PARTE 2 ENFERMEDADES DE LA LISTA DE LA OIE Y OTRAS ENFERMEDADES DE IMPORTANCIA PARA EL COMERCIO INTERNACIONAL

Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008

SECCIN 2.1.

ENFERMEDADES DE VARIAS ESPECIES

CAPTULO 2.1.1.

CARBUNCO BACTERIDIANO

RESUMEN
Definicin de la enfermedad: El carbunco bacteridiano es primariamente una enfermedad de animales herbvoros, aunque todos los mamferos, incluyendo los humanos, y algunas especies aviares pueden contraerlo La mortalidad puede ser muy alta, especialmente en los herbvoros. El agente etiolgico es Bacillus anthracis, que forma esporas, es Gram positivo y tiene forma bacilar. La enfermedad tiene una distribucin mundial y es una zoonosis. Descripcin de la enfermedad: Esta enfermedad est mediada por exotoxinas. Se han descrito formas hiperagudas, agudas, subagudas y a veces crnicas de la enfermedad. Las seales clnicas ante-morten pueden estar virtualmente ausentes en las formas hiperagudas y agudas de la enfermedad. La forma subaguda puede estar acompaada de fiebre progresiva, depresin, inapetencia, debilidad, postracin y muerte. En sus formas subaguda, aguda y crnica, la enfermedad puede mostrar una inflamacin localizada y fiebre, y, en la forma crnica, el nico sntoma puede ser al agrandamiento de los ndulos linfticos. Identificacin del agente: Bacillus anthracis se asla de la sangre o de los tejidos de un animal recin muerto de carbunco en cantidades relativamente grandes, y la morfologa de las colonias de B. anthracis es caracterstica despus de su incubacin durante la noche en agar sangre. La colonia es relativamente grande, de aproximadamente 0.30.5 cm de dimetro. Su color vara del blanco grisceo al gris, no es hemoltica, presenta apariencia rugosa y vtrea y tiene una consistencia muy adhesiva y pegajosa Las clulas vegetativas de B. anthracis son grandes, de 35 m de largo y aproximadamente 1 m de ancho. Al final de la fase de crecimiento exponencial, se forman esporas centrales elipsoidales, que no hinchan el esporangio. Las clulas se tien fuertemente como Gram positivas y se ven largas cadenas de clulas in vitro, mientras que in vivo se ven parejas o cadenas cortas. La observacin de bacilos con cpsula, normalmente en grandes cantidades, en un frotis sanguneo teido con azul de metileno policromo (reaccin de MFadyean) tiene valor diagnstico. Pruebas serolgicas: La deteccin de anticuerpos en suero de animales infectados se usa raramente para el diagnstico y es esencialmente una herramienta de investigacin. El procedimiento actualmente predominante es el enzimoinmunoensayo (ELISA). Requisitos para las vacunas y los materiales de diagnstico: La vacuna del carbunco usada ms ampliamente en ganadera, desarrollada por Max Sterne en 1937, es una forma viva esporulada, no encapsulada, mantenida en suspensin. En Rusia y algunos pases del bloque del Este, se usa un tipo equivalente de vacuna (cepa 55). La vacuna Pasteur ya no se usa en Italia. Se ha desarrollado una nueva vacuna, Carbosap, que retiene ambos plsmidos y muestra muy poca virulencia. En las directrices del carbunco de la Organizacin Mundial de la Salud se proporciona una lista de productores.

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Captulo 2.1.1. Carbunco bacteridiano

A. INTRODUCCIN
El carbunco bacteridiano es una enfermedad aguda bacteriana que afecta fundamentalmente a los herbvoros, pero que puede transmitirse al hombre. El agente etiolgico, Bacillus anthracis, es una bacteria Gram positiva formadora de esporas y con forma bacilar. El carbunco bacteridiano recibe muchos nombres distintos, como ntrax cutneo, enfermedad de los laneros, enfermedad de los traperos, carbunco maligno y pstula maligna. Los animales se infectan por ingestin de esporas o posiblemente por picadura de moscas que se han alimentado en animales o canales infectadas. Los animales infectados se encuentran normalmente muertos porque la muerte ocurre en 24 horas. Un cuidadoso examen post mrtem de los que han muerto recientemente puede mostrar diversas lesiones, ninguna de las cuales es patognomnica o constante. Para evitar la contaminacin ambiental, no se recomienda el examen post mortem de los cadveres de animales sospechosos de haber muerto de carbunco. Las lesiones observadas con ms frecuencia son las de una septicemia generalizada acompaada muchas veces de un bazo inflamado con consistencia similar a la de la mermelada de moras y escasa sangre coagulada. La hemorragia nasal, bucal, vaginal y/o anal al morir no es un sntoma comn. El bacilo Gram positivo Bacillus anthracis es el nico patgeno obligado dentro del gnero Bacillus. La mayora del resto de especies de Bacillus, son saprofitas frecuentes en el medio ambiente, aunque algunos, particularmente B. cereus, B. licheniformis y B. subtilis, se asocian en ocasiones con intoxicaciones alimenticias en el hombre y con otras manifestaciones clnicas tanto en humanos como en animales. Ms del 95% de los casos de carbunco en el hombre presentan la manifestacin cutnea y son consecuencia del manejo de las canales, o de cueros, pieles, pelos, carne o huesos de los cadveres. Bacillus anthracis no es invasivo y necesita una lesin para poder infectar. La proteccin de los veterinarios y manipuladores de animales exige llevar guantes y ropa protectora cuando se manejen muestras de animales sospechosos de carbunco, y no frotarse nunca la cara o los ojos. Existe riesgo de carbunco intestinal si las personas comen carne de animales enfermos. El riesgo de inhalar dosis infecciosas es importante en ocupaciones que impliquen el procesamiento de materiales derivados del animal en la fabricacin de productos (carbunco industrial). Estas incluyen el procesamiento del cuero, la lana, la piel para alfombras, los huesos, y otras ocupaciones en industrias similares donde el potencial de aerosolizacin de una cantidad importante de esporas incrementa el riesgo de exposicin a dosis infecciosas.

B. TCNICAS DE DIAGNSTICO
1. Identificacin del agente

La demostracin de B. anthracis encapsulado en frotis de sangre o de tejidos de cadveres frescos infectados de carbunco, y el crecimiento del organismo en placas de medio slido con sangre, no resulta muy complicado y est al alcance de la mayora de los laboratorios de bacteriologa. Puede haber cierta dificultad en el caso de cerdos y carnvoros en los cuales la bacteriemia terminal no es muy marcada, o en animales que recibieron antibiticos antes de morir. La recuperacin de B. anthracis de reses antiguas muertas en descomposicin, de materiales procesados (hueso, carne, piel), o de muestras ambientales (suelo contaminado) es a menudo difcil, requiriendo procedimientos de mucho tiempo y trabajo.

a)

Cultivo e identificacin de Bacillus anthracis

i) Muestras frescas Bacillus anthracis crece fcilmente en la mayora de los tipos de agar nutritivo, aunque el agar sangre de caballo o de oveja al 57% es el medio de eleccin para el diagnstico. La sangre es el principal material clnico para examinar. Los frotis de sangre o de otros lquidos corporales o los tomados a partir de incisiones en tejidos o de rganos se siembran por extensin sobre placas de agar sangre. Tras incubar una noche a 37C, las colonias de B. anthracis son de color blanco grisceo, de 0,30,5 mm de dimetro, no hemolticas, de superficie hmeda traslcida, y muy pegajosas cuando se las toca con un asa de platino. A veces se ven rastros y grupos prominentes de crecimiento hacia la colonia de origen, todos en la misma direccin. Esta caracterstica se ha descrito como crecimiento en forma de cabeza de medusa. La confirmacin de que se trata de B. anthracis se puede llevar a cabo demostrando la presencia en el cultivo con sangre de un bacilo encapsulado, con esporas y Gram-positivo. Se puede determinar la ausencia de movilidad como una prueba adicional. La susceptibilidad de B. anthracis al bacterifago gamma fue descrita inicialmente por Brown y Cherry en 1955 (3). El fago esta disponible en el CDC (vase la nota a pie de pgina 1), en varios laboratorios veterinarios centrales nacionales y en otros laboratorios de referencia para el carbunco. El procedimiento

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Captulo 2.1.1. Carbunco bacteridiano

para la prueba es simplemente sembrar en estra una lnea con el organismo sospechoso sobre una placa con medio slido nutritivo o con sangre, o en una porcin de una placa (se pueden llevar a cabo varias pruebas sobre una placa), y colocar una gota de 1015 l de la suspensin del fago sobre una parte del rea sembrada y colocar, as mismo, un disco de penicilina de 10-unidades en el otro lado. Hay que dejar que la gota de la suspensin del fago penetre e incubar la placa a 37C. Se debe incluir un cultivo control; la vacuna de Sterne se puede usar con este propsito. Si el cultivo es B. anthracis, el rea bajo el fago estar desprovista de crecimiento bacteriano, debido a la lisis, y se podr ver una zona clara alrededor del disco de penicilina despus de la incubacin durante la noche. (Nota: muy ocasionalmente se encuentra aislamientos de B. anthracis resistentes al fago; de forma similar, en la literatura cientfica hay algunos informes de resistencia a la penicilina). ii) Visualizacin de la cpsula

Bacillus anthracis encapsulado y virulento est presente en los tejidos, la sangre y otros fluidos del cuerpo de los animales muertos por carbunco. Las bacterias deben verse en los frotis de estas muestras que se han secado, fijado y teido con azul de metileno policrmico (reaccin de MFadyean). La cpsula se colorea de rosa, mientras que las clulas del bacilo se tien de azul oscuro. Las clulas se encuentran en pares o en cadenas cortas y a menudo terminan como cortadas a bisel (las cadenas a veces parecen un conjunto de coches del tren -la llamada apariencia en furgn de ferrocarril). Ni la tincin de Gram ni la de Giemsa revela la cpsula. La cpsula no se presenta en B. anthracis cuando crece aerbicamente sobre agar nutritivo o en caldo nutritivo, pero puede verse cuando la bacteria virulenta se cultiva durante unas pocas horas en unos mililitros de sangre (la sangre desfibrinada de caballo o de oveja parece ser la ms adecuada). Alternativamente, la cpsula se produce cuando B. anthracis virulento se cultiva en medio de agar nutritivo que contenga 0,7% de bicarbonato sdico y se incuba en presencia de CO2 (20% es ptimo, pero tambin sirve una jarra de anaerobios). El medio slido se prepara poniendo en 90 ml de agua el suficiente agar nutritivo en polvo para hacer 100 ml de medio slido. Despus se lleva al autoclave y se enfra a 50C en bao de agua; se aaden 10 ml de una solucin de bicarbonato sdico al 7% esterilizada por filtracin (filtro de 0,22-0,45 m) y se mezcla. La solucin se vierte despus en placas Petri. Bacillus anthracis encapsulado formar colonias mucosas y la cpsula se puede visualizar haciendo frotis finos sobre portas de microscopio, fijando y tiendo con azul de metileno policromtico. iii) Otras muestras

Es posible la identificacin de B. anthracis en muestras no recientes y en materiales procesados, as como en muestras ambientales como las recogidas en los suelos, pero estas muestras presentan a menudo contaminantes saprofticos cuyo crecimiento se superpone al de B. anthracis y oscurece su identificacin en medios no selectivos. Se sugiere el siguiente procedimiento: a) b) Se mezcla la muestra en dos volmenes de agua destilada o desionizada y se coloca en un bao de agua a 62.5 0.5C durante 3060 minutos. Se preparan diluciones decimales de 102 o 103. De cada una de las diluciones se siembran en agar sangre 10100 l, y de modo opcional 250300 l en un agar PLET (polimixina, lisozima, EDTA [cido etilndiamino tetraactico], acetato de talio) (7, 11). Todas las placas se incuban a 37C. Las placas de agar sangre se analizan tras una noche de incubacin para verificar la presencia de colonias tpicas como se ha descrito anteriormente y se examinan las placas PLET a las 4048 horas. La confirmacin de la identidad de las colonias sospechosas como B. anthracis se realiza como se describi anteriormente.

c)

El medio PLET (7, 11) se prepara con agar base de infusin de corazn (DIFCO) reconstitudo segn las instrucciones del fabricante y con la adicin de 0,250,3 g/litro de EDTA y 0,04 g/litro de acetato de talio. (NOTA: el acetato de talio es venenoso y debe manejarse con precaucin). La mezcla se autoclava y se enfra uniformemente hasta 50C antes de aadir la polimixina a 30,000 unidades/litro y la lisozima a 300,000 unidades/litro. Tras mezclar cuidadosamente, el agar se distribuye en placas Petri. Estn apareciendo descripciones de procedimientos para la deteccin directa de B. anthracis en los suelos y en otros medios ambientales mediante el uso de la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR). Hasta ahora, ninguno de estos mtodos ha sido de utilidad rutinaria. Se puede contemplar la inoculacin en animales para recuperar B. anthracis si fracasan todos los otros mtodos. Ejemplos de estas situaciones son muestras de animales que recibieron terapia antibitica antes de morir o muestras ambientales sometidas a compuestos esporicidas. Dada la tendencia a eliminar el uso de animales en pruebas biolgicas, esta estrategia debe considerarse como un ltimo recurso y solamente si est justificada. Los ratones o cobayas adultos son los animales de eleccin. Si las muestras son suelos, los animales deben tratarse el da antes de la prueba con suero antitetnico y contra la gangrena gaseosa. Las muestras se preparan como si fueran para cultivo incluyendo un choque trmico de 62,5C durante 15 minutos. Los ratones se inyectan subcutneamente con 0,050,1 ml; los cobayas se inoculan intramuscularmente con hasta 0,4 ml (0,2 ml en el msculo de cada pata posterior). Si B. anthracis est

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Captulo 2.1.1. Carbunco bacteridiano

presente, provocar la muerte en 4872 horas y el organismos se podr cultivar a partir de la sangre como se seal anteriormente.

b)

Deteccin y diagnstico inmunolgico

Hay que tener en cuenta que B. anthracis est antignicamente muy relacionado con B. cereus, que es un componente ubicuo de la microflora ambiental. Los nicos antgenos no compartidos que permiten diferenciar estas dos especies por tcnicas inmunolgicas son los antgenos de la toxina del carbunco, producida durante la fase exponencial de crecimiento, y los de la cpsula de B. anthracis. Esto supone una limitacin considerable en los mtodos que pueden emplearse para la deteccin rutinaria. i) Prueba de Ascoli

Ascoli (1) public en 1911 un procedimiento para detectar el antgeno termoestable del carbunco en tejidos animales que eran clasificados como despojos. Se emplea antisuero obtenido en conejos para producir una reaccin de precipitina. La prueba carece de mucha especificidad porque los antgenos termoestables de B. anthracis los comparten otras especies de Bacillus, y depende de la probabilidad de que solamente prolifere B. anthracis en el animal y deposite el antgeno suficiente para dar una reaccin positiva. Parece que en la actualidad solamente se emplea en Europa del Este. Para realizar la prueba de Ascoli, se ponen aproximadamente 2 g de muestra en 5 ml de solucin salina con una concentracin final de 1/100 de cido actico y se hierve durante 5 minutos. La solucin resultante se enfra y se filtra mediante un papel de filtro. Se colocan en un pequeo tubo de ensayo unas cuantas gotas de antisuero de conejo (ver su preparacin ms adelante). El filtrado del paso anterior se coloca con cuidado sobre la capa superior del antisuero. Una prueba positiva es la formacin de una banda visible de precipitina en 15 minutos. Se deben incluir suspensiones de muestras control negativas y positivas. El antisuero se prepara en conejos por inoculacin subcutnea de la vacuna Sterne del carbunco los das 1 y 14. Los das 28 y 35, los conejos reciben 0.5 ml de una mezcla de varias cepas virulentas B. anthracis que no superen 105 unidades formadoras de colonias (CFU)/ml suspendidas en solucin salina. Alternativamente, las bacterias virulentas vivas se pueden inactivar por suspensin prolongada en solucin salina con formol al 0.2%, pero se necesita aumentar la masa antignica a 108109 CFU/ml. La suspensin debe ser probada para verificar la inactivacin de B. anthracis antes de la inoculacin del animal cultivando 0.1 ml en 100 ml de caldo nutritivo con 0.1% de histidina y, tras una incubacin a 37 C durante 7 das, subcultivando en agar sangre o en agar nutritivo. Para la suspensin con formol, el rgimen de dosis despus de la vacunacin inicial a los das 1 y 14 consiste en incrementar dosis de 0,1, 0,5, 1, y 2 ml suministradas intravenosamente a intervalos de 45 das. Por cualquiera de estos procedimientos, una sangra a los 10 das de la ltima inyeccin puede determinar si se deben administrar dosis adicionales de 2 ml con la finalidad de aumentar el ttulo de precipitina. ii) Immunofluorescencia

Aunque la observacin de las cpsulas por inmunofluorescencia en condiciones de investigacin ha tenido xito (4), no se ha podido establecer con ella un diagnstico rutinario.

c)

Confirmacin de la virulencia con la reaccin en cadena de la polimerasa

La confirmacin de la virulencia se puede establecer usando la PCR. Las instrucciones siguientes se han extrado de la ref. 11. El ADN molde para PCR que se puede preparar a partir de una colonia fresca de B. anthracis en agar nutritivo suspendiendo un asa del cultivo en 25 l de agua estril desionizada (o destilada) y calentando a 95 C durante 20 minutos. Despus de enfriar hasta aproximadamente 4C y de centrifugar brevemente, el sobrenadante se puede usar para la reaccin PCR. Los cebadores adecuados (2,5) para confirmar la presencia de los plsmidos pX01 y pX02 se dan en el cuadro que se incluye a continuacin. Diana
Antgeno de proteccin (PA)

Cebador ID
PA 5 30483029 PA 8 24522471

Secuencia 53
TCC-TAA-CAC-TAA-CGA-AGT-CG GAG-GTA-GAA-GGA-TAT-ACG-GT CTG-AGC-CAT-TAA-TCG-ATA-TG TCC-CAC-TTA-CGT-AAT-CTG-AG

Tamao del producto

596 bp

Concentracin
1 mM

Cpsula

1234 14111430 1301 22572238

846 bp

0,2 mM

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La PCR se puede llevar a cabo en volmenes de 50 l usando los cebadores indicados anteriormente, 200 M en cada caso de dATP, dCTP, dTTP y dGTP, 1,5 mM de MgC2 y 2,5 unidades de polimerasa ampli Taq TM1, todo en tampn NH4, seguido de la adicin de 5 l de ADN molde. Se ha encontrado que un gel de agarosa al 2% funciona bien con estos fragmentos pequeos. Alternativamente, hay preparaciones Ready-to-GoTM que estn disponibles comercialmente en Pharmacia Biotech2. Se trata de preparados secos, mezclados previamente, y ya distribuidos, que son estables a temperatura ambiente, y que contienen todos los reactivos necesarios, excepto el molde y el cebador, para llevar a cabo reacciones de PCR de 25 l. El molde se puede aadir en un volumen de 2.5 l. Se puede usar el siguiente ciclo de PCR: 1 95C durante 5 minutos; 30 95C durante 0,5 minutos seguido de 0,5 minutos a 55C y de 0,5 minutos a 72C; 1 72C durante 5 minutos; enfriar a 4C. Ha de tenerse en cuenta que los cebadores incluidos en el cuadro anterior, que se han usado durante algunos aos en una instalacin de referencia del carbunco, han sido tiles para confirmar la presencia o ausencia de pXO1 y/o pXO2 en cultivos puros de aislamientos procedentes de especies animales (incluyendo humanos) o en muestras ambientales. Sin embargo, no son adecuados para la deteccin directa de B. anthracis en tales casos. En las refs. 6 y 9 se puede encontrar una seleccin de alternativas. En el caso improbable de que un aislamiento carezca tanto de pXO1 como de pXO2, se debera usar tambin un marcador cromosmico; los cebadores para estos se proporcionan en las refs. 6 y 9.

C. REQUISITOS PARA LAS VACUNAS Y EL MATERIAL DE DIAGNSTICO

La vacuna de ms amplio uso para prevenir el carbunco en animales es la desarrollada por Sterne en 1937 (10). Este autor obtuvo una variante rugosa de B. anthracis virulento en cultivos slidos con suero en atmsfera de elevado contenido en CO2. Esta variante, llamada 34F2, era incapaz de formar cpsula y despus se descubri que haba perdido el plsmido pX02, que codifica la formacin de la cpsula. Ha llegado a ser la cepa ms usada en todo el mundo para produccin de vacunas contra el carbunco en animales. En Europa Central y del Este, el ingrediente activo de las vacunas actuales para el ganado es un derivado equivalente, la cepa 55, que tambin carece de pX02. En el Apndice V de la ref. 11 se suministra una lista de fabricantes de vacuna contra el carbunco para uso en animales. La siguiente informacin referente a la preparacin de vacuna contra carbunco, para uso en animales est basada en las referencias 8 y 12. Se describen procedimientos generales, pero las Autoridades Reguladoras Nacionales deben ser consultadas en relacin a las operaciones de los procedimientos estndares que pueden ser de incumbencia local.

1.
a)

Control del inculo

Caractersticas del inculo
La produccin de vacunas del carbunco se basa en un sistema de lotes de inculos. Un lote de inculo es una cantidad de esporas de composicin uniforme que son procesadas a la vez y mantenidas con el fin de preparar vacunas. Cada lote de inculo no tiene ms de tres pases del cultivo original y debe producir una vacuna que sea eficaz y segura para uso en animales. Se recomienda preparar un gran lote de siembra de la cepa original y conservarlo por liofilizacin para preparacin de futuros lotes. Se pueden adquirir los cultivos originales3. El lote de siembra es aceptable para producir la vacuna de carbunco si una vacuna preparada de dicho lote o una suspensin derivada de un cultivo del lote supera los requisitos de control final respecto a ausencia de contaminacin bacteriana, seguridad y eficacia (inmunogenicidad),

b)

Preparacin del inculo original

Se cultivan lotes de siembra sobre medios slidos diseados para favorecer la esporulacin del organismo (ver seccin C.1.2, ms adelante). La frmula del medio slido de la ref. 8 es: 50 g de casena digerida con tripsina de (tripticasa); 10 g de extracto de levadura; 0.1 g CaCl2.6H2O; 0,01 g de FeSO4.7H2O; 0,05 g de MgSO4.7H2O; 0,03 g de MnSO4.4H2O; 5,0 g de K2HPO4; 1,0 g de KH2PO4; 22 g de agar; 1.000ml de agua desionizada o destilada. Los ingredientes se disuelven en agua convenientemente calentada; la solucin se

1 2 3

Producto disponible en Applied Biosystems; (https://products.applied biosystems.com/ab/en/US/adirect/ab?cmd=catNavigate2&catlD=601622 Uppsala, Sweden, producto nmero 27-9555-01. National Institute for Biological Standards and Control, Blanche Lane, South Mimms, Potters Bar, Hertfordshire EN6 3QG, United Kingdom.

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Captulo 2.1.1. Carbunco bacteridiano

ajusta a pH 7,4, se distribuye en botellas Roux (120 ml por botella) u otro recipiente apropiado, se esteriliza por autoclave y se enfra en posicin horizontal. Despus de que el agar se haya solidificado, se extrae aspticamente el exceso de lquido y las botellas se dejan en un incubador (37C) por al menos 2 das para secarse y para comprobar su esterilidad. Sobre el agar de las botellas Roux se siembran volmenes de 2 ml de inculo vacunal de un laboratorio de referencia, y se debe incubar a 37C hasta que se aprecie un mnimo de 80% de esporulacin (al menos 72 horas) mediante examen microscpico de muestras tomadas aspticamente con el asa de cultivo. La masa microbiana se recoge con 10 ml de de agua estril desionizada o destilada por botella y se comprueba su pureza. Despus de lavar tres veces con agua estril desionizada o destilada se aade a la suspensin final un estabilizador estril para liofilizacin, en el mismo tipo de agua, y se distribuye la solucin en viales para liofilizacin, que luego se congelan.

c)

Preparacin y prueba del inculo de trabajo

Se reconstituye un vial del stock de inculos y se siembran varios cultivos (de aproximadamente 10 ml) para esporulacin en tubos con agar inclinado (con tripticasa). Se incuban 72 horas a 37C y se guardan en nevera. Los tubos con agar inclinado se ensayan en cuanto a pureza mediante cultivo en placas de agar nutritivo y en caldo nutritivo (0,1 ml en 100 ml de caldo nutritivo). Este ltimo se debe subcultivar en agar nutritivo despus de incubar a 37C durante 7 das y debera ser un cultivo puro de B. anthracis. Tambin se debe ensayar una muestra del caldo nutritivo para comprobar la falta de movilidad. Para un proceso de produccin, los volmenes de inculo que se necesitan deben calcularse dependiendo de la cantidad de esporas recogidas de cada tubo de agar inclinado con 10 ml de agua estril desionizada o destilada, que se usarn para inocular cinco botellas Roux.

d)

Seguridad del lote de inculo

Se deben inyectar subcutneamente no menos de 5 109 esporas cultivables en cada una de tres ovejas no vacunadas de 1-2 aos de edad, que deben sobrevivir despus de un perodo de observacin que supere 10 das.

e)

Inmunogenicidad del lote de inculo

Se deben inocular al menos 10 cobayas sanos, de 300500 g de peso, con 5 106 esporas viables y tenerlos en observacin 21 das. Debe sobrevivir al menos el 80% de los animales. Los animales inmunizados, junto con tres controles, deben de ser luego desafiados con 10 dosis letales medias (LD50) de la cepa JB de B. anthracis. Durante un perodo de observacin de 10 das, ninguno de los animales debe sucumbir ante el desafo o descarga mientras que todos los controles deben morir de carbunco. Se deber repetir la prueba en caso de muerte de alguno de los animales inmunizados.

2.
a)

Mtodo de produccin
Preparacin de concentrados de vacuna
Se preparan botellas Roux con medio de agar tripticasa como para el caso del inculo original visto antes en la seccin C.1.b. Una botella Roux puede suministrar unas 2.000 dosis de vacuna. Cada botella Roux se inocula con 2 ml de suspensin de inculo de trabajo y se incuba a 37C con tapn poroso durante varios das hasta que muestras de cultivo tomadas con un asa de platino de botellas seleccionadas al azar revelen que al menos un 90% de los organismos estn en forma esporulada cuando dichas muestras se examinan en preparaciones montadas para contraste de fases (las esporas aparecen brillantes en contraste de fases) o mediante tincin de esporas. Entonces se recoge el crecimiento de cada botella con 20 ml de solucin salina fisiolgica. Se deben realizar pruebas de contaminacin por subcultivo en placas de agar nutritivo e inoculacin de 100 ml de caldo nutritivo con 0,1 ml de las esporas recogidas y su posterior subcultivo en agar nutritivo despus de 7 das a 37C y mediante pruebas de movilidad. Las masas microbianas recogidas despus de el crecimiento que sean aceptables (es decir, aquellas que no muestran evidencia de contaminacin), se almacenan juntas.

b)

Glicerinacin
Al volumen de masa microbiana final recogida se debe aadir el doble del volumen de glicerol neutro puro y estril. Tambin se puede aadir en este paso saponina (a concentracin final de 0,1%) si se tuviera que incluir como adyuvante. Se mezcla exhaustivamente (la adicin de perlas de vidrio esterilizadas suele ser de ayuda). Se realizan pruebas de pureza como antes y se mantiene el producto a temperatura ambiente durante 3 semanas para permitir la lisis de cualquier forma de bacteria vegetativa, se realiza una determinacin de esporas viables y se guarda despus en nevera.

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Captulo 2.1.1. Carbunco bacteridiano c) Determinacin del ttulo y dilucin para uso
El nmero de esporas cultivables en el producto se determina luego sembrando por extensin diluciones decimales sobre placas con agar nutritivo. La suspensin se diluye de modo que la masa final contenga el nmero deseado de esporas cultivables. El diluyente empleado debe contener la misma proporcin de solucin salina, glicerol y (en su caso) saponina que la presente en el concentrado de vacuna. La vacuna debe contener no menos de 1 107 esporas viables por dosis para el ganado bovino, bfalos y caballos, y no menos de 15 106 esporas por dosis para ovejas, cabras y cerdos.

d)

Inocuidad
La prueba de seguridad se realiza sobre dos ovejas o cabras sanas y consiste en la inoculacin subcutnea del doble de la dosis vacunal recomendada. Los animales se observan por 10 das. El producto final supera la prueba si no se desarrollan reacciones sistmicas y si no se observa algo ms que un edema transitorio en el lugar de la inyeccin. Si la prueba se realiza solo en ovejas, un edema progresivo indica que la vacuna puede resultar inadecuada para cabras.

e)

Llenado de recipientes
La distribucin de alcuotas de las vacunas en recipientes de mono y multidosis se realiza como se indica en el Informe Tcnico No. 363 de la serie publicada por la Organizacin Mundial de la Salud titulada Requisitos Generales para los Establecimientos de Produccin y Laboratorios de Control (Requirements for Biological Substances No.1), 1965, 1617. Bsicamente, el producto final se distribuye en los recipientes de modo asptico en un rea no usada para la produccin, y se debe evitar cualquier contaminacin o alteracin del producto. Despus de la distribucin, la vacuna debe liofilizarse en recipientes adecuados a las dosis. Los recipientes se sellan tan pronto como sea posible con un material que no perjudique al producto y que se a capaz de mantener un cierre hermtico durante la validez de la vacuna.

3.

Control del proceso

Las pruebas de pureza se basan en el examen microscpico de frotis teidos y en pruebas de cultivo y movilidad como se indic en la seccin C.2.a.

4.
a)

Control de lotes y pruebas sobre el producto final

Esterilidad
La vacuna es un cultivo de esporas vivas de B. anthracis; la esterilidad no es de aplicacin, pero los lotes se deben ensayar en cuanto a ausencia de contaminacin (ver captulo 1.1.9,).

b)

Eficacia
La eficacia o inmunogenicidad se prueba en el producto final del siguiente modo: se inoculan al menos 10 cobayas sanos de 300500 g con una dosis de vacuna para ovejas. Los cobayas se observan por 21 das, y durante este perodo debe sobrevivir al menos el 80% de los animales. Los cobayas inmunizados supervivientes y tres controles no vacunados se desafan con una dosis apropiada de B. anthracis virulento. Un desafo recomendado es suministrar 200 LD50 de la cepa Pasteur II (JB), que se puede obtener de la misma fuente que la cepa vacunal Sterne 34F2. Si 10 das despus del estmulo de desafo, todos los cobayas vacunados sobreviven y los animales control mueren, se estima que el producto final es satisfactorio. Si durante el perodo que sigue al desafo muere cualquier animal vacunado por causa distinta al carbunco, y la muerte no se asocia con la vacuna, la prueba debe repetirse.

c)

Dosis
La dosis mnima recomendada para ganado vacuno y para caballos es de 1 107 esporas cultivables; para ovejas, cabras y cerdos es de 1-5 106 esporas cultivables. La vacuna debe contener estas esporas en un volumen apropiado, por ejemplo 1 107/ml.

d)

Duracin de la inmunidad
La mayor parte de los expertos consideran que la inmunidad es buena durante al menos 1 ao y se recomienda dar una dosis estimulatoria anual de recuerdo. Los caballos pueden ser ms lentos en el desarrollo de la inmunidad despus de la vacunacin inicial; en consecuencia, algunos productores recomiendan una vacunacin inicial con dos dosis, administradas con separacin de 1 mes, seguida por una nica dosis anual de recuerdo.

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Captulo 2.1.1. Carbunco bacteridiano e) Estabilidad

Al no existir una prueba de aceptacin general para la estabilidad de las vacunas del carbunco, se recomienda que, al llenar cada lote, se determine el nmero de esporas cultivables antes y despus de conservarlos a una temperatura apropiada por un cierto perodo. No debera evidenciarse un descenso en el nmero de esporas cultivables.

f)

Conservantes y almacenamiento
Las esporas de Bacillus anthracis son estables en vacunas liofilizadas y no liofilizadas y no se necesitan conservantes. Se recomienda su almacenamiento con refrigeracin (4C).

g)

Precauciones (riesgos)
Se sabe que la vacuna produce enfermedad en algunas cabras y llamas; esto puede deberse al adyuvante de saponina. No se recomienda el uso de la vacuna en hembras grvidas ni en animales destinados al sacrificio antes de las 23 semanas de la vacunacin. Las regulaciones locales en algunos pases o regiones pueden especificar otros intervalos temporales, pero no existe ninguna razn cientfica para considerar que la carne de animales clnicamente sanos no es apta para el manejo o consumo humano despus de un perodo de retencin de 2 semanas despus de la vacunacin. Est contraindicada la administracin simultnea de antibiticos a animales vacunados, pues el antibitico puede interferir con la vacuna. No se deben dar antibiticos durante algunos das antes y algunos das despus de la vacunacin. La vacuna viva no usada, los viales vacos, y el equipo usado para la vacunacin estn contaminados con esporas vivas y deberan ser autoclavados, desinfectados o incinerados. En el hombre, la inoculacin accidental se trata eliminando en lo posible el inculo en el sitio de la inyeccin y lavando extensamente la herida con agua y jabn. Debe buscarse atencin mdica si se desarrollara infeccin.

5.
a)

Pruebas sobre el producto final

Seguridad
Cada lote de vacunas debe ser ensayado en cuanto a seguridad como se describe en la seccin C.2.d.

b)

Potencia
Cada lote de vacunas debe ser ensayado en cuanto a potencia como se describe en la seccin C.4.b.

6.

Propagacin del bacterifago gamma para diagnstico

Los fagos especficos del carbunco se aislaron por primera vez en los aos 1950, y el denominado en concreto fago gamma se describi inicialmente en 1955 y pronto se convirti en un diagnstico estandarizado para el carbunco. El fago gamma pertenece a una familia de fagos del carbunco estrechamente relacionados (11). Ocasionalmente se puede encontrar un B. anthracis negativo para el fago o un B. cereus positivo para el fago. Aunque el fago debe usarse conjuntamente con otras pruebas para la confirmacin, la prueba es til y fiable. Las suspensiones de fagos se pueden obtener en laboratorios veterinarios centrales o de laboratorios de Salud pblica. El fago se puede propagar y concentrar mediante el siguiente protocolo. Se mantiene el fago a 24C sin congelar, pues perdera rpidamente la viabilidad. Fase 1 i) ii) Se siembra una placa de agar sangre (BA) con la cepa de la vacuna Sterne de B. anthracis. Se Incuba durante una noche a 37C. Se inoculan aproximadamente 10 ml de caldo nutritivo (NB) con una muestra de su crecimiento en la placa de BA e incubar a 37C durante aproximadamente 4 horas o hasta que se inicie la turbidez, y despus refrigerar. Se siembran por extensin 100 l del cultivo del paso ii en tres placas previamente secadas con medio de BA y se incuba a 37C durante 3060 minutos. Se siembran por extensin 100 l de la suspensin de fago sobre las mismas placas. Se incuba una noche a 37C. Se recoge el fago liberado por lisis en la placa BA con 5 ml de NB y se realiza un segundo lavado con 5 ml de NB. Se Incuba durante una noche a 37C.

iii) iv) v)

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Captulo 2.1.1. Carbunco bacteridiano

vi) Se Filtra (0.45 m) y se titula dejando unas gotas de 20 l (tres gotas por dilucin) de diluciones decimales del filtrado en solucin salina sobre una capa de B. anthracis cultivado como en el paso iii.

Fase 2 Se sigue esencialmente el mismo procedimiento descrito en la fase 1, aunque solo se usa el filtrado del paso vi para recoger el fago de las placas. vii) Se preparan tres cultivos de la cepa Sterne en medio BA, como e el paso iii. Se incuba a 37 C durante 30 60 minutos.

viii) Se extienden 100 l de fago del paso vi. Se incuba a 37C durante la noche. ix) x) xi) xii) Se aade 1 m de NB concentrado 10 a 9 ml del filtrado del paso vi. Se recoge el fago del paso viii con 5 ml de la solucin del paso ix, y se realiza un segundo lavado de 5 ml con el resto de la solucin del paso ix. SE aaden 10 ml de 1 NB. Se incuba a 37 C durante la noche, se filtra y se cuenta.

Fase 3 xiii) Se inoculan 100 ml de caldo de infusin de cerebro y corazn con aproximadamente 2,5 ml del cultivo del paso ii. Se incuba en un agitador rotatorio a 37C hasta que aparezca la turbidez. xiv) Se aaden 20 ml del filtrado del paso xii y se contina la incubacin toda la noche. xv) El filtrado obtenido se analiza para comprobar su esterilidad y se titula en diluciones decimales sobre una capa de la cepa de la vacuna como en el paso (vi) para determinar la concentracin del fago. Esta debera ser del orden de 108109 unidades formadoras de placas por ml.

7.

Azul de metileno policromtico (tincin de MFadyean)

El azul de metileno policromtico se prepara de la siguiente forma: se disuelven 0,3 g de azul de metileno en 30 ml de etanol al 95%; se mezclan 100 ml de 0,01% de hidrxido potsico (KOH) con la solucin de azul de metileno. Esta solucin debera exponerse preferentemente al aire, con una agitacin ocasional, durante al menos 1 ao para que se oxide y madure. La adicin de K2CO3 (a una concentracin final del 1%) acelera la "maduracin" del colorante, pero antes de que se considere fiable desde el punto de vista del diagnstico, debe establecerse su eficacia probndola en paralelo con un lote previo de colorante funcional sobre muestras bona fide. Se ha encontrado que las tinciones que dan reaccin positiva con cultivos de B. anthracis cultivado artificialmente en sangre de caballo no dan a veces resultados positivos en el campo. Para hacer frotis para tinciones, solo se necesitan unas gotitas de sangre o fluido del tejido, y es mejor un frotis reducido. Despus de fijarla en etanol y secarla, se coloca una gota de colorante (aproximadamente 20 l) sobre el frotis y se extiende sobre l con un asa de platino. Transcurrido 1 minuto, el colorante se lava con agua, se empapa el exceso, se seca al aire y se observa inicialmente usando una lente con un objetivo de 10 bajo el cual aparecen las cadenas cortas como cabellos pequeos; una vez encontradas, se pueden observar usando aceite de inmersin (1.000) para buscar la presencia de la cpsula rosa rodeando los bacilos teidos de azul/negro. Para evitar la contaminacin en el laboratorio, la placa y el papel absorbente se deben autoclavar o dejar durante algunas horas en una solucin de hipoclorito sdico al 10%.

REFERENCIAS
1. 2. ASCOLI A. (1911). Die Przipitindiagnose bei Milzbrand. Centralbl. Bakt. Parasit. Infeckt., 58, 6370. BEYER W., GLOCKNER P., OTTO J. & BOHM R. (1996). A nested PCR and DNA-amplification-fingerprinting method for detection and identification of Bacillus anthracis in soil samples from former tanneries. Salisbury Med. Bull., No. 87, Special Suppl., 4749. BROWN E.R. & CHERRY W.B. (1955). Specific identification of Bacillus anthracis by means of a variant bacteriophage. J. Infect. Dis., 96, 3439. EZZELL J.W. & ABSHIRE T.G. (1996). Encapsulation of Bacillus anthracis spores and spore identification. Salisbury Med. Bull., No 87, Special Suppl., 42.

3.

4.

Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008

Captulo 2.1.1. Carbunco bacteridiano

5. HUTSON R.A., DUGGLEBY C.J., LOWE J.R., MANCHEE R.J. & TURNBULL P.C.B. (1993). The development and assessment of DNA and oligonucleotide probes for the specific detection of Bacillus anthracis. J. Appl. Bacteriol., 75, 463472. JACKSON P.J., HUGH-JONES M.E., ADAIR D.M., GREEN G., HILL K.K., KUSKE C.R., GRINBERG L.M., ABRAMOVA, F.A. & KEIM P. (1998). PCR analysis of tissue samples from the 1979 Sverdlovsk anthrax victims: The presence of multiple Bacillus anthracis strains in different victims. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 95, 1224 1229. KNISELY R.F. (1966). Selective medium for Bacillus anthracis. J. Bacteriol., 92, 784786. MISRA R.P. (1991). Manual for the Production of Anthrax and Blackleg Vaccines. Food and Agriculture Organisation of the United Nations (FAO) Animal Production and Health Paper 87, FAO, Rome, Italy. RAMISSE V., PATRA G., GARRIGUE H., GUESDON J.L. & MOCK M. (1996). Identification and characterization of Bacillus anthracis by multiplex PCR analysis of sequences on plasmids pXO1 and pXO2 and chromosal DNA. FEMS Microbiol. Lett., 145, 916.

6.

7 8.

9.

10. STERNE M. (1937). The effect of different carbon dioxide concentrations on the growth of virulent anthrax strains. Onderstepoort J. Vet. Sci. Anim. Ind., 9, 4967. 11. TURNBULL P.C.B., BOEHM R., COSIVI O., DOGANAY M., HUGH-JONES M.E., LALITHA M.K. & DE VOS V. (1998). Guidelines for the Surveillance and Control of Anthrax in Humans and Animals. WHO/EMC/ZDI/98.6. World Health Organization, Geneva, Switzerland. 12. WORLD HEALTH ORGANIZATION EXPERT COMMITTEE ON BIOLOGICAL STANDARDIZATION (1967). Requirements for Anthrax Spore Vaccine (Live for Veterinary Use) (Requirements for Bioiogical Substances No. 13). World Health Organization (WHO) Technical Report Series No. 361. WHO, Geneva, Switzerland.

LECTURAS ADICIONALES

A.

LOGAN N.A. & TURNBULL P.C.B. (1998). Bacillus and recently derived genera. In: Manual of Clinical Microbiology, Seventh Edition, Murray P.R., Baron E.J., Pfaller M.A., Tenover F.C. & Yolken R.H., eds. American Society for Microbiology, Washington DC, USA, 357369. QUINN C.P. & TURNBULL P.C.B. (1998). Anthrax. In: Topley & Wilsons Microbiology and Microbial Infections, Vol. 3, Ninth Edition, Collier L., Balows A. & Sussman M., eds. Arnold, London, UK, 799818. TURNBULL P.C.B., (ED.) (1996). Proceedings of the International Workshop on Anthrax. Salisbury Med. Bull., Special Supple. No. 87, 139 pages. TURNBULL P.C.B. (1998). Anthrax. In: Zoonoses. Biology, Clinical Practice, and Public Health Control. Palmer S.R., Soulsby E.J.L. & Simpson D.I.H., eds. Oxford University Press, Oxford, UK, 316. WHITFORD H.W. & HUGH-JONES M.E. (1994). Anthrax. In: Handbook Series in Zoonoses, Second Edition, Beran G.W., editor-in-chief. CRC Press, Boca Raton, Florida, USA, 6182.

B.

C.

D.

E.

* * *

NB: Existe un laboratorio de referencia de la OIE para el carbunco (vase EL cuadro en la parte 3 de este Manual o consltese una lista actualizada en la pgina web de la OIE: www.oie.int).

10

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