluorescente cuando se
ilumina con luz ultravioleta. Tras la electroforesis, se visualiza el gel con una
lmpara de luz UV, y se vern las bandas correspondientes a las muestras de
DNA aplicado y los marcadores de peso molecular (Pea y col, 2009).
Las muestras de ADN que deben cargarse en el gel de agarosa se mezclan
en primer lugar con un tampn de carga que por lo general contiene agua,
sacarosa y un colorante (por ejemplo, cianol de xileno, azul de bromofenol, verde
de bromocresol, etc.). El tampn de carga se emplea con tres fines: aumentar la
densidad de las muestras para que las gotas de ADN caigan uniformemente en el
pocillo; aadir color a la muestra, simplificando de este modo el proceso de carga;
incorporar un colorante a la muestra que, en un campo elctrico, se desplace
hacia el nodo a una velocidad previsible (Soma y Querci, 200).

Extraccin de ADN por solubilidades de fases inmiscibles

Es el protocolo bsico para la extraccin de ADN y consiste en el
tratamiento de la muestra con solventes orgnicos. Se fundamenta en las
diferencias entre las propiedades fsico-qumicas del ADN y las del resto de los
componentes de la clula (Luke y Herrez, 2006).
Los cidos nucleicos son muy solubles en agua debido al fuerte carcter
hidroflico de sus grupos fosfato. Dentro de una mezcla de solventes no miscibles,
uno acuoso y otro orgnico no polar, los cidos nucleicos tendern a permanecer
en la fase acuosa, en tanto que los lpidos y gran parte de las protenas
desnaturalizadas se encontrarn en la fase orgnica. En la preparacin de cidos
nucleicos, los solventes que se usan ms frecuentemente para la extraccin de
protenas y lpidos son el fenol y el cloroformo (Zarate y col, 2009).
Despus de que es eliminada la fase orgnica (que contiene lpidos y
protenas) se procede a recuperar el DNA, para ello, se adiciona etanol al 100 %
que permite que el ADN se pliegue sobre s mismo hacindolo insoluble. Un paso
de centrifugacin permite que el ADN permanezca en el fondo del tubo mientras
que el etanol es desechado. Los restos de etanol se eliminan con un lavado con
etanol al 70 % y el remanente se elimina por evaporacin (Alejos y col, 2010).

Materiales y mtodos

Los ratones (Mus musculus) cepa IMT utilizados fueron suministrados por el
bioterio del Instituto de Medicina Tropical (IMT-UCV). Se inocularon con 4000
trypomastigotes cada uno.
La cepa de T. cruzi usada fue una extrada de un chipo llevado
voluntariamente por un paciente al IMT procedente del estado Miranda.
Se hizo seguimiento de la parasitemia de los ratones extrayendo sangre de
la cola y contabilizando el nmero de parsitos por el mtodo de Brener (1962)
diariamente a partir del sptimo da de haberse inoculado. As se pudo determinar
el perodo prepatente, los niveles de parasitemia y la mortalidad.
Fue sacrificado un ratn sin inocular y este lo usamos como control
negativo. En lo concerniente al resto, un ratn fue procesado el da que se
hallaron parsitos en sangre (final del periodo prepatente), y luego se proces uno
cada 5 das (n=4).

Recoleccin de la orina
Para la recoleccin de la orina se diseo una trampa de orina, la cual
consisti en un envase de plstico de 23 onzas con la base reemplazada por una
rendija de metal ms una malla de plstico. La luz de la malla no permita el paso
de las heces pero s el de la orine del ratn, que era colocado dentro del envase.
La orine era recolectado por un segundo envase de 16 onzas puesto en la parte
inferior del primero.
Para aumentar el volumen de orine recolectado se inyect
intraperitonealmente 5 veces la dosis recomendada de diurtico (Furosemida)
para un ratn de 20 g, usando las proporciones para humano. Dosis humana: 1
mL (20 mg/mL) para 80 Kg.
Luego se meda el volumen de orine obtenida. De esta se dedican 5 L a la
aplicacin del mtodo de Brener; 200 L se preservacin en un volumen igual
buffer de preservacin Guanidina-EDTA 6M; 100 L a la extraccin inmediata del
ADN; y el resto a cultivo en medio bifsico. La cantidad de orine dedicado al
cultivo variaba dependiendo de la cantidad de orine extrado en cada ratn.
Luego de la recoleccin se conceda al ratn un plazo de recuperacin de
24 horas. Terminado el plazo se proceda a la recoleccin de sangre.

Recoleccin de sangre
Las muestras de sangre de los ratones se obtuvieron por pulsin cardaca
con una aguja de insulina (8 mm) heparinizada procurando obtener la mayor
cantidad de sangre.
Luego se medi el volumen de sangre obtenida. Se dedicaban 5 L de
sangre para el mtodo de Brener. Luego lo restante se centrifug durante 15 min
a 1500 xg, se recolecto el suero obtenido y respecto al paquete globular 200 L
preservaron en guanidia; 100 L se usaron para la extraccin directa e inmediata
de ADN y el resto a cultivo. La cantidad de sangre dedicada al cultivo variaba
dependiendo de la cantidad de sangre extrada en cada ratn.

Mtodo de Brener
Se colocaron 5 L de sangre u orine del animal entre un portaobjetos y un
cubre objetos de 22 mm x 22 mm. Se visualiz mediante un microscopio marca
Carl Zeiss 4857670 en donde se contaron 100 campos visuales. Luego para
determinar la concentracin de parsitos se multiplic el nmero de parsitos
observados en esos 100 campos por 8,134 (valor de ajusto de acuerdo con las
caractersticas del microscopio).

Extraccin de ADN
Para cada muestra se agreg en un eppendorf de 600 L, 100 L de FenolCloroformo-Alcohol Isoamilico (24:23:1), 150 L de agua destilada y 100 L de
muestra. Se centrifug por 3 min a 9000xg. Luego se colect la mayor cantidad de
sobrenadante posible y se agreg a este el mismo volumen de cloroformo. Se
centrifug esta mezcla por 3 min a 9000 xg. se colectaba la mayor cantidad de
sobrenadante posible y se le aadi 300 L de Etanol al 100%, esto se centrifug
a 9000 xg durante 15 min. Despus, se descart el lquido, y se resuspendi el
precipitado en 500 L de Etanol al 70 % y se centrifug a 9000 xg durante 15 min.
Por ltimo se descart el lqudo y se conservo el ADN obtenido a 4C.

Ensayos de PCR
En este ensayo se usaron cebadores especficos al ADN de kinetoplasto de
T.cruzi (ADNk), ellos son 121 (5-AAATAATGTACGGGGGAGATGCATGA-3) y 122
(5-GGTTCGATTGGGGTTGGTGTAATATA-3). A cada muestra se agregaron los
siguientes componentes en concentraciones finales: 3 L de buffer Tris (1X); 3,6

L de MgCl (3 mM), 0,75 L de dNTPs (0,25 mM); 1,5 L de primer 121 (2,25 M);
1,5 L de primer 122 (2,25 M); 14,53 L de agua destilada; 0,12 L de taq
Hotstar (6 unidades/mL) y 5 L de ADN de la muestra.
El ciclo programado en el termociclador fue el siguiente: 95 C por 5 min; 94
C por 3 min; [97,5 C por 1 min; 64 C por 2 min] X 2; [94 C por 1 min; 62 C por
1 min] X 33; 72 C por 10 min.
El resultado de la amplificacin se visualiz con la ayuda de un gel de
agarosa al 1,2 % teido con bromuro de etidio.

Prueba ELISA
Se sensibilizaron las placas con antgeno total de T.cruzi, 1g de antgeno
por pozo. Se incub la placa a 4 C durante toda la noche. Se lavaron las placas 3
veces con PBS-tween 20 (0,05%) en el lavador automtico. Se secaron las placas
y se cubrieron con papel transparente. Luego se hizo una dilucin 1/50 de los
sueros obtenidos en solucin PBS pH: 7,2, Tween-20 0,05% y leche descremada
al 5%. Despus incubamos esas placas con 50 L de cada suero en su pozo
correspondiente durante 30 min a 37 C. Se lav la placa. Luego se incub 50 L
de conjugado anti-IgG de ratn unido a fosfatasa alcalina diluido 1/500 durante 30
min a 37 C. Terminado estos se lav bien la placa. Se agreg 50 L de para-nitrofenil-fosfato 1 mg/mL en buffer DEA pH 9, 5, y se incub durante 15 min a oscuras
en temperatura ambiente. Luego se detuvo la reaccin con 50 L NaOH 1 M. Por
ltimo se ley la reaccin a 405 nm.
Se consideraron positivas aquellas muestran cuya valor de DO fue mayor al
punto de corte establecido a priori en la Seccion de Inmunologia IMT-UCV, que fue
de 0,200.

Cultivo in vitro
Las muestras fueron cultivadas en medio LIT constituido por extracto de
hgado al 5 %; suero fetal bovino al 5 % PGAB (penicilina, glutamina y piruvato de
sodio) al 1 %; Hemina y glucosa al 2 % y agua destilada. El medio slido Agar
sangre, constituido por Bacto agar al 3 %; infusin cerebro-corazn al 3,7 %;
sangre al 3 % y agua destilada.

Resultados

A travs del mtodo de Brener determinamos el perodo prepatente, el cual

dur 18 das. Tambin se pudo determinar la parasitemia de los das siguientes, tal
como se ve en la figura 1. Ningn ratn muri como consecuencia de la
enfermedad antes de completarse el estudio.

32536

24402

Tripomastigotes/ml de sangre 16268

8134

0
0

10

15

20

25

30

35

Das desde inoculacin

Figura 1-. Curva de parasitemia. Las muestras proceden de la sangre de ratn

extrada del corazn. Cada punto corresponde a un ratn sacrificado el da
sealado. A los 18 das concluy el perodo prepatente.

Se evaluaron los sueros obtenidos de los ratones, contra antgenos de T.

cruzi y se us un conjugado anti-IgG de ratn. Tal como se espera dada la
ontegenia de este tipo de anticuerpos, los valores positivos se obtuvieron varias
semanas despus de la infeccin, para nuestro caso, los ratones positivos a la IgG
anti-T. cruzi se obtuvieron a partir de la tercera semana post-inoculacion (Figura
2).

Figura 2. Resultados de la prueba ELISA. RC = Ratn control, sacrificado sin

inocular T.cruzi; R1 = Ratn 1, sacrificado al final del perodo prepatente; R2 =
Ratn 2, sacrificado 7 das despus; R3= Ratn 3, sacrificado 3 das despus de
R2; R4 = sacrificado 7 das despus de R3. La lnea roja corresponde al punto de
corte de la prueba, muestras con valores de D.O por encima de ella son tomado
como positivos.

Para determinar la presencia de tripanosomas en la orina de estos

roedores, se utilizaron las pruebas de Brener, PCR y el cultivos in vitro. Los
resultados obtenidos mostraron que mediante la tcnica de Brener como por la
tcnica de cultivos in vitro, no se observ presencia de formas tripomastigotes.
Adicionalmente, es importante sealar que los cultivos in vitro de las muestras de
orina fueron poco tiles, debido a que el 75% de las muestras presentaron
contaminaron por hongos; el mismo hongo en todo los casos (Tabla 1 y Tabla 2).
Este hecho pone en tela de juicio a nuestra trampa de orina. As que slo
contbamos con la prueba de PCR para extraer algn tipo de informacin extra
respecto a nuestro objetivo general.
En la figura 3 vemos el resultado de la PCR.

Figura 3. Resultado de la PCR. Gel de agarosa al 1.2 %. En la parte superior est

sealizado en contenido de cada bolsillo. CO corresponde la muestra de orine del
ratn control; R1O muestra de orina ratn 1; R2O muestra de orina del ratn 1;
R3O muestra de orina del ratn 3; R4O muestra de orina del ratn 4; CS muestra
de sangre del ratn control; R1S muestra de sangre del ratn 1; R2S muestra de
sangre del ratn 2; R3S muestra de sangre del ratn 3; R4S muestra de sangre
del ratn 4. La diferencia entre las muestra con apostrofe y las sin apostrofe reside
en que las muestra sin apostrofe fueron preservadas en guanidina y extradas el 16-2015. Las muestras con apostrofe fueron extradas el mismo da que se sacrific
el animal. M corresponde al marcador de peso molecular (para visualizarlo mejor
se incluy la figura 4). Las flechas indican la banda que corresponde al amplificado
de 330pb. Es muy importante notar que R1O y R3O son positivas para la
prueba.

Figura 4. Resultado de la PCR. Mismo que presentado en la figura 3, con la

salvedad de que en esta figura es ms fcil visualizar el marcador de peso
molecular.

Tabla 1.- Cultivos de muestras de orina.

nombre del cultivo

Fecha de cultivo

Das de cultivo

Ratn control

25-05-2015

50

Ratn 1

08-06-2015

36

Ratn 2

12-06-2015

32

Ratn 3

17-06-2015

28

Ratn 4

25-06-2015

19

Estado del cultivo

contaminado con
hongo
negativo
contaminado con
hongo
contaminado con
hongo
contaminado con
hongo

Tabla 2.- Cultivos de muestras de sangre.

Nombre del cultivo

Fecha de cultivo

Das de cultivo

Estado del cultivo

Ratn control

26-05-2015

49

negativo

Ratn 1

09-06-2015

35

contaminado

Ratn 2

15-06-2015

29

Seco

Ratn 3

18-06-2015

26

Positivo

Ratn 4

24-06-2015

18

Positivo

Conclusiones

Si se desea cultivar el orine de ratn es necesario utilizar un mtodo de

recoleccin distinto al usado en este trabajo.

El ensayo ELISA es efectivo para determinar presencia de anticuerpos anti

antgenos de T.cruzi; y esto es relacionable con la presencia del parsito.

Para cultivar parsitos es necesario trabajar con la mayor esterilidad posible

para evitar la contaminacin de los cultivos.

El uso de furosamida (a tal 0,04 mg/mL) es til para la obtencin de orina

de ratn, ya que se pudo obtener hasta 800 L de orina.

Aplicar el mtodo de Brener en orina es poco recomendable, dada la

dificultad de enfocar la orina en el microscopio.

Es preferible extraer el ADN de las muestras en el momento de su

recoleccin y guardar el ADN obtenido a 4C que preservarlas con
guanidina.

Es recomendable usar un ttulo de parsitos mayor a 400 parsitos/mL para

tener un perodo prepatente menor y probablemente una mayor parasitemia
en sangre.

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