I.

GENERALIDADES DEL PROYECTO:

1. TITULO
Efecto de la combinacion de macerozyma y celulasa en la viabilidad de protoplastos
obtenidos de tejido foliar de Solanum lycopersicum var. Rio Grande "tomate".
2. AUTOR
2. AS ES OR
4. TIPO DE INVESTIGACION
4.1. De acuerdo al fi !ue "e #er"i$ue: %a"ica
4.&. De acuerdo al di"eo de i'e"(i$acio: Explicativa
5. Localidad e I"(i(ucio dode "e de"arrollara el #ro)ec(o:
*.1. Localidad:
Lu$ar de E+ecucio
La,ora(orio de Fisiologia y Cultivo de ejidos !egetales
"abellon #ntonio $amanamud $%2&2.' $eccion de (otanica. Facultad de
Ciencias (iol)gicas de la *niversidad +acional de rujillo
*.&. I"(i(ucio:
*niversidad +acional de rujillo' Facultad de Ciencias (iol)gicas' Escuela de
Ciencias (iol)gicas' ,epartamento de Ciencias (iol)gicas' $eccion de
(otanica
-. Tarea" del E!ui# de I'e"(i$acio:
Au(or: Elaboration y ejecuci)n del proyecto' recoleccion de datos' analisis de resultados
y redaction del informe.
A"e"or: )rientar en el optimo desarrollo de la metodologia' procedimientos' asi como en
el analisis de resultados y redacci)n del informe.
-. Dura(io de la e+ecucio del #ro)ec(o: 11 meses
.. Croo$ra-a de Tra,a+o
E(a#a" .ec/a Iic.
.ec/a
Ter-.
Dedic. Se- 0/r"1
2.1 /ecoleccion de datos
05 Feb.
2&0&
05 $et.
2&0&
2&
2.& #nalisis de datos
05 $et.
2&0&
05 )ct.
2&0&
05
2.3 Elaboration del 1nforme
14 )ct.
2&0&
04 ,ic.
2&0&
0&
2. Recur"o"
2.0. "ersonal
Te"i"(a:
A"e"or: I
4.&. %iee"
4.&.1 De co"u-o
3 *5 1ts. #gua destilada
3 &4 1ts. #lco4ol 2-5
3 &2 6g. #lgodon
3 &2 7g. #zdcar
3 &- (isturis
3 155 bolsas negras de polietileno
3 &- Cajas de "apel #luminio
3 &- 6g. ,etergente8 #ce
3 &- Escobillas
3 &2 Espatulas
3 &5 Frascos de plastic5 0&& ml
3 5&& Fras9uitos de "enicilina
3 &0 1t. :ipoclorito de sodio.
3 &- "liegos de papel filtro ;4atman +5 0
3 &2 (aguetas de vidrio
3 &- (ea6ers 25& ml
3 &- Erlenmeyer 05& ml
n 02 <aminas portaobjetos
3 02 <aminillas cubreobjetos
3 &- =ec4eros
3 &- "ipetas de 0& ml' 0>0&
3 &- "ipetas de 25 ml' 0>0&
3 &- "lacas petri de 0&cm. de diarnetro
3 &- "robetas de 5& ml
3 &- "robetas de 0&& ml
3 &0 #utoclave !E/1C#< #CE/) 1+)?. 04<' !;/ (rand
Eppendorf
3 &0 (alanza analitica Eppendorf
&0 #gitador magnetic5 Eppendorf
n &0 Estereoscopio 7@E+,#:<
)lermometro de maxima y minima
3 &0 p:%metro 1+)<#( <E!E<
3 &0 =icrotomo (altec
2.2.2 ,e inversion
E6UIPOS
3 &0 Camara fotografica digital $#=$*+A
VIATICOS Y ASIGNACIONES
3 "asajes y compra de sernillas de tomate
VESTUARIO
n 5& Auantes de goma
3 5& =ascarillas
7ATERIALES DE ESCRITORIO
3 &- (oligrafos Faber Castell color azul
3 &2 <ibretas de #puntes
3 &0 millar de papel (ond #4 #tlas
3 &- "lumones indelebles Faber Castell
7ATERIAL IN.OR7ATICO
3 &0 dispositivo *$( 7ingston 2 gigas.
3 &- C,s de -5& =b. <A.
15. PRESUPUESTO
0&.0 7ATERIAL NO DISPONI%LE
CODIG
O
DESCRIPCION UNIDAD CANTIDA
D
COSTO
UNITARIO
0Si.1
TOTAL
Si.
*.3.11.35 %iee" de co"u-o
$emillas de Lycopersicom
esculentum
*nidad
BsobreC
D 2& -&'&&
Enzima macerozyma /%0& Aramos 0& 4& 4&&.&&
Enzima celulasa Aramos 0& 4& 4&&.&&
Colorante #zul Evans Aramos D 05& 45&.&&
#gar Comercial 6ilo 0>4 4& 4&'&&
"apel filtro *nidad D -'&& 12855
(andejas plasticas *nidad - 2'&& 02'&&
#gua ,estilada <itros 15 0'&& 0&'&&
<eila clorox <itro 2 D'&& -'&&
#lco4ol Comercial <itro 5 4'&& 2&'&&
#lgodon Comercial 7ilo E>2 02'&& 02'&&
/on Comercial <itro F 2'5& 2&'&&
,etergente 7ilo 0 5'&& 5'&&
@abG Comercial *nidad 2 2'&& 4'&&
+avajas de (isturi *nidad 4 0'5& -'&&
#zitcar 7ilo 0 2'&& 2'&&
Cuademo 0&& 4ojas
#4 cuadriculado
*nidad 0 5'&& 5'&&
"apel bond #4 atlas F&gr. =illar 0 2&'&& 2&'&&
<apicero Faber Castell
H&-D "unta fina
*nidad D 2'&& -'&&
<apiz Faber Castell 2( *nidad D 0'&&
D'&&
(orrador Faber Castell *nidad 2 0'&& 2'&&
"lum)n de tinta indeleble
Faber Castell ):"%C,
420%F
*nidad 2 0'5& D'&&
Corrector Faber Castell *nidad 0 2.&& 2.&&
Cartuc4os de tinta negra
para impresora 4p F45c
*nidad 0
45'&& 45'&&
Cartuc4os de tinta a
colores para impresora
4p F45c
*nida
d
0
-5'&& -5'&&
$ub%
total
50.0-.-'&&
*.3.11.3
&
Pa"a+e" y $a"(o"
de (ra"#or(e
=ovilidad local *nidad varios 0.&& 25&'&&
$ub%
total
$> 25&'&&
*.3.11.3
4
O(ro" "er'icio" de (ercero"
$ervicios de 1nternet :ora 5& 0'&& 5&.&&
Espiralado del informe *nidad . D'&& 20'&&
Fotocopias *nidad varios &'0& 2&'&&
Encuademado y Empastado *nidad . 2&'&&
04&'&&
$ub%
total
50.2D0'&&
Re"u-e
CODIGO DESCRIPCIUN
TOTAL
S9.
*.3.11.35 %iee" de co"u-o $0.0-.-'&&
*.3.11.3& Pa"a+e" ) $a"(o" de (ra"#or(e $0.25&'&&
*.3.11.34
O(ro" "er'icio" de (ercero" $0.2D0'&&
To(al S9.&1*:855
11. .INANCIA7IENTO:
3 /ecursos disponibles propios de la *niversidad +acional de rujillo.
n #utofinanciado
II. PLAN DE INVESTIGACION
1. ANTECEDENTES V ;USTI.ICACION DEL PRO%LE7A
El genera Solanum sp. "tomate" B$olanaceaeC' comprende unas 25&& especies'
siendo una de las mas importantes Solanum lycopersicum, la cual esta difundida
particularmente en #merica del $ur desde el centro de Ecuador a traves de "er* 4asta el
norte de C4ile B=ostacero y col.' 2&&2C ' la mayor production se concentra en #sia'
region 9ue particip) can un 5&I de la production global en 2&&F. $u versatilidad para
consumo en fresco o en conserva y su adaptabilidad 4an jugado un papel fundamental en
su rapida y extensa utilization B@ones y col.' 2&&0C' debido a su rico contenido en
vitaminas #' (0' %&8 y CJ sales minerales coma8 potasio' fosforo' sodio' magnesia' cobre'
calcio' sodio' 4ierro y azufre' presenta tambien carotenoides coma el licopeno Bpigmento
9ue da el color rojo caracteristico al tomate' el cual es antioxidante con una funcion
protectora de nuestro organismo' la pulpa del fruto es rico en sapaninas' licopinas'
carotenos' acid5 malico' acidos organicos' aceite graso e 4istamina' ademas contiene un
antibiotic5 llamado tomatina B=ostacero y col.' 2&&2J Aeb4ardt y 4omas' 2&&2J Fraser y
col.' 2&&2J F#$' 2&&DJ "eralta y $pooner' 2&&.C .
<a significativa diversidad del genera Solanum y su signification potential para la
mejora futura del tomate cultivado 4an sido revisadas recientemente desde varias
perspectivas B(reto y col.' 022DJ (ell y <ind4out' 2&&.J Kuriaga y col.' 2&&2C <os
esfuerzos en la mejora genetica del tomate 4an dada lugar a cultivares adaptados a una
diversidad de ambientes' metados de production y usos alimentarios. En este esfuerzo
una de los objetivos principales 4a sido el desarrollo de cultivares resistentes a las
enfermedades del "tomate". <os parientes silvestres del tomate cultivado 4an sido los 9ue
con frecuencia 4an proporcionado la *nica fuente initial de resistencia a dic4as
enfermedades. Este grupo incluye a S. hirsutum Btolerancia al frioC' S. pennellii
Btolerancia a se9uiaC' S. peruvianum Bresistencia a insectosC' S. chilense Bresistencia a
nematodesC y S. pimpinellifolium Bresistencia a enfermedadesC B@ones y col.' 2&&0C.
En los *ltimos alias se 4a tratado de obtener plantas de tomate resistentes a plagas
y enfermedades' u adecuado crecimiento de este cultivar' frutos de calidad' entre otrosJ
mediante cruzas con especies nativas' lo cual sugiere la necesidad de buscar
fuentes alternativas de diversidad' sin embargo la incongruencia interespecifica entre
muc4as de estas especies limita el valor de la 4ibridacion sexual. En este sentido' las
tecnicas de cultivo in vitro como la obtencion de protoplastos viables de Lycopersicum
esculentum brindan un gran complemento a las tecnicas convencionales de
mejoramiento siendo una excelente alternativa' ya 9ue es el punto de partida para la
obtencion de 4ibridos somaticos' germoplasma y fusion de protoplastos.
En 0FF& :anstein propuso el temiino #ro(o#la"(o para designar a la unidad del
protoplasma contenidos dentro de una celulaJ dic4o en otras palabras' el protoplasto es la
unidad 4omeostatica basica de la celula en is 9ue no esta involucrada la pared celular.
=uc4os protoplastos pueden resintetizar la pared celular' dividirse' formar colonias e
incluso regenerar plantas. <a capacidad para producir un organismo altamente
diferenciado' a partir de una sola celula somatica' es una caracteristica *nica de los
protoplastos de las plantas superiores B(enitez (.' 2&&5J :urtado y =erino' 0224J
$zabados' L.8 1441 en /oca y =grogins6i' 0220J $errano y "inol' 0220C.
En teoria es posible aislar protoplastos de cual9uier tipo de plantas' arganos o
tejidos 8 4ojas' petalos' apices de tallo' tallos' raices' frutos' coleoptilos' 4ipocotilos'
raicillas de plantulas' embriones' cotiledones' capas de aleurona de granos de cereales'
nodulos de maiz' celulas madre de microsporas' tetradas de microspora' granos de polen'
y de cultivos de calla y celulas en suspension' pero las fuentes 9ue se usan corrientemente
son mesofilo foliar y tejidos cultivados in vitro como celulas en suspension ' callos' y
apices de plantulas generadas in vitro B$zabados' <.' 0220 en /oca y =grogins6i' 0220J
$errano y "ifiol' 0220C. El mesofilo es una "uente adecuada de protoplastos' se utilizan'
en general' 4ojas completamente abiertas de plantas jovenes' o brotes nuevosJ a menudo
se prefieren las 4ojas de brotes de cultivos in vitro a las 4ojas de plantas cultivadas en
invernadero B$zabados' L.8 1441 en /oca y =grogins6i' 0220C.
<a preplasmolizacion del tejido de la 4oja con soluciones 4ipertonicas antes del
tratamiento con enzimas para aislamiento del protoplastos 4a sido usado. En el
aislamiento de protoplastos' la lamina media es degradada con pectinasas y la pared
celular es digerida con celulasas y 4emicelulasas. <as enzimas mas utilizadas para la
degradation de la pared celular son la celulasa y macerozima 9ue se 4an utilizado en el
aislamiento y obtencion de protoplastos de diferentes cultivares como AIHum cepa
"cebolla"' Prunus cerasifera "ciruelo"' Persea americana "palta, Prunus armeniaca
"durazno", Passflora edulis "maracuya"' !offea ara"ica "cafL"' entre otrosJ teniendo
muy (uenos resultados utilizando combinaciones promedio de 2.5I de celulasa y &.-I
de macerozima. B(rac4o y col' 2&&FJ #ndreu y col.' 2&&-J ;itja6sono y col.' 022FJ
)rtin%"arraga y (urgos' 2&&DJ /ivera y "erea' 2&&4J Fernandez y =enendez' 2&&-C
,urante el tratamiento enzimatico' una presion ostnotica favorable es necesaria para
reemplazar la presion de la pared contra los protoplastos. <a sustancia osmotica incluye
at manitol' sacarosa y otros compuestos azucarados y otras sales. ,espues del tratamiento
enzimatico' los protoplastos son purificados del tejido no digerido' celulas rotas y tejido
vascular' usando filtracion' centrifugaci)n y lavados BEri6sson' 02F5C
Es importante enfatizar 9ue cada genera' cada especie' asi como las variedades
de cada especie' tienen sus propias caracteristicas y re9uerimientos para el cultivo. $on
muc4os los factores 9ue de una u otra forma afectan la cantidad' frecuencia y calidad de
los protoplastos' siendo los principales el agente inductor de los protoplastos en el
cultivo' la temperatura' los tiempos de incubation' las especies vegetales y el tipo y edad
del tejido. Como consecuencia' es dificil generalizar las capacidades de division de los
protoplastos en cultivo' pues dependen de su information genetica y de los factores
ambientales y nutricionales. #demas de las apropiadas condiciones osm)ticas durante el
aislamiento y subsiguiente cultivos' dependen la estabilidad' viabilidad y ulterior
crecimiento de protoplastos B(4ojMani' 022&J :urtado y =erino' 0224J $errano y "inol'
0220C.
&. ;USTI.ICACION
El use de variedades de bajo potential productivoJ tecnicas de production ineficientesJ
problemas de comercializacion derivados de sobreoferta del producto en algunas epocas
del anoJ production de semilla de baja calidad fisica' fisiologica' genetica Bpureza
varietalC y fitosanitariaJ y a un control ineficiente de plagas y enfermedades' se propone
ajustar un protocol5 in vitro para la obtencion de protoplastos viables de L)co#er"icu-
e"cule(u- siendo punto de partida para obtener 4ibridos somaticos mediante la fusion
de protoplastos donde se podra transmitir caracteristicas beneficiosas 9ue se encuentran
en las especies silvestres 4acia las especies cultivadas.
D. PRO%LE7A
0'Cual sera la combination adecuada de celulasa y macerozima 9ue produzcan el mayor
numero de protoplastos viables en Solanum lycopersicum var. Rio Grande "tomate"N
4. <IPOTESIS
<a combinaci)n de celulasa B2IC y macerozima B&.-IC debera promover el mayor nitmero
protoplastos viables en Solanurn lycopersicum var. Rio Grande "tomate".
5. 5 % ;ET IVO
O Estandarizar un protocolo para la obtenci)n de protoplastos viables a partir de
tejido foliar de Solari um lycopersicum var. Rio Grande utilizando combinaciones de
celulasa y macerozima.
,eterminar la combinaci)n adecuada de celulasa y macerozima para producir el
mayor n*mero de protoplastos viables de Solanum lycopersicum
D. DISE*15 DE INVESTIGACION
=.1 7ATERIAL VEGETAL
El material biologic5 9ue se utilizard en el presente trabajo de investigation' seran 4ojas de
Lycopersicum eseulentum de 05 dias de edad obtenidas in vitro a partir de semillas <as
semillas de Lyeopersicum esculentum seran obtenidas del Centro Comercial #gronegocios
Aenesis $.#.C. las cuales' en el laboratorio' seran esterilizadas en una solucion de 4ipoclorito
de sodio al 0'5I durante 05 minutos y luego pasaran por tres enjuagues con agua destilada
esteril. <as semillas seran cultivadas bajo condiciones asepticas en medio =uras4ige y
$6oog' 02-2 B=$C' la germinaci)n sera a temperatura ambiente. "osteriormente' al germinar
seran transferidas a camara de crecimiento con fotoperiodo de 0- 4oras luz y F 4oras de
oscuridad B4- /aMl m
%2
sEC utilizando fluorescente de luz (lanca y fria. <a temperatura sera
tomada diariamente.
=.&. AISLA7IENTO DE PROTOPLASTOS
<as 4ojas de 05 dias seran cortadas en pe9uelias secciones B0 gramoC y colocadas en 0&2&
nil de una soluci)n pre%plasmotica B&'5 = manitol' p: 5..C por 0 4ora. <as 4ojas pre%
plasmolizadas luego seran transferidos e incubados en 0& ml de una solucion de
enzimas8 celulasa y macerozima Bver tratamientosC anadiendo .&& mg>0 cloruro de
calcio' 0I =E$ en sorbitol &'5 =J p: 5'-. El tejido sera incubado con la mezcla
enzimatica por 0- 4oras a 22 5C' en oscuridad y en batio de agua con agitacion
constante a 4& rpm. <as secciones del tejido se transferiran a cajas petri de poliestireno
de 5 cm de diametro' 9ue contendra - ml de soluci)n enzimatica permitiendo 9ue el
enves de la 4oja 9uede en contacto con la solucion.
,espues de 0-%0F 4oras del tratamiento enzimatica en la oscuridad y a 245 C' la
suspension de protoplastos seran filtradas usando una malla de nylon de 0&&pm.. El
filtrado sera centrifugado a F& g por 5 minutos. El "pellet" de protoplastos sera
resuspendido y lavado en una solucion de sacarosa B2&I' plyC. #9ui los protoplastos
viables seran separados de los protoplastos muertos por centrifugaci)n a 02&%0-& g por 5
minutos. <a capa de protoplastos viables en la superficie de la solucion seran colectado y
lavado y centrifugado a 0&& g en &.25 = manitol por 5 minutos. El pellet de protoplastos
sera luego lavado dos veces en la solucion de fusion B&.5 = manitol' &.2 m= CaC02C.
=.3. TRATA7IENTOS
Di$e"(io e>i-a(ica de la #ared celular
"ara 1levar a cabo la digesti)n enzimatica de la pared celular se probaron con dos
enzimas celulasa B0I' 0.5I y 2IC y macerozima B&.2I' &.4I y &.-IC. <as
combinaciones seran8
Enzimas
ratamientos Celulasa x =acerozima BIC
i 0.& x &.2
2 0.& x &.4
0.5 x &.4
- 0.5 x &.-
F
2.& x &.4
T4 &.5 ? 5.=
Estard constituido por 2 tratamientos' 5 4ojas por tratamiento. "ara cada tratamiento se
realizard tres repeticiones. "ara el diseilo se re9uerird un total de 0D5 unidades
experimentales.
=.4. VISUALI@ACION DE LOS PROTOPLASTOS Y DETER7INACION DE LA
VIA%ILIDAD.
<a viabilidad se determinard por dos tecnicas8 una sera usando F,# Bdiacetato de
fluoresceinaC y visualizados utilizando microscopio de fluorescencia
<a tecnica F,# se llevara a cabo mediante tinci)n con #zul de Evans B#EC al 0I
BPasuda y col.' 02F5C. ,urante este periodo' muestras de 2 m< del cultivo cada 5
4oras se tomaran para la cuantificaci)n. <as observaciones y las
fotomicrofotografias se realizaran utilizando un microscopio +17)+ de 4&&x y
camara digital )lympus B5.0 magapixelC.
*n mililitro de la muestra de protoplastos se centrifuga a 0&&& rpm al cual se le
agrega 0&&; de azul de Evans B0IC. <uego se incuba por 0& minutos a
temperatura ambiente' se elimina sobrenadante y se resuspende con agua
destilada. $e 4acen 0& conteos utilizando la camara de neMbabuer.
"ara el control se utilizaran muestra fijadas en #F#.
/egeneration de pared celular8 se anotat4 el tiempo en 9ue se regenera la pared
celular y ella se visualizara utilizando azul anilina' la cual colorea los (%B0>DC%
glucanos.
=.* EVALUACION
$e procedera al conteo de los protoplastos viables con apariencia esferica utilizando la
camara de +eMbaMer.
$e determinara el porcentaje de paredes celulares regeneradas y protoplastos en division.
=.= ANALISIS ESTADISTICOS
O <os datos obtenidos seran sometidos a promedio' desviaci)n estandar y #+#!#'
con una significancia de 0# A &.&5C usando $tatgrap4ic "lus 5.0' al encontrarse
diferencia significativa se comprobaran con prueba tu6ey.
.. RE.ERENCIAS %I%LIOGRA.ICAS
#ndreu' ".J #rbeloa' #.J erren' +. y =arin' @. 2&&-. #islamiento y cultivo de
protoplastos del patron ciruelo E=ariana 2-24E 0Pruu" cera"ifera E4r4 x P. munsoniana
;. ;ig4t G :edric6C Estacion Experimental de #ula ,ei BC$1CC. #vda =ontariana
0&&5' 5&&52 Karagoza Q Espana.
(all' P.J <ind4out' ". 2&&.. ,omestication and (reeding of omatoes8 ;4at 4ave ;e
Aained and ;4at Can ;e Aain in t4e FutureN #nnals of (otany 0&&8 0&F5%0&24
(enitez %.8 #. 2&&5. #vances /ecientes en (iotecnologia !egetal e 1ngenieria Aenetica
de "lantas. Editorial /everte' $.#. Espana.
(4ojMani' $.$. 022&. "lant issue Culture. #pplications and <imitations.Elsevier $cience
"ublis4ers. (.!. #msterdam.
(rac4o' =.J Aarcia' =.J =arcano' L. et al. 2&&F. )btencion y aislamiento de
protoplastos de tejido radicular de Allium cepa, <. Ciencia, jun. 2&&F' vol.0-' no.2'
p.040%04.. 1$$+ 0D05%2&.-.
(reto' =.J #sins' =.J Carbonell' E. 022D. Aenetic variability in Lycopersicon species
and t4eir genetic relations4ips. 4eor #ppi Aenet F-800D%02&
Eri6sson' . 02F5. "rotoplast isolation and culture. 1n8 Fo66e' <.C. G Constabel' F. Beds.C.
:andboo6 of "lant Cell Culture. <C/ "ress. (oca /aton. "p. 0%2&
F#$>*$,#. :orticultural G ropical "roducts ,ivision. 2&&D. "rocessed omato
"roducts )utloo6 and $ituation in $elected Countries' .p
Fernandez' /. y =enendez' #. 2&&-. !iability in protoplasts and cell suspensions of
Coffea arabica cv. Catimor Electronic @ournal of (iotec4nology 1$$+8 &.0.%D45F !ol.2
+o.5' 1ssue of )ctober 05' 2&&- Colombia.
Fraser' ".J /omer' $.J $4ipton' $.' =ills' ".J 7iano' @.J ,ra6e' /.J $c4uc4' ;. and (ramley'
". 2&&2. Evaluation of transgenic tomato plants expressing an additional p4ytoene
synt4ase in a fruit%specific manner. "roceedings of t4e +ational #cademy of $ciences 228
0&22%0&2..
Aeb4ardt' $. and 4omas' /. 2&&2. +utritive !alue of Foods. *nited $tates ,epartment
of #griculture. #gricultural /esearc4 $ervice' :ome and Aarden (ulletin +umber .2'
+utrient ,ata <aboratory' (eltsville' =aryland.
:urtado =. y =erino =. 0224. Cultivo de ejidos !egetales. Editorial rillas' $'#.
=exico.
@ones' @.J $tall' /. y Kitter' . 2&&0. "lagas y enfermedades del tomate. Ediciones =undi%
"rensa. (arcelona. "g. 2%4.
=ostacero' @.J =ejia' F.J y Aamarra' &. 2&&2. axonomia de las fanerogamas *tiles del
"eru. Editoras normas <egates $.#.C. C)+CPEC. rujillo%"er
%
*. "g. .-4%.-5' .FF%
.F2.
)rtin%" Earraga' F. y (urgos' <. 2&&D. 1solation and culture of mesop4yll protoplast from
apricot. @our. :ort. $ci. G (iotec4. .F B5C8 -24%-2F
"eralta' 1. and $pooner' ,. 2&&.. :istory' origin and early cultivation of tomato
B$olanaceaeC. pp 0%2.. 1n8 Aenetic 1mprovement of $olanaceous Crops' !ol. 28 omato.
=.7. /azdan and #.7. =attoo Beds.C' $cience "ublis4ers' Enfield' *$#R
/ivera' /. y "erea' =. 2&&4. #islamiento y cultivo de protoplastos en maracuya. Acta
Biologica Colombiana, Vol. 9 No. 2, 2! D5
$errano A. y "iriol $. 0220. (iotecnologia !egetal. Editorial $intesis' $.#. =adrid.
Espana.
$zabados' <. 0220. "rotoplastos8 aislamiento' cultivo y regeneration de plantas. En /oca
y =grogins6i Beds.C. .Cultivo de ejidos en la #gricultura. Fundamentos y #plicaciones.
Centro 1nternacional de #gricultura ropical BC1#C. Colombia.
;itja6sono' /.J <itz' E y Arosser' @. 022F. 1solation' culture and regeneration of avocado
#Persea americana =ill.C protoplasts. "lant Cell /ep.' 0F8 2D5%242.
Pasuda' .' Fujii' P. and Pamaguc4i' . Embryogenic callus induction from Caffea
arabica leaf explants by benzyladenine. Plant Cell P"ysiol. &=:*4*B*4:8 02F5.
Kuriaga' E.J (lanca' $.% Cordero' <.J $ifres' #.J (las%Cerdan' ;.J =orales' /.J +uez' F.
2&&2. Aenetic and bioclimatic variation in Solanum pimpinellifolium. Aenet /esour
Crop Evol 5-8D2%50