Identificación de Los Polifenoles en Zumos de Frutas Rojas

IDENTIFICACINDELOS POLIFENOLESENZUMOSDEFRUTAS ROJAS
Titulacin: Intensificacin: Alumna: Directores de proyecto:
Mster en Ingeniera Ambiental y de Procesos Qumicos y Biotecnolgicos. Especialidad en Investigacin Jacinta Collado Gonzlez Mercedes Alacid Crceles Jose Mara Obn de Castro
Cartagena, 9 de Diciembre de 2011.
Identificacin de Polifenoles en Zumos de frutas rojas
JacintaColladoGonzlez
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Proyecto Fin de Mster

TTULO: Identificacin de los polifenoles en zumos de frutas rojas PROYECTO INVESTIGADOR NDICE Pgina 5 5 6 9 9 12 13 14 15 20 21 22 23 27 28 29 30 31 32 33 34 35 38 38 38 39 40 40 43 46 51 52
CAPTULO 1.- INTRODUCCIN 1.- La importancia de los zumos de fruta 1.1.- La importancia de las frutas en nuestra dieta 1.2.- Beneficios de los zumos de frutas rojas para la salud 2.- Los zumos de frutas 2.1.-Definicin y tipos 2.2.- La calidad y autenticidad de los zumos de frutas rojas 2.2.1.- Perfil de los polifenoles 2.2.1.1.- cidos fenlicos 2.2.1.2.- Flavonoides 2.2.1.3.- Estilbenos 2.2.1.4.- Lignanos 2.2.1.5.- Perfil de los antocianos 2.3.- Comercializacin de los zumos 3.- Los zumos de frutas rojas 3.1.- Mirtilo (Blueberry) 3.2.- Arndano europeo (Cranberry) 3.3.- Grosella (Blackcurrant) 3.4.- Cereza (Cherry) 3.5.- Uva tinta (Black grape) CAPTULO 2.- JUSTIFICACIN Y OBJETIVOS 1.- Justificacin y objetivos 2.- Estructura del trabajo CAPTULO 3.- PLAN DE TRABAJO 1.- Plan de trabajo CAPTULO 4.- MATERIALES Y MTODOS 1.- Materiales 1.1.- Reactivos empleados 1.2.- Patrones empleados 1.3.- Muestras de frutas rojas 2.- Mtodos 2.1.- Mtodos de anlisis de polifenoles por HPLC 2.2.- Mtodo de medida del detector de fotodiodos (PDA). 2.3.- Mtodos de medida de espectros de masas 2.4.- Mtodos de medida de preparacin de patrones y de muestras 2.5.- Condiciones de anlisis por HPLC con detector de fotodiodos y detector de masas
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CAPTULO 5.- RESULTADOS 1.- Anlisis por HPLC de los patrones estudiados 1.1.- Anlisis por UV VISIBLE de los patrones estudiados 1.2.- Anlisis por detector de masas de los patrones estudiados 2.- Anlisis por HPLC de los zumos de frutas rojas 2.1.- Mirtilo (Blueberry) 2.2.- Arndano europeo (Cranberry) 2.3.- Grosella (Blackcurrant) 2.4.- Cereza (Cherry) 2.5.- Uva tinta (Black grape)
3.- Resumen de los polifenoles identificados en estas cinco frutas 3.1.- Antocianos identificados 3.2.- Flavonoles identificados 3.3.- cidos fenlicos identificados 3.4.- Flavanoles, estilbenos y cido ascrbico identificados
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CAPTULO 6.- CONCLUSIONES 1.- Conclusiones CAPTULO 7.- BIBLIOGRAFA 1.- Bibliografa
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CAPTULO1.INTRODUCCIN
1.- LA IMPORTANCIA DE LOS ZUMOS DE FRUTA 1.1.- La importancia de las frutas en nuestra dieta Las plantas forman parte de la dieta humana y contienen componentes bioactivos que pueden ejercer efectos fisiolgicos ms all de la nutricin, promoviendo la salud humana y siendo beneficiosos. A pesar de que las frutas y hortalizas frescas han formado parte de la dieta humana desde siempre, su importancia nutricional ha sido demostrada recientemente. Estudios epidemiolgicos demuestran que el consumo regular de frutas y vegetales est asociado con la disminucin del riesgo de padecer enfermedades crnicas como el cncer, problemas cardiovasculares, Alzheimer, derrame cerebral, cataratas o el empeoramiento funcional asociado a la edad, as como tambin ayudan al control de un peso adecuado (Stintzing y Carle, 2004 y Schieber et al., 2001). Muchas de estas enfermedades se han atribuido al consumo de dietas inadecuadas, debido al moderno estilo de vida urbana. La imagen pblica de las frutas y las hortalizas ha mejorado considerablemente debido a los avances de la Nutricin, y los profesionales de la salud, especialmente en los pases desarrollados, recomiendan aumentar el consumo de frutas y hortalizas por ser pobres en grasas y ricas en fibras diettica y disminuir el consumo de los alimentos de origen animal. As mismo, la fundacin mundial de investigacin contra el cncer promueve durante todo el ao el consumo de una variedad de verduras y frutas, la ingestin de un mximo de cinco o ms porciones de fruta y verduras al da. Los zumos de fruta pueden ayudar a los consumidores a alcanzar este objetivo. En el estudio llevado a cabo sobre la dieta europea a peticin de la Comisin Europea y que sirvi de base para el desarrollo de las directrices de la UE para las dietas saludables y estilos de vida, se hizo la siguiente recomendacin: ... El consumo de frutas y verduras en una poblacin debe ser de un mnimo de 400g/da. Dentro de Las frutas y hortalizas quedan excluidas las patatas y las races de almidn, pero se incluye los zumos de frutas (Fuente: Nutricin y Salud Pblica , Informes y Memorias EURODIET, Volumen 4, 2001)..
Figura 1.1: Variedad de frutas en la dieta
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1.2.- Beneficios de los zumos de frutas rojas para la salud Los zumos se pueden considerar como una forma del aporte diario de frutas y hortalizas, dentro de las campaas de cinco vegetales al da en la mayora de los pases europeos: Francia, Reino Unido, Alemania, Suecia, Austria, Finlandia, Blgica, Polonia, Noruega, Irlanda, Dinamarca, Italia y Espaa. Una estrategia nutricional surgida hace pocos aos es la denominada zumoterapia. Bsicamente se trata de consumir las frutas en forma de zumo y no crudas buscando la mxima asimilacin o disponibilidad de la gran cantidad de vitaminas y minerales que aportan las frutas y verduras. Los componentes que aporta el consumo de frutas en general y que son beneficiosos para la salud de los consumidores, se pueden clasificar en: Agua: en general todas las frutas tienen un alto porcentaje de agua, por ejemplo la grosella negra contiene un 90% de agua. Vitaminas: las frutas son ricas en vitaminas, la fresa es una buena fuente de vitamina C cuya accin es actuar como antioxidante, la uva tinta destaca por la presencia de cido flico y vitamina B6 Sales minerales: la frambuesa destaca por su riqueza en potasio, magnesio y calcio. Hidratos de carbono: la cereza destaca por su alto contenido en fructosa. Fibra: el arndano aporta mucha fibra que mejora el trnsito intestinal. cidos orgnicos: por ejemplo en la fresa destaca la presencia de cido ctrico (accin desinfectante), mlico, oxlico y saliclico (accin anticoagulante y antiinflamatoria).
Figura 1.2: Ejemplos de zumos de frutas rojas.
Adems de todos estos componentes principales de las frutas en general, en las frutas rojas cabe destacar la presencia de polifenoles como los antocianos que contienen efectos beneficiosos por sus propiedades. Segn la Asociacin de la Industria de Zumos y Nctares de Frutas y Vegetales de la Unin Europea, los jugos envasados son una fuente importante de vitaminas y minerales de la dieta total. Un estudio europeo resalt el hecho de que el 100% jugos de frutas y verduras ayuda a reducir los factores de riesgo relacionados con ciertas enfermedades. La AIJN atribuye numerosos beneficios para la salud a los polifenoles presentes en las verduras y sobre todo en las frutas rojas. En principio, los polifenoles se absorben rpidamente tanto en el estmago como en el intestino delgado y son metabolizados en el organismo, conservando sus propiedades antioxidantes. JacintaColladoGonzlez Pgina6
Los polifenoles son un grupo heterogneo de molculas que comparten la caracterstica de poseer en su estructura varios grupos fenlicos. Se pueden clasificar en grupos como los cidos fenlicos (benzicos y cinmicos), flavonoides (antocianinas, flavonoides, flavonoles, flavonas, flavanonas, isoflavonas), estilbenos y lignanos. El inters en los compuestos fenlicos de los alimentos ha aumentado de forma importante debido a su alta capacidad antioxidante y su positivo efecto en la salud humana. De hecho, algunos estudios han demostrado que muchos flavonoles y cidos fenlicos son antioxidantes considerablemente ms potentes que la vitamina C y la vitamina E (Vinson et al ,2001). Por estudios realizados se ha demostrado que hay una correlacin entre el contenido total de cidos fenlicos y flavonoides y la actividad antioxidante de un alimento (Middleton et al., 2002; Ehlenfeldt y Prior, 2001; Manach et al., 2004). Segn un informe del instituto Pasteur para la AIJN (Lecerf, J.M.; 2006) y un artculo De Pascual-Teresa y Snchez-Ballesta, 2008, algunas de las propiedades beneficiosas de los zumos para la salud humana son las siguientes: Propiedades cardiovasculares: La comunidad cientfica ha demostrado que la ingesta de una alta cantidad de polifenoles tienen un efecto tnico sobre el corazn, potencindolo mejorando la circulacin sangunea e impidiendo la formacin de trombos en los vasos sanguneos. Estas propiedades se le atribuyen fundamentalmente al flavonoide quercetina. Propiedades anticancergenas: Numerosos estudios han demostrado que muchos polifenoles, especialmente flavonoides, inhiben la iniciacin, promocin y progresin de clulas cancerosas y por consiguiente de tumores. Propiedades para reducir el colesterol: La comunidad cientfica demuestra que la ingesta de zumo de uva tinta concentrado aumenta la capacidad antioxidante y protege de la oxidacin del colesterol LDL produciendo beneficios. Propiedades antioxidantes: en las plantas los polifenoles pertenecientes al grupo de los flavonoides actan como antioxidantes. La actividad antioxidante de los polifenoles se debe a su facilidad para reducir la produccin de radicales libres, bien por inhibicin de las enzimas que intervienen, bien por quelacin con los metales de transicin responsables de la generacin de los radicales libres. Propiedades antiinflamatorias y analgsicas: Polifenoles como la hesperidina, presente en la naranja, se emplean en el tratamiento de ciertas enfermedades como la artritis. Los taninos, son otro grupo de de polifenoles que tienen propiedades astringentes, vasoconstrictoras y antiinflamatorias, pudindose utilizar en el tratamiento de las hemorroides. Propiedades beneficiosas para la diabetes: Los antocianos presentan efectos muy beneficiosos ante la diabetes. Por un lado intervienen en la absorcin de la glucosa, y por otro ejercen proteccin a las clulas pancreticas. Estudios demuestran que los antocianos pueden estimular la secrecin de insulina, siendo la pelargonidina el ms potente estimulante (De Pascual-Teresa y Snchez-Ballesta, 2008).
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Propiedades gstricas: Esta propiedad est relacionada con las propiedades

antiinflamatorias, puesto que el grupo de los flavonoides tiene la capacidad de prevenir procesos de inflamacin gstrica. Ciertos flavonoides, como la quercetina, la rutina y el kaempferol, tienen propiedades antiulcricas al proteger la mucosa gstrica. Tambin se puede citar el caso de la cianidina (una antocianidina) que protege los daos gstricos de la mucosa causados por la ingesta de aspirina Propiedades oculares: Se ha observado que el consumo de la grosella tiene un efecto positivo sobre la visin nocturna facilitando la adaptacin a la oscuridad. Tambin se ha demostrado que en el caso de pacientes con miopa, los antocinanos disminuyen los sntomas (Lee, 2005). Previenen la fragilidad del sistema vascular capital y venoso: Los polifenoles aumentan la resistencia y disminuyen la fragilidad capilar favoreciendo que estos vasos se rompan evitando de este modo el sangrado. Los polifenoles con mejores resultados ante el sistema vascular y venoso son los flavonoides como la rutina y la hesperidina (presentes en los ctricos) y la quercetina presente en muchas frutas. Propiedades antimicrobianas: La comunidad cientfica ha demostrado que polifenoles del tipo de los isoflavonoides, furanocumarinas y estilbenos tienen propiedades antibacterianas, antivirales y antifngicas. Propiedades de retrasar enfermedades neurodegenerativas: Mediante un estudio se ha comprobado que el consumo de frutas y jugos de verduras, que contienen una alta concentracin de polifenoles, disminuye el riesgo de incidencia de enfermedad de Alzheimer. Los zumos de frutas y hortalizas pueden desempear un papel importante en el retraso de la aparicin de la enfermedad de Alzheimer. Remedio tradicional ante las infecciones urinarias: Mediante estudios aleatorios clnicos se ha demostrado que hay una disminucin de la frecuencia de las infecciones urinarias en mujeres que consumen de zumo de arndano. Estudios sobre los mecanismos disponibles muestran que estos efectos beneficiosos son debidos a la inhibicin de la adhesin de la E. coli a la mucosa urinaria. Esto parece estar asociado a la presencia de proantocianidinas en el zumo de arndano.
De todos los zumos que hoy en da se encuentran en el mercado caben destacar los zumos de frutas rojas debido a sus beneficios para la salud. Entre las frutas rojas conocidas se puede citar: mirtilo, arndano, grosella, uva tinta, cereza, fresa, frambuesa, ciruela, higo chumbo, baya de sauco, granada,etc. Cada tipo de fruta roja presenta diferentes compuestos responsables de su coloracin. El color rojo de estas frutas no slo depende del tipo de fruta que sea sino tambin de la variedad de la fruta, por ejemplo el arndano europeo y el americano tienen distinta composicin. Depende tambin del grado de maduracin de los rganos vegetales, de una alteracin en la fruta debida a algn microorganismo, del modo de procesar la fruta, de las condiciones de almacenamiento, etc. Los compuestos rojos solubles en agua pueden clasificarse en dos grandes grupos: las antocianinas y las betacianinas.
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El inters general que la industria alimentaria muestra por estos zumos se centra en los que contienen antocianinas. Como fuente mayoritaria de este tipo de compuestos se puede citar algunos frutos rojos como el mirtilo, la cereza, la grosella y la uva tinta. As, 100gramos de estas frutas pueden aportar hasta 500 miligramos de antocianinas. En estudios recientes se pone de manifiesto que las antocianinas son glucsidos producidos naturalmente durante el metabolismo de las plantas y se encuentran asociados a molculas de azcares como glucosa, ramnosa, galactosa, arabinosa o xilosa. En estos estudios se muestra que estas antocianinas estn implicadas en muchas actividades biolgicas que pueden reducir el riesgo de enfermedad coronaria, inhibir la agregacin plaquetaria, reducir el riesgo de infarto y la insuficiencia vascular (Burns et al., 2000). Adems, los extractos de antocianinas provenientes de varios tipos de frutas rojas pueden ejercer actividades anticancergenas, antiinflamatorias, antimicrobianas, incluso pueden mostrar efectos neuroprotectores. Otros efectos beneficiosos son la mejora de visin y prevencin de la diabetes y que inducen la apoptosis (Katsube et al.,2003). Con respecto a las betacianinas, tambin se han realizados estudios que demuestran su efecto antiviral y antimicrobiano (Strack et al.,2003). Adems, se ha demostrado la actividad antioxidante de las betalanas y su papel en la quimioprevencin de cnceres de pulmn y de piel, inhibiendo la proliferacin de clulas tumorales humanas(Muntha et al.,2005 y Sreekanth et al.,2007). Como fuentes importantes de batalanas estn el higo chumbo o tambin la remolacha.
2.- LOS ZUMOS DE FRUTAS 2.1.- Definicin y tipos La Comisin del Codex Alimentarius fue creada en 1963 por la FAO y la OMS para facilitar el comercio internacional de alimentos y garantizar a los consumidores su calidad, seguridad e inocuidad. El cdigo ampliamente aceptado y adoptado se ocupa de la proteccin del consumidor as como de la produccin y comercio de los alimentos a escala mundial, regional, nacional y local. Uno de sus conceptos bsicos es un alimento no es nutritivo si no es inocuo. Las ventajas de su aplicacin son: Los beneficios de su aplicacin son los siguientes: a) Ayuda a que se cumpla el derecho fundamental a tener acceso a alimentos que sean de buena calidad, inocuos y nutritivos b) Elimina barreras no arancelarias y artificiales al comercio, lo que permite el acceso a los mercados a quienes producen, elaboran y comercializan alimentos c) Protege la salud de los consumidores. d) Hace que las reglas sean claras para todos, con lo que: d.1) Facilita la comercializacin de los alimentos d.2) Establece prcticas equitativas en el comercio de los alimentos. d.3) Permite la normalizacin de conceptos y puntos de calidad. JacintaColladoGonzlez Pgina9
Dentro de este codex alimentarius se encuentra el CODEX STAN 247-2005, que es un cdigo especfico para zumos. Conforme a las disposiciones pertinentes de la comisin del codex alimentarius, este cdigo define como zumo (jugo) de fruta el lquido sin fermentar, pero fermentable, que se obtiene de la parte comestible de frutas en buen estado, debidamente maduras y frescas o frutas que se han mantenido en buen estado por procedimientos adecuados, inclusive por tratamientos de superficie aplicados despus de la cosecha. La legislacin de zumos vigente en Espaa est regulada por: Real Decreto 462/2011, de 1 de abril, por el que se modifica el Real Decreto 1050/2003, de 1 de agosto, por el que se aprueba la Reglamentacin tcnicosanitaria de zumos de frutas y de otros productos similares, destinados a la alimentacin humana. Real Decreto 1050/2003, de 1 de Agosto, por el que se aprueba la Reglamentacin Tcnico Sanitaria de zumos de frutas y de otros productos similares destinados a la alimentacin humana (B.O.E. 02.08.2003) REAL DECRETO 1518/2007, de 16 de noviembre, por el que se establecen parmetros mnimos de calidad en zumos de frutas y los mtodos de anlisis aplicables. El Real Decreto 1050/2003, define un zumo de frutas como el producto susceptible de fermentacin, pero no fermentado, obtenido a partir de frutas sanas y maduras, frescas o conservadas por el fro, de una o varias especies, que posea el color, el aroma y el sabor caractersticos de los zumos de la fruta de la que procede. Se podr reincorporar al zumo el aroma, la pulpa y las celdillas que haya perdido con la extraccin. El Real Decreto 1518/2007 establece determinados parmetros analticos de autenticidad y calidad, que permitan evaluar la composicin de los zumos de frutas, a fin de asegurar el control de su calidad comercial y evitar el fraude al consumidor y la competencia desleal. El Real Decreto 462/2011 establece que: El producto obtenido deber presentar caractersticas organolpticas y analticas por lo menos equivalentes a las del tipo medio de zumo obtenido, conforme a las disposiciones del reglamento, de frutas de la misma especie. La elaboracin de los zumos podr realizarse junto con sus pepitas, semillas y pieles, que normalmente no se incorporan al zumo, aunque sern aceptables algunas partes o componentes de pepitas, semillas y pieles que no puedan ser eliminadas mediante las (BPF) buenas prcticas de fabricacin. Los zumos se preparan mediante procedimientos adecuados que mantienen las caractersticas fsicas, qumicas, organolpticas y nutricionales esenciales de los zumos de la fruta de la que proceden. Podrn ser turbios o claros y podrn contener componentes restablecidos de sustancias aromticas y aromatizantes voltiles, elementos todos ellos que debern obtenerse por procedimientos fsicos adecuados y proceder del mismo tipo de fruta. Podrn aadirse pulpa y clulas obtenidas por procedimientos fsicos adecuados del mismo tipo de fruta (CODEX STAN 247-2005).
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Figura 1.3: distintos tipos de zumos de frutas
Segn el Cdigo alimentario de Zumos (CODEX STAN 247-2005) y el RD 1050/2003, los tipos de zumos que podemos encontrar en el mercado son: Zumo de fruta: lquido sin fermentar, pero fermentable, que se obtiene de la parte comestible de frutas en buen estado, debidamente maduras y frescas o frutas que se han mantenido en buen estado por procedimientos adecuados. Zumo concentrado de fruta: producto obtenido a partir de zumo de frutas de una o varias especies, por eliminacin fsica de una parte determinada del agua. Cuando el producto est destinado al consumo directo, dicha eliminacin ser de al menos un 50%. Zumo de fruta a base de concentrado: producto obtenido mediante la incorporacin al zumo de frutas concentrado de la calidad de agua extrada al zumo en el proceso de concentracin y la restitucin de los aromas, y en su caso, la pulpa y las clulas perdidas del zumo, pero recuperados en el proceso de produccin del zumo de frutas que se trate o de zumo de frutas de la misma especie. El agua aadida deber presentar las caractersticas adecuadas, especialmente desde el punto de vista qumico, microbiolgico y organolptico, con el fin de garantizar las propiedades esenciales del zumo. Zumo de fruta deshidratado o en polvo: producto obtenido a partir de frutas de, una o varias especies, por eliminacin fsica de la totalidad del agua. Nctar de fruta: producto susceptible de fermentacin, pero no fermentado, obtenido por adicin de agua y de azcares y/o miel a los productos de zumo definidos anteriormente y al pur de frutas o a una mezcla de estos productos. La adicin de azcares y/o miel se autoriza en una cantidad no superior al 20% del peso total del producto acabado. Pur de frutas utilizado en la elaboracin de zumos y nctares de frutas: producto sin fermentar, pero fermentable, obtenido mediante procedimientos como el tamizado, triturado o desmenuzado de la parte comestible de la fruta entera o pelada sin eliminar el zumo. Podr contener componentes restablecidos, de sustancias aromticas y aromatizantes voltiles; y podrn aadirse pulpa y clulas obtenidas por procedimientos fsicos adecuados del mismo tipo de fruta. Pur concentrado de fruta utilizado en la elaboracin de zumos y nctares de frutas: producto obtenido mediante la eliminacin fsica de agua del pur de fruta en una cantidad suficiente para elevar el nivel de grados Brix en un 50% ms que el valor Brix establecido para el zumo reconstitudo de la misma fruta. Podr contener componentes restablecidos, de sustancias aromticas y aromatizantes voltiles, elementos todos ellos que debern obtenerse por procedimientos fsicos adecuados y proceder del mismo tipo de fruta. JacintaColladoGonzlez Pgina11
2.2.- La calidad y la autenticidad de los zumos de frutas rojas El cdigo alimentario de zumos (CODEX STAN 247-2005), presenta los factores esenciales de composicin, calidad y autenticidad de los zumos y nctares de frutas, indicando para cada caso los mtodos de anlisis que se deben seguir para la verificacin de dichos factores. En este cdigo, la autenticidad se define como el mantenimiento de las caractersticas fsicas del producto, qumicas, organolpticas y las caractersticas nutricionales de la(s) fruta(s) de la(s) que procede(n). Como criterio de calidad se establece que los zumos y nctares de frutas debern tener el color, aroma y sabor caracterstico del zumo del mismo tipo de fruta del que proceden. El RD 1518/2007, de 16 de noviembre, establece los parmetros mnimos de calidad y autenticidad en zumos y los mtodos de anlisis aplicables a cada tipo de fruta. Este Real Decreto pone de manifiesto los parmetros para los tipos de frutas siguientes: naranja, pia, mandarina, albaricoque, pera, manzana y melocotn. As mismo, se indican los mtodos aplicables a cada fruta. El cumplimiento de estos parmetros mnimos, no implica que no tengan que ajustarse tambin a otros que afecten a su autenticidad y calidad, y especialmente los recogidos en la Norma del Codex Alimentarius y en el Cdigo de Prcticas para evaluacin de zumos de frutas y vegetales de la Asociacin de la Industria de Zumos y Nctares de Frutas y Vegetales de la Unin Europea (AIJN). Esta asociacin presenta una gua de referencia para cada tipo de fruta como criterio de evaluacin de calidad y autenticidad de los zumos de las diferentes frutas. A modo general en todos los zumos, los parmetros: grados brix, maltosa e isomaltosa, deben considerarse como parmetros absolutos de autenticidad y calidad para los que no deben admitirse tolerancias. Especficamente en el caso de los zumos de frutas rojas, el parmetro de perfil de antocianos se considera un parmetro crtico para evaluar la calidad y la autenticidad de los zumos. Para este caso, el mtodo empleado es una modificacin del Mtodo IFU n 71 de 1998. El color es uno de los factores crticos dentro de las propiedades organolpticas que influyen en la aceptacin de los alimentos, en este caso el zumo, por el consumidor. Por ello, a veces se influyen subjetivamente otras propiedades como son el olor y/o el sabor. Pero hay que decir que estas modificaciones hechas de forma fraudulenta con el fin de enmascarar la menor calidad o el deterioro del zumo no estn permitidas. Un ejemplo de esto sera un zumo de arndano grosella y baya de saco al cual sin mencionarlo en la etiqueta se le ha aadido cereza, frambuesa, fresa, uva tinta, etc. El anlisis de los antocianos es til no slo para descubrir adulteraciones, sino tambin aquellos errores que hayan tenido lugar en el procesado y de los que no se sea consciente de ellos, como por ejemplo, fallos en la clasificacin de la frutas, (mezcla de cereza dulce y amarga).
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2.2.1.- Perfil de los polifenoles Los polifenoles son producto del metabolismo secundario de las plantas. Qumicamente son compuestos que tienen al menos un anillo aromtico al que estn unidos uno o ms grupos hidroxilo. Los compuestos fenlicos se encuentran en una gran variedad de plantas comestibles, frutos, hortalizas, bebidas como t, caf, cerveza y vino tinto, en el aceite de oliva, en cereales y en algunas semillas como las de leguminosas. Los frutos contienen concentraciones relativamente altas de derivados de quercetina, kaempferol, hesperetina, etc. y cidos fenlicos entre ellos los derivados cinmicos. Hortalizas como el tomate, cebolla, ajos, pimientos, etc. contienen sobre todo altas concentraciones de derivados de quercetina y de miricetina. El aporte de polifenoles en la dieta puede estar entre 50 y 800 mg/da, dependiendo del consumo de productos que lo contienen. Un nivel importante de antioxidantes, se alcanza cuando el consumo es de unos 800 mg/da, que puede lograrse con una dieta rica en frutas y hortalizas. Existe una gran variedad de compuestos fenlicos, que se pueden clasificar en diferentes grupos atendiendo al nmero de anillos fenlicos que contienen. POLIFENOLES
CIDOS
FENLICOS
FLAVONOIDES
ESTILBENOS
LIGNANOS
cidos hidroxibenzicos
Flavonas
cidos hidroxicinmicos
Flavanonas
Isoflavonas
Flavonoles
Flavanoles
Antocianinas
Figura 1.4: Esquema de los polifenoles
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A continuacin se explican los distintos polifenoles: 2.2.1.1.- cidos fenlicos: cidos hidroxibenzicos Los cidos hidroxibenzicos tienen una estructura bsica C6-C1, se encuentran libres y ligados como los steres de cido benzoico en muchas especies vegetales y animales. Los principales son los cidos glico, p-hidroxibenzoico, protocateclico, vanllico y sirngico. Su contenido en plantas comestibles por lo general es bajo salvo en ciertas frutas rojas, las cebollas o el rbano negro (Manach et al., 2004). Qumicamente se trata de derivados del cido hidroxibenzico cuya estructura est formada por un anillo aromtico unido a un carbono a partir de fenilpropanoides a los que se les deleccionan dos carbonos de la cadena propnica. Los cidos hidroxibenzicos son componentes de estructuras complejas como los taninos hidrolizables (gallotaninos en mangos y elagitaninas en frutas rojas como las granadas, fresas y moras). En la tabla 1.1 se muestran los cidos hidroxibenzicos estudiados en este proyecto.
Tabla 1.1: Estructura de los cidos hidroxibenzicos
cido 4- hidroxibenzico
cido 3,4dihidroxibenzico
cido glico C7H6O5
C7H6O3
C7H6O4
cido vanllico C8H8O4
cido elgico C14H6O8
cido sirngico C9H10O5
cidos hidroxicinmicos Los cidos hidroxicinmicos son un grupo de compuestos presentes en la pared celular vegetal, cuyos principales representantes son el clorognico, cido ferlico, p-cumrico, cafeico y sinpico, de los cuales el cido ferlico y p-cumrico son los de mayor abundancia en la naturaleza. Qumicamente su esqueleto est formado por un anillo aromtico, un grupo aliftico y un cido carboxlico en el extremo. Son denominados cidos hidroxicinmicos por la sustitucin del grupo -OH en el anillo aromtico. Por lo general, este tipo de compuestos se encuentran esterificados en la pared celular vegetal, por lo tanto, poseen una baja solubilidad. Destacan por ser unos buenos agentes antioxidantes.
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La estructura de los cidos cinmicos ms representativos de este grupo se muestran en la figura 1.5 y en la tabla1.2 quedan recogidos los cidos hidroxicinmicos estudiados en este proyecto.
Figura 1.5: Imagen de las estructuras de los cidos cinmicos ms representativos.
Tabla 1.2: Estructura de los cidos hidroxicinmicos
cido cinmico C9H8O2
cido cafico C9H8O4
cido ferlico C10H10O4
cido p-cumrico C9H8O3
cido sinpico C11H12O5
cido clorognico C16H18O9
2.2.1.2.- Flavonoides Los flavonoides son un gran grupo de sustancias vegetales que fueron descubiertas por el premio Nobel en Bioqumica Dr. Albert Szent-Gyorgi, quien les denomin como vitamina P. El Dr. Szent-Gyorgi descubri que los flavonoides favorecen la funcin de la vitamina C, mejorando su absorcin y protegindola de la oxidacin. Los flavonoides comprenden varias clases de sustancias naturales, entre las cuales estn muchas de las que les confieren colores amarillo, naranja, rojo, violeta y azul, a muchas flores, hojas y frutos, especialmente. Los flavonoides son un grupo de molculas que son producidas por el metabolismo secundario que, al igual que otros principios activos vegetales, se originan mediante una ruta biosinttica mixta (en el caso de los flavonoides, a travs de la ruta del cido shikmico y la ruta de la malonilcoenzima A) (Martnez M(2005)). Son los antioxidantes ms potentes presentes en los alimentos vegetales. En la tabla 1.3 se exponen las estructuras generales de los flavonoides. Son compuestos fenlicos diaril-propnicos, es decir, su estructura es del tipo C6-C3C6, con dos anillos aromticos (bencnicos) unidos entre s por una cadena de 3 tomos de carbono que forman un anillo heterocclico oxigenado.
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Los flavonoides se encuentran a menudo hidroxilados en las posiciones 3, 5, 7, 3, 4 y 5. La principal clasificacin de los flavonoides se consigue atendiendo a la presencia o ausencia de un grupo hidroxilo unido a la posicin 3: 1.- Los flavonoides 3-hidroxiflavonoides (flavanoles, flavonoles, flavanonoles, flavan3,4-dioles o leucoantocianidinas, antocianidinas, proantocianidinas o taninos condensados). 2.- Los flavonoides no hidroxilados en la posicin 3 (flavonas, isoflavonas, flavanonas). (Garca-Alonso, 2005).
Tabla 1.3: Estructuras generales de los flavonoiddes
Flavanoles
Flavonoles
Antocianinas
Flavonas
Isoflavonas
Flavanonas
Por lo general, dentro de las plantas los estudios han mostrado que los flavonoides se encuentran la mayora de las veces, ligados a molculas de carbohidratos. A este tipo de combinacin ncleo flavonoide bsico ms una o varias unidades de carbohidratos, se les denomina GLICSIDOS, y cuando no tienen ligadas molculas de carbohidratos se las denomina AGLICONAS FLAVONOIDES.
Flavanoles
Los flavanoles predominantes son la catequina y su ismero epicatequina, la galocatequina y su ismero epigalocatequina. Los flavanoles glicosilados son poco frecuentes. En la tabla 1.4 se presentan las estructuras de los flavanoles estudiados en este proyecto.
Tabla 1.4: estructura de los flavanoles
Catequina C15H14O6
Epicatequina C15H14O6
Galocatequina C15H14O7
Epigalocatequina C15H14O7
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Flavonoles Los flavonoles se caracterizan por la presencia de un doble enlace en C2 y de un grupo hidroxilo en C3 en el heterociclo. Se conocen 450 tipos de agliconas y 900 tipos de glucsidos aproximadamente (Iwashina 2000), de los cuales la gran mayora se presentan como O-glucsidos unidos en las posiciones 3 y/o 7. En la tabla1.5 se muestran ejemplos importantes de agliconas: el quercetina, kaempferol, Miricetina e isorhamnetina.
Tabla 1.5: Estructura de ejemplos de los cidos flavonoles
Quercetina C15H10O7
Kaempferol C15H10O6
Miricetina C15H10O8
Isorhamnetina C16H12O7
Antocianinas Qumicamente las antocianinas son glicsidos de las antocianidinas, es decir, estn constituidas por una molcula de antocianidina, que es la aglicona, a la que se le une un azcar por medio de un enlace glucosdico. La estructura qumica bsica de estas agliconas es el ion flavilio, tambin llamado 2-fenil-benzopirilio que consta de dos grupos aromticos: un benzopirilio y un anillo fenlico; el flavilio normalmente funciona como un catin. Las agliconas libres raramente existen en los alimentos, excepto posiblemente como componentes traza de las reacciones de degradacin. De todas las antocianidinas que actualmente se conocen (aproximadamente 20), las ms importantes son la pelargonidina, la delfinidina, la cianidina, la petunidina, la peonidina y la malvidina, nombres que derivan de la fuente vegetal de donde se aislaron por primera vez; la combinacin de stas con los diferentes azcares genera aproximadamente 150 antocianinas. Los hidratos de carbono que comnmente se encuentran son la glucosa y la ramnosa, seguidos de la galactosa, la xilosa y la arabinosa y, ocasionalmente, la gentiobiosa, la rutinosa y la soforosa. Habitualmente unidos en las posiciones 3 y tambien 5, formando 3-O-glucsidos y 3,5-di-Oglucsidos. Las estructuras de las antocianidinas estudiadas son expuestas en la figura 1.11. Las antocianidinas se caracterizan por la presencia de dos dobles enlaces, uno en la posicin 1 y otro en el C3 y de un grupo hidroxilo en C3 en el heterociclo. Las estructuras de las antocianidinas ms importantes quedan plasmadas en la tabla 1.6.
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Tabla 1.6: Estructura de las antocianidinas
Pelargonidina [C15H11O5+]
Delfinidina [C15H11O7+]
Cianidina [C15H11O6+]
Petunidina [C16H13O7+]
Peonidina [C16H13O6+]
Malvidina
[C17H15O7+]
Flavonas Las flavonas son amarillas y pueden estar en algunas flores, como en la prmula, dndoles un color amarillo a sus ptalos, o en frutos, como en la piel de las uvas, son las responsables del color amarillento de los vinos blancos. Se caracterizan porque tienen un doble enlace en el heterociclo en la posicin 2 -3 y el carbono 4 es un grupo carbonilo. El grupo hidroxilo del C3 de los grupos anteriores no se presenta en estas molculas. Hay tres flavonas importantes: la tricetina, presente en el polen de algunas plantas, la apigenina, presente en muchas plantas como la camomila, (Matricaria recutita) o el espino blanco (Crataegus laevigata), da un color marrn marfileo a las flores si se presenta sola; y la luteolina, de color amarillo, que incluso sirve para teir lana y otros tejidos. En la tabla 1.7 se muestran las estructuras de estas tres flavonas.
Tabla 1.7: Estructuras de tres flavonas importantes
Apigenina C15H10O5
Luteolina C15H10O6
Tricetina C15H10O7
Isoflavonas Las isoflavonas son sustancias diferentes a los esteroides endgenos humanos con capacidad de unirse a los receptores estrognicos. Las ms importantes son la genistena y la daidzena, sus estructuras se pueden ver en la tabla 1.8. JacintaColladoGonzlez Pgina18
Las flavonas presentan un anillo fenlico en la posicin 2 mientras que las isoflavonas lo tienen sustitudo en la posicin 3. La doble actividad de las isoflavonas (actuando a la vez como estrognicas y antiestrognicas), le confieren una serie de cualidades que permiten regular el balance hormonal en la mujer, pudiendo prevenir la osteoporosis y actuar como potentes antioxidantes que protegen frente al desarrollo de cncer de mama y reducir los efectos de la menopausia. Las Isoflavonas causan esto al competir con el propio estrgeno del cuerpo por los mismos sitios receptores en las clulas. Algunas de las enfermedades por estrgeno excesivo pueden disminuirse de esta manera. La mejor manera de consumir las isoflavonas es en la forma de soja (www.isoflavones.info)
Tabla 1.8: Estructura de dos isoflavonas importantes
Genistena C15H10O5
Daidzena C15H10O4
Flavanonas Se diferencian de las flavonas en que la insaturacin del heterociclo no est presente. Se encuentran en los ctricos y son las responsables en muchos casos de su sabor amargo. Las ms importantes son: La hesperitina, la naringenina y sus glicosilados correspondientes. Otra flavonona muy frecuente es la taxifolina. Las estructuras de todos ellos se pueden ver en la tabla 1.9.
Tabla 1.9: Estructura de las flavanonas
Hesperitina C16H14O6
Taxifolina C15H12O7
Naringenina C15H12O5
Hesperidina C28H34O15
Naringina C27H32O14
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En la tabla 1.10 se exponen ejemplos de presencia de algunos flavonoides en los alimentos:

Tabla 1.10: Ejemplos de flavonoides en la alimentacin Clase Chalcona Flavona Flavonona Nombre Butena Ocanina Chrisina Apigenina Naringina Naringenina Taxifolin Kaempferol Flavonol Quercetina Engeletin Flavononol Astilbin Genistina Taxifolin Genistena Daidzin Daidzena (+)Catequina (+)Gallocatequina ()Epicatequina Epigenidin Cianidina Delfinidina Pelargonidina 3,5,7,4OH;3Orhamnosa 3,5,7,5,4OH;3O rhamnosa 5,4OH;7glucosa 3,5,7,3,4OH 5,7,4OH 4OH;7glucosa 4,7OH; 3,5,7,3,4OH 3,5,7,3,4,5OH 3,5,7,5,4OH 5,7,4OH 3,5,7,4,OH;3,5OMe 3,5,7,3,4,5OH 3,5,7,4,OH Sustituyentes 2,4,3`,4OH 2,3,4,3`,4OH 5,7OH 5,7,4OH 5,4OH;7rhamnoglucosa 5,7,4OH 3,5,7,3,4OH 3,5,7,4OH 3,5,7,3,4OH Fuente en la dieta Varios Varios Pieldelasfrutas Perejil,apio Ctricos,pomelo Ctricos Ctricos Puerro,brcoli,endibias, pomelo,tnegro Cebolla,lechuga,brcoli, tomate,t,bayas,manzanas, aceitedeoliva. Pieldeuvablanca Pieldeuvablanca Habadesoja Frutas Habadesoja Habadesoja Habadesoja T T T Frutaalmacenada Cereza,fresa,frambuesa. Frutasrojas Frutasrojas
Isoflavona
Flavanol
Antocianidinas
2.2.1.3.- Estilbenos Los estilbenos poseen una estrutura bsica formada por 14 carbonos (C6-C2-C6) y su distribucin en los alimentos vegetales no es muy amplia (Garca-Alonso, 2005). Los estilbenos con mayor inters nutricional son el resveratrol (3, 5, 4trihidroxiestilbeno) y el piceido (resveratrol-3-O--D-glucsido), presentes en uvas y vinos. Estos compuestos quedan expuestos en la tabla 1.11. Este grupo ofrece una actividad antioxidante, anticancergena, cardioprotectora, neuroprotectora y antiinflamatoria (Stervbo et al., 2007). Estudios recientes en ratones han demostrado que ratones obesos cuya dieta estaba suplementada con resveratrol no solo son ms longevos, sino adems ms activos, presentado en menor medida los efectos negativos de una dieta hipercalrica (Baur et al., 2006). El resveratrol es el estilbeno ms ampliamente distribuido en el Reino Vegetal, aunque sus fuentes en la dieta son escasas. Se encuentran nicamente en cacahuetes, algunas bayas y en uva (piel y semillas), as como en sus derivados (zumo y vino), en cantidades muy pequeas (Burns et al., 2002). Sin embargo la concentracin de estos compuestos se puede incrementar debido a que son fitoalexinas y, por tanto, inducibles por distintos tipos de estrs entre los que destaca el producido por la luz ultravioleta (Cantos et al., 2001). La luz ultravioleta produce un dao en las uvas que hace que stas respondan al estrs sintetizando estos compuestos.
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Actualmente, investigadores del CEBAS-CSIC (Centro de Edafologa y Biologa Aplicada del Segura) han descubierto una tcnica que permite frenar el envejecimiento celular potenciando los efectos beneficiosos del resveratrol. En concreto, han logrado concentrar en una cpsula los beneficios aportados por 45 botellas de vino. (www.aesan.es).
Tabla 1.11: Estructura de losestilbenos
Resveratrol C14H12O3
Piceido C20H22O8
2.2.1.4.- Lignanos Los lignanos nombrados por primera vez por Harworth en 1941, son metabolitos secundarios de las plantas encontrados en una gran variedad de plantas que incluyen las semillas de lino (contiene ms de 100 veces la cantidad encontrada en otros alimentos), semillas de calabaza, semillas de ajonjol, centeno, y en algunas bayas. Aunque estn ampliamente distribuidos sus cantidades son muy reducidas, del orden de g por cada gramo de producto seco. Su estructura bsica consta de dos unidades C6-C3 unidas por enlaces , utilizadas para la nomenclatura de los lignanos. Son considerados fitoestrgenos, al igual que ocurre con las isoflavonas, que son qumicos de las plantas que mimetizan la hormona estrgeno. Las bacterias en nuestros intestinos convierten a otros lignanos en dos: enterolactona y enterodiol, los cuales tambin tienen efectos parecidos al estrgeno. Los lignanos estn siendo estudiados para su posible uso en la prevencin del cncer, particularmente cncer de mama. Compiten por los mismos puntos de las clulas donde se sujeta el estrgeno. Si hay poco estrgeno en el cuerpo (despus de la menopausia, por ejemplo), los lignanos pueden actuar como estrgeno dbil; pero cuando el estrgeno natural es abundante en el cuerpo, los lignanos pueden en su lugar reducir los efectos del estrgeno al desplazarlos de las clulas. Este desplazamiento de la hormona puede ayudar a prevenir varios tipos de cncer, como puede ser el cncer de mama. Adems, al menos un estudio de laboratorio sugiere que los lignanos pueden ayudar a prevenir el cncer de formas que no estn ligadas al estrgeno. (http://healthlibrary.epnet.com). A los lignanos tambin se les atribuyen otros efectos antioxidantes que ayudan a combatir los efectos de los dainos radicales libres. Algunos ejemplos de lignanos se muestran en la tabla 1.12:
Tabla 1.12: Estructura de algunos lignanos
enterolactona
enterodiol
7-hidroximatairesinol
secoisolariciresinol
C18H18O4
C18H22O4
C20H22O7
C20H26O6
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2.2.1.5.- Perfil de los antocianos En el caso de frutas rojas el perfil de antocianos es un parmetro crtico para la evaluacin de la calidad y autenticidad. El mtodo comnmente empleado es el Mtodo IFU n 71 de 1998, (Federacin Internacional de Productores de Zumos de Frutas) por el cual se determinan las antocianinas mediante cromatografa lquida de alta eficacia (HPLC). Este mtodo tambin permite el anlisis de betacianinas. Para conseguir el color del zumo comercial no se permite la presencia de ingredientes colorantes artificiales o naturales, o de otros zumos concentrados diferentes o extractos vegetales, adicionados de forma fraudulenta para enmascarar un zumo deteriorado o de menor calidad. Ejemplos son las adulteraciones de los zumos de grosella negra y cereza con baya de sauco, extracto de uva tinta o aronia. Otra es la del arndano rojo con extracto de uva tinta; tambin la adicin a la fresa, frambuesa o naranja sanguina, de aronia, baya de sauco, extracto de uva tinta, zarzamora, zanahoria o remolacha, etc. Actualmente hay muchos laboratorios que utilizan estos perfiles de antocianos de frutos rojos para verificar la autenticidad y controlar la calidad de productos alimentarios, tales como siropes, mermeladas, confituras.Tambin se emplean en la industria de zumos de frutas. Debido a este inters por los antocianos, hay un gran nmero de trabajos de investigacin que caracterizan los perfiles de antocianos de muchos frutos, y prcticamente cada grupo investigador ha realizado un mtodo analtico propio por HPLC para realizar estos anlisis. Se suelen utilizar mezclas de acetonitrilo o metanol con agua como fases mviles para conseguir la elucin. El pH se suele mantener a un pH inferior a 2 por adicin de cido. Los antocianos o antocianinas son pigmentos solubles en agua que pertenecen al grupo de los flavonoides, y qumicamente son glicsidos de las antocianidinas, es decir, estn constituidas por una molcula de antocianidina, que es la aglicona, a la que se le une un azcar por medio de un enlace glucosdico. La estructura qumica bsica de estas agliconas es el ion flavilio, tambin llamado 2-fenil-benzopirilio que consta de dos grupos aromticos: un benzopirilio y un anillo fenlico; el flavilio normalmente funciona como un catin. Se trata de los pigmentos naturales responsables de la coloracin que va desde el rojo-prpura al azul. Se encuentran presentes en numerosos alimentos, frutos, flores y verduras. dando lugar a los colores azules, prpuras, rojos y matices intermedios de estas coloraciones de frutas rojas como cerezas, ciruelas, fresas, frambuesas, zarzamoras, uvas y grosellas (Garca-Alonso, 2005). En las plantas se han aislado ms de 400 antocianinas diferentes, siendo los glicosidos ms estables que las agliconas libres (antocianidinas). A continuacin se exponen las 6 agliconas de los antocianos ms importantes y la coloracin que proporciona: Cianidina (E-163a): colorante alimentario rojo Delfinidina (E-163b): colorante alimentario azul-rojo Malvidina (E-163c): colorante alimentario prpura Pelargonidina (E-163d): colorante alimentario anaranjado Peonidina (E-163e): colorante alimentario rojo-marrn Petunidina (E-163f): colorante alimentario rojo oscuro
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El contenido en antocianos totales de algunas frutas se muestra en la tabla 1.13 (Garca-Alonso, 2005).
Tabla 1.13: Contenido de antocianos totales en algunas frutas
Fruta Arndano Cereza Frambuesa negra Frambuesa roja Fresa Grosella roja Uva tinta Zarzamora
Contenido antocianos (mg/kg o mg/L) 600-2000 20-4500 1700-4277 100-600 150-350 1300-1400 3000-7500 1150
Las antocianinas son molculas relativamente inestables y sus colores dependen del pH, temperatura, luz y de la presencia de metales. La acilacin con cidos cinmicos u otros cidos similares confiere una estabilidad adicional a las antocianinas. Se han desarrollado numerosos mtodos para la caracterizacin de antocianinas, si bien el anlisis por HPLC utilizando un detector de fotodiodos, es el mtodo ms extendido. El cromatograma obtenido es caracterstico de cada fruta y se conoce como perfil de antocianos.
2.3.- Comercializacin de los zumos Actualmente existen diversas asociaciones en la industria de los zumos. A nivel nacional, est la asociacin espaola de fabricantes de zumos (ASOZUMOS), se constituy en 1978 y est integrada por la mayor parte de las empresas del sector, con una representatividad sectorial estimada en ms del 80% de la produccin nacional. La pertenencia a ASOZUMOS es una garanta para el consumidor de la absoluta responsabilidad de las empresas adheridas y de su compromiso con la autenticidad de los productos que comercializa. A nivel europeo se encuentra la asociacin de la industria de zumos y nctares de frutas y vegetales de la unin europea (AIJN) y a nivel internacional est la federacin internacional de productores de zumos de frutas (IFU). Considerando los datos de un informe de mercado realizado por Zenithinternational y lanzado el 31 de mayo 2010 por la organizacin AIJN, se puede ver la evolucin de los seis pases ms consumidores de zumos de la Unin Europea. Esto se muestra en la figura 1.6. El volumen total de consumo de zumos y nctares de frutas durante el ao 2009 fue de 11.3 billones de litros.
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Figura1.6: Comparativa entre el 2005 y el 2009 de los 5 pases de la UE que ms han consumido zumo. Obtenido de un informe de FJN
Se constata que Alemania contina siendo el pas en cabeza en la relacin de pases en cuanto al consumo de zumos y nctares de frutas mientras que Espaa sigue ocupando el cuarto puesto, esto se puede ver en la figura 1.7.
Figura 1.7: Comparacin del consumo de zumo y nctar entre los pases de la UE en 2009.
Sin embargo a la hora de comparar todos los pases por el consumo de zumo por persona, la cosa cambia pues Espaa ocupa el dcimo primer puesto, tal y como se puede observar en la figura 1.8.
Figura 1.8: Comparacin del consumo de zumo por persona en los distintos pases de la Unin Europea en el 2009
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En la figura 1.9 esta comparacin se hace ms visible:
Figura 1.9: Mapa del consumo de zumo y nctar por persona en la UE durante el 2009.
En la figura 1.10 se muestra la comparacin a nivel mundial. Cuatro pases de la Unin Europea se encuentran entre los diez mayores mercados de zumos de fruta y nctares en el mundo, donde Espaa se halla en el octavo lugar del ranking. Los 10 pases que se muestran representan el 62% del consumo total mundial de zumos y nctares de frutas, donde Espaa supone tan slo el 1,1%.
Figura 1.10: Los diez primeros pases consumidores de zumo en el mudo durante el 2009
Como se puede apreciar en el grfico de la figura 1.11, los zumos ms comercializados en Europa y en el orden de ms a menos consumidos son: naranja, manzana, mezcla de varios, multivitaminados, pia y melocotn.
Figura 1.11: Los sabores ms vendidos en Europa
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Considerando solamente los valores de Espaa tomados de la asociacin ASOZUMO, se observa que las ventas tanto de zumos como de nctares ha aumentado en los ltimos aos, encontrndose as alrededor de unos 700 millones de litros de zumo de frutas consumido y alrededor de unos 375 millones de litros consumidos de nctar de frutas. Si se suman los litros consumidos de zumos y de nctares de frutas se ve que la cifra obtenida supera los 1000 millones de litros. Tambin se puede observar que en ambos casos el nmero de litros consumidos en condiciones ambiente supera los litros refrigerados consumidos. En la tabla 1.14 se hace constar que en el caso de los zumos a temperatura ambiente el zumo concentrado supera con creces al zumo exprimido mientras que en el caso del zumo refrigerado el zumo exprimido supera un poco al zumo concentrado. En la figura 1.12 se muestran algunos de los ejemplos de las distintas variedades de zumos y nctares.
Tabla 1.14: Evaluacin de las formas de consumo de zumos y nctares de fruta en Espaa desde el 2005 al 2009
Figura 1.12: Ejemplos de las distintas variedades de zumos y nctares
En cuanto a los sabores ms comercializados en Espaa son mostrados en la figura 1.13:
Figura 1.13: Los sabores ms comercializados en Espaa
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En relacin a estos sabores como se muestra en el cuadro de la tabla 1.15 puede observarse que todos suben a excepcin de la manzana sla y de la uva sla.
Tabla 1.15: Evolucin del mercado de los zumos de frutas en Espaa desde el 2005 hasta el 2009 ZUMOS DE FRUTAS Y NCTARES. SABORES
Es importante destacar que en los ltimos aos se han introducido en el mercado una amplia gama de zumos de frutas rojas, los cuales se comercializan en la mayora de los casos en mezclas de zumos que son conocidos como Antiox (contienen mezcla de frutas rojas en los zumos de frutas tradicionales) aunque en menor medida tambin se comercializan slos. Como ejemplo se puede mencionar la marca Minute Maid AntiOx que combinan pia, grosella negra y ciruela, o bien sabores como naranja, frambuesa, zanahoria, acerola y grosella negra. Otro ejemplo podra ser la marca Don Simn Antioxidantes que combina sabores como pia, grosella, manzana y arndano, o bien naranja, mora, uva y frambuesa. Las marcas blancas como Hacendado y El Corte Ingls tambin hacen sus zumos de frutas rojas. El zumo de frutas rojas con acerola de El corte ingls combina zumos de uva roja, cereza y grosella y los purs de frambuesa, fresa y mora. Del mismo modo el zumo antioxidante de la marca Hacendado combina purs de granada, frambuesa, cereza, mora y grosella y los zumos concentrados de uva tinta y manzana.
Figura1.14:EjemplosdezumosAntiox
3.LOSZUMOSDEFRUTASROJAS Hoy en da hay muchas frutas con pigmentos rojos de las que se pueden obtener zumos. Este trabajo se va a centrar, principalmente, en el estudio de cinco zumos de frutas rojas que son los que se describen en este apartado. Los pigmentos rojos que aparecen en las frutas rojas pertenecen a dos familias de compuestos qumicos, las antocianinas y las betacianinas, ambas con propiedades antioxidantes. Las frutas estudiadas en este trabajo deben su color a la presencia de antocianinas.
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3.1.- Mirtilo (Blueberry) El mirtilo (Vaccinium myrtillus L.) pertenece a la Familia de las Ericceas. Crece como un arbusto pequeo, de ramas leosas y hojas con borde aserrado. Las flores tienen la corola de color rosado y tienen forma acorazonada. Los frutos son bayas redondeadas de color negro azulado y de consistencia suave; contiene pequeas semillas. Su sabor es astringente. (www.plantamedicinales.net) Esta especie es nativa de los Estados Unidos. Actualmente, este pas junto con Canad son los exportadores lderes mundiales con un 90 % de la produccin total mundial. En verano abunda en lugares boscosos de Europa, como son Francia, Holanda, Alemania, Polonia y Espaa. Los ms consumidores de este tipo de frutas son Japn, Italia, Inglaterra, Alemania, Holanda y Espaa. El mirtilo es conocido por contener altos niveles de compuestos fenlicos, incluyendo los flavonoles y antocianinas por lo que se le atribuye una gran capacidad antioxidante respecto a otras frutas frescas. Estas antocianinas le aportan su color azul luminoso caracterstico. Tambin tiene otros compuestos como la cera epicutilar que tiene en su superficie. En cuanto a su composicin nutricional, tal y como se puede observar en la tabla 1.16, el mirtilo contiene fibra, aporta vitaminas A, B1,B2, B6 y C, hierro y potasio, entre otros muchos nutrientes. La forma en que se comercializa esta fruta es en forma de zumo y de zumo concentrado, aunque tambin se puede comercializar en forma de t.
Tabla 1.16: Composicin nutricional del mirtillo
Composicin por 100 gramos de porcin comestible

Agua(g) Caloras(Kcal) Fibra(g) Potasio(mg) Sodio(mg) Calcio(mg) Magnesio(mg) Manganeso(mg) VitaminaA(UI) 87,4 42 1,7 72 2 14 6 0,5 30 VitaminaB1(mg) VitaminaB2(mg) VitaminaB6(mg) VitaminaC(mg) cidonicotnico(mg) cidopantotnico(mg) Cobre(mg) Fsforo(mg) Hierro(mg) Cloro(mg) 0,014 0,0024 0,012 12 0,2 12 0,26 10 0,5 4
Figura 1.15: Frutos del mirtilo y la distribucin geogrfica mundial del cultivo. (www.consumer.es)
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3.2.- Arndano europeo (Cranberry) El arndano (Vaccinium oxycoccus L.) es un pequeo arbusto de 25 a 50 cm de altura y 1,5 cm de dimetro. Pertenece a la Familia de las Ericceas y al Gnero Vaccinium. El fruto del arndano es una baya pequea de forma esfrica, redonda u ovalada caracterizada por tener el cliz en forma de estrella. Su tamao es parecido al de una aceituna (entre 7 y 12 mm de dimetro), con la piel tersa y la pulpa jugosa. Su color es rojo intenso o negro y suele aparecer cubierto por un polvillo azulado o una pelcula resistente brillante. Destaca por su sabor agridulce y acidulado. Estos frutos son originarios de Asia y Europa, diferencindose el arndano americano del europeo. Actualmente, las mayores producciones de arndano en Europa se dan en Alemania, Francia y Polonia; El arndano americano se cultiva en Michigan, New Jersey y Carolina del Norte; y, en el hemisferio sur, destacan Chile, Argentina, Sudfrica, Australia y Nueva Zelanda. (www.diariomardeajo.com y www.consumer.es). El arndano que se consume en Espaa procede bsicamente de Australia, Chile, Holanda e Italia, pero cada vez toman mayor relevancia los que proceden de Huelva y Asturias. En este proyecto se ha estudiado el arndano europeo. El arndano destaca por sus cualidades hipocalricas, antioxidantes, nutritivas y medicinales, siendo clasificado por el Departamento de Agricultura de Estados Unidos (USDA) en la posicin nmero uno de frutos y vegetales por su capacidad antioxidante por su abundancia de pigmentos naturales: antocianos y carotenoides, tambin tiene, aunque en menos cantidad que la uva, el resveratrol. En la tabla 1.18 se expone su composicin nutricional.
Tabla 1.18: Composicin nutricional del arndano europeo
Composicin por 100 gramos de porcin comestible

Caloras(Kcal) Hidratosdecarbono(g) Fibra(g) Potasio(mg) Magnesio(mg) ProvitaminaA(g) VitaminaC(mg) VitaminaE(mg) 30,1 6,9 1,8 88 0,5 12 17 5
La forma en que se comercializa esta fruta es en forma de zumo y de zumo concentrado.
Figura 1.17: Frutos del arndano y la distribucin geogrfica mundial del cultivo. (www.consumer.es).
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3.3.- Grosella negra (Blackcurrant) La grosella negra (Ribes nigrum L.) es el fruto del grosellero. Se trata de un arbusto frondoso de la Familia de las Grossulariaceae que puede llegar a los 2 m de altura. Crece en forma de pequeos racimos similares a las uvas pero de tamao muy inferior. La baya es redonda y globosa con un tamao de 7 a 10 mm de dimetro. Su color va en funcin de la variedad. Destaca por su pulpa carnosa y jugosa y est llena de semillas diminutas que no estorban a la hora de consumir el fruto. Su sabor es amargo y muy cido. Estas frutas son originarias de las regiones boscosas euroasiticas. Actualmente, se cultivan especies con fines comerciales, por lo que es fcil encontrarlas en mercados especializados. Los pases productores de grosella negra ms importantes son: Italia, Blgica, Holanda e Inglaterra (www.consumer.es). El valor nutricional de la grosella negra, mostrado en la tabla 1.17, destaca por contener un 90 % de agua, mucha fibra y no tiene casi caloras por su escaso aporte de hidratos de carbono. Son especialmente ricas en vitamina C. Sin embargo, lo que en realidad caracteriza a estas frutas es su abundancia de pigmentos naturales (antocianos y carotenoides) de accin antioxidante.
Tabla 1.17: Contenido nutricional de la grosella negra
Composicin por 100 gramos de porcin comestible (Grosella negra) Caloras(Kcal) 35,1 Hidratosdecarbono(g) 4,4 Fibra(g) 5,8 Potasio(mg) 280 Magnesio(mg) 1,2 ProvitaminaA(g) 36 VitaminaC(mg) 40 VitaminaE(mg) 4,2
La forma en que se comercializa esta fruta es en forma de zumo y de zumo concentrado.
Figura 1.16: Frutos de grosella negra y la distribucin geogrfica mundial del cultivo. (www.consumer.es)
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3.4.- Cereza (Sour cherry) Las variedades de cereza ms conocidas en Europa se dividen en cerezas dulces (Prunus avium) o agrias (Prunus cerasus). Las cerezas estudiadas en este proyecto pertenecen al segundo grupo. El cerezo (Prunus cerasus L.) es un rbol frutal que pertenece a la Familia de las Rosceas y que puede llegar a alcanzar los 10 m de altura. Las cerezas son drupas, de forma redondeada, globosa o con figura de corazn. Poseen un hueso globoso y casi liso. Su tamao comercial est entre los 13 y 20 mm, con un dimetro de unos 2 cm y un peso de 6-9 g. Su color vara en funcin de la variedad, siendo entre el morado oscuro casi negro y el rojo. Destaca por su sabor dulce y jugoso o agrio (las guindas). El origen de esta fruta se sita en el mar Negro y en el mar Caspio, difundindose despus hacia Europa y Asia, por medio de las aves y las migraciones humanas. En la actualidad, el cerezo se cultiva en numerosas regiones y pases del mundo con clima templado, destacando Rusia, Estados Unidos, Alemania, Italia, Francia y Espaa. En nuestro pas, el valle del Jerte, en Cceres, es un rea de produccin tradicional aunque el valle del Ebro y la comunidad andaluza estn aumentando de forma notable su produccin. (www.consumer.es) El valor nutricional de la cereza se caracteriza por ser rica en hidratos de carbono, sobre todo en fructosa, aporta fibra y pequeas cantidades de provitamina A y de vitamina C. Esto queda plasmado en la tabla 1.19.
Tabla 1.19: Composicin nutricional de la cereza.
Composicin por 100 gramos de porcin comestible Caloras (Kcal) 58,3 Hidratos de carbono (g) 13,5 Fibra (g) 1,5 Potasio (mg) 260 Magnesio (mg) 11 Provitamina A (g) 3 Vitamina C (mg) 8 Calcio (mg) 16
Lo que en realidad destaca de las cerezas es su contenido en flavonoides (sobre todo antocianos, relacionados con el color caracterstico de estas frutas) y cido elgico del grupo de los hidroxibenzicos, ambos excelentes antioxidantes. La forma en que se comercializa esta fruta es en forma de zumo y zumo concentrado.
Figura 1.18: Frutos del cerezo y la distribucin geogrfica mundial del cultivo. (www.consumer.es)
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3.5.- Uva tinta (Black grape) La uva es el fruto de la vid y crece en forma de racimos. Pertenece al Gnero Vitis de la Familia Vitaceae que incluye unas 600 especies de arbustos. Los frutos son carnosos y nacen apiados en largos racimos compuestos por granos redondos o alargados de 1,6 cm de dimetro y un peso 200 a 350 mg. El color de la piel es rojizo o purpreo dependiendo de las variedades. Su pulpa es jugosa y dulzona. La uva se cultiva desde tiempos prehistricos, tal y como lo demuestran las semillas que se han hallado en yacimientos arqueolgicos de la edad del bronce de Suiza, Italia y en tumbas del antiguo Egipto. Los botnicos sitan el origen de la uva cultivada en Europa en la regin asitica del mar Caspio, desde donde las semillas se dispersaron hacia el oeste por toda la cuenca mediterrnea. Fueron los colonos espaoles los que introdujeron la vid en Amrica del Norte. Actualmente la vid se cultiva en las regiones clidas de todo el mundo, siendo los mayores productores: Australia, Sudfrica, Europa (Italia, Francia, Espaa, Portugal, Turqua y Grecia) y en el continente americano, California, Chile y Argentina. (www.consumer.es) El valor nutricional de la uva tinta, mostrado en la tabla 1.20, se caracteriza por tener un contenido moderado de azcares, principalmente glucosa y fructosa, y las vitaminas cido flico y vitamina B6, esta ltima en una cantidad que solo se ve superada por las frutas desecadas y por algunas frutas tropicales como el aguacate, el pltano, la chirimoya, la guayaba y el mango.
Tabla 1.20: Composicin nutricional de la uva tinta.
Composicin por 100 gramos de porcin comestible Caloras(Kcal) 67 Hidratosdecarbono(g) 15,5 Fibra(g) 0,4 Potasio(mg) 320 Magnesio(mg) 4 Calcio(mg) 4 VitaminaB6(mg) 0,1 ProvitaminaA(mg) 3 cidoflico(g) 26
En las uvas abundan diversas sustancias con reconocidas propiedades beneficiosas para la salud, tales como antocianos, flavonoides y taninos, responsables del color, aroma y textura caractersticos de estas frutas, y de los que dependen diversas propiedades que se le atribuyen a las uvas. Adems se encuentra un estilbeno que est siendo muy reconocido ltimamente, el resveratrol. La forma en que se comercializa esta fruta es en forma de zumo y de zumo concentrado.
Figura 1.19: Racimo de uva tinta y la distribucin geogrfica mundial del cultivo. (www.consumer.es)
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CAPTULO2.JUSTIFICACINYOBJETIVOS
1.JUSTIFICACINYOBJETIVOS De un tiempo a esta parte lo relacionado con los zumos de frutas rojas ha cobrado gran importancia, generando as un inters cada vez mayor, desde el momento en el que el consumidor asocia un potencial beneficio para su salud por el consumo de estos zumos. Esto repercute en la necesidad de disponer de mtodos analticos que permitan controlar la calidad y autenticidad de estos zumos, que adquieren en el mercado mayores precios, y se encuentran sometidos a una mayor posibilidad de fraudes. Las adulteraciones o posibles fraudes alimentarios son un problema econmico y por ello, la autentificacin de los productos alimenticios es un objetivo de gran importancia. En el caso de los zumos de frutas rojas, el tipo de adulteracin ms frecuente es la mezcla del zumo original con zumos de frutas ms baratas principalmente uva tinta. La estrategia de los mtodos de autentificacin consiste en medir o analizar un nmero de compuestos qumicos, que formen en conjunto el perfil caracterstico de cada fruta o zumo de fruta. Es decir, la huella dactilar de cada fruta. La variabilidad en las proporciones y contenidos de antocianinas en los zumos de frutas rojas analizados permite determinar la denominada huella dactilar de antocianos. La determinacin de este perfil de antocianos es ampliamente usado para verificar la autenticidad de productos alimentarios preparados con frutas rojas, tales como siropes, mermeladas y zumos de frutas (www.solociencia.com/quimica/08012602.htm). Por todo ello, el principal objetivo que se plante en este proyecto fin de mster, fue caracterizar el perfil polifenlico de cinco frutas rojas diferentes: mirtilo, arndano, grosella, cereza y uva tinta. Para realizar esta caracterizacin se aplicar un mtodo de anlisis por HPLC de los polifenoles de zumos de frutas rojas como alternativa al mtodo IFU n 71 empleado para antocianos (CODEX STAN 247-2005). Para ello se estudiar la deteccin simultnea por PDA y espectrometra de masas. Esta ltima tcnica analtica usada, de forma complementaria a la deteccin ptica, es capaz de dar informacin estructural y complementaria muy til a la hora de confirmar la presencia de polifenoles identificados con PDA y con fluorescencia en algunos casos. De forma desglosada los objetivos planteados fueron los siguientes: Objetivo 1: Estudiar los espectros de PDA y masas de patrones de polifenoles para seleccionar las longitudes de onda de absorcin para su deteccin y las fragmentaciones posibles que tienen lugar en los polifenoles presentes en zumos de frutas rojas. Objetivo 2: Conseguir resolver en un mismo cromatograma el mayor nmero de polifenoles posibles, evitando solapamientos de picos de compuestos.
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Objetivo 3: Analizar el perfil de antocianos y cidos fenlicos en zumos de frutas rojas. Objetivo 4: Ampliar el estudio a un mayor nmero de frutas abriendo el abanico abarcando tambin a otro tipo de frutas. Objetivo 5: Interpretacin de los espectros de masas, en la medida de lo posible, de los distintos polifenoles presentes en las frutas rojas. Objetivo 6: Mejorar el mtodo de trabajo inicial acortando el tiempo de anlisis mediante el empleo de un UPLC y complementar la deteccin por PDA, con deteccin por tndem de masas y fluorescencia.
2.ESTRUCTURADELTRABAJO El presente Trabajo Fin de Mster y Proyecto de Tesis Doctoral est organizado en los siguientes captulos: Captulo 1: Introduccin se incluye una revisin del estado actual de la industria de zumos y bebidas refrescantes. Captulo 2: Justificacin y objetivos Captulo 3: Plan de trabajo recoge la metodologa y el plan de trabajo planteado para la consecucin de los objetivos propuestos. Se incluye adems un diagrama de tiempos del desarrollo del proyecto en el que aparecen recogidos los hitos ms importantes del mismo. Captulo 4: Resultados preliminares recoge los resultados preliminares correspondientes a los primeros experimentos realizados en el laboratorio. Captulo 5: Conclusiones recoge las principales conclusiones extradas de los captulos anteriores. Captulo 6: Bibliografa presenta la bibliografa utilizada para la elaboracin de la presente memoria.
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CAPTULO3.PLANDETRABAJO
1.- PLAN DE TRABAJO Los objetivos planteados en este Trabajo Fin de Mster y Proyecto de Tesis Doctoral Identificacin de los polifenoles en zumos de frutas rojas por HPLC-UV/VISMASAS se podrn ir alcanzando de acuerdo con el plan de trabajo y el esquema de tiempos que se presentan a continuacin. Objetivo 1: Estudiar los espectros de PDA y masas de patrones de polifenoles para seleccionar las longitudes de onda de absorcin para su deteccin y las fragmentaciones posibles que tienen lugar en los polifenoles presentes en zumos de frutas rojas. Se comprarn algunos de los patrones comerciales de los polifenoles a estudiar, y se analizarn sus espectros de PDA y masas en agua y en las fases mviles a utilizar en los anlisis por HPLC (agua/trifluoroactico (0.5%) y agua/ acetonitrilo/ trifluoroactico (49.5/50/0.5)(V/V/V), para conocer sus longitudes de onda mximas de absorcin y las fragmentaciones que se producen. De estos experimentos se podrn seleccionar las condiciones de deteccin apropiadas para la identificacin de los polifenoles mediante el detector de masas. Objetivo 2: Conseguir ver en un mismo cromatograma el mayor nmero de polifenoles posibles. El mtodo IFU n 71 es el mtodo de anlisis de antocianos propuesto por la Federacin Internacional de productores de zumos de frutas (IFU). Este mtodo analiza por HPLC el perfil de antocianos utilizando un detector de fotodiodos (PDA), mientras que para analizar el resto de polifenoles se tienen que emplear diferentes mtodos de HPLC. El objetivo que se plantea aqu es el empleo de un nico mtodo de trabajo que es capaz de analizar tanto los antocianos como el resto de los polifenoles mayoritarios en los zumos de frutas rojas. Este mtodo propone una variacin del gradiente de elucin con respecto al mtodo IFU n 71. Con este gradiente se consigue corroborar la existencia de prcticamente todos los polifenoles presentes en dichos zumos. Utilizando la deteccin simultnea por PDA y detector de masas se optimizarn las condiciones de deteccin por masas de los flavonoides y los cidos fenlicos, as como, el volumen de inyeccin / concentracin de las muestras. Objetivo 3: Analizar el perfil de los cidos fenlicos, de los flavonoides y de los estilbenos en zumos de frutas rojas. Utilizando el mtodo analtico anterior se optimizarn las condiciones de deteccin por masas de los flavonoides, de los cidos fenlicos y de los estilbenos, y se analizarn los zumos de frutas rojas comerciales. La identificacin de compuestos se har fundamentalmente atendiendo a los tiempos de retencin de los patrones, a los espectros UV/Vis-Masas de los picos de
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cada compuesto, y a la composicin de las frutas descritas en trabajos previos de diferentes autores y publicados en revistas cientficas. Los grupos de flavonoides que se estudiarn especialmente sern los antocianos (cianidina, delfinidina, malvidina,...), flavonoles (quercetina, kaempferol), los flavanoles (catequina, epicatequina), estilbenos (resveratrol,). Los compuestos a identificar entre los cidos fenlicos, sern los derivados del cido benzoico (cido glico, cido protocateclico, 4-hidroxibenzoico) y los derivados del cido cinmico (cido cafico, cido p-cumrico, cido ferlico, cido sinpico). En caso de ser necesario se utilizar un detector de fluorescencia para la correcta identificacin de algn compuesto importante que ofrezca dudas. Los zumos de frutas rojas comerciales utilizados estn disponibles como zumo concentrado, y son suministrados por distintas casas comerciales. Objetivo 4: Ampliar el estudio a un mayor nmero de frutas abriendo el abanico abarcando tambin a otro tipo de frutas. Una vez analizados los zumos de frutas rojas se pasar a analizar zumos de otra clase de frutas, as como por ejemplo la manzana (que tiene algunos polifenoles como el cido clorognico, el floridzin entre otros) , la naranja (que tiene naringina, hesperidina entre otros), el pltano (que tiene catequina y cido glico) y ms tipos de frutas. Objetivo 5: Interpretacin de los espectros de masas, en la medida de lo posible, de los distintos polifenoles presentes en las frutas rojas. Se construir una tabla de componentes para cada uno de los zumos analizados, atendiendo para la identificacin de compuestos a los tiempos de retencin de los patrones, a los espectros UV/Vis-Masas de los picos, y a la composicin de las frutas obtenidas por diferentes autores en trabajos previos. Objetivo 6: Mejorar el mtodo de trabajo inicial acortando el tiempo de anlisis mediante el empleo de un UPLC y complementar la deteccin por PDA, con deteccin por tndem de masas y fluorescencia. Utilizando un UPLC y una deteccin complementaria por PDA, tndem de masas y fluorescencia se optimizarn algunos factores importantes: 1- El UPLC (cromatografa lquida de ultra eficacia) permite poder trabajar a presiones ms altas llegando hasta 100 MPa de presin (unas 1000 atmsferas), y como consecuencia permite poder utilizar partculas de tamao ms pequeo en las columnas (< 2 micrmetros), estas partculas de un dimetro tan pequeo, mejoran la resolucin porque se minimiza la difusin del analito al atravesar la columna. De este modo, se podr utilizar una columna ms pequea consiguiendo acortar el tiempo de anlisis, a la vez que se mejora la calidad de los resultados. Debe tenerse en cuenta la correccin que ha de hacerse al gradiente de elucin, siendo el nuevo gradiente:
Gradiente de elucin nuevo= gradiente X (longitud columna larga / longitud columna corta)
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2- El empleo de la fluorescencia permite poder detectar compuestos que por PDA son prcticamente inapreciables. 3- Utilizando un espectrmetro tndem de masas se puede conseguir una mejor resolucin en los espectros de masas permitiendo una visin ms completa de cada compuesto.
Redaccin y defensa de la Tesis Doctoral Una vez alcanzados todos los objetivos propuestos y, concluida la fase experimental, se proceder a la redaccin y defensa de la Tesis Doctoral.
El plan de trabajo que se propone est planificado para un tiempo aproximado de cuatro aos. Este tiempo es necesario para aplicar el mtodo analtico a un elevado nmero de frutas. Las etapas de desarrollo del Proyecto de Tesis han sido temporizadas y representadas en forma de tabla como se muestra en la Figura 3.1. Trabajo a realizar Objetivo 1 Objetivo 2 Objetivo 3 Objetivo 4 Objetivo 5 Objetivo 6 1er ao 2 ao 3er ao 4 ao
Figura 3.1: Tabla con la distribucin temporal del proyecto.
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CAPTULO4.MATERIALESYMTODOS
1.-MATERIALES 1.1.- Reactivos empleados Los reactivos nombrados a continuacin sern utilizados con el fin de elaborar las fases mviles para el anlisis por HPLC: Acetonitrilo (CH3CN) (Acetonitril for HPLC-Super Gradient) procedente de los laboratorios Panreac (Barcelona, Espaa). cido trifluoroactico (CF3COOH) (Trifluoroacetic acid for synthesis) procedente de los laboratorios Merck Schuchardt (Hohenbrunn, Alemania) Agua purificada en un sistema de purificacin de agua Milli-Q de Millipore (Bedford, MA, USA). Fase mvil A: Agua ultrapura y cido trifluoroactico (0,5%) (V/V) Fase mvil B: Acetonitrilo, agua ultrapura y cido trifluoroactico (50v/49,5v/0,5v)
1.2.- Patrones comerciales En este proyecto se han analizado una serie de patrones puros que han sido adquiridos a diversas casas comerciales (tabla a continuacin). Dichos patrones pertenecen a cuatro grupos de los polifenoles: cidos hidroxibenzoicos, cidos hidroxicinmicos, flavanoles y estilbenos (resveratrol). La Figura 4.1 muestra una fotografa de los productos comerciales y en la tabla 4.1 se pueden ver los patrones estudiados en este proyecto junto con sus solubilidades y sus casas comerciales. Para la disolucin de los patrones se utilizar agua purificada o metanol reactivo anlisis (Panreac, Espaa) en funcin de la solubilidad de cada patrn. Para el caso de los pigmentos de antocianinas no se dispone de patrones comerciales y para el caso de los pigmentos flavonoles se han analizado en el laboratorio los patrones de los distintos grupos (quercetina, isorhamnetina, kaempferol, Miricetina y rhamnetin).
Figura 4.1: Patrones puros a analizar
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Tabla 4.1: Informacin sobre los patrones estudiados en este proyecto.
NOMBRE SEGN IUPAC cido 3,4,5Trihidroxibenzico cido 4-hidroxi-3metoxibenzico cido elgico cido 3,4Dihidroxibenzico cido trans cinmico cido clorognico cido 3-(4hidroxifenil)acrlico cido 3-(3,4dihidroxifenil)acrlico cido 3-(4-dihidroxi3,5dimetoxifenil)acrlico (+) Catequina (-) Epicatequina Epigalocatequina-3galato
OTRA FRMULA NOMENCLATURA QUMICA cidos hidroxibenzicos cido glico cido vanllico cido elgico cido protocatequico cido cinmico cido clorognico cido p- cumrico cido cafico cido Sinpico C7H6O5 C8H8O4 C14H6O8 C7H6O4 C9H8O2 C16H18O9 C9H8O3 C9H8O4 C11H12O5
CASA COMERCIAL Fluka Analytical Fluka Analytical Fluka Analytical Aldrich Chemistry Aldrich Chemistry Sigma Sigma Sigma Fluka Analytical Sigma Fluka Analytical
SOLUBILIDAD Agua Agua Metanol Agua Agua Agua Agua Agua Agua Agua Agua
cidos hidroxicinmicos
Flavanoles (+) Catequina C15H14O6 (-) Epicatequina Epigalocatequina-3galato C15H14O6
C22H18O11
SigmaAldrich (Madrid, Spain) SigmaAldrich (Madrid, Spain)

Fluka Analytical
Metanol
Estilbenos
Resveratrol
Resveratrol
C14H12O3
Vitaminas
Metanol
cido ascrbico
cido ascrbico
C6H8O6
Agua
1.3.- Muestras de frutas rojas En este proyecto se han estudiado cinco frutas rojas en forma de zumo concentrado que se emplean normalmente en la elaboracin de zumos en la industria. En la tabla 4.2 se especifica la casa comercial de cada zumo.
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Tabla 4.2: Casas comerciales de los zumos de las frutas rojas analizadas.
FRUTA ROJA Mirtilo (Blueberry) Vaccinium myrtillus L wild Grosella negra (Blackcurrant) Ribes nigrum L. Arndano rojo (European Cranberry) Vaccinium oxycoccus L. Cereza agria (Sour Cherry) Prunus cerasus L. Uva tinta (Red Grape) Vitis vinifera L.
CASA COMERCIAL J. Garca Carrin S.A. (Jumilla, Espaa) (Junio-2006) J. Garca Carrin S.A. (Jumilla, Espaa) (Mayo-2008) Grnewald Frutchtsaft (Stainz, Austria) (Mayo-2008) Mondi Food (Rijkevorsal, B) J. Garca Carrin S.A. (Jumilla, Espaa)
Figura 4.2: variedad de frutas rojas
2.-MTODOS 2.1.- Mtodo de anlisis de polifenoles por HPLC (High Performance Liquid Chromatography). La cromatografa lquida de alta eficacia (HPLC) es la tcnica analtica de separacin ms ampliamente utilizada en la investigacin de pigmentos, ya que presenta las ventajas de tener una alta sensibilidad, fcil adaptacin a determinaciones cuantitativas exactas, idoneidad para su separacin y sobre todo , su gran aplicacin a sustancias que son de primordial inters en la industria alimentaria. La separacin de los componentes que constituyen una muestra mediante esta tcnica analtica se basa en la distribucin de estos componentes entre dos fases: la fase estacionaria que est contenida en la columna y la fase mvil, la cual eluye a travs de la columna. La funcin de esta fase mvil no slo es la de arrastrar al analito sino que tambin debe interaccionar con el analito. La cromatografa lquida se lleva a cabo en una columna de acero inoxidable, en la que todas las especies que pueden disolverse pueden separarse segn su afinidad por la fase mvil y la fase estacionaria y mediante la eleccin de una combinacin adecuada de estas fases. Con el objeto de aumentar la eficiencia en las separaciones, el tamao de las partculas de fase fija se fue disminuyendo hasta el tamao de micras (3- 10 m), lo cual gener la necesidad de utilizar altas presiones para lograr que fluya la fase mvil. De esta manera, naci la tcnica de cromatografa lquida de alta eficacia (HPLC), que requiere de instrumental especial que permita trabajar con las altas presiones requeridas.
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Un sistema de HPLC est compuesto por cuatro elementos bsicos: 1. Un sistema que sea capaz de gestionar e impulsar la fase mvil. Una bomba es la encargada de impulsar el/los disolventes al resto del sistema. Las bombas modernas tienen la capacidad para impulsar varios disolventes en proporciones variables y programables, adems en muchos casos el equipo dispone de desgasificador de fase mvil. 2. Una columna cromatogrfica que es la que contiene la fase estacionaria y es donde tiene lugar la separacin de los analitos. A veces va precedida por una pre-columna para impedir que lleguen a la columna componentes de la muestra que puedan daar la fase estacionaria. Hay que nombrar la presencia de un horno termostatizado que mantiene la temperatura de la columna constante, asegurando una mayor reproducibilidad en las separaciones aunque no siempre es necesario. 3. Un sistema que permita la insercin de las muestras, o sea un inyector, el cual permite la introduccin de una determinada cantidad de muestra en el sistema. 4. Un sistema capaz de informar del resultado de la separacin, es decir, un sistema de deteccin encargado de producir seales o respuestas analticas ante la presencia de las especies que abandonan la columna. Estos detectores pueden utilizarse simultneamente colocndolos en serie siempre que no sean destructivos. Adems tambin consta de un sistema de adquisicin de datos, tarea de la cual se encargan los ordenadores, dotados con programas especficos para ello. Evidentemente estos cuatro elementos bsicos pueden adoptar diferentes configuraciones y/o especificaciones dependiendo del modo cromatogrfico elegido y particularmente de las caractersticas de la fase mvil utilizada y de la propia muestra a separar.
Figura 4.3: diagrama esquemtico de un equipo de HPLC
En este proyecto se ha trabajado con una cromatografa de reparto en fase reversa (RP-HPLC), la cual consiste en el empleo de una fase fija o estacionaria apolar C18 y una fase mvil de polaridad moderada. Una de las fases estacionarias ms comunes de este tipo de cromatografa es la slica tratada con RMe2Cl, donde R es una cadena alquil como por ejemplo C18H37 C8H17. Con estas caractersticas se consigue un tiempo de retencin mayor para aquellos compuestos de naturaleza apolar, mientras que para las molculas de carcter polar eluyen ms rpidamente y por lo tanto obtiene un tiempo de retencin ms corto.
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La cromatografa de fase reversa es tan utilizada que a menudo se la denomina HPLC sin ninguna especificacin adicional. Se basa en el principio de las interacciones hidrofbicas que resultan de las fuerzas de repulsin entre un disolvente relativamente polar, un compuesto relativamente apolar y una fase estacionaria apolar. La fuerza conductora en la unin del compuesto a la fase estacionaria es la disminucin del rea del segmento apolar del analito expuesto al disolvente. Este efecto hidrofbico est dominado por la disminucin de la energa libre asociada con la minimizacin de la interfase compuesto-disolvente polar. El efecto hidrofbico disminuye con la adicin de disolvente apolar a la fase mvil. Esto modifica el coeficiente de particin de forma que el compuesto se mueve por la columna y fluye. Las caractersticas del compuesto de inters juegan un papel muy importante en la retencin. En general, la hidrofobicidad de la fase mvil se asocia con un tiempo de retencin mayor, por ejemplo, un compuesto con una cadena alquil larga, aumenta la hidrofobicidad de la molcula; la adicin de sales inorgnicas provoca un aumento lineal en la tensin superficial porque la entropa de la interfase compuesto-disolvente est controlada por sta y tiende a aumentar el tiempo de retencin. En este trabajo, se ha utilizado un equipo HPLC WATERS ALLIANCE 2695. Este equipo consta de las siguientes partes:

Bomba cuaternaria de flujo variable y gran precisin, con un volumen muerto inferior a 650 l. Horno para termostatizar la columna desde 25 C hasta 60 C en incrementos de 0,1 C. Sistema de lavado dinmico de las juntas y mbolos. Inyector automtico de hasta 120 viales, refrigerados desde 4 hasta 40 C. Utilidad informtica de control y tratamiento de datos Empower 2002. Adems se dispone de dos detectores: Detector UV-VIS de fotodiodos en serie, modelo 2996. o Analiza entre 190 y 800 nm o Rango lineal de hasta 2 unidades de absorbancia o 512 diodos o Resolucin espectral de 1,2 nm Detector de espectrometra de masas ZQ 4000. o Interfaz de ionizacin a presin atmosfrica doble ortogonal. o Sonda de electropulverizacin (ESI). o Sonda de ionizacin qumica a presin atmosfrica (APCI). o Analizador de tipo cuadrupolo con rango de masas de 2 a 4000 uma, con una resolucin de 1 uma. o Permite analizar mezclas con componentes que ionicen en modo positivo o en modo negativo, en un mismo anlisis. o El sistema de vaco controlado digitalmente est compuesto por una bomba turbomolecular y una bomba rotatoria de doble etapa.
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Figura 4.4: Equipo empleado (HPLC Waters Alliance 2695 con DAD modelo 2996 y detector de masas ZQ 4000) www. UPCT . es / ~ sait /
La columna empleada es una Zorbax SB-C18 (80 poro, 180 m2/g, carbon
load: 10%, estable a ph<2)(ref: 880975-902), 1641 bares de presin y un tamao de partcula de 5 m y 250 mm de longitud por 4,6 mm de dimetro interno. Casa Agilent (USA).
Figura 4.5: Columna de anlisis
El mtodo de trabajo empleado en este proyecto es una modificacin del mtodo IFU n71 (1998) de anlisis de antocianinas por HPLC con deteccin UV definido en el cdigo alimentario (CODEX STAN 247-2005). Esta modificacin consiste en sustituir el empleo de cido frmico por cido trifluoroactico y de la variacin del gradiente de elucin. 2.2.- Mtodo de medida del detector de fotodiodos (PDA) a) Fundamentos del detector de fotodiodos Los detectores de absorbancia ultravioleta (tambin visible) son los ms utilizados en HPLC. Su fundamento es la espectrofotometra de absorcin, que se basa en la absorcin de radiacin ultravioleta y visible por el analito, como consecuencia de lo cual se origina un estado activado que posteriormente elimina su exceso de energa en forma de calor, en un proceso que esquemticamente puede representarse as: X + h > X* > X + calor La cantidad de calor disipado es muy pequeo, por lo que el mtodo tiene la ventaja de originar un trastorno mnimo en el sistema que se estudia. Los detectores espectrofotomtricos ms potentes son los que utilizan una matriz de fotodiodos para registrar el espectro completo de cada soluto que pasa por el detector.
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Este tipo de detectores consisten en uniones tipo pn polarizadas inversamente y montadas sobre un chip de silicio. Los trminos tipo n y tipo p se refieren a materiales semiconductores que han sido dopados, es decir, cuyas propiedades elctricas han sido alteradas mediante la adicin controlada de pequesimas concentraciones de impurezas como boro o fsforo. En un diodo, la corriente elctrica slo fluye en un sentido a travs de la unin: desde el material de tipo p hasta el material de tipo n, y slo cuando el material de tipo p est a una tensin superior que el de tipo n. En la figura 4.6a se muestra la forma de la regin superficial de algunos de los fotodiodos. Cada uno est constitudo por una barra tipo p (positivo) difundida en un sustrato tipo n (negativo) para dar origen a una regin superficial que consta de una serie de elementos adyacentes cuyas dimensiones caractersticas son 2.5 por 0.025 mm (figura 4.6 b).
Figura 4.7a: Detector con una serie lineal de diodos en polarizacin inversa mediante un corte transversal
Figura 4.7b: Detector con una serie lineal de diodos en polarizacin inversa mediante una vista desde arriba.
En un diodo, la corriente elctrica slo fluye en un sentido a travs de la unin: desde el material de tipo p hasta el material de tipo n, y slo cuando el material de tipo p est a una tensin superior que el de tipo n. La tensin que debe aplicarse al diodo para crear esa condicin se denomina tensin de polarizacin directa y la tensin opuesta que hace que no pase corriente se denomina tensin de polarizacin inversa. Esta polarizacin inversa genera una capa de agotamiento (Es una regin formada por iones negativos y positivos descubiertos como consecuencia de la combinacin de los electrones y los huecos que estn en, o cerca de, la zona de la unin) que reduce casi a cero la conductancia de la unin. En la figura 4.7 se ensea dicha capa.
Figura 4.7: Un diodo y su capa de agotamiento
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Los fotodiodos individuales forman parte de un circuito integrado de gran escala formado sobre un solo chip de silicio. La cantidad de diodos en un chip vara de 64 a 4096, pero 1024 es la ms comn. La colocacin y polarizacin correctas de las regiones de tipo p y tipo n hacen que la corriente elctrica fluya por los trayectos adecuados y garantizan el buen funcionamiento de todo el chip. Al incidir la luz sobre el circuito integrado se generan huecos y electrones en dicha capa, dando lugar a una corriente elctrica, proporcional a la potencia de la radiacin electromagntica.
b) Funcionamiento del detector de fotodiodos La luz procedente de la fuente de emisin, tal como una lmpara de deuterio se colima por un sistema de lentes acromticos para que toda la luz pase a travs de la celda del detector en una red de difraccin hologrfica. De este modo, la muestra se somete a la luz de todas las longitudes de onda generada por la lmpara. La luz dispersada de la rejilla se deja caer en una matriz de diodos, la cual puede contener varios cientos de diodos y la salida de cada diodo se muestra regularmente por un equipo de un almacenamiento de datos en un disco duro. Al final del proceso, la salida de cualquier diodo puede ser seleccionada y producir un cromatograma utilizando la longitud de onda UV, que cay en ese diodo particular. La mayora de instrumentos permitirn la monitorizacin de al menos un diodo a tiempo real, para que el cromatograma se pueda seguir y ver cmo se desarrolla la separacin. Este sistema es ideal para sealar el tiempo de un pico en particular, el espectro de un soluto se puede obtener mediante la recopilacin de la memoria de la salida de todos los diodos en ese momento concreto. Esto genera directamente el espectro del soluto, es decir, una curva relacionando la absorcin con la longitud de onda. En la figura 4.8 se muestra un esquema general de un detector de fotodiodos.
Figura 4.8: Esquema general de un detector de fotodiodos
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Las caractersticas que debe cumplir un detector de fotodiodos son: 1. Ser altamente eficientes 2. Tener un bajo nivel de ruido, 3. Tene run amplio ancho de banda (es decir, que respondan de manera uniforme y rpida en todas las longitudes de onda de la seal), 4. Ser poco sensibles a las variaciones de temperatura 5. Ser baratos, pequeos, etc
2.3.- Mtodo de medida de espectros de masas. La Espectrometra de Masas es una poderosa tcnica microanaltica usada para identificar compuestos desconocidos, para cuantificar compuestos conocidos, y para elucidar la estructura y propiedades qumicas de molculas. La deteccin de compuestos puede ser llevada a cabo en muchos tipos de muestras, desde muestras elementales hasta grandes protenas y polmeros, para as obtener informacin caracterstica como el peso y algunas veces la estructura del analito deseado. En la figura 4.8 se presenta un esquema general del proceso de la
obtencin del espectro de masas.

Espectrodemasas Ionizacin m/z=29 m/z=27 M M
+.
1. Anlisis de la masa de todos los iones. 2. Recogida de datos 3. Representacin del diagrama de barras
pm=58 m/z=57 y adsorcin del exceso de energa m/z=13 m/z=43 descomposicin +. uni-molecular de M
Figura 4.8: Esquema general del proceso de la obtencin del espectro de masas
Esta tcnica ofrece numerosas ventajas frente a las tcnicas espectrofotomtricas ya que: Los lmites de deteccin que son, para muchos elementos, tres rdenes de magnitud ms sensibles frente a los mtodos pticos. Espectros notablemente ms sencillos, generalmente nicos y con frecuencia fcilmente interpretables. Capacidad para medir relaciones isotpicas atmicas. No implica la absorcin o emisin de luz Se utiliza, por ejemplo, un haz de electrones de alta energa que rompe la molcula en fragmentos. Las masas de los compuestos y su abundancia relativa proporciona mucha informacin sobre la estructura de la molcula. Aunque tambin hay que comentar la desventaja que presenta dicha tcnica, Resulta ser una tcnica destructiva, de modo que la muestra no se puede recuperar ntegra como consecuencia de haber sufrido la fragmentacin.
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El espectrmetro de masas es un instrumento diseado para separar los iones en fase gaseosa de acuerdo a su valor de m/z.
Figura 4.9: Diagrama de un espectrmetro de masas
El espectrmetro de masas incluye: Un sistema de vaco Herramientas para introducir la muestra (LC, GC...) Herramientas para producir los iones en fase gaseosa de las molculas de la muestra Herramientas para fragmentar los iones, con el fin de obtener informacin estructural, o para obtener una deteccin ms selectiva Un analizador, este elemento separa los iones en fase gaseosa. Adems en esta zona se movilizan los iones hasta la unidad de deteccin. Un sistema de deteccin Software y computacin En todos los casos, existe la necesidad de una interfaz que va a eliminar el disolvente y generar iones en fase gaseosa, luego estos iones se trasladan al detector del espectrmetro de masas. En la tcnica de ionizacin a presin atmosfrica (API) se combinan los pasos de la eliminacin de disolventes y de ionizacin de la muestra a presin atmosfrica. La interfaz es un tipo de haz de partculas, que separa la muestra del solvente, y permite la introduccin de la muestra en forma de partculas slidas en la regin de Alto vaco. El impacto de electrones es de inters para las molculas que no se ionizan con la tcnica de la API, o cuando un espectro de impacto electrnico es necesario, ya que proporciona informacin espectral independiente de la tcnica de introduccin de muestras (GC o LC, o la introduccin directa) y del instrumento del proveedor.
Figura 4.10: Esquema del espectrmetro de masas
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El corazn del espectrmetro de masas es el analizador. Este elemento separa los iones en fase gaseosa. El analizador utiliza campos elctricos o magnticos, o una combinacin de ambas para mover los iones de la regin donde se producen, a un detector, donde se produce una seal que es amplificada. Dado que el movimiento y la separacin de iones se basa en campos elctricos o magnticos, la relacin masa/carga, y no slo la masa, es de suma importancia. El analizador opera sometido a alto vaco, de modo que los iones pueden viajar al detector con un rendimiento suficiente. Los analizadores utilizados en este tipo de instrumentos son el cuadrupolo, la trampa de iones, el tiempo de vuelo y las combinaciones como por ejemplo los cuadrupolos triple. En nuestro caso el analizador es un cuadrupolo simple. Este analizador es el ms utilizado debido a su fcil uso, el rango de masas cubiertas, una buena linealidad para el trabajo cuantitativo, resolucin, calidad de los espectros de masas y un precio asequible. En la figura 4.10 se plasma el esquema de un cuadrupolo.
Figura 4.10: Esquema de un cuadrupolo
El tiempo de vida de un in desde su formacin hasta su deteccin es 50-100 microsegundos. El cuadrupolo se puede utilizar de dos modos: 1SIM (monitoreo de iones individuales) El modo de SIM es tambin llamado SIR (registro de iones individuales). En el modo de SIM, los parmetros (amplitud de las tensiones de voltaje de corriente directa y el radio de frecuencia de voltaje) se disponen para detectar slo un peso especfico, o una seleccin de masas especficas. Este modo ofrece la mayor sensibilidad para los usuarios interesados en determinados iones o fragmentos, ya que se puede gastar ms tiempo. Ese tiempo puede ser ajustado y se denomina tiempo de permanencia.Laventana de masapara la observacin deun ionen el modo deSIMsepuede ajustar,con el fin de compensar la calibracin para pequeos cambios de masas.Este es elfactor deamplitud. 2Scan.En el modo SCAN se obtienen todos los iones comprendidos en un rango m/z determinado. En la mayora deinstrumentos LC /MS, es posiblehacerel cambiopositivo a negativo,con el fin deanalizaren el mismolas molculas queseionizanen los modospositivos y negativos.
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En espectrometra de masas se utiliza una variedad de fuentes de ionizacin, siendo la energa que se transfiere durante el proceso de ionizacin y las propiedades qumico-fsicas de la especie a ionizar, los dos aspectos ms importantes que deben considerarse en relacin con las mismas. Las fuentes de ionizacin producen iones principalmente por ionizacin de una molcula neutra, mediante la expulsin o captura de electrones, protonacin, desprotonacin, formacin de aductos o la transferencia de una especie cargada a partir de una fase condensada a la fase gaseosa. La produccin de iones frecuentemente implica reacciones in-molcula en fase gaseosa. En este proyecto, la fuente de ionizacin es la ionizacin mediante electrospray (ESI). El HPLC se encuentra conectado a la sonda de electrospray, que consiste en un capilar metlico rodeado de un flujo de nitrgeno. Se aplica un voltaje entre la punta de la sonda y el cono de muestreo. En la mayora de aparatos, la tensin se aplica en los capilares, mientras que el cono de muestreo trabaja a baja tensin. En la figura 4.11 donde se queda plasmada el proceso de formacin de electrospray. El primer paso es la generacin de un aerosol. A una velocidad de flujo muy baja (a unos pocos l / min), la diferencia de potencial es suficiente para crear el spray. Al aumentar el flujo se hace necesario un flujo de nitrgeno para mantener estable el aerosol. Las fuentes de ionizacin a presin atmosfrica incluyen un dispositivo de calentamiento, con el fin de acelerar la evaporacin del disolvente. Una condicin indispensable para trabajar con electrospray es que el compuesto de inters debe ser ionizado en solucin.
Figura 4.11: proceso de formacin del electrospray
En el caso de que este detector no sea compatible con las condiciones del HPLC (es decir en el caso de la cromatografa de fase normal), es posible utilizar una post columna para conseguir las condiciones adecuadas. En el campo elctrico, en la punta del capilar, la superficie de las gotas que contienen el compuesto ionizado se cargan, ya sea positiva o negativamente, dependiendo de la polaridad del voltaje. Debido a la evaporacin del disolvente, el tamao de la gota se reduce y en consecuencia, la densidad de cargas en la superficie de la gota aumenta. Las fuerzas de repulsin entre las cargas aumentan hasta que haya una explosin de la gota. Este proceso se repite hasta que los iones de analito se evaporan de la gota.
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Mltiples Iones cargados pueden obtenerse en funcin de la estructura qumica de la sustancia analizada. Esta es la razn de por qu ESI es la tcnica de eleccin para el anlisis de protenas y otros biopolmeros en analizadores de cuadrupolo o de trampa de iones.
Figura 4.12: Diagrama de una fuente ESI
Esta vez el detector de masas empleado ha sido el waters micromass ZQ 4000, dedicado a la identificacin de compuestos de alto peso molecular y alta polaridad. Para la ionizacin dispone de sondas de electrospray y APCI (Atmospheric Pressure Chemical Ionization) pudiendo trabajar tanto en modo positivo como negativo. Resulta ideal para la confirmacin de estructuras ya conocidas y para la cuantificacin, es una combinacin de detector de HPLC y el analizador de masas de cuadrupolo que determina la relacin masa-carga (m/z) para diversos analitos. Un sistema de inyeccin con un inyector automtico introduce las muestras procedentes del HPLC en la fuente del analizador, donde sus molculas se ionizan a la presin atmosfrica. Los iones son entonces introducidos a travs de una serie de orificios y separados de acuerdo a su relacin masa-carga. Por ltimo, la deteccin de un sistema fotomultiplicador detecta los iones de masas separadas, amplifica las seales y enva la informacin al sistema de datos.
Figura 4.13: Detector Waters Micromass ZQ 4000
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2.4.- Mtodo de medida de preparacin de patrones y de muestras. a) Preparacin de patrones Atendiendo a la solubilidad de los patrones de polifenoles que se van a analizar, casi todos* se prepararan a una concentracin de 1mg/10mL en agua, excepto aquellos no solubles en agua que se disolvern en metanol (el cido elgico, el resveratrol y la galoepicatequina-3-galato). La preparacin de cada uno de los patrones analizados queda expuesta en la tabla 4.3. Se analiza tambin el patrn del cido ascrbico, que se prepara en agua y a la concentracin de los patrones anteriormente mencionados (1mg/10ml). *El resveratrol y la galoepicatequina-3-galato se preparan a una concentracin de 1 mg/ml.
Tabla 4.3: Preparacin de los patrones analizados
CONCENTRACIN PREPARADA cidos hidroxibenzicos cido glico 1mg/10ml cido vanllico 1mg/10ml cido elgico 1mg/10ml cido protocatequico 1mg/10ml cidos hidroxicinmicos cido cinmico 1mg/10ml cido clorognico 1mg/10ml cido p- cumrico 1mg/10ml cido cafico 1mg/10ml cido Sinpico 1mg/10ml cido cinmico 1mg/10ml Flavanoles (+) Catequina 1mg/10ml (-) Epicatequina 1mg/10ml Epigalocatequina-31mg/ml galato Estilbenos Resveratrol 1mg/ml cido ascrbico cido ascrbico 1mg/10ml
NOMENCLATURA
SOLUBILIDAD Agua Agua Metanol Agua Agua Agua Agua Agua Agua Agua Agua Agua Metanol Metanol Agua
Las cantidades correspondientes de cada compuesto se pesarn en balanza de precisin, se disolvern con ayuda de un agitador magntico y se llevarn al volumen correspondiente haciendo uso de un matraz aforado cuando corresponda. b) Preparacin de las muestras: Los zumos concentrados de frutas rojas estn almacenados a -20 C en los congeladores del departamento de Ingeniera Qumica y Ambiental de la UPCT. Los anlisis de dichos zumos se realizan en el SAIT (Servicio de Apoyo a la Investigacin Tecnolgica, Edificio I+D+I) de la Universidad Politcnica de Cartagena. Para su anlisis, unos 30 minutos antes, se sacan del congelador y se dejan descongelar completamente a temperatura ambiente. Una vez descongelados se homogeneizan y se cogen 10 ml de cada una de las muestras para su posterior anlisis.
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Estos zumos se diluyen 5 veces con agua y, antes de analizarse, se filtran aproximadamente 2 ml de muestra a travs de filtros de nylon de 0,45 m para eliminar las posibles partculas que puedan quedarse retenidas en la columna cromatogrfica y obturarla.
2.5.- Condiciones del anlisis por HPLC con detector de fotodiodos y detector de masas. Las condiciones del mtodo de trabajo consisten en: Fase mvil A: Agua/cido trifluoroactico (99,5/0,5) (v/v) Fase mvil B: Agua/acetonitrilo/cido trifluoroactico (49,5/50/0,5) (v/v/v) Flujo: 1 mL/min Volumen de inyeccin: 10 l de cada muestra de frutos rojos. Cuidados de la columna: limpieza con acetonitrilo, pues no se debe conservar la columna en medio cido. Deteccin: Se utilizan de manera simultnea el detector de fotodiodos y el de masas. Estos detectores se encuentran acoplados al HPLC mediante el uso de una bifurcacin. Del flujo que sale del HPLC a travs de esta bifurcacin una parte (el 30%) va para el PDA mientras que el resto (70%) va para el detector de masas. Datos para el espectrmetro de masas: ESI (+) Temperatura: 25C Capilaridad: 3500 V SCAN: 50-1000 m/z N2: 10 l/min Voltaje de cono: 15 y 45 Datos para el PDA: 240-550 nm Gradiente de elucin segn el mtodo propuesto: El gradiente de elucin empleado se puede observar en la tabla 4.4.
Tabla 4.4: Gradiente de elucin para el mtodo propuesto
Tiempo (min) 0 3,3 37,3 74,6 90,6 103,4 104,5 107,2
Fase mvil A(%) 92 82 68 40 0 0 92 92
Fase mvil B (%) 8 18 32 60 100 100 8 8
En el departamento, adems, se realiz el anlisis de las distintas frutas con las fases mviles y el gradiente de elucin del mtodo IFU n71. En las tablas 4.5 y 4.6 se muestran las condiciones del mtodo IFU empleado.
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Tabla 4.5: Comparacin de las fases mviles empleadas en ambos mtodos
Mtodo propuesto Fase mvil A: Agua/cido trifluoroactico (99,5/0,5) (v/v) Fase mvil B: Agua/acetonitrilo/cido trifluoroactico (49,5/50/0,5) (v/v/v) Tiempo (min) 0 1 26 35 38 43 46
Mtodo IFU n71 (1998) Fase mvil A: Agua/cido frmico (90/10) (v/v) Fase mvil B: Acetonitrilo/cido frmico (90/10) (v/v) Fase mvil B (%) 6,7 6,7 16,7 55,6 55,6 6,7 6,7
Tabla 4.6: Gradiente de elucin empleada en el mtodo IFU n 71
Fase mvil A (%) 93,3 93,3 83,3 44,4 44,4 93,3 93,3
A la hora de comparar ambos mtodos se puede observar que con las condiciones del mtodo propuesto se ha conseguido una mejora significativa en los cromatogramas. Con el mtodo IFU n71 se obtena una buena resolucin de los antocianos pero una escasa resolucin del resto de compuestos polifenlicos mientras que con este nuevo mtodo se llega a obtener una buena resolucin de una gran variedad de polifenoles y no slo de los antocianos, logrndose as una buena identificacin de un gran nmero de compuestos polifenlicos: antocianos, flavonoles, flavanoles, cidos fenlicos y estilbenos. Adems, al trabajar con una fase mvil menos cida se protege al equipo de HPLC ante una posible corrosin.
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CAPTULO5.RESULTADOS
1.-Anlisis por HPLC de los patrones estudiados. Se realizaron los anlisis individuales de estos patrones siguiendo las condiciones del mtodo de anlisis por HPLC que estn recogidas en el captulo 4: Materiales y Mtodos de este proyecto. Los resultados obtenidos se pueden resumir en dos puntos: Se realiz inicialmente un espectro de UV visible para cada compuesto, obtenindose as las longitudes de onda mximas de cada patrn y pudiendo establecer una longitud de onda para cada grupo de los polifenoles estudiados en las determinadas frutas. Se analiz el espectro de masas obtenido para cada patrn. Las caractersticas espectroscpicas de los patrones estudiados quedan plasmadas en la tabla 5.1.
Tabla 5.1: Caractersticas espectroscpicas (UV-Vis y masas) de los patrones estudiados
Compuesto
cido glico cido protocatequico cido vanllico cido elgico cido clorognico cido cafico cido p- cumrico cido Sinpico cido cinmico (+) Catequina Epigalocatequina-3-galato (-) Epicatequina Resveratrol cido ascrbico
Tiempo de UV-Visible retencin (min) (mx)nm cidos hidroxibenzicos 5,804 272,2 8,265 260,3 y 293,5 15,81 261,5 y 292,3 35,500 253,3 y 365,9 cidos hidroxicinmicos 13,816 241,5 y 326,8 16,570 248 y 324,4 26,083 227,3 y 310 34,091 236,8 y 324,4 61,660 278,1 Flavanoles 12,600 279,3 18,230 226,2 y 274,5 19,240 279,3 Estilbenos 53,170 223,8 y 320,8 cido ascrbico 3.004 243.8
Masas
170.8 154,9 168,9 303,2 354,9 y 162,9 180,9 147 224,8 y 206,9 148.8 y 130.7 291 y 138,9 459 291 y 138,9 228,9 176.8
1.1.-Anlisis por UV-Visible de los patrones estudiados. Los cidos hidroxibenzicos se detectan a una mx de absorbancia de 260 nm, mientras que los cidos hidroxicinmicos son detectados a una mx de absorbancia de 320 nm. Los flavanoles tienen un pico de absorcin a una de 280nm y es la a la que se va a medir. Hay que sealar que, sin embargo, es un pico muy poco intenso por lo que pueden pasar desapercibidos cuando estn presentes en poca concentracin. En estos casos, la tcnica ms apropiada para su identificacin es la fluorescencia con la que presenta una mx. de excitacin de 280nm y una mx. de emisin de 350nm . En este proyecto no se ha empleado esta tcnica pero si se confirmar su presencia por su espectro de masas. El patrn de resveratrol, nico patrn que pertenece al grupo de los estilbenos se detecta a mx de absorbancia de 280 nm. A parte de los polifenoles, como se ha podido ver, se ha estudiado tambin el cido ascrbico cuya mx. se alcanza a 243.8.
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Los espectros de absorbancia UV-Visible obtenidos de todos los patrones individuales se muestran en las tablas 5.2; 5.3; 5.4; 5.5 y 5.6.
Tabla 5.2: Espectros individuales de absorbancia UV-Visible de los patrones del grupo de los cidos hidroxibenzicos.
cido glico C7H6O5

0.30
cido protocatequico (cido 3,4-dihidroxibenzico) C7H6O4
0.50 AU
AU
272.2
0.20
260.3 293.5 370.7

250.00 300.00 350.00 nm 400.00 450.00
0.10
0.00 250.00 300.00 350.00 nm 400.00 450.00 500.00
0.00
469.6 496.3
500.00
cido vanllico C8H8O4

253.3
0.40
cido elgico C14H6O8
261.5
AU 0.10
0.30 AU 0.20 0.10
292.3 371.9
250.00 300.00 350.00 nm 400.00
365.9
0.00
420.1436.9
450.00
472.0
502.3520.6
0.00
500.00
250.00
300.00
350.00 nm
400.00
450.00
500.00
Tabla 5.3: Espectros individuales de absorbancia UV-Visible de los patrones del grupo de los flavanoles.
(+) Catequina C15H14O6
(-) Epicatequina C15H14O6

0.06
0.16 0.14 0.12 0.10 AU 0.08 0.06 0.04 0.02 0.00 250.00 300.00 350.00 nm
AU
0.04
279.3
0.02
279.3 333.9 357.8 380.3 404.4 428.5 450.2 470.8

250.00 300.00 350.00 nm 400.00 450.00 500.00
379.1
414.0428.5
400.00 450.00
493.9
500.00
520.6
0.00
523.0
Epigalocatequina-3-galato
C22H18O11
226.2
1.00 AU
274.5
0.00 250.00 300.00 350.00 nm 400.00 450.00 500.00
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Tabla 5.4: Espectros individuales de absorbancia UV-Visible de los patrones del grupo de los cidos hidroxicinmicos.
cido clorognico C16H18O9

326.8
0.20
cido cafico C9H8O4

0.10
324.4
0.15 AU
0.10
0.05
AU
241.5
0.05
0.00 250.00 300.00 350.00 nm 400.00
461.1
450.00 500.00
516.9
0.00 250.00 300.00 350.00 nm 400.00
418.8
453.9468.4 495.1 523.0

450.00 500.00
cido p- cumrico C9H8O3

0.12 0.10
cido Sinpico C11H12O5

0.08
310.1
236.8
324.4
0.06
0.08 AU
0.04
0.02 0.00 250.00 300.00 350.00 nm
408.0 428.5 452.7 469.6 492.6506.0 518.1

400.00 450.00 500.00
AU
0.06
227.3
0.04
0.02
0.00 250.00 300.00 350.00 nm 400.00
418.8
446.6 473.2 497.5 525.4

450.00 500.00
cido cinmico C9H8O2

278.1
AU 0.50 0.00 250.00 300.00 350.00 nm 400.00 450.00 500.00
Tabla 5.5: Espectro individual de absorbancia UV-Visible del patrn resveratrol.
Resveratrol
C14H12O3
303.0 320.8
2.00
223.8
AU 1.00 0.00 240.00 260.00 280.00 300.00 320.00 340.00 360.00 380.00 nm 400.00 420.00 440.00 460.00 480.00 500.00 520.00
Tabla 5.6: Espectro individual de absorbancia UV-Visible del patrn del cido ascrbico.
cido ascrbico
C6H8O6
243.8
0.80
0.60 AU 0.40 0.20 0.00 230.00 240.00 250.00 260.00 nm 270.00 280.00 290.00
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1.2.-Anlisis por detector de masas de los patrones estudiados. Al detector de masas le llega un flujo de 0.7 ml/min, flujo que est dentro de lo permitido sin llegar a saturar el equipo. Primeramente, al introducir la muestra en este detector se va a generar un cromatograma de respuesta, en el que hay que buscar al analito deseado mediante previo conocimiento de la masa de dicho compuesto. Debido a que las molculas pequeas no se podan ver en el detector de masas empleando un CV= 45, se realiz un barrido del voltaje de cono desde CV= 15 (con este voltaje las molculas apenas se rompen) hasta CV=45 (CV= voltaje de cono), resultando ser que con un voltaje de cono de CV= 45, las molculas sufran mltiples rupturas, de modo que las molculas pequeas (Pm<300) no se podan ver. Por este motivo se va a trabajar con un CV de 15. En la tabla 4.13 se muestran los espectros de masas de los patrones estudiados.
Tabla 5.7: Espectros de masas de los patrones estudiados
Nombre
Frmula y peso molecular

20000.0 In te n s ity
Espectro de masas
170.88 305.89
10000.0
cido glico
C7H6O5 170
0.0 50.00
100.00
150.00
200.00 m/z
250.00
300.00
350.00
400.00
102.01
20000.0
127.11 154.94 142.22
cido protocatequico (cido 3,4dihidroxibenzico)
15000.0 Intensity
C7H6O4 154
10000.0
5000.0
0.0 50.00
100.00
150.00
200.00 m/z
250.00
300.00
350.00
400.00
60.20
I n t e n s it y 100000
cido vanllico
C8H8O4 168
88.08103.05 83.09
100.00 150.00
168.90
207.04
200.00 250.00 300.00
0 50.00
m/z
60.24
300000 Intensity
200000
cido elgico
C14H6O8 302
100000
103.02 84.18
141.96 303.21
0 50.00
100.00
150.00
200.00 m/z
250.00
300.00
350.00
400.00
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162.93
1.5x106
cido clorognico
C16H18O9 354
Intensity
1.0x106
5.0x105
144.69
354.93
0.0 100.00 200.00 300.00 400.00 500.00 m/z 600.00 700.00 800.00 900.00 1000.00
100000 I n te n s it y
180.91 221.90
cido cafico
C9H8O4 180
0 50.00
100.00
150.00
200.00 m/z
250.00
300.00
350.00
400.00
200000
146.85
150000 In te n s ity
cido p- cumrico
C9H8O3 146.8
100000
78.09
50000
0 100.00 150.00 200.00 m/z

224.84
140000.0
250.00
300.00
350.00
400.00
120000.0
100000.0 In te n sity
80000.0
cido Sinpico
C11H12O5 224
60000.0
40000.0
20000.0
206.91 141.92 225.89
265.87
0.0 50.00
100.00
150.00
200.00 m/z
250.00
300.00
350.00
400.00
189.84 148.86
100000.0
80000.0
Intensity
60000.0
368.73
cido cinmico
C9H8O2 148
40000.0
79.94
130.77
213.72 251.76 397.64 259.10
20000.0
0.0 50.00
100.00
150.00
200.00 m/z
250.00
300.00
350.00
400.00
600000
138.89
In te n s ity
400000
122.91 73.11 91.10

0 100.00 150.00 200.00 m/z 250.00 300.00 350.00 400.00
( ) Catequina
C15H14O6 290
200000
290.93
Pgina58
1.0x106 8.0x105 Intens ity 6.0x105 4.0x105 2.0x105 0.0 50.00
459.02
Epigalocatequina3-galato
C22H18O11 458
288.95
460.28
100.00
150.00
200.00
250.00 m/z
300.00
350.00
400.00
450.00
500.00
400000
138.85
I n t e n s it y
(-) Epicatequina
C15H14O6 290
200000
122.88 73.11 95.91 290.89
0 100.00
2.5x106 2.0x106 1.5x106 1.0x106 5.0x105
150.00
200.00 m/z
250.00
228.91
300.00
350.00
400.00
Resveratrol
C14H12O3 228
Intens ity
0.0 50.00
100.00
150.00
200.00 m/z
250.00
300.00
350.00
400.00
176.80
800000
82.99
cido ascrbico
C6H8O6 176
400000
140.83
200000
100.94
0 50.00 100.00 150.00
217.76
200.00 m/z 250.00 300.00 350.00 400.00
Para poder exponer los resultados obtenidos es necesario conocer unos conceptos previos: In Molecular (pico molecular) M+: es el in obtenido por la prdida de un electrn por la molcula. Es el pico que representa la masa sin ese electrn. El pico base: el pico ms intenso del espectro, al que por convenio se le asigna una intensidad del 100 % Radical cation+ : son especies cargadas con un nmero impar de electrones Picos de fragmentacin: picos correspondientes a fragmentos ms ligeros, formados por descomposicin del in molecular. A menudo se corresponden con los carbocationes ms estables. En el espectro de masas se va a obtener la masa de los diferentes iones como M+1, de modo que la molcula que tiene un peso molecular de 170, por ejemplo, tendr un in molecular de 171, siempre que la carga que tenga la molcula sea igual a la unidad.
Pgina59
El primer patrn a explicar va a ser el cido glico. En su espectro se obtiene un pico base producto de su in molecular (m/z 171). El pico obtenido a una relacin m/z de 305 debe ser debido a la formacin de un aducto del cido glico. En el cido protocatequico (cido 3,4-dihidroxibenzico) se ha obtenido el pico importante debido a su in molecular (155 umas) y se han encontrado tambin otros picos causados por fragmentaciones que no se conocen muy bien. El cido vanillico presenta un pico fundamental debido a su in molecular (m/z 169) y un pico base de 60 umas. El pico resultante a una relacin m/z de 207 debe ser debido a la posible formacin de un aducto. En el elgico se puede ver su in molecular a 303 (pm+1), diferentes fragmentos debido a las diferentes rupturas que sufre la molcula y un pico base de m/z=60. En el caso del clorognico se obtiene el in molecular a m/z de 355 (pm+1) y un pico base a 162.9, pico caracterstico de los cidos hidroxicinmicos esterificados. ste es un cido hidroxicinmico esterificado. Segn la bibliografa (Abad-Garca et al., 2009),el primer fragmento que se pierde es la parte alcohlica para obtener el cido hidroxicinmico deshidratado (pico de 162.9) y una posterior prdida caracterstica de una molcula de agua (pico a 144.7).
Primer fragento que sepierde
Figura 5.1:Estructura del clorognico
En el caso del cido cafico se ve el pico base que se corresponde con su masa+1(180.9) y un pico con una relacin masa/carga de 221.9 debido seguramente a la formacin de algn aducto o bien debido a una posible esterificacin del grupo cido. El espectro del cido p-cumrico muestra dos seales importantes. La primera, obtenida a una relacin m/z de 146.9, debido a la prdida de una molcula de agua y la segunda seal con una m/z=118.9, producida por la prdida de una molcula de agua y una molcula de CO (B. Abad-Garca et al, 2009). El pico base del espectro en cuestin se da a una relacin masa/carga de 100.9, podra corresponderse con la prdida de otra molcula de agua.
Primera prdida
Terceraprdida Segundaprdida
Figura 5.2: Estructura del cido cumrico
Pgina60
El cido Sinpico muestra un pico base con una relacin m/z= 224.8 correspondiente a su in molecular. Se puede ver tambin otro pico caracterstico a 206.9, debido a la prdida de una molcula de agua (B. AbadGarca et al, 2009). El pico correspondiente a la masa/carga 141.9 no se conoce muy bien aunque se intuye que podra explicarse mediante la prdida de los dos grupos CH3OH y una posible ciclacin. El pico correspondiente a la relacin de 265.8 puede deberse a la esterificacin del cido sinpico o a la posible formacin de un aducto.
Posible tercera prdida Posible primera prdida
Posible segunda prdida Figura5.3:Estructuradelcidosinpico
El cido Cinmico muestra dos picos importantes. El primero, obtenido a una m/z 148.8 correspondiente a su in molecular y el otro pico importante es el obtenido a la relacin m/z 130.7, producto de la prdida de una molcula de agua. Tambin presenta un pico base cuya relacin m/z 189.8 podra deberse a la unin de este cido mediante un puente de hidrgeno con una molcula de acetonitrilo de la fase mvil. En el espectro de la (+-) Catequina se ve claramente el in molecular que corresponde a su pm+1= 291.El pico base se obtiene a una relacin masa/carga= 138.9, se corresponde con una fragmentacin muy intensa que sucede en el heterociclo conteniendo un hidroxilo en el carbono al heterotomo (B. Abad-Garca et al, 2009).
Figura5.4:Estructuradelacatequina
Fragmentacin severa. Se pierde este fragmento
Pgina61
En el espectro del Epigalocatequina-3-galato se ve claramente el pico base que se corresponde con su pm+1 (m/z 459). El otro pico obtenido (m/z 288.9) debe ser fruto de la fractura causada en el enlace que une el carboxilo a la estructura flavonoide.
Fragmentacin severa
Figura5.5:Estructuradelaepigalocatequina3galato
En el espectro de la (-) Epicatequina se ve claramente el in molecular que corresponde a su pm+1= 291.El pico base se obtiene a un pm+1= 138.9, se corresponde con una fragmentacin muy intensa que sucede en el heterociclo que contiene un hidroxilo en el carbono al heterotomo. La diferencia con respecto al anterior est en la posicin del OH en el anillo dihidropirano.
Fragmentacin severa. Fragmento que se pierde. Figura5.6:Estructuradelaepicatequina
En el espectro del resveratrol se ve un nico pico que es el pico base, el cual se corresponde con su masa +1 resultando ser una masa de 228.9. En el espectro del cido ascrbico se observan dos picos importantes, el primero que es el pico base y se corresponde con su in molecular (m/z 176.8) y el segundo, obtenido a una m/z 140.8 producido por la prdia de dos molculas de agua. En este espectro tambin se puede ver otra seal a una m/z 217.7, la cual podra ser generada por la unin de este cido mediante un puente de hidrgeno a una molcula de acetonitrilo de la fase mvil.
2.-ANLISIS POR HPLC DE LOS ZUMOS DE FRUTAS ROJAS En este proyecto se han analizado los perfiles de antocianos, flavonoles, flavanoles y cidos fenlicos de cinco frutas rojas. El anlisis se ha llevado a cabo mediante la tcnica de HPLC acoplada a un detector de fotodiodos y a un detector de masas. El mtodo est indicado en el apartado 2.5 de la seccin de mtodos.
Pgina62
2.1.- Mirtilo (Blueberry; Vaccinium myrtillus) La muestra analizada se trata de un zumo concentrado de esta fruta procedente de la empresa J.Garca Carrin. La muestra es analizada en el laboratorio del edificio de Servicio de Apoyo a la Investigacin Tecnolgica, Edificio I+D+I (SAIT). Anteriormente a su anlisis esta muestra se encuentra congelada a -20C en el laboratorio del departamento de Ingeniera Qumica y Ambiental de la UPCT. Antocianos presentes en el mirtilo Para identificar los antocianos presentes en el mirtilo se mira el cromatograma obtenido con el detector de fotodiodos (PDA) a una absorbancia de 520 nm, el resultado obtenido se comprueba con la bibliografa y posteriormente se corrobora dicha identificacin con el espectro de masas obtenido para cada antociano. La propuesta de identificacin de los antocianos en las frutas rojas se ha realizado mediante la comparacin de los datos obtenidos con los de la bibliografa. El motivo de este tipo de identificacin se debe a la gran diversidad de antocianos presentes en las frutas rojas y a la no comercializacin de patrones de muchos de ellos. En la figuras 5.7; 5.8 y 5.9 se muestra el perfil de los antocianos presentes en el mirtilo relacionado con los espectros de absorbancia originados por cada antociano.
0.20
2 1 3 4
5 7
6 8 12 11 10 9
40.00
520 nm
13
AU
0.10
14
0.00 10.00 20.00 30.00 Minutes 50.00 60.00

524.2
0.20
0.15
276.9
A U 0.10
524.2 516.9
0.05
276.9 280.5 276.9 280.5 276.9
516.9
0.00 250.00 300.00
344.7 330.4 345.9 329.2344.7 347.1

350.00 nm 400.00 450.00 500.00
Figura 5.7: Perfil cromatogrfico de los antocianos presentes en el mirtilo relacionado con los espectros de absorbancia originados por cada antociano.
Pgina63
0.20
2 1 3 4
5 7
6 8 12 11 10 9
40.00
520 nm
13
AU
0.10
14
0.00 10.00
0.040 0.035 0.030 0.025 A U
20.00
30.00 Minutes
50.00
60.00
524.2
221.5
0.020 0.015 0.010 0.005 0.000 250.00
276.9
276.9 281.6 280.5 276.9 235.6 508.4 519.4 347.1 348.3 322.0 343.5 330.4
300.00 350.00 nm
380.3
400.00 450.00 500.00
0.20
2 1 3 4
5 7
6 8 12 11 10 9
40.00
520 nm
13
AU
0.10
14
0.00 10.00 20.00 30.00 Minutes 50.00 60.00
0.12
0.10
0.08 A U
278.1
0.06
0.04
524.2 278.1 280.5 328.0

250.00 300.00
0.02
221.5
513.3 348.3 347.1

350.00 nm 400.00 450.00 500.00
0.00
A continuacin, en la tabla 5.8, se realiza la propuesta de identificacin de los antocianos presentes en el mirtilo.
Tabla 5.8: Propuesta de la identificacin de los antocianos presentes en el mirtilo
Nmero de identificacin 1 2 3
Tiempo de retencin (min) 21,054 23,246 26,113
Identificacin de los antocianos Delfinidina-3-O-galactsido Delfinidina-3-O-glucsido Cianidina-3-O-galactsido
Pgina64
4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 26,918 28,909 29,326 32,016 32,366 34,854 35,994 37,746 38,204 40,625 44,270 Delfinidina-3-O-arabinsido Cianidina-3-O-glucsido Petunidina-3-O-galactsido Petunidina-3-O-glucsido Cianidina-3-O-arabinsido Peonodina-3-O-galactsido Petunidina-3-O-arabinsido Malvinidina-3-O-galactsido Peonodina-3-O-glucsido Malvinidina-3-O-glucsido Malvinidina-3-O-arabinsido
A fin de comparar la forma de los distintos espectros de absorbancia obtenidos, se adjunta la tabla 5.9 en la que se muestran los espectros escalados presentando la misma absorbancia a 520 nm.
Tabla 5.9: Espectros escalados de los antocianos del mirtilo presentando la misma absorbancia a 520 nm
Delfinidina-3-O-galactsido
0.14
Delfinidina-3-O-glucsido
524.2
0.20
521.8
0.12
0.10
0.15
0.08 AU
276.9
AU
276.9
0.06
0.10
0.04 0.05 0.02
347.1
345.9
250.00
300.00
350.00 nm
400.00
450.00
500.00
250.00
300.00
350.00 nm
400.00
450.00
500.00
Cianidina-3-O-galactsido
516.9
0.080 0.070
0.08 0.10
Delfinidina-3-O-arabinsido
0.060 0.050 AU 0.040
280.5
AU 0.06
276.9
0.04
0.030 0.020 0.010
0.02
329.2
250.00 300.00
347.1
250.00
300.00
350.00 nm
400.00
450.00
500.00
350.00 nm
400.00
450.00
500.00
Cianidina-3-O-glucsido
0.14
Petunidina-3-O-galactsido
515.7
0.030 0.025
0.12
0.10
280.5
AU
0.020
AU
0.08
275.7
0.015
0.06
0.010
0.04
0.005
347.1
0.02
329.2
250.00 300.00 350.00 nm 400.00 450.00 500.00
0.000 250.00 300.00 350.00 nm 400.00 450.00 500.00
Petunidina-3-O-glucsido
0.016
Cianidina-3-O-arabinsido
513.3
0.014 0.012
0.060
0.050
281.6
0.040 AU
0.010
275.7
AU 0.008 0.006
0.030
0.020
0.004 0.002 0.000
0.010
348.3
320.8
0.000 250.00 300.00 350.00 nm 400.00 450.00 500.00
250.00
300.00
350.00 nm
400.00
450.00
500.00
Pgina65
Peonodina-3-O-galactsido
0.012
Petunidina-3-O-arabinsido
519.4
0.030 0.025
0.010
221.5
0.008
0.020
280.5
AU
AU
279.3
0.015
0.006
0.004
0.010
225.0
0.002
0.005
348.3
0.000 250.00 300.00 350.00 nm 400.00 450.00 500.00
0.000 250.00 300.00 350.00 nm 400.00 450.00 500.00
Malvinidina-3-O-galactsido
0.012
Peonodina-3-O-glucsido
513.3
0.025
0.010 222.6
0.020
280.5
0.008 AU
0.006
AU
274.5
0.015
0.004
300.6 349.5
0.010
0.002
0.005
0.000 250.00 300.00 350.00 nm 400.00 450.00 500.00
324.4
250.00
300.00
350.00 nm
400.00
450.00
500.00
Malvinidina-3-O-glucsido
0.10
Malvinidina-3-O-arabinsido
524.2
0.030
0.08
0.025
AU
AU
0.06
278.1
0.020
278.1
0.015
0.04
0.010
0.02
348.3
0.00 250.00 300.00 350.00 nm 400.00 450.00 500.00
0.005
347.1
0.000 250.00 300.00 350.00 nm 400.00 450.00 500.00
Al no tener patrones de los antocianos, la propuesta de identificacin de cada antociano se ha realizado mediante una comparacin con los datos de la bibliografa. Esto queda expuesto en la tabla 5.10.
Tabla 5.10: Bibliografa de los antocianos presentes en el mirtilo
Nmero de identificacin 1 2 3 4 5 6 7 8
Identificacin de los antocianos Delfinidina-3Ogalactsido Delfinidina-3-Oglucsido Cianidina-3-Ogalactsido Delfinidina-3-Oarabinsido Cianidina-3-Oglucsido Petunidina-3-Ogalactsido Petunidina-3-Oglucsido Cianidina-3-Oarabinsido
Tian et al (2005) x X X X X X X X
Phenol explorer x X X X X X X X
Daz Garca, Obn,Castellar(2011) X X X X X X X X
Pgina66
9 10 11 12 13 14 Peonodina-3-Ogalactsido Petunidina-3-Oarabinsido Malvinidina-3-Ogalactsido Peonodina-3-Oglucsido Malvinidina-3-Oglucsido Malvinidina-3-Oarabinsido x X X X X X X X X X X X X X X X X X
Para corroborar dicha propuesta se busca cada antociano por espectrometra de masas. El modo de proceder para esa bsqueda es el siguiente: Con el objetivo de obtener una buena resolucin y una buena sensibilidad del cromatgrafo, se va a trabajar en modo SCAN. As mismo, lo primero que se hace es extraer el cromatograma correspondiente a la masa+1 de un determinado compuesto, para ello es importante saber los fragmentos importantes que van a resultar del compuesto en cuestin, ya que puede facilitar la funcin. A veces es ms prctico y fcil buscar un compuesto por el peso de su fragmento mayoritario. Mediante integracin de un pico de dicho cromatograma se obtiene el espectro de un determinado compuesto. Atendiendo al tiempo de retencin obtenido en masas y por comparacin con el tiempo de retencin obtenido en el PDA se queda identificado dicho compuesto. A modo de ejemplo, en la figura 5.10, se expone un esquema de la verificacin del primer antociano de la lista, el delfinidina-3-O-galactsido.
+ Cromatogramaparapm=303.
Pm+1 Pm de de fragmentos fragmentos importantes= 303 y (sin 465. importantes= 303 azcar) y 465. 1
Masa= 464El primer pico tiene un tiempo de

.
retencin=21.054, cotejado con el PDA
500000
465.26 303.16
400000
In te n s ity
300000
60.29 83.17
200000
100000
0 100.00 200.00 300.00 400.00 500.00 m/z 600.00 700.00 800.00 900.00 1000.00
Espectro para la delfinidina-3-O-galactsido. JacintaColladoGonzlez Pgina67
Figura 5.10: Esquema de la verificacin del primer antociano de la lista, la delfinidina-3-O-galactsido
En la tabla 5.11 se presentan los espectros de masas referentes a los antocianos identificados en el mirtilo.
Tabla 5.11: Espectros de masas referentes a los antocianos identificados en el mirtilo.
Nmero de identificacin
Identificacin de los antocianos

500000
Espectro de masas
465.26 303.16
400000
Delfinidina-3-Ogalactsido
Intensity
300000
60.29 83.17
200000
100000
0 100.00 200.00 300.00 400.00 500.00 m/z 600.00 700.00 800.00 900.00 1000.00
465.26
500000
303.16
400000
Delfinidina-3-Oglucsido
Intensity
300000
200000
100000
0 100.00 200.00 300.00 400.00 500.00 m/z 600.00 700.00 800.00 900.00 1000.00
449.23
400000
287.13
300000 Intensity
Cianidina-3-Ogalactsido
200000
100000
0 100.00 200.00 300.00 400.00 500.00 m/z 600.00 700.00 800.00 900.00 1000.00
303.16
300000
435.21
Delfinidina-3-Oarabinsido
Intensity
200000
100000
0 100.00 200.00 300.00 400.00 500.00 m/z 600.00 700.00 800.00 900.00 1000.00
500000
449.23 287.13
400000
Cianidina-3-Oglucsido
Intensity
300000
200000
100000
0 100.00 200.00 300.00 400.00 500.00 m/z 600.00 700.00 800.00 900.00 1000.00
Pgina68
200000
60.29 479.28 317.12
150000 Intensity
Petunidina-3-Ogalactsido
100000
83.17
50000
0 100.00 200.00 300.00 400.00 500.00 m/z 600.00 700.00 800.00 900.00 1000.00
60.29
600000
479.22 317.19
Intensity
400000
Petunidina-3-Oglucsido
83.17 78.12 73.19 101.13 200000
0 100.00 200.00 300.00 400.00 500.00 m/z 600.00 700.00 800.00 900.00 1000.00
287.13
300000
419.25
83.17
Intens ity
Cianidina-3-Oarabinsido
200000
100000
0 100.00 200.00 300.00 400.00 500.00 m/z 600.00 700.00 800.00 900.00 1000.00
250000
60.29 83.17
200000
Intensity
150000
301.23 463.26 78.12
Peonodina-3-Ogalactsido
100000
50000
0 100.00 200.00 300.00 400.00 500.00 m/z 600.00 700.00 800.00 900.00 1000.00
60.29
800000
600000
10
Petunidina-3O-arabinsido
Intensity
400000
449.23 317.19
200000
0 100.00 200.00 300.00 400.00 500.00 m/z 600.00 700.00 800.00 900.00 1000.00
500000
493.24
400000
11
Malvinidina-3O-galactsido
Intensity
300000
60.29
200000
83.17
331.22
100000
0 100.00 200.00 300.00 400.00 500.00 m/z 600.00 700.00 800.00 900.00 1000.00
Pgina69
60.29
600000
Intensity
12
Peonodina-3O-glucsido
400000
301.16
463.26
200000
73.26 83.17 78.18
0 100.00 200.00 300.00 400.00 500.00 m/z 600.00 700.00 800.00 900.00 1000.00
493.31
600000
13
Malvinidina-3O-glucsido
Intensity
400000
331.22
200000
0 100.00
400000
200.00
300.00
400.00
500.00 m/z
600.00
700.00
800.00
900.00
1000.00
463.33
300000
331.15
14
Malvinidina-3O-arabinsido
Intensity
200000
100000
0 100.00 200.00 300.00 400.00 500.00 m/z 600.00 700.00 800.00 900.00 1000.00
A la hora de explicar este grupo de flavonoides por razones de sencillez se hace necesaria unas subdivisiones en funcin del grupo flavonoide principal. Se tienen as varios grupos: las delfinidinas (Df), las cianidinas (Ci), las petunidinas(Pt), peonidinas (Pn) y las malvidinas (Mv). Las delfinidinas glicosiladas identificadas son tres: la Df-3-O-galactsido, Df-3O-glucsido y el Df-3-O-arabinsido. Estos tres compuestos tienen en comn la seal de un fragmento importante (m/z 303) debido a la estructura flavonoide. Incluso los dos primeros antocianos tambin coinciden en el segundo fragmento importante (m/z 465) ya que los azcares glicosilados a la estructura principal son epmeros (Valls et al, 2009). Por el contrario, la tercera delfinidina vara en el peso total de la estructura final (m/z 435) debido a que el azcar es una pentosa y no como en los casos anteriores que era una hexosa (Valls et al, 2009). Con las cianidinas glicosiladas sucede lo mismo que en el caso anterior, se identifican tres compuestos glicosilados, la Ci-3-O-galactsido, Ci-3-Oglucsido y la Ci-3-O-arabinsido. Coincidiendo los dos primeros en los fragmentos importantes hallados, los cuales son debidos a la estructura principal (m/z 287) y a sta con sus azcares epmeros glicosilados (m/z 449) (Valls et al, 2009). Sin embargo, al igual que ocurre en el caso anterior, la Ci-3O-arabinsido coincide con las molculas anteriores en la estructura principal (m/z 287) pero no en el azcar, ya que de nuevo es una pentosa, lo que genera una seal diferente con una relacin m/z de 419, que se corresponde con su peso molecular ms uno (Valls et al, 2009). En el caso de las petunidinas vuelve a darse la misma relacin que en los casos anteriores, identificndose as dos petunidinas glicosiladas, la Pt-3-Ogalactsido y la Pt-3-O-glucsido, con iguales fragmentos importantes. El primer fragmento origina una seal a m/z de 317, correspondiente a la
Pgina70
estructura flavonoide y el segundo fragmento se corresponde a la estructura completa lo que genera un pico a m/z 479 (Valls et al, 2009). La tercera petunidina identificada es la Pt-3-O-arabinsido, cuyo pico producto de su estructura completa tiene una relacin masa/carga de 449. La otra seal que se ve, como ya se esperaba, es debida a la fragmentacin causada por la hidrlisis del azcar. Esta seal tiene una m/z de 317 (Valls et al, 2009). Las peonidinas identificadas son dos: Pn-3-O-galactsido y Pn-3-O-glucsido, los cuales presentan los mismos fragmentos importantes como resultado de que los azcares glicosilados en ambos casos son epmeros. Los fragmentos importantes se dan tienen una relacin masa/carga a 301(sin azcar) y a 463 (estructura completa) (Valls et al, 2009). El ltimo subgrupo es el de las malvidinas, resultando estar formado de tres compuestos glicosilados, los cuales son Mv-3-O-galactsido, Mv-3-O-glucsido y Mv-3-O-arabinsido. Los tres presentan un fragmento comn debido a la hidrlisis del azcar generando as una seal con una relacin m/z de 331. Los dos primeros compuestos coinciden en la seal producida por la estructura completa (493) debido a que los azcares glicosilados son epmeros (Valls et al, 2009). Mientras que el Mv-3-O-arabinsido muestra un pico con m/z 463 como resultado de la estructura completa del compuesto (Valls et al, 2009).
Flavonoles presentes en el mirtilo Para identificar los flavonoles presentes en el mirtilo se mira el cromatograma obtenido con el detector de fotodiodos (PDA) a una absorbancia de 360 nm. El resultado obtenido se comprueba con la bibliografa disponible y con los patrones analizados en el departamento, posteriormente se corrobora dicha identificacin con el espectro de masas obtenido para cada flavonol. En la figura 5.11 se muestra el perfil cromatogrfico de los flavonoles presentes en el mirtilo relacionado con los espectros de absorbancia originados por cada flavonol.
360
0.04
Antocianinas 3 4 1
2
AU
0.02
0.00
10.00
20.00
313.7
30.00 Minutes
40.00
50.00
60.00
0.030
232.0
0.020
A U
0.010
258.0
356.6 357.8 360.7 418.8 444.2 447.8 470.8 472.0 506.0 496.3525.4 513.3 524.2
254.4 255.6
0.000
-0.010
250.00
300.00
350.00 nm
400.00
450.00
500.00
Figura 5.11: Perfil de los flavonoles presentes en el mirtilo relacionado con sus espectros de absorbancia
correspondientes.
Pgina71
En la tabla 5.12 se realiza la propuesta de identificacin de los flavonoles presentes en el mirtilo, para la identificacin se atiende al tiempo de retencin.
Tabla 5.12: Propuesta de identificacin de los flavonoles presentes en el mirtilo.
1 2 3 4
Tiempo de retencin (min) 30,834 38,909 39,164 40,126
Identificacin de los flavonoles Miricetina Quercetina Quercetina-3-O-galactsido Quercetina-3-O-glucurnico
Tabla 5.13: Espectros de los flavonoles escalados presentando la misma absorbancia a 360 nm.
Miricetina
222.6
0.010 0.002 0.001
Quercetina
360.7 255.6
0.008
258.0
356.6
0.000
418.8
-0.001 AU -0.002 -0.003
AU
0.006
0.004
0.002
524.2 439.4 481.7493.9509.6 524.2

-0.004
0.000 250.00 300.00 350.00 nm 400.00 450.00 500.00
-0.005 250.00 300.00 350.00 nm 400.00 450.00 500.00
Quercetina-3-O-galactsido
0.040
Quercetina-3-O-glucurnico
0.005
313.7 229.7
361.7 254.4
0.030
0.000
AU
AU
0.020
-0.005
0.010
-0.010
0.000 250.00 300.00 350.00 nm 400.00
450.2 468.4
450.00
499.9
500.00
-0.015 250.00 300.00 350.00 nm 400.00 450.00 500.00
Pgina72
La bibliografa estudiada identifica en el mirtilo los siguientes flavonoles, esto se presenta en la tabla 5.14.
Tabla 5.14: Bibliografa de los flavonoles presentes en el mirtilo
Flavonoles
Kaempferol Kaempferol-3-O-glucsido Miricetina Miricetina-3-glucsido Miricetina-3-arabinsido Miricetina-3-rhamnsido Quercetina Quercetina-3-acetilrhamnsido Quercetina-3-arabinsido Quercetina-3-galactsido Quercetina-3-glucsido Quercetina-3-xilsido
Phenol explorer X X X X X X X X X X X
Daz Garca, Obn,Castellar (2011) X X X X X -
Para verificar dicha propuesta se recurre a la espectrometra de masas. Los distintos espectros de masas quedan recogidos en la tabla 5.15. Atendiendo al tiempo de retencin obtenido en masas y por comparacin con el tiempo de retencin obtenido en el PDA quedan identificados dichos compuestos.
Tabla 5.15: Espectros de masas de los flavonoles encontrados en el mirtilo.
Identificacin de los flavonoles

150000
Espectro de masas
319.18
Miricetina
In te n s ity
100000 73.19 50000
0 100.00 200.00 300.00 400.00 500.00 m/z 600.00 700.00 800.00 900.00 1000.00
60.29
600000
Quercetina
In te n s ity
400000
200000
73.19 96.21141.24
100.00 200.00
303.09 276.09
300.00 400.00 500.00 m/z 600.00 700.00 800.00 900.00 1000.00
Pgina73
60.29
200000
303.16
150000
Quercetina-3O-galactsido
Intens ity
100000 50000 81.11
141.03 170.30199.04 85.85 147.02

100.00 200.00 300.00 400.00
465.26
0 500.00 m/z 600.00 700.00 800.00 900.00 1000.00
300000
60.29 83.17
Intensity
200000
Quercetina-3O-glucurnico
303.16
100000 59.3684.37
77.07118.24 55.30 78.25 203.46

100.00 200.00
333.14 304.22
300.00 400.00
479.22
500.00 m/z 600.00 700.00 800.00 900.00 1000.00
Por razones estructurales se hace preciso hacer una subdivisin a la hora de explicar los flavonoles presentes en el mirtilo. En la primera subclase entra la miricetina, este flavonol presenta un pico importante producto de la estructura completa del compuesto (m/z 319). En su espectro se ven tambin otros picos pequeos generados por las sucesivas rupturas que van teniendo lugar en el proceso con el electrospray (Lin and Harnly, 2007). En la otra subclase entran las tres quercetinas. La quercetina presenta un pico importante debido a la estructura total del compuesto cuya masa +1 es 303. Se ven otros picos pequeos generados por la sucesiva fragmentacin del compuesto (Cho, Howard et al, 2005). En el espectro de la quercetina-3-O-galactsido se ven dos picos importantes, el pico base correspondiente a la masa+1 de la estructura flavonoide (302 umas), el segundo pico es el correspondiente a la estructura completa del compuesto (464 umas) (Cho, Howard et al, 2005). En el espectro de la quercetina-3-O-glucurnico se pueden ver dos picos importantes. El primero, producto de la estructura flavonoide, corresponde a la seal obtenida a una relacin m/z de 303 y el segundo es generado por la estructura molecular completa (478 umas) (Cho, Howard et al, 2005).
cidos hidroxibenzicos presentes en el mirtilo El perfil cromatogrfico de absorcin para los hidroxibenzicos se identifica a una absorbancia de 260 nm. La propuesta de identificacin de los cidos hidroxibenzicos en esta fruta se realiz atendiendo fundamentalmente al tiempo de retencin en que aparecan los picos de los patrones en los cromatogramas, a sus espectros en ultravioleta visible y a sus espectros en masas. A continuacin, en la figura 5.12, se muestra el perfil de los cidos hidroxibenzicos presentes en el mirtilo relacionado con los espectros de absorbancia originados por cada uno de ellos.
Pgina74
0.40
c. hidroxicinmico
AU 0.20
Antocianinas Flavonoles
260
3
10.00 15.00 20.00 25.00 Minutes 30.00 35.00 40.00 45.00
0.00 5.00
0.08
268.6
0.06
A U
259.2
0.04
254.4 295.9
0.02
0.00 250.00 300.00
368.3 364.7
350.00 nm
429.7443.0 459.9 476.9 496.3508.4 400.8 482.9498.7524.2 406.8408.0 430.9 449.0 519.4
400.00 450.00 500.00
Figura 5.12: Perfil de los cidos hidroxibenzicos presentes en el mirtilo relacionado con los espectros de absorbancia originados por cada uno de ellos.
La propuesta realizada para los cidos hidroxibenzicos presentes en el mirtilo se ofrece en la tabla 5.16. Esta propuesta se realiz atendiendo fundamentalmente al tiempo de retencin en que aparecan los picos de los patrones en los cromatogramas y a sus espectros en ultravioleta visible.
Tabla 5.16: Propuesta realizada para los cidos hidroxibenzicos presentes en el mirtilo
Tiempo de retencin (min)
4,786 8,395 10,681
Identificacin de los cidos hidroxibenzicos cido glico cido protocatequico (cido 3,4-dihidroxibenzico) cido 4-hidroxibenzico-4glucsido
A modo de comparar la forma de los distintos espectros de absorbancia obtenidos, se adjunta la tabla 5.17 en la que se muestran los espectros escalados presentando la misma absorbancia a 260 nm.
Tabla 5.17: Espectros escalados de los cidos hidroxibenzicos del mirtilo a una de absorbancia a 260 nm
cido glico
0.08
cido procatequico (cido 3,4-dihidroxibenzico)

0.06
0.10
268.6
259.2
AU 0.05
0.02 AU 0.04
295.9
0.00 250.00 300.00
347.1 364.7 386.3 406.8

350.00 nm 400.00
449.0 469.6482.9 510.8

450.00 500.00
0.00 250.00 300.00 350.00 nm
408.0
400.00
458.7 478.1 508.4524.2

450.00 500.00
Pgina75
cido 4-hidroxibenzico-4-glucsido
0.04
254.4
A U
0.02
0.00
439.4 459.9 481.7 507.2524.2
250.00
300.00
350.00 nm
400.00
450.00
500.00
Los cidos hidroxibenzicos identificados en el mirtilo segn la bibliografa quedan plasmados en la tabla 5.18.
Tabla 5.18: Bibliografa de los cidos hidroxibenzicos identificados en el mirtilo.
cido 4-hidroxibenzico-4glucsido cido glico-4-glucsido cido 3,4-dihidroxibenzico-4glucsido cido glico cido elgico cido 4-hidroxibenzico cido 3,4-dihidroxibenzico
USDA X X X -
Daz Garca, Obn,Castellar (2011) X X X X
Para verificar la propuesta realizada se recurre a la espectrometra de masas. Los respectivos espectros de masas se pueden ver en la tabla 5.19. Atendiendo al tiempo de retencin obtenido en masas y por comparacin con el tiempo de retencin obtenido en el PDA se quedan identificados dichos compuestos.
Tabla 5.19: Espectros de masas de los respectivos cidos hidroxibenzicos.
Identificacin de los hidroxibenzicos

1.4x106 1.2x106 1.0x106 8.0x105 6.0x105 4.0x105
Espectro de masas
129.93
cido glico
Intensity
103.02
2.0x105
171.06
213.79
0.0 50.00
100.00
150.00
200.00 m/z
250.00
300.00
350.00
400.00
83.05
400000
300000
In te n s ity
200000
60.24
100000
126.68 127.52 103.02 73.94 101.89104.16 114.33 72.15 115.68 154.70

100.00 150.00
203.26
200.00
252.27 229.16 253.28 240.97 260.35

250.00 300.00
364.19
350.00
0 m/z
Pgina76
60.24
1.0x106
cido 4hidroxibenzico-4glucsido
Intensity
5.0x105
100.94
0.0 100.00 200.00 m/z
300.92 318.97
300.00 400.0
En el espectro del cido glico es importante destacar su in molecular, que es171.6. Los otros dos picos no se sabe con exactitud a qu son debidos aunque se supone que el pico obtenido a una relacin de masa m/z 129.9 es producto de la apertura del anillo seguido de unas posteriores fragmentaciones. El segundo espectro presenta varios picos de los cuales cabe destacar el pico de 154.7, debido al peso molecular del cido 3,4-dihidroxibenzico. Otra seal que podra ser importante es el pico con una relacin m/z 127.5 obtenido tambin en el patrn aunque no se termina de conocer la fragmentacin que lo genera. El tercer espectro es el correspondiente al cido 4-hidroxibenzico-4-glucsido, este espectro es ms sencillo a la hora de interpretar. La seal de m/z 300 es debida a su M+1 y la seal de 318 debe ser producida por la formacin de un puente de hidrgeno con una molcula de agua.
cidos hidroxicinmicos presentes en el mirtilo El perfil cromatogrfico de absorcin para los cidos hidroxicinmicos se identifica a una absorbancia de 320 nm. En la figura 5.13 se muestra el perfil de los cidos hidroxicinmicos presentes en el mirtilo relacionado con los espectros de absorbancia originados por cada uno de los cidos. 2 1
10.00
0.25
0.20 AU
Flavonoles
320
0.10
0.00 20.00
326.8
30.00 Minutes
40.00
50.00
0.20
0.15 A U
241.5
0.10
314.9
0.05
232.0 412.8426.1439.4453.9
250.00 300.00 350.00 nm 400.00 450.00
0.00
502.3 521.8
500.00
Figura 5.13: Perfil de los cidos hidroxicinmicos presentes en el mirtilo relacionado sus respectivos espectros de absorbancia.
La propuesta realizada para los cidos hidroxicinmicos presentes en el mirtilo se adjunta en la tabla 5.20. Esta propuesta se realiz atendiendo fundamentalmente al tiempo de retencin en que aparecan los picos de los patrones en los cromatogramas y a sus espectros en ultravioleta visible. JacintaColladoGonzlez Pgina77
Tabla 5.20: Propuesta de los cidos hidroxicinmicos presentes en el mirtilo.
Nmero de identificacin 1 2
12,670 14,471
Identificacin de los cidos hidroxicinmos cido cafico-3-glucsido Clorognico (cido 3 - O cafeoilquinico)
Con el objetivo de comparar la forma de los distintos espectros de absorbancia obtenidos, se muestra en la tabla 5.21 en la que se muestran los espectros escalados presentando la misma absorbancia a 320 nm.
Tabla 5.21: Espectros escalados de los cidos hidroxicinmicos presentando la misma absorbancia a 320 nm.
cido cafico-3-glucsido
314.9
1.20
0.30
Clorognico
325.6
1.00 0.80
232.0
AU 0.20
241.5
AU
0.60 0.40 0.20
0.10
0.00 250.00 300.00 350.00 nm 400.00 450.00
516.9
500.00
0.00 250.00 300.00 350.00 nm 400.00 450.00 500.00
Los hidroxicinmicos identificados por la expuestos en la tabla 5.22.
bibliografa estudiada quedan
Tabla 5.22: Bibliografa para los cidos hidroxicinmicos presentes en el mirtilo.
cido hidroxicinmico
cido cafico cido p-cumrico cido ferlico cido p-cumrico-glicsido clorognico sinpico
Jakobek, L. (2007)
X X X -
Daz Garca, Obn,Castellar (2011)

X X X
Con el fin de comprobar que dicha propuesta es acertada se procede a examinar los espectros de masas recogidos en la tabla 5.23.
Tabla 5.23: Espectros de masas de los cidos hidroxicinmicos encontrados en el mirtilo.
cido hidroxicinmico
83.05
1.6x106 1.4x106 1.2x106
Espectro de masas
cido cafico3-glucsido
Intensity
1.0x106 8.0x105 6.0x105 4.0x105 2.0x105 0.0 50.00
180.84
343.00
100.00
150.00
200.00 m/z
250.00
300.00
350.00
400.00
Pgina78
163.05
Clorognico
400000
200000
83.17 60.29
355.16
0 100.00 200.00 300.00 400.00 500.00 m/z 600.00 700.00 800.00 900.00 1000.00
El espectro debido al cido cafico-3-glucsido presenta dos picos importantes, el in molecular correspondiente a su M+1 (343) y el pico a m/z 180.8, producto de la hidrlisis del azcar (Abad-Garca et al, 2009). El espectro del clorognico muestra dos seales importantes, el pico base que es producto de la prdida de la parte alcohlica del ster originando as esa seal a m/z 163 (Abad-Garca et al, 2009). El segundo pico obtenido es el in molecular que se corresponde con su M+1 (355).
Flavanoles presentes en el mirtilo El perfil cromatogrfico de absorcin para los flavanoles se identifica a una absorbancia de 280 nm. La propuesta de identificacin del flavanol presente en esta fruta se realiz atendiendo fundamentalmente al tiempo de retencin en que aparecan los picos de los patrones de los flavanoles en los cromatogramas, a sus espectros en ultravioleta visible y a sus espectros en masas. En la figura 5.14 se muestra el perfil cromatogrfico del flavanol presente en el mirtilo relacionado con su espectro de absorbancia.
Hidroxicinmicos
0.60
280
hidroxibenzicos
AU 0.40
0.20
1
0.00 2.00 4.00 6.00 8.00 Minutes 10.00 12.00 14.00 16.00
0.003 0.002 0.001 A U 0.000 -0.001 -0.002 -0.003
221.5
279.3
354.2
430.9
456.3472.0
493.9
525.4
250.00
300.00
350.00 nm
400.00
450.00
500.00
Figura 5.14: Perfil del flavanol presente en el mirtilo relacionado con su espectro de absorbancia.
Como se puede apreciar el flavanol presenta una absorbancia casi inapreciable en UV Visible. Este tipo de compuestos es apreciable en fluorescencia. Esta propuesta se plasma en la tabla 5.24, dicha identificacin se realiz atendiendo fundamentalmente al tiempo de retencin en que aparecan los picos de los patrones
Pgina79
en los cromatogramas, un poco a sus espectros en ultravioleta visible y sobre todo por su espectro de masa.
Tabla 5.24: Propuesta de identificacin de la catequina presente en el mirtilo.
Nmero de identificacin 1
11,796
Identificacin de los flavanoles Catequina
A continuacin, los flavanoles identificados por la bibliografa estudiada quedan expuestos en la tabla 5.25.
Tabla 5.25: Bibliografa de los flavanoles presentes en el mirtilo.
cido hidroxicinmico
Catequina Epicatequina Galocatequina Epigalocatequina
USDA
X X X X
Daz Garca, Obn,Castellar (2011)

X X X
Con el fin de mostrar que dicha propuesta es la correcta se adjunta la tabla 5.26 en la que se expone su espectro de masas.
Tabla 5.26: Espectro de masas de la catequina presente en el mirtilo.
Flavanol
140000.0
Espectro de masas
83.05
120000.0
100000.0
64.15
Intensity 80000.0
Catequina
101.82
60000.0
40000.0
84.12
126.80 109.01
214.23
290.78
20000.0
0.0 50.00
100.00
150.00
200.00 m/z
250.00
300.00
350.00
400.00
En este espectro se puede ver el in molecular que se corresponde con la M+1 de la catequina (291). El resto de picos son fruto de las prdidas sucesivas que ha ido sufriendo la molcula aunque no se pueden explicar con exactitud(Lin and Harnly, 2007). Se propone la utilizacin de un detector de fluorescencia para corroborar la presencia de este compuesto. El resveratrol en el mirtilo El perfil cromatogrfico de absorcin para el resveratrol se obtiene a una absorbancia de 280 nm, la misma mxima a la que se miran los flavanoles. En la figura 5.15 se puede ver el perfil del estilbeno presente en el mirtilo relacionado con su espectro de absorbancia. Esta propuesta de identificacin se realiz atendiendo fundamentalmente al tiempo de retencin del patrn en el cromatograma, tambin a sus espectros en ultravioleta visible y en masas.
Pgina80
280
0.60 0.40 0.20 0.00 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 Minutes 16.00 18.00 20.00 22.00 24.00 26.00 28.00 30.00
Hidroxicinmicos Hidroxibenzicos
Antocianinas
AU
294.7
0.020 A U
0.010
0.000
369.5 223.8
402.0417.6432.1
466.0
498.7 523.0
-0.010 250.00 300.00 350.00 nm 400.00 450.00 500.00
Figura 5.15: Perfil del resveratrol presente en el mirtilo relacionado con su espectro de absorbancia.
Como se puede ver el resveratrol, al igual que ocurra con la catequina, es prcticamente inapreciable en UV Visible, para verlo bien es necesaria la tcnica de fluorescencia. En la tabla 5.27 se adjunta la identificacin del estilbeno.
Tabla 5.27: Identificacin del estilbeno en el mirtilo
6,580
Identificacin del estilbeno Resveratrol glicosilado (piceido)
En cuanto a la bibliografa estudiada para el resveratrol, Rimando et al(2004) identifican en el mirtilo una cantidad de 768 ng/100g de muestra seca. Segn Trela y Waterhouse, a pesar de que se dan tanto la forma cis como la forma trans del resvertrol, en las bayas slo est presente el trans-resveratrol cuyo crecimiento est estimulado con su exposicin a luz ultravioleta. En la tabla 5.28 se muestra el espectro de masas del resveratrol glicosilado (piceido).
Tabla 5.28: Espectro de masas del resveratrol glicosilado.
Identificacin del estilbeno

600000
Espectro de masas
60.24
500000
400000
Resveratrol glicosilado
Intensity
300000
228.82
200000
100000
0 50.00
100.00
150.00
200.00 m/z
250.00
300.00
350.00
400.00
Como se puede ver en este espectro hay un pico importante que es el que se corresponde con el peso molecular ms uno de la estructura del resveratrol, pero hay que decir que el tiempo de retencin que se ha obtenido dista mucho del obtenido por el patrn, lo que lleva a la conclusin de que el que el compuesto identificado no es el
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resveratrol propiamente dicho sino un glicosilado de dicho compuesto y por motivo de una hidrlisis muy rpida el azcar no aparece en el espectro(Rimando et al, 2004). En la tabla 5.29 se realiza la comparacin del resveratrol glicosilado presente en el mirtilo y del patrn.
Tabla 5.29: Comparativa entre el resveratrol glicosilado presente en el mirtilo y el patrn.
Resveratrol patrn
Tiempo retencin (min) 53,170
2.5x106 2.0x106
Resveratrol glicosilado muestra

600000
228.91
60.24
500000
400000
In te n s it y
Intensity
1.5x106 1.0x106 5.0x105
300000
228.82
200000
100000
0.0 50.00
100.00
150.00
200.00 m/z
250.00
300.00
350.00
400.00
0 50.00
100.00
150.00
200.00 m/z
250.00
300.00
350.00
400.00
La vitamina C en el mirtilo La vitamina C o lo que es lo mismo el cido ascrbico aparece si hacemos un perfil cromatogrfico de absorcin a una longitud de onda de 243 nm. En la figura 5.16 se puede ver el perfil cromatogrfico del cido ascrbico presente en el mirtilo relacionado con su espectro de absorbancia.
2.00 AU
243
1.00
0.00 2.00
0.50
4.00
6.00
8.00
10.00 Minutes
12.00
14.00
16.00
18.00
20.00
237.9
0.40
0.30 A U 0.20 0.10 0.00 250.00 300.00 350.00 nm 400.00 450.00 500.00
Figura 5.16: Perfil cromatogrfico del cido ascrbico presente en el mirtilo relacionado con su espectro de absorbancia.
En la tabla 5.30 se muestra el tiempo de retencin del cido ascrbico presente en el mirtilo en las condiciones de anlisis explicadas anteriormente, muy parecido al que obtuvimos para el patrn (3 minutos).
Pgina82
Tabla 5.30: Identificacin de la vitamina C presente en el mirtilo.
Identificacin
2,978
cido ascrbico
Segn la bibliografa, www.consumer.es, el mirtilo presenta una concentracin de cido ascrbico de12mg/100g producto comestible. Para constatar esto se recurre a la espectrometra de masas cuyo resultado se recoge en la tabla 5.31.
Tabla 5.31: Espectro de masas del cido ascrbico presente en el mirtilo.
Identificacin
500000
Espectro de masas
334.89
400000
Intensity
300000
103.02
cido ascrbico
200000
100000
84.18
100.00
226.79 177.03 215.31 195.95
0 50.00
100.00
150.00
200.00 m/z
250.00
300.00
350.00
400.00
En este espectro el pico a resaltar es su in molecular, obtenido a una m/z de 177. Se piensa que la seal a 195.95 es producto de la captacin de una molcula de agua aunque esta seal no se obtuvo en el patrn. Si comparamos con el espectro de masas del cido ascrbico patrn, se observan en ste muchos ms picos. Esto puede deberse a que el pico que aparece est solapado con otro compuesto desconocido por el momento.
2.2.- Arndano europeo (Cranberry; Vaccinium oxycoccus) La muestra analizada consiste en un zumo concentrado de esta fruta procedente de la casa comercial Grnewald Fruchtsaft. La muestra es analizada en el laboratorio del edificio de Servicio de Apoyo a la Investigacin Tecnolgica, Edificio I+D+I (SAIT). Anteriormente a su anlisis esta muestra se encuentra congelada a -20C en el laboratorio del departamento de Ingeniera Qumica y Ambiental de la UPCT. Antocianos presentes en el arndano Para identificar los antocianos presentes en el arndano se estudia el cromatograma obtenido con el detector de fotodiodos (PDA) a una absorbancia de 520 nm. El resultado obtenido se comprueba con la bibliografa y posteriormente se corrobora dicha identificacin con el espectro de masas obtenido para cada antociano. En la figura 5.17 se muestra el perfil de los antocianos presentes en el arndano europeo relacionado con los espectros de absorbancia originados por cada antociano.
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0.04 AU 0.02 0.00 10.00 20.00
1 2 3
30.00 Minutes 40.00 50.00
520
60.00
515.7
0.04 A U
280.5
0.02
239.1
0.00 250.00
266.3 284.0
300.00
330.4
369.5385.1
440.6
523.0
350.00 nm
400.00
450.00
500.00
Figura 5.17: Perfil de los antocianos presentes en el arndano europeo relacionado con los espectros de absorbancia originados por cada antociano.
La propuesta de identificacin de los antocianos en las frutas rojas se ha realizado mediante la comparacin de los datos obtenidos con los de la bibliografa. A continuacin, en la tabla 5.32, se realiza la propuesta de identificacin de los antocianos presentes en el arndano.
Tabla 5.32: Propuesta de identificacin de los antocianos presentes en el arndano.
Identificacin de los antocianos Cianidina-3-O-galactsido Cianidina -3-O-glucsido Cianidina-3-O-arabinsido
A modo de comparar la forma de los distintos espectros de absorbancia obtenidos, se adjunta la tabla 5.33 en la que se muestran los espectros escalados presentando la misma absorbancia a 520 nm. Los espectros de los picos 2 y 3, al presentar una absorbancia muy baja, estn distorsionados con el rudo del aparato y no se aprecia bien su forma.
Tabla 5.33: Espectros escalados de los antocianos del arndano europeo a una absorbancia a 520 nm.
Cianidina-3-O-galactsido
0.06 0.04 0.02
514.5
223.8
223.8
0.005 AU
512.1 284.0 319.6 339.9 365.9 404.4416.4
280.5
AU
329.2
250.00 300.00 350.00 nm 400.00 450.00 500.00
0.000 250.00 300.00 350.00 nm 400.00 450.00 500.00
Pgina84
Cianidina-3-O-arabinsido
520.6
0.005 AU
225.0
274.5 325.6 350.7 375.5 394.8 427.3
458.7
0.000
250.00
300.00
350.00 nm
400.00
450.00
500.00
Tabla 5.34: Bibliografa de los antocianos en el arndano europeo.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Cianidina-3-Ogalactsido Cianidina-3-Oglucsido Cianidina-3-Oarabinsido Peonidina-3galactsido Peonidina-3arabinsido peonidina-3-Oglucsido malvidina-3-Oarabinsido malvidina-3-Oglucsido Delfinidina-3-Oglucsido Delfinidina-3-Ogalactsido
Borges et al (2010)
X X X X X X -
Andersen (1989)
X X X X X X X X
En la tabla 5.35 se presentan los espectros de masas referentes a los antocianos identificados en el arndano europeo.
Tabla 5.35: Espectros de masas referentes a los antocianos identificados en el arndano europeo.

200000
Espectro de masas
287.20 60.36 449.30
Cianidina-3O-galactsido
In te n s ity
100000
0 100.00 200.00 300.00 400.00 500.00 m/z 600.00 700.00 800.00 900.00 1000.00
Pgina85
449.28 287.19
83.17
Cianidina-3O-glucsido
In ten s ity
20000.0
72.19
0.0 100.00 200.00 300.00 400.00 500.00 m/z 600.00 700.00 800.00 900.00 1000.00
287.22
In te n s ity
419.26
Cianidina-3O-arabinsido
20000.0
72.19
142.04
0.0 100.00 200.00 300.00 400.00 500.00 m/z 600.00 700.00 800.00 900.00 1000.00
Los tres espectros coinciden en el primer pico importante, m/z 287.2, correspondiente a la estructura flavonoide de la cianidina. Diferencindose las tres en el segundo pico importante, el primer y segundo espectros muestran la otra seal importante a una m/z 449.3, ya que este pico es debido al flavonoide glicosilado y en ambos casos los azcares son epmeros. Mientras que en el tercer espectro, la tercera seal caracterstica se obtiene a una m/z de 419.3, producto de la glicosilacin de la cianidina con la arabinosa (Valls et al, 2009).
Flavonoles presentes en el arndano Para identificar los flavonoles presentes en el arndano se estudia el cromatograma obtenido con el detector de fotodiodos (PDA) a una absorbancia de 360 nm. El resultado obtenido se comprueba con la bibliografa disponible y con los patrones analizados en el departamento, posteriormente se corrobora dicha identificacin con el espectro de masas obtenido para cada flavonol. En la figura 5.18 se muestra el perfil de los flavonoles presentes en el arndano relacionado con los espectros de absorbancia originados por cada flavonol.
0.05 AU
2 3
360
0.00 30.00
0.08
35.00
40.00
45.00 Minutes
50.00
55.00
60.00
65.00
255.6 350.7
0.06
A U
0.04
0.02
256.8 256.8 255.6
353.0 348.3367.1 472.0 510.8 456.3475.7484.1 466.0496.3524.2 514.5 498.7496.3
0.00
250.00
300.00
350.00 nm
400.00
450.00
500.00
Figura 5.18: Perfil de los flavonoles presentes en el arndano estudiado relacionado con sus respectivos espectros de absorbancia.
Pgina86
A continuacin, en la tabla 5.36 se realiza la propuesta de identificacin de los flavonoles presentes en el arndano, para la identificacin se atiende al tiempo de retencin.
Tabla 5.36: Propuesta de identificacin de los flavonoles prenetes en el arndano europeo.
1 2 3 4
Identificacin de los flavonoles Quercetina-3-o-glucopiransido Quercetina-3-o-rhamnsido Quercetina-glicsido (n.i.) Quercetina-glicsido(n.i.)
Con el fin de comparar la forma de los distintos espectros de absorbancia obtenidos, se adjunta la tabla 5.37 en la que se muestran los espectros escalados presentando la misma absorbancia a 360 nm.
Tabla 5.37: Espectros de los flavonoles escalados a 360 nm.
Quercetina-3-o-glucopiransido
256.8
0.02
Quercetina-3-o-rhamnsido
256.8
0.08
354.2
351.9
469.6490.2 518.1
AU 0.04 0.02 0.06
AU
0.00
-0.02
250.00
300.00
350.00 nm
400.00
450.00
500.00
0.00 250.00 300.00 350.00 nm 400.00
446.6 481.7497.5 521.8

450.00 500.00
Quercetina-glicsido (n.i.)
0.025 0.020 0.015 AU 0.010 0.005 0.000 250.00 300.00 350.00 nm 400.00 450.00 500.00
Quercetina-glicsido (n.i.)
255.6 373.1
0.015
256.8 351.9
AU
0.010
0.005
521.8 453.9469.6 499.9

0.000 250.00 300.00 350.00 nm 400.00
466.0480.5 496.3
450.00 500.00
La bibliografa estudiada (tabla 5.38) identifica en el arndano los siguientes flavonoles.

Tabla 5.38: Bibliografa de los flavonoles presentes en el arndano estudiado.
Flavonoles
Quercetina-3-O-galactsido Quercetina-3-O-(2-O-xylosyl) piransido Quercetina-3-Oarabinosilfuransido Quercetina-3-O-rhamnsido Miricetina-3-O-galactsido Miricetina-3-arabinsido Quercetina
Borges et al (2010)
X X X X X X -
Phenol explorer
X
Pgina87
Para verificar dicha propuesta se recurre a la espectrometra de masas cuyo resultado se adjunta en la tabla 5.39. Atendiendo al tiempo de retencin obtenido en masas y por comparacin con el tiempo de retencin obtenido en el PDA se quedan identificados dichos compuestos.
Tabla 5.39: Espectros de masas de los flavonoles encontrados en el arndano.

200000
Espectro de masas
303.16
Quercetina-3-oglucopiransido
150000 Intensity
100000
50000
61.29 77.38
304.16 196.17
465.39 487.19
0 100.00 200.00 300.00 400.00 500.00 m/z 600.00 700.00 800.00 900.00 1000.00
303.16
300000
Quercetina-3-orhamnsido
Intensity
200000
83.24 55.37 60.29 100000 71.2085.10 198.29 61.35 304.28 131.86 197.51 287.39
0 100.00 200.00 300.00 400.00 500.00 m/z 600.00 700.00 800.00 900.00 1000.00
449.43
80000.0
101.20 78.25 83.30 303.23
60000.0
84.42 55.37
Quercetinaglicsido (n.i.)
In te n s ity
40000.0
593.29
20000.0
0.0 200.00 400.00 m/z 600.00 800.00 1000.00
141.92
1.2x106 1.0x106
Quercetinaglicsido (n.i.)
In te n s ity
8.0x105
82.95 6.0x105
4.0x105 78.03
302.87 350.92
73.11
2.0x105 0.0 200.00 400.00 m/z 600.00 800.00 1000.00
Los cuatro espectros son de cuatro quercetinas, ya que todos presentan el mismo pico caracterstico del flavonoide sin glicosilar (m/z 303) siendo diferentes el pico resultante de la glicosilacin de este flavonoide. La quercetina-3-O-glucopiransido, presenta el otro pico caracterstico a m/z 465, consecuencia de la glicosilacin con una molcula de glucosa. La quercetina-3-O-rhamnsido muestra el otro pico importante a m/z 449, correspondiente a la glicosilacin del flavonoide con la rhamnosa (Abad-Garca et al, 2009). Los otros dos espectros ofrecen dos picos a parte del debido a la estructura de la quercetina (303), uno a m/z 593 y otro a 350.9. El problema que plantean ambos espectros es la identificacin del azcar glicosilado.
Pgina88
cidos hidroxibenzicos presentes en el arndano europeo El perfil cromatogrfico de absorcin para los hidroxibenzicos se identifica a una absorbancia de 260 nm. A continuacin, en la figura 5.19, se muestra el perfil cromatogrfico de los cidos hidroxibenzicos presentes en el arndano europeo relacionado con los espectros de absorbancia originados por cada uno de ellos.
0.20 AU
1
0.10
Hidroxicinmicos
260
0.00 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 Minutes 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00
0.40
260.3
AU
269.8
0.20
294.7 452.7467.2
250.00 300.00 350.00 nm 400.00 450.00
0.00
507.2
500.00
Figura 5.19: Perfil de los cidos hidroxibenzicos presentes en el arndano europeo relacionado con sus respectivos espectros de absorbancia.
La propuesta realizada para los cidos hidroxibenzicos presentes en esta fruta se ofrece en la tabla 5.40. Esta propuesta se realiz atendiendo fundamentalmente al tiempo de retencin en que aparecan los picos de los patrones en los cromatogramas y a sus espectros en ultravioleta visible y a sus espectros de masas.
Tabla 5.40: Propuesta de identificacin de los cido hidroxibenzicos en el arndano europeo.
1 2
Tiempo de retencin (min) 4,321 8,240
Identificacin de los cidos hidroxibenzicos cido glico cido 3,4-dihidroxibenzico (cido protocatquico)
Con motivo de comparar la forma de los distintos espectros de absorbancia obtenidos se adjunta la tabla 5.41 en la que se muestran los espectros escalados presentando la misma absorbancia a 260 nm.
Tabla 5.41: Espectros escalados de los cidos hidroxibenzicos del arndano europeo a 260 nm.
cido glico
0.30
cido 3,4-dihidroxibenzico (cido protocatquico)
0.12 0.10
269.8
0.20
0.08 AU 0.06 0.04 0.02 0.00 250.00 300.00

AU
260.3
0.10
294.7
364.7
350.00 nm
393.5
400.00
458.7
450.00
482.9
500.00
520.6
0.00 250.00 300.00 350.00
370.7
400.00 nm 450.00
512.1
500.00
Pgina89
Segn Hkkinen, S. (1999), los cidos hidroxibenzicos presentes en el arndano europeo se reducen a un 1.8% de cido elgico. Para verificar la propuesta realizada se recurre a la espectrometra de masas. En la tabla 5.42 quedan plasmados los espectros de los distintos cidos hidroxibenzicos presentes en el arndano europeo. Teniendo en cuenta el tiempo de retencin obtenido en masas y por comparacin con el tiempo de retencin obtenido en el PDA se quedan identificados dichos compuestos.
Tabla 5.42: Espectros de masas de los cidos hidroxibenzicos identificados en esta variedad de arndano.

1.0x106 8.0x105
Espectro de masas
60.24 84.11
129.90
cido glico
In te n s ity
6.0x105 4.0x105 2.0x105 0.0 60.00 80.00 100.00 120.00 140.00 m/z 160.00 180.00 200.00 220.00 240.00
101.05 72.21 73.18 83.14 96.05 78.15 103.07118.94
141.96
170.85
190.01
141.96
300000 Intensity
101.01 118.96
200000
72.15 73.22 96.09 100.00 114.11 102.14 104.28 115.22

100.00 120.00
100000
144.10155.00
140.00 m/z 160.00 180.00
198.73
200.00 220.00 240.00
0 60.00 80.00
Por comparacin con el patrn explicado previamente se deduce que el pico caracterstico del cido glico es su in molecular obtenido a una relacin m/z 170.8. Segn el patrn, el espectro del cido protocatequico (cido 3,4dihidroxibenzico) muestra tres picos caractersticos de esta molcula, sus relaciones m/z son respectivamente 102.1; 141.9 y 155 (in molecluar). El pico base es el obtenido a la relacin m/z 141.96, cuya fragmentacin, al igual que la sufrida para obtener el pico a m/z 102.1, no se sabe muy bien. La explicacin del tercer pico importante es que es su in molecular (Abad-Garca et al, 2009).
cidos hidroxicinmicos presentes en el arndano El perfil cromatogrfico de absorcin para la identificacin de los cidos hidroxicinmicos se obtiene a una absorbancia de 320 nm. En la figura 5.20 se muestra el perfil de los cidos hidroxicinmicos en relacin con sus respectivos espectros de absorbancia.
Pgina90
1
0.20 AU
Antocianinas
Flavonoles
320
0.10
2
10.00 20.00
319.6 221.5
3 4
30.00 Minutes 40.00 50.00 60.00
0.00
0.15
0.10
A U
0.05
278.1 230.9 255.6
311.3 326.8 339.9 498.7 515.7 466.0 418.8 438.2446.6467.2473.2 502.3525.4 524.2 369.5377.9393.5 422.5 449.0461.1480.5492.6510.8 399.6 420.1 496.3 402.0
400.00 nm 450.00 500.00
0.00
250.00
300.00
350.00
Figura 5.20: Perfil cromatogrfico de los cidos hidroxicinmicos presentes en el arndano europeo relacionado con sus respectivos espectros de absorbancia.
La propuesta realizada se ofrece en la tabla 5.43. Dicha propuesta se realiz atendiendo fundamentalmente al tiempo de retencin en que aparecan los picos de los patrones en los cromatogramas y a sus espectros en ultravioleta visible y a sus espectros en masas.
Tabla 5.43: Propuesta de identificacin de los cidos hidroxicinmicos presentes en el arndano europeo.
1 2 3 4
Identificacin de los cidos hidroxicinmos Clorognico (cido 3 - O cafeoilquinico) cido cafico cido p-cumrico cido cinmico
Tabla 5.44: Espectros escalados de los cidos hidroxicinmicos encontrados en el arndano europeo presentando la misma absorbancia a 320 nm.
Clorognico
0.30 0.25 0.20 0.15 0.10 0.05 0.00 250.00 300.00 350.00 nm 400.00 450.00 500.00
cido cafico
328.0
0.00
320.8
260.3
-0.10 AU -0.20
AU
524.2
-0.30
250.00
300.00
350.00 nm
400.00
450.00
500.00
Pgina91
cido p-cumrico
0.040
cido cinmico
278.1
0.10
311.3
0.030
0.08
0.06
AU 0.020
227.3
AU 0.04 0.02
402.0418.8433.3 456.3468.4
250.00 300.00 350.00 nm 400.00 450.00
0.010
0.000
496.3 516.9
500.00
0.00 250.00 300.00 350.00
370.7 389.9
400.00 nm
438.2 456.3
450.00
502.3 523.0
500.00
Los hidroxicinmicos identificados por la bibliografa estudiada quedan expuestos en la tabla 5.45.
Tabla 5.45: Bibliografa para los cidos hidroxicinmicos presentes en el arndano europeo.
cido hidroxicinmico
cido p-cumrico cido cafico cido ferlico CClorognico cido p-cumrico-hexsido
Borges et al (2010)
X X
Hkkinen,S. (1999)
X X X -
Phenol explorer
X -
Con el fin de comprobar que dicha propuesta es correcta se procede a examinar los espectros de masas recogidos en la tabla 5.46.
Tabla 5.46: Espectros de masas de los cidos hidroxicinmicos identificados en el arndano estudiado.
cido hidroxicinmico
1.0x106
Espectro de masas
100.97 95.98
8.0x105
162.87
Intensity
6.0x105
118.85 83.01 144.75
Clorognico
4.0x105
2.0x105
90.99 146.91 141.86 137.06 131.95
354.42
0.0 100.00 200.00 300.00 400.00 500.00 m/z 600.00 700.00 800.00 900.00 1000.00
85.07
1.0x106 Intens ity
cido cafico
5.0x105
144.92 126.90 162.96 97.01 122.92 69.18 203.91 108.93

100.00 150.00 200.00 m/z
60.14
284.92 306.93324.93
0.0 50.00
250.00
300.00
350.00
400.00
800000
600000
cido p-cumrico
Intensity
400000
141.86
200000
103.52
146.84 198.46
0 100.00 200.00 300.00 400.00 500.00 m/z 600.00 700.00 800.00 900.00 1000.00
Pgina92
80000.0
83.11 148.94
320.93
60000.0 Intensity
cido cinmico
40000.0
130.75
20000.0
0.0 50.00
100.00
150.00
200.00 m/z
250.00
300.00
350.00
400.00
El espectro del clorognico muestra dos seales importantes, el pico base que es producto de que se pierde la parte alcohlica del ster originando as esa seal a m/z 163. El segundo pico obtenido es el in molecular que se corresponde con su M+1 (354.4) (Abad-Garca et al, 2009). El espectro correspondiente al cido cafico presenta dos picos caractersticos, uno cuya m/z es 162.9 producto de la eliminacin de una molcula de agua de este flavonoide. El otro pico importante es el obtenido a una m/z 144.9, debido a la prdida de otra molcula de agua (Abad-Garca et al, 2009).El pico que se ve a m/z 324.9 debe ser el resultado de la formacin de un aducto. Pensamos que se trata del cido cafico porque coincide con el tiempo de retencin del patrn. El espectro del cido p-cumrico muestra una seal caracterstica de este hidroxicinmico. Dicha seal es el resultado de la prdida de una molcula de agua (m/z 146.8) (Abad-Garca et al, 2009). El espectro de masas del patrn analizado tampoco muestra la seal de su masa +1 (166) e igualmente presenta un pico a 146.9. Por ltimo, al mirar la tabla 5.47 para comparar el espectro del cido cinmico aqu obtenido con el obtenido por el patrn se ve claramente que ofrece dos picos caractersticos, uno debido al M+1 de este cido (m/z 148.9) y el otro se debe a la prdida de una molcula de agua (m/z 130.7). El ltimo pico, m/z 320.9 debe ser el resultado de la formacin de un dmero.
Tabla 5.47: Comparativa de los espectros de masas del cido cinmico patrn y el que se encuentra en el arndano estudiado.
Cinmico arndano
80000.0
Cinmico patrn
320.93
189.84 148.86
100000.0
83.11 148.94
60000.0
80000.0
In te n s ity
40000.0
Intensity
60000.0
368.73
130.75
20000.0
40000.0
79.94
130.77
213.72 251.76 397.64 259.10
20000.0
0.0 50.00
100.00
150.00
200.00 m/z
250.00
300.00
350.00
400.00
0.0 50.00
100.00
150.00
200.00 m/z
250.00
300.00
350.00
400.00
Flavanoles presentes en el arndano europeo El perfil cromatogrfico de absorcin para los flavanoles se identifica a una absorbancia de 280 nm. En la figura 5.21 se muestra el perfil de los flavanoles presentes en el arndano relacionado con sus espectros de absorbancia.
Pgina93
hidroxibenzicos
Hidroxicinmicos
0.10 AU
Antocianinas
280
2
0.00 5.00 10.00 15.00 Minutes 20.00 25.00 30.00
0.15
A U
0.10
0.05
278.1 279.3 314.9

300.00 350.00 nm
0.00 250.00
368.3 383.9 402.0

400.00
426.1 433.3
450.00
474.5489.0
500.00
518.1
Figura 5.21: Perfil de los flavanoles presentes en esta variedad de arndano relacionado con sus respectivos espectros de absorbancia.
Como se puede ver la epicatequina presenta una absorbancia casi inapreciable en UV Visible, cosa que era de esperar ya que este tipo de compuestos es apreciable visualmente en fluorescencia. La sorpresa es que la catequina s que se consigue visualizar en esta longitud de onda (posiblemente se encuentre en alta concentracin). La propuesta recogida en la tabla 5.48 se realiz atendiendo fundamentalmente al tiempo de retencin en que aparecan los picos de los patrones en los cromatogramas, un poco a sus espectros en ultravioleta visible y sobre todo por su espectro de masa.
Tabla 5.48: Propuesta de los flavanoles presentes en el arndano europeo.
12,790 19,295
Identificacin de los flavanoles Catequina Epicatequina
Con el objetivo de comparar la forma de los distintos espectros de absorbancia obtenidos, se adjunta la tabla 5.49 en la que se muestran los espectros escalados presentando la misma absorbancia a 280 nm.
Tabla 5.49: Espectros escalados de los flavanoles del arndano europeo a una misma absorbancia de 280 nm.
Catequina
0.08
0.25 0.20
Epicatequina
0.06
0.15 AU
0.10
278.1
0.05
AU
0.04
0.02
280.5
490.2
0.00
250.00 300.00 350.00 nm 400.00 450.00 500.00
0.00
318.5
250.00 300.00 350.00 nm 400.00
420.1
446.6 469.6 489.0

450.00 500.00
525.4
A continuacin, se muestran los flavanoles identificados por la quedan expuestos en la tabla 5.50.
bibliografa,
Pgina94
Tabla 5.50: Bibliografa para los flavanoles en el arndano europeo.
cido hidroxicinmico
Epicatequina
Borges et al (2010)
X
Phenol explorer
X
Con el fin de mostrar que dicha propuesta es la correcta expone su espectro de masas en la tabla 5.51:
Tabla 5.51: Espectro de masas de los flavanoles hallados en esta variedad de arndano.
Flavanol
101.01
600000 Intensity
Espectro de masas
Catequina
400000
83.11 139.02 291.05 197.60

150.00 200.00 m/z 250.00 300.00 350.00 400.00
200000
78.13
0 50.00
122.87 114.39
100.00
140.89
101.01
600000 Intensity
Epicatequina
400000
83.11 139.02 291.05 197.60

150.00 200.00 m/z 250.00 300.00 350.00 400.00
200000
78.13
0 50.00
122.87 114.39
100.00
140.89
En ambos casos se obtiene el mismo espectro ya que son epmeros. Se puede ver un pico importante a m/z 291.05 correspondiente a su M+1. Otro pico importante es el obtenido a m/z 139.02, producto de la fractura de la molcula por el anillo B (fragmento que contiene al anillo A). El otro pico importante es el que se ve a m/z 122.8 y es el producto de la fractura por el anillo B conteniendo al anillo C (AbadGarca et al, 2009).
Fragmento de m/z 139.02 A B
C Fragmento de m/z 122.8
Figura5.22:Estructuradelaepicatequina
El resveratrol en el arndano El perfil cromatogrfico de absorcin para el resveratrol se obtiene a una absorbancia de 280 nm, la misma mxima a la que se estudian los flavanoles.En la figura 5.23 se muestra el perfil de este estilbeno presente en en el arndano europeo relacionado con su espectro de absorbancia.
Pgina95
Esta propuesta de identificacin se realiz atendiendo fundamentalmente al tiempo de retencin del patrn en el cromatograma de absorcin, a sus espectros en ultravioleta visible y en masas.
Hidroxibenzicos
Hidroxicinmicos
0.20 AU
Antocianinas
280
0.00 2.00
0.08 0.06 A U 0.04 0.02 0.00 250.00 300.00 350.00 nm
4.00
6.00
8.00
10.00
12.00
14.00
16.00 Minutes
18.00
20.00
22.00
24.00
26.00
28.00
30.00
295.9
230.9 371.9 492.6506.0 403.2 424.9 449.0 473.2

400.00 450.00 500.00
Figura 5.23: Perfil cromatogrfico del resveratrol presente en el arndano estudiado relacionado con su espectro de absorbancia.
Como se puede ver, el resveratrol, al igual que ocurra con la epicatequina, es prcticamente inapreciable en UV Visible, para verlo bien es necesaria la tcnica de fluorescencia. El proponer la presencia de resveratrol en el arndano se realiz fundamentalmente teniendo en cuenta el tiempo de retencin al que sala el pico del patrn en el cromatograma durante su anlisis, un poco a sus espectros en ultravioleta visible y sobre todo por su espectro de masa. La identificacin del resveratrol en este tipo de arndano se puede ver en la tabla 5.52.
Tabla 5.52: Propuesta de identificacin del resveratrol en el arndano europeo.
6,570
Identificacin del estilbeno Resveratrol glicosilado
En cuanto a la bibliografa estudiada para el resveratrol, Trela y Waterhouse afirman que a pesar de que se dan tanto la forma cis como la forma trans del resvertrol, en las bayas slo est presente el trans-resveratrol cuyo crecimiento est estimulado con su exposicin a luz ultravioleta. Segn el phenol explorer, el arndano europeo contiene 1.92 mg/100g de peso fresco. A continuacin, en la tabla 5.53, se muestra el espectro de masas del resveratrol glicosilado (piceido).
Tabla 5.53: Espectro de masas del resveratrol presente en el arndano europeo.

800000 60.24 600000
Espectro de masas
228.97
Intensity
400000
200000
0 50.00
100.00
150.00
200.00 m/z
250.00
300.00
350.00
400.00
Pgina96
Como se puede ver en este espectro hay un pico importante que es el que se corresponde con el M+1 de la estructura del resveratrol, pero hay que decir que el tiempo de retencin que se ha obtenido dista mucho del obtenido por el patrn, lo que lleva a la conclusin de que el que el compuesto identificado no es el resveratrol propiamente dicho sino un glicosilado de dicho compuesto y por motivo de una hidrlisis muy rpida el azcar no aparece en el espectro (Rimando et al, 2004). La comparativa entre el patrn y el estilbeno encontrado en esta variedad de arndano se puede ver muy bien en los espectros de la tabla 5.54.
Tabla 5.54: Comparativa entre el resveratrol glicosilado encontrado en este tipo de arndano y el patrn.
Resveratrol patrn tiempo retencin (min) 53,170

2.5x106 2.0x106 1.5x106 1.0x106 5.0x105
Resveratrol muestra (min) tiempo retencin (min) 6,570

800000 60.24
228.91
228.97
600000 Intens ity
In ten s ity
400000
200000
0.0 50.00
100.00
150.00
200.00 m/z
250.00
300.00
350.00
400.00
0 50.00
100.00
150.00
200.00 m/z
250.00
300.00
350.00
400.00
La vitamina C en el arndano La vitamina C se observa representando un perfil cromatogrfico de absorcin a una longitud de onda de 243 nm, tal y como se puede ver en la figura 5.24.
1.00 AU
243 1
2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 Minutes 12.00 14.00 16.00 18.00
0.50
0.00
232.0
A U
0.005
285.2
0.000 250.00 300.00
338.7
350.00
374.3
403.2
400.00
427.3
450.00
468.4
525.4 492.6509.6
500.00
nm
Figura 5.24: Perfil cromatogrfico del cido ascrbico encontrado en el arndano europeo relacionado con su espectro de absorbancia.
A continuacin, en la tabla 5.55, se muestra el tiempo de retencin del cido ascrbico presente en el arndano europeo en las condiciones de anlisis explicadas anteriormente.
Pgina97
Tabla 5.55: Identificacin del cido ascrbico presente en este tipo de arndano.
Identificacin
2,964
cido ascrbico
Segn la bibliografa, www.consumer.es, el arndano muestra una concentracin de cido ascrbico de17mg/100g producto comestible. Aunque Borges et al (2010) afirman que el arndano europeo contiene 19.48mg/100g de producto. Tal y como se ve en la tabla 5.56, por espectrometra de masas se muestra la presencia del cido ascrbico en la muestra tomada.
Tabla 5.56: Espectro de masas de la vitamina C en el arndano europeo.
Identificacin
3x106
Espectro de masas
59.15
In te n s ity 2x106 1x106 0 100.00 150.00 200.00 m/z 250.00 300.00 350.00 400.00
cido ascrbico
84.08 99.97 172.84 101.90 190.79 124.83 114.79 142.79 176.90 195.72 128.96 208.81216.99 126.83 119.91152.89
288.75 270.85286.81 306.89
De este espectro se puede decir que el pico importante a destacar es el in molecular del cido ascrbico con una m/z de de 177. Hay que decir que este espectro sale muy sucio posiblemente por las fragmentaciones de otros compuestos con tiempo de retencin cercano. 2.3.-Grosella (Blackcurrant; Ribes nigrum) La muestra analizada consiste en un zumo concentrado de esta fruta procedente de la empresa J.Garca Carrin. La muestra es analizada en el laboratorio del edificio de Servicio de Apoyo a la Investigacin Tecnolgica, Edificio I+D+I (SAIT). Anteriormente a su anlisis esta muestra se encuentra congelada a -20C en el laboratorio del departamento de Ingeniera Qumica y Ambiental de la UPCT. Antocianos presentes en la grosella Para identificar los antocianos presentes en la grosella se mira el cromatograma obtenido con el detector de fotodiodos (PDA) a una absorbancia de 520 nm. Los picos se identifican por el tiempo de retencin, PDA e identificacin con el espectro de masas obtenido para cada antociano. La propuesta de identificacin de los antocianos en las frutas rojas se ha realizado mediante la comparacin de los datos obtenidos con los de la bibliografa. El motivo de este tipo de identificacin se debe a la gran diversidad de antocianos presentes en las frutas rojas y a la no comercializacin de patrones de muchos de ellos. En la figura 5.25 se muestra el perfil cromatogrfico de los antocianos presentes en la grosella relacionado con los espectros de absorbancia originados por cada antociano. JacintaColladoGonzlez Pgina98
2
0.40 AU
520 nm 4
0.20
1 3 5
30.00 Minutes 40.00 50.00 60.00
0.00 10.00
0.40
20.00
521.8
0.30
276.9
A U 0.20
516.9 281.6
0.10
275.7 221.5 265.1280.5 239.1 0.00

250.00 300.00
345.9 345.9348.3361.7393.5
350.00 nm 400.00
453.9
450.00
523.0 519.4
500.00
515.7
Figura 5.25: Perfil cromatogrfico de los antocianos presentes en la grosella relacionado con sus respectivos espectros de absorbancia.
A continuacin, en la tabla 5.57, se realiza la propuesta de identificacin de los antocianos presentes en la grosella.
Tabla 5.57: Propuesta de identificacin de los antocianos hallados en la grosella negra.
Nmero de identificacin 1 2 3 4 5
Tiempo de retencin (min) 21.917 22.827 27.456 28.544 32.248
Identificacin de los antocianos Delfinidina-3- O-glucsido Delfinidina-3-O-rutinsido Cianidina-3-O-glucsido Cianidina-3-O-rutinsido Delfinidina
Tabla 5.58: Espectros de los antocianos de la grosella negra escalados presentando la misma absorbancia a 520 nm.
Delfinidina-3- O-glucosa
521.8
0.08
0.50
Delfinidina-3-O-rutinsido
525.4
0.40
221.5
0.06
276.9
AU 0.04
0.30 AU
278.1
0.20
0.02
343.5
250.00 300.00 350.00 nm 400.00 450.00 500.00
0.10
347.1
250.00 300.00 350.00 nm 400.00 450.00 500.00
Pgina99
0.030
Cianidina -3-O-rutinoside
515.7
0.25 0.20
516.9
0.020
279.3
AU
280.5
0.15 0.10 0.05 0.00 250.00 300.00 350.00 nm 400.00 450.00 500.00
AU 0.010 0.000 250.00 300.00 350.00 nm 400.00 450.00 500.00
Delfinidina
221.5 519.4 265.1
0.010 A U 0.005
453.9 348.3361.7
0.000 250.00 300.00 350.00 nm 400.00 450.00 500.00
393.5
En la tabla 5.59 se expone la propuesta de identificacin de cada antociano hecha mediante la comparacin con los datos de la bibliografa.
Tabla 5.59: Propuesta de identificacin para los antocianos en este tipo de grosella.
Nmero de identificacin 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Identificacin de los antocianos Delfinidina-3-O-glucsido Delfinidina-3-O-rutinsido Cianidina-3-O-glucsido Cianidina-3-O-rutinsido Delfinidina Peonodina-3-O-rutinsido Malvidina-3-O-rutinsido Pelargonidina Pelargonidina-3-Orutinsido Peonidina Petunidina-3-O-rutinsido
Bermdez et al. (2004) X X X X X -
Phenol explorer X X X X X X X X X X X
Goiffon et al. (1999)

X X X X . . .
Para corroborar dicha propuesta se trabaja con espectrometra de masas. En la tabla 5.60 se presentan los datos referentes a los antocianos identificados en la grosella.
Tabla 5.60: Espectrosde masas de los antocianos identificados en esta variedad de grosella.

I n t e n s it y 500000
Espectro de masas
60.36 101.20 78.25 73.39
100.00 200.00
465.26 303.16
300.00 400.00 500.00 m/z 600.00 700.00 800.00 900.00 1000.00
Delfinidina-3O-glucosa
Pgina100
I n t e n s it y
611.31 55.37
100.00 200.00
Delfinidina-3O-rutenosido
500000 0
303.23
300.00 400.00 500.00 m/z
612.31
600.00 700.00 800.00 900.00 1000.00
I n t e n s it y
100000
61.35 196.16 72.20 88.23 198.15

100.00 200.00
287.20 288.13
300.00 400.00
449.37
0 500.00 m/z 600.00 700.00 800.00 900.00 1000.00
I n t e n s it y
500000
595.36 83.30 287.13

200.00 300.00 400.00
Cianidina-3-Orutinoside
596.35
500.00 600.00 m/z 700.00 800.00 900.00 1000.00
0 100.00
60.36
250000 200000 In te n s ity 150000 100000
55.37 73.19 83.24
Delfinidina
78.32 100.26 50000 74.2689.33 54.37 102.26

0 200.00
303.16
400.00 m/z 600.00 800.00 1000.00
A la hora de explicar este grupo de flavonoides, por razones de sencillez, se hace necesario dividirlos en funcin del grupo flavonoide principal: Se tienen as dos grupos: las delfinidinas(Df) y las cianidinas(Ci). Las delfinidinas glicosilados identificados son tres: la Df-3-O-glucsido y la Df3-O-rutinsido y la delfinidina. Estos tres compuestos tienen en comn la seal de un fragmento importante (m/z 303) debido a la estructura flavonoide. El primer antociano tiene otra seal a una relacin m/z de 465, razn de la estructura completa del antociano (Valls et al, 2009). El segundo antociano la otra seal importante a m/z 611, debida a la estructura flavonoide con el azcar glicosilado, en este caso es el rutinsido (6OLrhamnosylDglucosa) (Sjka et al, 2009). Hay dos cianidinas glicosiladas, la Cianidina-3-O- glucsido, y la Cianidina-3O-rutinsido. Coincidiendo los dos en el fragmento debido a la estructura principal del flavonoide (m/z 287). Ambas cianidinas presentan otra seal importante producto de su correspondiente glicosilacin siendo sus respectivas relaciones m/z 449 y 595.3 (Sjka et al, 2009).
Flavonoles presentes en la grosella Para identificar los flavonoles presentes en la grosella se estudia el cromatograma obtenido con el detector de fotodiodos (PDA) a una absorbancia de 360 nm, el resultado obtenido se comprueba con la bibliografa disponible y con los patrones analizados en el departamento, posteriormente se corrobora dicha identificacin con el espectro de masas obtenido para cada flavonol. JacintaColladoGonzlez Pgina101
En la figura 5.26 se muestra el perfil de los flavonoles presentes en esta fruta relacionado con los espectros de absorbancia originados por cada flavonol.
0.02 AU 0.00 10.00 20.00 30.00 Minutes 40.00 50.00
Antocianinas
360
0.20 A U
263.9
355.4
0.10
256.8 255.6
354.2 354.2 457.5 479.3
0.00 250.00 300.00 350.00 nm 400.00
519.4 523.0 499.9 518.1

500.00
450.00
Figura 5.26: Perfil de los flavonoles presentes en la grosella negra relacionado con sus respectivos espectros de absorbancia.
En la tabla 5.61 se expone la propuesta de identificacin de los flavonoles presentes en la grosella, para la identificacin se atiende al tiempo de retencin.
Tabla 5.61: Propuesta de identificacin de los flavonoles presentes en esta variedad de grosella.
1 2 3
Identificacin de los flavonoles Miricetina-3-O-rutinsido Quercetina-3-O-glucsido Quercetina
Con motivo de comparar la forma de los distintos espectros de absorbancia obtenidos, se adjunta la tabla 5.62 en la que se muestran los espectros escalados presentando la misma absorbancia a 360 nm.
Tabla 5.62: Espectros de los flavonoles encontrados en la grosella negra escalados a una absorbancia a 360 nm.
Miricetina-3-O-rutinsido
0.08
0.20
Quercetina-3-O-glucsido
256.8 354.2
0.06 AU 0.04 0.02 0.00
263.9
355.4
AU 0.10
519.4
0.00 250.00 300.00 350.00 nm 400.00 450.00 500.00
523.0
250.00 300.00 350.00 nm 400.00 450.00 500.00
Quercetina
255.6
0.04
354.2
A U
0.02
0.00 250.00 300.00 350.00 nm 400.00
457.5
450.00
479.3
499.9 518.1
500.00
La bibliografa que se muestra en la tabla 5.63 identifica en la grosella los siguientes flavonoles. JacintaColladoGonzlez Pgina102
Tabla 5.63: Bibliografa para los flavonoles en la grosella negra.
Flavonoles
Kaempferol Kaempferol-3-Oglucsido Miricetina Miricetina-3-glucsido Miricetina-3-rutinsido Quercetina Quercetina-3-glucsido Quercetina-3-rutinsido Quercetina-3galactsido Isorhamnetina Quercetina-3-xilsido
Sjka,Guyot,Kolodziejzy, Krl y Baron (2009)

X X X X X -
Phenol explorer
X X X X X X X X X
Chen et al (2001)
X X -
Para verificar dicha propuesta se recurre a la espectrometra de masas que queda recogida en la tabla 5.64. Atendiendo al tiempo de retencin obtenido en masas y por comparacin con el tiempo de retencin obtenido en el PDA se quedan identificados dichos compuestos.
Tabla 5.64: Espectros de masas de los flavonoles presentes en esta variedad de grosella.

200000
Espectro de masas
319.25
Miricetina-3-Orutinsido
Intens ity
100000 0
130.18 84.24
100.00 200.00 300.00 400.00
481.22
500.00 m/z
627.40
600.00 700.00 800.00 900.00 1000.00
60000.0 96.14103.06140.97
Quercetina-3O-glucsido
101.20 133.06 59.2995.14158.08 20000.0 151.05 77.12

40000.0 91.32 0.0 100.00
Inten s ity
303.09 465.32
200.00
300.00
400.00
500.00 m/z
600.00
700.00
800.00
900.00
1000.00
60.29
In te n s ity 200000
Quercetina
303.16
0 100.00 200.00 300.00 400.00 500.00 m/z 600.00 700.00 800.00 900.00 1000.00
Por razones estructurales se hace preciso hacer una subdivisin a la hora de explicar los flavonoles identificados. En la primera subclase entra el miricetina. Este flavonol presenta tres picos importantes, el primer pico es producto de la estructura flavonoide del compuesto (m/z 319), el segundo es fruto de la glicosilacin de ste con la glucosa (m/z 481) y el tercer pico se debe al in molecular (m/z 627) (Sjka et al, 2009). En la otra subclase entran los dos quercetinas. Ambas quercetinas coinciden en la seal debida al in molecular de la quercetina (m/z 303). En el espectro de la quercetina-3-O-glucsido, adems, se ve otro pico fundamental y es el
Pgina103
correspondiente a la estructura completa del compuesto (464 umas) (Sjka et al, 2009). cidos hidroxibenzicos presentes en la grosella El perfil cromatogrfico de absorcin para los hidroxibenzicos se identifica a una absorbancia de 260 nm. En la figura 5.27 se muestra el perfil de los cidos hidroxibenzicos presentes en la grosella relacionado con los espectros de absorbancia originados por cada uno de ellos. La propuesta de identificacin de los cidos hidroxibenzicos en esta fruta se realiz atendiendo fundamentalmente al tiempo de retencin en que aparecan los picos de los patrones en los cromatogramas, a sus espectros en ultravioleta visible y a sus espectros en masas.
Antocianinas
2.00 AU
260
1.00
1
0.00 2.00 4.00 6.00 8.00
2
10.00 12.00 14.00 Minutes 16.00 18.00 20.00 22.00 24.00
0.04
254.4 263.9
A U
0.02
305.4
0.00
515.7 449.0469.6 490.2 369.5387.5403.2420.1439.4 507.2 459.9 481.7 524.2

350.00 nm 400.00 450.00 500.00
250.00
300.00
Figura 5.27: Perfil cromatogrfico de los cidos hidroxibenzicos presentes en la grosella negra relacionado con sus respectivos espectros de absorbancia.
La propuesta realizada para los cidos hidroxibenzicos presentes en la grosella negra se muestra en la tabla 5.65. Esta propuesta se realiz atendiendo fundamentalmente al tiempo de retencin en que aparecan los picos de los patrones en los cromatogramas y a sus espectros en ultravioleta visible.
Tabla 5.65: Propuesta de identificacin de los cidos hidroxibenzicos presentes en este tipo de grosella.
4,553 10,548
Identificacin de los cidos hidroxibenzicos cido glico cido 4-hidroxibenzico-4-Oglucsido
Pgina104
Tabla 5.66: Espectros escalados de los cido hidroxibenzicos de la grosella negra a una absorbancia a 260 nm.
cido glico
0.06 0.04 AU 0.02 0.00 -0.02 250.00 300.00 350.00 nm 400.00 450.00 500.00
cido 4-hidroxibenzico-4-O-glucsido
0.04
263.9
254.4
AU
0.02
370.7389.9
420.1439.4 464.8
515.7
0.00
439.4 459.9 481.7 507.2524.2
250.00
300.00
350.00 nm
400.00
450.00
500.00
Los cidos hidroxibenzicos identificados en la grosella segn la bibliografa quedan plasmados en la tabla 5.67.
Tabla 5.67: Bibliografa para los cidos hidroxibenzicos en la grosella negra.
cido glico cido 3,4dihidroxibenzico cido vanillico cido elgico-glucosa cido 4-hidroxibenzico4-O-glucsido cido galloilqunico cido glico-4-Oglucsido Galoil glucosa cido Protocatequico-4glucsido cido p-ansico cido benzico
Phenol explorer
X X X X X -
Russell, W. (2009)
X X X -
Chen et al (2001)
X X
Hkkinen,S. (1999)
X -
Para verificar la propuesta realizada se recurre al anlisis de los espectros de masas que estn recogidos en la tabla 5.68. Atendiendo al tiempo de retencin obtenido en masas y por comparacin con el tiempo de retencin obtenido en el PDA se quedan identificados dichos compuestos.
Tabla 5.68: Espectros de masas de los cidos hidroxibenzicos encontrados en esta variedad de grosella.

1.0x107 In te n s ity
Espectro de masas
129.93
cido glico
5.0x106
0.0 50.00
84.12 117.95 131.12 170.94 86.01

100.00 150.00 200.00 m/z 250.00 300.00 350.00 400.00
Pgina105
83.05
In te n s ity
cido 4hidroxibenzico-4glucsido
2x106
84.12
0 50.00 100.00
139.19
150.00
214.29
200.00 m/z 250.00
300.94
300.00 350.00 400.00
En el cido glico, segn el patrn previamente explicado, se observa su in molecular a una m/z 170.9. ste es el pico de mayor m/z pero se puede ver que aparece otro pico ms intenso que ste cuya relacin m/z es 129.9 cuya fractura no se sabe con exactitud. Podra pensarse que el cido es oxidado mediante la formacin de dos aldehdos y la correspondiente apertura del anillo. Tras lo cual se podra perder un grupo carbonilo quedando de este modo un fragmento cuya masa es de 129, por lo tanto su M+1 sera 130. El segundo espectro presenta dos picos importantes. El primero es el in molecular obtenido a m/z 300.9, que es el peso molecular del hidroxibenzico glicosilado. El segundo es el pico correspondiente al peso molecular de la estructura principal del flavonoide cuya m/z es 139.2 (Bendini et al, 2007).
cidos hidroxicinmicos presentes en la grosella El perfil cromatogrfico de absorcin para los cidos hidroxicinmicos se identifica a una absorbancia de 320 nm, tal y como se demuestra en la figura 5.28, en la que ensea el perfil de los cidos hidroxicinmicos presentes en la grosella negra relacionado con sus respectivos espectros de absorbancia.
0.08
1 2 3
Antocianinas
Flavonoles
320
0.06 AU
0.04
0.02
0.00 10.00 20.00

305.4
0.30 0.25 0.20 A U 0.15
30.00 Minutes
40.00
50.00
221.5
317.3
0.10 0.05 0.00 250.00 300.00 350.00 nm
230.9 228.5 311.3 411.6

400.00
434.5 453.9 432.1

450.00
515.7 479.3 478.1 496.3 515.7

500.00
Figura 5.28: Perfil de los cidos hidroxicinmicos presentes en la grosella negra relacionado con sus respectivos espectros de absorbancia.
Pgina106
La propuesta realizada para los cidos hidroxicinmicos presentes en la grosella se ofrece en la tabla 5.69. Esta propuesta se realiz atendiendo fundamentalmente al tiempo de retencin en que aparecan los picos de los patrones en los cromatogramas y a sus espectros en ultravioleta visible.
Tabla 5.69: Propuesta de identificacin de los cidos hidroxicinmicos presentes en la grosella negra.
9,502 12,237 16,948
Identificacin de los cidos hidroxicinmos Neoclorognico (cido 5 - O cafeoilquinico) cido p-cumaroil qunico ac.ferlico-4-glucsido
Con el objetivo comparar la forma de los distintos espectros de absorbancia obtenidos, se adjunta la tabla 5.70 en la que se muestran los espectros escalados presentando la misma absorbancia a 320 nm.
Tabla 5.70: Espectros escalados de los cidos hidroxicinmicos presentes en la grosella a una absorbanciade 320 nm.
Neoclorognico
306.6
0.06
0.08 0.10
cido p-cumaroil qunico

313.7
0.04
0.06 230.9
247.4
AU 0.04 0.02
AU 0.02
0.00 250.00 300.00 350.00 nm 400.00
436.9 455.1 474.5

450.00 500.00
520.6
0.00 250.00 300.00 350.00 nm 400.00 450.00
482.9504.8 518.1
500.00
ac.ferlico-4-glucsido
0.08
326.8
0.06
A U
237.9
0.04
0.02
0.00 250.00 300.00 350.00 nm 400.00
432.1447.8467.2492.6 521.8507.2
450.00 500.00
Los hidroxicinmicos identificados por la bibliografa estudiada quedan expuestos en la tabla5.71.

Tabla 5.71: Bibliografa para los cidos hidroxicinmicos en la grosella negra.
cido hidroxicinmico cido cafico cido p-cumrico cido ferlico cido trans cinmico
Jakobek, L. (2007) X X X X
Phenol explorer -
Pgina107
cido clorognico cido 3-feruloilquinico cido 3-p-cumaroilqunico cido 4-cafeoilqunico cido 4-feruloilquinico cido 4-p-cumaroilqunico cido 5-cafeoilqunico cido 5-feruloilquinico cido cafico-4-glucsido Cafeoil-glucosa cido ferlico-4-glucsido Feruloil-glucosa cido p-cumrico-4-glucsido p-cumaroil glucosa X X X X X X X X X X X X X X X
Con el fin de comprobar que dicha propuesta es cierta se procede a examinar los espectros de masas que se encuentran recogidos en la tabla 5.72.
Tabla 5.72: Espectros de masas de los cidos hidroxicinmicos identificados en la grosella negra.
cido hidroxicinmico
4x106
Espectro de masas
83.05
3x106
Intensity
Neoclorognico
2x106
60.18
1x106
84.12 294.08
0 50.00 100.00 150.00 200.00 m/z 250.00 300.00
354.86
350.00 400.00
600000
60.24 146.90
cido del p-cumaroil qunico
Intens ity
400000
200000
83.05
0 50.00
118.90
176.93 162.94
150.00 200.00 m/z 250.00 300.00
338.87
350.00 400.00
100.00
200000
194.76
150000 In te n sity
cido ferlico-4glucsido
100000
84.12 62.19 102.96

50000
356.85
0 50.00
100.00
150.00
200.00 m/z
250.00
300.00
350.00
400.00
En el espectro del neoclorognico (cido 5 -O-cafeoilquinico) se puede ver el in molecular que se corresponde con su M+1(m/z 354.8). Se sabe que es el neoclorognico y no el clorognico por el tiempo de retencin del patrn y por la ausencia del pico que sale en el patrn a una m/z de 162.9. Esta comparacin se puede ver bien en los espectros de la tabla 5.73. En la figura 5.29 Se puede observar la diferencia estructural que hay entre ambos ismeros.
Pgina108
Neoclorognico
(cido 5-O-cafeoilquinico)(cido 3-O-cafeoilquinico)

Figura 5.29: Diferencias estructurales entre los ismeros clorognico y neoclorognico Tabla 5.73: Comparativa del clorognico enconcontrado en la grosella con el patrn.
Fragmentan poraqu
Clorognico
Clorognico patrn
Tiempo de retencin (min) 13,816
162.93
1.5x106
3x106 4x106
Neoclorognico grosella
83.05
In ten s ity
Intens ity
1.0x106
2x106
60.18
1x106
5.0x105
144.69
354.93
84.12 294.08 354.86

350.00 400.00
0.0 100.00 200.00 300.00 400.00 500.00 m/z 600.00 700.00 800.00 900.00 1000.00
0 50.00
100.00
150.00
200.00 m/z
250.00
300.00
El segundo espectro de masas de ls cidos hidroxicinmicos corresponde al cido p-cumaroil qunico (C16H18O8), se sabe que esa seal es debida al cido pcumaroil qunico porque adems de presentar el pico debido a la masa del cido cumrico sin la molcula de agua (m/z 146.8), muestra una seal a una m/z 338.8 producto de su in molecular. Mirando su espectro del UV Visible se puede ver que es muy similar al del cumrico, la principal diferencia que hay entre estos dos compuestos es el tiempo de retencin al que salen. Esta diferencia se aprecia bien en los espectros de la tabla 5.74 y en la figura 5.30 queda reflejada la diferencia estructural entre ambos compuestos.
cido cumrico
Figura 5.30: Diferencia estructural entre el cido p-cumaroil qunico y el cido cumrico.
Pgina109
Tabla 5.74: Comparativa entre el derivado del cido p-cumrico y el patrn.
cido p-cumrico patrn

200000
cido p-cumaroil qunico en la grosella

146.88
600000
146.85
150000 I n t e n s it y
Intens ity 400000
100000
78.09
50000
200000
100.94
0 100.00 150.00 200.00 m/z 250.00 300.00 350.00 400.00

0 50.00 100.00 150.00 200.00 m/z 250.00 300.00 350.00 400.00
El tercer espectro es el del cido ferlico-4-glucsido. En este espectro se ven dos seales importantes, la primera es el pico base que se corresponde con la estructura flavonoide del cido ferlico (m/z 194.7) y la segunda es el in molecular que es el producto del flavonoide glicosilado (m/z 356.8) (Abad-Garca et al, 2009).
Flavanoles presentes en la grosella El perfil cromatogrfico de absorcin para los flavanoles se identifica a una absorbancia de 280 nm. Para continuar, en la figura 5.31, se muestra el perfil del los flavanoles presentes en la grosella relacionado con sus espectros de absorbancia.
0.20
Antocianinas
280
AU
0.10
1
0.00 5.00 10.00 15.00
2
20.00 Minutes 25.00 30.00 35.00 40.00
222.6
0.030
0.020 A U
289.9
0.010
287.6
0.000 250.00 300.00
323.2
350.00
381.5389.9 411.6 397.2 417.6

400.00 nm
449.0 443.0 461.1 479.3 498.7 520.6

450.00 500.00
Figura 5.31: Perfil cromatogrfico de los flavanoles presentes en la grosella negra relacionado con sus respectivos espectros de absorbancia.
Pgina110
Al igual que ocurra en el mirtilo, los flavanoles son casi inapreciables en el cromatograma, este tipo de compuestos es apreciable en fluorescencia. La propuesta se realiz atendiendo fundamentalmente al tiempo de retencin en que aparecan los picos de los patrones en los cromatogramas, un poco a sus espectros en ultravioleta visible y sobre todo por su espectro de masas. Esta propuesta se plasma en la tabla 5.75.
Tabla 5.75: Propuesta de identificacin de los flavanoles en esta variedad de grosella.
12,596 19,775
Con motivo comparar la forma de los distintos espectros de absorbancia obtenidos, se adjunta la tabla 5.76 en la que se muestran los espectros escalados presentando la misma absorbancia a 280 nm.
Tabla 5.76: Espectros escalados de los flavanoles de la grosella negra a una absorbancia de 280 nm.
Catequina
280.5
0.020 0.015 AU 0.010 0.005 0.000 250.00 300.00
Epicatequina
222.6
0.020
222.6
AU
0.010
289.9 360.7 385.1 404.4418.8436.9450.2

250.00 300.00 350.00 nm 400.00 450.00
362.8377.9
350.00 nm
411.6
400.00
444.2
450.00
476.9
506.0
500.00
493.9 515.7
0.000
500.00
A continuacin, en la tabla 5.77, se muestran los flavanoles identificados por la bibliografa estudiada quedan expuestos en la tabla de abajo.
Tabla 5.77: Bibliografa para los flavonoles de este tipo de grosella.
Flavanol
Catequina Epicatequina
Phenol explorer
X X
Chen et al (2001)
X -
Con el fin de corroborar que dicha propuesta es la correcta, en la tabla 5.78 se muestran sus espectros de masas.
Tabla 5.78: Espectros de masas de los flavanoles identificados en la grosella negra.
Flavanol
60.18
In te n s ity 500000
Espectro de masas
83.05 87.07 127.46 61.19 87.87101.95104.16144.58
Catequina
290.70
200.00 m/z 250.00 300.00 350.00 400.00
0 50.00
100.00
150.00
Pgina111
61.25
In te n s ity 20000.0
Epicatequina
119.20
10000.0
308.91 275.74 290.99
0.0 50.00
100.00
150.00
200.00 m/z
250.00
300.00
350.00
400.00
Por comparacin con el patrn y por bibliografa en el espectro de la catequina se puede ver un pico importante, el debido a su in molecular (291). Mientras que en el espectro de la epicatequina se pueden ver dos seales importantes, la primera, obtenida a una relacin m/z 290.9 que se corresponde con el in molecular de la epicatequina y la segunda, obtenida a una m/z de 119.2 es producto de la escisin del anillo B y la posterior prdida de dos molculas de agua y una molcula de CO (AbadGarca et al, 2009).
B
Escisin del anillo B Este fragmento - 2 H2O CO = 119.2
Figura5.32:Estructuradelaepicatequina
La vitamina C en la grosella La vitamina C o lo que es lo mismo el cido ascrbico de observa haciendo un perfil cromatogrfico de absorcin a una longitud de onda de 243 nm, como se puede ver en la figura 5.33.
1
2.00 AU
243
1.00
0.00 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 Minutes 35.00 40.00 45.00 50.00 55.00 60.00
1.00
240.3
0.50 A U
0.00
250.00
300.00
350.00 nm
400.00
450.00
500.00
Figura 5.33: Perfil cromatogrfico del cido ascrbico presente en la grosella negra relacionado con su espectro de absorbancia.
Pgina112
En la tabla 5.79 se muestra el tiempo de retencin del cido ascrbico presente en esta fruta en las condiciones de anlisis explicadas anteriormente.
Tabla 5.79: Identificacin de la vitamina C en la grosella negra.
Identificacin
2,968
cido ascrbico
Segn la bibliografa, www.consumer.es, la grosella presenta un rango de concentracin de cido ascrbico de200-40 mg/100g producto comestible. Para constatar la presencia de la vitamina C en la grosella se recurre a la espectrometra de masas que se muestra en la tabla 5.80.
Tabla 5.80: Espectro de masas del cido ascrbico.
Identificacin
90.04
2.0x106 1.5x106 1.0x106 5.0x105
Espectro de masas
cido ascrbico
Intensity
119.91 118.17 176.93

100.00 150.00 200.00 m/z
259.85
250.00
327.77 306.85
300.00 350.00 400.00
0.0 50.00
Por comparacin con el patrn pinchado cabe destacar en este espectro su in molecular cuya relacin m/z es 176.9.
2.4. - Cereza (Sour cherry; Prunus cerasus) La muestra de cereza analizada consiste en un zumo concentrado de esta fruta procedente de la casa comercial Mondi Food. La muestra es analizada en el laboratorio del edificio de Servicio de Apoyo a la Investigacin Tecnolgica (SAIT), Edificio I+D+I. Anteriormente a su anlisis esta muestra se encuentra congelada a -20C en el laboratorio del departamento de Ingeniera Qumica y Ambiental de la UPCT. Antocianos presentes en la cereza Para identificar los antocianos presentes en la cereza se estudia el cromatograma obtenido con el detector de fotodiodos (PDA) a una absorbancia de 520 nm, el resultado obtenido se comprueba con la bibliografa disponible y posteriormente se corrobora dicha identificacin con el espectro de masas obtenido para cada antociano. En la figura 5.34 se muestra el perfil de los antocianos presentes en la cereza relacionado con los espectros de absorbancia originados por cada antociano.
Pgina113
0.40
1
0.20
520
2
5.00 10.00 15.00 20.00 Minutes 25.00 30.00 35.00 40.00
A U
0.00
515.7
1.50
222.6
280.5
AU
1.00
519.4
0.50
280.5 330.4 330.4

250.00 300.00 350.00 nm 400.00 450.00 500.00
Figura 5.34: Perfil cromatogrfico de los antocianos presentes en la cereza agria relacionado con sus respectivos espectros de absorbancia.
La propuesta de identificacin de los antocianos en las frutas rojas se ha realizado mediante la comparacin de los datos obtenidos con los de la bibliografa. A continuacin, en la tabla 5.81, se realiza la propuesta de identificacin de los antocianos presentes en la esta fruta.
Tabla 5.81: Propuesta de identificacin de los antocianos en la cereza agria.
Identificacin de los antocianos Cianidina-3-O-glucosilrutinsido Cianidina-3-O-rutinsido
Con objetivo de comparar la forma de los distintos espectros de absorbancia obtenidos, se adjunta la tabla 5.82 en la que se muestran los espectros escalados presentando la misma absorbancia a 520 nm.
Tabla 5.82: Espectros escalados de los antocianos de la cereza agria a una absorbancia de 520 nm.
Cianidina-3-O-glucosil-rutinsido
516.9
0.40
Cianidina-3-O-rutinsido
0.15
523.0
0.30 AU
280.5
0.10 AU
281.6
0.20
0.05
0.10
332.8
250.00 300.00 350.00 nm 400.00 450.00 500.00
330.4
250.00 300.00 350.00 nm 400.00 450.00 500.00
Pgina114
Tabla 5.83: Bibliografa de los antocianos en esta variedad de cereza
Nmero de identificacin 1 2 3 4 5 6
Identificacin de los antocianos Cianidina-3-sophorido Cianidina-3-(2G-xilosilrutinsido) Cianidina-3-O-glucsido Cianidina-3-O-glucosilrutinsido Cianidina-3-O -rutinsido Peonodina-3-Orutinsido
Stintzing et al (2006)
Phenol explorer
Chaovanaalikit y Wrolstad (2004)
X X X
X X X X
X X X X X
Con el fin de corroborar dicha propuesta se trabaja con espectrometra de masas. En la tabla 5.84 se presentan los datos referentes a los antocianos identificados en la cereza.
Tabla 5.84: Espectros de masas de los antocianos identificados en la cereza.
Espectro de masas
757.41
500000
400000
In te n s ity
Cianidina-3-Oglucosil-rutinsido
300000
758.34
200000
100000
287.27 158.11 611.38
759.34
0 100.00 200.00 300.00 400.00 500.00 m/z 600.00 700.00 800.00 900.00 1000.00
595.36
400000
Intensity
Cianidina -3-Orutinsido
300000
200000
596.35
100000
287.13 95.13140.90 61.35 156.99 288.13

300.00 400.00 500.00 m/z
597.42 617.31
600.00 700.00 800.00 900.00 1000.00
0 100.00 200.00
En el espectro de la Cianidina-3-O-glucosil-rutinsido se ven claramente tres seales correspondientes a las fragmentaciones importantes que sufre la molcula. La primera seal (m/z 287) es la debida a la estructura principal de la cianidina. La segunda seal, a una relacin m/z 611, es la debida al flavonoide unido a una molcula de glucosa y sta a su vez unida a la molcula de glucosa del rutinsido (6OLrhamnosil- Dglucosa) fragmentado. La tercera seal se corresponde con la estructura completa del antociano glicosilado con la glucosa y el rutinsido (Wu and Prior, 2005). En el espectro de la Cianidina-3-O-rutinsido se ven dos picos importantes. El primero, causado por la estructura principal de la cianidina (m/z 287) y el segundo, obtenido a una m/z 595, es producido por la glicosilacin de la cianidina con el disacrido rutinsido (Wu and Prior, 2005). JacintaColladoGonzlez Pgina115
Flavonoles presentes en la cereza Para identificar los flavonoles presentes en la cereza se estudia el cromatograma obtenido con el detector de fotodiodos (PDA) a una absorbancia de 360 nm, el resultado obtenido se comprueba con la bibliografa disponible y con los patrones analizados en el departamento, posteriormente se corrobora dicha identificacin con el espectro de masas obtenido para cada flavonol. En la figura 5.35 se muestra el perfil cromatogrfico de los flavonoles presentes en esta fruta relacionado con los espectros de absorbancia originados por cada flavonol.
0.40
Antocianinas
0.30 AU
360
0.20
0.10
2 3
30.00 Minutes 40.00
0.00 10.00 20.00 50.00 60.00
0.15
256.8 354.2 255.6 254.4 266.3 354.2 353.0 348.3 492.6 445.4 470.8 496.3499.9 440.6 461.1 506.0 524.2 510.8 519.4 524.2 479.3479.3512.1
400.00 nm 450.00 500.00
0.10 AU 0.05 0.00
250.00
300.00
350.00
Figura 5.35: Perfil de los flavonoles presentes en la cereza agria relacionado con sus respectivos espectros de absorbancia.
En la tabla 5.85 se expone la propuesta de identificacin de los flavonoles presentes en esta fruta, para la identificacin se atiende al tiempo de retencin.
Tabla 5.85: Propuesta de flavonoles presentes en esta variedad de cereza.
1 2 3 4
Identificacin de los flavonoles Quercetina-3-glucosilrutinsido Quercetina-3-O-rutinsido Kaempferol-3-o-glucsido Isorhamnetina-3-O-glucsido
Pgina116
Tabla 5.86: Espectros escalados de flavonoles presentes en la cereza agria a 360 nm.
Quercetina-3-glucosil-rutinsido
221.5
0.020
Quercetina-3-O-rutinsido
221.5
0.030
259.2 351.9
255.6 354.2
AU
0.010
0.010
AU
0.020
0.000 250.00 300.00 350.00 nm 400.00 450.00
480.5 498.7
436.9
0.000 250.00 300.00 350.00 nm 400.00 450.00
475.7
504.8519.4
500.00
500.00
Kaempferol-3-o-glucsido
0.010 0.008 225.0 0.006 AU
Isorhamnetina-3-O-glucsido
0.020
263.9 345.9
254.4 221.5
344.7
0.015
0.002
418.8
0.000 -0.002 250.00 300.00 350.00 nm 400.00
443.0 462.3475.7
507.2
AU
0.004
0.010
0.005
422.5 440.6456.3 474.5 490.2

0.000
450.00 500.00
524.2
250.00
300.00
350.00 nm
400.00
450.00
500.00
En cuanto a la bibliografa estudiada para los flavonoles identificados en la cereza agria se recogen en la tabla 5.87.
Tabla 5.87: Bibliografa para los flavonoles en la cereza agria.
Flavonol Quercetina Quercetina-3-Oglucsido Quercetina-3-Orutensido Kaempferol-3-Orutensido
Lugasi et al (2003) X -
USDA X -
Ferretti et al (2010) X X X
Para verificar la propuesta se recurre a la espectrometra de masas que se ensea en la tabla 5.88. Atendiendo al tiempo de retencin obtenido en masas y por comparacin con el tiempo de retencin obtenido en el PDA se quedan identificados dichos compuestos.
Tabla 5.88: Espectros de masas de los flavonoles hallados en este tipo de cereza.

83.17
120000.0
Espectro de masas
73.19 303.23
100000.0
80000.0
Quercetina-3glucosil-rutinsido
In te n s ity
60000.0
40000.0
61.29 141.03 84.30 57.25
773.30
20000.0
0.0 100.00 200.00 300.00 400.00 500.00 m/z 600.00 700.00 800.00 900.00 1000.00
Pgina117
60.29
700000 600000 500000
Quercetina-3-Orutinsido
In te n sity
400000
83.17
300000 200000
96.14 78.18 101.13 194.83 84.17 141.10

100.00 200.00
303.16
100000 72.26 0
465.32
300.00 400.00 500.00 m/z
611.31
600.00 700.00 800.00 900.00 1000.0
70000.0
141.12
60000.0
50000.0
Kaempferol-3-oglucsido
Inte nsity
40000.0
196.77 142.46 159.26 62.35 20000.0 58.22 165.37

30000.0 10000.0
287.13
449.23
0.0 100.00 200.00 300.00 400.00 500.00 m/z 600.00 700.00 800.00 900.00 1000.0
120000.0
317.18
100000.0
80000.0
Isorhamnetina-3O-glucsido
In te n s ity
60000.0
40000.0
119.21 59.29 118.04
479.22
20000.0
0.0 100.00 200.00 300.00 400.00 500.00 m/z 600.00 700.00 800.00 900.00 1000.00
Por razones estructurales se hace preciso hacer una subdivisin a la hora de explicar los flavonoles identificados. En la primera subclase entran las dos quercetinas. La quercetina-3-glucosil-rutinsido presenta un in molecular a una relacin m/z 773.3 correspondiente al flavonol glicosilado con la glucosa y el rutinsido y un pico base a una m/z de 303.2 propio de la quercetina. En el espectro de la Quercetina-3-Orutinsido se pueden ver tres picos caractersticos de este flavonol. El primer pico (m/z 303.1) es el fragmento correspondiente a la estructura del flavonol sin glicosilar, el segundo pico, obtenido a 565.3, es debido a la glicosilacin de la quercetina con la glucosa del dmero, y el tercer pico, cuya m/z es 611.3, es producto del flavonol glicosilado con el dmero completo (Lin and Harnly, 2007). En la segunda subclase entra el kaempferol-3-o-glucsido. El espectro de este flavonol glicosilado presenta dos picos caractersticos de este flavonol glicosilado. El primero es debido a la estructura principal del flavonol (m/z 287) y el segundo es producto de su glicosilacin (m/z 449.2) (Lin and Harnly, 2007). En la tercera subclase est el Isorhamnetina-3-O-glucsido. El espectro de este flavonol glicosilado muestra dos picos debidos a dos fragmentaciones importantes. El primero, caracterstico de la estructura flavonoide muestra una m/z a 317.2. El otro pico importante, m/z de 479,2 fruto de la glicosilacin del flavonoide (Lin and Harnly, 2007). cidos hidroxibenzicos presentes en la cereza El perfil cromatogrfico de absorcin para los hidroxibenzicos se identifica a una absorbancia de 260 nm, lo cual se puede ver en la figura 5.36. La propuesta de identificacin de los cidos hidroxibenzicos en esta fruta se realiz atendiendo fundamentalmente al tiempo de retencin en que aparecan los picos de los patrones en los cromatogramas, a sus espectros en ultravioleta visible y a sus espectros en masas.
Pgina118
0.60 0.40 AU 0.20 0.00 5.00

0.20
Hidroxicinmicos
Antociacinas
260
Flavonol
10.00
15.00 Minutes
20.00
25.00
0.15
255.6
A U 0.10
265.1 288.8
0.05
0.00 250.00 300.00
347.1
350.00
369.5
398.4
400.00
443.0
450.00
479.3 497.5 472.0 497.5

500.00
519.4 521.8
nm
Figura 5.36: Perfil cromatogrfico de los cidos hidroxibenzicos presentes en la cereza agria relacionado con sus respectivos espectros de absorbancia.
La propuesta realizada para los cidos hidroxibenzicos presentes en la cereza se ofrece en la tabla 5.89. Esta propuesta se realiz atendiendo sobre todo al tiempo de retencin en que aparecan los picos de los patrones en los cromatogramas y a sus espectros en ultravioleta visible.
Tabla 5.89: Propuesta de los cidos hidroxibenzicos en este tipo de cereza.
4,045 7,463
Identificacin de los cidos hidroxibenzicos cido glico cido 3,4-dihidroxibenzico
Con el objetivo de comparar la forma de los distintos espectros de absorbancia obtenidos, se adjunta la tabla 5.90 en la que se muestran los espectros escalados presentando la misma absorbancia a 260 nm.
Tabla 5.90: Espectros escalados de los cidos hidroxibenzicos presentes en la cereza agria a 260 nm.
cido glico
0.12 0.10 0.08 AU 0.06 0.04 0.02 0.00 250.00 300.00
cido 3,4-dihidroxibenzico
255.6
265.1
AU
0.10
288.8 369.5
250.00 300.00 350.00 nm 400.00
0.00
347.1
350.00 nm
443.0
450.00 500.00
519.4
398.4
400.00 450.00
472.0
497.5
500.00
521.8
Pgina119
En cuanto a la bibliografa, Jakobek et al (2007) afirman que en la cereza agria no hay ni cido elgico ni el cido 4-hidroxibenzico. Y segn Dae-Ok kim et al (2005), el cido glico en la cereza agria vara desde 146,1 a 312,4 mg/100g de producto. Para comprobar que la propuesta realizada es correcta se trabaja con espectrometra de masas, la cual se presenta en la tabla 5.91. Atendiendo al tiempo de retencin obtenido en masas y por comparacin con el tiempo de retencin obtenido en el PDA se quedan identificados dichos compuestos.
Tabla 5.91: Espectros de masas de los cidos hidroxibenzicos identificados en la cereza agria

84.12
I n t e n s it y 1x107
Espectro de masas
129.93 170.94
cido glico
0 50.00
100.00
150.00
200.00 m/z
250.00
300.00
350.00
400.00
60.24
I n t e n s it y
500000
240.98 83.11 110.91 154.87 102.10 136.94 229.01

200.00 m/z 250.00 300.00 350.00 400.00
0 50.00
100.00
150.00
Por comparacin con el patrn previamente explicado se observa su in molecular a una m/z 170.9. ste es el pico ms importante pero se puede ver que aparece otro pico ms aparte de ste cuya relacin m/z es 129.9 cuya fractura no se sabe con certeza pero podra pensarse que el cido es oxidado mediante la formacin de dos aldehdos y la correspondiente apertura del anillo. Tras lo cual se podra perder un grupo carbonilo quedando de este modo un fragmento cuya masa es de 129, por lo tanto su M+1 sera 130. El espectro del cido 3,4-dihidroxibenzico presenta varios picos, importantes. Uno de los ms importantes es el pico obtenido a una m/z de 154.87, pues es el debido al M+1 del cido 3,4-dihidroxibenzico. Debido a la prdida de una molcula de agua, se obtiene el fragmento m/z 136.90 y por una prdida del cido de una molcula de CO2 se genera el fragmento de m/z 110.9 (Abad-Garca et al, 2009). El pico cuya m/z es 240.9 debe obtenerse por la formacin de un aducto.
Pgina120
cidos hidroxicinmicos presentes en la cereza El perfil cromatogrfico de absorcin para los cidos hidroxicinmicos se identifica a una absorbancia de 320 nm.En la figura 5.37 se expone el perfil cromatogrfico de los cidos hidroxicinmicos presentes en la cereza agria relacionado con sus respectivos espectros de absorbancia. La propuesta de identificacin de los cidos hidrocinmicos en esta fruta se realiz atendiendo fundamentalmente al tiempo de retencin en que aparecan los picos de los patrones en los cromatogramas, a sus espectros en ultravioleta visible y a sus espectros en masas.
0.40
1
2 3
4
320
AU 0.20 0.00 10.00
20.00
326.8
0.50
30.00 Minutes
40.00
50.00
0.40
0.30 A U
312.5
0.20
227.3
0.10
326.8 516.9 444.2 470.8 476.9478.1502.3 525.4 404.4415.2430.9 456.3469.6482.9496.3508.4 436.9438.2 404.4 421.3
350.00 nm 400.00 450.00 500.00
221.5
0.00
246.2
250.00 300.00
325.6
Figura 5.37: Perfil de los cidos hidroxicinmicos presentes en la cereza agria relacionado con sus respectivos espectros de absorbancia.
En la tabla 5.92 se ofrece la propuesta hecha para los cidos hidroxicinmicos presentes en esta fruta. Esta propuesta se realiz atendiendo fundamentalmente al tiempo de retencin en que aparecan los picos de los patrones en los cromatogramas y a sus espectros en ultravioleta visible.
Tabla 5.92: Propuesta de identificacin de los cidos hidroxicinmicos en esta variedad de cereza.
Nmero de identificacin 1 2 3 4
8,909 12,124 13,819 14,633
Identificacin de los cidos hidroxicinmos Neoclorognico (cido 5-Ocafeoilquinico) cido p-cumaroil qunico Clorognico (cido 3-Ocafeoilquinico) Cafico
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A modo de comparar la forma de los distintos espectros de absorbancia obtenidos, se adjunta la tabla 5.93 en la que se muestran los espectros escalados presentando la misma absorbancia a 320 nm.
Tabla 5.93: Espectros escalados de los cidos hidroxicinmicos de la cereza agria a una absorbancia de 320 nm.
Neoclorognico
326.8
0.40
0.20 0.30

311.3
AU
0.20
AU 0.10
227.3
0.00 250.00 300.00 350.00 nm 400.00
459.9476.9 496.3
450.00 500.00
0.00 250.00 300.00 350.00 nm
397.2
400.00
440.6 468.4 491.4 513.3

450.00 500.00
Clorognico
326.8
0.40
Cafico
326.8
0.05 221.5242.6 A U
241.5
AU 0.20
0.00
0.00 250.00 300.00 350.00 nm 400.00 450.00 500.00
510.8 404.4 426.1 455.1470.8 492.6 525.4

250.00 300.00 350.00 nm 400.00 450.00 500.00
Los hidroxicinmicos identificados por la bibliografa estudiada quedan recogidos en la tabla 5.94.
Tabla 5.94: Bibliografa para los cidos hidroxicinmicos en la cereza agria.
cido hidroxicinmico cido cafico cido p-cumrico cido neoclorognico cido p-3-cumaroil-qunico cido clorognico
Kirakosyan et al (2009) X X -
Jakobek, L. (2007) X X -
Phenol explorer X -
Con el fin de comprobar que dicha propuesta es cierta se procede a examinar los espectros de masas que se presentan en la tabla 5.95.
Pgina122
Tabla 5.95: Espectros de masas de los cidos hidroxicinmicos encontrados en la cereza agria.
Identificacin de los cidos hidroxicinmicos

600000
Espectro de masas
163.11
Inte nsity
400000
Neoclorognico
200000
355.26
0 200.00 400.00 m/z 600.00 800.00 1000.00
146.88
4x106 I n t e n s ity
2x106
118.96
0 50.00
60.29
600000 Intens ity
338.92
150.00 200.00 m/z 250.00 300.00 350.00 400.00
100.00
Clorognico
400000
163.11
78.18 200000 83.17 61.35

0 100.00 200.00
355.17
300.00
400.00
500.00 m/z
600.00
700.00
800.00
900.00
1000.00
400000 I n t e n s it y
85.06 78.13 97.10 118.96 144.92 132.59

150.00
162.94 176.92 324.83 203.84

200.00 m/z 250.00 300.00 350.00 400.00
Cafico
200000 0 50.00
100.00
En los espectros del neoclorognico y del clorognico se pueden ver las mismas seales: el in molecular (355) y el pico base (163). El in molecular se corresponde con su M+1 y el pico base se obtiene por la eliminacin de la parte alcohlica del ster y asi obtener el cido deshidratado (m/z 163.1) (Garca-Abad et al, 2009). Se pueden distinguir perfectamente por el tiempo de retencin, tal y como se muestra en los espectros de la tabla 5.96. Sus diferencias isomricas pueden verse enla figura 5.28 del apartado de cidos hidroxicinmicos presentes en la grosella.
Tabla 5.96: Comparativa del clorognico y del neoclorognico con el patrn.
Clorognico patrn
Tiempo de retencin (min) 13.816
162.93
1.5x106
In te n s ity
1.0x106
5.0x105
144.69
354.93
0.0 100.00 200.00 300.00 400.00 500.00 m/z 600.00 700.00 800.00 900.00 1000.00
Pgina123
Neolorognico muestra Tiempo de retencin (min) 8,909

163.11
600000
Clorognico muestra Tiempo de retencin (min) 13,819

60.29
600000 I n t e n s it y
Intens ity
400000
400000
163.11
200000
355.26
78.18 200000 83.17 61.35

0 100.00 200.00
355.17
0 200.00 400.00 m/z 600.00 800.00 1000.00
300.00
400.00
500.00 m/z
600.00
700.00
800.00
900.00
1000.00
El segundo espectro se sabe que es del cido p-cumaroil qunico porque muestra dos seales: la primera, debida a la prdida de una molcula de agua del cido pcumrico (m/z 147) y la segunda, producto de su in molecular. La principal diferencia entre ambos compuestos es el tiempo de retencin al que salen.Esto es muy apreciable en la tabla 5.97, donde se muestra la comparativa entre el espectro del cido p-cumaroil qunico y el espectro del patrn utilizado.
Tabla 5.97: Comparativa del derivado del cido p-cumrico y el patrn.
Cumrico patrn
200000
cido p-cumaroil qunico muestra

146.88
4x106 I n t e n s it y
146.85
150000 I n t e n s it y
100000
78.09
2x106
50000
118.96
0 50.00
100.00 150.00 200.00 m/z 250.00 300.00 350.00 400.00
338.92
150.00 200.00 m/z 250.00 300.00 350.00 400.00
100.00
Las diferencias estructurales entre el cido p-cumaroil qunico y el cido cumrico se recogen en la figura 5.29 del apartado cidos hidroxicinmicos presentes en la grosella. En el espectro debido al cafico se pueden ver dos seales importantes. La primera en explicar es su pico base obtenido a una m/z 162.9, se produce como consecuencia de la prdida de una molcula de agua del cido cafico y la segunda seal a explicar es la generada a m/z 144.9, consecuencia de la prdida de otra molcula de agua (Abad-Garca et al, 2009). De todos modos se observan gran cantidad de fragmentos ya que la seal del cido cafico es muy dbil. El in molecular no se observa, a diferencia de en el patrn, dnde es el pico base.
Pgina124
Flavanoles presentes en la cereza El perfil cromatogrfico de absorcin para los flavanoles se identifica a una absorbancia de 280 nm. La propuesta de identificacin de los flavanol presentes en esta fruta se realiz atendiendo fundamentalmente al tiempo de retencin en que aparecan los picos de los patrones de los flavanoles en los cromatogramas, a sus espectros en ultravioleta visible y a sus espectros en masas. En la figura 5.38 se muestra el perfil de los flavanoles en la cereza relacionado con sus respectivos espectros de absorbancia.
0.60
Hidroxicinmicos
Antocianinas Flavonoles
280
0.40 AU 0.20
1
0.00 5.00 10.00 15.00
2
20.00 25.00 Minutes 30.00 35.00 40.00 45.00 50.00
0.40
0.30 AU 0.20 0.10
274.5 279.3
0.00 250.00 300.00 350.00
383.9
400.00 nm
436.9
463.6
485.4 512.1 491.4 525.4

500.00
450.00
Figura 5.38: Perfil cromatogrfico de los flavanoles presentes en la cereza agria relacionado con sus respectivos espectros de absorbancia.
Al igual que ocurra en las otras frutas, estos flavanoles presentan una absorbancia demasiado baja para ser diferenciada de la lnea base. Este tipo de compuestos es apreciable en fluorescencia. La propuesta realizada se expone en la tabla 5.98, se realiz atendiendo fundamentalmente al tiempo de retencin en que aparecan los picos de los patrones en los cromatogramas, un poco a sus espectros en ultravioleta visible y sobre todo por su espectro de masa.
Tabla 5.98: Propuesta de identificacin del flavanol presente en este tipo de cereza.
12,590 19,388
Pgina125
La tabla 5.99 muestra los flavanoles identificados por la bibliografa estudiada.
Tabla 5.99: Bibliografa de los flavanoles en la cereza agria.
cido hidroxicinmico
Ferretti et al (2010)
USDA
Chaovanalikit y Wrolstad (2004)
Catequina Epicatequiina
X X
X X
Con el fin de demostrar que la propuesta realizada es la correcta se muestra su espectro de masas en la tabla 5.100.
Tabla 5.100: Espectros de masas de la epicatequina presente en la cereza agria.
Flavanol
122.97 102.31
Espectro de masas
138.84 291.06
150000
Intensity
Catequina
100000
50000
124.11 121.51
199.05
0 50.00
100.00
150.00
138.92
200.00 m/z
250.00
300.00
350.00
400.00
400000
350000
300000
290.93
250000
Epicatequina
Inten sity
200000
122.97
150000
101.02
100000
164.93
50000
0 50.00
100.00
150.00
200.00 m/z
250.00
300.00
350.00
400.00
En estos dos espectros las seales importantes son las mismas. El in molecular que se da a m/z 290.9 y el pico a m/z 138.9, producto de la fractura que sufre la molcula por el anillo B (Abad-Garca et al, 2009).
Fragmento de m/z 138.9 A B
Figura 5.39: Estructura de la epicatequina
La vitamina C en la cereza El cido ascrbico presenta un perfil cromatogrfico de absorcin a una longitud de onda de 243 nm, como se puede apreciar en la figura 5.40. JacintaColladoGonzlez Pgina126
1.00 AU
Hidroxicinmicos
243
Antocianinas
0.50
1
2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 Minutes 18.00 20.00 22.00 24.00 26.00 28.00 30.00
0.00
243.8
0.05 A U
0.00
369.5
393.5
450.2
506.0524.2
-0.05
250.00
300.00
350.00 nm
400.00
450.00
500.00
Figura 5.40: Perfil cromatogrfico del cido ascrbico presente en la cereza agria relacionado con su espectro de absorbancia.
El tiempo de retencin del cido ascrbico presente en la cereza bajo las condiciones de anlisis explicadas anteriormente se muestra en la tabla 5.101.
Tabla 5.101: Identificacin del cido ascrbico.
Identificacin
2,859
cido ascrbico
Segn Ferretti et al (2010), la cereza agria presenta una concentracin de cido ascrbico de 10mg/100g de producto. En la tabla 5.102 se muestra el espectro del cido ascrbico presente en este tipo de cerezas.
Tabla 5.102: Espectro del cido ascrbico presente en la cereza agria.
Identificacin
118.71
Espectro de masas
140.67 227.21218.19 247.86 219.69223.18 308.93 204.34231.16 264.68 306.92 147.39 171.95 198.72 216.37 216.94230.60258.58 289.27 292.17 164.48176.08176.87205.65 220.47 255.46 323.75 162.09
cido ascrbico
355.18
100000 56.3371.14
0 50.00
100.00
150.00
200.00 m/z
250.00
300.00
350.00
400.00
Mediante comparacin con el patrn explicado anteriormente, los picos importantes de este espectro y que merece la pena explicar son dos. El primero y ms importante es el debido a su M+1 (m/z 176.87) y el segundo ms importante es el resultado de perder dos molculas de agua (140.67). Es importante decir que como consecuencia de la poca concentracin que debe haber de cido ascrbico en la cereza y por lo tanto la tan escasa seal producida por este cido junto a los compuestos que tienen una fragmentacin parecida a la de dicho compuesto y que adems salen al mismo tiempo, pues este espectro se obtiene muy contaminado.
Pgina127
2.5.- Uva tinta (Black grape; Vitis vinifera L.) La muestra analizada se trata de un zumo concentrado de esta fruta procedente de la empresa J.Garca Carrin. La muestra es analizada en el laboratorio del edificio de Servicio de Apoyo a la Investigacin Tecnolgica, Edificio I+D+I (SAIT). Anteriormente a su anlisis esta muestra se encuentra congelada a -20C en el laboratorio del departamento de Ingeniera Qumica y Ambiental de la UPCT.
Antocianos presentes en la uva tinta Los antocianos presentes en la uva tinta se identifican con el detector de fotodiodos (PDA) a una absorbancia de 520 nm, lo cual se puede ver en la figura 5.41. El resultado obtenido con el PDA se comprueba con la bibliografa y posteriormente se corrobora dicha identificacin con el espectro de masas obtenido para cada antociano. La propuesta de identificacin de los antocianos en las frutas rojas se ha realizado mediante la comparacin de los datos obtenidos con los de la bibliografa.
0.06 0.04 AU 0.02 0.00
5 1 2 3
520
7 6
10.00
20.00
30.00
40.00 Minutes
50.00
60.00
70.00
80.00
524. 2
0.04
278.1
AU 0.02
524.2 524.2 516.9 525.4 520.6
221.5 221.5
0.00 250.00
278.1 284.0 278.1 280.5282.8 275.7

300.00
324.4332.8347.1 370.7 345.9347.1349.5 391.1

350.00
400.00 450.00 500.00 nm Figura 5.41: Perfil cromatogrfico de los antocianos presentes en la uva tinta relacionado con sus respectivos espectros de absorbancia.
Seguidamente en la tabla 5.103 se plantea la propuesta de identificacin de los antocianos presentes en la uva tinta.
Pgina128
Tabla 5.103: Propuesta de identificacin de los antocianos presentes en la uva tinta.
Nmero de identificacin 1 2 3 4 5 6 7
Tiempo de retencin (min) 21,960 27,390 30,592 36,645 39,241 56,243 65,559
Identificacin de los antocianos Delfinidina-3-O-glucosa Cianidina-3-O-glucsido Petunidina-3-O-glucsido Peonidina-3-O-glucsido. Malvidina-3-O-glucsido Malvidina-3-(6-acetil)glucsido Malvidina-3-(6-cumaroil)glucsido
Con objetivo de comparar la forma de los distintos espectros de absorbancia obtenidos, se adjunta la tabla 5.104 en la que se muestran los espectros escalados presentando la misma absorbancia a 520 nm.
Tabla 5.104: Espectros escalados de los antocianos a 520 nm.
Delfinidina-3-O-glucosa
524.2
0.004
520.6
0.020 AU
AU
278.1
0.003 0.002 0.001
280.5
0.010
347.1
0.000 250.00 300.00 350.00 nm 400.00 450.00 500.00
364.7377.9391.1 328.0 348.3

250.00 300.00 350.00 nm 400.00 450.00 500.00
Petunidina-3-O-glucsido
0.012
Peonidina-3-O-glucsido
516.9
0.010 0.008 AU 0.006 0.004 0.002
0.015
279.3
AU
0.010
278.1
0.005
0.000 250.00 300.00
349.5
350.00 nm 400.00 450.00 500.00
325.6
250.00 300.00 350.00
368.3
400.00 nm
450.00
500.00
Malvidina-3-O-glucsido
523.0
0.006
0.04
Malvidina-3- (6-acetil)-glucsido
221.5 525.4
278.1
AU
AU
0.004
275.7
0.02
0.002
345.9
0.00 250.00 300.00 350.00 nm 400.00 450.00 500.00
347.1
0.000 250.00 300.00 350.00 nm 400.00 450.00 500.00
Malvidina-3-(6-cumaroil)-glucsido
222.6 281.6 524.2
0.010 AU 0.005
250.00
300.00
350.00 nm
400.00
450.00
500.00
Pgina129
Tabla 5.105: Bibliografa para los antocianos en la uva tinta.
Nmero de identificacin 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19
Identificacin de los antocianos Delfinidina-3-O-glucsido Cianidina-3-O-glucsido Petunidina-3-O-glucsido Peonidina-3-O-glucsido Malvidina -3-O-glucsido Delfinidina 3cumaroilglucsido Malvidina-3-(6-acetil)glucsido Cianidina-3-(6cumaroil)-glucsido Petunidina-3-(6cumaroil)-glucsido Peonidina-3-(6cumaroil)-glucsido Malvidina-3-(6cumaroil)-glucsido Cianidina Delfinidina Delfinidina-3-(6cumaroil)-glucsido Delfinidina -3-(6-acetil)glucsido Malvidina Peonidina Petunidina Pelargonidina
Wu y Prior (2005) X X X X X X X X X X X -
Phenol explorer X X X X X X X X

X X X X X -
X X X X X X X X X
Para corroborar dicha propuesta se trabaja con espectrometra de masas. En la tabla 5.106 se presentan los datos referentes a los antocianos identificados en esta fruta.
Tabla 5.106: Espectros de masas de los antocianos identificados en la uva tinta.

I n t e n s it y 200000 83.24101.20
Espectro de masas
60.36 465.26
Delfinidina-3- Oglucosa
61.4296.29
0 100.00 200.00
303.23
300.00 400.00
500.00 m/z
600.00
700.00
800.00
900.00
1000.00
Pgina130
In t e n s ity 500000 55.3783.24
60.36
73.2678.25101.26 74.32
100.00 200.00
287.13
300.00
449.14
400.00 500.00 m/z 600.00 700.00 800.00 900.00 1000.00
400000 60.3683.24 In te n s ity
Petunidina-3-Oglucsido
55.3778.18101.13 96.14
200.00
200000 59.36 0
317.12
300.00 400.00
479.28
500.00 m/z 600.00 700.00 800.00 900.00 1000.00
100.00
Peonidina-3-Oglucsido.
60.36 55.37101.26 200000 78.3288.23 61.42 141.27

0 100.00 200.00
In te n s ity
301.16
463.26
300.00
400.00
500.00 m/z
600.00
700.00
800.00
900.00
1000.00
Malvidina-3-Oglucsido
I n t e n s it y
400000 83.24
493.24 331.29 494.44

400.00 500.00 m/z 600.00 700.00 800.00 900.00 1000.00
73.33 200000 78.25101.20

0 100.00 200.00
300.00
300000
83.17
Malvidina-3- (6-acetil)glucsido
Intensity
200000
78.25 60.29 73.19 72.26 142.23 196.17 331.13 535.33
100000
0 100.00
200000
200.00
300.00
400.00
500.00 m/z
600.00
700.00
800.00
900.00
1000.00
638.97
Malvidina-3-(6cumaroil)glucsido
150000 Intensity
331.03
100000
50000
0 100.00 200.00 300.00 400.00 500.00 m/z 600.00 700.00 800.00 900.00 1000.00
En cuanto a la explicacin de los respectivos espectros, se pueden hacer varias subdivisiones en funcin del grupo flavonoide principal: Se tienen as varios grupos: las delfinidinas(Df) y las cianidinas(Ci), Malvidinas(Mv), Petunidinas (Pt) y las peonidinas (Pn). La Delfinidina-3- O-glucsido presenta dos picos importantes. El primero se corresponde con el M+1 del la estructura principal flavonoide (303.2) y el segundo (465.2) es debido a la glicosilacin de la delfinidina (Valls et al, 2009). En el espectro de la Cianidina-3-O-glucsido se ven dos seales fundamentales. La primera, con una relacin m/z de 287.13, debida a la estructura de la cianidina y la segunda (m/z 449.14) producto de su glicosilacin (Valls et al, 2009). La Petunidina-3- O-glucsido dos seales caractersticas. La primera, producto de la relacin m/z de la estructura principal este flavonoide (317.1) y la segunda (479.3) es debida a la glicosilacin del petunidina (Valls et al, 2009).
Pgina131
El espectro de la Peonidina-3-O-glucsido ofrece dos seales principales. La primera se corresponde con la M+1 del peonidin obtenindose as el pico a la relacin m/z 301.16 y la segunda seal es fruto de la glicosilacin del flavonoide, generndose as un pico a m/z 463.26 (Valls et al, 2009). Por ltimo hay que hablar del grupo de las malvidinas en el que se encuantra las tres malvidinas encontradas: malvidina-3-O-glucsido, la Malvidina-3- (6acetil)-glucsido y la Malvidina-3-(6-cumaroil)-glucsido. Cada una de ellas presenta dos picos caractersticos teniendo el primero en comn (m/z 331). La segunda seal obtenida en cada caso se debe a las respectivas glicosilaciones de la malvidina, de este modo para la primera malvidina encontrada se obtiene una seal de relacin m/z 493.24 (Valls et al, 2009), para la segunda malvidina la seal de m/z 535.3 (Valls et al, 2009) y por ltimo, para la tercera malvidina la seal de m/z 638.9 (Valls et al, 2009).
Flavonoles presentes en la uva tinta Para identificar los flavonoles presentes en la uva tinta se estudia el cromatograma obtenido con el detector de fotodiodos (PDA) a una absorbancia de 360 nm, el resultado obtenido se comprueba con la bibliografa y con los patrones analizados en el departamento, posteriormente se corrobora dicha identificacin con el espectro de masas obtenido para cada flavonol. En la figura 5.42 se muestra el perfil de los flavonoles presentes en esta fruta relacionado con los espectros de absorbancia originados por cada uno de ellos.
0.020
1
0.010 AU
360
0.000
-0.010 10.00 20.00 30.00 Minutes

362.8
40.00
50.00
60.00
221.5
0.010 0.008 0.006 A U 0.004 0.002 0.000
255.6
.
359.7 472.0
222.6 260.3
424.9
-0.002
250.00 300.00 350.00 nm 400.00
462.3 478.1
498.7
523.0 524.2
450.00
500.00
Figura 5.42: Perfil de los flavonoles presentes en la uva tinta relacionado con sus respectivos espectros de absorbancia
En la tabla 5.107 se expone la propuesta de identificacin de los flavonoles presentes en la uva tinta, para la identificacin se atiende al tiempo de retencin.
Pgina132
Tabla 5.107: Propuesta de identificacin de los flavonoles presentes en la uva tinta.
1 2
Identificacin de los flavonoles Miricetina Quercetina
Tabla 5.108: Espectros escalados de los flavonoles de la uva tinta a 360nm.
Miricetina
0.010 0.008 0.006 AU 0.004 0.002 0.000 -0.002
250.00 300.00 350.00 nm 400.00
Quercetina
0.010 0.008
222.6 255.6 362.8
265.1
359.7
0.006 AU 0.004 0.002

434.5 462.3 498.7 515.7
472.0
0.000 -0.002
523.0
450.00
500.00
250.00
300.00
350.00 nm
400.00
450.00
500.00
La bibliografa estudiada identifica en la uva tinta los flavonoles mostrados en la tabla 5.109.
Tabla 5.109: Bibliografa para los flavonoles en la uva tinta.
Flavonoles Miricetina Quercetina Miricetina-3-glucsido Quercetina-3-galactsido Quercetina-3-Oglucurnide Quercetina-3-glucsido Laricitrin-3-O-galactsido Kaempferol Kaempferol-3-Oglucsido Laricitrin-3-O-rhamnosa7-O-cido trihidroxicinmico Kaempferol-3-Ocaffeoilato Isorhamnetina-3-Oglucsido Siringetin-3-Ogalactsido
Downey, Rochfort (2008) X X X X X X X X X
Phenol explorer X X X X -
Xia, Gui-Fang Deng, et al ( 2010) X X X X -
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Para verificar dicha propuesta se recurre a la espectrometra de masas, la cual se muestra en la tabla 5.110. Atendiendo al tiempo de retencin obtenido en masas y por comparacin con el tiempo de retencin obtenido en el PDA se quedan identificados dichos compuestos.
Tabla 3.110: Espectros de masas de los flavonoles presentes en la uva tinta.

Espectro de masas
60.36 319.18
Miricetina
100000
0 100.00
80000.0
200.00
300.00
400.00
500.00 m/z
600.00
700.00
800.00
900.00
1000.00
101.20 73.26
303.25
60000.0 Intensity
Quercetina
77.18 83.24 56.44145.02 103.26 20000.0

40000.0 0.0 200.00 400.00 m/z 600.00 800.00 1000.00
El espectro de la miricetina presenta un pico importante a una relacin de m/z 319 correspondiente a su in molecular (Lin and Harnly, 2007). En el espectro de la quercetina la seal fundamental es la debida a su in molecular (m/z 303.2) (Lin and Harnly, 2007).
cidos hidroxicinmicos presentes en la uva tinta El perfil cromatogrfico de absorcin para los cidos hidroxicinmicos se identifica a una absorbancia de 320 nm. Esto se presenta en la figura 5.43, en la que se puede ver el perfil del cido hidroxicinmico presente en la uva tinta relacionado con su espectro de absorbancia. La propuesta de identificacin de los cidos hidrocinmicos se realiz teniendo en cuenta fundamentalmente su espectros en ultravioleta visible y su espectros en masas.
0.05 0.00 5.00
0.08
AU
320
20.00 25.00 30.00
10.00
328.0
15.00 Minutes
0.06
313.7
A U 0.04
243.8
0.02
228.5 514.5 433.3 450.2462.3476.9 497.5 513.3 427.3 480.5

450.00 500.00
0.00
391.1404.4
250.00 300.00 350.00 nm 400.00
Figura 5.43: Perfil cromatogrfico de los cidos hidroxicinmicos presentes en la uva tinta relacionados con sus respectivos espectros de absorbancia.
Pgina134
La propuesta realizada para estos cidos hidroxicinmicos presentes en la uva tinta se ofrece en la tabla 5.111.
Tabla 5.111: Propuesta de identificacin de los cidos hidroxicinmicos encontrados en la uva tinta.
12,230 17.773
Identificacin de los cidos hidroxicinmos cido caftrico cido p-cumaroil tartrico
Los hidroxicinmicos identificados por la bibliografa estudiada quedan recogidos en la tabla 5.112.
Tabla 5.112: Bibliografa para los cidos hidroxicinmicos presentes en la uva tinta.
cido hidroxicinmico
cido cafico cido p-cumrico cido ferlico cido caffeoil tartrico (caftrico) cido p-cumaroil tartrico
Russell, W. (2009)
X X X -
Phenol explorer
X X
A modo de comparar la forma de los dos espectros de absorbancia obtenidos, se adjunta la tabla 5.113 en la que se muestran sendos espectros escalados presentando la misma absorbancia a 320 nm.
Tabla 5.113: Espectros escalados de los cidos hidroxicinmicos de la uva tinta a 320nm
cido caftrico
0.050
cido p-cumaroil tartrico

313.7
0.040
0.08
328.0
0.06
0.030 AU
AU
0.04
243.8
228.5
0.020
0.02
0.010
0.00 250.00 300.00 350.00 nm 400.00
427.3
462.3 480.5493.9 514.5

0.000
391.1404.4
250.00 300.00 350.00 nm 400.00
433.3
450.00
476.9
513.3
500.00
450.00
500.00
Con el fin de comprobar que la propuesta hecha es cierta se procede a examinar el espectro de masas que se ofrece en la tabla 5.114.
Tabla 5.114: Espectro de masas del cido caftrico y cumaroil tartrico presentes en la uva tinta.
cido hidroxicinmico
163.03
40000.0
Espectro de masas
30000.0 Intensity
83.17
20000.0
cido caftrico
10000.0
0.0 200.00 400.00 m/z 600.00 800.00 1000.00
Pgina135
60.36
300000
Intensity
cido p-cumaroil tartrico
200000
100000
55.37 61.42
83.24
147.05
0 100.00 150.00 200.00 m/z 250.00 300.00 350.00 400.00
En el espectro del caftrico se obtiene un nico pico importante cuya m/z es de 163.03, pico caracterstico de los cidos hidroxicinmicos esterificados. ste es un cido hidroxicinmico esterificado, segn la bibliografa (Abad-Garca et al., 2009), el primer fragmento que se pierde es la parte alcohlica para obtener el cido hidroxicinmico deshidratado (pico a 163.03). El segundo espectro de masas de ls cidos hidroxicinmicos corresponde al cido p-cumaroil tartrico (C13H12O8). En este espectro se obtiene una seal significativa y es la debida a la prdida de la parte alcohlica del ster (147.05). Se puede ver que su espectro del UV Visible es similar al del cido p-cumrico, la principal diferencia que hay entre ambos compuestos es el tiempo de retencin al que salen. Esta diferencia se aprecia bien en los espectros de la tabla 5.115 y en la figura 5.44 queda reflejada la diferencia estructural entre ambos compuestos.
cidopcumaroiltartrico
cidopcumrico
Figura 5.44: Diferencia estructural entre el cido p-cumaroil tartrico y el cido cumrico.
Tabla 5.115: Comparativa entre el derivado del cido p-cumrico y el patrn.
p-Cumrico patrn
200000
cido p-cumaroil tartrico muestra

60.36
300000
146.85
150000 I n t e n s it y
Intens ity 200000
100000
78.09
50000
100000
55.37 61.42
83.24
147.05
0 100.00 150.00 200.00 m/z 250.00 300.00 350.00 400.00
0 100.00 150.00 200.00 m/z 250.00 300.00 350.00 400.00
Pgina136
Flavanoles presentes en la uva tinta El perfil cromatogrfico de absorcin para los flavanoles se identifica a una absorbancia de 280 nm, tal y como se aprecia en la figura 5.45. La propuesta de identificacin del flavanol presente en esta fruta se realiz atendiendo fundamentalmente al tiempo de retencin en que aparecan el pico del patrn correspondiente en el cromatograma, a su espectro en ultravioleta visible y a su espectro en masas.
0.04 AU
Antocianinas
Hidroxicinmicos
280
1
5.00 10.00 15.00 Minutes 20.00 25.00 30.00
286.4 513.3
368.3 223.8
394.8 410.4
430.9
450.2
481.7
498.7
250.00
300.00
350.00 nm
400.00
450.00
500.00
Figura 5.45: Perfil cromatogrfico del flavanol presente en la uva tinta relacionado con su espectro de absorbancia.
Al igual que ocurra en las frutas anteriores, este tipo de compuestos es apreciable visualmente en fluorescencia. La propuesta de este flavanol se realiz atendiendo fundamentalmente al tiempo de retencin en que apareca el pico del patrn en el cromatograma, un poco a su espectro en ultravioleta visible y sobre todo por su espectro de masas. Dicha propuesta se plasma en la tabla 5.116.
Tabla 5.116: Propuesta de identificacin del flavanol presente en la uva tinta.
12,596
Identificacin de los flavanoles Catequina
A continuacin, en la tabla de 5.117, se muestran los flavanoles identificados por la bibliografa estudiada.
Tabla 5.117: Bibliografa para los flavanoles presentes en la uva tinta.
Flavanoles
Catequina Epicatequina Galocatequina Epigalocatequina
Phenol explorer
X X X X

X -
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Con el fin de demostrar que dicha propuesta es correcta se expone su espectro de masas en la tabla 5.118.
Tabla 5.118: Espectro de masas de la catequina identificada en la uva tinta.
Flavanol
20000.0
Espectro de masas
139.19
15000.0 Intensity
Catequina
10000.0
123.25 109.27
5000.0
165.19 146.98
133.42
196.07 207.18 188.25205.09229.75 198.41 194.36 212.33
291.11
367.44
0.0 100.00 150.00 200.00 m/z 250.00 300.00 350.00 400.00
La seal ms importante que se puede ver en el espectro de la catequina es el pico caracterstico de los flavanoles. Este pico se obtiene a una relacin masa/carga 139, se corresponde con una fragmentacin muy intensa que sucede en el heterociclo que contiene un hidroxilo en el carbono al heterotomo. Otra seal tambin muy importante y que es necesario mencionar es la debida a su in molecular, obtenida a una m/z 291.1 (Abad-Garca et al, 2009).
Fragmento cuyam/z=139
C A B
Figura 5.46: Estructura de la catequina
El resveratrol en la uva tinta El perfil cromatogrfico de absorcin para el resveratrol se obtiene a una absorbancia de 280 nm, la misma mxima a la que se miran los flavanoles. Dicho perfil est expuesto en la figura 5.47, donde se relaciona con su espectro de absorbancia. Esta propuesta de identificacin se realiz atendiendo fundamentalmente al tiempo de retencin del patrn en el cromatograma de absorcin, a sus espectros en ultravioleta visible y en masas.
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Hidroxicinmicos Antocianinas
AU
0.02 0.00 5.00
280
10.00
15.00 Minutes
333.9
20.00
25.00
30.00
35.00
0.010 A U
222.6 248.5
298.2
0.005
402.0418.8
0.000 250.00 300.00 350.00 nm 400.00
453.9
493.9
450.00
500.00
Figura 5.47: Perfil cromatogrfico del resveratrol encontrado en la uva tinta relacionado con su espectro de absorbancia.
Como se puede ver el resveratrol, al igual que ocurra con la catequina, es prcticamente inapreciable en UV Visible, para verlo bien es necesaria la tcnica de fluorescencia. La propuesta de la presencia de resveratrol en la uva tinta se realiz fundamentalmente teniendo en cuenta el tiempo de retencin al que sala el pico del patrn en el cromatograma durante su anlisis, un poco a sus espectros en ultravioleta visible y sobre todo por su espectro de masa. Esta propuesta se recoge en la tabla 5.119.
Tabla 5.119: Propuesta de identificacin del estilbeno en la uva tinta.
6.475
Identificacin del estilbeno Resveratrol glicosilado
En cuanto a la bibliografa estudiada para el resveratrol, mostrada en la tabla 5.120, Rimando et al (2004), se identifica para tres tipos de vitis vinfera L.
Tabla 5.120: Bibliografa para el resveratrol en la uva tinta.
Tipos de Vitis vinfera L. segn cultivos Cabernet Pinot Noir Merlot
resveratrol (ng/g muestra seca) 2475 5746 6356
El phenol explorer expone que en la uva tinta se identifica el resveratrol y su glicosilado (piceido). Segn Trela y Waterhouse, a pesar de que se dan tanto la forma cis como la forma trans del resvertrol, en la uva tinta solamente se ha visto el trans-resveratrol. Actualmente se comercializa un frmaco (revidox) que est constitudo por el trans resveratrol. Para conseguir dicha concentracin de trans resveratrol, se irradia, en condiciones de pH bajos (aproximadamente pH=1) una disolucin del ismero cisresveratrol con luz UV durante unas horas (22.8horas). En estas condiciones, se
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obtiene una conversin de trans resveratrol del 95% y se minimiza la conversin del trans en cis resveratrol. Para continuar, en la tabla 5.121 se muestra el espectro de masas del resveratrol glicosilado (piceido).
Tabla 5.121: Espectro de masas del estilbeno identificado en la uva tinta.

150000
Espectro de masas
229.35
Intensity
100000
50000
0 200.00 400.00 m/z 600.00 800.00 1000.00
Como se puede ver en este espectro hay un nico pico (m/z 229.3) que es el que se corresponde con el peso molecular ms uno de la estructura del resveratrol, pero hay que decir que el tiempo de retencin que se ha obtenido dista mucho del obtenido por el patrn, lo que lleva a la conclusin de que el que el compuesto identificado no es el resveratrol propiamente dicho sino un glicosilado de dicho compuesto y por motivo de una hidrlisis muy rpida el azcar no aparece en el espectro. En la tabla 5.122 se puede ver la diferencia de los tiempos de retencin.
Tabla 5.122: Comparativa entre el estilbeno hallado en la uva tinta y el patrn.
Resveratrol patrn
2.5x106 2.0x106 1.5x106 1.0x106 5.0x105
Resveratrol glicosilado muestra

229.35
228.91
I n t e n s it y
100000
50000
0.0 50.00
0
100.00 150.00 200.00 m/z 250.00 300.00 350.00 400.00
200.00
400.00 m/z
600.00
800.00
1000.00
La vitamina C en la uva tinta La vitamina C o lo que es lo mismo el cido ascrbico presenta un perfil cromatogrfico de absorcin a una longitud de onda de 243 nm, el cual se presenta en la figura 5.48.
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0.06 AU 0.04 0.02 0.00 2.00 4.00

242.6 291.1 367.1 424.9447.8 475.7 388.7408.0 331.6 355.4 507.2 524.2
243
6.00
8.00
10.00
12.00
14.00 16.00 Minutes
18.00
20.00
22.00
24.00
26.00
28.00
0.000 A U
-0.005
-0.010 250.00 300.00 350.00 nm 400.00 450.00 500.00
Figura 5.48: Perfil cromatogrfico del cido ascrbico presente en la uva tinta relacionado con su
espectro de absorbancia.
A continuacin, en la tabla 5.123, se muestra el tiempo de retencin del cido ascrbico presente en esta fruta en las condiciones de anlisis explicadas anteriormente.
Tabla 5.123: Identificacin del cido ascrbico en la uva tinta.
Identificacin
2,897
cido ascrbico
Segn la bibliografa, www.consumer.es; Yim Tong Szeto, Brian Tomlinson and Iris F. F. Benzi. (2002) y Phenol explorer la uva tinta o bien presenta un rango de concentracin de cido ascrbico tan bajo que no lo mencionan o bien es que la uva tinta carece de dicho cido. En este trabajo se ha demostrado que hay una muy pequea cantidad de cido ascrbico en esta fruta, para constatar la presencia de la vitamina C en la uva tinta se recurre a la espectrometra de masas que se expone en la tabla 5.124.
Tabla 5.124: Espectro de masas del cido ascrbico en la uva tinta.
Identificacin
200000
Espectro de masas
307.22 190.91
150000 Intensity
74.32
100000
cido ascrbico
55.44
195.03 177.15
289.20 313.19
50000
0 100.00 200.00 300.00 m/z 400.00 500.00 600.00
Por comparacin con el patrn explicado anteriormente, en este espectro hay que destacar la seal obtenida a la relacin m/z 177.1 generada por el in molecular. En cualquier caso, la concentracin de vitamina C es baja y el espectro de masas est muy contaminado por la presencia de otros compuestos que eluyen a tiempos de retencin muy similares.
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3.- Resumen de los polifenoles identificados en estas cinco frutas 3.1.- Antocianos identificados La propuesta de identificacin de antocianos en las frutas rojas se ha realizado fundamentalmente mediante comparacin de los datos obtenidos con los de la bibliografa disponible. La Tabla 5.125 presenta el conjunto de todos los antocianos identificados (20 en total) en cada una de las frutas rojas analizadas. Mirtilo: se identificaron un total de catorce antocianos de los cuales cinco son los ms caractersticos: Delfinidina-3-galactosido, Delfinidina-3-glucosido, Cianidina-3glucosido, Petunidina-3-glucosido y Malvidina-3-glucosido. Arndano europeo: se identificaron tres antocianos, siendo el ms caracterstico el Cianidina-3-galactosido. En el caso de ir acompaado este fruto con el mirtilo, su perfil cromatogrfico se obtendra enmascarado con este ltimo, lo cul deber tenerse en cuenta al analizar las mezclas de ambas frutas. Grosella negra: se identificaron cinco antocianos de los cuales dos son los caractersticos: Delfinidina-3-rutinosido y Cianidina-3-rutinosido. Cereza: se identificaron dos antocianos. El ms caracterstico es el Cianidina-3glucosil rutinosido. Uva tinta: se identificaron cinco antocianos de los cules tres son los ms caractersticos: Malvidina-3-glucosido, Malvidina-3-(6-acetil)-glucsido y la Malvidina3-(6-cumaroil)-glucsido.
Tabla 5.125: Tabla resumen de los antocianos encontrados en las cinco frutas rojas estudiadas.
Propuesta de identificacin Delfinidina-3o-galactsido Delfinidina-3o-glucsido Delfinidina-3o-rutinsido Cianidina-3-oglucosilrutinsido Cianidina-3-ogalactsido Delfinidina-3o-arabinsido Cianidina-3-oglucsido
Tiempo de retencin (minutos) 21,054 22.374 22,827 23,322 26,132 26,918 28,439
Mirtilo (Blueberry) X X
Arndano europeo (Cranberry)
Grosella negra (Blackcurrant)
Cereza agria (Sour cherry)
Uva tinta (Black grape)
X X X
X X X
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Cianidina-3-orutinsido Petunidina-3o-galactsido Petunidina-3o-glucsido Delfinidina Cianidina-3-oarabinsido Peonidina-3o-galactsido Petunidina-3o-arabinsido Peonidina-3o-glucsido Malvidina-3-ogalactsido Malvidina-3-oglucsido Malvidina-3-oarabinsido Malvidina-3(6-acetil)glucsido Malvidina-3(6-cumaroil)glucsido 28,741 29,326 31,304 32,248 32,452 34,854 35,994 37,423 37,746 39,933 44,270 56,423 65,559 X X X X X X X X X X X X X X X X X
3.2.- Flavonoles identificados La propuesta de identificacin de flavonoles en las frutas rojas se ha realizado fundamentalmente mediante comparacin de los datos obtenidos con los de la bibliografa disponible. La Tabla 5.126 presenta el conjunto de todos los flavonoles identificados (11 en total) en cada una de las frutas rojas analizadas: Mirtilo: se identificaron un total de cuatro flavonoles, siendo dos los ms caractersticos: Quercetina-3-o-galactsido y Quercetina glucurnico. Arndano europeo: se encontraron cuatro pero se pudieron identificar solamente dos flavonoles, siendo el ms caracterstico la Quercetina-3-o-rhamnsido. Grosella negra: se identificaron tres flavonoles de los cuales el ms caracterstico es: la Miricetina-3-o-rutinsido. Cereza: se identificaron cuatro flavonoles de los cuales los ms caractersticos son dos: Quercetina-3-o-glucosil-rutinsido y Quercetina-3-o-rutinsido. Uva tinta: se identificaron los dos flavonoles ms caractersticos de esta fruta: Miricetina y Quercetina.
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Tabla 5.126: Tabla resumen de los flavonoles identificados en las cinco frutas rojas estudiadas.
Propuesta de identificacin Quercetina-3o-glucosilrutinsido Miricetina-3-orutinsido Miricetina Quercetina-3o-glucsido Quercetina-3o-rutinsido Quercetina-3o-galactsido Quercetina Quercetinaglucurnico Kaemperol-3o-glucsido Quercetina-3o-rhamnsido Isorhamnetina3-o-glucsido
Tiempo de retencin (minutos) 24,325 28,294 30,188 37,417 37,533 39,118 39,326 41,126 45,794 47,347 47,473
Mirtilo (Blueberry)
Cereza agria (Sour cherry) X
X X X X X X X X X X X X X X
3.3.- cidos fenlicos identificados

La propuesta de identificacin de los cidos fenlicos en las frutas rojas se realiz atendiendo fundamentalmente al tiempo de retencin en que aparecan los picos de los patrones en los cromatogramas y a su espectro en ultravioleta visible. La Tabla 5.127 muestra los 13 cidos fenlicos que se han identificado, si bien, se han podido detectar un mayor nmero de compuestos que todava faltaran por identificar, el cual es uno de nuestros siguientes objetivos. Los perfiles de composicin de cidos fenlicos para estas cinco frutas son diferentes y pueden ser utilizados como criterio de autenticidad de cada una de las frutas. El perfil del arndano europeo es caracterstico y se basa, entre otros componentes, en la presencia de cido cafico y cido clorognico. En el supuesto de una mezcla de arndano y mirtilo, el conocer el contenido en cido cafico-glucosilado y de cido cafico de cada fruta sera de gran inters.
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Tabla 5.127: Tabla resumen de los cidos fenlicos hallados en las cinco frutas rojas estudiadas.
Propuesta de identificacin
Tiempo de retencin (minutos)
Mirtilo (Blueberry)
cido glico cido 3,4dihidroxibenzico Neoclorognico cido-4hidroxibenzico4-glicsido cido p-Cumaroil qunico cido caftrico cido cafico-3glicsido Clorognico Cafico cido ferlico-4glicsido cido p-cumrico cido cinmico
4,426 8,033 9,205 10,614 12,180 12,230 12,670 14,007 15,608 16,948 26,301 62,347
X X
X X
X X
X X X
X X X X
X X X X X X X X X
3.4.- Flavanoles, estilbenos y cido ascrbico identificados

La identificacin de estos compuestos en las frutas rojas se llev a cabo principalmente considerando el tiempo de retencin en el que aparecan los picos de los patrones en los cromatogramas y a su espectro en ultravioleta visible. En la tabla 5.128 se recogen los cuatro compuestos identificados para las diferentes frutas.
Tabla 5.128: Tabla resumen de los flavanoles, estilbenos y del cido ascrbico identificados en las cinco frutas estudiadas.
Propuesta de identificacin
Tiempo de retencin (minutos)
Mirtilo (Blueberry)
Catequina Epicatequina Resveratrol glicosilado cido ascrbico
12,444 19,486 6,542 2,933
X X X
X X X X
X X X
X X X X X
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CAPTULO6.CONCLUSIONES
1.- CONCLUSIONES En base a los resultados conseguidos hasta el momento y del anlisis de la informacin recogida en la presente memoria se desprenden las siguientes conclusiones: 1. La utilizacin de este mtodo mejorado del mtodo analtico por HPLC IFU n 71 de anlisis de antocianos variando el gradiente de elucin, y que est implementado con el uso simultneo de dos detectores: el habitual de fotodiodos y un segundo detector de masas ayuda en la deteccin de los polifenoles presentes en los zumos. 2. La espectrometra de masas es una tcnica muy apropiada para la identificacin llevada a cabo en este proyecto, consiguindose una confirmacin de los compuestos identificados previamente con PDA, adems, posibilita la identificacin de aquellos compuestos que no se aprecian bien con el detector de fotodiodos. Esto permite obtener una huella dactilar ms precisa de los zumos de frutas pudindose, de este modo, detectar las posibles adulteraciones puedan producirse en stos durante su comercializacin. 3. Debe tenerse en consideracin que aquellos compuestos cuyo peso molecular es muy bajo van a poder aparecer enmascarados con las fracciones de los otros compuestos de alto peso molecular que eluyan en tiempos cercanos. Para solventar esta dificultad, se ha estudiado la posibilidad de que aqullos sufran el menor nmero de fragmentaciones posibles disminuyendo el voltaje de cono en el detector de masas. 4. El mtodo empleado permite analizar prcticamente todos los polifenoles de las frutas rojas, adems de otros compuestos como la vitamina C, es de gran inters para el control de calidad y para conocer la huella dactilar de cada uno de los zumos en su posible etiquetado. Adems, esto permitir identificar y cuantificar los componentes de las frutas rojas que pueden mostrar efectos beneficiosos para la salud de los consumidores. 5. Cada fruta ha mostrado unos perfiles caractersticos de antocianos, flavonoles, cidos fenlicos y flavanoles, que sirven como criterio de autenticidad de esa fruta. 6. Con este mtodo se han logrado identificar en los zumos de las cinco frutas rojas estudiadas un total de 48 compuestos, de los cuales 20 son antocianinas, 11 son flavonoles, 13 cidos fenlicos, 2 flavanoles, un estilbeno y el cido ascrbico.
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CAPTULO7.BIBLIOGRAFA
1.- BIBLIOGRAFA
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Identificación de Los Polifenoles en Zumos de Frutas Rojas

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IDENTIFICACINDELOS POLIFENOLESENZUMOSDEFRUTAS ROJAS

Titulacin: Intensificacin: Alumna: Directores de proyecto:

Cartagena, 9 de Diciembre de 2011.

Identificacin de Polifenoles en Zumos de frutas rojas

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Proyecto Fin de Mster

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54 54 57 63 63 84 98 114 128 141 141 142 143 144 145 146

Identificacin de Polifenoles en Zumos de frutas rojas

Figura 1.1: Variedad de frutas en la dieta

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Figura 1.2: Ejemplos de zumos de frutas rojas.

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Propiedades gstricas: Esta propiedad est relacionada con las propiedades

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Figura 1.3: distintos tipos de zumos de frutas

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cido glico C7H6O5

cido vanllico C8H8O4

cido elgico C14H6O8

cido sirngico C9H10O5

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Figura 1.5: Imagen de las estructuras de los cidos cinmicos ms representativos.

Tabla 1.2: Estructura de los cidos hidroxicinmicos

cido cinmico C9H8O2

cido cafico C9H8O4

cido ferlico C10H10O4

cido p-cumrico C9H8O3

cido sinpico C11H12O5

cido clorognico C16H18O9

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Tabla 1.6: Estructura de las antocianidinas

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En la tabla 1.10 se exponen ejemplos de presencia de algunos flavonoides en los alimentos:

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En la figura 1.9 esta comparacin se hace ms visible:

Figura 1.11: Los sabores ms vendidos en Europa

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Figura 1.12: Ejemplos de las distintas variedades de zumos y nctares

En cuanto a los sabores ms comercializados en Espaa son mostrados en la figura 1.13:

Figura 1.13: Los sabores ms comercializados en Espaa

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Tabla 1.16: Composicin nutricional del mirtillo

Composicin por 100 gramos de porcin comestible

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Composicin por 100 gramos de porcin comestible

La forma en que se comercializa esta fruta es en forma de zumo y de zumo concentrado.

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La forma en que se comercializa esta fruta es en forma de zumo y de zumo concentrado.

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