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EQUIPAMIENTO ELECTROFORTICO
Para llevar a cabo una separacin electrofortica se necesitan los siguientes
elementos:
Fuente de alimentacin. Proporciona el campo elctrico mediante dos
electrodos, uno positivo (nodo) y otro negativo (ctodo) entre los que se
establece una diferencia de potencial.
Cubeta. Recipiente en cuyos extremos se sitan los electrodos.
Soporte electrofortico.
TIPOS DE SOPORTE
Se clasifican en dos grupos:
1) Soportes No Restrictivos Tipo I. El Tamao de poro no se opone al paso de
las molculas. El agar es el ejemplo ms representativo y se obtiene a partir de
algas marinas y est formado por dos tipos de polisacridos: la agarosa y la
agaropectina; sta ltima posee varios grupos cargados (grupos carboxilo y
sulfato), lo que la hacen inadecuada como soporte electrofortico por el efecto
electroendosmtico que produce. La agarosa se utiliza ampliamente sobre todo
para la separacin de cidos nucleicos y para el anlisis de protenas. Los diferentes
tipos de agarosas se caracterizan por su punto de fusin (entre 35-95C), su
resistencia fsica y el grado de electroendsmosis.
2) Ocurre interaccin entre las protenas y los hidroxilos de la celulosa del papel,
ocasionando que la migracin frene
*** Acetato de celulosa: se usa en anlisis de fluidos bilgicos,
fundamentalmente se emplea en corridas de corto tiempo y con cantidades
pequeas. La desventaja de usar este medio como soporte es que contiene algunos
grupos carboxlicos y sulfatos que pueden frenar la migracin
*** Geles: son polmeros de red tridimensional, se pueden usar geles de almidn,
poliacrilamidas, agarosa y agarosa-poliacrilamidas, de los cuales el ms usado es el
gel de poliacrilamida. Es una tcnica barata, fcil, rpida y eficaz para resolver
mezclas complejas de protenas.
*** Capilar: generalmente se usa un capilar de slica fundida que normalmente se
cubre con una capa de polimina para darle mayor rigidez y resistencia. Tiene una
ventaja y es que el capilar permite el pasaje de la luz UV de tal manera que la
visualizacin es on-line. Con esta tcnica descrita es posible separar cationes,
aniones, protenas, macromolculas y sustancias no cargadas en forma simultnea.
Las desventajas son que se requiere el uso de elevados voltajes, el costo es mayor
y la muestra debe ser en pequeas cantidades
Teido o tincin: suelen utilizarse colorantes orgnicos que interaccionen con las
protenas de forma poco selectiva, principalmente electrosttica. Entre esas
sustancias tenemos: azul brillante de Coomassie, negro amido, rojo Ponceau. Para
los cidos nucleicos se usa el azul de metileno, o ms frecuentemente,
compuestos fluorescentes e intercalantes como el bromuro de etidio. (Compuesto
intercalante: aquel que se introduce entre los pares de bases apilados del ADN).
Tras la electroforesis, el gel se sumerge en un recipiente con una disolucin del
colorante y se espera a que aqul se impregne y as el colorante se una a las
molculas separadas en el gel. Finalmente la observacin se puede realizar por
luz ultravioleta
2) Por transferencia
Western Blot: se emplea para que las protenas sean accesibles a la deteccin
por anticuerpos. Primero se transfieren las protenas desde el gel de
CRITERIOS DE SEPARACIN
1) Electroforesis Analtica: orientada a la bsqueda de propiedades de un solo
componente
2) Electroforesis preparativa: orientada a la separacin entre gran cantidad de
componentes
TIPOS DE ELECTROFORESIS
1) Electroforesis libre. El campo elctrico se aplica a disoluciones o suspensiones
(figura 1). Histricamente, es el origen de la electroforesis tal y como hoy la
conocemos y fue desarrollada por Arne Tiselius en 1937. Actualmente est en
desuso, ya que al ser un fluido el medio en el que se desarrolla, tiene poco poder de
resolucin.
Las molculas cargadas migran hacia los electrodos, aunque no bien separadas por
tratarse de una disolucin.
2) Electroforesis en zona. Es una de las tcnicas ms utilizadas en bioqumica y
biologa molecular por su elevada resolucin. El campo elctrico se aplica a un
medio o soporte estabilizante (en vez de a un fluido) y la muestra se deposita en
una reducida zona del mismo (figura 2). Con esta tcnica cada partcula migra de
acuerdo a su propia movilidad.
4) Isoelectroenfoque
Se trata de una variante de electroforesis en la que el gel (poliacrilamida) posee un
gradiente de pH fijado en su estructura. Esto se consigue incluyendo en su
preparacin molculas ionizables con valores de pH diferentes. Como consecuencia,
al avanzar los componentes de la muestra a lo largo del gel se encuentran en
entornos de pH diferente, y eventualmente alcanzan una regin en la cual el pH es
igual al punto isoelctrico de la molcula muestra (Pto. Isoelctrico: es el pH al cual
la carga neta de la protena es nula en un gradiente continuo de pH) y, en
consecuencia, sta detiene su avance. Se alcanza, pues, un equilibrio y se consigue
la separacin de los componentes de la muestra de acuerdo con su punto
isoelctrico, que adems se puede medir, pues se conoce el gradiente de pH del
gel.
5) Electroforesis Bidimensional
Es una sucesin de dos electroforesis distintas (o en distintas condiciones)
realizadas sobre una misma muestra. En la primera de ellas (primera dimensin) se
separan los componentes de la muestra segn un criterio (carga, tamao o pI), y en
la segunda (segunda dimensin) segn un parmetro distinto del anterior. De esta
manera, se combinan dos modos de separacin diferentes y se consigue el mximo
de resolucin posible mediante tcnicas electroforticas.
posibilita
que
haya
Por esta razn, las molculas globulares se mueven con mayor facilidad que las
elongadas, ya que la esfera presenta la mnima superficie a igualdad de volumen.
As, molculas del mismo tamao y carga, pero de diferente forma, pueden tener
una movilidad electrofortica diferente y ser, por tanto, separables mediante una
electroforesis.
Tampn. Durante una electroforesis, se produce una electrolisis del agua por
accin del campo elctrico, lo cual genera protones en la proximidad del nodo e
iones hidroxilo en el ctodo. El tampn es, por esta razn, esencial durante la
electroforesis para evitar que el nodo se acidifique y el ctodo se haga ms bsico,
pero no debe afectar a las molculas a separar.
Adems, la fuerza inica condiciona la movilidad electrofortica de las substancias a
separar, ya que influye en su esfera de solvatacin y en la conductividad de todo el
sistema, por lo tanto, es necesaria una fuerza inica suficiente para mantener el pH
y la conductividad durante todo el proceso, pero no muy elevada, ya que llegara a
interferir en el sistema.
Normalmente, se emplean tampones con fuerzas inicas moderadas (0.05-0.10M),
siendo el pH la caracterstica que debe ser ms controlada, puesto que determina la
carga de la muestra. Conviene sealar tambin que atendiendo a la distribucin del
tampn, los sistemas se clasifican en continuos cuando se emplea un nico tampn
en el proceso, y discontinuos cuando se emplean, al menos, dos tampones de pH y
composicin diferentes.
Soporte. La simple presencia del soporte en una electroforesis hace que se
presenten una serie de fenmenos de elevada trascendencia para el resultado del
proceso:
Adsorcin. Es una retencin inespecfica de las molculas de la muestra sobre el
soporte, por lo que afecta negativamente a la resolucin, ensanchando las bandas
de migracin.
Electroendsmosis (EEO). Es un fenmeno que se da en algunos soportes (sobre
todo en los no restrictivos de tipo I), en los que aparecen cargas negativas, debidas
a grupos carboxilo o sulfato, al estar en contacto con una disolucin inica.
Al aplicar el campo elctrico, los iones y las molculas se desplazan segn su carga,
pero en su migracin se encuentran con un flujo de cationes desplazndose sobre la
superficie del soporte y otro de aniones hacindolo por el centro de los poros (figura
6). Este flujo orientado se llama flujo electroendosmtico. El EEO va en contra de la
resolucin de una electroforesis, ya que las bandas de la muestra se ensanchan y
se distorsionan; sin embargo, la EEO contribuir a una mejor resolucin en las
inmunoelectroforesis y en la electroforesis
APLICACIONES DE LA ELECTROFORESIS
En este ejemplo, los patrones empleados son fragmentos bien conocidos, aquellos
obtenidos a partir del DNA del virus por la accin de las endonucleasas de
restriccin EcoRI e HindIII.
Isoenzimas
Las variantes de una enzima, con pequeas diferencias en su estructura y en su
actividad enzimtica, se analizan rutinariamente mediante electroforesis o, en
especial, mediante isoelectroenfoque. De hecho, los nombres de las isoenzimas
derivan a veces de su movilidad electrofortica. Se puede aplicar anlogamente a
las isoformas de protenas no enzimticas.
Mapas de restriccin
Una de las formas de estudiar la secuencia de los cidos nucleicos, en especial el
DNA, consiste en tratarlo con distintas enzimas de restriccin, analizar mediante
electroforesis en gel de agarosa los fragmentos resultantes e intentar reconstruir la
secuencia de la molcula original formando su mapa de restriccin, uno de los tipos
de mapa fsico.
Secuenciacin de cidos nucleicos
La obtencin de la secuencia completa, nucletido a nucletido, tambin depende
del anlisis electrofortico de fragmentos de DNA, tanto en el mtodo qumico de
Maxam y Gilbert como en el mtodo enzimtico de Sanger. Se utilizan en este caso
Aplicaciones 2
La principal aplicacin es la caracterizacin y anlisis cuantitativo de molculas
biolgicas, principalmente protenas, pptido y aminocidos.
Tambin encuentra aplicacin para la separacin de otras sustancias bioqumicas
(insulina, histonas, fibringeno, lipoprotenas, enzimas)
La aplicacin de los geles de poliacrilamida en electroforesis es en la separacin de
molculas circulares y lineales de DNA.
Aplicaciones
El explosivo avance de la electroforesis capilar se ha extendido al rea biomdica,
en el campo de las protenas, pptidos, ADN, anlisis de lquidos de perfusin,
monitoreo de drogas, marcadores genticos tumorales y neurobioqumicos, drogas
xenobiticas, de abuso, y pericias forenses.
En el rea biofarmacutica, para el control de calidad de productos farmacuticos y
biotecnolgicos, quimioterpicos y de estructura quiral.
En el rea de alimentos, se le aplica al fraccionamiento y cuantificacin de
aminocidos, hidratos de carbono, cidos orgnicos, aditivos y contaminantes.
En el rea de control ambiental, permite la identificacin de contaminantes y sus
metabolitos, pesticidas, metales pesados e hidrocarburos.
Como todo desarrollo de un rea analtica nueva, la incorporacin de tcnicas
acopladas como la espectroscopia de masa, fluorescencia inducida por lser y otras
variantes permiten augurar un promisorio futuro.