PRCTICA N 13

DETERMINACIN DE Clostridium botulinum, Clostridium perfringens

I. INTRODUCCIN:
El gnero Clostridium Son bacilos anaerobios grandes, grampositivos, mviles.
Descomponedores de protenas y/o formadores de toinas. Son saprofitos !suelo, tracto
instestinal". #lgunos patgenos causan botulismo, ttanos, gangrena gaseosa y colitis
seudomembranosa. Entre las especies m$s importantes en alimentos son:
Clostridium botulinum,
#naerbico estricto, mvil, esporas subterminales son muy resistentes, resisten %&&'C ( a )
*oras. Causa el botulismo y se distribuye en todo el mundo. Se encuentra en el suelo y en
*eces de animales.
Clostridium botulinum, es un microorganismo muy distribuido en el suelo, a veces en aguas
dulces y marinas y est$n implicados en muc*os alimentos, asociados fundamentalmente a la
carne y productos c$rnicos, sometidos a procesos de conservacin o enlatado caseros como
por e+emplo el +amn a*umado, magro de cerdo, pats y embutidos !el nombre de botulismo
deriva del latn ,botulus- . embutido". /a toina se genera en los alimentos mal procesados,
0ue no cumplen las condiciones de anaerobiosis, enlatados o con poca acide1 o alcalinidad, y
en alimentos pasteuri1ados y tratados inapropiadamente, no conservados en refrigeracin, en
particular en envolturas *ermticas. /a Ebullicin destruye las toinas pero no las esporas.
/os peces tambin se pueden contaminar con C. botulinum, especialmente por el tipo E, en el
medio acu$tico y de a0u 0ue los productos ahumados derivados del pescado *ayansido
responsables de varios brotes de botulismo.
/a contaminacin del sueo es un origen importante de C. botulinum eistente en los
alimentos y constituye un origen al 0ue est$n inevitablemente epuestas las horta!"as, de
modo especial los cultivos de ra#ces y $u$os, como por e+emplo platos preparados de
e%saadas de patatas coc!das !parcialmente", e%saadas de horta!"as pree%&asadas, etc...
En los brotes de botulismo se pueden descubrir cuatro caractersticas corrientes:
%. El alimento *a sido contaminado, en el origen o durante su tratamiento, con esporas o
con clulas vegetativas de C. botulinum.
2. El alimento recibe alg3n tratamiento 0ue restringe la microflora competitiva y en
circunstancias normales, tambin debera controlar a C. botulinum.
(. /as condiciones eistentes en el interior del alimento !p4, E*, #5" son apropiadas para
el crecimiento de este microorganismo.
6. El alimento se consume fro o despus de un tratamiento suave 0ue es insuficiente para
inactivar la toina.
7uesto 0ue los a!me%tos e%atados poco 'c!dos pueden satisfacer todos los criterios
anteriores, para garanti1ar su inocuidad, en la industria del enlatado *a sido necesario
implantar rigurosas medidas de control del tratamiento. Sin embargo, cuando los alimentos
enlatados se preparan como actividad domstica en pe0ue8a escala !*ortali1as embotelladas o
enlatadas", la mayor variabilidad y el control menos riguroso del tratamiento al 0ue se
someten son evidentemente origen de problemas sanitarios de importancia.
El botulismo en los seres *umanos es una enfermedad rara pero grave causada por la ingestin
de to(!%as pre)ormadas producidas por Clostridium botulinum. De los 9 tipos de toina !# a
:" reconocidos de Clostridium botulinum producen $otu!smo e% e ser huma%o as cepas
A* +* E* , !rara ve1". /os tipos de C. botulinum se distinguen por el tipo antignico de la
toina producida. # y ; vinculados con alimentos, E productos de pesca, normalmente se
relacionan con consumo de pescados y mariscos.. C ,cuello blando- en aves. D, botulismo en
mamferos. /as toinas botulnicas !neurotoinas", 0ue afectan a los %er&!os co!%-r.!cos de
/NP !sistema nervioso perifrico" llegando a producir par'!s!s )'c!da.
/os sntomas aparecen entre las < *oras y los < das despus de ingerir el alimento con
toinas, aun0ue lo m$s normal es a las %2 o 6< *oras. 01m!tos* co%st!pac!1%* rete%c!1% de
or!%a* &!s!1% do$e* d!)!cutad e% a de.uc!1%* d!s)a.!a* se2uedad de $oca 3 d!)!cutad e%
e ha$a o d!s)o%#a. Suele *aber casos mortaes por par'!s!s resp!rator!a o card!aca cuyo
porcenta+e est$ entre el 2& = )& > !tasa de mortalidad alta". ?arda < meses en curarse.
Clostridium perfringens
;acilos gruesos, rectos, inmviles, esporas ovales levemente deformantes relativamente
aerotolerante, forma c$psula en te+idos y algunos medios, *emolticos, gasgenos, lic3an
gelatina $cido y gas de carbo*idratos *emlisis calor@fro, fermentacin ,tormentosa de la
lec*e- !coagulacin y disrupcin", producen cuatro toinas mayores: , , y : protenas,
termol$biles, accin en1im$tica, antignicas, dan tooides.
Est$ ampliamente distribuido en la atmsfera y se *alla frecuentemente en el intestino *umano
y de muc*os animales domsticos y salva+es. /as esporas de esta bacteria est$n presentes en el
suelo, sedimentos y $reas su+etas a la polucin fecal por *umanos y animales. /a enfermedad
transmitida por Cl. perfringens se describe como e%&e%e%am!e%to per)r!%.e%s de a!me%tos.
Es uno de los microorganismos m$s difundidos por la super)!c!e terr'2uea, e% sueo, a.uas
%aturaes, co%te%!do !%test!%a y car%es crudas de mam#)eros y a&es.
A!me%tos asoc!ados* /as carnes y derivados y los caldos de carne sometidos a un tratamiento
trmico defectuoso. /a preparacin de alimentos para colectividades !como escuelas,
cafeteras, *ospitales, alo+amientos, penitenciaras, etc." es la causa m$s com3n de
intoicacin por Cl. perfringens, y ocurre cuando una gran cantidad de alimentos se preparan
con muc*a anticipacin.
II. O+4ETI0O/5
Determinar la presencia de C. botulinum en alimentos enlatados !at3n" y alimentos
!pescado fresca o salado".
Determinar la presencia de C. perfringens en muestra de agua.
III. MATERIA6E/5
Mater!a de a$orator!o5
@ ?riturador mec$nico
@ Centrifuga ! %&&& = 2&&& rpm" refrigerada
@ ?ubos de centriguga !pl$stico"
@ 7ipetas
@ #gu+as *ipodrmicas
@ Solucin salina fisiolgica estril
@ ;a8o maria
@ ?ubos de dilucin
Aedios:
@ Aedio Bobinson o ?ripticasa glucosa !para C. botulinum"
@ Aedio Cilson ;lair. !para C. perfringens"
@ Diluyente Solucin de Binger !para C. perfringens" en caso de muestra de
alimentos.
@ #gar clostridium.
Mater!a $!o1.!co5
@ Batones
Muestra5
@ #gua de po1o
@ 7escado salado
@ /ata de at3m
I0. PROCEDIMIENTO5
7.1 PROCEDIMIENTO PARA C. botulinum
/e rea!"a u%a prue$a e(porator!a* para !%&est!.ar a to(!%a.

Muestra a!me%to e%atado 8atum95 la lata del at3n debe estar *inc*ada.
?riturar el alimento.
4omogeni1ar el alimento con solucin salina en un proporcin %:%.
Centrifugar el *omogeni1ado en centrifuga refrigerada.
Etraer el sobrenadante y colocar en dos tubos, y luego inyectar a ratones por va
intraperitoneal.
@ # un tubo someter a ba8o mara por %& min e inyectar &.) ml a un ratn.
@ # otro tubo sin someter a ba8o mara inyectar directamente &.) ml a otro ratn.
Dbservar a los animales por 6 das.
Sntomas:
@ 7ar$lisis motora progresiva en 6 = ) *oras
@ #bdomen retrado
@ Bespiracin dificultosa
@ #lta debilidad
:eneralmente la muerte del animal se da por la toina tipo E, es la m$s letal
produciendo la muerte del animal en 26 *oras. Si *ay demasiada toina la muerte
es r$pidamente.
A!sam!e%to.
Etili1ar el medio Boberson !carne cocida" o medio ?ripticasa glucosa. !%&ml"
Embuir el alimento en tres tubos diferentes % o 2 gramos del alimento !atum".
El tubo debe contener %& m l !?ripticasa glucosa".
El %' tubo no calentar, al 2' calentar a F&'C G %& min y el (' a <&'C (& min.
Hncubar.
Dbservar la presencia de turbide1 y gas. I tambin observar al *idrlisis de las
protenas en la carne
7.1 PROCEDIMIENTO PARA C. perfringens (sulfito reductores)
Muestra5 agua de po1o.
Etili1ar ) tubos, a cada tubo agregar 6 ml de medio Cilson ;lair !a este medio se
le agrega una solucin sulfito ferrosa.J solucin sulfito sdico %gJ solucin
alumbre frrico !6 gotas" y agua destilada %& ml
/uego calentar la muestra en ba8o mara a <& 'C %&min y agregar a cada tubo
del medio % ml de muestra. /o normal es utili1ar 2& ml de medio y ) ml de
muestra.
Hncubar los tubos a (9'C 6< *oras.
Beali1ar la lectura:
@ Colonias negras en la profundidad indica Clostridium sulfito reductores,
El resultado se epresa:
Esporas de costr!d!um su)!to reductores ( 1:: m de a.ua
Para a!me%tos5 Muestra5 7escado salado !guitarra"
Dbtener el pescado salado, y agregar a un frasco con solucin de Binger o agua
peptonado.
Beali1ar diluciones *asta %&
@(
empleando la solucin de Binger o agua peptonada
Sembrar en profundidad en #gar Clostridium.
Hncubar en anaerobiosis
0. RE/U6TADO/5
PARA C. botulinum
@ Despus de *aber inoculado la muestra centrifugada de atun al ratn, no se
observ ning3n sntoma.
@ 7ara el aislamiento: en medio ?ripticasa glucosa se observ el siguiente
resultado:
@
PARA C. perfringens (sulfito reductores)
Muestra5 agua.
Despus de *aber incubado los tubos a (9'C 6< *oras, se observ presencia de
gas en todos los tubos
Se sembr en agar sangre: observ$ndose colonias con presencia de *alos.
Para a!me%tos5 Muestra5 7escado salado !guitarra"
%' ?E;D
CDK :#S
2' ?E;D
SHK :#S
(' ?E;D
SHK :#S
D
&
C
D
&
C
F&
&
C
F&
&
C
<&
&
C
<&
&
C
Despus de *aber sembrado en profundidad en agar Clostridium se observ el
siguiente resultado:
Ko se observaron colonias negras.
0I. CONC6U/IONE/5
Despus de *aber inoculado la muestra centrifugada de at3n al ratn no se observ
ning3n sntoma, pues esto 0uiere decir 0ue el alimento est$ apta para consumo
*umano.
Se logr identificar Clostridium sp. por la morfologa observada.
0II. CUE/TIONARIO5
1. L7ruebas bio0umicas para C. botulimunM
%&
@%
%&
@2
%&
@(
;. L7ruebas bio0umicas para C. perfringensM
?ambin *idroli1an la gelatina y la lecitina
3. Como se reali1a la anaerobiosis en C. perfringens !mtodos"
/as +arras para anaerobiosis se emplean principalmente para cultivos en placas. /a atmsfera
anaerobia en el interior de estas +arras se puede conseguir seg3n varios procedimientos:
A9 T<CNICA DE E0ACUACION=REEMP6A>O5
En este procedimiento se precisa primero crear el vaco mediante una bomba de vaco y una
ve1 *ec*o sto se introducir$ la me1cla gaseosa 0ue nos permite controlar si se *a producido o
no la atmsfera anaerobia.
+9 T<CNICA ?UE EMP6EA UN /I/TEMA @ENERADOR DE A; B CO;5
En este sistema utili1aremos:
N :enerador descartable de 42@CD2, 0ue consiste en una envoltura sellada de papel de
aluminio.
N Hndicador de anaerobiosis: los *ay de tipo bacteriolgico y 0umico.
/os bacteriolgicos consisten en introducir en la +arra un cultivo de un aerobio estrictoJ si ste
crece, indica un fallo en el establecimiento de la atmsfera de anaerobiosis.
N Catali1ador en ,fro-: consta de unas bolitas de al3mina recubiertas de paladio. por las
bacterias.
C9 T<CNICA ?UE EMP6EA UN /I/TEMA @ENERADOR DE CO;5
En este sistema se utili1a el generador descartable de CD2 y un indicador de anaerobiosis
!igual al descrito anteriormente."
El generador descartable de CD2 consiste en un sobre 0ue contiene como principio activo el
$cido ascrbico. Cuando este sobre se coloca en una +arra cerrada, el ogeno atmosfrico de
la +arra es r$pidamente absorbido con la generacin simult$nea de diido de carbono. Este
mtodo difiere del anterior en 0ue la reaccin contin3a sin produccin de *idrgeno, y por
tanto no re0uiere un catali1ador. ?ampoco es necesaria la adicin de agua para activar la
reaccin.

/a temperatura ptima de incubacin para la mayora de los patgenos *umanos est$ prima
a la corporal !()@(9' C", pero eisten variaciones. #lgunos no pueden soportar esta ?O, y otros
tienen un margen m$s amplio. Determinados *ongos y levaduras dermatofitos, crecen me+or a
temperatura ambiente, prima a los (&'C.
Es muy importante 0ue la ?O de incubacin se mantenga en los lmites establecidos durante
todo el proceso ./a *umedad puede ser controlada de forma autom$tica si se *ace llegar agua
desde una fuente eterna a medida 0ue el sistema lo necesita o manualmente si se coloca un
recipiente con agua en el estante inferior de la estufa.
/!stemas de !%cu$ac!1% e% a%aero$!os!s. Su eleccin viene determinada por el coste, n3mero
de cultivos y limitaciones de espacio. /os m$s comunes son las c$maras, +arras o ca+as y
bolsas de anaerobiosis.
Con independencia del sistema utili1ado es importante monitori1ar el ambiente anaerobio con
una tira indicadora de a1ul de metileno o de resa1urina, y la temperatura de incubacin.
Eisten diferentes modelos de c$maras para anaerobios, en las 0ue se consigue una atmsfera
anaerobia mediante una me1cla de gases 0ue contiene )> de 4
2
, )@%&> de CD
2
y <)@P&> de
K
2
. 7oseen un sistema de intercambio 0ue consiste en un compartimento rgido con una puerta
interior y otra eterior. /as +arras son recipientes cilndricos, de metal o de pl$stico rgido, 0ue
deben cerrarse *ermticamente y en los 0ue la atmsfera anaerobia se obtiene entre % y 2
*oras despus de introducir unos sobres !:as7aQ
R
, ;ecton DicQinson" en los 0ue, al a8adir
4
2
D se libera 4
2
y CD
2.
El 4
2
se combina con el ogeno eistente formando agua gracias a la
presencia de un catali1ador. #ctualmente eisten sistemas en los 0ue no *ace falta a8adir 4
2
D
o introducir el catali1ador !#naerogen
R
, Doid". Aediante una tcnica automati1ada,
#noomat
R
, tambin se puede lograr una atmsfera anaerobia en las +arras. Como ya se *a
se8alado debe introducirse un indicador de ogeno, 0ue suelen ser tiras de papel con a1ul de
metileno, 0ue se decoloran al desaparecer la presencia del ogeno.
?ambin se encuentran disponibles en el mercado diferentes sistemas de bolsas de
anaerobiosis de pl$stico transparente y fleible como :as7acQ 7ouc*
R
!;ecton DicQinson" o
#naerogenCompact
R
!Doid" con generadores e indicadores adecuados. Se pueden utili1ar
tanto para el transporte de muestras al laboratorio como para la incubacin de cultivos.
0III. RE,ERENCIA/ +I+6IO@RA,ICA/
Clostridium perfringens5 IN,ECCIONE/ DE PIE6 B TE4IDO/
+6ANDO/. D!spo%!$e e%5
*ttp://555.seimc.org/control/reviS;acte/pdf/Clostper.pdf
Historia del Clostridium botulinum. Disponible en:
*ttp://555.scielo.cl/pdf/rci/v2&snotas*ist/art%%.pdf
Clostridium perfringens. Clostridium botulinum. Disponible en:
*ttp://555.bvsops.org.uy/pdf/clostridium.pdf
:TKEBD C/DS?BHDHEA. Disponible en:
file:///D:/clostridium>2&botulinum/?EA#>2&26>2&7DD>2&#K#EBD;HDS@
HH.pptU(%2,%