PREPARACION DE UN

METODO DE PURIFICACION
DE PROTEINAS
Francisca Acevedo C-E
Francisca.acevedo@ufrontera.cl

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(
%
)

Pasos
PASOS DE PURIFICACION
1. Preparacin
2. Extraccin
3. Clarificacin
4. Concentracin
5. Pulido (polishing)
Alcanzar un alto grado de
pureza final
PREPARACION DE UN METODO
Responder a las siguientes preguntas:
1. Cul es la materia prima disponible?
Clula vegetal

Clula animal

Hongos y levaduras

Bacterias
Gram positivas
Gram negativas
2. cmo debiera ser tratada ?
3. Se requiere purificar a gran escala ?

5. Cul es el costo del proceso de purificacin escogido ?

4. Qu consecuencia tendr este escalamiento en las tcnicas de
purificacin escogidas ?
6. Cules son los recursos y equipos disponibles para lograr la
purificacin ?
7. Cul ser el uso esperado de la protena purificada ??
8. Cul es el grado de pureza necesario o esperado en relacin a
la materia prima y uso final de la protena ?
Pureza (%) Uso
Alta (> 95 %) Cristalografa rayos X y caracterizacin fisicoqumica

Moderada (< 95%) Antgeno para la produccin de anticuerpos

Reconstruccin de rutas metablicas: estudio de la funcin
de protenas y enzimas, estudio de la cintica y regulacin de
la reaccin, etc.

Uso de biocatalizadores (proteasas, lipasas, amilasas, etc.)

Uso en terapias (insulina, tratamiento hormonal, etc).

Uso de protenas recombinantes para ensayos de
transformacin gentica

Baja (50%)

Uso en biorremediacin de suelos contaminados
Uso industrial
9. Es mejor sobre-purificar que sub-purificar

Aunque el nde pasos de purificacin debiera minimizarse, la
calidad del producto final no debiera estar comprometida.
10. Procedimiento costo-efectivo: disear un proceso de
purificacin econmico y escalable
11. Qu debe ser eliminado ?
Definir las propiedades de la protena de inters e
impurezas crticas para simplificar la seleccin de
las tcnicas y optimizacin.
12. Cules son los contaminantes que inactivan o interfieren con
los anlisis ?

13. Debe ser eliminado completamente ?
Propiedades de la protena Influencia en la purificacin

Estabilidad a la
temperatura
Necesidad de trabajar rpidamente a bajas
temperaturas

Uso de detergentes Considerar sus efectos en las etapas cromatogrficas y
la necesidad de remover el detergente. Escoger el
detergente adecuado.

Fuerza inica Seleccin de las condiciones de tcnicas de
precipitacin y cromatografa de interaccin
hidrofbica
Co-factores para la
estabilidad o actividad
Seleccin de aditivos, pH, sales, soluciones tamponadas
Sensibilidad a proteasas Necesidad de remover rpidamente las proteasas o
adicionar inhibidores
Propiedades de la protena Influencia en la purificacin

Sensibilidad a iones metlicos Necesidad de agregar EDTA o EGDA en soluciones
tamponadas

Masa molecular Seleccin de resina de filtracin en gel

Propiedades de cargas Seleccin de resina de intercambio inico

Afinidad bioespecfica Seleccin de ligando por medio de afinidad

Hidrofobicidad Seleccin de un medio para la cromatografa de
interaccin hidrofbica
Minimizar la manipulacin de muestras en cada etapa la
cual puede provocar prdida de la actividad enzimtica o
reducir el rendimiento de purificacin
CONSIDERACIONES IMPORTANTES
Usar una tcnica diferente para cada paso: de modo de
aprovechar al mximo las caractersticas de la muestra las
cuales pueden ser utilizadas para la separacin (tamao,
cargas, hidrofobicidad, especificidad de ligando).
Proteger las protenas durante el proceso de purificacin

Efecto de la superficie
Efecto de la temperatura
Inhibidores de proteasas
Escoger las soluciones tamponadas adecuadas
Minimizar el uso de aditivos: puede que sea necesario remover
los aditivos en un paso adicional de purificacin, como por
ejemplo en caso de que interfieran en los ensayos de
actividad enzimtica.
Escoger los ADITIVOS adecuados

Sales
Iones metlicos
Quelantes
Surfactantes
ADITIVOS
Sales: se usan KCl o NaCl 0.1-0.2 M, simulando las condiciones
fisiolgicas
Iones metlicos:
- si un complejo es formado entre la solucin tamponada y un
catin divalente como Ca
2+
o Mg
2+
, la capacidad de los iones H
+

de la solucin tamponada es reducida. Adems, la disponibilidad
de los iones metlicos para participar en una reaccin enzimtica
puede ser disminuida.

-Evitar las soluciones tamponadas TRIS cuando un cofactor
metlico es requerido para la actividad o estabilidad de una
enzima/protena.

Por ej., en presencia de 100 mM TRIS con 2 mM Mn
2+
, un 29% del
metal es quelado.

Sales
Iones metlicos
Quelantes
Surfactantes
Quelantes

Cuando es necesario limitar los efectos de los metales,
se pueden usar quelantes especficos:


a. Para eliminar cantidades de trazas de metales
pesados, se usa EDTA 0.1-5 mM

b. EGTA tiene una alta afinidad por quelar el Calcio

c. O-phenanthroline quela zinc, mientras que m-
phenanthroline no.
Surfactantes

Las protenas de membrana solubilizadas forman
micelas con los surfactantes.

La concentracin micelar crtica (CMC) se define
como la concentracin de surfactante ms baja a la
cual se forma la micela.
son molculas anfipticas.
son a menudo usados para la extraccin y purificacin
de protenas de membranas
Usar concentraciones bajas de surfactantes (0.1%). De
lo contario, se puede producir una desnaturalizacin
de las protenas.
1. Detergentes inicos

Contienen grupos con carga positiva (catinicos) o cargas
negativas (aninica).

Presentan la desventaja de ser altamente desnaturante. Sin
embargo, permiten la separacin de protenas en su forma
monomrica, facilitando la determinacin de la masa molecular.
a) Dodecil sulfato de sodio o de litio (SDS, LiDS)

Son surfactantes aninicos.

LiDs tiene la ventaja de ser soluble a 4C, mientras que SDS no.

El uso de estos surfactantes en presencia de solucin tampn de
sulfato de potasio o de amonio puede llevar a su precipitacin a
temperatura ambiente.
b) Sodium cholate y sodium deoxicolato (DOC)

Son surfactantes aninicos que tienden a desnaturalizar menos
que otros detergentes inicos.

El pKa de estos surfactantes es entre 8 y 9, y la precipitacin del
surfactante en su forma cida es un problema a pH < 7.5.

La presencia de cationes divalentes causan la precipitacin de
DOC
2. Detergentes no-inicos

Poseen grupos no cargados en la cabeza hidroflica por lo que son
menos propensos a romper las interacciones protena-protena y son
particularmente tiles para aislar complejos proteicos funcionales.

Desnaturalizan en menor grado que los surfactantes inicos.
a) Triton X-100

Muchas enzimas retienen su actividad usando 1-3 % Triton X-
100.

Este surfactante posee una alta absorbancia a 280 nm.
b) Triton X-114

Trition X-114 (2%) adicionado a la solucin de protena tiene la
facultad de causar una separacin entre ste y la fase
acuosa a temperaturas bajo 20 C. Por lo tanto, protenas
hidroflicas se quedan en la fase acuosa mientras las protenas
de membrana pueden ser recuperadas en la fase apolar del
surfactante.
c) Octyl glucoside (OG)

El surfactante OG es considerado mejor qumicamente que
Triton X-114, permitiendo la obtencin de resultados ms
reproducibles con este surfactante.

Una concentracin de 10-45 mM OG es suficiente para
solubilizar las protenas de membrana.

OG es ms fcil de remover de la solucin que TRITON


3. Detergentes zwitterinicos

Poseen grupos cabezales con carga positiva y negativa.

Estos surfactantes son ms eficientes que los detergentes no-
inicos para sobrellevar las interacciones protena-protena y
causan menos desnaturalizacin de protenas que los
detergentes inicos.

a) CHAPS

CHAPs no interfiere con la cromatografa de
intercambio inico y las protenas en solucin
conteniendo CHAPS pueden refrigerarse con
seguridad.
PROTECCION DE LAS PROTEINAS antes durante-
despus del proceso de purificacin

a) Efecto de superficie

Las soluciones diluidas de protenas pierden a menudo la actividad en
forma rpida, debido a la desnaturalizacin en las superficies de vidrio.

La prdida de la protena debido a la adhesin no especfica en las
superficies de vidrio es de 1 g de protena en 5 cm
2
de superficie de
vidrio. Pero este efecto se pierde al adicionar altas concentraciones de
otras protenas, usualmente Albmina. Para evitar esa ltima medida
(adicin de protena contaminante), las soluciones diluidas de
protenas deben ser rpidamente concentradas.
b) Efecto de la temperatura

Sobre 30 a 40 C, las protenas varan ampliamente en cuanto a su
estabilidad, inactivndose muchas, pero otras se mantienen estables
incluso sobre el punto de ebullicin de agua (ej., fosfatasa alcalina
bacteriana)
c) Almacenamiento

La vida media de una protena se alarga mediante un
almacenamiento a baja temperatura.


Las mejores condiciones de almacenamiento:

4 C
20 C
-80 C
- 200 C (en nitrgeno lquido),

dependiendo de la muestra.


Para almacenamientos de corto tiempo (1- 7 das), la
protena puede ser almacenada a 4 C si:


La actividad de la enzima de inters no disminuye
durante ese perodo

No hay degradacin visible por electroforesis 2-D


Cantidad insignificante de material pelletizado luego de
centrifugar por 10 min a 20.000 x g (de lo contrario,
indicara desnaturacin)
Para almacenamiento de largo tiempo (ms de 1
semana):

Almacenar la protena a 4C como precipitado
suspendido en sulfato de amonio

Almacenar la protena en forma liofilizada


La protena precipitada en sulfato de amonio puede ser
pelletizada por centrifugacin 20 min a 20,000 x g y luego
congelada con nitrgeno lquido y almacenada a
temperatura 80C.

Glicerol al 50% es utilizado para estabilizar las
protenas a 4 C
d) Adicin de inhibidores de proteasas

Se adicionan para atrasar la protelisis


Muchos inhibidores de proteasas son poco solubles
en solucin acuosa, por lo que debe ser mezclados
rpidamente para minimizar la precipitacin.


Los ms comunes son:

o PMSF
o EDTA
o Pepstatina A
o Leupeptina
o Aprotinina


PMSF


Inhibe las serina proteasas (quimiotripsina, tripsina,
trombina) y tiol proteasas (papana).

Soluble en isopropanol al 10 mg/mL

Solucin stock estable por ms de 1 ao a temperatura
ambiente

Concentracin de trabajo: 17-174 g/mL (0.1 10 mM)

Inestable en solucin acuosas, adicionar PMSF recin
preparado en cada paso de purificacin
EDTA

Inhibe las metaloprotasas

Soluble en agua a 0.5 M pH 8-9

Solucin stock estable por ms de 6 meses a 4C

Concentracin de trabajo: 0.2-0.5 mg/mL (0.5 1.5
mM)

Adicionar NaOH para ajustar en pH de la solucin
stock, de lo contrario EDTA permanece insoluble.
Pepstatina A

Inhibe proteasas cidas como pepsina, renina,
catepsina D y chymosin

Soluble en metanol al 1 mg/mL

Solucin stock estable por 1 semana a 4 C o 6 meses
a -20 C

Concentracin de trabajo: 0.7 g/mL (1 M)

Insoluble en agua
Leupeptina


Inhibe las serina proteasas y tiol proteasas tales como
papana, plasmina y catepsina B

Soluble en agua a 10 mg/mL

Solucin stock estable por 1 semana a 4 C o 6 meses
a -20C

Concentracin de trabajo: 0.5 g/mL (1 M)
Aprotinina

Inhibe las serina proteasas como plasminia, kallikrein,
tripsina y quimiotripsina

Soluble en agua a 10 mg/mL, ajustar a pH 7-8.
Inactiva a pH > 12.8

Solucin stock estable por 1 semana a 4 C o 6 meses
a -20C

Concentracin de trabajo: 0.06-2.0 g/mL (0.01-0.3
M)
CARACTERISTICAS DE LAS SOLUCIONES TAMPONADAS
Una solucin tamponada es definido como una mezcla de un
cido y su base conjugada la cual reduce los cambios en el pH de
una solucin cuando se agrega un cido o una base.
La seleccin de una adecuada solucin tamponada es
importante de modo de mantener una protena en un pH deseado
y para asegurar los resultados experimentos reproducibles
Para preparar una solucin amortiguadora de un pH determinado
debe seleccionarse un cido o una base cuyo pK
a
sea cercano al
pH de la solucin tampn que se requiere preparar.
Todos los productos qumicos deben ser para anlisis (no grado
tcnico)
Una vez que la solucin tamponada es escogida, lo mejor es
trabajar a una concentracin baja (50 mM) para evitar
efectos de fuerza inica.
Considerar que las enzimas se desnaturalizan
irreversiblemente a valores de pH extremos.
El pH fisiolgico de la mayora de las clulas animales es 7.0-
7.5 a 37 C. Debido al efecto de la temperatura, este valor
aumenta cercano a 8 a temperaturas cercanas a 0.
La eleccin de las soluciones tamponadas
depender tambin de los mtodos empleados:


Para cromatografa por filtracin en gel, la mayora
de las soluciones tamponadas son compatibles con las
protenas

Para cromatografa de intercambio aninico,
soluciones tamponadas catinicos como TRIS son de
eleccin

Para cromatografa de intercambio catinico, las
soluciones tamponadas aninicos tales como fosfato
funcionan bien.
Las buenas soluciones tamponadas tales como MES,
PIPES, MOPS son:

Inertes

poseen baja absorbancia UV

son afectadas en menor grado por la temperatura y
fuerza inica

Sin embargo, son ms caras que las soluciones
tamponadas tradicionales, tales como citrato o
acetato.
Name pKa
Acetate 4.76
Pyridine 5.23
MES 6.15
Bis-TRIS 6.46
PIPES 6.76
MOPS 7.20
HEPES 7.55
TRIS 8.06
Borate 9.23
Glycine 9.78
CAPS 10.40
Valores de pKa de tampones biolgicos comunes
El pH de una solucin debe ser ajustado a la temperatura a la
cual la solucin tamponada ser usada

Sin embargo, esto requiere que el electrodo de pH sea
estandarizado a la temperatura de trabajo, 4C.

En la prctica, la solucin tamponada es preparada a temperatura
ambiente y el pH es ajustado tambin a temperatura ambiente.

Los efectos de la temperatura en el pH de la solucin tamponada
pueden ser grandes.

Por ejemplo, TRIS tiene un pKa de 8.06 a 25 C pero cambia a 8.85 a
0 C.
Es habitual preparar soluciones stock de tampn 10x o 100x. Esto
permite manejar volmenes ms pequeos y la adicin de agentes
bactericidas tales como azida de sodio 0.02%
ATENCION: la adicin de las soluciones stock
de solucin tamponada pueden cambiar el pH.


Por ejemplo:

La solucin tamponada fosfato 0.1 M tiene pH 6.7.
Si se diluye 10 veces, el pH aumenta a 6.9
Si se diluye 100 veces, el pH aumenta a 7.0

El pH del TRIS disminuye 0.1 unidad por cada dilucin
10x
LIMITACIONES de algunas soluciones tamponadas
Las soluciones tamponadas compuestas de
componentes inorgnicos (fosfato, borato, bicarbonato)
pueden interactuar con enzimas afectando sus
actividades.

Las soluciones tamponadas forman complejos de
coordinacin con iones metlicos di- y trivalentes
resultando en la liberacin de protones, disminucin de
pH, quelacin del metal y formacin de complejos
insolubles.
Las soluciones tamponadas con bajas constantes de
unin a metal son PIPES, TES, HEPES y CAPS los cuales son
los de preferencia para el estudio de enzimas.
El tampn fosfato:

-precipita o se une a muchos cationes polivalentes

- inhibe una gran cantidad de enzimas (quinasas,
fosfatasas, deshidrogenasas)

-Muestra una dependencia del pKa en la dilucin del
buffer
El tampn citrato:

-Se une a algunas protenas y forma complejos
metlicos
El tampn cacodilato es txico
El tampn carbonato tiene una solubilidad limitada y
como est en equilibrio con CO
2
, los estudios deben
realizarse en sistemas cerrados.
El tampn ADA absorbe luz a longitudes de onda
mayores a 260 nm y se une a iones metlicos.
El tampn MOPS interfiere con el mtodo de Lowry, pero
no el mtodo de Bradford o l de BCA
El tampn TRIS:

- participa en varias reacciones enzimticas, como por ej. aquellas
catalizadas por la fosfatasa alcalina

- pasa a travs de las membranas biolgicas y por lo tanto generar
valores falsos.

- es afectado por la concentracin de la solucin tamponada y
temperatura
El tampn HEPES:

- Interfiere con el mtodo de Lowry, pero no con el de Bradford o
BCA

- Todos los tampones buenos (HEPES; EPPS; PIPES) forman radicales
bajo diversas condiciones y debieran ser evitados en sistemas donde
se estudian los procesos redox.
Prevencin de la contaminacin de soluciones tamponadas
Las soluciones tamponadas fosfato son altamente susceptibles a la
contaminacin microbiana. Ocupar una solucin stock de 1 M la
cual tiene menor riesgo de contaminacin.
Filtrar las soluciones tamponadas travs de un aparato de
filtracin estril de modo de prevenir el crecimiento bacteriano y
de hongos especialmente a pH 6 a 8.
Prevenir la contaminacin del tampn durante el
almacenamiento con 0.02% (3 mM) de azida de sodio.
Este reactivo no interacta significativamente con las
protenas a esa concentracin.
La refrigeracin ayuda a reducir la contaminacin de las
soluciones tamponadas.

Usar agua desionizada en la preparacin de las soluciones
tamponadas
BASE DE DATOS

http://www.brenda-enzymes.info/

Tamao

pI

Hidrofobicidad

Solubilidad

etc
TAREA 1. ESTRATEGIAS DE PURIFICACION


Ud. requiere purificar la enzima X

1. Cul es la funcin de esta enzima ?

2. Porqu requiere purificarla ?

3. De qu fuente Ud. la purificar ?

4. Cul es el grado de purificacin esperado de la enzima purificada ?

5. Definir los requerimientos de pureza de acuerdo al uso final del
producto

6. Definir las propiedades de la protena de inters e impurezas crticas.
Estabilidad a la temperatura, pH, fuerza inica, solventes orgnicos,
a la oxidacin, a condiciones de almacenamiento.
Cofactores, inhibidores, iones metlicos
Masa molecular
Punto isoelctrico




7. Mtodo analtico

Cul es el test enzimtico que debo aplicar para determinar la
actividad enzimtica de la enzima que deseo purificar ?

Cul es el sustrato utilizado y cul es el producto de la reaccin ?

Cmo se mide ?



8. Se requiere purificar a gran escala ?

Qu consecuencia tendr ese escalamiento en las tcnicas de
purificacin escogidas ?