Mutaciones de Resistencia y prueba molecular Genotype MTBDRplus

MSc Blgo. Marco A. Galarza Prez Laboratorio de Biotecnologa y Biologa Molecular Instituto Nacional de Salud
mgalarza@ins.gob.pe l @i b

Genoma de Mycobacterium tuberculosis

Ge ot p cac Genotipificacin: RFLP IS6110 Spoligotyping MIRU SNPs

CM AS

MTBC

MTBDRplus

MTBDRsl

Cl ifi i G Clasificacin General ld de genes de d Mycobacterium M b t i t tuberculosis b l i

Funcin Metabolismo de lpidos Informacin de Vas Pared celular y p procesos celulares RNAs estables Elementos IS y bacterifagos Protenas PE y PPE Metabolismo intermediario y respiracin Protenas reguladoras Virulencia, detoxificacin y adaptacin Funcin hipottica conservada Protenas de funcin desconocida N de genes 225 207 517 50 137 167 877 188 91 911 607 % del total 5.7 5.2 13.0 1.3 3.4 42 4.2 22.0 4.7 2.3 22.9 15.3 % del total con capacidad codificante 9.3 6.1 15.5 0.2 2.5 71 7.1 24.6 4.0 2.4 18.4 9.9

Bases g genticas de resistencia a drogas g

Los estudios genticos han determinado que en el Complejo de Mycobacterium tuberculosis (MTBC), (MTBC) la resistencia a drogas antituberculosas es la consecuencias de mutaciones espontneas en genes codificantes de blancos de la droga o enzimas envueltas en la activacin de la droga. droga La resistencia asociada a mutaciones cromosomales al azar han sido descritas para todas las drogas de primera lnea. Sin embargo l alteraciones las l i genticas i en fenotipos f i MDR y poliresistentes li i an no han sido descritas completamente, debido a que son consecuencia de adquisiciones secuenciales de mutaciones en mltiples loci. Desafortunadamente las mltiples localizaciones de las mutaciones para cada droga pueden envolver ms de un gen o distintos loci de un mismo gen.

Esquema de los mecanismos moleculares de resistencia a drogas de 1ra y 2da lnea

A: RNA polimerasa B: gyrasa

2008.Tesis: Tello, C.

Regiones genmicas asociadas con resistencia a drogas de 1era y 2da lnea

Antibitico Estreptomicina a pc a Rifampicina Gen rpsL rrs rpo po katG oxyR-ahpC inhA k A kasA ndh embCAB pncA inhA ethA rrs gyrA gyrB tlyA rrs thyA Producto Prot. Ribosomal S12 RNAr 16S Subunidad Subu dad RNApol po Catalasa-peroxidasa Alkilhidroxireductasa Enoyl ACP reductasa ketoacil k t il ACP sintetasa i t t NADH deshidrogenasa Arabinosiltransferasas Amidasa Enoyl ACP reductasa Flavoprot. monooxigenasa RNAr 16S Subunidad DNA girasa Subunidad DNA girasa RNAr metiltransferasa RNAr 16S Timidilato sintetasa Frecuencia de mutacin (%) ( ) 60 < 10 > 95 60-70 20 < 10 < 10 NA 70 70-100 < 10 NA 65 > 90 NA NA NA NA

Isoniacida

Etambutol Pyrazinamida Etionamida Kanamicina Fluoroquinolonas Capreomicina Acido para-aminosalicilico

Mutaciones en el gen rpo asociados con resistencia a Rifampicina en M. tuberculosis

81pb

*M.tuberculosisrpo gene codonsarenumberedaccordingtotherpogeneofE.coli

Mutaciones en el gen gyrA asociadas con resistencia a fluoroquinolonas en M. tuberculosis

40pb

RIF: 98.7% RIF 98 % INH: 92.0%

FLQ: 90.6% CM: 88.4% AM: 86.7% EM: 69.2%

Tecnologa DNASTRIP

Extraccin DNA

PCR

Deteccin

Resultados

B fi i d Beneficios de t trabajar b j con los l sistemas i t de d pruebas b DNA-STRIP DNA STRIP

Rpido: los resultados de muestras pulmonares, extra pulmonares o de cultivo se pueden obtener en 48h. Seguro: los controles internos documentan la validez de los resultados y aseguran los procedimientos de la prueba. Fiable: combinacin de amplificacin especfica y la hibridacin garantizan la fiabilidad del diagnstico. Fcil de usar: fcil de realizar la tcnica, adecuada para los laboratorio de referencia. Alta sensibilidad y especificidad: comprobado por varias publicaciones internacionales. internacionales Rentable: un mnimo de equipos slo es necesario, lo que permite a todos los laboratorios de una aplicacin rentable. Disponibles de automatizacin: los laboratorios de alto flujo de muestras pueden d aumentar t su eficiencia fi i i mediante di t el l uso dispositivos di iti d de automatizacin de Hain Lifesciences. .

Etapas de la prueba molecular Genotype MTBDRplus

1.Extraccin de DNA: Muestras clnicas o Cultivos con crecimiento en medio lquido o slido. 2. Mltiplex PCR: primers marcados con biotina. 3. Hibridacin reversa: Desnaturalizacin D t li i qumica i Hibridacin Lavado astringente Reaccin de tincin mediada por AP (fosfatasa alcalina). Cualquiermtodode extraccindeDNApuede serutilizado

MezcladePNMque contienenlaszonaswild typeydemutacinparalos genesrespectivos Controldeconjugado, controldeamplificacin, controlTUB TUB,controllocus gen,sondaswildtypey sondasdemutacin

Caractersticas del Genotype MTBDRplus

El Genotype MTBDRplus esta basado en la Tecnologa DNA-STRIP y permite la simultanea identificacin gentico molecular de: El complejo Mycobacterium tuberculosis Resistencia a la rifampicina por la deteccin de las mutaciones ms comunes en el gen rpo. Resistencia a la isoniacida por la deteccin de las mutaciones ms comunes en los genes katG e inhA. A partir de muestras clnicas con p p positiva o cultivos. baciloscopa

1. 2.

3.

Indicaciones para el uso de Genotype MTBDRplus

Diagnstico Di ti de d pacientes i t Despus de fracaso al tratamiento y recada. Con anamnesis (signos y sntomas de la enfermedad) y que procedan de zonas de alta prevalencia de MDR-TB. En pases con alta prevalencia de tuberculosis y de alta carga de TB-MDR. Para fines de seleccin en el desarrollo de p planes de accin especfica p contra la TB.

Beneficios y ventajas j del uso de Genotype yp MTBDRp plus

Permite el tratamiento temprano adecuado, lo que reduce la transmisin y propagacin de la TB-MDR. Se puede realizar a partir de un frotis positivo de muestra pulmonar de pacientes y de cultivos. Los resultados se obtienen en 48h en comparacin p con los mtodos convencionales que demoran de 1 a 2 meses.

Caractersticas del Genotype MTBDRsl

El Genotype G MTBDRsl permite la simultanea identificacion genetico molecular de: p j Mycobacterium y El complejo tuberculosis. Resistencia a las Fluoroquinolonas, como ofloxacina y moxifloxacina por la deteccin de las mutaciones ms comunes en el gen gyrA. Resistencia a los antibiticos inyectables (viomicina, kanamicina, amikacina y capreomicina) mediante la deteccin de las ms comunes mutaciones en el gen rrs. Resistencia al medicamento de primera l lnea Et b t l por la Etambutol l deteccin d t i de d las l mutaciones ms comunes en el gen embB. A partir de muestras clinicas con baciloscopia positiva o cultivos.

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Indicaciones para el uso de Genotype MTBDRsl

Diagnstico de pacientes con TB-MDR, para recibir informacin sobre nuevas resistencias a antibiticos. Despus de fracaso al tratamiento y recada. En pases con un elevado uso de los medicamentos. En las regiones de alta carga TB MDR-XDR. MDR XDR

Beneficios y ventajas del uso de Genotype MTBDRsl

Deteccin de TB-XDR en pacientes previamente diagnosticados como TBMDR. Confirmacin Co ac de resultados esu tados po por p pruebas uebas de suscept susceptibilidad b dad a d drogas. ogas Minimizar los efectos secundarios extremos a travs de un esquema de tratamiento adecuado. Es econmico, econmico si comparamos el costo del tratamiento (costo/beneficio). (costo/beneficio)

Principio de la prueba molecular Genotype

Primersmarcados conbiotina

Extraccin DNA y p preparacin p Mix PCR

PCR e Hibridacin

Interpretacin de resultados: Resistencia a Rifampicina y/o Isoniacida usando el Genotype MTBDRplus

Interpretacin de resultados: Resistencia a Fluoroquinolonas, Aminoglicsidos/Pptidos cclicos y Etambutol usando el Genotype MTBDRsl

Experiencia en el INS del uso de la metodologa Genotype

FLUJO DE TRABAJO: FASE 1
Kit MTBDR Rplus Kit MTBDRsl

31 MDR 9 XDR

108 Mx Biolgicas:
80 cepas (24 LJ-OMS / 56 APP) 28 M. clnicas (Back ups) 65 MDR 10 XDR, 29 MDR 17 15 Monoresistentes 18 pansensibles (12 INH,3 RIF) 54 Pansensibles

40 MDR/XDR

14 Monoresistentes (10 INH,4 RIF) 54 Pansensibles

FLUJO DE TRABAJO: TRABAJO FASE 2

Kit MTBD DRplus

100 Mx Biolgicas: 85 cepas criopreservadas 15 cultivos APP 65 MDR MDR 65 17 Monoresistentes Monoresistentes 17 18 pansensibles p (16 INH 1 RIF) INH,1

67 MDR 13 Monoresistentes a INH 20 Pansensibles Galarza et.al. datos no publicados

18 pansensibles

Experiencia en el INS del uso de la metodologa Genotype

MTBDRplus Sensibilidad 99 1% 99.1% y especificidad 95.0% de la prueba molecular Genotype MTBDRplus con respecto p a Rifampicina. p Sensibilidad (97.0%) y especificidad (98.7%) de la prueba molecular Genotype p yp MTBDRplus para Isoniacida. Se encontraron valores de sensibilidad (97.1%) ( ) y especificidad (94.2%) de la prueba Genotype MTBDRplus para la condicin MDR. MTBDRsl La sensibilidad y especificidad fue 100.0% para las Fluoroquinolonas. Sensibilidad 87.5% y especificidad 75 0% para Capreomicina. 75.0% Capreomicina Sensibilidad 81.3% y especificidad 100.0% para Kanamicina. Sensibilidad 52.6% 52 6% y especificidad 84.6% para Etambutol. Se encontraron valores de sensibilidad (81 8%) (81.8%) y especificidad (100.0%) de la prueba Genotype MTBDRsl para la condicin XDR. XDR
Galarza et.al. datos no publicados

Recomendaciones sobre el uso de las pruebas Genotype

Realizar estudios en campo, con un mayor nmero de muestras clnicas y evaluar los kits Genotype MTBDRplus y Genotype MTBDRsl. En cada escenario, escenario la seleccin de mtodos debera estar guiada por la situacin epidemiolgica y la identificacin de los grupos de pacientes prevalentes o numerosos para los que es tcnicamente t i t posible ibl agilizar ili o mejorar j el l diagnstico di ti de TB. El anlisis de las evidencias producidas debe contribuir a mejorar la utilizacin de las herramientas ya introducidas y guiar la racional incorporacin y aplicacin de nuevos mtodos moleculares. moleculares

Algoritmo bsico de Dx. de TB con uso de mtodos moleculares Genotype MTBDRplus