Coloraciones

Un colorante biolgico es una molcula que es capaz de unirse a una estructura de

la clula y darle color. Los colorantes se emplean tambin en la constitucin de los
medios de cultivo, como indicadores o como inhibidores.
En microbiologa, las coloraciones tienen diferentes objetivos: demostrar los
microorganismos y algunas otras clulas en diferentes especmenes; poner de
manifiesto algunas caractersticas morfolgicas y estructuras microbianas tales
como: esporas, flagelos, grnulos, cpsulas, etc., y diferenciar los microorganismos
segn su comportamiento tintorial.
Los colorantes que se extraen de productos vegetales o animales se
denominancolorantes naturales, entre los que se encuentran: el carmn, el tornasol,
el ndigo y la hematoxilina. Otros, como los extrados del alquitrn de hulla, son
anilinas sintticas. En la actualidad, el trmino colorante de anilina se est
abandonando porque muchos de los colorantes sintticos en uso, no derivan de la
anilina.
Los cidos y las bases libres son, en general, poco solubles, por lo que en
microbiologa se utilizan casi exclusivamente las sales de los cidos y de las bases
colorantes. Los llamadoscolorantes bsicos contienen un catin coloreado unido a un
anin incoloro y los cidosconstan de un catin incoloro unido a un anin coloreado.
Los bsicos son los ms usados en bacteriologa, debido a que las bacterias, ricas en
cidos nucleicos, portan cargas negativas en forma de grupos fosfatos, los que se
combinan con los colorantes cargados positivamente.
Entre los colorantes bsicos, los ms empleados son: tionina, azul de toluidina, azul
de metileno, fucsina, violeta cristal, violeta de genciana, verde metilo, safranina y
verde de malaquita. Entre los cidos podemos citar: naranja G, cido pcrico, fucsina
cida y eosina.
Los colorantes cidos se utilizan en tcnicas especiales, coloraciones negativas o en
mtodos para estudiar algunas estructuras bacterianas, fundamentalmente
citoplasmticas.
Existe un grupo de sustancias, cuya base y cido tienen carcter colorante, y son
denominadas colorantes neutros. Entre ellos se encuentra el grupo de los eosinatos:
eosinato de azul de metileno, de azul de toluidina, de violeta de metilo.
El primer paso de cualquier coloracin es la preparacin del frotis, el que puede
realizarse a partir de las colonias, de cultivos en caldo y de las muestras o productos
patolgicos que se examinan.
En la preparacin de los frotis es necesario seguir el mtodo establecido, cuyos pasos
fundamentales consisten en extender el material sobre la lmina portaobjeto, secar
al aire o con ligero calor y fijar con calor. Algunos frotis pueden fijarse con metanol,
alcohol absoluto o cloroformo.
El frotis debe ser preparado de manera tal que al realizar la observacin microscpica,
los microorganismos se encuentren con la separacin adecuada que permita la
ptima visualizacin de cada uno, lo que se logra al hacer una preparacin cuidadosa,
que no sea demasiado gruesa, evitando las masas de microorganismos.
El objeto de toda coloracin es fijar el colorante sobre la materia a teir con una
intensidad tal que un lavado con el solvente que sirvi para preparar el bao de
tintura, no la decolore.
Las soluciones colorantes que se emplean en bacteriologa son, en general, acuosas.
Cuando los microorganismos se tien por simple inmersin en el bao colorante, se
denominan coloraciones directas, y cuando se tien tras la accin de un mordiente,
se nombran coloraciones indirectas o por aplicacin de un mordiente.
Las coloraciones simples utilizan una sola sustancia colorante. En las coloraciones
diferenciales, combinadas o compuestas se hacen actuar simultnea o sucesivamente
varios colorantes con el fin de demostrar diferencias entre las estructuras de las
clulas. En microbiologa mdica se usan con mucha frecuencia dos mtodos de
coloraciones compuestas o diferenciales, la coloracin de Gram y la coloracin de
Ziehl-Neelsen.
Coloraciones simples

Usan un solo colorante, no distinguen por lo tanto, organismos ni estructuras con

reacciones tintoriales diferentes. Se emplean para la observacin del tamao, forma
y agrupacin de las clulas.
El proceder consiste en dejar actuar, durante un tiempo, la solucin colorante sobre
el frotis. Los colorantes ms empleados son: azul de metileno, fucsina diluida, tionina
fenicada, azul de toluidina, safranina y cristal violeta.
Coloraciones compuestas o diferenciales
Coloracin de Gram
En 1884, Hans Christian Gram desarroll un mtodo de tincin bacteriana que
coloreaba algunas clulas de color azul-violeta y otras que se decoloraban, se tean
con el color de la solucin colorante empleada como contraste.
En el procedimiento para la coloracin de Gram se usan cuatro reactivos diferentes.
El primero es una solucin de cristal violeta (cloruro de hexametil-p-rosanalina), que
tie todas las clulas de color azul-violeta.
El segundo reactivo es una solucin de Lugol (yodo-yoduro de potasio). El yoduro
remplaza al cloruro en la molcula de cristal violeta y el complejo formado se vuelve
insoluble en agua. Todas las clulas reaccionan de igual forma.
La adicin de un tercer reactivo, decolorante (acetona y etanol), remueve solamente
el colorante de las clulas gramnegativas. Con el fin de explicar esta manera de
actuar se han planteado diversas causas, entre ellas, diferentes uniones al magnesio,
a las ribonucleasas o al cido nucleico. Tambin se sealan diferencias en la
permeabilidad, que sugiere que el alcohol decolora la membrana externa de las
bacterias gramnegativas, las cuales permiten la salida del complejo cristal violetaLugol.
La safranina, colorante de contraste y cuarto reactivo empleado en el mtodo, hace
visible las clulas gramnegativas al teirlas de color rojo.
Se ha demostrado que la estructura de la pared bacteriana es la base de la reaccin
diferencial frente a la coloracin de Gram. Las bacterias teidas de azul-violeta,
llamadas grampositivas, poseen grandes cantidades de cido teicoico en sus paredes
celulares; y las teidas en rojo, bacterias gramnegativas, contienen lipopolisacridos.
Se han descrito diferentes modificaciones al mtodo original de Gram, entre las que
podemos citar:
La modificacin de Hucker, que recomienda la utilizacin de una solucin de cristal
violeta en lugar de la violeta genciana empleada por Gram.
Otra modificacin es la que emplea carbolfucsina como colorante de contraste y se
recomienda para el estudio de bacilos anaerobios gramnegativos y de las especies
del gnero Legionella.
La modificacin de Kopeloff se recomienda para una mejor visualizacin de las
bacterias anaerobias y consiste en adicionar a la solucin de cristal violeta, colocada
sobre el frotis, unas gotas de una disolucin de NaHCO3 al 5 %.
Coloracin de microorganismos Acidorresistentes
Las especies del gnero Mycobacterium, las nocardias, algunos actinomicetos y los
criptosporidios, retienen los colorantes aun despus de los procesos de decoloracin
con cidos, o con soluciones de cido-alcohol o cido-acetona, por lo que son
denominadosmicroorganismos acidorresistentes.
Dicho carcter es atribuido a un componente lipdico (cido miclico) en las paredes
bacterianas de las especies del gnero Mycobacterium y otros organismos
relacionados. En el caso de los criptosporidios y de las endosporas se le atribuye a
factores de impermeabilidad.
Los componentes y factores antes mencionados hacen ms difcil la penetracin del
colorante en la clula microbiana, por lo que los procederes para estas coloraciones
necesitan de la ayuda del calor, de solventes orgnicos o de detergentes.
Entre los mtodos de coloracin para demostrar la acidorresistencia se encuentran el
mtodo de Ziehl-Neelsen, el de Kinyoun y el que utiliza colorantes de fluorocromo;
en este ltimo es necesaria la observacin en un microscopio de fluorescencia.
La coloracin de Ziehl-Neelsen es una modificacin de un mtodo descrito por Paul
Ehrlich en 1882 y consiste en cubrir el frotis con una solucin de carbolfucsina que

se calienta hasta que emita vapores, se decolora con alcohol-cido (cido clorhdrico
al 3 % en etanol) y finalmente se aplica un colorante de contraste, azul o verde (azul
de metileno de Lffler o verde de malaquita).
Los microorganismos que retienen el color rojo del primer colorante son los
acidorresistentes y los que no los retienen, son los no acidorresistentes, y toman el
color del colorante de contraste.
La coloracin de Kinyoun no requiere la aplicacin del calor y utiliza colorantes
similares al mtodo de Ziehl-Neelsen.
El mtodo que aplica rodamina-auramina no utiliza el calor y emplea como colorante
de contraste una solucin de permanganato de potasio o de naranja de acridina.
Coloraciones negativas
Son coloraciones que se emplean fundamentalmente para la observacin de
estructuras bacterianas que se tien con dificultad con otros mtodos.
Se fundamenta en hacer resaltar las clulas sin teir, sobre un fondo teido; para
lograrlo se utiliza tinta china o colorantes cidos (ejemplo: la nigrosina).
Coloraciones para demostrar estructuras de los microorganismos
Coloracin de cpsulas
Los mtodos ms usados para poner de manifiesto las cpsulas bacterianas son las
coloraciones negativas o sus modificaciones. Un mtodo de tincin de la cpsula es
el que trata las bacterias con una solucin caliente de cristal violeta seguido por un
lavado con solucin de sulfato de cobre, con el fin de remover el exceso de colorante,
ya que el lavado con agua disolvera la cpsula. El sulfato de cobre tambin imparte
color al fondo.
A la observacin microscpica, la clula y el fondo aparecen teidos en color azul
oscuro y la cpsula de color azul plido.
La coloracin de Anthony-Hiss emplea las mismas soluciones colorantes antes
descritas, pero en el momento de realizar el frotis, los microorganismos se suspenden
en un lquido proteico (leche, suero). Despus de la aplicacin de los colorantes, el
cristal violeta se fija a la protena y destaca la cpsula de la clula; el sulfato de cobre
tie la cpsula.
Coloracin de flagelos
Cuando los flagelos se tratan con suspensiones coloidales inestables de sales de cido
tnico, pueden ponerse de manifiesto y conocerse su disposicin en la clula.
El fundamento del mtodo est dado por la formacin de un grueso precipitado que
se deposita sobre la pared celular y los flagelos, aumentando el dimetro de los
mismos, de manera tal que al aplicar fucsina bsica se hacen visibles en el microspio
ptico (coloracin de Leifson).
El mtodo de Leifson fue modificado por Ryu y utiliza el cristal violeta en lugar de la
fucsina, que hace ms estables los reactivos a la temperatura ambiente.
Otro mtodo para la coloracin de estas estructuras es la coloracin con plata, que
emplea, entre otras, una solucin de nitrato de plata y aplicacin de calor. Los
flagelos se visualizan al microscopio como lneas oscuras.
En los casos de bacterias con muchos flagelos, se pueden agrupar en haces durante
el movimiento y es posible observarlos al estudiar la clula viva mediante la
microscopia de campo oscuro o de contraste de fases.
Coloracin de esporas
En observaciones microscpicas de preparaciones de bacterias sin teir, las esporas
se observan como cuerpos refringentes intracelulares y si las clulas bacterianas
estn teidas con los mtodos habituales, se aprecian como zonas incoloras en su
interior.
Para la tincin de las esporas, habitualmente se utiliza el carbolfucsina o el verde de
malaquita. El primero, en el mtodo de Ziehl-Neelsen ya descrito, y el segundo, en
el mtodo de Schaeffer-Fulton. En el mtodo de Moeller se aplican los mismos
colorantes que en el procedimiento de Ziehl-Neelsen, pero se fija el frotis con alcohol
absoluto y cloroformo. Por la impermeabilidad de la pared de la espora se requiere
calentar la preparacin con el fin de que el colorante penetre.

Al emplear suficiente cantidad de alcohol que permita la decoloracin de la clula

vegetativa, la impermeabilidad de la pared no permite la decoloracin de la espora.
En los mtodos de tincin de las esporas antes sealados, se utilizan colorantes de
contraste para la clula vegetativa. Cuando teimos la espora con verde de
malaquita, utilizamos safranina como colorante de contraste; y cuando la espora se
tie con carbolfucsina, la clula vegetativa se tie con azul de metileno.
Coloraciones de grnulos metacromticos
Los grnulos de volutina en el interior del citoplasma bacteriano, constituyen una
fuente de adenosina trifosfato (ATP) y tienen la caracterstica de ser grnulos
metacromticos, o sea, que aparecen teidos de diferente color al resto de la clula.
Se tien intensamente con los colorantes de anilina.
Se han descrito diferentes mtodos de coloracin para ponerlos de manifiesto, entre
ellos: la coloracin de Albert, la modificacin de Christensen, la coloracin de Neisser
y las coloraciones de azul de metileno para grnulos y bacterias, as como la
coloracin con azul de metileno alcalino.
Coloracin de ncleo
Los ncleos se pueden teir con los colorantes especficos para ADN. Ejemplo:
coloracin de Feulgen.
Otras coloraciones utilizadas en microbiologa y parasitologa
mdicas
Los mtodos citados a continuacin y otros, sern tratados en los captulos
correspondientes a cada uno de los microorganismos: En bacteriologa
Naranja de acridina. Se emplea para distinguir entre las bacterias y las clulas
humanas, como en el caso de la sangre y el lquido cefalorraqudeo. Tambin puede
usarse para la tincin de Mycoplasma sp. y de algunos parsitos.
Coloracin de Brown-Hopes-Gram. Recomendada para distinguir bacterias en
cortes de tejidos.
Coloracin de Warthin-Stary. Se emplea para la observacin de espiroquetas y en
la tincin de biopsias de tejidos para la deteccin de rickettsias.
Coloraciones de Giemsa, Machiavello y Castaeda. Permiten la deteccin de
rickettsias con el empleo del microscopio luminoso.
Las clamidias, que tienen propiedades tintoriales similares a las rickettsias, son
detectadas mediante las coloraciones de Giemsa y Machiavello. En micologa
Lactofenol azul de algodn. Para la deteccin de elementos de los hongos.
Coloracin de Schiff. cido peridico, de gran aplicacin en la deteccin de clulas
levaduriformes y de hifas de hongos en tejidos.
Coloraciones de Giemsa y de Wright. Muy usadas para la identificacin
de Histoplasma capsulatum.
Coloracin rpida de Gomori (metenamina-nitrato de plata). Se emplea en la
observacin de hongos. De gran utilidad en la histopatologa de las lesiones
producidas por hongos (ejemplo: micetomas) y en la deteccin dePneumocystis
carinii.
El empleo del fluorocromo calcoflor blanco facilita la visualizacin de estructuras
fngicas al ser observadas al microscopio de fluorescencia. De gran utilidad en la
deteccin de Pneumocystis carinii.
En parasitologa
La modificacin de Wheatley de la coloracin tricrmica de Gomori y el uso de
hematoxilina frrica en el examen de las heces fecales; las coloraciones de Giemsa,
de Wright, de Field, de Leishman y de hematoxilina de Delafield, en la deteccin de
parsitos de la sangre.
En virologa
Inmunofluorescencia directa e indirecta y coloraciones para la deteccin de cuerpos
de inclusin que, por lo general, muestran afinidad por los colorantes cidos como la
eosina.