PROTOCOLO PARA LA PRODUCCIN DE EMBRIONES

IN VITRO DE ALPACA (Vicugna pacos)

CONSIDERACIONES PREVIAS E INTRODUCCIN AL PROTOCOLO

El presente protocolo de Fertilizacin In Vitro en Alpacas es consecuencia del trabajo de

tesis intitulado: Evaluacin de la Fertilizacin In Vitro de ovocitos de Alpaca (Vicugna
pacos) recuperados de ovarios del matadero de Nuoa Puno 2014 realizado en su
totalidad a 4200 msnm, en el Centro de Innovacin y Produccin de Quimsachata de la
E.E.A. Illpa INIA Puno, en el periodo Agosto Noviembre considerado como poca de
baja eficiencia reproductiva en camlidos sudamericanos.
Este protocolo tom como referencia base el Protocolo para la Produccin de Embriones
In Vitro en Bovinos del Dr. Pedro Garca Herradn de la Universidad de Santiago de
Compostela Espaa, as como diversas consideraciones y modificaciones tomadas en
cuenta de otras investigaciones realizadas en camlidos.
Cabe resaltar el trabajo conjunto y coordinado de los doctores del Programa Nacional de
Investigacin en Camlidos, as como profesionales en esta rea que permitieron llevar a
cabo la adaptacin de este protocolo para profundizar y ampliar la gama de tecnologas
aplicables en pro del mejoramiento del ganado alpaquero en el Per.
Rajiv E. Mlaga Chuquitaype
Bachiller en Ingeniera Biotecnolgica -UCSM

PREPARACIN DEL MEDIO PARA EL TRANSPORTE DE LOS OVARIOS

Preparar la Solucin Salina 0.9% mezclando 9 gr de NaCl y 1000 ml de agua ultra

pura mili-Q.
Calentar la solucin hasta que rompa el hervor.
Aadir 10 ml de Antibitico antimictico cuando la temperatura de la solucin
haya descendido hasta 37 C. No aadirla a altas temperaturas debido a que se
inactiva el antibitico.

RECOGIDA Y TRANSPORTE DE OVARIOS

Realizar la extraccin de los ovarios despus del beneficio del animal, justo al
momento que sus rganos internos se vean expuestos. Evitar su contacto con el
piso o la exposicin prolongada de los ovarios al medio ambiente.
Introducirlos en el termo con medio de transporte inmediatamente y mantener
la temperatura en un rango de 35.5 hasta 37.5C mximo. Idealmente mantener
los ovarios a 37C hasta el momento en que se inicie su manipulacin.

RECUPERACIN DE LOS OVOCITOS

Realizar la recuperacin del COC bajo visualizacin en estereoscopio, empleando

pinzas y bistur.
Colocar el ovario en una placa Petri con 20 ml de medio de Lavado previamente
preparado y temperado en bao Mara a 37C.

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Visualizar el folculo del cual se realizar la extraccin y sujetando firmemente el

ovario con la pinza, realizar un corte longitudinal en la superficie del folculo
suavemente para permitir la salida de todo el COCs.
Aspirar el COCs empleando una micropipeta (10 ul o 20-200ul) al momento de
su visualizacin y colocarlo en una placa Petri pequea con 5 ml de medio de
Lavado para su mantenimiento y posterior seleccin.

OBSERVACIN:
La aspiracin del COCs se puede realizar justo al momento de su liberacin por el
corte folicular o al finalizar el corte de todos los folculos de trabajo.
Clasificacin y Seleccin del COCs:
Seleccionar para el trabajo solamente los ovocitos que presenten un citoplasma
homogneo pigntica como morfolgicamente.
La clasificacin de ovocitos para el trabajo puede ser dada por el investigador
basndose en los diferentes parmetros mencionados en la literatura.
Lavar los ovocitos seleccionados tres (3) veces en gotas de 50 ul con medio de
Lavado anteriormente preparado y temperado.
Realizar un (1) lavado en 50 ul de medio de maduracin al cual se depositaran.
Realizarlo cuidadosamente para evitar el desnudamiento de los ovocitos.
MADURACIN IN VITRO
Preparacin de Placas para MIV:
En la placa de 6 pocillos, dispensar en cada pocillo 500 ul de medio de
Maduracin previamente preparado.
Tapar la placa y rotularla con el nmero de la corrida y la fecha de trabajo.
Colocar la placa en la cmara de CO2 con una anterioridad de 2 horas, antes de
colocar los ovocitos.
Disposicin de los ovocitos para su MIV:
Colocar en un nmero no mayor de 25 ovocitos por pocillo empleando una
micropipeta.
En la medida de lo posible, evitar que un nmero menor a 5 ovocitos se
encuentre en cada pocillo.
Registrar el nmero de ovocitos colocados en cada pocillo numerado y la
categora de estos para llevar un registro en cuanto al progreso de su maduracin
Colocar la placa con los ovocitos en la incubadora a 38.5C, 5% de CO2 y 100 %
de humedad por un tiempo de maduracin de 34 horas.
FERTILIZACIN IN VITRO
Tratamiento del Semen post-coleccin:
Colocar el semen colectado en bao Mara a 37.0 C y aadir en la proporcin
1:1 el Dilutor Tris- Yema de Huevo.
Pipetear lo suficiente para permitir la completa miccin entre el Dilutor y el
semen colectado.

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Seleccin Espermtica:
Preparar la gradiente de Percoll en la densidad requerida. Se recomienda
trabajar con la densidad 45/22.5.
Inclinar 45 el tubo con la gradiente y colocar suavemente por las paredes 500 ul
de la muestra de semen con Dilutor. El semen se colocar en la parte superficial
del tubo sobre la gradiente.
Centrifugar por 10 minutos a 3500 RPM (las revoluciones y el tiempo de
centrifugacin depender de la cantidad, filancia y contaminacin del semen)
Lavado Espermtico:
Terminada la centrifugacin, eliminar por decantacin o empleando una
micropipeta toda la gradiente y restos de plasma seminal del tubo.
Lavar las paredes y resuspender el pellet formado con 100 ul de medio SPERMTALP.
Concentrar todos los volmenes de resuspensin de todas las gradientes
realizadas en tubos eppendorf, y centrifugar por 5 minutos a 650 RPM.
IMPORTANTE: Evitar la resuspensin o eliminacin del pellet formado que contiene
los espermatozoides.
Capacitacin Espermtica:
Resuspender el pellet de espermatozoides formado con 230 ul de FERTIL-TALP.
Colocar en un tubo eppendorf, 220 ul de la Solucin Espermtica resuspendida,
30 ul de solucin de Heparina y 30 ul de solucin PHE (Penicilamina, Hipotaurina,
Epinefrina)
Evaluar el progreso y la eficiencia en el aumento de la motilidad en microscopio
antes de realizar la Fertilizacin.
Preparacin de las placas para FIV:
Colocar 250 ul de medio FERTIL-TALP en cada pocillo.
Rotular con el nmero de corrida y la fecha de trabajo.
Colocar la placa con el medio en la Incubadora o Cmara de CO2, con una hora
de anterioridad a colocar los ovocitos.
Tratamiento de los Ovocitos Maduros:
Terminado el tiempo de maduracin, recuperar empleando micropipeta todos
los ovocitos que se encuentren homogneos pigntica y morfolgicamente.
Adems de presentar las caractersticas morfolgicas que indiquen su
maduracin.
Realizar tres (3) lavados en gotas de 50 ul de medio SPERM-TALP y un (1) lavado
final en una gota de 50 ul de FERTIL-TALP antes de colocarlo en la placa de
Fertilizacin.
Colocar los ovocitos maduros, con la mayor cantidad de clulas del cmulus
rodendolos en cada pocillo.
Colocar la placa de FIV con los ovocitos en la incubadora o cmara de CO2 por
una hora antes de realizar la fertilizacin.

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Fertilizacin In Vitro:
Colocar 250 ul de la Solucin Fertilizante preparada (30 ul Sol. Heparina, 30 ul
Sol. PHE, 220 ul Sol. Espermtica) en cada pocillo con los ovocitos maduros.
Se alcanzar un volumen final de 500 ul en cada pocillo de la placa de FIV.
Dejar en co-cultivo los ovocitos maduros y los espermatozoides capacitados por
18 a 20 horas en la incubadora con un atmsfera de 5% de CO2, 38.5 C y 100%
de humedad.
IMPORTANTE: El tiempo de co-cultivo depender de la motilidad y la concentracin
de espermatozoides, as como del nmero de ovocitos a fertilizar. Se recomienda
trabajar a 18 horas sin exceder en ningn caso de 20 horas.

CULTIVO IN VITRO DE EMBRIONES

Primera Etapa de Cultivo Embrionario (48 horas):
Preparacin de Placas para 1 Medio de Cultivo (KSOMaa):
En la placa de 6 pocillos, dispensar en cada pocillo 400 ul de medio KSOMaa
previamente preparado.
Tapar la placa y rotularla con el nmero de la corrida y la fecha de trabajo.
Colocar la placa en la incubadora con 5% CO2, 100% de humedad, y a 38.5C.
IMPORTANTE: El medio KSOMaa requiere estar preparado con anterioridad y
colocarse en la incubadora para su estabilizacin 12 horas antes de colocar los
presuntos cigotos.
Tratamiento de Ovocitos post-Fertilizacin:
Terminado el periodo de co-cultivo, aspirar los ovocitos de la placa de FIV y
colocarlos en gotas de 50 ul de medio de cultivo KSOMaa.
Desprender las clulas del cmulus de los presuntos cigotos mediante pipeteo,
empleando una micropipeta de 20-200ul. El pipeteo debe ser constante hasta
visualizar los ovocitos completamente libres de CCs.
Realizar tres (3) lavados en gotas de 50 ul de medio KSOMaa antes de pasarlos
definitivamente a los pocillos preparados.
1 Cultivo Embrionario en M. KSOMaa:
Colocar los presuntos cigotos en los pocillos de la placa de Cultivo Embrionario
en una cantidad no mayor a 25 ovocitos por pocillo.
Rotular la placa con el nmero de corrida y la fecha de inicio del cultivo.
Colocarlos en la incubadora a 38.5C, 5% de CO2 y 100% humedad.
Dejar la placa en cultivo por 48 horas, registrando la hora de inicio y la hora a la
cual terminar su desarrollo.

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Segunda Etapa de Cultivo Embrionario (7 das):

Preparacin de Placas para 2 Medio de Cultivo (SOFaa):
En la placa de 6 pocillos, dispensar en cada pocillo 500 ul de medio SOFaa
previamente preparado.
Tapar la placa y rotularla con el nmero de la corrida y la fecha de trabajo.
Colocar la placa en la incubadora con 5% CO2, 100% de humedad, y a 38.5C.
IMPORTANTE: El medio KSOMaa requiere estar preparado con anterioridad y
colocarse en la incubadora para su estabilizacin 2 horas antes de colocar los
embriones.
2 Cultivo Embrionario en M. KSOMaa:
Colocar los embriones en los pocillos de la placa de Cultivo Embrionario en una
cantidad no mayor a 25 ovocitos por pocillo.
Rotular la placa con el nmero de corrida y la fecha de inicio del cultivo.
Colocarlos en la incubadora a 38.5C, 5% de CO2 y 100% humedad.
Dejar la placa en cultivo hasta el 6 o 7 da, registrando la fecha de inicio del
segundo cultivo.
Evaluar al 6 da el progreso de los embriones, al cual deben presentarse en etapa
de blastocisto eclosionado.

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ANEXO - 1
COMPOSICIN Y PREPARACIN DE MEDIOS
MEDIO DE TRANSPOTE DE OVARIOS
Composicin:
MEDIOS DE TRANSPORTE (1 Litro)
NaCl
9 gr
Agua mili Q
1000 ml
Antibitico Antimictico
10 ml
Preparacin:
- Pesar el NaCl en una balanza analtica.
- Medir 500 ml de agua mili-Q en una probeta y colocarlo en una botella de 1 L.
- Aadir y disolver la sal. Terminar de enrazar a 1000 ml con agua mili-Q.
- Rotular con nombre, volumen y fecha de preparacin.
MEDIO DE LAVADO Y RECOLECCIN DE OVOCITOS
Composicin:
MEDIO DE LAVADO (200 ml)
SOF Hepes Stock
200 ml
L Glutamina
2ml
Piruvato
600 ul
Gentamicina
200 ul
Aminocidos Esenciales
4 ml
Aminocidos no Esenciales
2 ml
Preparacin:
- Medir en probeta 100 ml de solucin Stock de SOF Hepes y aadir uno por uno
los aditivos en el orden que aparecen.
- Aadir uno por uno los aditivos y disolver hasta su completa disolucin.
- Esterilizar el medio por filtracin empleando una jeringa de 20 ml sin mbolo y
un filtro millipore de 22 um.
- Rotular con nombre, volumen y fecha de preparacin.
MEDIO DE MADURACIN
Composicin:
MEDIO DE MADURACION (10 ml)
TCM - 199
10 ml
FCS
1 ml
FSH
10 ul
HcG
100 ul
17 Estradiol
10 ul
Piruvato
20 ul
Gentamicina
10 ul

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Preparacin:
- Colocar aproximadamente 5 ml de medio TCM-199 en un tubo falcon de 50 ml.
- Aadir uno por uno los aditivos en el orden que aparecen. Excepto el estradiol.
- Homogenizar el medio despus de aadir cada aditivo.
- Empleando una jeringa sin mbolo, enrazar a 10 ml con medio TCM.
- Esterilizar el medio por filtracin y posteriormente aadir el estradiol.
- Rotular con nombre, volumen y fecha de preparacin.
MEDIO SPERM TALP
Composicin:
MEDIO SPERM-TALP (10 ml)
SPERM - Stock
10 ml
Piruvato
100 ul
BSA Factor V
0.0300 g
Gentamicina
10 ul
Preparacin:
- Colocar aproximadamente 5 ml de SPERM Stock en un tubo falcon de 50 ml.
- Aadir uno por uno los aditivos en el orden que aparecen.
- Homogenizar el medio despus de aadir cada aditivo.
- Empleando una jeringa sin mbolo, enrazar a 10 ml con SPERM Stock.
- Esterilizar el medio por filtracin.
- Rotular con nombre, volumen y fecha de preparacin.
MEDIO FERTIL TALP
Composicin:
MEDIO FERTIL-TALP (10 ml)
FERTIL - Stock
10 ml
Piruvato
25 ul
BSA FAF
0.0600 g
Gentamicina
10 ul
Preparacin:
- Colocar aproximadamente 5 ml de FERTIL Stock en un tubo falcon de 50 ml.
- Aadir uno por uno los aditivos en el orden que aparecen.
- Homogenizar el medio despus de aadir cada aditivo.
- Empleando una jeringa sin mbolo, enrazar a 10 ml con FERTIL Stock.
- Esterilizar el medio por filtracin.
- Rotular con nombre, volumen y fecha de preparacin.

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PERCOLL
PERCOLL 90 % (20 ml)
Percoll
PBS 10X
Lactato de Sodio
NaHCO3

18 ml
2 ml
73 ul
0.0410 g

Preparacin:
- Disolver en 1 ml de PBS 10X el NaHCO3 y aadir el Lactato de Sodio.
- Aspirar 15 ml de Percoll con una jeringa de 20 ml y posteriormente aspirar el ml
de PBS 10X preparado anteriormente. Completar con 1 ml de PBS10X y enrasar
a 20 ml con Percoll en la jeringa.
- Ajustar el pH a 7.4, rotular y guardar en refrigeracin.

PERCOLL 45 % (20 ml)

Percoll 90 %
FERTIL - STOCK

10 ml
10 ml

Preparacin:
- Medir con una jeringa 10 ml de Percoll 90 % y colocarlo en un tubo falcon.
- Medir nuevamente con una jeringa 10 ml de Fertil Stock y mezclarlo en el tubo
falcon con los 10 ml de Percoll de 90% hasta alcanzar su homogenizacin.
- Ajustar el pH a 7.4, rotular y guardar en refrigeracin.

PERCOLL 22.5 % (20 ml)

Percoll 45 %
FERTIL - STOCK

10 ml
10 ml

Preparacin:
- Medir con una jeringa 10 ml de Percoll 45 % y colocarlo en un tubo falcon.
- Medir nuevamente con una jeringa 10 ml de Fertil Stock y mezclarlo en el tubo
falcon con los 10 ml de Percoll de 45% hasta alcanzar su homogenizacin.
- Ajustar el pH a 7.4, rotular y guardar en refrigeracin.
Preparacin de las Gradientes de Percoll:
- Colocar 1 ml de Percoll de 90 o 45% (dependiendo de la gradiente a preparar)
en el fondo de un tubo falcon de 15 ml empleando una micropipeta.
- Inclinar el tubo 45 y colocar suavemente 1 ml del otro Percoll complementario
a la gradiente a preparar (45 o 22.5).
- Tapar el tubo y colocarlo en bao Mara a 37.0 C hasta el momento de su uso.

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MEDIO DE CULTIVO 1 KSOMaa

Composicin:
MEDIO DE CULTIVO KSOMaa (10 ml)
KSOM Stock
10 ml
L Glutamina
100 ul
Piruvato
30 ul
Gentamicina
10 ul
EDTA
10 ul
Aminocidos Esenciales
200 ul
Aminocidos No Esenciales
100 ul
BSA
0.010 g
Preparacin:
-

Colocar aproximadamente 5 ml de KSOM Stock en un tubo falcon de 50 ml.

Aadir uno por uno los aditivos en el orden que aparecen.
Homogenizar el medio despus de aadir cada aditivo.
Empleando una jeringa sin mbolo, enrazar a 10 ml con KSOM Stock.
Esterilizar el medio por filtracin.
Rotular con nombre, volumen y fecha de preparacin.

MEDIO DE CULTIVO 2 SOFaa

Composicin:
MEDIO DE CULTIVO SOFaa (10 ml)
KSOM Stock
10 ml
L Glutamina
100 ul
Piruvato
30 ul
Gentamicina
10 ul
Aminocidos Esenciales
200 ul
Aminocidos No Esenciales
100 ul
Glucosa
0.0013 g
FCS
500 ul
Preparacin:
-

Colocar aproximadamente 5 ml de SOF Stock en un tubo falcon de 50 ml.

Aadir uno por uno los aditivos en el orden que aparecen.
Homogenizar el medio despus de aadir cada aditivo.
Empleando una jeringa sin mbolo, enrazar a 10 ml con SOF Stock.
Esterilizar el medio por filtracin.
Rotular con nombre, volumen y fecha de preparacin.

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SOLUCION PHE
Composicin:
SOLUCION PHE (20 ul)
Sol. Hipotaurina
Sol. Penicilamina
Sol. Epinefrina
Solucin Salina 0.9%

5 ml
5 ml
2 ml
8 ml

Preparacin:
- En un tubo falcon 15 ml tapado con papel aluminio, colocar inicialmente los 8
ml de solucin salina y aadir las soluciones en el volumen establecido.
- Homogenizar y alicuotar en 50 ul. Almacenar en congelacin.

SOLUCION FERTILIZANTE
Composicin:
SOLUCION FERTILIZANTE (280 ul)
Sol. Heparina
30 ul
Sol. PHE
30 ul
Sol. Espermtica
220 ul

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ANEXO - 2
COMPOSICIN Y PREPARACIN DE SOLUCIONES STOCK
MEDIO DE LAVADO Y RECOLECCIN DE OVOCITOS
Composicin:
MEDIO DE SOF STOCK (200 ml)
NaCl
1.2580 g
KCl
0.1060 g
KH2PO4
0.0320 g
NaHCO3
0.4200 g
Rojo Fenol
0.0020 g
Lactato de Sodio
94.06 ul
CaCl2 Stock
4 ml
MgCl2 Stock
4 ml
MEDIO SOF HEPES STOCK (200 ml)
SOF Stock
200 ml
HEPES
0.476 g
Observacin:
- Medir inicialmente un volumen de 100 ml de agua mili-Q en una probeta.
- Aadir uno por uno las sales y homogenizar despus de colocarla.
- Enrazar a un volumen final de 200 ml con agua mili-Q.
-

Para SOF HEPES Stock: Medir nuevamente 100 ml de la solucin stock

preparado y aadir el HEPES. Disolver y enrazar al volumen final de 200 ml
empleando la solucin stock.
Regular el pH a 7.4 empleando NaOH o HCl.
Esterilizar por filtracin y rotular con el nombre, volumen y fecha de
preparacin.

MEDIO SPERM TALP

Composicin:
MEDIO SPERM-STOCK (100 ml)
NaCl
0.5844 g
KCl
0.0231 g
KH2PO4
0.0036 g
NaHCO3
0.2101 g
Rojo Fenol
0.0010 g
Lactato Sdico
403.75 ul
CaCl2
0.0294 g
MgCl2
0.0082 g
Hepes
0.2383 g

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Observacin:
- Aadir y disolver las sales una por una.
- Esterilizar el medio por filtracin.
- Rotular con nombre, volumen y fecha de preparacin.
MEDIO FERTIL TALP
Composicin:
MEDIO FERTIL-STOCK (100 ml)
NaCl
0.6662 g
KCl
0.0239 g
KH2PO4
0.0036 g
NaHCO3
0.2101 g
Rojo Fenol
0.0010 g
Lactato Sdico
186.90 ul
CaCl2
0.0294 g
MgCl2
0.0102 g
Observacin:
- Aadir y disolver las sales una por una.
- Esterilizar el medio por filtracin.
- Rotular con nombre, volumen y fecha de preparacin.

GRADIENTE DE PERCOLL
Composicin:
Solucin A (10 ml)
NaCl
KCl
MgCl2 . 6H2O
CaCl2
Glucosa
Ac. Pirvico

0.8000 g
0.0200 g
0.0100 g
0.0100 g
0.1000 g
0.0036 g

Solucin B (10 ml)

NaH2PO4
KH2PO4

0.1150 g
0.0200 g
PBS 10X (5 ml)

Solucin A
Solucin B
Agua mili-Q

0.5 ml
0.5 ml
4 ml

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Preparacin:
- Colocar 1 ml de la gradiente ms densa empleando una micropipeta en el fondo
de un tubo falcn de 15 ml.
- Colocar 1 ml de la gradiente menos densa empleando una micropipeta en la
superficie de la anterior gradiente. Al colocarlo, inclinar el tubo 45 y aadirlo
suavemente por las paredes.
- Colocar el tubo con la gradiente en bao mara hasta el momento de su uso.
MEDIO DE CULTIVO KSOM
Composicin:
MEDIO KSOM STOCK (15 ml)
NaCl
0.0832 g
KCl
0.0027 g
KH2PO4
0.0007 g
NaHCO3
0.0315 g
MgSO4 . 7H2O
0.0007 g
Glucosa
0.0005 g
Rojo Fenol
0.0002 g
Lactato de Sodio
21.15 ul
CaCl2 Stock
0.3 ml
Preparacin:
- Aadir y disolver las sales una por una.
- Esterilizar el medio por filtracin.
- Rotular con nombre, volumen y fecha de preparacin.

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ANEXO - 3
PREPARACIN DE SOLUCIONES DE SALES STOCK
Solucin Stock CaCl2:
Disolver 0.6285 gramos en 50 ml de agua mili-Q.
Solucin Stock MgCl2:
Disolver 0.2490 gramos en 50 ml de agua mili-Q.
Gentamicina:
Disolver 0.05 gramos en 1 ml de agua mili-Q. Alicuotar segn la necesitad y
mantener en refrigeracin en frascos opacos.
L Glutamina:
Disolver 0.014 gramos en 1 ml de solucin salina estril 0.9%.
Gonadotropina Corinica Humana (HcG):
Disolver 0.005 gramos en 1 ml de TCM. Alicuotar y congelar.
Solucin Heparina Base:
Disolver 0.001 de heparina en 1 ml de TCM. Alicuotar y congelar.
Solucin Piruvato:
Disolver 0.011 gramos en 1 ml de Solucin salina 0.9%. Alicuotar y conservar en
congelacin.
Hormonas:
EDTA:
Disolver 0.0037 gramos en 1 ml de Solucin Salina Estril (0.9%)
Estradiol:
Disolver 0.0010 gramos en 1 ml de Etanol Absoluto. Almacenar a -20C en un
frasco opaco.
Hormona Folculo Estimulante (Folltropin):
Disolver 0.0005 gramos en 1 ml en TCM. Alicuotar en 20 ul y congelar.
Solucin Capacitante:
Solucin de Heparina:
En un tubo eppendorf colocar 5 ul de Solucin Heparina Base y 95 ul de FERTIL
Stock.

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Solucin de Hipotaurina:
Disolver 0.001 gramo en 10 ml de solucin salina 0.9%.
Solucin de Penicilamina:
Disolver 0.003 gramos en 10 ml de Solucin salina 0.9%.
Solucin de Epinefrina:
Disolver 0.0018 gramos en 40 ml de la Solucin Disolvente (77 ul Lactato de
Sodio, 0.05 g de metabisulfito sdico y 50 ml de agua).

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