Pruebas Bioqumicas

Determinan la actividad metablica de una cepa pura. Son

empleadas principalmente para la identificacin y
clasificacin de bacterias y hongos.

Pruebas Bioqumicas

E + S ES E + P
Se pueden resumir en los siguientes puntos:

Sustrato (contenido en el medio de cultivo)

Enzima o va metablica (secretada o en el interior del
microorganismo)

Producto
Revelador y/o indicador (aunque algunas no los emplean)

Los fundamentos completos de estas pruebas y dems informacin pueden

encontrarlos en el libro: Pruebas bioqumicas para la identificacin de bacterias
de importancia clnica de Jean F. MacFaddin, Editorial Mdica Panamericana.

Hidrlisis del Almidn

Prueba negativa

Prueba positiva

El almidn es producido
principalmente por
plantas superiores, est
compuesto de amilosa y
amilopectina. Diversas
enzimas amilolticas
hidrolizan almidn y sus
productos.

Agar Almidn
Sustrato: Almidn (polmero de glucosa).
Enzima: Amilasa (exoenzima).
Producto: Glucosa.
Revelador: Lugol.
Fundamento: El lugol con el almidn forman un complejo
color caf-prpura que desaparece cuando el almidn ha
sido degradado.

Degradacin de la casena
Agar Leche Descremada
Sustrato: Casena (protena).
Enzima: Caseinasa (Proteasa,
exoenzima).
Producto: Aminocidos.
Revelador: No requiere.

Prueba negativa

Prueba positiva

Fundamento: Las proteasas son excretadas al medio para la

degradacin de protenas, la casena es la protena de la leche
que le confiere el color blanco, cuando la casena es hidrolizada
desaparece el color blanco alrededor del crecimiento
microbiano.

Hidrlisis de la lecitina y
reduccin del telurito
Agar yema de huevo/Agar Baird Parker
Sustrato: Lecitina.
Enzima: Lecitinasa.
Producto: Fosforilcolina.
Revelador: No requiere.
Algunos microorganismos producen lecitinasa que hidroliza la
lecitina (fosfolpido). Se utiliza el agar yema de huevo. Las colonias
productoras de lecitinasa forman una zona opaca a su alrededor.
El medio de Baird Parker es empleado para el aislamiento y
cuantificacin de estafilococos coagulasa positivos, al que se
adicionan componentes que lo hacen selectivo. Las colonias
tpicas de S. aureus son oscuras por la reduccin del telurito,
adems presentan el halo de hidrlisis de la lecitina.

Licuefaccin de la gelatina
Gelatina Nutritiva
Sustrato: Gelatina (protena).
Enzima: Gelatinasa (Proteasa,
exoenzima).
Producto: Aminocidos.
Revelador: No requiere o puede
emplearse el carbn activado en
polvo.
Prueba negativa

Prueba positiva

La gelatina es una protena que tiene la capacidad de gelificar,

cuando es hidrolizada por la gelatinasa en los aminocidos que la
componen pierde su caracterstica de gelificar. Se pueden
emplear varios medios que permiten la visualizacin
macroscpica como la gelatina adherida a carbn activado.

Fermentacin de carbohidratos
Medio base rojo de fenol ms
carbohidrato o polialcohol, con
campana de fermentacin (Durham).
Sustrato: Carbohidrato o polialcohol.
Va: Fermentativa.
Producto: cidos orgnicos.
Indicador: Cualquier indicador de pH.
Negativo/Positivo(A)/Positivo(AG)

Los compuestos de carbono (carbohidratos o polialcoholes)

deben ser incorporados, algunos requieren de ser degradados
en monmeros y transportados a la clula para posteriormente
en condiciones anaerobias ser metabolizados por la va
fermentativa. La fermentacin (degradacin) de un compuesto
orgnico se observa por la acidez en el medio de cultivo y la
formacin de gas capturado en la campana de fermentacin.

Oxidacin/Fermentacin
Hugh and Leifson
Sustrato: Carbohidratos.
Vas: Fermentativa y/u Oxidativa.
Producto: Acido pirvico.
Indicador: Azul de bromotimol u
otro indicador cido/base.
Las bacterias utilizan hidratos de carbono por uno de dos procesos
metablicos, fermentativo u oxidativo. La principal diferencia es la
necesidad de oxgeno atmosfrico y una fosforilacin inicial. Por
prueba se inoculan dos tubos de medio y uno de ellos se sella con
aceite mineral o parafina para impedir la entrada de oxgeno.
La fermentacin requiere de una fosforilacin inicial, utiliza las vas
de la Gluclisis (Embden-Meyerhof-Parnas EMP), de las Pentosas
fosfato y Entner-Doudoroff.

Oxidacin/Fermentacin
La oxidacin de la glucosa
produce cido pirvico por una
va de derivacin (shunt), ocurre
en condiciones aerobias y no
requiere de fosforilacin inicial.

La produccin de cido se observa por el vire del indicador al

amarillo. En los tubos positivos puede haber generacin de gas.
Reaccin

Tubo con reaccin positiva

Tubo abierto

Tubo sellado

Oxidacin

Abierto

Amarillo (+)

Verde (-)

Fermentacin

Sellado

Amarillo (+)

Amarillo

Ni fermentacin,
ni oxidacin

Ninguno

Azul o verde

Verde

Fermentacin y
oxidacin

Ambos

Amarillo

Amarillo

Rojo de Metilo/Voges Proskauer

Caldo RM/VP
Sustrato: Glucosa.
Vas: Fermentacin cida o neutra.
Producto: Acido orgnicos o acetona.
Reveladores: Solucin de Rojo de Metilo,
Alfa Naftol y KOH 40%.

Fermentacin cido mixta: Los productos finales son cidos

orgnicos que provocan un descenso brusco del pH inicial del
medio (viraje del indicador de amarillo pH por encima de 5,1) y rojo
(pH por debajo de 4,4). Estos microorganismos por cada 4
molculas de piruvato formadas, reducen dos a cido lctico y dos
las metabolizan para formar cido actico y frmico; parte del
acetato pasa a etanol y parte del frmico a CO2 y H2 en
cantidades iguales.

Rojo de Metilo/Voges Proskauer

Fermentacin butilengliclica: en sta,
parte del piruvato se metaboliza
produciendo cantidades menores de
cido lctico, frmico y actico, la
mayor parte del piruvato se condensa
formando acetilmetilcarbinol, que es
reducido a 2,3-butilenglicol, productos
que son neutros.

Para determinar la presencia de los productos neutros (prueba

de Voges-Proskauer): Se agrega un poco de a-naftol al 5% en
etanol (medio adquiere aspecto lechoso), luego se le aade
(KOH 40%) que desaparece el aspecto lechoso, se agita
fuertemente. (Prueba positiva color rosado - violceo en la parte
superior del tubo; Prueba negativa no tiene coloracin).

Utilizacin de citrato

Prueba negativa

Prueba positiva

Medio de Citrato de Simmons

Sustrato: Citrato de sodio.
Va: Varias dependientes del pH del
medio.
Producto: Acetato/formato en
condiciones alcalinas y Acetato,
CO2, lactato/Acetona y CO2 en
condiciones cidas.
Indicador: Azul de bromotimol.

Un microorganismo que puede utilizar el citrato como nica

fuente de carbono tambin utiliza las sales de amonio del
medio como nica fuente de nitrgeno. La extraccin de
nitrgeno de las sales de amonio producen amoniaco y se
alcaliniza el medio virando el indicador al alcalino.

Agar Hierro de Kligler (KIA)

Agar hierro de Kligler
Sustratos: Glucosa 0.1%, lactosa 1% y
Tiosulfato o grupos SH de la cistena.
Va: Fermentativa y enzimas: Tiosulfato
reductasa y cistena desulfurilasa.
Productos: cidos mixtos y H2S.
Indicadores: Rojo de fenol y sales de Fe2+ .
En presencia de tiosulfato en el medio o la degradacin de
protenas liberando aminocidos azufrados, algunos
microorganismos forman H2S gaseoso por medio de las enzimas
tiosulfato reductasa y cistena desulfurilasa. El gas incoloro H2S se
forma en condiciones cidas y reacciona con el citrato de
amonio frrico para producir un precipitado negro insoluble de
sulfuro ferroso metlico.

Agar Hierro de Kligler (KIA)

No fermentadores
No fermenta
pH = 7.4

O2
Pptidos
Aminas

Pico de flauta
alcalino y fondo
alcalino

No fermentadores de lactosa
Glucosa
cidos Mixtos

O2
Pptidos
Aminas

Glucosa
cidos Mixtos

O2
Pptidos
Aminas

Reaccin inicial:
Pico de flauta
cido y fondo
cido
Reaccin final:
Pico de flauta
alcalino y
fondo cido

Fermentadores de lactosa
Glucosa +
Lactosa

cidos Mixtos

O2
Pptidos
Aminas

Pico de flauta
cido y fondo
cido

Las bacterias incapaces de

fermentar utilizan las peptonas y
liberan aminas que alcalinizan todo el
medio.
Las bacterias que solo fermentan la
glucosa, inicialmente tambin utilizan
aerbicamente la glucosa. Debido a
la baja concentracin de glucosa
(0.1%), metabolizan las peptonas
alcalinizando la superficie del medio.
Las bacterias fermentadoras de
glucosa y lactosa, fermentan la
glucosa 0.1% y al trmino de esta,
fermentan la lactosa 1%, permitiendo
la acidificacin completa del medio.

Agar Hierro de Kligler (KIA)

El medio de Kligler est
diseado para la
identificacin de
enterobacterias y otras
bacterias Gram negativas.
Interpretacin:
Tubo

4A

Fermentacin de Glucosa

Produccin de gas de la
fermentacin

Fermentacin de Lactosa

Produccin de H2S

Medio SIM
(Sulfhdrico Indol Movilidad)
Medio SIM (medio semislido)
Sustratos: Tiosulfato o grupos SH de la cistena y triptfano.
Enzimas: Tiosulfato reductasa, cistena desulfurilasa y tiptofanasa.
Producto: H2S e Indol.
Revelador: Sales de Fe2+ y p-Dimetilaminobenzaldehdo (DMABA).
En presencia de tiosulfato en el medio o la
degradacin de protenas liberando
aminocidos azufrados, algunos
microorganismos forman H2S gaseoso por
medio de las enzimas tiosulfato reductasa y
cistena desulfurilasa. El gas incoloro de H2S
reacciona con el citrato de amonio frrico
para producir un precipitado negro insoluble
de sulfuro ferroso metlico.
Prueba positiva

Prueba negativa

Medio SIM
(Sulfhdrico Indol Movilidad)
Las enzimas triptofanasas oxidan el triptfano
para formar tres metabolitos: indol, metil indol y
cido indolactico. Los reactivos de Erhlich o
Kovacs contienen DMABA que reacciona con el
indol producido formando un compuesto
quinnico color violeta, que se observa por la
aparicin de un anillo en la superficie del medio.
Prueba positiva

Prueba negativa

El medio de cultivo tiene consistencia semislida

por lo que la movilidad se observa por el
crecimiento del microorganismo en todo el tubo,
ms all de la zona de inoculacin (picadura).
Los microorganismos inmviles solo crecern en
la zona inoculada.
Prueba negativa

Prueba positiva

Ureasa
Caldo urea o agar urea de Christensen.
Sustrato: Urea.
Enzima: Ureasa.
Producto: Amonaco.
Indicador: Rojo de fenol.

La hidrlisis de la urea por la enzima

ureasa libera dos molculas de
amoniaco que alcaliniza el medio,
entonces se vira el indicador de pH,
en el caso del rojo de fenol una
prueba positiva es color bugambilia.

Prueba negativa

Prueba positiva

Reduccin de Nitratos

Caldo nitratos
Sustrato: Nitrato de sodio.
Enzima: Nitrato reductasa.
Producto: Nitritos.
Revelador: Reactivos de Griess.
Nitrato reductasa (NAR).

N03 NO2 NO N2O N2

-

Nitrito reductasa (NIR).

NO reductasa (NOR).
N2O reductasa (N2OR).

Reduccin de Nitratos
El nitrito reacciona
con dos reactivos:
cido sulfanlico y
dimetil-a-naftilamina
(o a-naftilamina). La
reaccin de color
se debe a la
formacin de un
compuesto
diazonio, psulfobenceno-azoa-naftilamina.

N
NH2

+
SO3H

HNO2

+ H2 O

Acido nitroso

Acido sulfanlico
(incoloro)

+
NH2

SO3H

a-naftilamina
(incolora)

Acido sulfanlico diazotizado

(sal de diazonio)

Acoplamiento

+ H2 O
SO3H

NH2

p-sulfobenceno-azo-a-naftilamina
(colorante rojo azo hidrosoluble)

Cuando la prueba resulta negativa para nitritos se utiliza la prueba

del zinc para reducir qumicamente los nitratos presentes a nitritos
y formar con los reactivos de Griess el compuesto colorido.

Descarboxilasas
Medio base de descarboxilasas u otros
medios como LIA (Lysine Iron Agar) o
MIO (Motility Indole Ornithine).
Sustrato: Aminocidos (lisina, ornitina o
arginina) .
Enzimas: Lisina u ornitina
descarboxilasa y arginina dihidrolasa.
Producto: Amonaco.
Indicador: Prpura de bromocresol.
Los aminacidos al perder el grupo carboxilo se convierten en
diaminas lo que incrementa el pH del medio y el indicador
(prpura del bromocresol) vira a violeta. Las descarboxilasas
son tiles en la diferenciacin de enterobacterias.

Prueba de la coagulasa
Plasma de conejo
Sustrato: Factores de la coagulacin.
Enzima: Coagulasa
(estafilocoagulasa).
Producto: Cogulo.
Revelador: No requiere.
Prueba positiva

Prueba negativa

La enzima producida por S. aureus es excretada al medio

extracelular, el mecanismo propuesto es la accin de esta
enzima sobre los factores de la coagulacin presentes en el
plasma y formar un cogulo visible.

Oxidasa
Cultivo de medio nutritivo
Sustrato: Compuesto reducido.
Enzima: Oxidasa.
Producto: Compuesto oxidado.
Revelador: Reactivo de Kovacs,
diclorhidrato de tetrametil-p-fenilendiamina
(TPD) al 1%, solucin incolora.
Se basa en la produccin bacteriana de una enzima oxidasa
intracelular. Esta reaccin se debe a un sistema de citocromo
oxidasa que activa la oxidacin del citocromo reducido por el
oxgeno molecular, el que a su vez acta como un aceptor de
electrones en la fase terminal del sistema de transferencia de
electrones. La prueba positiva se observa por la oxidacin del
reactivo incoloro en pocos segundos formndose un producto
colorido.