TRADUCCION N 1

Abra Acceso Library Journal

Cmo citar este artculo: Darsa, K.V. y Thatheyus, A.J. (2014) La biodegradacin del
Compuesto Petrleo Usando Pseudomonas aeruginosa. Abra Acceso Library Journal, 1:
E735. http://dx.doi.org/10.4236/oalib.1100735

BIODEGRADACIN DE COMPUESTO DE PETRLEO USO DE

PSEUDOMONAS AERUGINOSA
K. V. Darsa1, A. Joseph Thatheyus2 Departamento de Inmunologa y Microbiologa, El
Colegio Americano, Madurai, India 1PG 2PG e Investigacin del Departamento de
Zoologa de la universidad americana, Madurai, India Email: jthatheyus@yahoo.co.in
Recibido 16 de mayo 2014; revisado 26 de junio 2014; aceptado 16 de agosto 2014
Copyright 2014 por los autores y OALib.
Este trabajo est licenciado bajo la Licencia Creative Commons Reconocimiento
Internacional (CC BY). http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/

Resumen
El presente estudio se realiz para determinar la biodegradacin de la gasolina por
Pseudomonas aeruginosa aislado de gasolina contaminada del suelo. La cepa
aislada fue capaz de crecer en un mnimo caldo junto con 2,5%, 5%, 7,5% y 10%
concentraciones de gasolina que indicaba la capacidad del organismo en la
degradacin de la gasolina y la utilizacin como fuente para el crecimiento. La
eficiencia de la cepa aislada se determin mediante el anlisis de los parmetros
de pH, densidad ptica y CO2 liberado durante la degradacin de la gasolina.
Cromatografa lquida de alta resolucin (HPLC) anlisis tambin confirm la la
degradacin de la gasolina por Pseudomonas aeruginosa.
Palabras clave
Biodegradacin, Hidrocarburos, Pseudomonas aeruginosa, Gasolina
Materias: Ciencias del Medio Ambiente, Microbiologa
1. Introduccin
Productos a base de petrleo son la principal fuente de energa para la industria y
la vida diaria. Fugas y derrames accidentales ser peridicos en la exploracin,
produccin, refinacin, transporte y almacenamiento de petrleo y derivados
productos. La cantidad de filtracin natural crudo se estim en 600.000 toneladas

mtricas por ao con un rango de incertidumbre de 200 mil toneladas mtricas por
ao [1]. Hidrocarburos aromticos policclicos (HAP) son importantes
contaminantes que se introducen en el medio ambiente a travs de diferentes
formas, tales como las actividades antropognicas, combustin, la descarga no
deseada de los petroleros, los derrames alrededor de las refineras de petrleo y
las instalaciones de la planta de gas [2] - [4]. Hidrocarburos se consideran ser de
origen biolgico, ya que los hidrocarburos de cadena corta o larga (alcanos: C10 C20; C20 - C40) parecen ser exclusivamente el origen de los procesos biolgicos
[5]. Estos compuestos tienen propiedades txicas, cancergenas y mutagnicas [6]
[7] y son considerados como un peligro grave para la salud humana y medio
ambiente [8] - [12]. El uso de microorganismos para reducir la contaminacin de
petrleo a travs de la biorremediacin tiene K. V. Darsa, A. J. Thatheyus OALibJ |
DOI: 10.4236 / oalib.1100735 02 de agosto 2014 | Volumen 1 | E735 ha
demostrado que es viable, costo relativamente bajo, el enfoque de baja tecnologa
y est ms extendido de lo qumico y tratamientos fsicos [13].
Ha habido una amplia evidencia sobre la degradacin microbiana de los
hidrocarburos del petrleo [14]. Desde la biodegradacin de hidrocarburos de
petrleo es un proceso natural controlado por la temperatura, el pH y la escasez
de nutrientes como el N y el P [15] [16], la biorremediacin es un mtodo viable y
prometedor para la limpieza y reparacin de hidrocarburos ambiente contaminado
[17]. Las bacterias son los agentes ms activos en la biodegradacin del petrleo
y no hay evidencia de su fundamental papel como degradadores primarios de
aceite derramado [18] - [20]. Efecto de diversos nutrientes en la degradacin de
petrleo crudo por diferentes bacterias se investig por varios cientficos [21] [23]. Varios factores, tanto fsico-qumicas y biolgicas, afectar la tasa de
degradacin microbiana de hidrocarburos en el suelo. Recientemente, el creciente
inters en el uso de varios Pseudomonas durante la degradacin del petrleo
crudo se han comunicado [24] - [28]. Sin embargo, la aplicacin de diseo
experimental estadstico para la optimizacin de la degradacin del aceite crudo
con Pseudomonas sp. Rara vez se investigaron. Recientemente, la optimizacin
del medio para una novela de crudo lipasa degradante de Pseudomonas
aeruginosa Se inform SL-72 utilizando mtodos estadsticos para la
biorremediacin de petrleo crudo [29]. ZoBell [30] inform de que cerca de cien
especies de bacterias, lo que representa treinta microbiana gneros, tena
hidrocarburos propiedades oxidantes. Se haban encontrado muchas especies y
gneros de tener esta capacidad [31]. El hetertrofos microorganismos que se
encuentran en el suelo incluyen poblaciones de origen natural que tienen la
capacidad de degradar petrleo productos especies de Pseudomonas,
Arthrobacter, Alcaligenes, Corynebacterium, Flavobacterium, Achromabacter,

Micrococcus, Nocardia, Mycobacterium y parecen ser el hidrocarburo ms aislado

consistentemente bacterias degradantes del suelo [32]. El presente trabajo est
diseado para aislar cepa bacteriana capaz de degradar contaminantes del aceite
y poner a prueba su eficacia de la degradacin de gasolina.
2. Materiales y Mtodos
Para el aislamiento de gasolina eficiente degradar cepa bacteriana, las muestras
de suelo se obtuvieron de literas de gasolina y automviles talleres alrededor de
Madurai en recipientes estriles y se llevan al laboratorio de inmediato [33]. tal
muestras de suelo fueron sometidos a dilucin en serie hasta 10-7 de dilucin [34].
Desde 10-5 y 10-6 de dilucin, 0,1 ml fue tomada y propagacin en placas sobre
Bushnell Hass medio de sal mineral (sulfato de magnesio 0,2 g, cloruro de calcio
0,02 g, fosfato monopotsico 1 g, fosfato dipotsico 1 g, 1 g Nitrato de amonio y
cloruro frrico 0,05 g en un litro) que contiene 2,5% de la gasolina [35]. Estas
placas de Petri se incubaron a 37 C durante 24 horas. Entre las colonias
desarrolladas, se seleccion una colonia bacteriana para estudios posteriores. La
cepa bacteriana seleccionada fue sometido a la tincin y otras pruebas
bioqumicas como MR, VP, Indol Gram, Catalasa, citrato, Licuefaccin de la
gelatina, celobiosa, lactosa, maltosa, sacarosa, D-xilosa, trehalosa, sorbitol,
Utilizacin de malonato, D-arabinosa y glicerol para la identificacin de la adopcin
de Bergey Manual [36]. Para probar la eficacia de biodegradacin de la cepa
bacteriana aislada, 100 ml de caldo mnimo (Dextrosa 1 g, sulfato de amonio 1 g,
0,7 g Fosfato dipotsico, fosfato monopotsico 2 g, Citrato de sodio 0,5 g, y sulfato
de magnesio 0,1 g) que contiene 2,5%, 5%, 7,5% y 10% las concentraciones de
gasolina por separado en 250 ml
Se prepararon matraces Erlenmeyer. A cada matraz, un inculo ml del cultivo puro
de la cepa aislada durante la fase logartmica se aadi. Los frascos de cultivo se
incubaron en un agitador a 30 C a 100 rpm. Despus 4, 8, 12 y 16 das de
tratamiento, el pH, la densidad ptica (OD) y el CO2 se determinaron para cada
concentracin de gasolina [37] [38].
El pH del medio se estim usando un medidor de pH despus de cada cuatro das
de tratamiento. La densidad ptica del medio de cultivo se determin a 600 nm
despus de 0, 4, 8, 12 y 16 das de tratamiento. Para la estimacin de CO2 Un ml
fue tomada de cada concentracin de gasolina el medio de cultivo despus de 4,
8, 12 y 16 das de tratamiento y tratado contra solucin 0,05 N de NaOH, el
indicador utilizado fue fenolftalena y la aparicin de color rosado Era el punto final.
El uso de la siguiente frmula se calcula la cantidad de CO2 [33].

CO2 (mg/) = Titre value Normality of NaOH x 1000 x44

Titre value Normality of
Para el anlisis de HPLC, el caldo fermentado de la cepa bacteriana de la
concentracin de gasolina 10% y el control se tomaron despus de 16 das de
tratamiento y se administraron para anlisis por HPLC en CECRI, Karaikudi
(Modelo- Shimadzn, Bomba-LC-20 AD, PDA detector-SPDM 20A y Inyeccin-20 l)
[39]. Los parmetros de pH, ptico densidad y CO2 fueron sometidos a dos
anlisis de varianza (ANOVA) utilizando MS Excel. Las variaciones fueron K. V.
Darsa, A. J. Thatheyus OALibJ | DOI: 10.4236 / oalib.1100735 03 de agosto 2014 |
Volumen 1 | E735 considerado estadsticamente significativo slo cuando el valor
F calculado es mayor que el valor F tabulada en P es menos de o igual al 0,05
[40].
3. Resultados y Discusin
Sobre la base de las pruebas bioqumicas, la cepa bacteriana aislada se identific
como Pseudomonas aeruginosa. Fue un bacilo Gram negativo que presenta
resultados positivos a citrato, catalasa, licuefaccin de gelatina, Malonato y glicerol
pruebas. Se observaron resultados negativos para la reaccin de Gram, indol, rojo
de metilo (MR), Voges Proskauer (VP), celobiosa, Lactosa, maltosa, sacarosa, Dxilosa, trehalosa, sorbitol y pruebas de D-arabinosa (Tabla 1).
Figura 1 divulga los cambios en el pH registrados despus de 4, 8, 12 y 16 das de
tratamiento con Pseudomonas aeruginosa hasta 8 das de tratamiento, la
disminucin en el pH se observ en toda la concentracin de gasolina, excepto
7,5%, indicando la formacin de cidos orgnicos despus de la degradacin de
gasolina. Despus de 8 das de tratamiento el nivel de pH se increment en todas
las concentraciones de gasolina fue notado debido a la degradacin de gasolina.
Los cambios en la densidad ptica durante el tratamiento de la gasolina por
Pseudomonas aeruginosa se ilustran en la figura 2. Aumento de los valores de
densidad ptica durante el perodo inicial del tratamiento se observ. Pero
despus, hay se observ un descenso y la densidad ptica mxima a la
concentracin de la gasolina un 7,5% despus de ocho das de tratamiento.
La Figura 3 muestra los cambios en el nivel de CO2 en el medio de cultivo durante
el tratamiento de la gasolina por Pseudomonas aeruginosa. La degradacin
Gasolina result en la produccin de CO2, que mostr un aumento lineal con el
aumento en la concentracin de gasolina. Se observ ms alto nivel de CO2 en un

10% de gasolina despus de ocho das de tratamiento. Liberacin de CO2 mostr

el incremento durante el periodo inicial y posteriormente se mantuvo en el nivel
asntota excepto el 5% concentracin de gasolina.
Tabla 1. Pruebas bioqumicas utilizadas para la identificacin del microorganismo
Aislado.
Muestra N

hay pruebas bioqumicas

Pseudomonas aeruginosa

Carcter Colonia

Tamao Colonia

mediano

Tipo de clula

Rod

reaccin Gram

prueba MR

Prueba de 6 VP

prueba Indol

Prueba de catalasa

prueba Citrato

10

Gelatina Licuefaccin

11

Celobiosa

12

Lactosa

13

Maltosa

14

La sacarosa

15

D-xilosa

16

La trehalosa

17

Sorbitol

18

Malonato

19

D-arabinosa

20

Glicerol

Nota: + Positivo; - Negativo.

+
+

K. V. Darsa, A. J. Thatheyus
OALibJ | DOI: 10.4236 / oalib.1100735

04 de agosto 2014 | Volumen 1 | E735

Figura 1. Cambios en el pH durante la degradacin de la gasolina por

Pseudomonas aeruginosa.

Figura 2. Densidad ptica de varias concentraciones de gasolina durante la

degradacin por Pseudomonas aeruginosa.

Figura 3. Dixido de carbono liberado durante la degradacin de la gasolina por

Pseudomonas aeruginosa.
Informe cromatogrfico de anlisis de la concentracin de gasolina de control que
tiene el 10% sin inculo se exhibe en la Figura 4. En esto, slo dos picos se
observaron con el tiempo de retencin de 1,933 y 2,247 minutos. La Figura 5
ilustra el informe de anlisis de HPLC para la concentracin de gasolina 10% de
los tratados con Pseudomonas aeruginosa durante diecisis das. En este sentido,
tanto los picos observados en el control faltaban pero varios nuevos picos con
diferente tiempo de retencin fueron apareciendo lo que indica la degradacin de
la gasolina en varias intermedios.
Tabla 2 divulga el anlisis de dos vas de la varianza para los parmetros, el pH,
densidad ptica y CO2 con la variables de perodo de tratamiento y concentracin
de gasolina. Las variaciones debidas a la concentracin de la gasolina fueron
estadsticamente
K. V. Darsa, A. J. Thatheyus OALibJ | DOI: 10.4236 / oalib.1100735 05 de agosto
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Tabla 2. Anlisis de dos vas de varianza de los factores con las variables, perodo
de tratamiento y concentracin de gasolina para P. aeruginosa.
Factor Fuente de variacin df MS Calculado Tabla valor F valor F

Nivel de importancia

pH Perodo de tratamiento

0.257

13.056

3.862548

Significativo

Concentracin Gasolina

0.425

2.154

3.862548

No significativo

Perodo de tratamiento

0.006

2.390

3.259167

No significativo

Densidad Concentracin Gasolina 3 0.013

5.448

3.862548

Significativo

ptica

4.636

3.862548

Significativo

3.863

3.862548 S

significativo

Perodo de tratamiento 3 68.566,67

El dixido de carbono
Concentracin Gasolina 3 237.966,7

Figura 4. HPLC informe de anlisis para el 10% de Gasolina (control).

Figura 5. HPLC informe de anlisis para el 10% de la gasolina tratada con

Pseudomonas aeruginosa durante 16 das. Significativa para la densidad ptica y
CO2, mientras que ellos no fueron estadsticamente significativas debido al
perodo de tratamiento. Variaciones debido al perodo de tratamiento fueron
significativas para el pH, pero no fueron significativos debido a la concentracin de
gasolina.
K. V. Darsa, A. J. Thatheyus OALibJ | DOI: 10.4236 / oalib.1100735 06 de agosto
2014 | Volumen 1 | E735
La degradacin ms rpida y completa de la mayora de los contaminantes
orgnicos se produce en virtud de aerbico condiciones [41]. El ataque intracelular
inicial de contaminantes orgnicos es un proceso oxidativo y la activacin como
as como la incorporacin de oxgeno es la reaccin enzimtica catalizada por la
clave oxigenasas y peroxidasas. Perifrico vas de degradacin de contaminantes
orgnicos convertir paso a paso en los intermedios del intermediario central de
metabolismo, por ejemplo, el ciclo del cido tricarboxlico. Biosntesis de biomasa
celular se produce desde el centro metabolitos precursores, por ejemplo, acetilCoA, succinato y piruvato. Azcares requeridos para diversas biosntesis y el
crecimiento son sintetizados por la gluconeognesis. Los microorganismos
implicados en la degradacin del aceite estn ampliamente distribuidos en la
naturaleza y se han aislado del suelo y el agua con sus potenciales degradantes
del petrleo [42]. Los microbios capaces de utilizar el petrleo y sus productos
como nica fuente de carbono y energa ocurrir prcticamente en todas partes en
el aire, agua y suelo [43]. Se estima que en un gramo de suelo no contaminado,
hay slo 100 a 1.000 clulas de microorganismos que degradan hidrocarburos,

mientras que, en un gramo de suelo contaminado por el petrleo, su nmero

aumenta a 1 x 106 a 5 x 107 clulas, sobre todo si la contaminacin ocurrido
repetidamente y durante mucho tiempo [44]. Caractersticas taxonmica de estos
aislados los identificaron como Bacillus sp., Staphylococcus sp., Micrococcus sp.,
Pseudomonas sp., Psychrobacter sp., y Alcaligens faecalis [45]. Micrococcus,
Staphylococcus, tambin se inform de Pseudomonas putida y Alcaligenes para
degradar gasleo [46].
La tasa de biodegradacin de petrleo crudo en el suelo fue rpida y que podra
ser debido a los microorganismos en el suelo que tiene la eficiencia en la
utilizacin del aceite crudo residual como fuente de carbono y energa [47]. El
petrleo crudo contiene hidrocarburos y no resiste el ataque de microorganismos.
El hidrocarburo utilizando microorganismos aislados desde el suelo fueron
especies de Bacillus, Lactobacter, Arthrobacter, Pseudomonas, Micrococcus,
Zoopage, y Articulosporium. Bacillus sp. Predominado, especialmente en el suelo
contaminado petrleo crudo. Esto puede ser debido a la capacidad de estos
organismos para producir esporas, que puede protegerlos de los efectos txicos
de los hidrocarburos [48]. Sin embargo, la degradacin bacteriana de aceite es
ms significativo (80%) que los hongos (20%) [49] [50]. El gnero Pseudomonas y
Bacillus, en particular, han sido objeto de numerosos estudios. La Pseudomonas
sp es uno de los mejores degradadores de petrleo crudo. Pseudomonas se
denomina como aceite Comer Bug en la industria de petrleo crudo. Un
interesante y caracterstica til de muchos Pseudomonas sp. Es su capacidad de
utilizar una amplia variedad de sustratos orgnicos para crecimiento. La bacteria
invade el aceite crudo que consiste en rica fuente de compuestos orgnicos
adecuados para la el crecimiento de esta bacteria y produce biotensioactivos que
limpian el crudo [51]. Pseudomonas aeruginosa mostr la capacidad degradantehexadecano ms excelente a pH 7,0. diferencia en la capacidad de Pseudomonas
aeruginosa en biodegradarse n-hexadecano a diferentes valores de pH podra no
relacionado slo a su papel en el proceso del metabolismo de hidrocarburos, sino
tambin a la diversidad microbiana y su actividad bajo las condiciones cidas,
neutras o alcalinas [52]. En este pH estudio mostr un aumento en todas las
concentraciones y el ms alto pH se observ para la concentracin de gasolina
7,5%.
Los microorganismos se consideran biodegradables eficientes debido a su
abundancia, la amplia variedad de especies, y su versatilidad catablica y
anablica, as como su capacidad para adaptarse a las condiciones ambientales
adversas. A travs de la actividad metablica de estos microorganismos, los
contaminantes orgnicos se pueden transformar en agua, CO2 y la biomasa [53].

La degradacin completa de un compuesto a sus componentes minerales, en la

que el carbono orgnico del compuesto se convierte en CO2 por la respiracin,
que se llama mineralizacin. Cuando se mantienen las condiciones aerbicas,
Evolucin de CO2 puede ser utilizado como una medida de la actividad metablica
microbiana con una precisin razonable [54].
Los estudios que incluyen la medicin de la tasa de mineralizacin pueden
proporcionar informacin importante sobre el biodegradabilidad de los compuestos
de residuos industriales, incluyendo residuos de aceite. En este estudio cambios
en el pH, CO2 y celular crecimiento indican indirectamente la degradacin de la
gasolina. La disminucin inicial en el pH puede indicar la formacin de cidos
orgnicos como resultado de la degradacin de la gasolina por P. aeruginosa. Las
concentraciones ms altas de gasolina, durante el perodo inicial de tratamiento
mostraron un aumento en la biomasa confirmando el aislado es capaz de exhibir
un crecimiento por romper los hidrocarburos del petrleo. Este tambin se
confirma por el aumento de la liberacin de dixido de carbono, que puede ser un
producto de la degradacin de la gasolina.
El anlisis por HPLC tambin ofrece una confirmacin adicional exhibiendo nuevos
picos que representan los metabolitos de la gasolina degradacin. El patrn de
degradacin de los microorganismos mostr que primero atacaron el hidrocarburo
inferior y superior cadenas y los de longitud media fueron atacados ms tarde en
el curso de la incubacin. Considerable informacin sobre las la degradacin
microbiana est disponible en la literatura, pero menos se sabe sobre la
biodegradabilidad de algunos Petrk. V. Darsa, A. J. Thatheyus OALibJ | DOI:
10.4236 / oalib.1100735 07 de agosto 2014 | Volumen 1 | E735 productos
comerciales Leum como el queroseno [55]. El mecanismo dominante que
descompone estos petrleo productos es la biodegradacin, que se lleva a cabo
por la poblacin microbiana natural, [56]. En el presente estudio Pseudomonas
aeruginosa es capaz de degradar la gasolina que se utiliza como fuente de
carbono y energa.
4. Conclusin
La degradacin de la gasolina por el aislado, Pseudomonas aeruginosa se
encontr que era ms eficiente. Esto se evidencia por los cambios en el pH, el
aumento en la densidad ptica y CO2 liberado. Aparicin de nuevos picos en el
El anlisis de HPLC confirma el proceso de degradacin. Por lo tanto, el aislado
tiene la capacidad de tolerar las concentraciones de gasolina y crecer en ellos. Por
lo tanto esta cepa se puede emplear como agente de biorremediacin y se utiliza
en la restauracin del ecosistema contaminado con aceite.

Agradecimientos
Los autores agradecen a las autoridades de la universidad americana de las
instalaciones y el estmulo.

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