PTICA Y MICROSCOPA

CSAR EDUARDO MONTALVO ARENAS

Agosto DEL 2006

un ra$o luminoso posee las caractersticas del movimiento ondulatorio P%op'ed&de" de un& ond& lu$'no"&. La figura luz 2 nos muestra el esquema de una onda de luz" en el que se observan las c%e"t&" )&+ de la onda as como sus valles (b). !e denomina un ciclo de la onda a la distancia recorrida por el fotn entre dos crestas o dos valles Las propiedades de una onda luminosa son2 a& Longitud de onda Es la distancia que e-iste entre dos crestas o dos valles sucesivos de la onda luminosa Las longitudes de onda de la luz son mu$ peque1as2 3eneralmente se miden en nanmetros (nm& o en angstroms (). !i observamos la figura luz * nos percataremos que las longitudes de onda del espectro radiante visible abarcan entre 400 nm. (color violeta) a 700 nm. (color rojo). La longitud de una onda luminosa se e-presa por la letra griega lambda %& E-isten otras formas de energa radiante que poseen longitudes de onda muc0o menores como la radiacin ultravioleta" los ra$os ." la radiacin de electrones" los ra$os gamma $ a4n m#s cortas como los ra$os csmicos Entre las formas de energa cu$as longitudes de onda son m#s largas que las de la luz" est#n consideradas la radiacin infrarro)a %calrica& $ las ondas de radio que suelen medir varios metros de longitud Las diferentes longitudes de onda de la luz son percibidas como colo%e". Esto significa que cada color observado por el o)o 0umano o captado por el material fotogr#fico sensible se debe a la estimulacin por una determinada longitud de onda del 0az luminoso

Concepto de luz. La luz es una forma de energa radiante electromagntica que percibimos con el sentido de la visin La luz es la porcin visible de la energa radiante !e considera a la luz como un fenmeno electromagntico" por lo tanto est# constituida por partculas electromagnticas denominadas !otone"# que se desplazan a travs del espacio a una velocidad constante" siguiendo tra$ectorias rectilneas" con un movimiento ondulatorio $ propag#ndose en el vaco" en el aire $ a travs de todos los cuerpos transparentes como el agua $ el vidrio La luz es irradiada a travs del espacio en todas las direcciones !u movimiento ondulatorio se propaga en lnea recta $ la velocidad de esta propagacin depende de la densidad del medio transparente que atraviesa El sol emite energa radiante electromagntica %espectro radiante& compuesta por energa radiante visible %luz&" $ energa radiante invisible como las radiaciones ultravioleta %' ( & e infrarro)a $ otras radiaciones que se grafican en la figura luz *

+igura

Luz * Se $ue"t%&n l&" d'!e%ente" lon('tude" de ond& )n&n*$et%o"+ del e"pect%o elect%o$&(n,t'co. L& luz ocup& un pe-ue.o e"p&c'o en todo el e"pect%o %&d'&nte.

,omo se puede apreciar" la luz ocupa una zona mu$ reducida en el con)unto de ondas electromagnticas del espectro total" tambin integrado por un grupo de ondas invisibles que abarcan" desde un e-tremo a otro" a los ra$os csmicos" ra$os gamma" ra$os ." radiacin ultravioleta" ra$os infrarro)os" microondas" ondas de /(" de radio" etc A pesar que estas radiaciones son invisibles al o)o 0umano" varias de ellas pueden estimular los componentes fotosensibles del material fotogr#fico" como por e)emplo los ra$os . (radiografas)" los ra$os gamma (gammagrafas)" 0aces de electrones (fotografas obtenidas con el microscopio electrnico) $ las fotografas que se captan con instrumentos especiales %microscopios $ c#maras fotogr#ficas& que iluminan o irradian a los ob)etos con ra$os ultravioleta (fluorescencia) o con radiacin infrarro)a Los !otone" son partculas sumamente peque1as" de masa igualmente peque1a que no puede ser medida pero poseedoras de gran energa que" al desplazarse en el espacio lo 0acen de manera ondulatoria $ en lnea recta" por lo tanto

'n 0az de luz blanca es visualizado como tal" cuando lo integran una mezcla uniforme de ra$os luminosos de todas las longitudes de onda El o)o 0umano percibe el color porque la retina contiene dos tipos de clulas nerviosas fotosensibles cono" )perciben colores+ $ /&"tone" %captan sensaciones de blanco $ negro& Los conos" a su vez" son clulas que dependiendo de la longitud de onda que los estimula" captan los tres tipos de colores primarios2 azul" verde $ ro)o El material fotogr#fico sensible %pelculas $ papeles& a colores" posee tres capas sensibles para cada una de estas longitudes de ondas luminosas" por lo tanto debemos considerar que el espectro visible que capta este material est# integrado por los citados ra$os luminosos

+igura luz 2
"u &$pl'tud.

E"-ue$& de un& ond& lu$'no"& $o"t%&ndo "u lon('tud 0

b& mplitud de onda. Es la distancia que e-iste entre la parte superior e inferior de la onda %fig luz 2 & La amplitud de onda le confiere a un ra$o luminoso" la intensidad luminosa o brillante! sin modificar el color Esto significa que si un 0az luminoso de un color determinado es m#s intenso o m#s brillante que otro del mismo color es porque la amplitud de onda del primero es ma$or que la del segundo

La energa total de un 0az luminoso que llega a un ob)eto %luz incidente& debe equivaler a la suma de la energa de la luz refle)ada" absorbida $ trasmitida El material ptico que trasmite los ra$os luminosos" de acuerdo a una disposicin $ orientacin definida $ regular de sus molculas" se denomina t%&n"p&%ente. !i trasmite la luz pero desordena el tra$ecto de los ra$os $ los dirige en todas las direcciones" recibe el nombre de t%&n"l4c'do. !i un material absorbe la ma$ora de los ra$os luminosos se dice que es op&co

C&%&cte%1"t'c&" de l& luz. En un determinado medio la luz

se desplaza en lnea recta $ con una velocidad constante La luz se desplaza tambin en un espacio relativamente vaco $ en el vaco total" esto a diferencia de las ondas sonoras $ de las ondas de agua que requieren de un medio material para que puedan e-istir $ desplazarse ,uando un ra$o luminoso pasa de un medio menos denso %aire" por e)emplo& a otro transparente de ma$or densidad" como el agua" vidrio o pl#stico" su velocidad disminu$e !in embargo" si abandona este medio m#s denso $ se desplaza nuevamente en el medio menos denso" recobra su velocidad original Estos cambios de velocidad son importantes pues producen una de las caractersticas de la luz2 l& %e!%&cc'*n. La luz que se origina de una fuente emisora se desplaza o irradia en todas direcciones De tal forma que su energa se dispersa a medida que se ale)a de su punto de origen5 por lo tanto" la energa luminosa que incide sobre una superficie situada a cierta distancia ser# menor que la que incide sobre la misma superficie pero situada m#s cerca de la fuente emisora Este 0ec0o se percibe como un cambio en la luminosidad ,uando la luz se desplaza a travs del are suele llegar a la superficie de alg4n ob)eto %fig luz 6 & $" en ese punto la luz puede ser2 "eflejada . Las superficies de los ob)etos no transparentes refle)an o 7rebotan8 la luz
9adiacin de calor

5&z lu$'no"o

;aterial transl4cido +igura luz < Reco%%'do de lo" %&0o" lu$'no"o" en un $&te%'&l
t%&n"l4c'do.

,uando un ra$o luminoso emitido en un medio de menor densidad incide sobre un cuerpo transparente de ma$or densidad $ que posee superficies planas %un vidrio grueso" por e)emplo& lo puede 0acer en varios #ngulos de incidencia Dependiendo del #ngulo de incidencia el ra$o luminoso e-perimenta varios fenmenos2 &+ !i lo 0ace perpendicularmente a la superficie del cuerpo trasparente El ra$o luminoso lo atraviesa sin e-perimentar ning4n tipo de desviacin en su tra$ectoria %fig luz6a& La modificacin que e-perimenta es disminuir su velocidad La velocidad de la luz es de 600"000 =m>sg en el aire Al atravesar ese medio transparente %vidrio& su velocidad se reduce a 200" 000 ?m >sg @or lo tanto el vidrio tendr# un poder de refraccin de * < pues el ndice de refraccin se e-presa as2 I R A velocidad de la luz en el aire velocidad de la luz en el medio La cifra e-presa la relacin que e-iste entre la velocidad de la luz en el aire $ su velocidad en el medio transparente utilizado De la misma manera" se pueden obtener los ndices de refraccin de una serie de sustancias que se utilizan tanto en microscopa como en fotografa o en otras actividades en las que se utilizan medios pticos A continuacin se muestran los ndices de refraccin de una serie de sustancias transparentes2 Su"t&nc'& Bndice de refraccin t%&n"p&%ente Aire * 0006 Agua +luorita 3licerina Aceite de inmersin * 6600 * :6:0 * :C00 * <*<0 2

)&+

)/+

+igura luz 6 a& luz %e!le2&d&5 b& luz &/"o%/'d& bsorbida. !i el ob)eto es opaco %no transparente&" la luz no refle)ada en su superficie es absorbida por el ob)eto $ desaparece La energa luminosa absorbida se transforma en energa calrica dentro del ob)eto #ransmitida. !i el ob)eto es transparente" la ma$or parte del 0az luminoso lo atraviesa $ contin4a su desplazamiento a travs del mismo

+igura luz :
t%&n"p&%ente.

Ond&" lu$'no"&" t%&n"$'t'd&" & t%&3," de un o/2eto

(idrio +lint Dirconia Diamante !ulfuro de plomo

* <200 * 6600 * E200 2 :200 6 E*00

seg4n la le$ de !nell" los diversos colores de la luz son refractados $ desviados en distinto grado luz

T&/l& 6. Fndices de refraccin de diversas sustancias transparentes

/
&'%e
:<o

&

7/

+igura luz C D'"pe%"'*n de un :&z de luz /l&nc&; &l &t%&3e"&% un p%'"$&; 3'd%'o
en %&0o" lu$'no"o" de d'!e%ente" lon('tude" de ond&.

&'%e

7c

Esta propiedad por la que las ondas luminosas de diferente longitud" integrantes de un 0az de luz blanca" se desplazan a diferente velocidad en un cuerpo transparente $ e-perimentan desviaciones en su recorrido en diferentes grados de desviacin se denomina d'"pe%"'*n o de"co$po"'c'*n de la luz El e)emplo m#s evidente es el que se produce cuando un 0az de luz blanca incide en la superficie de un prisma Las diferentes longitudes de onda de los ra$os 0acen que estos se refracten $ dispersen en #ngulos distintos ocasionando que por la superficie opuesta del prisma emer)an los ra$os luminosos de distintos colores Los ra$os violetas $ azules se refractan m#s $ su grado de desviacin ser# ma$or que los ra$os de color naran)a o ro)o %+ig luz C & Pol&%'z&c'*n de l& luz La luz irradiada por un cuerpo emisor se desplaza en forma rectilnea en todas las direcciones del espacio $ las ondas luminosas oscilan en todos los planos perpendiculares a su desplazamiento" es decir" en #ngulos rectos con respecto a dic0as tra$ectorias %fig luz H & !i en el camino que siguen los ra$os se interpone un dispositivo que tenga un arreglo molecular de sus componentes en forma de re)illas mu$ finas orientadas en un solo plano % prismas o filtros de polarizacin&" el ra$o luminoso que continuar# su recorrido ser# aquel cu$o plano de vibracin coincida con la orientacin del dispositivo5 en cambio" los otros ra$os luminosos detendr#n su tra$ectoria !e afirma que el ra$o que contin4a vibrando" al atravesar la re)illa de polarizacin" es un ra$o luminoso polari!ado. 'n 0az de lu! polari!ada esta integrado por ra$os luminosos que vibran en una sola direccin o en un solo plano de polarizacin

+ig luz 6 G El e"-ue$& %ep%e"ent& l& t%&0ecto%'& de t%e" %&0o"

lu$'no"o" )3'd%'o+. -ue 'nc'den en l& "upe%!'c'e de un cue%po t%&n"p&%ente

/+ El ra$o luminoso incide de manera oblicua sobre la superficie" en un #ngulo equivalente a :<o grados o menos En estas condiciones" el ra$o luminoso no atraviesa el cuerpo transparente" $ 7rebota8 sobre su superficie" en un #ngulo similar al de incidencia %fig luz 6b & A esta caracterstica se le denomina %e!le9'*n de la luz $olor de un objeto !i un ob)eto coloreado" opaco o transparente" es iluminado por un 0az de luz blanca" refle)ar# o trasmitir# 4nicamente los ra$os luminosos que tengan una longitud de onda similar al del color del ob)eto Los ra$os luminosos de otras longitudes de onda que componen el 0az de luz blanca ser#n absorbidos por el ob)eto De la misma manera" si el ob)eto refle)a todas las longitudes de onda del 0az luminoso que incide sobre l" la sensacin de color que percibimos ser# el color blanco En cambio si absorbe todas las longitudes de onda" la sensacin visual ser# la del color negro. c+ El ra$o luminoso incide de manera oblicua sobre la superficie en #ngulos ma$ores a :< o grados En este caso el ra$o luminoso se desva en su tra$ectoria acerc#ndose 0acia el ra$o que incide de manera perpendicular %ra$o 7a8 o normal& $ no se desva Al abandonar el medio transparente $ discurrir en el medio de menor densidad" el ra$o luminoso vuelve a desviarse %fig luz 6c&" pero a0ora ale)#ndose de la normal A esta caracterstica del ra$o luminoso se le denomina %e!%&cc'*n. D'"pe%"'*n o de"co$po"'c'*n de l& luz. La velocidad de un ra$o de luz" en un medio depende de su longitud de onda Los ra$os luminosos de ondas cortas pierden m#s velocidad que aquellos de ondas largas5 un ra$o de luz azul se desplaza m#s lentamente que un ra$o de luz ro)a" esto significa que el ndice de refraccin de un cuerpo transparente vara con la longitud de onda del ra$o luminoso que lo atraviese @or lo tanto"

+igura luz H Se $ue"t%& l& $&ne%& co$o "e (ene%& luz pol&%'z&d&.

Inte%!e%enc'& de lo" %&0o" lu$'no"o". Dos ondas luminosas que se emiten desde un mismo punto $ discurren paralelas 6

entre s 0aciendo coincidir sus cimas $ valles %se dice que las ondas luminosas est#n en fase&" suman sus intensidades %brillantez& $ al incidir sobre un ob)eto lo iluminan con ma$or intensidad o brillantez %fig luz Ea& En cambio" si dos ondas luminosas discurren ligeramente desfasadas" en un I en J longitud de onda % contraste de fases de las ondas luminosas& la intensidad de ellas se anula" de manera parcial o total" respectivamente %fig luz E b $ c& Esto se traduce en que el ob)eto iluminado por ellas recibir# la mitad de la intensidad luminosa %*>: de desfase& o al anularse totalmente %*>2 de desfase& no ser# iluminado A este comportamiento de dos ondas luminosas desfasadas se le denomina interferencia

)&+

)/+

)c+

+igura luz *0. D'!e%ente" cl&"e" de lente" d'3e%(ente"> &+ /'c*nc&3&; /+

pl&n&?c*nc&3& 0 c+ con3e9&?c*nc&3& ) $en'"co d'3e%(ente+.

CARACTERISTICAS @ENERALES DE LAS LENTES. Los ra$os luminosos procedentes de un cuerpo emisor5 los refle)ados o los trasmitidos por un ob)eto iluminado $ que se trasladan en el espacio" al incidir sobre la superficie de una lente biconve-a" le confieren a sta una serie de caractersticas tales como2 Cent%o *pt'co de l& lente !e denomina as a un punto situado en el centro de la lente" sobre el e)e principal %fig luz ** c o & Kueda establecido que los ra$os luminosos que atraviesan una lente $ pasan por el centro ptico" no se refractan El requisito indispensable para que se cumpla esta condicin es que los ra$os luminosos incidan de manera perpendicular sobre la superficie curva de la lente E2e o %&0o p%'nc'p&l. Es la lnea marcada por la tra$ectoria de un ra$o luminoso que incide perpendicularmente sobre la superficie curva de la lente $ la atraviesa por el centro ptico %a& Este ra$o luminoso no e-perimenta ni refraccin ni refle-in 3eomtricamente se define como la lnea que conecta el centro de las dos esferas" de cu$as superficies se originan las dos superficies curvas de la lente %fig luz ** & Las diversas mediciones que se 0acen con relacin a las lentes toman como referencia el e)e principal
%b&

+igura

luz E E"-ue$&" -ue %ep%e"ent&n el %eco%%'do de ond&" lu$'no"&" cu&ndo e"t8n en &+ !&"e; /+ de"!&"&d&" en < de lon('tud de ond& 0 c+ en un = de lon('tud de ond&.

LENTES. !e denominan lentes a ciertos aditamentos transparentes %vidrio" pl#stico" etc & que presentan por lo menos una de sus superficies curvas E-isten dos tipos de lentes2 Lente" con3e%(ente" o po"'t'3&" !e caracterizan porque concentran los ra$os luminosos paralelos que se desplazan a travs de ellas" en un punto denominado !oco. !e reconocen como tales porque son m#s gruesas en la parte central $ m#s delgadas en la parte perifrica E-isten tres clases de lentes convergentes o positivas" como se muestra en la figura luz E

%a&

A!

! %c&

co

A!

%a&

%b&

%c&

+igura luz E D'!e%ente" cl&"e" de lente" con3e%(ente"> &+ /'con3e9&; /+

pl&n& con3e9& 0 c+ c*nc&3&?con3e9& )$en'"co con3e%(ente+.

+igura luz ** G C&%&cte%1"t'c&" de un& lente /'con3e9&.

Lente" d'3e%(ente" o ne(&t'3&" !on las lentes en los cuales los ra$os luminosos paralelos que las atraviesan tienden a dispersarse impidiendo que se constitu$a un foco2 El foco de estas lentes se forma por la pro$eccin virtual de los ra$os dispersados" en el mismo lado de la lente de donde provienen los ra$os luminosos @or esta razn se dice que es un foco negativo Las lentes divergentes se reconocen porque son m#s delgadas en la parte central $ m#s gruesas en la parte perifrica Las lentes negativas son de tres clases" tal como se observa en la figura luz *0

R&0o" "ecund&%'o" !on todos los ra$os luminosos %b $ c& que se desplazan en forma paralela al e)e principal de la lente %fig luz ** b& $ no atraviesan el centro ptico /odos ellos" en menor o ma$or grado" inciden de manera oblicua sobre la superficie curva de la lente $" al atravesarla" son refractados Al emerger $ continuar su recorrido cruzan el e)e principal en un punto denominado !oco %f&. Boco o punto !oc&l de un& lente Es el lugar del e)e principal en donde los ra$os paralelos o secundarios que inciden en una lente" al ser refractados" convergen en un determinado punto 'na lente que opera en un medio de igual ndice de refraccin" a ambos lados de ella" posee dos puntos focales o focos equidistantes del centro ptico de la lente %fig luz **& :

Las lentes positivas tienen focos reales En este sistema de lentes convergentes el primer foco % f & esta localizado en el espacio enfrente de la lente del lugar donde proviene el 0az de luz" el segundo foco % fL & est# detr#s de la lente %fig luz **& al lado de donde se descarga la luz refractada En las lentes divergentes los ra$os paralelos al e)e principal que inciden en una de sus superficies %lente bicncava& se refractan $ emergen de la lente ale)#ndose del e)e principal" por lo tanto" no e-iste la posibilidad que formen un foco real @ara representar el foco de esta lente se deben prolongar los ra$os refractados 0acia el mismo lado del punto donde se origin la luz En el punto donde estas prolongaciones convergen se considera que se forma el foco virtual de la lente negativa D'"t&nc'& !oc&l Es la distancia que e-iste entre el foco $ el centro ptico de la lente %fig luz ** & /oda lente al poseer dos focos tambin tiene dos distancias focales" una a cada lado de la lente Do/le de l& d'"t&nc'& !oc&l Es la distancia equivalente a dos distancias focales %2f& /ambin e-isten dos distancias focales %fig luz **& a cada lado de la lente De la misma manera" se pueden se1alar sobre el ra$o principal tres %6f&" cuatro %:f& o infinitas %nf& distancias focales Bo%$&c'*n de l& '$&(en de un o/2eto & t%&3," de un& lente. La construccin geomtrica de la imagen de un ob)eto" cu$os ra$os luminosos inciden $ atraviesan una lente debe cumplir las siguientes condiciones2 Desde cualquier punto del objeto O, por ejemplo desde el punto p, se emiten varios rayos luminosos. Para que se forme la ima en de ese punto p se tra!an dos rayos luminosos que se despla!an si uiendo dos trayectorias diferentes" #no de ellos, paralelo al eje principal, se refracta al atravesar la lente y prosi ue su recorrido para interceder con el foco (f$) de la lente y continuar su despla!amiento, de manera indefinida, al otro lado de la lente. %l otro rayo que parte del mismo punto p incide de manera perpendicular sobre la superficie de la lente, atraviesa el centro &ptico, por lo tanto no se refracta, y contin'a su trayectoria. %n el lu ar donde los dos rayos se interceptan se forma la ima en del punto p. (uando todos los puntos del objeto )ayan construido sus correspondientes im* enes al otro lado de la lente, entonces la sucesi&n de ellos inte rar* la ima en del objeto (fi . lu! +,.). @ara que se forme la imagen de un punto de un ob)eto" los dos ra$os luminosos que se originen del citado punto deben interceptarse al otro lado de la lente

caractersticas de los ra$os luminosos que incidan en la lente $ la distancia que guarda el ob)eto con relacin a la lente De acuerdo a estos criterios" e-isten varios procedimientos para la formacin de im#genes a travs de una lente

C&%&cte%1"t'c&" (ene%&le" de l&" '$8(ene" !o%$&d&" po% un& lente>

%magen real. Es la imagen que se forma al otro lado de la lente de donde esta situado el ob)eto !e caracteriza porque puede ser recogida o pro$ectada en una pantalla %o en una pelcula fotogr#fica& %magen virtual Es la imagen que se forma en el mismo lado de la lente donde est# situado el ob)eto !e caracteriza porque no puede ser recogida o pro$ectada en una pantalla %magen aumentada o de ma&or tama'o ,omo su nombre lo indica es una imagen del ob)eto aumentada varias veces el tama1o real del mismo %magen de menor tama'o Es m#s peque1a que el tama1o real del ob)eto %magen derec(a ;uestra el e-tremo superior e inferior de la imagen en la misma posicin que tiene el ob)eto %magen invertida Los e-tremos superior e inferior de la imagen est#n situados de manera inversa a la posicin real que posee el ob)eto5 as mismo" los lados derec0o e izquierdo est#n invertidos ,asos que se presentan en la formacin de im#genes2 6. %magen de un objeto cuando est) situado entre la lente & el foco. Los dos ra$os luminosos que emite cada punto del ob)eto atraviesan la lente" se refractan pero no se interceptan entre s" porque no logran converger sino" al contrario divergen @ara que se pueda construir la imagen" deben prolongarse los ra$os luminosos" al mismo lado de la lente donde est# el ob)eto %fig luz *2 &

+ig luz *2 O/2eto "'tu&do ent%e l& lente 0 el !oco.

,aractersticas de la imagen > de $&0o% t&$&.o; de%ec:& 0 3'%tu&l. E)emplos2 la lupa & el ocular del microscopio %magen de un objeto situado en el foco. Los dos ra$os luminosos que se emiten en los puntos del ob)eto $ atraviesan la lente no convergen pues se desplazan de manera paralela" por lo tanto no se interceptar#n $ tampoco se formar# la imagen en ninguno de los lados de la lente %fig luz *6& !i el ob)eto fuera un punto luminoso" al otro lado de la lente" se pro$ectar# un 0az luminoso que se prolonga al infinito

Bo%$&c'*n de '$8(ene". La capacidad de las lentes para

formar im#genes" en una serie de instrumentos pticos" tales como microscopios" lupas" c#maras fotogr#ficas" telescopios" binoculares" etc " depende en gran medida de las

<

+igura luz *6. O/2eto "'tu&do $8" &ll8 de A!.

A!

co

E)emplos2 c)mara microscopio.

fotogr)fica*

el

condensador

del

+igura luz *6 O/2eto "'tu&do en el !oco.

F. %magen de un objeto situado muc(o m)s all) del doble de la distancia focal. ,onforme el ob)eto se sit4a muc0o m#s all# del doble de la distancia focal" la imagen se va 0aciendo cada vez m#s peque1a %fig luz *C&" 0asta transformarse en un punto

E)emplos2 una linterna a bateras* un faro & un reflector +ue sirve para iluminar espect)culos. C. %magen de un objeto situado entre el foco & el doble de la distancia focal (entre f & ,f). Los ra$os luminosos emitidos por cada punto del ob)eto forman una imagen con las caractersticas siguientes2 de $&0o% t&$&.o; %e&l e 'n3e%t'd& %fig luz *: & A! !
co

A!

+igura luz *C. O/2eto "'tu&do $uc:o $8" &ll8 del do/le de l& d'"t&nc'&
!oc&l) 'n!'n'to+.

2f

co

+igura luz *:. O/2eto "'tu&do ent%e ! 0 A!.

E)emplos2 el objetivo del microscopio* el pro&ector de diapositivas o transparencias* el pro&ector de cine. D. %magen de un objeto situado en el doble de la distancia focal (en ,f). De acuerdo a la construccin geomtrica de la imagen Msta tiene las siguientes caractersticas > del mismo tama1o" real e invertida %!'(.luz.6E& -jemplo" -istema &ptico para copiar diapositivas.

E)emplo2 los indicadores luminosos +ue se usan se'alar determinadas partes de la imagen pro&ectada de una transparencia. La concentracin de ra&os del sol a trav.s de una lupa. A/e%%&c'one" de l&" lente". En todo sistema ptico" por la naturaleza de la luz" el comportamiento de los ra$os luminosos al desplazarse a travs de las lentes $ las caractersticas qumicas del material con que se fabrican las lentes" se producen una serie de modificaciones o cambios en la tra$ectoria de los ra$os luminosos" dando como resultado que la imagen proporcionada por la lente no sea equivalente a la imagen construida geomtricamente $ tericamente esperada A estas diferencias que se producen se denominan aberraciones de las lentes Las aberraciones de las lentes afectan la calidad de las im#genes" especialmente en la falta de definicin %bordes carentes de nitidez&" en la disminucin del contraste" en la distorsin de la forma $ la aparicin de bordes coloreados Las aberraciones de las lentes se producen por dos causas2 a& La descomposicin o dispersin de la luz en el espectro radiante visible $ b& por las superficies curvas de las lentes Las principales aberraciones que afectan a una lente son2 A/e%%&c'*n c%o$8t'c& !i se analiza geomtricamente una lente biconve-a" podemos deducir que est# formada por dos prismas unidos por sus bases $ cu$as superficies se pulieron 0asta transformarlas en superficies curvas En el caso de una lente bicncava" sta resulta de la unin de dos prismas por sus vrtices ligeramente truncos" $ pulimentados 0asta que las superficies se 0icieran curvas %+ig luz *H &

2f

+igura luz *< G O/2eto "'tu&do en A!.

E. %magen de un objeto situado m)s all) del doble de la distancia focal ( m)s all) de ,f). De acuerdo al dise1o de formacin de im#genes" las caractersticas que muestra la imagen % fig luz *6 & son2 de $eno% t&$&.o; %e&l e 'n3e%t'd&.

A!

co

A!
%a& %a& %a& %b&

+igura luz *H E"-ue$& -ue %ep%e"ent& te*%'c&$ente l& con"t%ucc'*n de

un& lente /'con3e9& )&+ 0 un& /'c*nc&3& )/+ & p&%t'% de l& un'*n de p&%e" de p%'"$&".

divergentes para 0acer coincidir en un solo plano las im#genes de los tres colores b#sicos2 azul" verde $ ro)o A/e%%&c'*n e"!,%'c& !i se dirige sobre una lente convergente un 0az de luz constituido por ra$os paralelos al e)e principal" los ra$os para-iales o m#s cercanos al e)e principal convergen casi en un mismo punto focal" en cambio" los ra$os m#s perifricos sufrir#n una ma$or refraccin $ tendr#n puntos de convergencia % puntos focales& a diferentes distancias del foco principal5 esto significa que se formar#n focos secundarios %fig luz 20a & m#s cercanos a la lente La imagen de un punto aparecer# rodeada de un 0alo de difusin creciente Este tipo de aberracin produce im#genes con bordes poco contrastados %fig luz 20b& !e corrige esta aberracin empleando diafragmas situados antes de las lentes para eliminar la tra$ectoria de los ra$os luminosos m#s perifricos

@or lo tanto" el 0az de luz blanca que incida sobre la superficie curva de una lente5 al atravesarla" refractar# $ luego dispersar# los ra$os luminosos de diferentes longitudes de onda que la constitu$en Los ra$os que se refractan m#s son los de menor longitud de onda %violetas $ azules& $ los ro)os $ amarillos se refractar#n menos En la figura luz *E se observa que los ra$os azules se refractan $ desvan m#s que los ra$os de color verde $ estos m#s que los ro)os ,ada uno de estos ra$os interceptar# en distintos focos" al e)e principal5 e-istiendo para cada ra$o de color refractado distintos puntos focales" uno a continuacin del otro ,omo consecuencia de lo anterior se formar#n im#genes del ob)eto" en diferentes planos focales Los ra$os azules mostrar#n una distancia focal menor que los ro)os" por lo tanto la imagen del ob)eto" formada por los ra$os azules ser# ligeramente menor $ se formara un poco m#s cerca de la lente que las im#genes formadas por los ra$os verdes $ ro)os %fig luz *E & !i la imagen se observa de frente o se recoge en una pantalla mostrar# los bordes levemente coloreados de azul" verde $ ro)o

,f

co

,f

+igura luz 20 D'&(%&$& -ue $ue"t%&> a& el %eco%%'do de lo" %&0o"

lu$'no"o" en un& lente -ue $ue"t%& &/e%%&c'*n e"!,%'c&; b& '$&(en de un punto lu$'no"o; !o%$&do po% l& &/e%%&c'*n e"!,%'c&.

+igura luz *E D'&(%&$& -ue $ue"t%& l& !o%$&c'*n de '$8(ene"

colo%e&d&" del o/2eto; po% l& d'!e%enc'& de (%&do" de de"3'&c'*n -ue e9pe%'$ent&n lo" %&0o" lu$'no"o" &zul; 3e%de 0 %o2o.

La aberracin crom#tica se 0ace evidente en lentes simples En la actualidad se 0ace la correccin para esta aberracin utilizando lentes construidos con diferentes tipos de vidrios %croNn $ flint& que poseen distintos ndices de refraccin $ utilizando dobletes o tripletes de lentes positivas $ negativas" de tal manera que 0acen coincidir los ra$os luminosos de dos colores A este tipo de lentes se les denomina &c%o$8t'co". De este tipo de lentes est#n confeccionados los ob)etivos de los microscopios de estudiante !i se desea corregir a4n m#s la aberracin crom#tica" las lentes se confeccionan con un mineral denominado fluorita %i r * :6:& poseedor de propiedades pticas que permiten alcanzar un alto grado de correccin Las lentes fabricadas con este material se denominan "e$'&poc%o$8t'co". Actualmente e-isten lentes llamados &poc%o$8t'co". Est#n fabricados de tal manera que se 0a eliminado" en ellos" la aberracin crom#tica ,on ellos se confeccionan ob)etivos de microscopios de investigacin $ c#maras fotogr#ficas semiprofesionales $ profesionales El costo de ellos es mu$ alto pues se requiere utilizar varios lentes convergentes $

Otra forma de correccin es a1adir a la lente" otra con una curvatura adecuada $ con un ndice de refraccin diferente que permita que los ra$os perifricos disminu$an su capacidad de refraccin Al corregir la aberracin de esfericidad se trata de corregir" al mismo tiempo" la aberracin crom#tica" obtenindose lentes o sistemas de lentes aplan)ticos semiapocrom)ticos o lentes aplan)ticos apocrom)ticos. A/e%%&c'*n de cu%3&tu%& de c&$po. Los ra$os luminosos que son emitidos por un ob)eto $ atraviesan la lente convergente forman una imagen curvada naturalmente" es decir que no se constru$e sobre un plano perpendicular al e)e principal u ptico" sino en una superficie curva Esto se debe a los diferentes #ngulos de refraccin que e-perimentan los ra$os luminosos para-iales $ perifricos %fig luz 2* & Esta aberracin es f#cil de comprobar" observando alg4n ob)eto a travs de una lupa o una preparacin 0istolgica con un microscopio de estudiante En ambos casos se observar# que la imagen e-0ibe una gran nitidez en el centro pero mostrar# bordes ligeramente borrosos P en el microscopio cuando se enfoque la parte perifrica" el centro de la imagen aparecer# borroso

La aberracin de curvatura de campo se corrige utilizando los mismos procedimientos para corregir la aberracin de esfericidad Al corregir esta aberracin la imagen aparece ntida en toda su e-tensin

mi.r&s, que significa peque1o $ s.op/oo, que significa observar Es decir el microscopio es un instrumento que sirve para observar ob)etos o estructuras peque1as E-isten dos tipos de microscopios que emplean la luz como fuente de energa para formar im#genes aumentadas $ detalladas de ob)etos que a simple vista no es posible observar2

,f

co

,f

a& ;icroscopio fotnico simple o lupa b& ;icroscopio fotnico compuesto El $'c%o"cop'o "'$ple o lup& es un instrumento de amplificacin de im#genes que consiste en la utilizacin de una o m#s lentes convergentes en un solo sistema ptico Dependiendo de la curvatura de la superficie de la%s& lente%s& las lupas pueden ampliar las im#genes de los ob)etos desde <" H"*0" *2" 20 $ 0asta <0 veces +orman una imagen de ma&or tama'o* derec(a & virtual
lente ocular tubo e-tensible lente ob)etivo

+ig luz 2* D'&(%&$& -ue $ue"t%& l& t%&0ecto%'& de lo" %&0o" lu$'no"o"
p&%& !o%$&% l& '$&(en -ue p%e"ent& &/e%%&c'*n de cu%3&tu%& de c&$po.

A/e%%&c'*n de d'"to%"'*n. En este tipo de aberracin la imagen del ob)eto aparece alterada en sus dimensiones referidas al centro de la imagen o en sus porciones perifricas Esto se debe que los diversos componentes del ob)eto adoptan en la imagen diferentes aumentos seg4n la distancia del componente de la imagen con relacin al e)e principal ,omo consecuencia de ello las lneas verticales $ las 0orizontales que se encuentran pr-imas a los m#rgenes de la imagen no resultan rectas En las lentes se distinguen dos tipos de distorsin2 /istorsin en almo(adilla. ,uando en la imagen del ob)eto %22a& se observa que las lneas rectas se curvan de forma cncava en relacin con el e)e ptico" como en la figura luz 22b /istorsin en barrilete. ,uando en la imagen del ob)eto se observa que las lneas rectas se curvan en forma conve-a en referencia e)e ptico como se observa en la figura luz 22b Esta distorsin no afecta la nitidez de la imagen

diafragma +igura microsc * D'&(%&$& -ue $ue"t%& lo" co$ponente" del

$'c%o"cop'o co$pue"to !&/%'c&do po% lo" G&n"en.

Los $'c%o"cop'o" !ot*n'co" co$pue"to" que se emplean actualmente tienen sus antecesores en los instrumentos pticos desarrollados" en el periodo comprendido entre *<E0 $ *6*0" por Qans %padre& $ Dacaras %0i)o& Ransen5 quienes mediante el tallado cuidadoso de lentes biconve-as constru$eron los primeros microscopios compuestos %fig microsc *& A partir de esa poca" el microscopio es el instrumento m#s utilizado en el estudio de clulas $ te)idos !e fue perfeccionando" tanto en su parte ptica como en su parte mec#nica" gracias a los adelantos tecnolgicos aplicados a los componentes antes mencionados !e denominan compuestos porque la imagen se forma mediante la utilizacin de tres sistemas de lentes" cada uno de ellos constituidos por lentes convergentes $ divergentes Los sistemas de lentes son el condensador" los objetivos $ los ocul&%e" En la actualidad" el microscopio fotnico es un instrumento de uso cotidiano en los laboratorios de investigacin $ de diagnstico as como en las aulas de ense1anza de Siologa" Embriologa" Qistologa" ;icrobiologa $ @atologa

%a&

%b&

%c&

+igura luz 22 I$&(en de un cu&d%o con"t'tu'do po% l1ne&" :o%'zont&le"

0 3e%t'c&le"> &+ d'"to%"'*n en &l$o:&d'll&; /+ d'"to%"'*n en /&%%'lete.

Agosto del 2006

MICROSCOPA.

C,"&% Edu&%do Mont&l3o A%en&".

El estudio detallado de los componentes de clulas $ te)idos animales o vegetales" por el tama1o que poseen" requiere el uso de instrumentos que permitan ampliar muc0as veces m#s la imagen de las estructuras que los constitu$en El instrumento que fue empleado por los primeros bilogos para estudiar la clula $ los te)idos" fue el $'c%o"cop'o El nombre deriva etimolgicamente de dos races griegas2

Co$ponente" del $'c%o"cop'o !ot*n'co.

El microscopio fotnico compuesto esta integrado por tres tipos de componentes2

&+ Co$ponente" $ec8n'co"2 !on aquellos que sirven de

sostn" movimiento $ su)ecin de los sistemas pticos $ de iluminacin as como de los ob)etos que se van a observar Mstos se muestran en la imagen del microscopio de la figura microsc 22 H&"e o p', Es un soporte met#lico" amplio $ slido en donde se apo$an $ sostienen los otros componentes del microscopio H%&zo; e"t&t'3o o colu$n& @ermite la su)ecin $ traslado del microscopio !oporta al tubo ptico" a la platina $ el revolver Pl&t'n& !uperficie plana de posicin 0orizontal que posee una perforacin circular central En ella se apo$a la preparacin %l#mina portaob)etos que contiene a la muestra que se va a e-aminar& que se su)eta a la platina mediante pin!as o con un carrito o c(arriot que" mediante mandos especiales facilitan el movimiento de la preparacin de derec0a a izquierda $ de adelante 0acia atr#s Tu/o *pt'co ,onsiste en un cilindro met#lico que suele medir *60mm o *C0 mm de longitud %dependiendo del fabricante del microscopio& el cual en un e-tremo" est# conectado al revolver o portaob)etivos $ en el otro se relaciona con el %los& ocular%es& Re3ol3e% o po%t&o/2et'3o" Es un componente que gira alrededor de un e)e con la finalidad que los ob)etivos que sostiene coincidan de manera perpendicular con la perforacin central de la platina En su superficie inferior posee varios agu)eros donde se atornillan los ob)etivos To%n'llo" $&c%o$,t%'co 0 $'c%o$,t%'co 3eneralmente est#n situados en la parte inferior del brazo o columna @ueden estar separados %en los microscopios antiguos& o el tornillo micromtrico est# incorporado en la circunferencia del tornillo macromtrico %microscopios actuales& Ambos tornillos permiten el desplazamiento de la platina 0acia arriba $ 0acia aba)o con la finalidad de acercar o ale)ar la preparacin 0acia los ob)etivos $ as conseguir un enfoque ptimo de la imagen
+igura microsc 2 P%'nc'p&le" co$ponente" de un $'c%o"cop'o !ot*n'co
co$pue"to

El macromtrico produce desplazamientos evidentes $ r#pidos de la platina" en cambio el tornillo micromtrico produce movimientos imperceptibles de la platina $ sirve para efectuar el enfoque fino $ definitivo de la imagen En la actualidad los microscopios tienen incorporados a los mecanismos de desplazamiento de los tornillos macro $ micromtricos" topes de seguridad que impiden que stos contin4en descendiendo indefinidamente $ as se evita roturas $ da1os a la laminilla $ a las lentes de los ob)etivos En(%&n&2e" 0 c%e$&lle%& ,onstitu$en mecanismos de desplazamientos de las diferentes partes del microscopio C&/ez&l Es un componente situado en relacin con el tubo del microscopio que alberga principalmente prismas o espe)os que sirven para acondicionar en l dos o m#s oculares" o sistemas mec#nicos que soportan c#maras fotogr#ficas" de vdeo o sistemas de pro$eccin de la imagen

/+ Co$ponente" *pt'co"2 !on los ob)etivos" los oculares"

el condensador $ los prismas Los tres primeros est#n constituidos por sistemas de lentes positivos $ negativos Conden"&do%2 Es el componente ptico que tiene como funcin principal concentrar $ regular los ra$os luminosos que provienen de la fuente luminosa %fig micros 6&
o/2eto pl&t'n&

condensador

d'&!%&($& 9a$os luminosos

+igura microsc 6 D'&(%&$& de lo" p%'nc'p&le" co$ponente" de un

conden"&do% 0 %eco%%'do de lo" %&0o" lu$'no"o".

Est# formado por una o dos lentes convergentes que re4nen los ra$os luminosos $ los orientan 0acia la abertura central de la platina ;ediante un mecanismo de E

cremallera se acerca o ale)a de la platina /ambin tiene incorporado un diafragma iris que regula la entrada de luz /odo ello con la finalidad de concentrar la ma$or cantidad de ra$os luminosos en el plano donde est# situado el ob)eto a observar La ma$ora de los condensadores de los microscopios actuales tambin poseen una apertura numrica que indica la cantidad de luz que puede captar $ luego enviar 0acia la preparacin O/2et'3o" Los ob)etivos est#n considerados los elementos m#s importantes en la formacin de la imagen microscpica" $a que estos sistemas de lentes establecen la calidad de la imagen en cuanto a su nitidez $ la capacidad que tiene para captar los detalles de la misma %pode% de %e"oluc'*n& Est#n constituidos tambin por un )uego de lentes" en este caso" convergentes $ divergentes" para eliminar" en la medida de lo posible" una serie de aberraciones que afectaran la calidad de las im#genes formadas Las lentes se disponen dentro de un soporte o camiseta de metal" en cu$o e-terior est#n inscritas una serie de anotaciones numricas que indican" como se observa en la figura microsc :2 el aumento propio del ob)etivo" la apertura numrica" el tipo de material con que est#n tallados las lentes %de fluorita o semiapocrom#ticos& o la calidad que tendr#n las im#genes" al anularse en la construccin de los ob)etivos" algunas aberraciones de las lentes %acrom#ticos" apocrom#ticos" aplan#ticos etc & o si se debe usar alguna sustancia de inmersin

Otra clasificacin de los ob)etivos se refiere al tipo de correccin al que deben someterse las lentes con la finalidad de disminuir o anular algunas aberraciones que se producen en las lentes" como las aberraciones crom#tica" de curvatura de campo" astigmatismo $ de esfericidad Dependiendo de las aberraciones corregidas los ob)etivos pueden ser2 crom)ticos. Estos ob)etivos corrigen los ra$os luminosos azules $ ro)os 0acindolos coincidir en un solo plano focal En tanto que los otros ra$os coloreados se forman en otro plano focal generando una imagen cu$os bordes se observan levemente difusos %espectro luminoso secundario& Los ob)etivos de los microscopios 7de estudiante8 son acrom#ticos 0emiapocrom)ticos . !e les conoce tambin como ob)etivos de !luo%'t&8" corrigen el espectro secundario dando como resultado im#genes de bordes m#s ntidos @or la alta capacidad que tienen para transmitir las radiaciones luminosas de onda corta" se les considera como los ob)etivos ideales para microscopa de fluorescencia pocrom)ticos. En estos ob)etivos se 0acen coincidir en un solo plano los ra$os luminosos azules" ro)os $ verdes" obteniendo as una imagen de bordes sumamente ntidos" pero la correccin de esta aberracin trae consigo la acentuacin de otra" que es la de curvatura de campo" pues la superficie focal de la imagen es ligeramente curva" dando como resultado que" al observar la imagen $ tratar de enfocarla en la zona central del campo microscpico se desenfoca la zona perifrica $ viceversa 1lanapocrom)ticos !on los ob)etivos en los cuales se 0an corregido la ma$or cantidad de aberraciones como la crom#tica" curvatura de campo" de esfericidad $ de astigmatismo5 por lo tanto se obtienen im#genes sumamente ntidas $ el campo microscpico aparece totalmente plano" enfocado en toda su e-tensin !on los ob)etivos que generan im#genes con me)or resolucin" es preferible usarlos cuando se desea obtener im#genes fotogr#ficas% fotomicrografa& La comple)idad en la construccin de los ob)etivos $ el n4mero de lentes que se utilizan aumenta conforme se van corrigiendo m#s aberraciones @or e)emplo un ob)etivo planapocrom#tico suele incorporar en su construccin entre *0 a *2 lentes Esto" en consecuencia" encarece el costo de ellos La imagen que forman los ob)etivos es &u$ent&d& de t&$&.o; 'n3e%t'd& 0 %e&l !e mencion al inicio del ac#pite que los ob)etivos est#n considerados como los integrantes m#s importantes del microscopio" pues de la calidad de sus componentes depende que" en la imagen generada a travs de ellos" se puedan observar una ma$or cantidad de detalles En otros trminos" los ob)etivos son los responsables de ofrecer im#genes me)or resueltas La capacidad que tienen los ob)etivos de formar im#genes en donde se distingan m#s detalles del ob)eto e-aminado depende de una serie de factores como los que se mencionan a continuacin2 *0

*0>0 22

+l4or :0>0 6<

@lan *00>* 2< ol

+igura micros : P%'nc'p&le" c&%&cte%1"t'c&" e9te%n&" de lo" o/2et'3o".

Los ob)etivos se fabrican para ampliar las im#genes de los ob)etos observados en diversos aumentos5 as se tienen ob)etivos con aumentos propios de 6 < -" :-" *0-" 2<-" :0-" 6<- $ *00- Algunos ob)etivos tienen alrededor de ellos una lnea coloreada que indica a simple vista el aumento propio Los ob)etivos tambin se clasifican de acuerdo al medio que e-iste entre el ob)eto e-aminado $ la lente frontal del ob)etivo De acuerdo a esta caracterstica son "eco" o de 'n$e%"'*n !on ob)etivos secos aquellos que entre el ob)eto observado $ el ob)etivo solamente e-iste el aire5 en cambio se denominan ob)etivos de inmersin aquellos que requieren que entre la preparacin $ la lente frontal del ob)etivo se coloque una sustancia lquida" sta puede ser agua" glicerina o un 7aceite de inmersin8" natural como el 7aceite de cedro8 o aceites artificiales

nd'ce de %e!%&cc'*n !e denomina as a la relacin

e-istente entre la velocidad de la luz en el aire $ su velocidad en el medio transparente utilizado De la misma manera" se pueden obtener los ndices de refraccin de una serie de sustancias que se utilizan en la construccin $ tallado de las lentes de los ob)etivos La velocidad de la luz es de 600"000 =m>sg en el aire Al atravesar un medio transparente como el vidrio del cual est#n fabricados las lentes de los microscopios" su velocidad se reduce a 200" 000 ?m >sg @or lo tanto el vidrio tendr# un ndice de refraccin de * <5 pues el ndice de refraccin de un ob)eto o una sustancia transparente se e-presa mediante la frmula2
Veloc'd&d de l& luz en el &'%e

que e-ista entre el ob)eto $ la lente frontal del ob)etivo" el #ngulo de apertura ser# ma$or o menor C&pt&c'*n de %&0o" lu$'no"o" & t%&3," de o/2et'3o" "eco" 0 o/2et'3o" de 'n$e%"'*n. La figuras microsc 6 $ C muestran la diferencia en la captacin de ra$os luminosos de un ob)etivo )&+ en el cual la interfase es aire $ en el ob)etivo )/+ donde se 0a colocado como interfase una sustancia de inmersin que posee un ndice de refraccin similar al del vidrio Los ra$os luminosos que atraviesan el aire se refractan m#s $ por lo tanto su desviacin es ma$or porque el ndice de refraccin del aire es igual a * 0

B9A

Veloc'd&d de l& luz en el $ed'o

A continuacin se muestran los ndices de refraccin de una serie de sustancias transparentes que se emplean en microscopa para construir lentes o como sustancias de inmersin2 Agua A * 6600 Aceite de inmersin A * <*<0 +luorita A * :6:0 (idrio %croNn& A * <200 +lint A * 6600

ra$o refle)ado

An(ulo de &pe%tu%&2 Es la capacidad de un ob)etivo de

captar los ra$os luminosos refractados cuando stos atraviesan un medio transparente ,uanto ma$or sea este #ngulo" la lente frontal del ob)etivo aceptar# una ma$or cantidad de ellos %fig micros <& o/2et'3o
)&+ +igura microsc 6 T%&0ecto%'& de lo" :&ce" lu$'no"o" en un o/2et'3o
"eco.

En la figura 6 los ra$os que emergen del ob)eto" al llegar a esta interfase constituida por are se refractan o su #ngulo de inclinacin es tal que sobrepasan el )ngulo critico de refraccin" por lo que al llegar a la lente frontal del ob)etivo se refle)an en la superficie $ no son captados por la lente En la figura %b& el ndice de refraccin del aceite de inmersin %* <2& es similar al del vidrio %portaob)etos" cubreob)etos $ la lente frontal del ob)etivo& por lo tanto los ra$os luminosos perifricos que emergen del ob)eto no se desvan $ pueden ser aceptados por el ob)etivo" increment#ndose de esa manera la cantidad de ra$os luminosos que penetran al microscopio

)&+

)/+

+igura microsc < R&0o" lu$'no"o" -ue !o%$&n el 8n(ulo de &pe%tu%&.

En el esquema anterior" el #ngulo de apertura de la lente frontal del ob)etivo capta o acepta una serie de ra$os luminosos teniendo como lmite de captacin los ra$os laterales del cono luminoso %lneas continuas&" en cambio los ra$os perifricos %lneas punteadas& no son aceptados Esta capacidad de captacin est# dada fundamentalmente por la distancia que e-iste entre el ob)eto $ el ob)etivo As" se puede constatar que en la figura <a el #ngulo de apertura es de apro-imadamente <0T" en cambio en la figura <b el #ngulo es muc0o ma$or %E<T& donde se observa que la lente logra captar otros ra$os perifricos Dependiendo del ndice de refraccin del material transparente con el que est# construido la lente del condensador" o la interfase %aire o sustancia de inmersin&

)/+ +igura microsc 6. T%&0ecto%'& de lo" :&ce" lu$'no"o" en un o/2et'3o de

'n$e%"'*n.

**

A la mitad del #ngulo de apertura se le denomina alfa % &" por e)emplo si el #ngulo de apertura de un ob)etivo es de <0T" su valor alfa ser# de 2<T Este valor es importante pues permitir# calcular un factor que tiene que ver directamente con la capacidad del ob)etivo para formar im#genes que muestren m#s detalles" es decir me)or resueltas

e2istir entre dos puntos del objeto para +ue se puedan visuali!ar como dos puntos separados . La calidad de una imagen" en la que se observe la claridad" nitidez $ la riqueza de detalles" depende del poder de resolucin del ob)etivo -l poder de resolucin de un objetivo depende de la longitud de onda () del ra&o luminoso utili!ado & la apertura num.rica del sistema ptico del objetivo. El poder de resolucin %d& se e-presa mediante la frmula de Abbe2
6.AA 9 6.AA 9

Ape%tu%& nu$,%'c& )NA+ Es una medida que indica

la capacidad del ob)etivo de poder captar los ra$os refractados por las estructuras finas de las cuales est# constituido el ob)eto que se observa Esta capacidad se traduce en el poder del microscopio de formar im#genes que muestren al observador una serie de detalles del ob)eto que se est# e-aminando ,uanto ma$or sea la apertura numrica de un ob)etivo" ste tendr# una ma$or capacidad de mostrar detalles finos en la imagen que forma La apertura numrica de un ob)etivo se calcula empleando la formula matem#tica siguiente2

dJ
A ) NA+

dJ
A)NA o/2et'3o K NA conden"&do%+

)&+

)/ +

UA A n - "en
dJ Donde n representa el ndice de refraccin de la interfase que separa el cubreob)eto de la muestra e-aminada $ la lente frontal del ob)etivo $ es la mitad del #ngulo de apertura La apertura numrica de un ob)etivo guarda una relacin directamente proporcional con el aumento propio del ob)etivo & tambi.n con la capacidad +ue tiene de mostrar ma&ores detalles. @or e)emplo en la relacin de ob)etivos que se muestran se puede comprobar lo afirmado referente al aumento del microscopio2 Au$ento del ob)etivo 6 2D9 6I9 *02<DI9 Ape%tu%& numrica 0 0C I.6I I.AA 0 2< 0 :< I.FE

I.F6 9 NA

I.F6 9

dJ

NA o/2et'3o K NA conden"&do%

La cifra * 22>2 0 6* es la constante de Abbe

Esto significa que si empleamos un ob)etivo de AU A * 2< con una longitud de onda de <60nm" el poder de resolucin ser# de 2C6nm" la cifra obtenida nos indica que el ob)etivo ser# capaz de distinguir o resolver la imagen de dos puntos que en el ob)eto est#n separados entre s por 2C6nm !i la separacin de ellos es menor a esta cifra el ob)etivo no podr# distinguirlos como dos puntos separados La cifra resultante de aplicar la frmula se denomina lmite de resolucin 'n c#lculo m#s e-acto del poder de resolucin se obtiene cuando en la frmula se a1ade la apertura numrica del condensador" tal como se observa en la frmula %b& ,uando se efect4a correctamente la iluminacin del ob)eto utilizando %adecuar la distancia apropiada del condensador $ la regulacin de captacin de la luz abriendo o cerrando el diafragma iris del mismo& la apertura numrica del condensador" la imagen que forma el ob)etivo logra mostrar el m#-imo poder de resolucin @or e)emplo si se emplea el mismo ob)etivo del caso anterior %de AU A * 2<&" el mismo tipo de luz % A <60nm& $ se ilumina la muestra con un condensador de AU A H0 es posible comprobar lo mencionado anteriormente Al realizar los c#lculos correspondientes resulta que el poder de resolucin del ob)etivo" sin tomar en cuenta la AU del condensador" es de 2C6nm En cambio cuando se inclu$e la apertura numrica del condensador el resultado es de *66nm Estas cifras nos demuestran que cuando se realiza la iluminacin del ob)eto mediante el uso adecuado del condensador" la capacidad del ob)etivo de resolver detalles me)ora casi en un 60V m#s -l m)2imo poder de resolucin +ue se puede obtener es de 0., m apro2imadamente* para lo *2

666II9

0 H0
6.AEo'l

La ma$ora de los denominados microscopios de estudiantes que se fabrican en la actualidad vienen implementados %AU $ aumentos propios& con los ob)etivos que est#n se1alados en negritas

Au$ento de un o/2et'3o Es la capacidad que posee un

ob)etivo de ampliar la imagen del ob)eto observado !e define como la relaci&n entre el tama0o de la ima en y el objeto, en valores lineales (lar o y anc)o). En la relacin anterior" un ob)etivo que tiene grabado en la camiseta la cifra *0- aumentar# *0 veces el tama1o de la imagen del ob)eto e-aminado

Pode% de %e"oluc'*n. !e define as la capacidad de un

ob)etivo de poder distinguir la distancia mnima +ue debe

cual se re+uiere +ue el microscopio proporcione una imagen de un aumento total de 30002 a 34002.

Ocul&%. Es otro componente ptico del microscopio" debe su

nombre porque la imagen final se observa a travs de l acercando el o)o a la lente 7ocular8 del componente Es el encargado de formar una segunda imagen a partir de la imagen primaria que forma el ob)etivo La imagen del ocular es de ma$or tama1o" virtual $ derec0a Esta imagen 4nicamente ampla un n4mero determinado de veces %<-" H-" *0-" *2-& a la imagen formada por el ob)etivo Uo a1ade" por m#s aumentos propios que posea" ning4n detalle a los generados por el ob)etivo En la generalidad de los casos" los oculares est#n construidos por dos lentes convergentes %planos conve-os& La primera lente se denomina 7de campo o frontal8" est# situada en la parte anterior del ocular %fig micros H& $" es la encargada de recoger $ ampliar la imagen generada por el sistema de lentes del ob)etivo La lente posterior" en contacto estrec0o con el o)o del observador" se denomina lente 7ocular8 $ es la responsable de aumentar nuevamente la imagen $ orientarla 0acia el o)o del observador Los oculares se clasifican" dependiendo de la disposicin de las lentes $ del diafragma" dentro de la camiseta met#lica que los contienen" en2 Ocul&%e" ne(&t'3o" de 5L0(en" Est#n constituidos por dos lentes plano conve-os" con la superficie conve-a dirigida 0acia aba)o Entre ambos se sit4a un diafragma anular" localizado en el plano focal de las lentes En este diafragma se puede ad0erir un puntero o se1alador que suele ser elaborado por una peque1a porcin de una pesta1a o pelo

P%'"$&". En los microscopios modernos monoculares o binoculares" se requiere el empleo de prismas" estructuras transparentes que" en el caso de los microscopios monoculares" sirven para desviar los ra$os luminosos de la tra$ectoria rectilnea del e)e ptico del ob)etivo $ dirigirlos 0acia el tubo ptico ligeramente inclinado $ luego 0acia el ocular
!uperficie reflectante

ra$os de luz dirigidos 0acia el tubo ptico $ el ocular 9a$os luminosos provenientes del ob)etivo

+igura microsc E P%'"$& con "upe%!'c'e %e!lect&nte -ue "'%3e p&%&

de"3'&% lo" %&0o" lu$'no"o".

En los microscopios binoculares" los prismas separan los ra$os luminosos provenientes del ob)etivo" en dos 0aces de luz $ los dirigen a cada ocular En ambos casos e-iste siempre una superficie reflectante para evitar la descomposicin de la luz

C+ Co$ponente" de 'lu$'n&c'*n2 !e consideran

dentro de este grupo a los instrumentos que proporcionan energa luminosa al microscopio Las fuentes de energa luminosa son de dos tipos natural $ artificial La luz n&tu%&l" emitida por el sol" se obtiene de manera indirecta mediante un e"pe2o que posee una superficie plana $ otra cncava El espe)o est# situado en la superficie superior de la base o pie 'n mecanismo especial permite orientarlo 0acia un lugar iluminado indirectamente por el sol %una ventana" por e)emplo& $ luego dirigir el 0az luminoso 0acia la lente del condensador La luz &%t'!'c'&l se genera a travs de una l8$p&%& de /&2o 3olt&2e %generalmente de 6 voltios& que" mediante un %eo"t&to regula la emisin $ la intensidad de luz Al igual que el espe)o" este sistema de iluminacin se inserta en la base o pie del microscopio En los microscopios que poseen un espe)o" por carecer de una fuente de luz incorporada" tambin se puede emplear la luz artificial emitida por una l#mpara que pro$ecta el 0az luminoso de la misma manera como se orienta la superficie reflectante del espe)o cuando se ilumina el microscopio con luz natural B'lt%o" En diversas partes del recorrido de 0az luminoso" aunque en la ma$ora de los casos se sit4an entre la fuente luminosa $ el condensador /ienen por finalidad modificar la longitud de onda de la luz que ilumina el ob)eto a observar @or e)emplo" cuando se utiliza !on estructuras transparentes %de vidrio" pl#stico o gelatina& coloreadas que se localizan luz artificial es necesario emplear filtros azules pues modifican el color ligeramente amarillento que poseen los ra$os luminosos que emite las l#mparas elctricas" *6

%a&
ocul&% ne(&t'3oM )/+ en un ocul&% po"'t'3o.

%b&

+igura microsc H D'&(%&$& de l& d'"po"'c'*n de l&" lente" en> )&+ un

Ocul&%e" po"'t'3o" o de R&$"den Las lentes plano conve-as est#n dispuestas con las superficies curvas dirigidas 0acia adentro El diafragma est# situado por deba)o de la lente de campo o frontal5 en el plano donde se forma la imagen formada por el ob)etivo Adem#s de estos oculares" e-isten otros tipos como los de campo de visin amplia 5 aquellos acondicionados para poder observar con los anteojos puestos $ otros oculares que generalmente que se usan en los microscopios binoculares" denominados oculares de compensacin . Mstos consisten en que uno de ellos posee un sistema de lentes mviles que permite enfocar correctamente la imagen del ob)eto" despus que el enfoque total del microscopio se 0a realizado $ se nota a4n una imagen levemente desenfocada en uno de ellos" generalmente el izquierdo" porque al observar la imagen a travs de cada ocular derec0o e izquierdo se nota que una de ellas no est# enfocada correctamente

transform#ndolos en ra$os de luz 7blanca8 Este color de luz es m#s aceptada por la retina $ en las preparaciones 0istolgicas coloreadas me)ora facilita la rendicin de color de las estructuras celulares o tisulares e-aminadas @ara ciertos casos de microscopa fotnica especial se requiere el au-ilio de filtros especiales como en el caso de los microscopios de fluorescencia" contraste de fases $ de polarizacin Dependiendo del fabricante $ de los modelos de microscopios" los filtros se colocan en anillos o dispositivos especiales denominados 7portafiltros8 que" en el caso de los microscopios fotnicos de campo claro %de uso m#s frecuente&" est#n situados inmediatamente encima de la fuente luminosa o deba)o de la lente frontal del condensador

&

+igura microsc *0 I$8(ene" -ue $ue"t%&n el pode% de %e"oluc'*n de

lo" "'"te$&" o/2et'3o K ocul&% &decu&do" )&u$ento 4t'l+. &+ o/2etoM /+ o/2et'3o D9M c+ o/2et'3o 6I9; d+ o/2et'3o DI9 0 e+ o/2et'3o 6II9. Se :& ut'l'z&do un ocul&% de 6I9.

!e denomina &u$ento 3&c1o de la imagen de un ob)eto" aquel que por m#s ampliacin que se 0aga de la imagen" utilizando oculares de ma$ores aumentos" se llega a un punto en que $a no se logran distinguir m#s detalles %fig microsc **&

Au$ento tot&l del $'c%o"cop'o !ot*n'co co$pue"to El

aumento total de la imagen del microscopio compuesto se obtiene multiplicando el aumento propio del ob)etivo por el aumento propio del ocular2 ATJ &u$ento del o/2et'3o 9 &u$ento del ocul&%
)&+ )/+ )c+ )d+

+igura microsc ** I$8(ene" -ue $ue"t%&n un e2e$plo de &u$ento

3&c1o. Gue(o de do" o/2et'3o" D9 0 6I9 0 de do" ocul&%e"> de 6I;9 0 AI9. &+ o/2etoM /+ '$&(en con o/2et'3o de D9 K ocul&% de 6I9M c+ '$&(en con o/2et'3o de 6I9 K ocul&% de 6I9 0 d+ '$&(en de o/2et'3o de 6I9 K ocul&% de AI9.

Au$ento 4t'l 0 &u$ento 3&c1o del $'c%o"cop'o. La imagen que forma el microscopio fotnico compuesto posee caractersticas que permiten ver menor o ma$or cantidad de detalles de la misma !e observar#n m#s detalles cuanto me)or sea el poder de resolucin del ob)etivo empleado Pa se 0a mencionado que la resolucin de la imagen del ob)eto depende esencialmente de la apertura numrica del ob)etivo $ del tipo de luz que se utilice El ocular solamente aumenta la imagen proporcionada por el ob)etivo sin a1adirle a sta alguna capacidad de resolver me)or los detalles !e define como aumento 4til de un microscopio cuando al ampliar la imagen del ob)eto %a travs de un )uego de ob)etivo W ocular& se distinguen una serie de detalles" es decir se resuelven me)or las estructuras que lo integran %fig micros *0&

@ara obtener el &u$ento 4t'l de una imagen e-iste un procedimiento que nos indica el )uego de ob)etivos con los correspondientes oculares que se debe utilizar en la ampliacin de la imagen 'na manera sencilla de calcular el aumento 4til de un )uego de o/2et'3o K ocul&% es multiplicando la AU del ob)etivo por *000 La cifra obtenida es el aumento total que debe tener la imagen cuando se multiplica el aumento del ob)etivo por el aumento del ocular" por e)emplo si se tiene un ob)etivo de *00- que posee una AUA* 2< el aumento m#-imo que debe presentar la imagen para ofrecernos la ma$or cantidad de detalles es aquel que resultara de multiplicar * 2< - *000 A *2<0 aumentos" por lo tanto si el ob)etivo es de *00 ampliaciones debemos usar un ocular de por lo menos *2-" si usamos un ocular de *<- la ampliacin de la imagen nos estara dando un aumento vaco Al contrario" si empleamos un ocular de <- A <00-" estaramos frente a un caso de subutilizacin del poder de resolucin del ob)etivo pues no se lograra el aumento necesario para lograr observar los detalles de la imagen que el ob)etivo empleado 0a logrado resolver Los lmites que e-isten para que un ob)etivo pueda ofrecer al observador un adecuado poder de resolucin oscilaran entre las cifras que se1alan un m#-imo poder de resolucin equivalente a multiplicar la AU del ob)etivo utilizado por *000" $ un mnimo poder de resolucin 4til equivalente a multiplicar la AU del ob)etivo por <00

Pode% de penet%&c'*n o de p%o!und'd&d de c&$po

La imagen que se forma a travs del microscopio proviene de un ob)eto sumamente delgado %<m a *0m de grosor&" que genera varios planos de im#genes2 profundos" intermedios $ superficiales ,uando se e-amina un te)ido con ob)etivos de ba)os aumentos :- *0- la imagen que se observa puede enfocarse *:

con facilidad con el tornillo macromtrico" sin que se diferencien los planos de enfoque antes mencionados" pero cuando la imagen se forma al emplear ob)etivos de :0- $ *00-" es necesario utilizar el enfoque fino a travs del tornillo micromtrico" pues es muc0o m#s evidente que si enfocamos el plano superficial" es probable que al ascender levemente la platina por accin del micromtrico logremos enfocar $ visualizar con nitidez el plano focal medio o el profundo @or lo tanto" el poder de penetracin o de profundidad de los ob)etivos es inversamente proporcional al aumento propio de los mismos D'"t&nc'& l'/%e de t%&/&2o !e denomina as a la distancia que e-iste entre la superficie de la laminilla cubreob)etos $ la lente frontal del ob)etivo Esta distancia ser# ma$or cuanto menor sea el aumento propio del ob)etivo $ viceversa

La imagen generada por el ob)etivo es captada posteriormente por la lente de campo del ocular $ la ampla el numero de veces del aumento que aquel posee La imagen formada por el ocular ser# de $&0o% t&$&.o" de%ec:& con %el&c'*n & l& '$&(en !o%$&d& po% el o/2et'3o $ 3'%tu&l %fig microsc *6&

2f

"

"

"

"

2f

"

+igura microsc *6. C&%&cte%1"t'c&" de l& '$&(en !o%$&d& po% el ocul&%.

Bo%$&c'*n de l& '$&(en & t%&3," del $'c%o"cop'o !ot*n'co La imagen total del microscopio fotnico se forma
mediante las im#genes que generan sucesivamente el ob)etivo $ el ocular @ara que se forme una imagen del ob)eto observado es indispensable que por lo menos dos ra$os luminosos que inciden en el ob)eto iluminen una porcin del mismo /al como se observ en los casos de formacin de im#genes" un punto iluminado del ob)eto trasmite dos ra$os luminosos2 uno" orientado paralelamente al e)e principal" se refracta al atravesar la lente del ob)etivo" en tanto que el otro se traslada en direccin oblicua 0acia el centro ptico de la lente $ la atraviesa sin refractarse

La imagen total formada por ambas lentes ser#2 &u$ent&d& de t&$&.o; 'n3e%t'd& 0 3'%tu&l con relacin al ob)eto /al como se esquematiza en la figura ;icrosc *:
lente o/2et'3o lente ocul&%

"

"

"

"

"

2f

2f
+igura microsc *: C&%&cte%1"t'c&" de l& '$&(en tot&l !o%$&d& po% el
"'"te$& *pt'co del $'c%o"cop'o.

+igura microsc *2 C&%&cte%1"t'c&" de l& '$&(en !o%$&d& po% el

o/2et'3o

En el lugar donde los dos ra$os luminosos se interceptan se formar# la imagen del punto iluminado !i del ob)eto se trasmiten dos ra$os luminosos por cada punto que lo constitu$en igual numero de puntos luminosos formar#n la imagen ,on la diferencia que la imagen ser# ampliada U n4mero de veces correspondiente al aumento propio que posea el ob)etivo Esta imagen es de ma&or tama'o* real e invertida %ver figura microsc *2& Los otros ra$os luminosos que llegan a la lente frontal del ob)etivo $ que no iluminan ning4n punto del ob)eto" al atravesar la lente" le confieren al campo microscpico una iluminacin uniforme A este tipo de iluminacin se denomina de c&$po cl&%o

TIPOS DE MICROSCOPIOS BOTNICOS.

C,"&% Edu&%do Mont&l3o A%en&" Las caractersticas descritas" de los componentes del microscopio fotnico" as como la formacin de las im#genes de los ob)etos observados corresponden al microscopio fotnico" instrumento de ma$or uso en los #mbitos acadmicos docentes $ de investigacin el denominado2

M'c%o"cop'o de t%&n"p&%enc'& o de c&$po cl&%o. Este

microscopio se caracteriza porque emplea luz natural o luz artificial como energa luminosa para formar las im#genes del ob)eto que se observa La imagen muestra puntos o #reas iluminadas %generalmente coloreados& sobre un fondo claro o transparente

*<

Lente del conden"&do%

d'&!%&($&

+igura microsc *< L&" !oto$'c%o(%&!1&" $ue"t%&n '$8(ene" de c,lul&"

de"c&$&d&" del ep'tel'o /uc&l. &+ '$&(en o/ten'd& de c,lul&" "'n te.'%; /+ '$&(en o/ten'd& con c,lul&" te.'d&" con &zul de tolu'd'n&; DII9.

+igura microsc *6. D'&(%&$& -ue %ep%e"ent& el %eco%%'do de lo" %&0o"

lu$'no"o"; en el "'"te$& *pt'co del conden"&do% 0 l& de"3'&c'*n de lo" %&0o" lu$'no"o" o/l'cuo"; en el $'c%o"cop'o de c&$po o"cu%o.

@ara que la imagen sea visible con nitidez es necesario que el ob)eto e-aminado este coloreado o te1ido" es decir que los componentes celulares $ tisulares de la estructura se contrasten mediante colorantes especficos que absorban $ transmitan determinadas longitudes de onda del espectro visible Las longitudes de onda que no se absorban son transmitidas al o)o 0umano o a un material fotogr#fico sensible dando como resultado que la estructura te1ida aparece de un determinado color El campo microscpico aparece claro o transparente porque los ra$os luminosos directos que provienen del condensador no encuentran en su camino ninguna estructura coloreada $ entran como ra$os de luz blanca 0acia el ob)etivo !i se e-aminan ob)etos sin colorear la imagen ofrecer# detalles poco contrastados" casi transparentes Las secciones de te)idos deben ser delgadas con un grosor de < m a *0 m !e puede emplear secciones de ma$or espesor pero la imagen no mostrar# un buen poder de resolucin $ tampoco e-0ibir# contornos ntidos" pues en el campo microscpico se observar#n varios planos superpuestos de las im#genes

,uando estos ra$os oblicuos encuentran en su recorrido" alguna partcula" son desviados 0acia la lente frontal del ob)etivo $ la imagen de la partcula se observa brillante en medio de un fondo oscuro

+igura microsc *C I$&(en c,lul&" ep'tel'&le" de"c&$&d&" de l& $uco"&

/uc&l; !oto(%&!'&d&" $ed'&nte el $'c%o"cop'o de c&$po o"cu%o.

E-isten diversos tipos de condensadores dise1ados $ fabricados especialmente para la microscopa de campo oscuro 'na manera sencilla de fabricar un diafragma que produzca campo oscuro en un microscopio de estudiante es elaborar con una cartulina negra un diafragma que se coloca deba)o del condensador del microscopio %ver fig microsc *H&

M'c%o"cop'o de c&$po o"cu%o. !e denomina as por que

La imagen que se forma est# constituida por una serie de estructuras brillantes sobre un fondo oscuro El principio ptico de este microscopio es el de aprovec0ar un con)unto de ra$os luminosos oblicuos que inicialmente no entran a la lente frontal del ob)etivo" observ#ndose el campo microscopio totalmente oscuro @ara que esto ocurra se requiere en primer lugar que la apertura num.rica del condensador sea ma&or +ue la apertura num.rica del objetivo Esta condicin facilita que los ra$os luminosos directos provenientes de la fuente luminosa sean impedidos de entrar a la porcin central de la lente del condensador $ solo penetren $ emer)an de l" los ra$os perifricos que al refractarse se 0acen oblicuos
o/2et'3o

+igura microsc

*H. E"-ue$& -ue $ue"t%& l& $&ne%& de !&/%'c&% un d'&!%&($& p&%& p%oduc'% c&$po o"cu%o en un $'c%o"cop'o !ot*n'co.

po%t&o/2eto"

platina

El microscopio de campo oscuro se emplea para ver clulas vivas %protozoarios" bacterias" clulas descamadas" etc & en las cuales no se 0an aplicado sustancias fi)adoras ni colorantes /ambin se pueden observar partculas que tengan un tama1o inferior a los 0 2 de micrmetro5 esto se debe a que los ra$os de luz oblicuos que inciden en ellas forman un 0alo luminoso brillante alrededor de las mismas ;ediante el empleo de este microscopio se distinguen con facilidad la forma $ el movimiento 0elicoidal que muestra la *6

espiroqueta #reponema pallidum " una bacteria causante de la sfilis

+igura microsc 20 Reco%%'do de do" ond&" lu$'no"&" p&%& $o"t%&% el

e!ecto de 'nte%!e%enc'& en> &+ cu&ndo l&" ond&" de luz "e encuent%&n en !&"eM /+ cu&ndo l&" ond&" e"t8n de"!&"&d&" en = lon('tud de ond& 0 c+ en un < de lon('tud de ond&.

M'c%o"cop'o de cont%&"te de !&"e" Es el microscopio

fotnico m#s utilizado para observar ob)etos o estructuras transparentes sin te1ir Al igual que el microscopio de campo oscuro facilita la observacin de clulas vivas para distinguir $ analizar sus componentes morfolgicos $ ciertas funciones que ellas puedan desarrollar %fagocitosis" mitosis" movimientos ameboideos" ciliares o flagelares" etc &

De acuerdo a la construccin especial de ciertos aditamentos %anillo de fases $ placa de fases& que posee el microscopio de contraste de fases" es factible que el sistema separe los dos ra$os luminosos que inciden $ emergen del ob)eto %el directo $ el refractado& para que" de manera artificial" el ra$o refractado retrase su recorrido mas o menos a la mitad de longitud de onda $ cuando estos ra$os de luz se interfieran puedan anularse ofreciendo una porcin oscura de la imagen es decir disminucin de la intensidad luminosa en un fondo iluminado formado por los ra$os luminosos directos %fig microsc *E" 2*& El microscopio de contraste de fases requiere de un condensador especial que contiene en su interior el diafragma con el anillo de fases adecuado para cada tipo de ob)etivos $ stos que alberguen placas de fases localizadas en el plano focal de los mismos

+igura microsc *E I$&(en c,lul&" ep'tel'&le" de"c&$&d&" de l& $uco"&

/uc&l; !oto(%&!'&d&" $ed'&nte el $'c%o"cop'o de cont%&"te de !&"e".

El principio ptico de este microscopio consiste en la capacidad que tiene para transformar" en los ob)etos transparentes" los peque1os ndices de refraccin que cada uno de sus componentes posee en diferencias de intensidad luminosa" ofreciendo im#genes donde las estructuras del ob)eto aparecen contrastadas en tonos oscuros o tonos brillantes $ tonos intermedios ,uando se trat en el tema de ptica" los ndices de refraccin" se afirm que un ra$o luminoso retrasaba su velocidad cuando atravesaba una sustancia transparente que posea un ndice de refraccin ma$or que el are %B9A * 00& Los componentes celulares $ tisulares de muestras sin te1ir no son f#cilmente observables por el o)o 0umano porque sus ndices de refraccin que cada uno de ellos posee" son de escasa diferencia entre s Los ra$os luminosos que los atraviesan suelen retardar su recorrido en un I J longitud de onda %de acuerdo a sus ndices de refraccin& respecto a los ra$os luminosos directos que en su recorrido no encuentran estructura alguna5 por lo tanto" el $'c%o"cop'o de cont%&"te de !&"e" utiliza la propiedad que tienen dos ondas luminosas desfasadas de interferir entre ellas para generar im#genes contrastadas por la ma$or o menor intensidad luminosa que e-0iban sus componentes
&+
@laca

9a$o directo

ra$o refractado

Ob)etivo

@latina

ob)eto

,ondensador

Anillo

/+ +igura microsc 2* D'&(%&$& -ue $ue"t%& l& t%&0ecto%'& de lo" %&0o" c+

lu$'no"o" & t%&3," de lo" co$ponente" *pt'co" del $'c%o"cop'o de cont%&"te de !&"e".

*C

M'c%o"cop'o de cont%&"te d'!e%enc'&l )CID+ o de No$&%"N'.

'nte%!e%enc'&l

B'(u%& $'c%o"c. AA. D'&(%&$& -ue %ep%e"ent& lo" co$ponente" *pt'co" del $'c%o"cop'o CID 0 el %eco%%'do de lo" %&0o" lu$'no"o".

Este tipo de microscopio fue dise1ado $ construido bas#ndose en los principios pticos seme)antes al microscopio de contraste de fases" porque la imagen se genera utilizando las diferencias de fase de los ra$os luminosos que atraviesan el ob)eto observado La diferencia con el microscopio de contraste de fases radica en que el sistema ptico" mediante un filtro especial %de luz polarizada& 0ace vibrar las ondas de luz en un solo plano" m#s o menos en un #ngulo de :< 5 estas ondas de luz polarizada se dirigen a un prisma especial %de Xollaston # *& donde en la primera parte del prisma" se dividen en dos ondas luminosas que vibran a0ora en dos planos diferentes de E0 entre ellas" pero ligeramente desfasadas" emergen" despus de atravesar la segunda parte del prisma" como dos ondas luminosas separadas pero a0ora en fase $ se dirigen al ob)eto para que iluminen puntos mu$ cercanos $ los atraviesen %Las zonas iluminadas pueden tener ndices de refraccin 0omogneas" una zona 0omognea $ otra con un B9 diferente o bordes de estructuras con diferentes B9" etc & En cualquiera de los casos" la onda luminosa que atraviesa el ob)eto se retrasar# con relacin a la otra onda que no lo atraviesa" la cual servir# como referencia

,onsiderando que el retraso est# en relacin directa con el grosor del ob)eto $ con su ndice refraccin" el valor del retraso se puede emplear para determinar la masa por unidad de superficie del material observado" clulas por e)emplo $" por lo tanto la masa de sus componentes Las ondas luminosas que emergen del ob)eto entran al prisma de Xollaston # 2 %cu$a estructura cristalogr#fica tiene una posicin invertida con respecto al prisma # *& $ colocado ligeramente descentrado del e)e ptico del microscopio Las dos ondas que estaban desfasadas empiezan a ponerse en fase en la primera mitad del prisma" pero luego en la segunda parte vuelven a desfasarse un I de longitud de onda $ as salen del prisma" pero no pueden interferirse porque vibran en planos distintos !e dirigen al analizador" otro filtro de polarizacin con su estructura cristalogr#fica perpendicular al primer filtro de polarizacin" encargado de 0acer rotar el plano de las dos ondas luminosas" los 0ace coincidir $ se produce la interferencia De esta manera se observa una ligera diferencia de intensidad entre la zona que fue atravesada del ob)eto $ la porcin 0omognea o de menor ndice de refraccin que se muestra con una ma$or intensidad luminosa !i la primera zona es un borde" por e)emplo" de una clula o de una estructura intracelular $ la segunda zona es 0omognea o de menor ndice de refraccin se observar# un borde mu$ brillante o luminoso rodeado de una zona menos iluminada" dando el aspecto de una imagen tridimensional

+iltro analizador

@risma de Xollaston Y 2

ob)etivo

ob)eto

condensador

+igura microsc 26 I$8(ene" o/ten'd&" $ed'&nte el $'c%o"cop'o e

cont%&"te 'nte%!e%enc'&l d'!e%enc'&l o de No$&%"N0. &+ e%'t%oc'to" no%$&le" 0 c%en&do". H+ c,lul&" de"c&$&d&" del ep'tel'o /uc&l. @risma de Xollaston Y *

El borde brillante se forma en un lado del ob)eto" en tanto que el otro lado ocurre un proceso inverso" el borde se oscurece $ el #mbito que lo rodea muestra cierta brillantez La imagen que se forma da la sensacin visual de ba)orrelieve o de un 7aspecto tridimensional8 % fig microsc 26&

+iltro polarizador

M'c%o"cop'o de luz pol&%'z&d&.

Onda luminosa

'na serie de componentes biolgicos" vegetales $ animales" celulares o tisulares est#n constituidos por molculas que por

*H

su organizacin cristalina" paracristalina o fibrilar en su estructuracin bioqumica" adoptan determinada orientacin en el espacio Estas estructuras orientadas en el espacio con un arreglo molecular especial" interactuan con las ondas luminosas que incidan en ellas de formas mu$ variadas" dependiendo de cmo ese ob)eto esta orientado As" los ndices de refraccin del ob)eto ser#n diferentes dependiendo de los e)es de rotacin del ob)eto 'n ob)eto con e)es que poseen varios ndices de refraccin se denomina birrefringente @or la disposicin espacial de los #tomos $ molculas tambin se denominan anisotrpicas La birrefringencia resulta de la alineacin de #tomos o molculas en un determinado plano del ob)eto Estos #tomos $ molculas interaccionan intensamente con ondas luminosas que incidan en ellos desde una determinada direccin" 0aciendo que el plano de vibracin de las ondas luminosas pueda ser modificado o rotado 0asta en un #ngulo de :< Las estructuras birrefringentes cuando son iluminadas con luz polarizada brillar#n intensamente sobre un fondo oscuro5 en cambio su respuesta a la iluminacin ser# mu$ dbil o nula cuando las ondas luminosas incidan desde una direccin diferente $ stas no puedan ser modificadas en su plano de vibracin
Bmagen 2 +iltro analizador brillante oscura

La birrefringencia de una estructura depende de la disposicin asimtrica regular de sus molculas o iones" por e)emplo cristales de fosfatos $ carbonatos de calcio %cristales de 0idro-iapatita& del te)ido seo o ciertas inclusiones celulares como los granos de almidn % birrefringencia cristalina o intrnseca & o una disposicin regular de unidades submicroscpicas asimtricas como los miofilamentos de miosina de las fibras musculares estriadas" los microt4bulos del 0uso acrom#tico % birrefringencia de forma& !e denominan estructuras monorrefringentes o anisotrpicas aquellas cu$o arreglo molecular les confiere un mismo ndice de refraccin Esta disposicin espacial impide que las ondas luminosas polarizadas puedan ser giradas @ara analizar la anisotropa o birrefringencia de una estructura celular o tisular se utiliza el microscopio de luz polarizada Este microscopio se caracteriza porque posee entre el recorrido de los ra$os luminosos dos filtros o prismas polarizadores 'no de ellos % filtro polari!ador& est# localizado despus de la fuente luminosa $ antes del ob)eto" es el filtro encargado de polarizar la luz5 el otro se localiza posterior al ob)eto %filtro anali!ador Las re)illas moleculares de cada filtro se disponen" en el microscopio de polarizacin" perpendiculares entre s Esto significa que si iluminamos el microscopio $ observamos el campo microscpico" ste aparecer# totalmente oscuro" en cambio si en la platina colocamos un ob)eto birrefringente %fibras musculares estriadas" clulas vegetales conteniendo cloroplastos" clulas animales en mitosis" fibras col#genas" granos de almidn" etc & la estructura cristalina o paracristalina de sus molculas 0ar#n rotar el plano de luz polarizada que se trasmiti entre ellas $ lo 0ar#n coincidir con el arreglo molecular de la re)illa del filtro analizador" por lo tanto el ob)eto birrefringente aparecer# brillante sobre un fondo oscuro !e emplea tambin para observar clulas $ organismos microscpicos vivos

onda de luz no girada

ob)etivo

ob)eto

onda de luz girada

condensador

ondas polarizadas +iltro polarizador

Ondas luminosas

+igura microsc 2< Boto$'c%o(%&!1& de un& !'/%& $u"cul&% e"t%'&d& +igura microsc 2:
D'&(%&$& -ue $ue"t%& el %eco%%'do de lo" %&0o" lu$'no"o" en el $'c%o"cop'o de pol&%'z&c'*n 0 l& /'%%e!%'n(enc'& -ue e9:'/e l& e"t%uctu%& $olecul&% del o/2eto. e"-uel,t'c& $o"t%&ndo /&nd&" e"t%'&d&" /'%%e!%'n(ente" )&n'"ot%*p'c&"+ 0 $ono%%e!%'n(ente" )'"ot%*p'c&"+. L& /'%%e!%'n(enc'& "e de/e & l& d'"po"'c'*n e"p&c'&l -ue po"en lo" !'l&$ento" de $'o"'n&.

*E

M'c%o"cop'o de !luo%e"cenc'& o de %&d'&c'*n ult%&3'olet&.

,iertas sustancias naturales o artificiales poseen la propiedad que cuando son estimuladas por energa de cierta longitud de onda % por e)emplo energa radiante invisible como la radiacin ultravioleta o radiacin luminosa violeta o azul& absorben esta energa $ emiten fotones que integran ondas visibles de luz" de longitudes de onda siempre ma$ores que las ondas con las que fueron e-citadas Este fenmeno se denomina fluorescencia La luz emitida se observa en forma de destellos coloreados sobre un fondo oscuro %fig microsc 26& La condicin esencial para que se produzca fluorescencia es que la longitud de onda de la energa radiante e-citatoria sea menor que la longitud de onda emitida La propiedad de generar fluorescencia es propia de ciertas estructuras celulares animales o vegetales @or e)emplo la clorofila cuando es e-citada por radiacin ultravioleta emite radiacin visible de color ro)o La vitamina 7D8 contenida en clulas animales como los 0epatocitos resplandece de un color blanco brillante E-isten una serie de sustancias colorantes artificiales que tambin emiten fluorescencia cuando son e-citadas Estas sustancias se denominan fluorocromos. Los fluorocromos se emplean para demostrar una serie de componentes celulares o tisulares pues al unirse de manera especfica a algunos de ellos $ ser e-citados por radiacin ultravioleta o longitudes de onda menores %azul" violeta& resplandecen ofreciendo im#genes de colores diferentes" generalmente de longitudes de ondas azules" verdes" amarillas" naran)as o ro)as 'no de los fluorocromos m#s conocidos es el naran)a de acridina @or e)emplo cuando se 7colorean8 clulas o te)idos con este fluorocromo es posible demostrar de manera especfica #cidos nucleicos2 El DNA emite radiacin verdeGamarillenta $ el RNA fluoresce de color ro)o E-isten dos tipos de fluorescencia2 a& natural o autofluorescencia se produce cuando determinadas estructuras o sustancias animales o vegetales" al ser e-citadas con radiacin ultravioleta irradian fluorescencia Los e)emplos citados en p#rrafos anteriores %clorofila" (itamina 7D8" etc &" el pigmento flavina" componente del semen tambin es autofluorescente" corroboran lo mencionado b& fluorescencia artificial Es aquella que irradian" de manera especfica" determinadas estructuras celulares o tisulares cuando son 7coloreadas8 por fluorocromos8 $ observadas a travs del microscopio de fluorescencia La fluorescencia artificial se aplica mediante dos procedimientos2 1rocedimiento directo que consiste en unir directamente el fluorocromo" a ciertos componentes de las clulas o te)idos5 por e)emplo" el naranja de acridina con los #cidos nucleicos La auramina con los bacilos de la tuberculosis %en este caso

el 1ycobacterium tuberculosis fluoresce de color amarillo dorado& En otros casos es posible in$ectar soluciones de fluorocromos vitales al interior de las clulas para observar el transporte de sustancias de una clula a otra 1rocedimiento indirecto. @ara que se produzca fluorescencia es indispensable que el fluorocromo se ligue a una determinada sustancia protenica" mediante enlaces covalentes %con)ugados&" la cual mediante la reaccin inmunolgica antgeno %componente que se desea identificar& G anticuerpo %sustancia ligada con el fluorocromo&" se unir#n de manera especfica @or e)emplo se ligan fluorocromos con anticuerpos antiGtubulina $ el con)ugado se vierte en un cultivo de te)idos 3racias a este procedimiento se puede observar el 0uso acrom#tico %constituido por microt4bulos& de las clulas en proceso de mitosis As mismo se con)ugan fluorocromos a anticuerpos antiG actina o antiGmiosina para demostrar el citoesqueleto de clulas como macrfagos o fibroblastos u observar la disposicin de los miofilamentos de actina $ miosina en las fibras musculares
Bmagen fluorescente @lano de la imagen

ocular

filtro protector

ob)etivo ra$os verdes espcimen

,ondensador

9a$os filtrados %azules&

ra$o filtrado ultravioleta

+iltro selector

+igura microsc

2C D'&(%&$& -ue %ep%e"ent& lo" p%'nc'p&le" co$ponente" del $'c%o"cop'o de !luo%e"cenc'& po% t%&n"p&%enc'& 0 el %eco%%'do de lo" %&0o" lu$'no"o".

La microscopa de fluorescencia 0a permitido avanzar de manera sorprendente en la investigacin de procesos fisiolgicos celulares que mediante otros procedimientos no 0ubiera sido posible realizar La fluorescencia permite demostrar" por la radiacin luminosa que emiten" partculas sumamente peque1as que con otros tipos de microscopios 20

fotnicos no son f#ciles de visualizar En este tipo de procedimiento es indispensable obtener el registro fotogr#fico de las im#genes obtenidas El microscopio de fluorescencia consta de los mismos componentes de un microscopio fotnico al que se le a1aden varios aditamentos %fuente luminosa $ filtros especiales& con la finalidad de que emita" de manera selectiva" radiaciones de determinadas longitudes de onda2 radiacin ultravioleta u ondas luminosas de color violeta" azul" verde E-isten dos tipos de microscopio de fluorescencia2 aquel en el cual las radiaciones e-citatorias atraviesan la muestra a observar" se le denomina microscopio de fluorescencia de transmisin o de transparencia Este tipo de microscopio casi est# en desuso P el denominado microscopio de epifluorescencia donde la radiacin e-citatoria es aplicada sobre la muestra a travs de un sistema incorporado al ob)etivo La radiacin no atraviesa el espcimen Los aditamentos son2 Buente lu$'no"& de gran potencia que preferentemente emita radiaciones '(" violeta" azul $ verde B'lt%o" "electo%e" o e9c't&do%e" encargados de filtrar $ seleccionar las ondas radiantes de aquellas que no se desean emplear B'lt%o p%otecto% o de /&%%e%&. Es un filtro de color amarillo5 est# localizado entre el ob)etivo $ el tubo ptico Es indispensable utilizarlo para bloquear alg4n tipo de radiacin ultravioleta que pueda 0aberse trasmitido o refle)ado $ que no e)erci en la muestra actividad e-citatoria %la radiacin '( posee una alta energa que puede irritar e inflamar los te)idos del globo ocular& O/2et'3o" de !luo%'t&. Los ob)etivos cu$as lentes est#n construidos por silicatos %vidrios de flint o de croN& poseen autofluorescencia" por lo que es necesario reemplazarlos por ob)etivos de fluorita En el caso del microscopio de epifluorescencia" los ob)etivos est#n dise1ados $ construidos para que ellos tambin funcionen como lentes condensadores pro$ectando la energa radiante uniformemente sobre la muestra E"pe2o d'3'"o% de :&ce". Es un aditamento propio de este tipo de microscopio Est# situado en posicin oblicua por encima del ob)etivo !us caractersticas fsicas solamente le permiten refle)ar" 0acia el espcimen la longitud de onda filtrada $ seleccionada 9adiaciones que no fueron bloqueadas por el filtro e-citador atraviesan el espe)o divisor $ contin4an su tra$ectoria sin ser refle)ados

+igura microsc 26 Boto$'c%o(%&!1& de e"t%uctu%&" celul&%e" -ue

$ue"t%&n !luo%e"cenc'&. Bmagen fluorescente plano de la imagen

ocular

filtro protector

filtro selector

espe)o divisor de 0aces

ob)etivo condensador

espcimen

+igura microsc

2H D'&(%&$& -ue %ep%e"ent& lo" p%'nc'p&le" co$ponente" del $'c%o"cop'o de ep'!luo%e"cenc'& 0 el %eco%%'do de lo" %&0o" lu$'no"o".

M'c%o"cop'o t%'d'$en"'on&l de %&"t%eo con!oc&l.

Las im#genes obtenidas con los microscopios de fluorescencia" de transmisin $ de epifluorescencia" tienen el inconveniente que no siempre muestran una resolucin $ una nitidez deseada" $a sea porque los especmenes e-aminados son demasiado gruesos %los componentes que fluorescen muestran varios planos focales" los que al superponerse e-0iben una imagen desenfocada& o porque durante proceso de preparacin de la muestra $ su observacin posterior el fluorocromo tiende a ser fotoo-idado por la energa radiante que lo e-cita $ su capacidad de generar luminiscencia se pierde con rapidez5 en otros casos suele difundirse lentamente $ el contorno del espcimen aparece levemente difuso !i la muestra e-0ibe zonas sumamente peque1as que 2*

reaccionan al fluorocromo" el resplandor o el brillo de la imagen suele ser mu$ dbil sobre un fondo del campo microscpico totalmente oscuro Esto obliga a que para obtener las im#genes fotogr#ficas se requiere tiempos de e-posicin bastante prolongados %a pesar de e-istir material fotogr#fico con velocidades de e-posicin sumamente r#pidas& lo que ocasiona que se presenten los inconvenientes mencionados anteriormente Ante estos inconvenientes se 0a logrado dise1ar $ construir un microscopio denominado microscopio fotnico tridimensional de rastreo confoca l" a travs del cual se obtienen im#genes" preferentemente fluorescentes" sumamente ntidas" con una gran capacidad de resolucin $ sin que se produzca la fotoo-idacin del fluorocromo El mecanismo de accin de este microscopio se basa en la iluminacin de la muestra con un delgado ra&o laser concentrado en un foco que recorre con rapidez" punto por punto" todos los componentes del espcimen" a una profundidad microscpica constante" de tal manera que se ilumina un plano mu$ delgado %plano ptico&" apro-imadamente calculado entre 0 < a 0 H de micrmetro La imagen as obtenida se recoge en un monitor $ se guarda en la memoria de un procesador" el cual )unta las im#genes de otros planos" inferiores o superiores 0asta integrarla en una sola imagen de contornos sumamente ntidos $ con una gran e-0ibicin de detalles que" en otras condiciones" no seran posibles de observar ;ediante el sistema computarizado la imagen compuesta se puede observar en tres dimensiones e inclusive puede rotarse para ser visualizada desde diferentes #ngulos

)unto con otros cientficos desarrollaron un microscopio electrnico" en el que mediante la aplicacin de energa elctrica de alto volta)e a un electrodo met#lico" se emitan 0aces de electrones con longitudes de onda que en un principio no lograron sobrepasar el poder de resolucin del microscopio fotnico pero que" en el a1o de *E6H" despus de una serie de innovaciones como el fabricar $ adicionarle un condensador que orientaba" concentraba $ aceleraba la marc0a del 0az de electrones emitidos" les permiti alcanzar im#genes con un poder de resolucin cercano a los *0 nanmetros %*00Z& La longitud de onda de los electrones emitidos por el electrodo met#lico %c#todo&" depende del volta)e aplicado" es decir" a ma$or volta)e utilizado menor ser# la longitud de onda del 0az de electrones La relacin de con el poder de resolucin del microscopio electrnico es2 ,on *0 ?ilovoltios %?(& de aceleracin" se produce una longitud de onda %& de 0 00*nm que genera" a su vez" una resolucin de *0 nm ,on *00 ?(" la es igual a 0 000: nm $ el poder de resolucin es de : nm ,on *000 ?(" la es igual a 0 000* nm $ el poder de resolucin es de * nm Los 0aces de electrones emitidos por el c#todo se desplazan en todas las direcciones del espacio" por lo tanto es necesario reorientarlos $ acelerar su desplazamiento Esto se consigue con un #nodo colocado en las cercanas de la emisin que genera un alto potencial elctrico positivo E-isten dos tipos de microscopios electrnicos2 el ME de t%&n"$'"'*n $ el ME de /&%%'do %scanning&

B'(u%& $'c%o"c. AO Bmagen de una fase de la mitosis obtenida mediante

microscopio tridimensional confocal

M'c%o"cop'o elect%*n'co.

El microscopio fotnico tiene una capacidad m#-ima de mostrar detalles de la imagen de un ob)eto %poder de resolucin&" cuando entre ellos e-iste una distancia apro-imada de 0 2 de micrmetro Este tipo de microscopio es incapaz de ofrecer un poder de resolucin ma$or porque e-isten dos factores limitantes2 la longitud de onda % & de la energa luminosa utilizada $ la apertura numrica %A U & de la lente del ob)etivo La 4nica manera de aumentar el poder de resolucin de un microscopio era encontrar energa radiante con longitudes de onda menores a las que posee el espectro radiante visible En *E60" el fsico De Sroglie" bas#ndose en estudios tericos predi)o que los electrones" emitidos ba)o ciertas circunstancias" como en el vaco" por e)emplo" podan desplazarse $ comportarse como ondas de energa ,omprobada esta teora" entre *E62 $ *E6:" =noll $ 9us?a"

B'(u%& $'c%o"c. CI. +otografa de un microscopio electrnico de

transmisin

22

M'c%o"cop'o elect%*n'co de t%&n"$'"'*n +ue dise1ado $

construido bas#ndose en los mismos principios de un microscopio fotnico5 con la diferencia que en vez de usar energa luminosa emplea 0aces de electrones $ reemplaza las lentes pticas %de vidrio& por 7lentes8 construidas mediante campos electromagnticos En la figura microsc 6* se representan los principales componentes del ; E de transmisin" los cuales son2 4n c)todo" constituido por un filamento de alambre de tungsteno que se calienta e irradia un c0orro de electrones cu$a velocidad $ longitud de onda est#n relacionadas con el volta)e de la energa elctrica que se le aplica 4n )nodo" encargado de orientar los 0aces de electrones" reagruparlos $ acelerar su recorrido Lente condensadora (primer campo electromagn.tico). Los 0aces de electrones provenientes del #nodo son concentrados por este primer campo electromagntico $ dirigidos 0acia el 0oporte de la muestra* en este lugar" dependiendo de la densidad que posean los componentes del espcimen los 0aces de electrones los atraviesan" son absorbidos" refle)ados o son desviados en su recorrido Las muestras deben ser secciones sumamente delgadas para permitir el paso de los electrones 3eneralmente se utilizan secciones de te)idos del orden de 20 a *00 nanmetros El escaso grosor del espcimen dificulta la formacin de la imagen por lo que es necesario 7te1ir8 o contrastar las secciones con soluciones de sales de metales pesados %plomo" uranio" plata o vanadio&" los cuales tienen cierta afinidad por determinados componentes celulares Lente objetivo (segundo campo electromagn.tico) . Los electrones que atraviesan la muestra o los desviados por los componentes de la misma" llegan a esta zona donde son enfocados para formar una imagen ampliada Esta imagen es recogida por la Lente ocular o de pro&eccin (tercer campo electromagn.tico) que vuelve a enfocar la imagen $ la pro$ecta" ampliada tambin numerosas veces" 0acia la pantalla fluorescente. 2sta e s una superficie plana constituida por un soporte de colodin donde se distribu$en partculas mu$ finas de sales de zinc o de fsforo verde" las cuales emiten energa luminosa %ondas de ma$or longitud" visibles al o)o 0umano& cuando son estimuladas por el c0oque de los electrones @ara obtener un registro permanente de la imagen observada se reemplaza la pantalla fluorescente con una placa fotogr)fica" cu$os componentes son estimulados por los electrones de la misma manera que act4an los fotones c#todo
8nodo :&z de elect%one"

conden"&do% $ue"t%&

lente ob)etivo

imagen ampliada

Lente )ocul&%+ p%o0ecto%&

imagen final @antalla fluorescente o placa fotogr#fica

+igura microsc 6* D'&(%&$& -ue %ep%e"ent& lo" co$ponente" p%'nc'p&le" de un $'c%o"cop'o elect%*n'co 0 el %eco%%'do del :&z de elect%one".

/odos los componentes del microscopio electrnico est#n contenidos dentro de una columna met#lica conectada a un

sistema de 0acer vaco Es imprescindible que e-ista el

vaco dentro de la columna pues los electrones son desviados f#cilmente si e-isten en el medio partculas o molculas suspendidas Los electrones que atraviesan o son desviados por estructuras del espcimen que poseen escasa o nula densidad llegan a la pantalla fluorescente $ estimulan sus partculas Aquellos electrones que inciden en estructuras de ma$or densidad" son refle)ados o absorbidos" no las atraviesan $ de)an zonas de la pantalla sin estimular" por lo tanto en esos lugares no se emite luminosidad De esa manera se forma la imagen con zonas iluminadas o claras denominadas electronl5cidas " $ otras oscuras o electrondensas %fig microsc 62& El ; E de transmisin se emplea para obtener im#genes con un gran poder de resolucin que alcanza desde 0 < a * 0 nanmetro

+igura microsc 62 Boto$'c%o(%&!1& o/ten'd& con el $'c%o"cop'o Lente

elect%*n'co de t%&n"$'"'*n.

26

M'c%o"cop'o )"c&nn'n(+.

elect%*n'co

de

/&%%'do
@antalla de /( Bmagen del ob)eto

Este tipo de microscopio electrnico funciona con los mismos principios electrnicos del ; E de transmisin2 una fuente generadora de electrones" campos electromagnticos que act4an como 7lentes8 concentradoras %6& de los 0aces de electrones o como ampliadoras de im#genes La diferencia estriba en que los electrones no atraviesan el espcimen para formar las im#genes Los electrones se aceleran $ concentran 0asta formar un 0az sumamente delgado de mas o menos < nm de di#metro que rastrea o 7barre8 la superficie de la muestra Los electrones son refle)ados por los componentes de la misma o al c0ocar con ellos generan electrones secundarios En ambos casos los electrones se envan e inciden en la superficie de un detector localizado en las cercanas de la muestra Este aditamento est# conectado a un amplificador que enva se1ales en forma de ra$os catdicos a la pantalla de un monitor de televisin %ver fig microsc 62& @ara registrar la imagen formada se utiliza una c#mara fotogr#fica El ; E de barrido" ofrece im#genes con una resolucin que alcanzan de *0 a 20 nm El aumento efectivo es de *<"000 a <0"000 di#metros Otra venta)a de este microscopio es que forma im#genes con una gran profundidad de foco5 de apro-imadamente <00 veces que la del microscopio fotnico Esta propiedad le confiere a la imagen su aspecto tridimensional %fig microsc 6:&

+igura microsc

66 E"-ue$& -ue %ep%e"ent& lo" p%'nc'p&le" co$ponente" del $'c%o"cop'o elect%*n'co de /&%%'do 0 l& t%&0ecto%'& del :&z de elect%one".

Otra diferencia radica en la preparacin del espcimen que debe ser e-aminado5 este microscopio sirve para observar su superficie constituida por una serie de diminutos relieves" sinuosidades" depresiones" grietas $ prominencias" tal como se e-0iben en estado viviente" pero que debe estar totalmente des0idratado pues tambin en este microscopio se debe traba)ar en el vaco El agua del material biolgico no se puede sustituir por una sustancia de inclusin porque no se requiere efectuar secciones delgadas del te)ido En cambio" se le debe proporcionar a la superficie del espcimen la capacidad de 0acerse reflectante a los electrones que incidan en ella La totalidad del material biolgico a observar" posee un alto contenido de agua" si se desea eliminarla sec#ndola al aire se produciran graves da1os en la estructura morfolgica de las clulas por efecto de la tensin superficial en la interfase aireGagua @ara que esto no ocurra las muestras se preparan a travs de la tcnica del secado (asta el punto crtico en el que se sustitu$e el solvente de des0idratacin por un gas en su estado lquido %,O 2& que" aplic#ndole una determinada presin $ a una temperatura especfica" pasa a la fase gaseosa sin pasar por el estado slido5 esto evita que el material se colapse $ mantenga su superficie intacta5 con todos los relieves que tuvo al estado natural A continuacin se cubre la superficie con una capa conductora %60 a *00 nm& de carbn finamente pulverizado $ posteriormente con una pelcula de metal pesado %plata" oro" platino o paladio& del mismo grosor Ambos elementos se depositan mediante un sistema de evaporacin al vaco De esta manera la superficie de la muestra est# preparada para recibir los electrones" refle)arlos o emitir electrones secundarios

c#todo
8nodo :&z de elect%one" Lente" conden"&do%& "

detector

muestra
amplificador

2:

B'(u%& $'c%o"c. CD. Bmagen que forma el microscopio de

7scanning8 o de barrido

9evisado el *6 de septiembre del a1o 2002

2<