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DETERMINACIN DE BACTERIAS COLIFORMES

TOTALES Y FECALES. MTODO DE RECUENTO POR


DILUCIN EN TUBO: Nmero Ms Probable (NMP)
(PRACTICA #5)

I. INTRODUCCIN

La tcnica de colimetra se utiliza para buscar bacterias coliformes que son
bacterias de morfologa bacilar, Gram (-), aerobias o anaerobias
facultativas, oxidasa negativas, no esporgenas y capaces de fermentar la
lactosa con produccin de cido y gas a 37C en un tiempo mximo de 48
horas.
Los organismos coliformes son buenos indicadores de la contaminacin
fecal del agua, su empleo como indicadores de la calidad higinica de los
alimentos se basa en la experiencia positiva adquirida en el agua.
El hallazgo de gran nmero de estos organismos en alimentos y el agua
indica la polucin o contaminacin fecal. La presencia de contaminacin
fecal en los alimentos o en el agua no es admisible tanto si se aslan o no
los patgenos intestinales.
Los coliformes fecales se distinguen fcilmente de los coliformes no fecales
utilizando T de inclusin elevadas.
El incremento de coliformes en los alimentos es pobre o muy lento a T de
5C, aunque algunos autores afirman que los coliformes crecen entre 3-6C.
La incorporacin a los medios de Cultivo de la Lactosa y Sales Biliares
(caso de agar Mc- Conckey) hace posible la diferenciacin entre estos
organismos y otros muchos que pueden encontrarse en los alimentos o en
el agua.
Para determinar la presencia de bacterias coliformes se ha utilizado el
mtodo del nmero ms probable (NMP) en que la muestra de alimento se
procesa como en el Recuento Standard en Placa (REP) en tres diluciones
proporcionales seriadas sembradas en 6, 9, 15 tubos del medio adecuado,
para el mtodo de los 2, de los 3 o de los 5 tubos respectivamente.
El nmero de la muestra original se conoce por las tablas Standard de NMP.
Este mtodo fue dado a conocer por Mc Crady en 1915. No es un mtodo
de anlisis exacto. Este mtodo es de naturaleza estadstica y el NMP
conseguido es ms alto que el mtodo SPC


II. OBJETIVOS
Determinar la presencia de coliformes presentes en la
muestra mediante el mtodo del NMP (Numero Ms
Probable).
Determinar coliformes totales
Determinar coliformes fecales.
Determinar si la muestra analizada es apta para el
consumo humano.
III. MATERIALES
Muestra biolgica: Agua de acequia.

Medios de cultivo:
o Caldo Lauril Sulfato Triptosa.
o Caldo EC
o Caldo Brila
o Agar Mc conckey
o Agar ENDO
Diluyente: agua peptonada al 0.1%
Tubos con campana de Durham.
Pipetas.
Tubos de dilucin.
Asa bacteriolgica.
Estufa.
IV. PROCEDIMIENTO

1) COLIFORMES TOTALES

Pesar o medir la muestra para efectuar las diluciones de
10
-1
hasta 10
-6
(solo utilizaremos hasta 10
-3
).
Para la dilucin 10
-1
agregar 90mL. de diluyente + 10mL.
de muestra; pero para la realizacin de la prctica se
utilizaran 3 mL. ms 27mL. de diluyente.
Colocamos 1 ml de la dilucin 10
-1
a otro con el
diluyente: dilucin 10
-2
; y as hasta completar las
diluciones requeridas.
Realizar las tcnicas de los tubos: 5 tubos por dilucin
Se utilizan cinco tubos (por dilucin) que contengan
Caldo lauril sulfato.
En cada tubo agregar 1 ml de su dilucin
correspondiente.
Verter 1 ml. de cada dilucin en cada serie, de la
siguiente manera:










10
-1

10
-2

10
-3

1ml
1ml
1ml
Incubar a 35 C 1C durante 24 o 48 horas.
Realizar lecturas respectivas = 1 lectura: 24 h. 2
lectura: 48h.
Observar la presencia de gas. Si las 24 horas hay tubos
con gas positivo los retiramos, y los que an no, dejar
que cumplan sus 48 h.
Relacionar con la tabla Standard.
Confirmar que son coliformes totales sembrando Agar
Mc Conckey o en ENDO o Caldo BRILA.
Confirmar resultados.














2) COLIFORMES FECALES O TERMOTOLERANTES(RESISTEN
A 45
O
C)

Utilizar los tubos ya confirmados de coliformes totales
para realizar la prueba de coliformes fecales
De cada tubo, con una asa de micrn en anillo y de 3
mm. De dimetro tomar una azada y llevar al tubo que
contenga caldo EC con campana de Durham.Tambin
se pueden utilizar tubos con caldo BRILA mas caldo
peptonado (10ml por tubo)
Luego incubar en Bao Mara con agitacin a 45,5 C +/-
0,2 por 24 horas
Realizar las lecturas, buscar la presencia de gas que
indica positividad.
Para verificar que es E.coli(coliforme fecal ms
comn)llevar a agar Mc. Makonkey, ver si hay
degradacin de la lactosa y hacer las pruebas
bioqumicas respectivas

Criterio microbiolgico: la ICMSF y la gua tcnica de la OPS/OMS/94, para el
estudio evaluacin del Riesgo Microbiolgico de los alimentos vendidos en la
Va publica en ciudades de Amrica Latina, que seala como lmite permisible
para alimentos crudos de 1000 coliformes fecales y el alimentos cocidos de 100
coliformes fecales.












V. RESULTADOS




Lectura: 5 5 5
Se observ formacin de gas en todos los tubos, al hacer las
respectivas lecturas















10
-1
10
-3
10
-2
Valores del NMP para 5 tubos inoculados a partir de tres diluciones
decimales sucesivas
(Report, 1969; Woodward, 1957; American Public Health Association,
1970)

NMP de
microorganismo
s por ml de la 1.
a

dilucin
Categora
*
24,0 1
35,0 1
54,0 1
92,0 1
160,0 1
180,0+ --

Para este resultado la tabla de NMP para 5 tubos inoculados a partir de tres
diluciones decimales sucesivos encontramos: 180,0+ coliformes totales/ ml.



Nmero de tubos positivos
observados en cada
dilucin

1.
a
dilucin 2.
a
dilucin 3.
a
dilucin
5 5 0
5 5 1
5 5 2
5 5 3
5 5 4
5 5 5
Mediante el aislamiento se logr identificar la presencia de E.coli en la
muestra trabajada.



De las pruebas realizadas se logr aislar a E. coli

VI. CUESTIONARIO

a) CUL ES LA COMPOSICIN DEL AGAR ENDO Y EMB Y
COMO SE LEEN ESTAS SIGLAS?
AGAR EMB
Este medio (tambin denominado E.A.M.) es utilizado para el
aislamiento selectivo de bacilos Gram negativos de rpido
desarrollo y escasas exigencias nutricionales. Permite el desarrollo
de todas las especies de la familia Enterobacteriaceae.
Fundamento
Este medio combina las frmulas de Holt-Harris y Teague
con la de Levine, para obtener un mejor rendimiento en el
aislamiento selectivo de enterobacterias y otras especies de
bacilos Gram negativos. La diferenciacin entre organismos
capaces de utilizar la lactosa y/o sacarosa, y aquellos que
son incapaces de hacerlo, est dada por los indicadores
Pruebas bioqumicas: IMVIC, TSI, LIA
eosina y azul de metileno; stos ejercen un efecto inhibitorio
sobre muchas bacterias Gram positivas. Muchas cepas de
Escherichia coli y Citrobacter spp. presentan un
caracterstico brillo metlico. Las cepas que utilizan la
lactosa poseen centro oscuro con periferia azulada o rosada,
mientras que las que no lo hacen son incoloras. Este medio
permite el crecimiento de Candida spp. como colonias
rosadas y puntiformes; la siembra en profundidad permite el
desarrollo de clamidosporas en C. albicans. Enterococcus
spp. crece en este medio como colonias puntiformes y
transparentes, mientras que Acinetobacter spp. y otras
bacterias oxidativas pueden dar colonias de color azul
lavanda; esto puede ocurrir aunque las cepas no sean
capaces de acidificar a partir de lactosa al 0.5% y ello se
debe a la incorporacin de azul de metileno a sus
membranas. En este medio se obtiene adems, un buen
desarrollo de especies de Salmonella y Shigella.
Frmula (en
gramos por
litro)
Instrucciones
Peptona 10.0 Suspender 36 g del polvo en un
litro de agua destilada. Reposar
5 minutos; mezclar, calentando
a ebullicin durante 1 o 2
minutos hasta su disolucin.
Esterilizar en autoclave a no
ms de 121C durante 15
minutos. Enfriar a 45C y
distribuir agitando suavemente.
Lactosa 5.0
Sacarosa 5.0
Fosfato
dipotsico
2.0
Agar 13.5
Eosina 0.4
Azul de
metileno
0.065
pH final: 7.2 0.2

AGAR ENDO
El agar Endo es un medio de cultivo diferencial y ligeramente
selectivo utilizado para la deteccin de coliformes y otros
microorganismos entricos.


Fundamento
La selectividad del agar Endo se debe a la combinacin de
sulfito de sodio y fucsina bsica que inhibe ligeramente el
crecimiento de los microorganismos gram positivos.
Frmula:








Qu otros medio diferente al que se sembr se emplea?
El medio Eosina Azul de Metileno (EMB) es un medio de plaqueo diferencial
que puede usarse en lugar del agar Mac Conkey en el aislamiento y deteccin
de Enterobacteriaceae o de bacilos coliformes de muestras con bacterias
mixtas. Los colorantes anilnicos (eosina y azul de metileno) inhiben a las
bacterias Gram positivas y a las Gram negativas exigentes. Se combinan para
formar un precipitado a pH cido y, de este modo, sirven tambin como
indicadores de la produccin de cido. Las colonias lactosa (+) dan colonias de
color violeta, las de E. coli presentan un caracterstico brillo verde metlico, las
de Enterobacter presentan un color violeta sin brillo metlico (ojo de buey). Las
colonias de Klebsiella son siempre mucosas, grandes y ligeramente rosadas
Agar para enterobactereaceas (HEKTOEN) para bacterias intestinales
patgenas. Debido a ambo indicadores (azul de bromotimol y fucsina acida) las
colonias lactosa positivas muestran una expresiva diferencia cromtica frente a
las colonias lactosa negativas.








Ingredientes por litro.

Peptona...................................................10 g
Lactosa...................................................10 g
Fosfato Dipotsico.................................3.5 g
Agar........................................................15 g
Fucsina Bsica...................................... 0.5 g
Sulfito de Sodio..................................... 2.5 g
PH final: 7.5 0.2 a 25 C.
VII. CONCLUSIONES

Se determin la presencia de coliformes totales y fecales
(termotolerantes) en la muestra de agua de acequia mediante el mtodo
del NMP (Numero Ms Probable).
Se determin que la muestra analizada tiene un NMP >180,0 UFC/ml de
muestra (cdigo: 555).
Se logr adiestrarse en el mtodo del NMP para detectar coliformes

VIII. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS

Jay, James. Microbiologa Moderna de los Alimentos. Cuarta
Edicin. Editorial Acribia S. A, Zaragoza. Espaa.
Aurazo de Zumaeta, Margarita. Lima. Per 2004. Manual
Anlisis Bsicos de Calidaddel gua de Bebida.
http://depa.pquim.unam.mx/amyd/archivero/TecnicBasicas-
Colif-tot-fecales-Ecoli-NMP_6529.pdf