UNIVERSIDAD TCNICA DE AMBATO FACULTAD DE CIENCIA E INGENIERA EN ALIMENTOS CARRERA DE INGENIERA BIOQUMICA LABORATORIO DE BIOINGENIERA Profesor: Gioconda Garca,

Ph. D. Ayudante: Juan Pablo Peafiel Nombre: Mara Dolores Caldern Daniela Navas L. Curso: Noveno U BQ Practica: #1 Tema: OBTENCIN Y CUANTIFICACIN DE ACIDO CTRICO INTRODUCCIN Un metabolito es cualquier sustancia producida durante el metabolismo (digestin u otros procesos qumicos corporales). El trmino metabolito tambin se puede referir al producto que queda despus de la descomposicin (metabolismo) de un frmaco por parte del cuerpo (Kumar, 2013). Un metabolito principal est directamente implicado en el crecimiento normal, el desarrollo y la reproduccin. El alcohol es un ejemplo de un metabolito primario producido en gran escala por parte de la microbiologa industrial. Los metabolitos primarios, muy abundantes en la naturaleza, son indispensables para el desarrollo fisiolgico de la planta; se encuentran presentes en grandes cantidades, son de fcil extraccin y su explotacin es relativamente barata y conducen a la sntesis de los metabolitos secundarios. Entre ellos se encuentran aminocidos proteicos, protenas, carbohidratos, lpidos, cidos grasos, algunos cidos carboxlicos, etc. Los metabolitos secundarios son derivados de los primeros, pero su distribucin en el reino vegetal es ms limitada y para determinados compuestos queda restringida a ciertas especies e incluso a algunos grupos dentro de una misma especie, por lo tanto es improbable que desarrollen un papel fundamental en el metabolismo primario. Sin embargo, existen excepciones, entre estas estn las clorofilas y los reguladores del crecimiento (hormonas vegetales), de los que sus funciones bioqumicas y fisiolgicas han sido ampliamente reconocidas; adems, recientemente se estableci que los flavonoides son factores que inducen la germinacin del polen y la elongacin del tubo polnico (Verpoorte, 2000.).

Los metabolitos o productos secundarios no tienen un papel definido en los procesos de respiracin, asimilacin, transporte, a diferencia de los metabolitos primarios como los carbohidratos, protenas, cidos nucleicos (Gonzles, sf). El cido ctrico es un compuesto natural que se encuentra en todos los seres vivos, pero est particularmente concentrado en las frutas ctricas. Primero fue producido a partir del jugo de limn, en Italia, all por 1860, pero con un rendimiento muy bajo, tiempo despus se descubri que haba ciertos hongos microscpicos capaces de acumular cido ctrico, lo que permiti su produccin en gran escala, casi todo el cido ctrico industrial se obtiene del hongo Aspergillus niger, que acumula enormes cantidades del cido y es muy fcil de cultivar en grandes fermentadores de acero. Por su sabor agradable, baja toxicidad y otras propiedades fisico-qumicas, el cido ctrico tiene un sinnmero de aplicaciones. Es uno de los principales aditivos alimentarios, usado como conservante, anti-oxidante, acidulante y saborizante de golosinas, bebidas gaseosas y otros alimentos. Se lo usa adems en la industria farmacutica, para lograr efervescencia y sabor, y tambin como anticoagulante de la sangre. Se agrega a detergentes y otros productos de limpieza, para estabilizarlos, otorgarle acidez, y reemplazar a los corrosivos ms fuertes. Hoy la produccin mundial de cido ctrico alcanza las 550.000 toneladas por ao, y es producido principalmente en Estados Unidos, la Unin Europea y China (ArgenBio, s/f).

OBJETIVOS Objetivo General Obtener cido ctrico a partir de Trichoderma y Aspergillus.

Objetivos Especficos Calcular el nmero de UFC de la cepa de Trichoderma. Indicar la produccin de cido ctrico a partir de un microorganismo.

MATERIALES, EQUIPOS Y REACTIVOS pH-metro Brixmetro Cajas petri Cmara de flujo laminar Autoclave Mechero de alcohol Incubadora

Medio de cultivo (PDA) Cepas de Aspergillus niger y Trichoderma

PROCEDIMIENTO Replicacion de Material Biologico

Elaboracion de suspension de esporas y conteo en Hemocitmetro

Construccion de reactores con sustrato Suero de leche

Cuantificacion de parametros de pH, acidez, Brix

CLCULOS Y RESULTADOS Tabla 1: Variacin del pH del medio (suero de leche) en funcin del tiempo Das Aspergillus Tricoderma 1 4,05 3,22 2 4,02 3,27 3 3,94 2,95 4 3,82 3,87 5 3,72 3,71 Fuente: Laboratorio de Bioingeniera Realizado por: Caldern - Navas Tabla 2: Volumen titulante (NaOH 0,1N) utilizado para neutralizar el cido ctrico Das Aspergillus Tricoderma 1 3,0 2,5 2 3,1 2,5 3 3,8 3,4 4 5,2 3,6

5 6,2 5,5 Fuente: Laboratorio de Bioingeniera Realizado por: Caldern - Navas Tabla 3: Acidez del medio del cultivo liquido (suero de leche) en funcin al tiempo Das Aspergillus Tricoderma 1 4 3,33 2 4,13 3,33 3 5,07 4,53 4 6,93 4,80 5 8,27 7,33 Fuente: Laboratorio de Bioingeniera Realizado por: Caldern - Navas Tabla 4: Brix en funcin al tiempo Das Aspergillus Tricoderma 1 5,0 5,0 2 5,0 4,4 3 3,6 4 4 5,0 4 5 5,0 3,6 Fuente: Laboratorio de Bioingeniera Realizado por: Caldern - Navas Grafico 1: Replica de Trichoderma

Fuente: Laboratorio de Bioingeniera Realizado por: Caldern - Navas

Grafico 2: pH vs. Das

4.5 4 3.5 3 pH 2.5 2 1.5 1 0.5 0 y = -0.086x + 4.168 R = 0.963 y = 0.158x + 2.93 R = 0.439 pH del medio Aspergillus pH del medio Trichoderma Lineal (pH del medio Aspergillus) Lineal (pH del medio Trichoderma)

Lineal (pH del medio Trichoderma) 0 1 2 3

Dias

Fuente: Laboratorio de Bioingeniera Realizado por: Caldern - Navas Grafico N3: Acidez vs. Das
9 8 7 6 Acidez 5 4 3 2 1 y = 1.134x + 2.278 R = 0.9273 Acidez del medio Aspergillus Acidez del medio Trichoderma

y = 0.947x + 1.823 R = 0.8379

Lineal (Acidez del medio Aspergillus) Lineal (Acidez del medio Trichoderma) Lineal (Acidez del medio Trichoderma)

0
0 2 Dias 4 6

Fuente: Laboratorio de Bioingeniera Realizado por: Caldern - Navas

Grafico N4: Brix vs. Das

6 5 4 Brix 3 2 1 y = -0.32x + 5.16 R = 0.9143 y = 4.72 R = 0 Brix Aspergillus Brix Trichoderma Lineal (Brix Aspergillus) Lineal (Brix Trichoderma) 0 2 Dias 4 6

Fuente: Laboratorio de Bioingeniera Realizado por: Caldern - Navas Grafico N5: Acidez vs. pH
9 8 7 6 Acidez 5 4 3 2 1 0 0 1 2 pH 3 4 5 y = 2.3988x - 3.5014 R = 0.3057

y = -13.393x + 58.048 R = 0.9934

Acidez vs pH Aspergillus Acodez vs pH Trichoderma Lineal (Acidez vs pH Aspergillus) Lineal (Acidez vs pH Aspergillus) Lineal (Acidez vs pH Aspergillus) Lineal (Acodez vs pH Trichoderma)

Fuente: Laboratorio de Bioingeniera Realizado por: Caldern - Navas Tabla N5: Datos Conteo Hemocitmetro Trichoderma Recuadro 1 Recuadro 2 Recuadro 3 28 12 17 28 8 23 26 24 18 30 12 15

15 28 14 18 Promedio Fuente: Laboratorio de Bioingeniera Realizado por: Caldern Navas Clculo de rea recuadros 1 y 3

0,25mm2 * 0,1mm 6.25 *103 mm3 6.25 *106 lt

Clculo de rea recuadros 2

0,2mm2 * 0,1mm 4 *103 mm3 4 *106 lt

Calculo Conteo de UFC

44.8 *106 35 *106 28.8 *106 108.6 *106UFC

DISCUSIN El cido ctrico ha sido conocido como una sustancia natural de las plantas desde finales del siglo XIX, y desde 1893 los cientficos saben que es producido por hongos filamentosos. En 1923 se inici la primera fermentacin practica para la produccin de este acido orgnico utilizando microorganismos que crecan sobre la superficie de los cultivos. En la actualidad el uso de hongos para la elaboracin de importantes productos comerciales ha aumentado rpidamente en los ltimos tiempos, instaurando un marco en el cual el cido ctrico se ha posicionado como el mayor cido orgnico producido por fermentacin con Aspergillus niger, a la vez que es ampliamente usado en la industria de alimentos, bebidas, farmacutica, qumica entre otras (Ates et al, 2002). En cuanto a la produccin de cido ctrico, se afirma que el pH inicial requerido depende de la fuente de carbono utilizada, adems que se menciona que los hongos filamentosos Aspergillus niger acumulan altas concentraciones de cido ctrico a partir de hexosas o disacridos cuando es cultivado bajo condiciones particulares. En lo que se refiere al pH, la variacin respecto a Aspergillus y Trichoderma es notoria debido a que el primer hongo forma una lnea casi recta, mientras que el segundo hongo present alteraciones en las mediciones de pH, tal como se puede apreciar claramente en el grfico 2.

Al observar el grafico 3, que se refiere a la variacin de acidez, se puede observar claramente el aumento de acidez en el medio conforme el aumento en los das de incubacin, lo que demuestra la formacin de cido ctrico en el medio de cultivo por medio de los microorganismos. La medicin de grados Brix demuestran una lnea casi recta que disminuye para Trichoderma, mientras que para Aspergillus casi no demuestra variacin exepto en el dia 3, por lo que nos da un R2 de cero, tal como se observa en el grafico 4.

CUESTIONARIO Qu son reactores biolgicos?

Un reactor biolgico es un equipo que opera utilizando microrganismos y o enzimas para la conversin oxidativa de compuestos orgnicos (Wikilibros, s/f) Qu es un metabolito secundario?

Los metabolitos secundarios son derivados de los primeros, pero su distribucin en el reino vegetal es ms limitada y para determinados compuestos queda restringida a ciertas especies e incluso a algunos grupos dentro de una misma especie, por lo tanto es improbable que desarrollen un papel fundamental en el metabolismo primario (Verpoorte, 2000.). Diferencia entre metabolitos primarios y secundarios.
Metabolitos secundarios

Metabolitos primarios Productos del metabolismo general Ampliamente distribu dos en plantas y microorganismos Indispensables para la vida

Productos del metabolismo especial Biosintetizados a partir del metabolismo primario Distribucin restringida a ciertas plantas, microorganismos Aminocidos de protenas, monosacridos, Distribucin taxonmica restringida (a veces lpidos, cidos derivados del ciclo de los caracterstico de un gnero dado o de una cidos tricarboxlicos, glcosidos, etc especie) No indispensables para la vida Alcaloides, terpenos, flavonoides, esteroides, cumarinas, etc.

Tabla 1. Diferencias entre metabolitos primarios y secundarios (Verpoorte, 2000)

Explicar brevemente mtodos de cuantificacin de tipos de metabolitos (mnimo 5).

Validacin de un mtodo analtico espectrofotomtrico para la cuantificacin de metabolitos estables de xido ntrico en fluidos biolgicos Se trata de un mtodo espectrofotomtrico por espectrometra de UV-Vis para la cuanticacin de metabolitos estables de xido ntrico (NO3-) en muestras biolgicas (suero) utilizando la reaccin colorimtrica de Griess modicada a un coeciente de extincin de A572-A587 nm. Bajo estas condiciones, el mtodo analtico mostr ser selectivo, lineal (en el intervalo de concentracin de 0 a 40M, con un porcentaje de recobro analtico promedio del 101.9% y un coeciente de variacin del 1.4%), exacto (con un porcentaje de recobro analtico promedio del 102.2% y un coeciente de variacin del 0.2%) y preciso (con un porcentaje de recobro analtico promedio del 101.1% y un coeciente de variacin del 1.9%), un lmite de deteccin de 0.69 pM y un lmite de cuanticacin de 2.10 pM. Mtodo de Bradford.- (Bradford, M. Anal. Biochem., 72:248, 1976), el mismo est basado en el cambio de color del colorante Coomassie brilliant blue G-250 en respuesta a diferentes concentraciones de protenas. Este compuesto interacciona con aminocidos bsicos (especialmente arginina) y aromticos. Esta unin del colorante con las protenas provoca un cambio en el mximo de absorcin del colorante desde 465 a 595 nm. Por lo tanto, este mtodo se basa en la propiedad del Azul Brillante de Coomasie G-250 de presentarse en dos formas con colores diferentes, rojo y azul. La forma roja se convierte en azul cuando el colorante se une a la protena. Experimentalmente se mide la diferencia de Absorbancias entre 595 y 465 nm (595-465nm). Mtodo de Lowry.- (1951) es un mtodo colorimtrico de valoracin cuantitativa de las protenas. Bajo condiciones alcalinas el Cu++ forma un complejo con los enlaces peptdicos de las protenas y se reduce a Cu+. El Cu+ as como los grupos R de Tirosina, Triptofano y Cisteina reaccionan con el reactivo de Folin. Este reactivo reacciona primero produciendo un producto inestable que se reduce lentamente a azul de molibdeno/tungsteno esta reaccin ocurre en medio cido. Comentarios: aquellos agentes que acidifican las soluciones (por ejemplo: cidos fuertes o buffers), los quelantes de Cu (por ej. EDTA) o los reductores de Cu (por ej.: mercaptoetanol, ditiotreitol, fenoles) sern interferentes de la reaccin. Las protenas producirn distintas intensidades de color dependiendo primariamente de su contenido de Tyr y Trp. Mtodo de Biuret.- El nombre de la reaccin procede del compuesto coloreado formado por la condensacin de dos molculas de urea con eliminacin de amonaco. Si una solucin fuertemente alcalina de sulfato cprico (CuSO4) se aade a una solucin de

protena se forma una complejo entre el ion cprico y los enlaces peptdicos, con aparicin de una coloracin violeta-prpura, que presenta un mximo de absorcin a 540 nm. Cromatografa de lquidos HPLC.- En la cromatografa lquida, la fase mvil es un lquido que fluye a travs de una columna que contiene a la fase fija. La separacin cromatogrfica en HPLC es el resultado de las interacciones especficas entre las molculas de la muestra en ambas fases, mvil y estacionaria. A diferencia de la cromatografa de gases, la cromatografa de lquidos de alto rendimiento (HPLC, de high-performance liquid chromatography) no est limitada por la volatilidad o la estabilidad trmica de la muestra. La HPLC es capaz de separar macromolculas y especies inicas, productos naturales lbiles, materiales polimricos y una gran variedad de otros grupos polifuncionales de alto peso molecular. Con una fase mvil lquida interactiva, otro parmetro se encuentra disponible para la selectividad, en adicin a una fase estacionaria activa. La HPLC ofrece una mayor variedad de fases estacionarias, lo que permite una mayor gama de estas interacciones selectivas y ms posibilidades para la separacin. HPLC preparativa.- Es la tcnica escogida para aislamiento y purificacin de productos de valor en las industrias qumicas y farmacuticas as como en la biotecnologa y la bioqumica. La cromatografa preparativa comprende un amplio rango de aplicaciones, desde el aislamiento de 1g de muestra para identificacin espectroscpica hasta el aislamiento de un compuesto puro de una mezcla de 100 g.

CONCLUSIONES Se obtuvo cido ctrico partir de Trichoderma y Aspergillus niger, siendo ms factible obtener el cido ctrico de Aspergillus niger, que acumula enormes cantidades del cido y es muy fcil de cultivar en grandes fermentadores de acero. Se calcul el nmero de UFC de la cepa de Trichoderma, obteniendo 108,6 * 106 unidades formadoras de colonias. Se indic la produccin de cido ctrico a partir de Aspergillus niger, siendo as la fermentacin aerbica, la condicin fundamental pare tener un gran rendimiento es que le medio sea deficiente en hierro, y el cido ctrico es super producido como agente quelante para apoderarse del hierro.

BIBLIOGRAFA ArgenBio. s/f. La Biotecnologa en nuestra vida cotidiana y en un mundo que crece y cambia. El cido ctrico. Consultado en: http://www.argenbio.org/index.php?action=novedades&note=433 (22/11/2013). Ates, S., Dingil, N., Bayraktar, E. y Mehmetoglu, U. 2002. Enhancement of citric acid production by immobilized and freely suspended Aspergillus niger using silicone oil. Process Biochemistry. Gonzles, F. sf. Metabolitos primarios, inters industrial. Consultado http://darwin.usal.es/profesores/pfmg/sefin/MI/tema07MI.html (22/11/2013). Kumar, F. 2013. Metabolito. Consultado http://www.nlm.nih.gov/medlineplus/spanish/ency/article/002258.htm (22/11/2013). en:

en:

Verpoorte, R. 2000. Secondary Metabolism. En: Metabolic engineering of plants secondary metabolism. Verpoorte, R.; Alfermann, A.W. (eds). Kluwer Academic Publishers. Netherlands. 1-29 pp (22/11/2013). Wikilibros. s/f. Procesos biolgicos. Consultado en: http://es.wikibooks.org/wiki/Ingenier%C3%ADa_de_aguas_residuales/Procesos_biol%C3 %B3gicos_aerobios (22/11/2013).