Preparacin, fijacin y coloracin simple de frotis y descripcin morfolgica de bacterias y hongos.

Jos R. Moran Castillo y Rosa A. Ferrer Hernndez. Universidad Nacional Experimental Sur del Lago, carrera Ingeniera de Alimentos, U.C. Microbiologa General. Resumen: En microbiologa se han desarrollado muchas tcnicas para el estudio de bacterias, una de ellas es la forma de cultivarlos que fue estudio de la prctica anterior, en esta prctica se llev a cabo una nueva tcnica para estudiar las bacterias como lo es la tincin de frotis, teniendo como la tincin ms resaltante la tincin Gram, la cual ser explicada ms adelante en este informe. Al instante de comenzar a trabajar en el laboratorio el primer paso fue desinfectar con alcohol el mesn de trabajo para as comenzar con el primer mtodo que fue la preparacin de frescos a partir de un cultivo bacteriano lquido y de uno solido (echerichia coli), en el segundo mtodo se llev a cabo la preparacin de frotis tambin a partir de medio de cultivo bacteriano lquido y solido (echerichia coli) los cuales se fijaron, en el tercer mtodo se efecto la tincin simple en unos de los frotis preparado y la tincin Gram en el frotis restante, mientras que la preparacin de frescos no se tio y por ltimo se llev a cabo el montaje de hongos tiendo y observando en el microscopio. Luego del montaje de los hongos, se observ en el microscopio cada uno de los frotis y frescos preparados. Introduccin: La observacin vital (frescos) consiste en colocar una pequea muestra de un medio de cultivo en el portaobjetos y colocndole encima de la muestra un cubre objetos y observar, principalmente permite visualizar la motilidad de las bacterias. La tincin simple se basa en la afinidad del colorante por los componentes celulares. La tincin simple se utiliza para destacar el microorganismo completo para que se vean las formas y las estructuras celulares bsicas. En la tinciones simples se usa un nico reactivo, que preferentemente es de tipo bsico y contiene un cromgeno (compuesto que da color al tinte) con carga positiva, ya que la pared celular de las bacterias posee componentes con carga negativa que atraen y enlazan el cromgeno. Se utilizan solamente para incrementar el contraste; todas las clulas absorbern el colorante y quedarn teidas del mismo color. Por tanto, la tincin simple mejora la observacin de la clula completa). Se denomina frotis a la extensin que se realiza sobre un portaobjetos de una muestra o cultivo con objeto de separar lo ms posible los microorganismos, ya que si aparecen agrupados en la preparacin es muy difcil obtener una imagen clara y ntida. Este frotis debe ser posteriormente fijado al vidrio del portaobjetos para poder aplicar los mtodos habituales de tincin que permiten la observacin al

microscopio de las bacterias sin que la muestra sea arrastrada en los sucesivos lavados. La fijacin de una extensin bacteriana hace que las bacterias queden inactivadas y adheridas al vidrio alterando lo menos posible la morfologa bacteriana y las posibles agrupaciones de clulas que pudiera haber. La tincin simple es una de las tcnicas aplicada en la prctica y la otra tcnica de tincin que se efectu en la prctica fue la tincin Gram es uno de los mtodos de tincin ms importantes en el laboratorio bacteriolgico y con el que el estudiante debe estar perfectamente familiarizado. Su utilidad prctica es indiscutible y en el trabajo microscpico de rutina del Laboratorio de Microbiologa las referencias a la morfologa celular bacteriana (Cocos, Bacilos, Positivos, Negativos, Etc.) se basan justamente en la tincin de GRAM. Esta tincin se denominada as por el bacterilogo dans Christian Gram, quien la desarroll en 1844. Sobre la base de su reaccin a la tincin de Gram, las bacterias pueden dividirse en dos grupos, Gram positivas y Gram negativas (en este caso, los trminos positivo y negativo no tiene nada que ver con carga elctrica, sino simplemente designados grupos morfolgicos distintos de bacterias). Clsicamente los reactivos utilizados para la realizacin de la tincin de Gram han sido el cristal violeta como colorante inicial, la solucin de lugol para acomplejar a ste, el alcohol y/o acetona para la decoloracin y la safranina o fucsina bsica como contra colorante. Las Gram negativas a la hora de la observacin microcopia se vera de color fucsia, mientras que la Gram positiva se vern violeta. Los hongos son organismos eucarioticos y de mayor tamao que las bacterias. (scrib.com; practica 3 de microbiologa). Los objetivos de la practicar fueron los siguientes: Aprender la tcnica de preparacin de frescos a partir de medio de cultivo slido y lquido. Para observacin microbiolgica. Conocer mtodos de preparacin, fijacin y coloracin de frotis, la observacin de bacterias a partir medio slido y lquido. Identificar microscpicamente las principales formas bacterianas y la importancia de las tinciones simples para la caracterizacin morfolgica. Conocer las principales caractersticas morfolgicas (macroscpicas y microscpicas) de los hongos.

Materiales y mtodos: Los materiales utilizados en la prctica fueron: Cultivos solido Cultivo liquido bacteriano Safranina bacteriano Cronometro Cultivo de hongos Cinta adhesiva

Azul de metileno

Gotero

Aguja de diseccin

Alcohol-cetona Microscopio Asa de platino Portaobjetos Cubreobjetos

Lugol Mechero Algodn Papel absorbente Pipeta Pasteur

Marcador indeleble Piseta con agua destilada Pinzas de madera Alcohol isopropilico Mantel

Los mtodos fueron: El cultivo bacteriano lquido y solido que se utilizara como muestra es echerichia coli. Excepto los montajes de hongos que son con una especie de hongo desconocida. 1. Preparacin de frescos a partir de cultivo solido: Lavar y secar muy bien el portaobjeto y roturarlo, depositar con el asa una gota de agua o solucin salina en el portaobjeto, luego se toma una pequea muestra de la cepa y emulsionarla con el agua, colocar de inmediato el cubre objeto sobre la muestra y observar al microscopio describiendo lo observado. 2. Preparacin de frescos a partir de cultivo liquido: Lavar y secar muy bien el portaobjeto y roturarlo, depositar con el asa una gota del medio de cultivo, colocar de inmediato el cubre objeto sobre la muestra y observar al microscopio describiendo lo observado. 3. Preparacin y fijacin de frotis a partir de cultivo solido: Lavar y secar muy bien el portaobjeto y roturarlo, depositar con el asa una gota de agua o solucin salina en el portaobjeto, luego flamear el asa hasta que quede al rojo vivo y dejar enfriar el asa, tomar la muestra de la caja de Petri con el asa previamente flameada, emulsionar la gota de agua con la muestra, extender suavemente en un rea de 2 cm, dejar secar la preparacin a temperatura ambiente. Luego de haber esperado que se secara a temperatura ambiente se fijaron tomando por un extremo del portaobjetos y se pas 3 veces por la llama azul del mechero. 4. Preparacin y fijacin de frotis a partir de cultivo liquido: Lavar y secar muy bien el portaobjeto y roturarlo, luego flamear el asa hasta que quede al rojo vivo y dejar enfriar el asa, tomar la muestra de la fiola quitndole el tapn y flameando la boca de la fiola con el asa previamente flameada, extender suavemente en un rea de 2 cm, dejar secar la preparacin a temperatura ambiente. Luego de haber esperado que se secara a temperatura ambiente se fijaron tomando por un extremo del portaobjetos y se pas 3 veces por la llama azul del mechero. 5. Tinciones simple de frotis: Se tom uno de los frotis y se hizo una tincin simple esto se realiza de esta forma, se cubre el frotis previamente fijado con 2 gota de azul de metileno se deja durante 30-60 segundos, luego

se elimina el exceso de colorante con un lavado suave con agua corriente o destilada, dejar secaral aire y observar. 6. Tinciones diferenciales Gram de frotis: Se toma el frotis previamente preparado, sujetar con una pinza o con la mano el portaobjeto por un extremo, luego se agrega con un gotero 2 gotas de cristal violeta y dejarlo durante un minuto, transcurrido el tiempo lavar cuidadosamente con agua destilada, sacudir y agregarle al frotis 2 gotas de lugol y dejarlo durante un minuto, lavar inmediatamente con agua destilada, luego se agrega con el gotero 2 gotas de alcohol-cetona y dejarlo durante 30 segundos, lavar cuidadosamente con agua destilada seguidamente agregar con el gotero 2 gotas con safranina y dejarlo durante 30 segundos lavar cuidadosamente con agua destilada eliminando el exceso de agua con papel absorbente, dejar secar al aire libre y observar al microscopio. 7. Montajes de hongos con azul de metileno: Realizar una descripcin macroscpica. Se corta una tira de 4 a 5cm de cinta adhesiva tomndola nicamente de los extremos, luego cerca del mechero se abre la placa de Petri y se presiona suavemente la cinta sobre la colonia, luego se agrega sobre la cinta 1 gota de azul de metileno, previamente colocada en el centro del portaobjetos dicha cinta funcionara como cubre objetos por lo que se debe de aplanar la muestra evitando que se formen burbujas sin alterar demasiado las estructuras, se deja reposar durante un periodo de tiempo de 3 a 5 minutos luego se limpia el exceso de colorante especficamente en la parte superior de la cinta plstica con papel absorbente, y hacer las observaciones en el microscopio con los objetivos de 10x y 40x. 8. Montajes de hongos con lacto fenol: Realizar una descripcin macroscpica. Se corta una tira de 4 a 5cm de cinta adhesiva tomndola nicamente de los extremos, luego cerca del mechero se abre la placa de Petri y se presiona suavemente la cinta sobre la colonia, luego se agrega sobre la cinta 1 gota de azul de metileno, previamente colocada en el centro del portaobjetos dicha cinta funcionara como cubre objetos por lo que se debe de aplanar la muestra evitando que se formen burbujas sin alterar demasiado las estructuras, se deja reposar durante un periodo de tiempo de 3 a 5 minutos luego se limpia el exceso de colorante especficamente en la parte superior de la cinta plstica con papel absorbente, y hacer las observaciones en el microscopio con los objetivos de 10x y 40x. Resultados: Los resultados fueron los siguientes: 1. Preparacin de frescos a partir de medio de cultivo slido y liquido: se observa grandes cantidades de bacterias, en el fresco a partir de medio liquido se observa una lnea en el medio de la observacin y al lado derecho con las bacterias en constante movimiento, mientras que en el

slido estaban alrededor de unas burbujas de aire y tambin en movimiento pero ms diminuto.

2. Frotis (tincin simple): Se logr observar grandes cantidades de bacterias en este caso sin movimiento, tambin se pudo ver su forma alargada (bacilos), caractersticas morfologas bsicas.

3. Frotis (Tincin Gram): En el montaje de esta tincin se observ que las bacterias eran de color fucsia, haba gran cantidad de bacterias, su forma era alargada y estaban juntas las bacterias.

4. Montaje de hongo con azul de metileno: En la descripcin macroscpica de este hongo, su color y su apariencia era como borra de caf, suba a la superficie, penetraba el medio y su crecimiento era de forma anillada.

5. Montaje de hongo con lacto fenol: En su descripcin macroscpica se tiene que su color era verdosos (distintas tonalidades), penetra en la especie en forma aterciopelada. En los resultados microscpico se tiene que se observ formas filamentosas, tambin se distinguan hifas, tambin estructuras sexuales (conidias pegadas).

Discusin de resultados: Al referirse a los resultados obtenidos en la observacin microscpica de las diferentes tinciones de frotis, tambin las observaciones de frescos y de los hongos es muy interesante ya que al observarlos macroscpicamente tanto en los cultivos bacterianos como en loa hongos se ve muy sencillo pero al investigarlo microscpicamente se puede detallar u observar diferentes caractersticas como su forma, movimiento, estructura, entre otras. Al discutir y analizar la primera observacin (hongo teido con azul de metileno), se observ microscpicamente un color verdoso esto es consecuencia de que el azul de metileno es un colorante bsico es decir penetra las clulas y las tie y con el color original del hongo hay un contraste de color verdoso, tambin se observan los conidios, cabe resaltar que la especie del hongo es desconocida. Siguiendo con las observaciones (hongo teido con lactofenol) en este se observaron estructuras sexuales (conidias), tambin se observaron hifas y se vea un color amarilloso por efecto del colorante En la tercera observacin fue la de frescos (solidos), en la cual se ven las bacterias al igual que en la observacin de los frescos (lquidos) la cual se distinguen solamente grandes cantidades de bacterias y movimiento de las mismas, no se observa ninguna otra caracterstica ya que los frescos no se tieron. Al centrarnos en los resultados microscpicos del frotis (tincin simple) a parte de ver las bacterias tambin se distinguen su forma (alargadas) esto quiere decir que es un bacilo, pero en esta observacin no se percibe movimiento ya que las bacterias mueren al momento de ser fijadas, en esta tincin solo se ve la morfologa bsica ya que el azul de metileno tie todas las bacterias por igual ya que es un colorante bsico y realiza el contraste necesario para mejorar la observacin. Y en la tincin Gram que fue la ltima en observar se determinan que las bacterias eran bacilos por su forma alargada, y Gram negativa por el color que tenan en el momento de la observacin que eran fucsia, ese color lo toma debido a que su pared no es

muy gruesa y basndonos en los fundamentos tericos cuando se obtienen esas caractersticas se llega a esas conclusiones. Al investigar algunas caractersticas de la bacteria la cual fue utilizada en la prctica (echerichia coli) nos damos cuenta que esta bacteria es un bacilo, y es Gram es decir que concuerdan los resultados con el fundamento terico entonces viendo esto la prctica fue llevada a cabo de manera efectiva. Conclusiones: Al observar cada muestra, concluimos que la preparacin de frotis, de fijacin, y de tincin fue la correcta. Ya que observamos lo esperado. Se pudo identificar correctamente la morfologa de los microorganismos, se vio la diferencia de dos diferentes mtodos de tincin (simple y diferencial). Y se comprendi la importancia de estos mtodos. La observacin de bacterias al microscopio se dificulta por la falta de contraste, por ello es imprescindible teirlas con el uso de algn colorante. La tincin simple es muy importante aunque solo sirve para observar estructuras bsicas de bacterias La tincin de Gram resulta de gran importancia para poder identificar el tipo de bacteria de acuerdo a la clasificacin dada por la composicin de sus paredes en Gram positivas y Gram negativas, as mismo para la identificacin morfolgica de las mismas. Para el manejo de las muestras en el laboratorio de microbiologa, se requiere extremada precaucin para evitar contaminaciones con los cultivos, muestras y posibles infecciones que podamos contraer. Para evitar eso, usamos muy eficazmente el mechero. Los hongos se observaron correctamente obteniendo lo esperado. Bibliografa: Preparacin, Fijacin Y Coloracin Simple De Frotis. Tincin Diferencial De Gram Y Tinciones Selectivas. BuenasTareas.com. Recuperado 22-2, 2013, de http://www.buenastareas.com/ensayos/Preparaci%C3%B3nFijaci%C3%B3n-y-Coloraci%C3%B3n-Simple-De/5689878.html Tinciones Gram. Tinciones simples y diferenciales. Recuperado 22-22013. De: http://es.scribd.com/doc/54954638/Informe-de-Microbiologia Aranguren Y, Machado E, Mora Y, Isea F, Manual de prctica de microbiologa para ingeniera de alimentos. 2013.