TEMA 5: RESCATE DE EMBRIONES, OBTENCIN DE PLANTAS LIBRES DE

PATGENOS Y AISLAMIENTO DE PROTOPLASTOS

1. CULTIVO DE EMBRIONES. APLICACIONES PRCTICAS

El cultivo de embriones consiste en el aislamiento y crecimiento, in vitro, de un embrin,
con el fin de obtener una planta viable.
En este proceso, todos los nutrientes que forman parte del medio de cultivo son los
sustitutos del endospermo.
Tiene un doble inters cientfico:
-

De tipo bsico. Permite un estudio muy detallado de las diferentes etapas del
desarrollo y de los factores que en l estn implicados.

De tipo aplicado.
o

Permite el desarrollo de embriones hbridos (interespecficos e incluso

intergnicos) que de otro modo seran inviables y la germinacin precoz, que
acorta la duracin del ciclo vital de las plantas.

y con ello la posibilidad de aumentar el nmero de generaciones en un

determinado tiempo, algo muy importante en los programas de mejora
vegetal.

Existen dos tipos de cultivo de embriones:

-

Embriones maduros que se encuentran en semillas maduras. La finalidad de este

cultivo es:
1.

Romper procesos de dormicin que en muchos casos se deben a la accin de

las cubiertas.

2. Formar plantas completas directamente, sin recurrir a procesos de

enraizamiento.
3. Ser punto de partida de plantas que sean difciles de enraizar.
Microinjertos.
4. Servir como patrn para el cultivo de meristemos, de cara a la obtencin
de plantas libres de patgenos
Es un tipo de cultivo que presenta muy pocas dificultades.
Si acaso, existe la dificultad fsica de separarlos del resto de las estructuras de la
semilla.

Embriones inmaduros. Se utiliza para impedir la muerte temprana del embrin

(aborto embrionario) que ocurre frecuentemente cuando se han llevado a cabo
procesos de hibridacin interespecfica.
Tambin para obtener semillas artificiales de hbridos que no producen semillas
viables.
Es un proceso muy difcil tanto desde el punto de vista de la manipulacin (partimos
de estructuras mucho ms pequeas que el embrin maduro) como del cultivo.
Dentro de ellos podemos cultivar embriones, vulos u ovarios.

Ilustracin 1.Desarrollo del embrin desde las etapas ms tempranas: preglobular y globular donde se
considera que el embrin es inmaduro. A partir del estado de corazn (que es la etapa ms tarda) y ya
a partir de aqu se considera que el embrin se encuentra en la etapa embrionaria.

2. APLICACIONES DEL CULTIVO DE EMBRIONES

Obtencin de hbridos a travs de cruces interespecficos (Es la ms importante)
-

En ocasiones puede ocurrir fertilizacin cruzada entre diferentes especies y se

forman embriones.

Sin embargo, estos embriones a menudo presentan anormalidades durante el

proceso de desarrollo que conducen al aborto temprano.

Cuando el embrin aborta en un estadio muy temprano es mejor cultivar el vulo

completo en un medio base hasta que se desarrolle y de lugar a un fruto con
semillas hbridas.

A veces es necesario formar callo a partir de embriones muy poco desarrollados y

luego regenerar planta a partir de estos callos, porque las clulas de estos callos ya
tienen la informacin gentica que a nosotros nos interesa.

Produccin de plantas haploides

-

En algunos cruzamientos interespecficos, en las primeras divisiones celulares que

se producen para formar el embrin, uno de los dos juegos de cromosomas se
pierde, y, como consecuencia, se forma un embrin haploide que slo es viable si se
cultiva in vitro.

Naturalmente, a partir de un embrin de este tipo lo que se regeneran son plantas

haploides.

Un ejemplo es el del cruce entre dos especies del gnero Hordeum, al que
pertenece la cebada (vulgare). Hordeum vulgare X Hordeum bulbosum. En este caso,
los cromosomas que se pierden son los de H. bulbosum y de aqu su inters (le da
ms inters a Hordeum vulgare).

Acortamiento de los ciclos de mejora debido a la germinacin precoz

-

Si los embriones inmaduros se extraen tempranamente, antes de que se hayan

puesto en marcha los mecanismos de dormicin y se cultivan in vitro, se puede
conseguir que germinen

Con ello se consigue que el ciclo vital se acorte de modo muy llamativo.
o

Ej en el girasol se ha conseguido reducir justo a la mitad (de 120-150 das a

60-75). Si cada 60 das se completa una generacin, al cabo de un ao se
pueden haber obtenido 6 generaciones. En este caso debemos coger los
embriones maduros despus de 8-10 de haber sido polinizados.

Ensayos tempranos de viabilidad de semillas (No lo ha explicado)

Germinacin de semillas de parsitos obligados y de orqudeas (No lo ha explicado)

Ilustracin 2. Semillas de orqudea antes de germinar (el grupo de la izquierda) y en varios estadios de
germinacin (a la derecha). La semilla est formada por un embrin no diferenciado en eje embrionario y
cotiledones y una cubierta que en un 96% es aire.

Las semillas maduras de las orqudeas carecen de un embrin diferenciado. En su

lugar tienen una masa globosa y desorganizada de clulas. En estos casos, en lugar
de hablar de radcula, se usa el trmino de polo radicular y en lugar de hablar de
plmula, se utiliza el trmino de polo plumular.

Para que las semillas de las orqudeas germinen es necesaria la presencia en el

suelo de micorrizas (Hifas de determinados tipos de hongos que crecen en el suelo).
No se sabe con claridad qu compuestos son los que la orqudea recibe del hongo.
Lo que si se ha conseguido es cultivar in vitro muchas de estas semillas.

Se ha conseguido es cultivar in vitro muchas de estas semillas. Con ello se ha

conseguido:
o

Mejorar el ndice de germinacin. Como son muy pequeas, y tienen muy

poca o ninguna reserva alimenticia
-

Slo una proporcin muy baja logra germinar y desarrollar una

planta.

La germinacin y el desarrollo ocurren mucho ms rpidamente y se acorta

la duracin de los ciclos de mejora.

Ilustracin 3. Embrin de orqudea.

Las semillas de plantas que son parsitos obligados, como es el caso del jopo u
orobanque, carecen tambin de un embrin claramente formado.

La germinacin de estas semillas, exige la presencia de la planta parasitada.

o

Sin embargo, mediante tcnicas de cultivo in vitro se puede conseguir

que germinen en ausencia del hospedador.

Para ello, se adiciona al medio un extracto procedente de la

planta hospedadora.

Los compuestos que ms comnmente debe tomar el parsito de

la

planta

parasitada

son

hormonas

como citoquininas

giberelinas, compuestos fenlicos tales como escopoletina y

estrigol.
Servir de punto de partida para la obtencin de callo
Los callos obtenidos a partir de embriones cigticos tanto maduros como inmaduros
tienen un elevado potencial morfogentico, es decir, a partir de ese callo vamos a poder
producir cualquier tipo de rgano, cualquier tipo de planta de una forma bastante fcil.

3. FACTORES QUE INFLUYEN SOBRE EL CULTIVO DE EMBRIONES

Medio de cultivo
o

Los embriones maduros pueden crecer en medios bastante simples.

Por ejemplo, los de olivo crecen bien en un medio semejante al de

crecimiento pero sin hormonas (ni citoquininas ni auxinas) y con slo 10 g de
sacarosa por litro.

Los embriones inmaduros tienen, sin embargo, requerimientos ms complejos y

adems varan con el grado de inmadurez. Los medios MS y Gamborg B5 son los ms
usados para el rescate de embriones. Los suplementos requeridos aparte, dependen
del estado de desarrollo del embrin.

En unos casos es ms favorable la presencia de NH4+ y en otros la de NO3-.

En la germinacin de las semillas de orqudea es muy importante la presencia de Fe.

Ilustracin 4. Imagen que muestra la importancia de la presencia de Fe en el medio de germinacin y crecimiento

de las semillas de orqudea. A la izquierda sin Fe y a la derecha con 25 mg/l de EDTAFeNa.

Raghavan identific 2 fases en el estado del embrin:

o

En la fase heterotrpica el embrin joven o proembrin depende del endospero para su

crecimiento y requiere medios complejos:

Aminocidos, particularmente asparragina y glutamina como mnimo.

Varias vitaminas y extractos naturales como leche de coco o hidrolizado de

casena.

La sacarosa no slo se adiciona como fuente de carbono, sino tambin para

mantener un potencial de solutos ptimo. Se usan concentraciones de entre 8
12%. Pueden adicionarse o no otros azcares junto a la sacarosa ya que ste es
el azcar de eleccin en el rescate de embriones.

Con respecto a los reguladores del crecimiento, en estados muy jvenes del
embrin se necesitan niveles moderados de auxinas y bajos de citoquininas y
elevada concentracin de sacarosa. Tras dos semanas hay que cambiar el medio
porque los embriones dejan de crecer. La composicin de este segundo medio
sera niveles bajos de sacarosa, moderados de citoquinina y bajos de auxina, es
decir, justo lo contrario.

El segundo estado de desarrollo del embrin es la fase autotrfica, que usualmente

comienza en el estado de corazn tardo del embrin.

El embrin ya es capaz de sintetizar por s mismo las sustancias que necesita

para su crecimiento tomando los nutrientes del medio que necesita para ello.

A partir de este estado, se utilizar un medio de cultivo simple con un

porcentaje de sacarosa de un 2 3%.

Fuente de carbono y potencial de solutos del medio de cultivo (No lo ha explicado)

Extractos procedentes de plantas (No lo ha explicado)

Ilustracin 5. Imagen que muestra la importancia de la presencia de peptona en el medio de germinacin y

crecimiento de las semillas de orqudea. A la izquierda sin peptona y a la derecha con 2 g/l de esta sustancia

Temperatura y luz
o

Los requerimientos de temperatura y luz varan segn las especies en funcin de

los requerimientos de sus parentales. En general, los cultivos se inician a una
temperatura elevada, de entre 25 30C pero en especies que exhiben dormancia
es necesario un tratamiento previo con fro (vernalizacin).

La oscuridad es necesaria en etapas iniciales para facilitar la germinacin durante 1

o 2 semanas, despus se pasa a la luz.

4. OBTENCIN DE PLANTAS LIBRES DE PATGENOS

o

La mayora de las plantas cultivadas, sobre todo las que se han reproducido
vegetativamente, estn infectadas de modo sistmico por uno o ms patgenos
(hongos, virus, bacterias, etc).

Es muy difcil, y a veces imposible, eliminar bacterias, hongos o virus internos

de las plantas. Se pueden controlar con antibiticos y fungicidas pero suelen
resultar txicos para las plantas.

Por lo que respecta a los virus, existen productos que limitan su multiplicacin
(antivirales), pero resultan excesivamente caros para su utilizacin comercial.

El ms eficaz hasta la fecha es la ribavirina (1- -D-ribofuranosil-1,2,4-triazol3-carboxamida) que se comercializa con el nombre de virazol.

A pesar de la dificultad, si se eliminan los patgenos los resultados pueden ser

muy llamativos:
se han descrito incrementos de cosecha de hasta un 300% al sustituir

plantas infectadas por otras libres de patgenos.

o

Otro gran inters de producir estas plantas libres de patgenos es el hecho de

que pueden exportarse de un pas a otro (plantas certificadas).

5. PROCEDIMIENTOS DE CULTIVO
a) Termoterapia
o

Consiste en aplicar altas temperaturas a los explantos contaminados. As se

puede impedir o ralentizar la replicacin de determinados virus, bacterias,
hongos pero debe utilizarse una temperatura que permita la supervivencia
del explanto.

Se debe seleccionar una temperatura y un tiempo de tratamiento

Se suelen utilizar ts entre 35-40C durante intervalos de unos minutos a

varias semanas.
i. Un extremo es el caso del virus de la patata X que necesita 2-3 meses
continuados de tratamientos a 35C.

En ocasiones, cuando el tratamiento resulta muy agresivo para la planta es

conveniente alternar das de elevada temperatura con temperaturas normales.

Se obtienen mejores resultados si a la vez se mantienen humedad e iluminacin

elevadas en la cmara de cultivo.

A qu tipo de material se le aplica el tratamiento?

o

Lo que se suele hacer es tomar un vstago o explanto de la planta infectada,

introducirlo in vitro.

Este explanto lo llevamos a la cmara de cultivo y lo sometemos a termoterapia y

posteriormente se aslan las yemas que hayan podido crecer y se cultivan en un
nuevo medio de cultivo.

o La desventaja que tiene esta tcnica es que una pequea proporcin de plntulas no
sobreviven.
o

La termoterapia se combina normalmente con otros tratamientos tales como cultivo

de meristemos y microinjerto.

b) Cultivo de meristemos
o

En los meristemos o no hay virus o stos estn en muy bajas concentraciones. Cul
es la razn?
o

Los virus se suelen mover en la planta a travs del sistema vascular, y este
no est desarrollado en los meristemos.

El movimiento del virus clula-clula, a travs de plasmodesmos, es muy

lento. Por tanto, las nuevas clulas que se estn originando por mitosis se
infectarn con dificultad. En algunos casos se duda incluso de que existan
estas conexiones a travs de plasmodesmos en meristemos.

Ej.: En el caso del virus del mosaico del tabaco y del virus X de la
patata, se ha visto que estos virus avanzan 1-2 cm/hora a travs del
tejido vascular y sin embargo, de 5-15 micras/hora a travs de
plasmodesmos.

La divisin celular es muy elevada en meristemos y por tanto la capacidad

de replicacin del ADN se est utilizando en la divisin de clulas de la
planta en detrimento de la multiplicacin de los virus.

Los sistemas de inactivacin vrica que existen en la planta estn ms

concentrados en las clulas meristemticas.

En este sentido, se ha sugerido que las altas concentraciones de

citoquininas y auxinas desempearan este papel.

Tambin de que los virus necesitan de algunos enzimas que no se

expresan en las clulas meristemticas.

Ninguna de estas dos teoras se ha podido demostrar.

A qu nos referimos cuando hablamos de meristemos?

o

Como lo normal es que se utilicen meristemos apicales de tallo, nos referiremos a

ellos. Hay que distinguir entre.
o

Meristemo. El meristemo apical del tallo es la porcin ms distal del pice

del tallo. Suelen medir aproximadamente 0.1 mm de dimetro y entre 0.25 y
0.30 mm de altura.

pice meristemtico. Si adems del meristemo se toman entre 1 y 3

primordios foliares, tendremos un pice meristemtico. Este pice mide
hasta 0.5 mm de altura.

pice caulinar. Es la porcin ms distal del tallo y puede tener hasta 1 mm

de altura. Incluye el meristemo pero tambin muchos primordios foliares.

Desde el punto de vista de la obtencin de plantas libres de virus, lo mejor es

utilizar meristemos
o

pero desde el punto de vista de la manipulacin y de la capacidad de

regeneracin, lo mejor son los pices caulinares.

c) Microinjerto
o

El microinjerto de pices caulinares in vitro para la obtencin de plantas de naranjo

libres de virus:
o

Consiste en extraer el pice caulinar de la variedad a injertar, constituido

por el meristemo apical, y primordios foliares y luego sembrarlo sobre la
superficie decapitada de epicotilo de un embrin de 2 semanas de edad.

En muchas ocasiones es muy difcil conseguir que los tallos enracen. Para evitar
este problema, lo que se puede hacer es injertar los meristemos sobre patrones
cultivados in vitro a partir de semilla.

Esta tcnica ha dado muy buenos resultados en ctricos

Ilustracin 6. Microinjerto de pices meristemticos. (A) La flecha seala un pice meristemtico de Citrus sinensis
injertado sobre un patrn de 2 semanas de edad. (B) Corte del punto de unin entre el pice meristemtico y el
patrn 5 das despus del injerto. Se observa la formacin de callo en el punto de unin

d) Eliminacin de virus a partir de callos y protoplastos

o

Plantas de tabaco infectadas con MTV han perdido el virus a travs de sucesivos
repicados.

Dos pueden ser las razones de que esto ocurra:

o

La replicacin del virus no es tan rpida como la capacidad de multiplicacin

de las clulas y por ello algunas no se infectan

Algunas clulas adquieren resistencia al virus o simplemente se seleccionan

clulas que en el explanto inicial ya eran resistentes

Tambin se han conseguido plantas libres de virus a partir de protoplastos

obtenidos de plantas infectadas.

La gran limitacin que tiene cualquiera de estos dos mtodos es que se produce
variacin somaclonal en una alta proporcin.

10

e) Quimioterapia
o

Consiste en utilizar sustancias qumicas para eliminar los patgenos.

El uso de antivirales sera la resolucin definitiva pero hasta ahora no se ha

encontrado ninguno que sea realmente efectivo.

Algunas sustancias qumicas disminuyen la replicacin de los virus en las plantas

durante un tiempo, pero una vez que se suspende el tratamiento vuelven a crecer otra
vez los virus.

Han sido evaluados varios mtodos. El que mejores resultados ha dado ha sido el
virazol o ribavirina.

f) Electroterapia
o

El mtodo consiste en aplicar corriente elctrica a las yemas vegetales por un perodo
de tiempo variable dependiendo de la planta que se trate.

Ej.: Esta tcnica se ha utilizado para eliminar el virus del mosaico del almendro y para
ello se sometieron los brotes a 500 voltios por tiempo variable.

Los mejores resultados se obtuvieron cuando se pusieron 500 voltios durante 5

minutos y con 20 minutos parece que se eliminaron todos los virus.

Tambin se ha utilizado con la caa de azcar, en el virus de la banana en estos casos

se ponen de 5-30 voltios por un perodo de 5 minutos.

La eficiencia del tratamiento es aproximadamente del 3-70%, dependiendo de la planta.

g) Mtodos combinados
Casi todos los protocolos que se utilizan son una combinacin de las tcnicas que acabamos
de comentar.
Formacin de rganos adventicios seguida del cultivo de meristemos

Algunos rganos adventicios formados in vitro a partir de explantos procedentes

de ejemplares infectados carecen de virus.

Brotes adventicios formados a partir de hoja de tabaco, petunia, col o vid.

Posteriormente se toman los meristemos de esos rganos y se cultivan.

Qquimioterapia con cultivo de meristemos

Se introduce la planta en un medio de cultivo con virazol. Se aslan los brotes que crecen y
se vuelven a cultivar en otro medio. Tiene un gran inconveniente y es que el virazol es muy
citotxico tanto para el virus como para las clulas de la planta.

11

En patata se ha conseguido eliminar algunos virus cultivando segmentos nodales en

medio MS con ribavirina 0.8 mM en condiciones de 4 h de luz a 30 C y 4 h de
oscuridad a 31 C durante 28 das.

6. PRUEBAS PARA DETECTAR LA PRESENCIA DE PATGENOS

Indexaje de cultivos (Actividad)
Pruebas inmunolgicas para detectar patgenos (Actividad)
Bioensayos
o

Consisten en la obtencin de extractos procedentes de la planta problema y su

aplicacin a plantas muy sensibles al virus en cuestin.

Si al cabo de un cierto tiempo la planta sensible muestra sntomas de

enfermedad, es que el extracto problema estaba infectado.

Para facilitar la penetracin del virus, a la planta sensible al virus se le adiciona

algn abrasivo que pueda lesionar las paredes celulares

Con este mtodo slo se puede certificar la ausencia de aqullos virus de los que se
han efectuado pruebas especficas

o
o

Eliminacin de otros tipos de patgenos

El cultivo de meristemos, aunque diseado originalmente para la eliminacin de virus,
se ha comprobado que es capaz de eliminar tambin bacterias, micoplasmas y hongos.

7. CULTIVO Y AISLAMIENTO DE PROTOPLASTOS

o

Los protoplastos son clulas vegetales desprovistas de sus paredes celulares.

Representan un caso muy interesante a la hora de estudiar clulas vegetales
individuales ya que no tienen continuidad citoplasmtica con las clulas vecinas.

Los protoplastos pueden ser tiles para:

Estudios bioqumicos relacionados con mecanismos comunicacin celular.

Siempre es el paso previo a la introduccin de ADN forneo en una

clula para producir hbridos interespecificos por fusin celular

El factor ms importante a la hora de conseguir buenos resultados es la

adecuada seleccin del tejido de partida

12

7.1 Aislamiento de protoplastos

El explanto inicial se incuba con mezclas de enzimas de tipo celulasa, pectinasa y
hemicelulasa de origen fngico.

El medio que se vaya a utilizar para eliminar la pared celular debe ser hipertnico por
dos razones:

Es el nico medio de garantizar que no es hipotnico pues en su caso, entrara agua

a la clula y terminaran por estallar.

La hipertonicidad hace que la clula se plasmolice y as se rompan las conexiones

entre clulas a travs de plasmodesmos.
Se suele utilizar soluciones de glucosa, fructosa, galactosa, manitol o
sorbitol (azcares o alcoholes derivados de los azcares).
A veces se utilizan sales para disminuir el potencial hdrico del medio, como
Cl2Ca ya que el Ca contribuye a mantener la integridad de las membranas.

Veamos algunos de los aspectos de inters relacionados con el aislamiento de

protoplastos

7.2. Digestin enzimtica de las paredes celulares

o

Dos son los enzimas que deben estar siempre presentes: celulasas y pectinasas.

Las primeras porque degradan la pared celulsica primaria.

y las segundas porque destruyen la lmina media que separa las paredes
celulares de las clulas vecinas (constituida por pectina y de aspecto
gelatinoso).

Algunos tejidos requieren adems la presencia de hemicelulosas. Aunque las

enzimas

que

se

venden

comercialmente

estn

purificadas,

contienen

contaminaciones de proteasas y nucleasas que pueden ser de utilidad para la

digestin de protenas de la pared celular.
o

La digestin de las paredes se lleva a cabo bajo agitacin suave.

Para efectuarla, los enzimas se disuelven en el medio de cultivo. En

casos especiales, y con mezclas enzimticas especficas, el
procedimiento puede durar tan slo 30 minutos.

13

Cules son los factores ms importantes del medio?

o
Dos factores muy importantes para conseguir la divisin celular son los iones Ca++ y
los niveles de nitrgeno amoniacal.
o

El Ca++ tiene efecto positivo sobre el cultivo. Su concentracin a valores

elevados comprendidos entre 14 y 40 mM:

Promueve la divisin celular

Favorece la sincronizacin del ciclo celular

Disminuye los procesos de agregacin

Reduce el oscurecimiento de los protoplastos durante los primeros

estadios del cultivo.

El nitrgeno amoniacal normalmente se diluye a la mitad o a .

aunque es esencial para promover la divisin celular, tiene efecto

negativo sobre los protoplastos.

As pues una vez que los protoplastos han regenerado la pared celular y comienzan
a dividirse, se deben restablecer los niveles habituales de Ca y nitrgeno amoniacal

Cules son los factores ms importantes del medio?

Casi siempre se necesitan auxinas y citoquininas.
En ocasiones es necesaria la adicin de PVP u otros antioxidantes
La presencia de un compuesto que mantenga bajo el potencial hdrico del medio es
esencial para el cultivo de los protoplastos.
Un factor muy importante es la densidad de siembra. Lo normal es cultivar entre
104 y 105 protoplastos/ml
Si lo que se pretende es seguir el desarrollo de clulas individuales que hayan sido
transformadas, se deben cultivar a densidades muy bajas: de entre 100 y 500
protoplastos/ml.

8. MANIPULACIN GENTICA DE PROTOPLASTOS

a) Fusin de protoplastos
o

Los protoplastos viables normalmente regeneran las paredes celulares, pero

mientras tienen sus membranas plasmticas desnudas se pueden fusionar.

Como resultado de la fusin de protoplastos se forman clulas que tienen dos o

ms ncleos.
Si los que se fusionan proceden de diferentes lneas parentales se
denominan heterocariones,

14

si se han originado a partir de clulas genticamente idnticas reciben

el nombre de homocariones.
Una vez que se ha producido la fusin de los ncleos podemos hablar de
hbridos
o

La fusin de protoplastos permite que en la nueva clula haya orgnulos

citoplasmticos de ambos parentales (a diferencia de la reproduccin sexual).

Los genomas mitocondriales se pueden recombinar pero los genomas

cloroplastidiales normalmente no lo hacen

La fusin de protoplastos es un fenmeno que en ocasiones ocurre de modo

espontneo, sobre todo cuando los protoplastos proceden de clulas que se
encontraban en divisin activa.

La fusin inducida se lleva a cabo mediante procedimientos qumicos o

elctricos.
o

En ambos casos la membrana plasmtica se desestabiliza de modo

temporal, lo que da como resultado la formacin de poros.

Las molculas lipdicas orientadas al azar en los poros se alinean y

forman puentes de membrana entre los protoplastos adyacentes, con la
consiguiente unin de los citoplasmas de dichos protoplastos

15

Fusin de protoplastos. Fusin qumica.

Para inducir la fusin de protoplastos se necesita una sustancia que la facilite: estas
sustancias reciben el nombre de fusgenos. Tienen que ocurrir tres fenmenos:

1. Aglutinacin. Los protoplastos se disponen muy cerca unos de otros. Para ello es
necesario que se neutralicen las cargas negativas superficiales de las membranas
plasmticas. Esto se puede conseguir con:
o

pH elevado e iones Ca++. Por ejemplo, una alta concentracin de

Cl2Ca 2H2O elimina por completo las cargas negativas de la superficie de
los protoplastos.

Mediante tratamiento con polietilnglicol. El PEG es un polmero de alto

PM. Su carga, levemente negativa, le permite establecer enlaces por
puentes de hidrgeno con molculas de agua, protenas, carbohidratos, etc
y sirve de puente de unin entre protoplastos que se encuentren prximos.

Adems, PEG puede unirse a cationes (de Ca u otros) y estos cationes a su

vez sirven de puente de unin entre cargas negativas de protenas o
fosfolpidos de protoplastos vecinos.

El empleo de PEG da lugar a la produccin de una gran cantidad de

heterocariones binucleados debido a que el nmero de protoplastos que se
fusionan es de slo 2 3 frente a la gran cantidad que se suelen unir
cuando se emplean iones Ca++. La concentracin que se suele emplear es 15 45% de PEG durante 15 a 30 min. Pasado el tiempo de tratamiento, los
protoplastos se lavan para quitar el PEG con medio de cultivo.

Otros

posibles

fusgenos

son:

N03Na,

N03K,

PEG

DMSO

(Dimetilsulfxido), alcohol polivinilico, sulfato de dextrano, policationes

tales como poli-L-lisina, etc
2. Fusin localizada de las membranas plasmticas.
o

Lo que da lugar a la formacin de puentes citoplasmticos entre los

protoplastos.

Cuando se lavan los protoplastos y se elimina PEG y/o los cationes, las
cargas positivas y negativas de los protoplastos pueden interaccionar entre
si y facilitar la unin entre ellos.

Sea cual sea el fusgeno empleado, las bajas temperaturas (15 C) mejoran
los resultados en la etapa de aglutinacin. Sin embargo, para la etapa de
fusin son mejores las altas temperaturas, entre 30 y 37 C.

En la prctica, todo el procedimiento se lleva a cabo a 24 C.

16

3. Fusin completa de las membranas plasmticas.

o

Los

puentes

citoplasmticos

se

expanden

hasta

dar

homocariones

heterocariones esfricos y se cierran los puentes citoplasmticos que

constituyen el protoplasto.
La fusin qumica presenta algunos inconvenientes tales como:
o

Los fusgenos son txicos para algunos protoplastos.

Por ejemplo, el PEG produce destruccin de mitocondrias

Normalmente se fusionan ms de dos clulas, produciendo agregacin mltiple.

El fusgeno se debe eliminar antes del cultivo y esto es complicado.

Con la fusin qumica se suele obtener slo un 1% de fusin celular frente al

20% o ms que se consigue con otros mtodos como la electrofusin

Fusin de protoplastos. Electrofusin. (Actividad)

9. RESULTADOS DE LA FUSIN DE PROTOPLASTOS

o

Mientras que con los mtodos de ingeniera gentica se transfiere uno o muy
pocos genes, la fusin de protoplastos permite transferir una gran cantidad de
genes desde una clula donadora hasta otra receptora.

Esto es de gran inters agronmico ya que cantidad y calidad de la cosecha, o

resistencia al estrs estn codificados por un gran nmero de genes. De
manera que la mejora gentica de este aspecto slo va a poderse llevar a cabo
mediante fusin de protoplastos.

Hbridos simtricos:
o

Son aqullas plantas hbridas en las que estn presentes, de modo completo, los
dos genomas nucleares de las clulas parentales. Ocurre en muy pocos casos
pero en ocasiones, particularmente con Solanum tuberosum, se ha conseguido.

17

Hbridos asimtricos:
o

Son aqullos hbridos en los que est presente, de modo completo, uno de los
dos genomas parentales mientras que el otro slo est en parte.

Suelen ser ms interesantes que los hbridos simtricos, ya que estos suelen
llevar junto con los genes deseables, algunos de nulo inters o incluso
perjudiciales.

Los cromosomas que se mantienen completos son los del parental que tiene un
ciclo celular ms breve.

Un mtodo para conseguir hbridos asimtricos consiste en aplicar radiaciones

X a los protoplastos de las clulas donadoras.

Este tratamiento fragmenta los cromosomas, por lo que terminan por

eliminarse. Sin embargo, alguno de los fragmentos se pueden integrar en
el genoma de la clula receptora y modificarla.

Hbridos:
o

Son aqullos en los que los genomas nucleares parentales de ambos estn de modo muy
desequilibrado. La mayora de los genes proceden de uno de ellos pero hay genes
extranucleares (cloroplastidial y mitocondrial) de ambos parentales

En la fusin celular de los gametos sexuales para formar un cigoto, todos los
cloroplastos y las mitocondrias proceden del gameto femenino.

Los cbridos y los hbridos asimtricos son los productos ms interesantes de la fusin
de protoplastos. Hay que recordar que muchos fenmenos tales como resistencia a
herbicidas y esterilidad masculina se deben a genes extranucleares.

Los principales mtodos para la obtencin de cbridos son los siguientes:

o

Fusin de un protoplasto normal con otro al que se le haya eliminado el ncleo

(citoplasto).

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Fusin de un protoplasto normal con otro que contenga un ncleo inviable. El

tratamiento con rayos X parece que no afecta a los genomas extranucleares
probablemente porque hay una gran cantidad de copias de estos en cada clula.

Eliminacin de uno de los ncleos tras la formacin del heterocarin

Eliminacin selectiva de uno de los juegos de cromosomas en un estadio posterior

10. INCONVENIENTES DE LA FUSIN DE PROTOPLASTOS

Como inconvenientes ms claros citaremos los tres siguientes:
o

Los productos que se obtienen de la fusin de protoplastos son a menudo estriles,

producen plantas con malformaciones o son inestables, es decir la descendencia que
producen no es hbrida.

No siempre es fcil disponer de mtodos eficaces que permitan la seleccin de los

hbridos.

Los procedimientos de produccin y cultivo de protoplastos conducen a una elevada

inestabilidad gentica, de modo que es posible que el protoplasto que se fusione no sea
exactamente igual que la clula parental.

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