Produccin de

metabolitos secundarios
en biorreactores
Alejandro Mentaberry
Departamento de Fisiologa, Biologa Celular y Molecular
FCEN-UBA
Conceptos y Tcnicas de Biotecnologa
Curso 2010
Sumario
Potencial econmico de los metabolitos secundarios
Referencias
Estrategias para incrementar la produccin
de metabolitos secundarios.
- Seleccin de especies vegetales apropiadas
- Seleccin de lneas celulares mejoradas
- Optimizacin de las condiciones de cultivo
- Agregado de precursores
- Suspensiones, rganos y clulas inmovilizadas
- Uso de elicitores microbianos y de estreses abiticos
- Permeabilizacin y remocin in situ
Diseo de procesos. Ejemplos
Ingeniera metablica y biotransformacin
Potencial econmico
de los metabolitos secundarios
El metabolismo secundario regula
muchas de las relaciones
de la planta con el medio circundante
Concepto
general
La produccin de metabolitos secundarios est estrechamente
relacionada con el proceso de desarrollo de la planta.
- Generalmente no est asociada al crecimiento.
- Depende de condiciones determinadas de control hormonal.
- Es paralela al desarrollo de tejidos especializados y rganos
(races, tallos, hojas y glndulas).
- La biosntesis y acumulacin suele estar fuertemente
compartimentalizada a nivel intracelular, celular, de tejidos
y de rganos.
Los metabolitos secundarios se producen ante situaciones
de estrs o enfermedad.
- Factores biticos
- Factores abiticos
Cultivo
de tejidos y
metabolismo
secundario
- Insecticidas
- Saborizantes
- Colorantes
Las plantas
como fuente
de metabolitos
secundarios
de inters
comercial
Potencial
- 75% de las nuevas estructuras qumicas descubiertas
provienen de las plantas.
- Slo se tiene buen conocimiento de 5.000 de las 250.000-
300.000 especies vegetales que se creen existentes en el
planeta.
- 25% de los medicamentos de las industrias farmacuticas
son de origen vegetal.
- 75% de la poblacin mundial utiliza la medicina tradicional
que consiste principalmente en el uso de extractos
provenientes de plantas.
- Desarrollo creciente de fitoteraputicos y nutracuticos
- Medicinas
- Herbicidas
- Proteasas
- Fragancias
- Antimicrobianos
- Enzimas
Ejemplos de
terpenoides
producidos
en plantas
Se conocen
unos 25.000
terpenoides
presentes
en plantas
Taxol
(droga anticancergena)
Forbol
(irritante y cocarcinognico)
Costunlido
(repelente de inserctos;
antinutriente de mamferos)
Azadiractina A
(antinutrientede insectos)
-Ecdisona
(disruptor de la muda de insectos)
Hecogenina
(agliconade una saponina;
detergente)
Digitoxigenina
(aglicona de digitoxina; tratamiento
de congestiones cardacas)
Taxol
(droga anticancergena)
Forbol
(irritante y cocarcinognico)
Azadiractina A
(antinutrientede insectos)
Costunlido
(repelente de inserctos;
antinutrientede mamferos)
Ejemplos de alcaloides producidos en vegetales
Se han caracterizado unos 12.000 alcaloides en plantas
Hyoscyamus niger Atropina
Rauwolfia serpentina Ajmalina
Cocana
Cafena Coffea arabica
Erythroxylon coca
Cinchona
officinalis
Quinina
Hyoscyamus niger Atropina
Rauwolfia serpentina Ajmalina
Cocana
Cafena Coffea arabica
Erythroxylon coca
Cinchona
officinalis
Quinina
Ejemplos de
fenlicos
derivados de
fenilpropanoides
Unos 8.000 fenlicos
se forman en las
plantas por las rutas
del cido shikimico o
del malonato/acetato
gingeroles
Rizoma de ginger
Pimiento rojo y negro
piperina
norhidrocapsaicina
capsaicina
Granos de caf
Corteza de canela
cinnamaldehido
cido clorognico
Algunas de las medicinas ms importantes o sus
precursores derivados de plantas y sus ventas en el 2002
Nombre Tipo Origen Uso teraputico
Alcaloides: ventas proyectadas para el 2002: 4045 millones US$
Hiosciamina,
escopolamina
Alcaloides del tropano Solanaceas Anticolinrgicos
Camptotecina Alcaloide indlico Camptotheca
acuminata
Antineoplsico
Capsaicina Alcaloide fenilalquilamino Capsicum spp. Analgsico local
Codena, morfina Alcaloide opiceo Papaver somniferum Analgsico
Colchicina Alcaloide isoquinolinico Colchicum autumnale Antigota
Galantamina Alcaloide isoquinolinico Leucojum aestivum Inhibidor coliesterasa
Pilocarpina Alcaloide imidazlico Pilocarpus jaborandi Colinrgico
Nicotina Alcaloide pirrolidnico Nicotiana spp. Terapia antitabaco
Quinina Alcaloide quinolnico Cinchona spp. Antimalrico
Quinidina Alcaloide quinolnico Cinchona spp. Cardiotnico
Reserpina Alcaloide indlico Rauwfolia serpentina Antihipertensivo, psicotrpico
Vinblastina,
vincristina
Alcaloide indlico Catharanthus roseus Antineoplsico
Yohimbina Alcaloide indlico Apocynaceae,
Rubiaceae
Afrodisaco
Terpenos y esteroides: ventas proyectadas para el 2002: 12400 millones US$
Artemisinina Lactona sesquiterpnica Artemisia annua Antimalrico
Diosgenina, Esteroides Dioscorea spp. Hormonas esteroidales
Taxol Diterpenos Taxus brevifolia
Glicsidos: ventas proyectadas para el 2002: 9230 millones US$
Digoxina, digitoxina Glicsidos esteroidales Digitalis spp. Cardiotnico
Sennsidos A y B Antracenos Cassia angustifolia Laxante
Otros: ventas proyectadas para el 2002: 5014 millones US$
Ipecac Mezcla de alcaloides de
ipecacuana
Cephaelis
ipecacuanha
Emtico
Podophyllotoxina Lignanos Podophyllum peltatum Antineoplsico

Antitumoral
Produccin
de metabolitos
secundarios
por cultivo
in vitro
de clulas
y rganos
vegetales:
por qu?
- Independizarse de factores externos, tales como:
cambios de temperatura, sequas, plagas,
variabilidad de la produccin, factores polticos
y sociales, etc.
- Evitar la extincin de especies vegetales.
- Disponer de condiciones controladas en el proceso
de produccin y extraccin.
- Hacer viable la produccin de compuestos
complejos con uno o ms C quirales en forma ms
econmica respecto de la sntesis qumica
- Posibilitar la obtencin de nuevos compuestos
no presentes en la planta madre.
- Establecer procesos de biotransformacin slo
realizables por enzimas provenientes de plantas.
Procesos industriales
Tipo de compuesto
Farmacuticos
Pigmentos
Fragancias
Saborizantes
Depigmentadores
Producto
Shikonina
Berberina
Sanguinarina
Gingsensidos
Taxol
Cartamina
Geraniol
Citronerol
Vanillina
Arbutina
Compaa
Mitsui Petrochemical Ind.
Mitsui Petrochemical Ind.
Vigont Researol Lab.
Nitto Denko Co.
Phyton USA
Kibun Kyoto University
Kanedo Co.
Kanedo Co.
Kanedo Co.
Mitsui Petrochemical Ind.
20 M
0,6 M
4.800
340.000
1.000
n/a
3.250
4.500
-
-
Precio
(U$S/kg)
18 Pigmentos Morinda citrifolia Antraquinonas
12,4 Antibacteriano,
colorante
Lithospermun
erythrorhizon
Shikonina
10,6 Antibacteriano Thalictrum minus Berberina
8,9 Pigmento Perilla frutescens Antocianinas
3,8 Esteroide Dioscorea deltoidea Diosgenina
0,025 Analgsico Papaver somniferum Morfina
2,5 Antibitico Papaver somniferum Sanguinarina
0 Antileucmico Catharanthus roseus Vincristina
0,06 Anticancergeno Taxus brevifolia Paclitaxel (Taxol)
21-36 Antiinflamatorio Cloeus blumei Acido rosmarnico
Rendimiento (%) Aplicacin Especie Producto
Tomado de: Scragg. Agricultural Biotechnology, 1998.
Productos comerciales potenciales y rendimientos
de algunos cultivos de clulas vegetales
Condiciones econmicas:
- Compuestos de alto precio (>1.000 U$S/kg)
- Alto rendimiento y productividad del cultivo
comparado con la planta entera
- Buen crecimiento en biorreactores
- Crecimiento lento de la planta entera
como fuente alternativa
Parmetros principales:
- Productividad: g de producto/L/da
- Concentracin mxima de producto:
g de producto/L
- Rendimiento: g producto/g sustrato
Viabilidad de
un proceso
para su
escalado a
nivel industrial
Estrategias para incrementar
la produccin de metabolitos secundarios
Esquema del patrn de crecimiento
de una suspensin celular vegetal
Rendimiento de biomasa en sustrato
Cuantificacin
y cintica
de un proceso
Td: tiempo de duplicacin de la biomasa
: velocidad especfica de crecimiento del organismo
Y: rendimiento
X: biomasa
S: sustrato
Asociado al crecimiento No asociado al crecimiento
Patrones de formacin de producto
Seleccin de especies vegetales apropiadas
Seleccin de lneas celulares mejoradas
Optimizacin de las condiciones de cultivo
Agregado de precursores
Tipo de cultivo: suspensiones, rganos
o clulas inmovilizadas
Uso de elicitores microbianos
y estrs abitico
Permeabilizacin y remocin in situ
Metodologas
utilizadas para
optimizar
la produccin
de metabolitos
secundarios
Screening y seleccin de lneas sobreproductoras
- Se facilita cuando el metabolito de inters es un
pigmento, ya que puede hacerse una seleccin
visual.
- Es importante contar con un mtodo rpido y sencillo
para seleccionar lneas ms productoras (por ejemplo,
ELISA).
Optimizacin del medio de cultivo (variables ms
ensayadas)
- Fuente de carbono
- Limitacin en nitrgeno
- Limitacin en fosfato
- Hormonas (auxinas, citoquininas, giberelinas)
- Relacin C/N
Agregado de precursores
- Bajo costo
- Baja toxicidad
- No muy alejado del producto final en la ruta metablica
Metodologas
utilizadas para
optimizar
la produccin
de metabolitos
secundarios
Diferencias entre suspensiones de clulas vegetales
y de clulas microbianas
Tomado de: Scraag. Plant Biotechnology, 1992.
Consecuencias para
cultivos a gran escala
Sedimentacin rpida;
sensibilidad a fuerzas de corte;
formacin de gradientes;
dificultad para tomar muestras
Largos tiempos de proceso;
baja productividad
Necesidad de grandes
cantidades de inculo;
escalado ms largo
Bajas velocidades
de agitacin
Baja demanda de oxgeno:
fermentadores con baja
transferencia de oxgeno
Permeabilizacin;
remocin in situ
Clulas
vegetales
Agregados de
10-200 m y
de hasta 2 mm
de dimetro
Lenta; td ~ 2-5 das
5-20%
Sensible /
Tolerante
Baja
Intracelular /
a veces extracelular
Clulas
microbianas
Clulas
Individuales
2-10 m
Rpida;
td ~ 1-2 h
Pequea
Insensible
Alta
Extracelular
Caracterizacin
Tamao
y morfologa
Velocidad
de crecimiento
Densidad de
inoculacin
Sensibilidad a
fuerzas de corte
Aireacin
Acumulacin
del producto
Problemas a considerar:
- Tasa de crecimiento
- Volumen del inculo
- Tamao y agregacin de las clulas
- Oxigenacin
- Agitacin
Cultivos en
suspensin
2,3 0,30 80 L (EA) Helianthus annuus
5,9 0,12 7 L (EA) Picrasma quassioides
0,72 0,96 15, 30, 130 L (AG) Nicotiana tabacum
0,63 1,10 15, 500 L (AG) Nicotiana tabacum
1,4 0,48 10 L (EA) Morinda citrifolia
2,2 0,32 30 L (EA) Catharanthus roseus
5,2 0,13 7 L (EA) Quassia amara
1,7 0,42 600 L (AG) Nicotiana tabacum
Tiempo de
duplicacin (d)
Tasa de crecimiento
especfica (d
-1
)
Bioreactores Lnea celular
AG: bioreactor con agitacin
EA: bioreactor de elevacin por aire (airlift)
Tomado de: Scraag. Plant Biotechnology, 1992.
Ejemplos de tasas de crecimiento de
suspensiones de clulas vegetales en biorreactores
La densidad el inculo y del diseo del biorreactor inciden
en el desarrollo de las suspensiones celulares
Tamao y distribucin de agregados
de Helianthus annuus en varios
biorreactores y en Erlenmeyer
Efecto de la densidad de inculo
en el crecimiento de cultivos
de Picrasma quassiodides.
Tomado de: Scragg. Secondary products from plant tissue culture, 1990.
Tomado de: Scraag. Plant Biotechnology, 1992.
Porcentaje de callos de Vitis vinifera
que contienen pigmentos de acuerdo
con el tamao de los agregados
Tomado de: Nagamori et al., Biochemical Engineering Journal, 2001.
Distribucin del tamaos obtenido en
biorreactores con medio en presencia de
carboximetilcelulosa (crculos cerrados)
y en medio control (crculos abiertos)
Tomado de: Honda et al., Journal of Bioscience and Bioengineering, 2002.
Tamao de agregado y acumulacin
de metabolitos secundarios
Patrn de flujo de dos diseos de propulsor
Agitador de paletas inclinadas
(flujo axial)
Agitador de paletas planas o de Rushton
(flujo radial)
Tomado de: Doran. Bioprocess Engineering Principles, 1998.
deflector
deflector
Adaptado de: Doran. Bioprocess Engineering Principles,1998.
Diseos de distintos propulsores
Columna de burbujeo Airlift con tubo interno Airlift con loop externo
Biorreactores de agitacin neumtica
El biorreactor ms grande del mundo es de tipo air-lift
ICI, Ltd. factory, Billingham, UK
Instalada en 1980, produce 6.000 Tm de protena bacteriana (Methylophilus methylotrophus)
por mes.
Biorreactor de tambor rotatorio
Biorreactor de membranas
Tomado de: Scraag. Plant Biotechnology, 1992.
Tomado de: Bhme et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 1997.
Diseos alternativos para biorreactores
con agitacin mecnica
Cultivo de rganos: races transformadas
Propiedad
Forma de crecimiento
Patrn de crecimiento
Tiempo de duplicacin
Biomasa final
(peso seco/L)
Background gentico
Formacin inicial de producto
Medio de crecimiento
Localizacin del producto
Tipo de proceso
Suspensiones
Clulas simples-agregados
Desorganizado; cada clula
puede dividirse y expandirse
15 h-das
30-60 g
Heterogneo
Usualmente bajo
Complejo; hormonas
y vitaminas
Intracelular- extracelular
Batch; continuo, deben
ser inmovilizadas
Races transformadas
Red de ramificaciones
Divisin celular localizada;
crecimiento linear con
ramificaciones laterales
36 h-das
30-60 g
Euploide
Similares a la planta madre
Simple, sales y azcar
Intracelular- extracelular
Batch o continuo, no hay
necesidad de inmovilizar
Fenotipo de raz
transformada con
Agrobacterium
rhizogenes
Gnero
Nicotiana
Catharanthus
Cinchona
Duboisia
Datura
Beta
Lippia
Artemisia
Coreopsis, Bidens
Tagetes
Digitalis
Cassia
Panax
Chaenactis
Podophyllum
Linum
Lithospermum
Solanum
Metabolito
Alcaloides
Alcaloides piridnicos
Indoles
Tropano
Otros
Betalaina
Sesquiterpenos
Poliacetilenos
Tiofenos
Glicsidos cardioactivos
Antraquinonas
Saponinas
Polyines
Lignanos
Naftoquinonas
Esteroides
Algunos
metabolitos
secundarios
producidos
por races
transformadas
Tomado de: Hairy Roots, Culture and Application, 1997.
Biorreactor de lecho de niebla
(nutrient mist reactor)
Biorreactor de lecho de goteo
con malla para inmovilizar a las races
Biorreactores para el cultivo de races
Bomba de aire
R
o
t

m
e
t
r
o
B
o
m
b
a
p
e
r
i
s
t

l
t
i
c
a
Generador de niebla
Cmara
de cultivo
Controlador Controlador
On Off
Intensidad
Filtro de aire
Condensador
de niebla
Adicin de nutrientes
Bomba
Salida de aire
Aire Aire
Inculo
Reservorio
Malla de
inmovilizacin
Tomado de:Hairy Roots,
Culture and Applications,
1997.
Compuesto
Piretrinas
Cardenlidos
Artemisinina
Aceites esenciales
Aceites esenciales
Planta
Chrysanthemum spp.
Digitalis spp.
Artemisia annua
Mentha spp.
Pelargoium spp.
Cultivo
de tallos
Ventajas
- Cultivos gentica y bioqumicamente estables
- Productos sintetizados y/o acumulados en tejidos
presentes en tallos y hojas (glndulas, epidermis,
etc.); caso de los aceites esenciales
- Niveles similares a los de la planta (no siempre se
cumple).
Desventajas
- Slo para productos sintetizados en tallos y hojas
- Vitrificacin
Airlift modificados: A: airlift con placas para sostener los
cultivos de tallos; B: Igual que A, pero con alimentacin por
goteo; C: Igual que A, pero con alimentacin por niebla.
Produccin de artemisinina en los distintos bioreactores
Tomado de: Liu et al., Process Biochemistry, 2003.
Cultivo de tallos de Artemisia annua
para la produccin de artemisinina
La inmovilizacin se define como
el confinamiento de un biocatilizador,
enzimtico o celular, dentro o sobre
una matriz slida para favorecer
la liberacin del producto y la reutilizacin
del propio biocatilizador.
Unin a una matriz:
- Covalente
- Inica
- Por crosslinking
- Por adsorcin
Entrampamiento:
- Geles o polmeros
- Membranas: microencapsulacin
o reactores de membrana
Inmovilizacin
Ventajas
- Posibilita la reutilizacin del biocatalizador y una
rpida separacin del medio de cultivo.
- Las clulas vegetales permanecen viables
por largos perodos de tiempo.
- Es posible establecer sistemas de cultivo continuo,
con el consiguiente aumento en la productividad.
- Es posible establecer cultivos de alta densidad
permitiendo el uso de biorreactores ms pequeos.
- La inmovilizacin favorecera la interaccin entre
las clulas, favoreciendo cierto grado
de diferenciacin con el consiguiente incremento
en la produccin.
- Es compatible con otras estrategias de optimizacin
. (elicitacin, permeabilizacin y remocin de producto)
- En muchos casos, la misma inmovilizacin induce
la secrecin del producto al medio de cultivo.
Inmovilizacin
Desventajas
- Se agrega una etapa ms al proceso,
con el consiguiente aumento en los costos
operativos. Esto incluye el costo de la matriz
y de toda la maquinaria necesaria
para la inmovilizacin.
- Al agregar un barrera ms al sistema,
aumentan los problemas relacionados
con la transferencia de nutrientes
y de oxgeno.
- El agregado de otra etapa en el proceso
aumenta los riesgos de contaminacin.
Inmovilizacin
Efectos de la inmovilizacin en la produccin de metabolitos secundarios
Efectos de la inmovilizacin en la liberacin de metabolitos secundarios
Tomado de: Payne et al., Plant cell and tissues culture en liquid ssytem. 1991.
Inmovilizacin
Compuesto
Ferruginol
Solasodina
L-DOPA
Capsaicina
Planta
Salvia miltiorrhiza
Solanum surattense
Mucuna pruriens
Capsicum frutescens
Clulas Libres
26
7
-
Trazas
Inmovilizadas
45
47-59
90
100
% Producto en el medio
Especie
Capsicum frutescens
Capsicum frutescens
Cofffea arabica
Catharanthus roseus
Tagetes patula
Producto
Capsaicina
Capsaicina
Metilxantinas
Ajmalicina
Tiofenos
Incremento
> 100
> 100
13
3,5
20
Tipo de inmovilizacin
Poliuretano
Gel
Gel
Gel
Agregados naturales
Biorreactores para clulas inmovilizadas
Lecho empaquetado Lecho fluidizado Agitacin mecnica
Tomado de: Payne et al. Plant cell and tissue culture in liquid systems, 1991.
La inmovilizacin en el contexto de distintas
opciones de cultivos de tejidos
Elicitacin
Agentes biticos
- Extractos de paredes de hongos o bacterias
- Acido araquidnico
- Quitosano
- Metil jasmonato
Agentes abiticos
- Metales pesados
- Radiacin UV
- Presin osmtica
- Ultrasonido
Tomado de: Singh. Hairy Roots, Culture and Applications, 1997.
Incremento de la produccin de metabolitos secundarios
por elicitacin en diferentes cultivos in vitro
Producto despus
de elicitacin
75 mol / L
4,27 mg / g peso seco
1 mg / frasco
2% peso seco
15 mg / g peso fresco
28 g / 10 mL
9 mg / g peso seco
160 g / g peso fresco
0,55 g / 100 g
peso seco
Elicitor
Phytium aphanidermatum
(extracto crudo)
Phytophtora megasperma
(extracto crudo)
Trichoderma virideae
(extracto crudo)
Saccaromyces cereviseae
(extracto crudo)
Verticilium dahliae
(extracto crudo)
Endgeno
(extracto crudo)
Penicilinum spp.
(extracto crudo)
Glutation abitico
Fusarium conglutanis
(extracto crudo)
Especie
Catharanthus roseus
(suspensiones)
Datura stramonium
(suspensiones)
Capsicum annum
(suspensiones)
Thalictrum rugosum
(suspensiones)
Sanguinaria canadensis
(suspensiones)
Lithospermum erythrorizon
(suspensiones)
Catharanthus roseus
(races transformadas)
Lotus corniculatus
(races transformadas)
Tagetes patula
(races transformadas)
Producto
Alcaloides
indlicos
Alcaloides
del tropano
Capsidiol
Berberna
Dopamina
Shikonina
Alcaloides
indlicos
Isoflavonoides
Tiofenos
Concentracin
del elicitor
10 ml / 50 mL
de cultivo
55 mg / L de cultivo
20 g / mL
0,2 mg / g peso fresco
1 ml / 15 mL
de cultivo
1 mg / mL
0,01 g / L peso seco
10 mM
0,2 mg / mL
de medio
Producto
en control
50 mol / L
0,85 mg / g peso seco
0
0,5% peso seco
3 mg / g peso fresco
0
3 mg / g peso seco
0
0,2 g /100 g
peso seco
Dosaje de elicitor necesario para
biorreactor en columna de burbujeo
y para biorreactores de lecho de goteo
o de niebla en funcin de la constante de
equilibrio entre el elicitor y receptor
Gastos de elicitor por biorreactor para
biorreactor en columna de burbujeo y para
biorreactor de lecho de goteo o niebla.
Efecto de la configuracin del biorreactor
sobre el proceso de elicitacin
Tomado de: Singh, Hairy root Culture and Applications, 1997.
DMSO
Shock trmico
Cambios de pH
Limitacin de fosfato y oxgeno
Elicitacin
Detergentes y aceites de siliconas
Electropermeabilizacin
Liberacin
del producto
al medio
Lquido-lquido:
Compuestos inmiscibles en agua: Se utilizan solventes
orgnicos o lpidos (sistemas de dos fases agua-orgnico).
Ejemplos: migliol, hexadecano, dodecano.
Compuestos miscibles en agua: Se utilizan sales o soluciones
de polmeros (sistemas de dos fases acuosas).
Ejemplos: DEAE, PEG.
Slido-lquido:
La segunda fase es un material slido como resinas u otros
absorbentes. Generalmente resinas como XAD, RP18, etc.
Requerimientos:
- Autoclavables
- No txicos
- Fcil separacin del producto de inters
de la segunda fase
- No modificacin del medio de cultivo
- Permanencia de las clulas en la fase acuosa
Remocin
de producto
in situ
Diagrama de un tanque de agitacin mecnica modificado
para operar con remocin in situ del producto
1: tanque; 2: malla de acero inoxidable para inmovilizar races;
3: sensor de oxgeno; 4: malla acero inoxidable; 5: medidor
DO; 6: agitador; 7: lana de vidrio; 8: resina XAD-2; 9: filtro de
vidrio; 10: generador de aire; 11: condensador;
12: marco de la malla
Diagrama de un biorreactor de agitacin
por lquido con loop externo
Tomado de: Hairy Roots, Culture and Application, 1997.
Adaptaciones para la extraccin in situ del producto
Extraccin in situ de alcaloides con aceite de silicona a
partir de un cultivo de clulas de Eschscholtzia californica
A: particin de alcaloides con
diferentes cantidades de polimetil-
silanos. Los alcaloides se acumulan
en la fase superior.
B: Extraccin in situ de alcaloides
en la parte superior de un
fermentador de elevacin por aire
de 2 L.
Secuencia en la
optimizacin de
un proceso para
la produccin
de metabolitos
secundarios
Seleccin de la planta por su contenido de metabolitos
secundarios para iniciar cultivos in vitro
Establecimiento de cultivos in vitro
Estabilizacin y seleccin de cultivos
in vitro: velocidad de crecimiento, niveles de producto,
liberacin al medio
Optimizacin de medio de cultivo para produccin
por diseo factorial: nutrientes, precursores, elicitacin,
liberacin y remocin in situ
Optimizacin en biorreactores: escalado
Sistema de cultivo: batch, continuo, fed-batch, perfusin,
en dos etapas. Extraccin y purificacin del producto
Ingeniera metablica
y biotransformacin
Estrategias
para modificar
el metabolismo
secundario
mediante
manipulacin
gentica
Completar rutas metablicas mediante
insercin de genes heterlogos
Amplificar rutas normales
Bloquear rutas alternativas
Bloquear rutas normales
Modificar la regulacin de rutas normales
Modificar los mecanismos de secrecin
y exportacin
Bloquear rutas de degradacin
Ingeniera metablica del metabolismo secundario
Enzima
Triptofano decarboxilasa
(TDC)
Hiosciamina-6-hidroxilasa
(H6H)
Triptofano decarboxilasa (TDC)
y estrictosidina sintasa (STR)
ORCA3 (factor
De transcripcin)
(S)-esculerina 9-O-
metiltransferasa (SMT)
Desoxixilulosa fosfato
reductoisomerasa (DXR)
C1 y R (factores
de transcripcin)
Especie
Peganum harmala
(suspensiones y races)
Hyosciamus muticus
(races transformadas)
Catharanthus roseus
(suspensiones)
Catharanthus roseus
(suspensiones)
Coptis japonica
(suspensiones)
Mentha spp.
(planta)
Zea mays
(callos)
Producto
Serotonina
Escopolamina
Alcaloides indlicos
(TIAs)
Alcaloides indlicos
(TIAs)
Berberina
Aceites esenciales
Antocianinas
Observaciones
Incremento de 10-20 veces
en producto
Contenido de producto 4 veces
superior a planta control
Contenido de TIAs de 300 mg/L
comparado con control 50mg/L.
Lneas inestables
Incremento de la concentracin de TIAs
de 3 veces despus de agregar
el precursor secologanina
Incremento del flujo hacia la produccin
de berberina de 15%
Incremento del 50% ene l contenido
de aceites esenciales
Produccin de antocianinas y fenoles
que no se producan en los callos sin
transformar.
Ingeniera
metablica
del
metabolismo
secundario
Problemas
- Clonado de genes
- Estabilidad de lneas transgnicas
- Compartimentalizacin de productos
- Transporte y acumulacin de productos
- Limitaciones y arquitectura
de la ruta metablica
- Canales metablicos (limitacin del
flujo metabolico por la capacidad de las
enzimas participantes)
La biotransformacin es la conversin de un sustrato (natural o sinttico) por
medio de un biocatalizador (enzima, clula, tejido, rgano, clulas inmovilizadas)
en un producto complejo. Generalmente involucra uno o pocos pasos enzimticos.
Requerimientos:
- Se requiere la presencia de las enzimas necesarias en la clulas y de sus cofactores.
- La velocidad de formacin del producto debe ser mayor que su metabolizacin.
- El cultivo debe tolerar al precursor y al producto formado.
- El precursor debe poder ingresar en la clula y el producto debe ser preferentemente
secretado.
- El precursor debe tener un valor mucho menor al del producto formado.
Planta Precursor Producto
Capsicum frutescens
(clulas inmovilizadas)
Acido protocatecuico
y cido cafeico
Vainillina y capsaicina
Catharanthus roseus
(clulas inmovilizadas)
Vinblastina Vincristina
Daucus carota
(clulas inmovilizadas)
Codeinona Codena
Mucuna puriens
(clulas inmovilizadas)
Tirosina L-DOPA
Rauwfolia serpentina
(clulas inmovilizadas)
Hidroquinona Arbutina
Mentha spp.
(clulas inmovilizadas)
Mentona Neomentol
Coffea arabica
(clulas inmovilizadas)
Teobromina Cafena
Adaptado de: Giri et al., Biotechnology Advances, 2001.
Biotransformacin
Ejemplos de diseo de procesos
Operacin Producto
asociado
Producto
no-asociado
Batch + +
Batch alimentado + +
Batch alimentado
repetitivos
+ +
En dos etapas - +
Continuo + -
Perfusin - +
Relacin entre el sistema de cultivo y el patrn
de sntesis del metabolito secundario
Esquema de un proceso completo para la produccin de un metabolito
secundario por cultivo in vitro de clulas y rganos vegetales
Shikonina
Planta entera
- La extraccin se realiza en plantas de aproximadamente 3 aos.
Suspensiones celulares
- 2,4-D estimula el crecimiento pero no la produccin.
- Las bajas concentraciones de nitrgeno y la elicitacin inducen
la produccin de shikonina.
- Se utilizan fermentadores de agitacin mecnica y tambor rotatorio.
- La productividad de shikonina es 840 veces superior a la de planta entera.
Tomado de: Yamasaki. Plant Photo Gallery
Produccin de shikonina por suspensiones celulares
de Lithospermum erythrorhizon
Tomado de: Scraag. Plant Biotechnology, 1992.
Proceso para la produccin de shikonina a partir de clulas
de Lithospermum erythrorhizon por Mitsui Petrochemical Ind.
Berberina
Planta entera
- La extraccin se realiza en plantas de aproximadamente de 5-6 aos.
Suspensiones celulares
- Las lneas celulares productoras se seleccionaron a travs de
. protoplastos y screening de por fluorescencia.
- El sistema de cultivo utilizado es el de batch alimentado y el producto est
. asociado al crecimiento.
Tomado de: Yamasaki Plant Photo Gallery
Produccin del alcaloide berberina
por suspensiones celulares de Coptis japonica
Ginsensidos
Planta entera
- La extraccin se realiza en plantas de aproximadamente 5-7 aos .
- Se requieren perodos prolongados de cuidado que exponen a los cultivos
a riesgos de pestes y cambios drsticos de clima.
- La concentracin de saponinas es de 0,5 % peso seco.
Suspensiones celulares
- La concentracin de saponinas es de 0,65 % peso seco.
- La productividad de biomasa es de 700 mg/L/da.
- El medio de cultivo contiene bajas concentraciones de amonio.
- A gran escala se emplean tanques agitados mecnicamente a bajas velocidades.
Races transformadas
- La concentracin de saponinas es de 0,95 % peso seco.
- El medio de cultivo requiere del agregado de 2 mg/L de IBA y de 0,1 mg/L de quinetina.
- A gran escala se emplean tambores rotatorios.
Produccin de ginsensidos por Panax ginseng
Tomado de: Yamasaki. Plant Photo Gallery
Taxol
Planta entera
- La edad de los rboles para extraer el producto es de 50-100 aos.
- La concentracin de taxol en la corteza es de 0,01 % del peso seco.
- Este mtodo de produccin podra llevar a la extincin de la especie.
. - Debido a la gran variedad de taxoides presentes, se hace difcil la purificacin del taxol.
. - El material vegeta empleado presenta variacin en la concentracin de precursores.
- Las plantas empleadas crecen lentamente.
Tomado de: Schoepke Plant Image Gallery
Produccin de taxol por Taxus spp
Taxol
Suspensiones celulares de T. brevifolia
- Se emplean metiljasmonato o extractos fngicos como elicitores.
- La composicin ptima de gases es 10% (v/v) oxgeno, 0,5% (v/v) dixido de carbono y 5 ppm de etileno.
- El incremento de la presin osmtica, sacarosa (60 g/L), estimula la produccin.
- Los precursores como la fenilalanina y el cido benzoico incrementan la productividad.
- El taxol puede ser removido in situ con resinas como XAD y el solvente dibutilftalato.
- El sistema de operacin se realizan en dos etapas: la primera para el crecimiento y la segunda
en un medio de produccin con elicitacin.
- Los reactores que se utilizan son de tipo airlift, columna de burbujeo u otros que produzcan
poco estrs hidrodinmico (escalado hasta 75.000 L).
Schoepke Plant Image Gallery
Produccin de taxol por Taxus spp
Planta entera
- La planta tiene bajas concentraciones
de alcaloides.
- La purificacin y extraccin son costosas.
Suspensiones celulares
- La limitacin de fosfato y nitrgeno combinado con la elictacin, inducen la produccin de
del precursor ajmalicina (utilizado para tratar hipertencin y problemas cardiolgicos).
- Las lneas celulares seleccionadas son resistentes a las fuerzas de corte, posibilitando
el desarrollo de cultivos a gran escala,
- En los cultivos a gran escala es necesario re-circular los gases de salida.
- Las suspensiones no acumulan alcaloides indlicos dimricos: vinblastina y vincristina.
- Se necesitara aumentar la productividad 40 veces respecto de la productividad especfica
obtenida actualmente (0,26 mg/g peso seco/da) para que el proceso sea viable.
Vinblastina
Tomado de: Manhart Plant Image Gallery
Produccin de alcaloides indlicos de Catharantus roseus:
vincristina y vinblastina
Estructuras de
vainillina y de
distintas
antocianinas
Vainillina (1)
Pelargonidina-3-glucsido R2=OH (1)
Cianidina-3-glucsido R2+R3=OH (2)
Delfinidina-3-glucsido R1+R2+R3=OH (3)
Wescott et al., 1994 0,7 B5 Races areas transfectadas
Wescott et al., 1994 0,002 - Fruto
Referencia % Peso Seco Medio Material
Wescott et al., 1994 0,7 B5 Races areas transfectadas
Wescott et al., 1994 0,002 - Fruto
Referencia % Peso Seco Medio Material
Produccin de vainillina en clulas y tallos de Vanilla planifolia cultivados in vitro
a
Medio de Gamborg et al. (1968) con 1 mg/L
b
Medio de Gamborg et al. (1968) con 1 mg/L NAA, 0,1 mg/L cinetina, y 15 mM total N
c
Medio de Murashige y Skoog (1962) con 5 mg ANA y 0,5 mg/L cinetina
Do y Cormier, 1991 B5
b
Suspensin celular Vitis vinifera
Oxalis reclinata
Aralia cordata
Especie
Crouch et al., 1993 MS
c
Suspensin celular
Sakamoto et al., 1994 cianidin 3-xilosilglucosido 10,3 B5
a
Suspensin celular
Referencia % Peso Seco Medio Material
Do y Cormier, 1991 B5
b
Suspensin celular Vitis vinifera
Oxalis reclinata
Aralia cordata
Especie
Crouch et al., 1993 MS
c
Suspensin celular
Sakamoto et al., 1994 cianidin 3-xilosilglucosido 10,3 B5
a
Suspensin celular
Referencia % Peso Seco Medio Material
Produccin de antocianinas por clulas cultivadas in vitro
Tomado de: Kurtz and Constabel, Agricultural Biotechnology, 1998.
Fenilpropanoides y flavonoides: algunos casos tpicos...
Conclusiones
Aspectos bioingenieriles a resolver:
- Diseo de biorreactores especiales para cultivos
de tejidos vegetales
- Instrumentacin y control de los bioprocesos
- Diseo de biorreactores ms econmicos
- Mtodos no letales para liberacin
de los metabolitos secundarios
- Mtodo adecuado para la remocin in situ
Aspectos biolgicos a resolver:
- Conocimiento de la regulacin de las rutas
biosintticas: enzimas y factores de transcripcin
- Conocimiento de la regulacin del transporte
y acumulacin de los metabolitos secundarios
- Conocimientos de los mecanismos
de degradacin del producto
1. Plant Biotechnology. Fowler, M., Gwarren,G.S. and
Moo-Young, M. (eds.). Pergamon Press, 1992.
2. Plant cell and tissues culture en liquid system. Payne,
G.F., Bringi, V., Prince, C. and Shuler, M.L. Munich
Hanser Publishers, 1991.
3. Secondary products from plant tissue culture.
Charlwood, B. and Rhodes, M.J.C. (ed.). Oxford
University Press, 1990.
4. Design, formulation, and optimization of media. In:
Bioreactor System Design. Asenjo, J. and Merchuk, J.
(ed.) Marcel Dekker Publishers, 1995.
5. Hairy Roots, Culture and Application. Doran, P. (ed.).
Harwood Academic Publishers, 1997.
6. Bioprocess Engineering Principles. Doran, P. Academic
Press, Harcout Brace and Company Publishers, 1998.
Referencias