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OFICINA ESPAOLA DE PATENTES Y MARCAS

11 Nmero de publicacin: 51 Int. Cl.7: C12N

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ESPAA

15/85 A01H 5/00 C12N 15/52

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TRADUCCIN DE PATENTE EUROPEA

86 Nmero de solicitud europea: 94926515 .1 86 Fecha de presentacin : 17.08.1994 87 Nmero de publicacin de la solicitud: 0719342 87 Fecha de publicacin de la solicitud: 03.07.1996

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54 Ttulo: Procedimientos para la produccin de polihidroxibutirato y de polihidroxialcanoatos relacionados en

los plstidos de plantas superiores.

30 Prioridad: 17.08.1993 US 108193

73 Titular/es: Michigan State University

06.06.1994 US 254357

238 Administration Building East Lansing, Michigan 48824, US

45 Fecha de publicacin de la mencin BOPI:

72 Inventor/es: Somerville, Christopher, Roland;

16.10.2005

Nawrath, Christiane y Poirier, Yves

45 Fecha de la publicacin del folleto de la patente:

74 Agente: Curell Suol, Marcelino

16.10.2005

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Aviso: En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicacin en el Boletn europeo de patentes, de
la mencin de concesin de la patente europea, cualquier persona podr oponerse ante la Ocina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposicin deber formularse por escrito y estar motivada; slo se considerar como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposicin (art. 99.1 del Convenio sobre concesin de Patentes Europeas).
Venta de fascculos: Ocina Espaola de Patentes y Marcas. C/Panam, 1 28036 Madrid

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DESCRIPCIN Procedimientos para la produccin de polihidroxibutirato y de polihidroxialcanoatos relacionados en los plstidos de plantas superiores.
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Referencia cruzada con la solicitud relacionada Esta solicitud es continuacin en parte de la solicitud de patente US n de serie 08/108.193, presentada el 17 de agosto de 1993, que a su vez es una continuacin en parte de la solicitud de patente US n de serie 07/732.243, presentada el 19 de julio de 1991. Derechos del gobierno
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La invencin descrita en la presente memoria fue realizada en el transcurso del trabajo realizado con la subvencin n DE-AC02-76ERO-1338 del Department of Energy de los Estados Unidos y n DMB 9014037 de la National Science Foundation. El Gobierno de los Estados Unidos posee determinados derechos sobre la presente invencin. Antecedentes de la invencin

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(1) Campo de la invencin La presente invencin se reere a las invenciones que mejoran la produccin de una clase de material denominado polihidroxialcanoatos (PHA) en las plantas superiores. PHA es un grupo de material polimrico bacteriano compuesto de polisteres lineales de hidroxicidos y presenta propiedades termoplsticas. Anteriormente se ha demostrado un nivel bajo de produccin de PHA en Arabidopsis thaliana transformada con los genes bacterianos implicados en la sntesis de PHA tal como se describe en la solicitud de patente US n de serie 07/732.243, presentada el 19 de julio de 1991. A n de producir grandes cantidades de PHA en las plantas superiores, se han de localizar las enzimas para la produccin de PHA en un compartimento subcelular que posee una gran concentracin de precursor para la sntesis de PHA que es el plstido. Se modicaron los tres genes de Alcaligenes eutrophus implicados en la sntesis de PHA a partir de acetil-CoA para dirigir las correspondientes enzimas al plstido de las clulas vegetales de Arabidopsis como un ejemplo especco de la presente invencin. (2) Descripcin de la tcnica relacionada

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Los polihidroxialcanoatos (PHA), polisteres de los 3-hidroxicidos, son producidos como reservas de almacenamiento de carbono por una gran variedad de bacterias (Anderson, A.J. y Dawes, E.A., Microbiol. Rev. 54: 450472, 1990). El poli-D-(-)-3-hidroxibutirato (PHB), el PHA ms extendido y caracterizado a fondo, es un termoplstico biodegradable y biocompatible. La investigacin sobre la produccin de PHA se ha concentrado por lo tanto en Alcaligenes eutrophus que produce los PHA de cadena corta (unidades C3 a C5 ). En A. Eutrophus, PHB se sintetiza a partir del acetil-CoA mediante la accin consecutiva de tres enzimas (Figura 1) (Steinbchel, A. y Schlegel, H.G., Mol. Microbiol. 5: 535-542, 1991). La primera enzima de la serie de reacciones, 3-cetotiolasa (E.C. 2.3.1.9), cataliza la condensacin reversible de dos grupos de acetil-CoA para formar acetoacetil-CoA. La acetoacetil-CoA reductasa (E.C. 1.1.1.36) reduce posteriormente la acetoacetil-CoA a D-(-)-3-hidroxibutil-CoA, que se polimeriza a continuacin mediante la accin de la PHB sintetasa para formar PHB. PHB se produce como un polmero de 105 a 106 unidades de monmero que se acumulan en los grnulos de 0,2 a 0,5 m de dimetro, conteniendo cada grnulo aproximadamente 1000 cadenas de polmero (Anderson, A.J. y Dawes, E.A., Microbiol. Rev. 54: 450-472, 1990). Cuando se cultiva en un medio que contiene glucosa, A. eutrophus acumula normalmente PHB hasta el 80% del peso en seco. Los genes que codican las tres enzimas biosintticas phb descritas anteriormente han sido clonadas a partir de A. eutrophus (Peoples, O.P. y Sinskey, A.J., J. Biol. Chem. 264: 15293-15297, 1989 y J. Biol. Chem. 264: 15298-15303, 1989; Slater, S.C., Volge W.H. y Dennis, D.E., J. Bacteriol. 170: 4431-4436, 1988, Schubert, P., Steinbchel, A. y Schlegel, H.G., J. Bacteriol. 170: 5837-5847, 1988). Adems del homopolmero PHB, A. eutrophus y otras especies bacterianas pueden producir polmeros que contienen varias proporciones de numerosos monmeros C3 a C5 diferentes. La naturaleza y proporcin de estos monmeros estn inuidas por la fuente de carbono suministrada en el medio de cultivo. Por ejemplo, cuando se suministra cido propinico o cido pentanoico a la materia prima de fermentacin, se produce un copolmero aleatorio que contiene monmeros tanto de 3-hidroxibutirato (3HB) como 3-hidroxivalerato (3HV) con un mximo del 43% molar al 90% molar de unidad 3HV, respectivamente (Anderson, A.J. y Dawes, E.A., Microbiol. Rev. 54: 450-472, 1990). Estos copolmeros de PHA son sintetizados por la misma PHB sintetasa que utiliza los derivados del tioster de la coenzima A de los cidos orgnicos de C3 a C5 . Adems de PHB y de los copolmeros que contienen PHB, existe otra clase general de PHA que contienen unidades de monmeros que oscilan entre C6 y C12 . Pseudomonas olevorans es la bacteria prototipo que sintetiza los PHA que contienen (D)-3-hidroxicidos de cadena media cuando se proporcionan n-alcanos o cidos n-alcanoicos en el medio de cultivo. El mejor estudiado de estos PHA es el polihidroxioctanoato, que se acumula cuando P. olevorans se cultiva en un medio que contiene octanoato (Huisman, G.W., de Leeuw, O., Eggink, C. y Witholt, B.
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Appl. Environ. Microbiol. 54: 2924, 1988). Adems, los nicos polmeros que poseen monmeros insaturados o de cadena ramicada, as como que poseen grupos laterales cloruro o uoruro, se pueden obtener por manipulacin de la materia prima de fermentacin (Doi, Y. (ed.), en: Microbial polyesters, cap. 3, VCH Publisher, Nueva York (1990).
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PHB es un termoplstico rgido y relativamente quebradizo (Doi, Y. (ed.), en: Microbial Polyesters, cap. 6, VCH Publisher, Nueva York (1990); Holmes, P.A. en: Developments in cristallyne polymers-2. Basset, D.C. (ed.), 1-65, 1988). La incorporacin de monmeros 3HV en el polmero conduce a una disminucin en la cristalinidad y en el punto de fusin en comparacin con PHB, produciendo una disminucin de la rigidez y un aumento de la dureza del polmero, haciendo a P(3HB-co-3HV) y otros copolmeros relacionados ms adecuados para muchas aplicaciones comerciales. Tambin es posible mezclar varios polmeros y plasticantes con PHB para mejorar sus caractersticas fsicas (Holmes, P.A. en: Developments in cristallyne polymers-2. Basset, D.C. (ed.), 1-65, 1988). PHB presenta buena resistencia al UV pero generalmente escasa resistencia a los cidos y bases as como a los disolventes orgnicos. PHB posee buena impermeabilidad al oxgeno y es resistente a la degradacin hidroltica en el aire hmedo. Estas propiedades le hacen atractivo a PHB como fuente de plstico para una amplia gama de productos de consumo, tal como recipientes domsticos, bolsas y papeles de envolver, en contraste con PHB, los PHA de cadena larga son elastmeros con punto de fusin que oscila entre 40 y 60C (Gross, R.A., De Mello, C., Lenz, R.W., Brandl, H. y Fuller, R.C., Macromolecules 22: 1106, 1989). Las propiedades fsicas de estos PHA tienen que ser caracterizadas todava completamente. PHB y los copolmeros relacionados se degradan fcilmente en el suelo, lodos y agua del mar. Por ejemplo, en el suelo a 30C, las pelculas de copolmero P(3HB-co-4HB) y del homopolmero PHB se descomponen en dos y diez semanas, respectivamente (Doi, Y. (ed.), en: Microbial Polyesters, cap. 1, VCH Publishers, Nueva York (1990). Se demostr que numerosas bacterias y hongos eran capaces de degradar de forma activa estos polmeros (Dawes, E.A. y Senior, P.J., Adv. Microb. Physiol. 10: 135-266 (1973). Se han aislado polimerasas e hidrolasas extracelulares de PHB de varias bacterias, incluyendo Alcaligenes feacalis. PHB se puede degradar de este modo a unidades monomricas de 3HB que se pueden utilizar como fuente de carbono para cultivos bacterianos y micticos. Adems, PHB es muy compatible, hacindole potencialmente atractivo para aplicaciones mdicas tales como lamentos de sutura y excipientes de frmacos (Koosa, F., Muller, R.H. y Davis, S.S. en: Critical reviews in therapeutic drug carrier system, 6: 117-129, 1989). La degradacin de PHB produce cido D-3-idroxubutdico, metabolito normalmente presente en la sangre. La biodegradacin de PHB es un aspecto importante de su utilidad como plstico para productos disponibles en artculos de consumo, as como para utilizaciones especializadas tales como en cubiertas vegetales agrcolas o implantes sanitarios. El copolmero P(3HB-co-3HV) sintetizado por A. eutrophus es producido industrialmente por Imperial Chemical Industries y comercializado bajo la marca registrada BIOPOL. El coste estimado basado en la produccin de 500.000 kg de polmero al ao es aproximadamente de 15 dlares por kg, en contraste con aproximadamente 1 dlar por kg para los plsticos de artculos de consumo procedentes del petrleo tales como polipropileno (Poole, R., Science 245: 11871189, 1989). Los dos contribuyentes principales al coste de produccin son la fuente de carbono aadido a la materia prima (p. ej., sacarosa, glucosa, propionato) y la recogida del polmero de las bacterias. Se estn explorando numerosas estrategias para reducir el coste de produccin (Poirier, Y., Dennis, D.E., Nawrath, C. y Somerville, C. Adv. Mater. 5: 30-36, 1993). Por ejemplo, algunas bacterias son capaces de producir PHB cuando se cultivan en fuentes de azcar sin renar econmicas tales como las molasas y el jarabe de maz. Algunas cepas de Pseudomonas y Rhodococcus son capaces de producir numerosos copolmeros de PHA cuando se cultivan en glucosa, impidiendo de este modo la adicin de sustratos costosos, como propionato, requeridos normalmente para la produccin del copolmero. As mismo es de esperar que la ingeniera gentica de las bacterias, que comprende la utilizacin de E. coli que sintetiza PHB, tenga un impacto sobre el coste de produccin del PHB. Sin embargo, a pesar de estas mejoras potenciales, en general se est de acuerdo en que debido a los costes inherentes relacionados con la fermentacin bacteriana y el tratamiento corriente abajo, el coste de PHA producido por bacterias probablemente no sea menor de aproximadamente 3 a 5 dlares por kg. Es poco probable que alguna vez sea posible producir biomasa bacteriana a un coste comparable al de la produccin de biomasa a partir de plantas superiores. Por ejemplo, la patata puede rendir aproximadamente 20.000 kg de almidn por hectrea, acumulando el tubrculo de la patata almidn hasta el 80% de su peso en seco (Martin, J.H., Leonard, W.H. y Stamp, D.L. (eds.), captulo 36, en: Principles of Field Crop Production, 898-932, Macmillan, Nueva York, 1976). El almidn es uno de los artculos de precio ms bajo (aproximadamente 0,2 dlares/kg) y el ms abundante del mundo. Asimismo, los cultivos que producen aceite, tal como rabina, producen 1.000 kg de aceite por hectrea con un contenido de aceite de semilla hasta el 44% del peso en seco (Downey, R.K. y Rbbelen, G., en: Oil crops of the world, Rbbelen, G., Downey, R.K. y Ashri, A. (eds.), captulo 16, McGraw-Hill, Nueva York, 1989). Se ha demostrado que las plantas, adems de ser muy productivas, son muy ecaces en la produccin de numerosas protenas extraas biolgicamente activas, tales como los anticuerpos (Hiatt, A., Cafferkey, R. y Bowdish, K., Nature 342: 76-78, 1989). Existe creciente inters en hacer uso de la gran productividad y exibilidad de las plantas que producen una variedad de materiales orgnicos, incluyendo protenas y otros diversos polmeros (Moffat, A.S., Science 256: 770-771, 1992). La produccin de poli D-(-)-3-hidroxibutirato, un elemento de la familia de los PHA, se ha demostrado anteriormente en la planta superior Arabidopsis thaliana (Poirier, Y., Dennis, E., Klomparens, K. y Somerville, C., Science 256: 520-523, 1992 y la solicitud de patente n de serie 07/732.243). De estas tres enzimas necesarias para producir PHB a partir de acetil-CoA, la 3-cetotiolasa est presente de forma endgena en las plantas. En los experimentos iniciales, los genes de la bacteria Alcaligenes eutrophus que codica a 3-cetotiolasa (phbA), la acetoacetil-CoA reductasa
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(phbB) y la PHB sintetasa (phbC), se transrieron y expresaron en Arabidopsis bajo el control de la transcripcin del activador 35S de CaMV (Figura 1). En estos experimentos, las enzimas se dirigieron al citoplasma, debido a la ausencia de seales que se dirigen al orgnulo en los productos gnicos. Mediante cruces genticos apropiados, se obtuvo una planta hbrida que contena todas las enzimas requeridas para la sntesis de PHB. El anlisis de los compuestos solubles en cloroformo presentes en la planta hbrida por cromatografa de gases y espectrometra de masas (GC-MS) puso de maniesto la presencia de PHB. Se podra detectar entre 20 y 100 g de PHB por gramo de peso fresco de material vegetal. El examen por microscopa electrnica de secciones nas de tejidos vegetales que producen PHB puso de maniesto la presencia de aglomeraciones de grnulos radiantes a los electrones. Estos grnulos eran muy similares en tamao y aspecto a los grnulos encontrados en A. eutrophus y otras bacterias que acumulan PHB. Sorprendentemente, los grnulos de PHB se encontraron en varios compartimentos, a saber el ncleo, las vacuolas y el citoplasma. No se pudo detectar ningn grnulo de PHB en los mitocondrias o el cloroplasto. La base para esta distribucin de grnulos es desconocida. La demostracin de la produccin de PHB en plantas de Arabidopsis modicadas genticamente puso de maniesto varios problemas. Uno de los problemas es el bajo rendimiento de PHB. Un segundo problema es el efecto desfavorable de la expresin de los genes phb en el crecimiento de la planta. La expresin de grandes cantidades de actividad de acetoacetil-CoA reductasa en plantas transgnicas produjo una reduccin signicativa en el crecimiento y en la produccin de semillas en comparacin con las plantas naturales. Por ejemplo, en una lnea transgnica que expresa aproximadamente 9 unidades de actividad de acetoacetil-CoA reductasa por mg de protena (estando denida una unidad como un mol de acetoacetil-CoA reducida por min), el peso en fresco de brotes de 22 das se redujo al 19% del tipo natural (Poirier, Y., Dennis, D. E., Klomparens, K., Nawrath C. y Somerville, C., FEMS Microbiol. Lett., 103: 237246, 1992). La produccin de semillas se redujo aproximadamente en la misma proporcin. Este fenotipo podra ser el resultado de la desviacin de una cantidad signicativa de acetil-CoA y/o acetoacetil-CoA lejos de las vas bioqumicas esenciales que conducen a una disminucin de la produccin de compuestos tales como tohormonas, carotenoides, esteroles, quinonas, avonoides y lpidos (Figura 2). Por otra parte, la acumulacin de -hidroxibutiril-CoA o de un producto procedente de ella, puede ser perjudicial para las clulas vegetales. El destino de D--hidroxibutiril-CoA producido en las plantas transgnicas es desconocido. La expresin de la PHB sintetasa, por s misma, no present efecto aparente sobre el crecimiento o el vigor de las plantas transgnicas. Sin embargo, en las plantas hbridas que contienen ambos genes se atro ms severamente el crecimiento que en las plantas que contienen nicamente la actividad de la acetoacetil-CoA reductasa. Esto podra ser debido bien a una eliminacin ms severa del sustrato en la serie de reacciones del mevalonato o al efecto nocivo de los grnulos de PHB, particularmente a los grnulos que se acumulan en el ncleo. Descripcin de las formas de realizacin preferidas
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La presente invencin se reere a un material vegetal transgnico que tiene plstidos, conteniendo dicho material vegetal ADN extrao que codica un polipptido bacteriano que se selecciona de entre el grupo constituido por 3cetotiolasa, acetoacetil-CoA reductasa y polihidroxialcanoato (PHA) sintetasa y mezclas de las mismas que conducen a la produccin de un polihidroxialcanoato en el plstido en la planta.
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La presente invencin se reere asimismo a un material vegetal transgnico que tiene plstidos, conteniendo dicho material vegetal ADN extrao que codica un pptido que presenta actividad de 3-cetotiolasa en el plstido en la planta.
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La presente invencin se reere asimismo a un material vegetal transgnico que tiene plstidos, conteniendo dicho material vegetal ADN extrao que codica un pptido que presenta actividad de acetoacetil-CoA-reductasa en el plstido en la planta. La presente invencin se reere asimismo a un material vegetal transgnico que tiene plstidos, conteniendo dicho material vegetal ADN extrao que codica un polipptido que presenta actividad de PHA sintetasa en el plstido en la planta. La presente invencin se reere asimismo a un material vegetal transgnico que tiene plstidos, conteniendo dicho material vegetal ADN extrao que codica uno o ms enzimas que conducen a la sntesis de polihidroxialcanoato (PHA) a partir de hidroxiacil-CoA en el plstido de la planta. La presente invencin se reere asimismo a un material vegetal transgnico que tiene plstidos, conteniendo dicho material vegetal ADN extrao que codica uno o ms enzimas que catalizan la sntesis de hidroxiacil-CoA en el plstido de la planta.

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La presente invencin se reere asimismo a un vegetal transgnico que tiene plstidos, conteniendo dicho material vegetal ADN extrao que codica una o ms enzimas que conducen a la produccin de acetoacetil-CoA, a partir de los productos codicados por el ADN extrao, en el plstido de la planta.
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La presente invencin se reere asimismo a un material vegetal transgnico que tiene plstidos, conteniendo dicho material vegetal ADN extrao que codica una o ms enzimas que conducen a la produccin de 3-hidroxibutiril-CoA, a partir de los productos codicados por el ADN extrao, en el plstido de la planta.
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La presente invencin se reere asimismo a un procedimiento para la introduccin del ADN extrao que codica polipptidos que conducen a la sntesis de un polihidroxialcanoato (PHA) en el plstido en una planta que comprende el cruzamiento por fertilizacin sexual de dos plantas que no producen PHA, conteniendo cada una ADN extrao procedente de una bacteria que codica una o ms enzimas diferentes en una serie de reacciones que conduce a la polimerizacin de hidroxiacil-CoA por PHA sintetasa para producir el vegetal que sintetiza el PHA en un plstido de la planta. Objetivos
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Por consiguiente, un objetivo de la presente invencin consiste en proporcionar una o ms de las enzimas que conducen a la acumulacin de PHA, particularmente PHB, en el plstido. Un objetivo de la presente invencin consiste adems en proporcionar plantas que presentan buen crecimiento y formacin de semillas. Estos y otros objetivos se pondrn de maniesto cada vez ms en relacin con la descripcin y los dibujos siguientes. Breve descripcin de los dibujos La Figura 1 es un diagrama de ujo que presenta la serie de reacciones de la sntesis de PHB en A. eutrophus. Los genes que codican las tres enzimas se presentan entre parntesis.

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La Figura 2 es un diagrama de ujo que presenta la serie de reacciones metablicas que utilizan acetil-CoA y acetoacetil-CoA en plantas transgnicas que producen PHB. Los productos nales principales de la serie de reacciones metablicas endgenas de la planta que utilizan acetil-CoA y acetoacetil-CoA como precursores se presentan en la parte superior del diagrama. La serie de reacciones adicional creada en las plantas transgnicas mediante la expresin de los genes phbB y phbC procedentes de A. eutrophus est indicada en el recuadro. La Figura 3 es un diagrama esquemtico de las fusiones del gnicas TPSS-phb. a) fusin gnica TPSS-3-cetotiolasa, b) fusin gnica TPSS-acetoacetil-CoA reductasa y c) fusin gnica TPSS-PHB sintetasa.

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Todos estos constructos estn compuestos por cuatro zonas distintas indicadas en los recuadros, a saber el pptido de trnsito de 55 aminocidos y los primeros 23 aminocidos de la protena madura codicada por el gen 3,6 de la subunidad pequea de Rubisco del guisante, una secuencia de enlace corta y la zona de codicacin completa de los genes phbA (A), phbB (B) y phbC (C) de A. eutrophus con excepcin de las metioninas iniciales. Las secuencias de aminocidos (cdigo de una sola letra) estn indicadas en negrita as como las secuencias de ADN presentes en las uniones de cada zona. Los tramos de aminocidos entre las uniones, indicadas por guiones, se han publicado anteriormente (Cashmore, A.R. en: Genetic engineering of plants (ed. Kosuge, T., Meredith, C.P. y Hollaender, A.) 29-38, Plenum Press NY, 1983; Janes, B., Hollar, J. y Dennis, D., E.A. Dawes (ed.), Novel Biodegradable Microbial Polymers 175-190 (1990)). Los asteriscos indican codones de terminacin. Se indican los puntos de restriccin de endonucleasa que fueron introducidos mediante PCR durante los procedimientos de subclonacin. La Figura 4 es un diagrama esquemtico de los plsmidos Ti que albergan al promotor 35S de CaMV y de la fusin gnica TPSS-phb. Se presentan las cartografas de pBI-TPSS-Thio (A), pBI-TPSS-Red (B) y pBI-TPSS-Syn (C). Los componentes fsicos de cada constructo son, de izquierda a derecha: LB, secuencia del borde izquierdo; Kan, gen de neomicin fosfotransferasa II; CaMV-35S, activador 35S del virus del mosaico de la colior; TPSS, pptido de trnsito de la subunidad pequea (3,6 genes) de Rubisco del guisante; recuadro sombreado, enlazador sinttico; gen de 3-cetotiolasa (A), gen de acetoacetil-CoA reductasa (B), o gen de PHB sintetasa (C); poli A, punto de poliadenilacin; RB, secuencia del borde derecho. Se indican las posiciones de los puntos de restriccin importantes de endonucleasa. La Figura 5 es un diagrama esquemtica de los plsmidos Ti que albergan el activador especco de la semilla y de la fusin gnica TPSS-phb. Se presentan las cartografas de pBIB-CNN-Thio (A), pBIB-KCN-Red (B), y pBIB-HCNSyn (C). En todos los constructos, el activador especco de la semilla del gen CRB de la protena de almacenamiento de la semilla 12S de A. thaliana se coloc corriente arriba de la fusin gnica TPSS-phb. Se utilizaron los marcadores selectivos siguientes: ALS que codica la acetolactato sintetasa (A), Kan, que codica la neomicin fosfotransferasa II; Hyg, higromicin fosfotransferasa. La Figura 4 presenta una descripcin ms detallada. La Figura 6 es una autorradiografa de un anlisis por transferencia Western de las plantas transgnicas A. thaliana que expresan al plsmido pBI-TPSS-Thio y de plantas de referencia. Se separaron alcuotas de extractos de protena de la hoja en bruto que contenan 1,2 g de protena en una SDS-PAGE al 10%. Las protenas electrotransferidas sobre celulosa se incubaron con anticuerpo anti-3-cetotiolasa. Los extractos de protena analizados fueron T4-3A (banda C; Somerville, C.R., Poirier, Y. y Dennis, D.E., solicitud de patente n de serie 07/732.243), TPSS-Thio GHI 1 (banda 1), TPSS-Thio L (banda 2), TPSS-Thio STU4 (banda 3) y TPSS-Red STU (banda U). La Figura 7 es una autorradiografa de un anlisis por transferencia Western de las plantas transgnicas A. thaliana que expresan al plsmido pBI-TPSS-Red y de plantas de referencia. Se separaron alcuotas de extractos de protena de la hoja en bruto que contenan 1,2 g de protena en una SDS-PAGE al 12%. Las protenas electrotransferidas sobre celulosa se incubaron con anticuerpo anti-acetoacetil-CoA reductasa. Los extractos de protena analizados fueron RedB-2B (banda C; Somerville, C.R., Poirier, Y. y Dennis, D.E., solicitud de patente n de serie 07/732.243),
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TPSS-Red DEF (banda 1), TPSS-Red GHI1 (banda 2), TPSS- Red GHI2 (banda 3), TPSS-Red MNO1 (banda 4), TPSS-Red MNO2 (banda 5), TPSS-Red STU (banda 6), TPSS-Red VXY (banda 7) y TPSS-Syn VXY (banda U).
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La Figura 8 es una autorradiografa de un anlisis por transferencia Western de las plantas transgnicas A. thaliana que expresan al plsmido pBI-TPSS-Syn y de plantas de referencia. Se separaron alcuotas de extractos de protena de la hoja en bruto que contenan 50 g de protena en una SDS-PAGE al 8%. Las protenas electrotransferidas sobre celulosa se incubaron con anticuerpo anti-PHB sintetasa. Los extractos de protena analizados fueron S8-1-2C (banda C; Somerville, C.R., Poirier, Y. y Dennis, D.E., solicitud de patente n de serie 07/732.243), TPSS-Red STU (banda U), TPSS-Syn GHI1 (banda 1), TPSS- Syn GHI2 (banda 2), TPSS-Syn JKL (banda 3) y TPSS-Syn VXY (banda 4). La Figura 9 es una autorradiografa de un anlisis por transferencia Western de las plantas transgnicas A. thaliana que expresan al plsmido pBIB-CCN-Thio y de plantas de referencia. Se separaron alcuotas de extractos de protena de semillas en bruto que contenan 50 g de protena en una SDS-PAGE al 12%. Las protenas electrotransferidas sobre celulosa se incubaron con anticuerpo anti-3-cetotiolasa. Los extractos de protena analizados fueron CN-Red 17-1 (banda C), CN-Thio 13-3 (banda 1) y CN-Thio 14-1 (banda 2). La Figura 10 es una autorradiografa de un anlisis por transferencia Western de las plantas transgnicas A. thaliana que expresan pBIB-KCN-Red y de plantas de referencia. Se separaron alcuotas de extractos de protenas en bruto que contenan 50 g de protena en una SDS-PAGE al 12%. Las protenas electrotransferidas sobre celulosa se incubaron con anticuerpo anti-acetoacetio-CoA reductasa. Los extractos de protena analizados fueron RedB-2B (banda LR; Somerville, C.R., Poirier, Y. y Dennis, D.E., solicitud de patente n de serie 07/732.243), los extractos de protenas de semillas fueron CN-Syn 34-1H1 (banda U), CN-Red 17-3K (banda 1) CN-Red 17-1 (banda 2). La Figura 11 es una autorradiografa de un anlisis por transferencia Western de las plantas transgnicas A. thaliana que expresan al plsmido pBIB-HCN-Syn y de plantas de referencia. Se separaron alcuotas de extractos de protenas en bruto que contenan 50 g de protena en una SDS-PAGE al 12%. Las protenas electrotransferidas sobre celulosa se incubaron con anticuerpo anti-PHB sintetasa. Los extractos de protena analizados fueron S8-1-2C (banda LS; Somerville, C.R., Poirier, Y. y Dennis, D.E., solicitud de patente n de serie 07/732.243), RedB-2B (banda LR; Somerville, C.R., Poirier, Y. y Dennis, D.E., solicitud de patente n de serie 07/732.243), CN-Red 17-1 (banda C), CN-Syn 35-1 (banda 1), CN-Syn 35-1aA (banda 2), CN-Syn 35-G1 (banda 3), CN-Syn 34-1 Hb (banda 4), CN-Syn 34-1 Hc (banda 5), CN-Syn 34-1bA (banda 6), CN-Syn 34-1bA2 (banda 7), CN-Syn 34-1bB (banda 8), CN-Syn 341B (banda 9) y CN-Syn 34-1G (banda 10). La Figura 12 es una autorradiografa de un anlisis por transferencia Southern de plantas de A. thaliana de referencia no transformadas y transgnicas transformadas con los constructos pBI-TPSS-phb del plsmido. Un g de ADN genmico procedente de A. thaliana no transformada de la especie Rschew y procedente de plantas transgnicas se digirieron con el enzima de restriccin HindIII, se separaron los fragmentos mediante electroforesis en gel de agarosa y se transrieron a membranas de niln. Se hibridaron los ltros a fragmentos de ADN marcados con 32 P procedentes de los genes (A) phbA, (B) phbB y (C) phbC. Los ADN genmicos analizados fueron TPSS-Thio GHI1 (banda Thio 1), TPSS-Thio L (banda Thio 2), TPSS-Thio STU4 (banda Thio 3), TPSS-Red DEF (banda Red 1), TPSS-Red GHI1 (banda Red 2), TPSS-Red GHI2 (banda Red 3), TPSS-Red MNO1 (banda Red 4), TPSS-Red MNO2 (banda Red 5), TPSS-Red STU (banda Red 6), TPSS-Red VWX (banda Red 7), TPSS-Syn GHI1 (banda Syn 1), TPSSSyn GHI2 (banda Syn 2), TPSS-Syn JKL (banda Syn 3), TPSS-Syn VWX (banda Syn 4) y natural no transformado (banda C). La Figura 13 es una autorradiografa de un anlisis por transferencia Southern de plantas de A. thaliana de referencia no transformadas y transgnicas transformadas con los constructos pBIB-CN-phb del plsmido. Los ADN genmicos analizados fueron CN-Thio 13-3 (banda Thio 1), CN-Thio 14-1 (banda Thio 2), CN-Red 17-2 (banda Red 1), CN-Red 17-3 (banda Red 2), CN-Red 17-1dA (banda Red 3), CN-Red 17-1dB (banda Red 4), CN-Red 17-3K (banda Red 5), CN-Red 17-2K (banda Red 6), CN-Syn 34-1bA (banda Syn 1), CN-Syn 34-1bB (banda Syn 2), CNSyn 34-1Hb (banda Syn 3), CN-Syn 34-1G1 (banda Syn 4), CN-Syn 35-1 (banda Syn 5), CN-Syn 35-1A (banda Syn 6) y natural no transformado (banda C). Rerase a la leyenda 12 de la gura para una descripcin ms detallada. La Figura 14 representa el anlisis por cromatografa de gases (GC) de extractos puricados de PHB y de plantas. (A) Cromatograma de ggases de PHB transestericad adquirido en Sigma Chemical Company; (B) Cromatograma de gases de extractos en cloroformo de hojas de A. thaliana natural no transformada de la especie Rschew. La echa muestra la posicin en la que se eluira el hidroxibutirato de etilo del cromatograma; (C) Cromatograma de gases de extractos en cloroformo de hojas del hbrido TPSS-Thio L/TPSS-Red DEF/TPSS-Syn GHI1. La echa indica la posicin del pico hidroxibutirato de etilo. La Figura 15 representa el anlisis por cromatografa de gases-espectrometra de masas del hidroxibutirato de etilo preparado a partir de un patrn de PHB y de PHB de extractos vegetales. (A) Espectro de masas de PHB transestericado comercial; (B) Espectro de masas del pico de GC del extracto de hojas en cloroformo de un hbrido TPSS-Thio L/TPSS-Red DEF/TPSS-Syn GHI1 que presenta un tiempo de residencia idntico al del hidroxibutirato de etilo (tal como se muestra en la Figura 14 C).
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La Figura 16 representa grcos de barras que muestran la acumulacin de PHB en las hojas de diferentes hbridos TPSS-Thio/TPSS-Red/TPSS-Syn vegetales. (A) mediciones realizadas en hojas en desarrollo (de 20 a 30 das); (B) mediciones realizadas en hojas maduras (de 50 a 60 das).
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La Figura 17 representa fotografas de rositas naturales (WT) completamente desarrolladas y de plantas transgnicas de Arabidopsis que expresan las enzimas biosintticas de PHB en el plstido (A) y en el citoplasma (B). Las hojas del hbrido TPSS-Thio L/TPSS-Red DEF/TPSS-Syn-GHI1 que producen PHB en el plstido contenan aproximadamente 1,2 mg de PHB/g de peso en fresco (A, PHB+). El hbrido Red/Syn que expresa las enzimas de PHB en el citoplasma contena aprox. 100 g de PHB/g de peso en fresco (B/PHB+). Las plantas naturales y transgnicas se cultivaron en idnticas condiciones. La Figura 18 representa una fotografa que ilustra el efecto de acumulacin en gran concentracin de PHB en el plstido en la pigmentacin de la hoja. (A) Hoja de una planta natural de 50 das; (B) Hoja de un hbrido transgnico de Arabidopsis de 50 das que produce 700 g de PHB/g de peso en fresco en el plstido de hojas en desarrollo.

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La Figura 19 representa micrografas por transmisin electrnica (TEM) de secciones nas de un trihbrido productor de PHB que expresa las enzimas de PHB en el plstido (TPSS-Thio L/TPSS-Red DEF/TPSS-Syn GHI1). (A) La aglomeracin de grnulos translcidos a electrones en el cloroplasto de una clula mesla est indicada mediante echas. Se coloc la planta en la oscuridad durante 48 h antes de la toma de muestras para el anlisis por EM a n de eliminar el almidn. La barra representa 1 m. (B) Micrografas por transmisin electrnica de secciones nas de hojas naturales recogidas despus de 4 horas de iluminacin en un fotoperiodo de 12 h. La acumulacin de almidn en los plstidos en forma de grnulos individuales ovulares est indicada por echas grandes en el tipo natural; (C) Micrografas por transmisin electrnica de secciones nas de hojas hbridas TPSS-Thio L/TPSS-Red DEF/TPSS-Syn GHI1 ositivas a PHB recogidas despus de 4 horas de iluminacin en un fotoperiodo de 12 h. La acumulacin de almidn en los plstidos en forma de grnulos individuales ovulares est indicada por echas grandes. La aglomeracin de grnulos de PHB translcidos a electrones en el plstido del trihbrido est indicada mediante echas pequeas. La barra representa 1 m. La Figura 20 representa un anlisis por transferencia Western de extractos de protena de plantas TPSS-Thio L/TPSS-Red DEF/TPSS-Syn GHI1 transgnicas incubadas con el anticuerpo anti-PHB sintetasa. Extractos de protenas solubles (bandas 1 y 2) y de protenas solubilizadas de la fraccin de la membrana y de partculas (bandas 3 y 4) de dos plantas diferentes TPSS-Thio L/TPSS-Red DEF/TPSS-Syn GHI1. La banda C presenta el extracto de protenas solubles de una planta TPSS-Syn GHI1. Es til indicar las deniciones de determinados trminos que se han de utilizar a continuacin. Transformacin signica el procedimiento para cambiar el genotipo de un organismo receptor mediante la introduccin estable del ADN por cualquier medio.

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Una planta transgnica es una planta que contiene secuencias de ADN que normalmente no estn presentes en la especie, pero que se introdujeron mediante transformacin. Transcripcin signica la formacin de una cadena de ARN segn la informacin gentica contenida en el ADN.

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Traduccin signica el proceso mediante el cual la informacin gentica en una molcula de ARNm dirige la orden de los aminocidos especcos durante la sntesis de la protena. Un activador es un fragmento de ADN que origina la transcripcin del material gentico. Para los nes descritos en la presente memoria, activador se utiliza para indicar los fragmentos de ADN que permiten la transcripcin en las clulas vegetales. Un punto de adicin de poli-A es una secuencia de nucletidos que da lugar a que determinados enzimas escindan el ARNm en un punto especco y aadan una secuencia de restos de cido adenlico al terminal 3 del ARNm.

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phbC, phbA, phbB son los smbolos gnicos dados a los genes de A. eutrophus para PHB polimerasa, 3-cetotiolasa y acetoacetil-CoA reductasa, respectivamente (Peoples, O.P. y Sinskey, A.J., J. Biol. Chem. 264: 15289-15303, 1989). Un plstido es un orgnulo autorreplicador que est situado en mltiples copias en el citoplasma de diferentes tipos de clulas vegetales. Este orgnulo est rodeado por una membrana de doble capa y contiene su propio ADN. Las protenas situadas en el plstido son codicadas por su propio ADN y sintetizadas en el plstido o son codicadas por el ncleo de la clula vegetal, sintetizadas en el citoplasma y transportadas al interior del plstido. Al describir la descendencia de vegetales transgnicos, es til adoptar un convenio que designe cuntas generaciones de autopolinizacin han transcurrido desde la introduccin del ADN. En la presente memoria se disea el original que transforma la generacin T0. La descendencia resultante de la autopolinizacin de esta generacin se denomina generacin T1 y as sucesivamente.
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En el caso de polinizacin cruzada entre dos plantas precursoras distintas, la descendencia resultante procedente del episodio de polinizacin cruzada inicial se denomina generacin F1.
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La invencin descrita en esta exposicin se reere al alivio de la interrupcin del crecimiento y de la produccin baja de PHB relacionado con la primera generacin de plantas productoras de PHB cambiando la localizacin celular de las enzimas biosintticas de PHB y regulando la especicidad del tejido y el ritmo de la expresin. A n tanto de aumentar la produccin de PHB como de impedir la eliminacin potencial de los productos esenciales procedentes del acetil-CoA y/o acetoacetil-CoA, se dirigieron enzimas biosintticas de PHB bacteriano al compartimento subcelular que presenta un alto ujo metablico a travs de acetil-CoA y/o acetoacetil-CoA, es decir el plstido. Al ser el punto de sntesis de cidos grasos en las plantas, el plstido posee un elevado nivel de produccin de acetil-CoA (Harwood, J.L., Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 39: 101-138, 1988). En los tejidos de almacenamiento, la desviacin de algo de este acetil-CoA del plstido fuera de la biosntesis de cidos grasos hacia la produccin de PHB no debera ser perjudicial para el crecimiento de la planta. El almidn, un biopolmero de elevado peso molecular sintetizado de manera natural en las plantas, se acumula en grandes cantidades en los plstidos de muchos tejidos de almacenamiento (amiloplastos) (Preiss, J., Ann. Rev. Plant Physiol. 33: 431-454, 1982). En los cloroplastos fotosintticos, se acumula tambin el almidn transitoriamente durante el periodo diario de jacin de CO2 . El plstido es por consiguiente un compartimento que puede variar sus dimensiones y tiene una gran capacidad de almacenamiento. Por lo tanto, la acumulacin de PHB en el plstido no es de esperar que interera con la funcin del plstido o cause alguna interrupcin mecnica. Adems, la expresin de la serie de reacciones biosintticas del PHB en el citoplasma produjo la acumulacin de grnulos de PHB en el citoplasma, el ncleo y vacuolas, pero no en el plstido (Poirier, Y., Dennis, E., Klomparens, K. y Somerville, C. Science 256: 520-523, 1992). Esto aumenta la posibilidad de que la envoltura del plstido sea impermeable a la penetracin por los grnulos de PHB. Por consiguiente, una ventaja aadida de la produccin de PHB del plstido es que los grnulos de PHB pueden acumularse y permanecer exclusivamente en el plstido, impidiendo la interrupcin mecnica potencial de otros orgnulos por los grnulos. En la invencin descrita en la presente memoria, se introdujeron en el interior de las clulas vegetales los genes phbA, phbB y phbC de Alcaligenes eutrophus modicados para el direccionamiento del plstido de las enzimas codicadas. Se expresaron bajo control de transcripcin del activador 35S de CaMV, el mismo activador que se haba utilizado anteriormente para construir plantas productoras de PHB. Este mtodo permite una comparacin directa del plstido, de la expresin citoplsmica de las enzimas y de los niveles de produccin de PHB. En una segunda parte de la invencin descrita en la presente memoria, la produccin de PHB se limit a un tejido especco y a una etapa especca del ciclo vital de la planta para reducir la posibilidad de efectos perjudiciales en el desarrollo general de las plantas. Ya que el ujo de acetil-CoA en los plstidos es particularmente elevado en los tejidos que normalmente acumulan una gran cantidad de aceite, tales como las semillas de una planta oleosa, la semilla en desarrollo constituye un tejido adecuado para la produccin de PHB. El desvo de algo de este acetil-CoA fuera de la sntesis de cidos grasos utilizado para almacenar lpidos hacia la sntesis de PHB no debera ser perjudicial para el crecimiento de la planta. Por consiguiente, las enzimas phb dirigidas al plstido se expresaron especcamente en el desarrollo de las semillas que utilizan el activador de un gen de la protena de almacenamiento de la semilla de Arabidopsis thaliana. La produccin de PHA a escala agrcola requiere que las plantas productoras de PHA tengan un vigor normal y que el nivel de PHA producido est por encima de un determinado nivel mnimo que no ha sido todava alcanzado en las generaciones anteriores de plantas transgnicas. La presente invencin es por consiguiente de gran importancia para el desarrollo con xito de plantas productoras de PHA. A causa de la estrecha relacin de Arabidopsis y Brassica napus, los constructos descritos en los siguientes apartados deberan utilizarse directamente para la produccin de PHB en Brassica. Adems, debido a la similitud de los mecanismos de la expresin gnica y del metabolismo del carbono primario en diferentes especies de plantas superiores, es tambin evidente que la esencia de la presente invencin, la produccin de PHA en plstidos, sea aplicable a otras especies vegetales. La produccin de PHB en otras plantas productoras de aceite, tales como las semillas de colza y girasol o en el mesocarpio del aguacate o en el aceite de palma, es particularmente atractiva ya que estos rganos vegetales estn especializados en proporcionar el acetil-CoA precursor para la biosntesis de los cidos grasos. Aunque los experimentos expuestos a continuacin se reeren a la especie vegetal Arabidopsis thaliana (L.) Heynhold, el procedimiento descrito es generalmente aplicable a cualquier planta superior para la que haya disponible un procedimiento de transformacin. Asimismo, aunque el procedimiento descrito en la presente memoria se reere a la utilizacin de genes de A. eutrophus, el procedimiento descrito es generalmente aplicable a la utilizacin de genes de cualquier organismo que sean capaces de la sntesis de PHB. Tambin es evidente que, aunque el procedimiento descrito se reere a la produccin de PHB, el procedimiento es generalmente aplicable a la produccin de cualquier polihidroxialcanoato que sea producido normalmente en microorganismos mediante la actividad de PHA sintetasa (que incluye la PHB sintetasa), y para la que el sustrato hidroxiacil-CoA apropiado se produzca en una planta determinada. La produccin de PHB en los plstidos en las plantas transgnicas requiere la conrmacin de la secuencia de las etapas siguientes:
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1.) la construccin de uno o ms plsmidos que contienen fusiones de los genes bacterianos para la sntesis de PHB en las secuencias de direccionamiento del plstido expresadas bajo el control de un activador vegetal en E. coli, 2.) la introduccin de estos plsmidos en el interior de Agrobacterium tumefaciens, 3.) la infeccin de plantas con Agrobacterium tumefaciens transformado a n de transformar las clulas vegetales con los genes modicados (es decir, A. thaliana en este ejemplo) 4.) la seleccin de plantas transformadas con los genes modicados, 5.) la seleccin de plantas que son homozigticas para los genes ectpicos, 6.) anlisis de las plantas transformadas respecto a la integracin del plsmido y a la expresin de los genes ectpicos para asegurar que son activos y que los productos gnicos se dirigen al plstido, procesados y operativos, 7.) la produccin de plantas hbridas que contienen dos o ms genes ectpicos diferentes por cruces sexuales, 8.) el anlisis de la presencia de PHB en el material hbrido. 1. Construccin de los plsmidos que contienen la secuencia de direccionamiento al plstido-fusiones gnicas de phb bajo el control de un activador vegetal en E. coli
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1.1. Fusin de una secuencia seal a las zonas de codicacin de los genes phb A n de dirigir una protena al estroma del plstido en las clulas vegetales, la protena debe contener un pptido de trnsito en su extremo N-terminal (Keegstra, K. y Olsen, L.J., Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 40: 471501, 1989; Archer, E.K. y Keegstra, K., J. Bioenerg. Biomem., 22: 789-810, 1990). Por consiguiente, una secuencia seal que codica el pptido de trnsito ha de estar fusionada en el marco de lectura correcto al terminal 5 de la secuencia de codicacin de la protena. El pptido de trnsito de la subunidad pequea de la ribulosa 1-5 bifosfato carboxilasa (rubisco) (TPSS) ha sido bien caracterizado (Robinson, C. y Ellis, R.J., Eur. J. Biochem., 142: 343-346, 1984, Wasmann, C.C., Reiss, B., Barlett, S. G., y Bohnert, H.J., Mol. Gen. Genet. 205: 446-453, 1986; Friedmann, A.L. y Keegstra, K., Plant Physiol. 89: 993-999, 1988; Lubben, T.H., Gatenby, A.A., Ahlquist, P., y Keegstra, K., Plant Mol. Biol. 12: 13-18, 1989; Schnell, D.J., Biobel, G. y Pain, D., J. Biol. Chem. 266: 3335-3342, 1991) y se ha utilizado anteriormente con xito en numerosos experimentos de direccionamiento (van de Broeck, G., Timko, M.P., Kausch, A.P., Cashmore, A.R., Van Montagu, M. y Herrera-Estrella, L., Nature 313: 358-363, 1985; Schreier, P. H., Seftor, E.A., Schnell, J., y Bohnert, H.J., EMBO J. 4: 25-32, 1985; Boutry, M., Nagy, F., Poulsen, C., Aoyagi, K. y Chua N.-H., Nature 328: 340-342, 1987; Lubben, T.H., y Keegstra, K., Proc. Natl. Acad. Sci. 83: 5502-5506, 1986; Lamppa, G.K., J. Biol. Chem., 263: 14996-14999, 1988; Gatenby, A.A., Lubben, T.H., Ahlquist, P., y Keegstra, K., EMBO J. 7: 1307-1314, 1988; Cheung, A.Y., Bogorad, L., Van Montagu, M., y Schell, J., Proc. Natl. Acad. Sci. 85: 391-395, 1988; Lubben, T.H., Theg, S.M. y Keegstra, K., Photosyn. Res. 17: 173-194, 1988). Por consiguiente se utiliz el TPSS de guisante en los siguientes experimentos. Sin embargo, tambin podran utilizarse de manera anloga numerosos pptidos de trnsito diferentes implicados en el direccionamiento del plstido. Como el pptido de trnsito est normalmente escindido durante la importacin al plstido, la estructura tridimensional en la unin entre el pptido de trnsito y la protena puede ser importante para la ecacia del transporte (Wasmann, C.C., Reiss, B., Barlett, S.G. y Bohnert, H.J., Mol. Gen. Genet. 205: 446-453, 1986; Lubben, T.H., Gatenby, A.A., Ahlquist, P., y Keegstra, K., Plant Mol. Biol. 12: 13-18, 1989). Por consiguiente, la secuencia de gen que codica los primeros 23 aminocidos de la subunidad pequea de rubisco se incluyeron en el pptido de trnsito que se fusion con los genes bacterianos de A. eutrophus implicados en la produccin de PHB, a saber los genes phbA, phbB y phbC. Para obtener la fusin exacta entre las secuencias seal y los genes bacterianos, se amplicaron por reaccin en cadena de polimerasa (PCR) las secuencias que codican al TPSS as como a los genes phb utilizando cebadores de oligonucletido que crearon nuevos puntos de restriccin sintticos en uno de los dos extremos de la secuencia. Los cebadores diseados para amplicacin se presentan en la Tabla 1.

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TABLA 1 Amplicaciones de PCR
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a) Zona de restriccin introducida utilizando el oligonucletido para la reaccin PCR. b) Tamao del fragmento amplicado de ADN utilizando los oligonucletidos y la fuente de ADN. c) Somerville, C.R., Poirier, Y. y Dennis, D.E. Solicitud de patente n de serie 07/732.243.

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d) Wasmann, C.C., Reiss. B., Barlett, S.G., y Bohnert, H.J., Mol. Gen. Genet. 205: 446-453, 1986. e) Pang, P.P., Pruitt, R.E. y Meyerowitz, E.M. Plant Mol. Biol. 11: 805-820, 1988.

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La Tabla 1 incluye tambin la fuente del ADN a partir de la cual se amplicaron los fragmentos y el tamao del fragmento amplicado. Se puricaron los fragmentos por PCR, se escindieron con enzimas que reconocen las zonas de restriccin introducidas y se separaron por electroforesis en gel de agarosa. El fragmento XbaI-SmaI de 0,27 kbp puricado que contiene el fragmento de ADN de la secuencia seal se lig al vector pUC18 escindido con las mismas enzimas de restriccin para producir el plsmido pUC-TPSS. El fragmento SmaI-SacI de 1,3 kbp puricado del gen phbA y el fragmento de 0,8 kbp de los genes phbB se ligaron en el interior del plsmido cortado con pUC-TPSS SmaI y SacI para crear los plsmidos pUC-TPSS-Thio y pUC-TPSS-Red. El fragmento SmaI de 1,9 kbp del gen phbC se lig a pUC-TPSS cortado con SmaI. Se seleccion un clon en el cual se clon la sintetasa en la orientacin correcta detrs de la secuencia seal y se denomin pUC-TPSSSyn. En resumen, cada uno de los plsmidos creados, a saber pUC-TPSS-Thio, pUC-TPSS-Red y pUC-TPSS-Syn, contiene una parte de una zona de codicacin de un gen vegetal y de un gen bacteriano fusionado conjuntamente de manera que codican un polipptido sinttico. En la unin entre la planta y la secuencia bacteriana se form una secuencia sinttica que codica los tres aminocidos serina-arginina-valina (S-R-V). En la Figura 3 se presentan las secuencias de aminocidos y de ADN presentes en las uniones entre las secuencias seal y los genes bacterianos. Cuando se expresan en una clula vegetal, estos polipptidos es de esperar que sean reconocidos por el sistema de importacin de la protena de los plstidos y se transporte al estroma de los plstidos. 1.2. Adicin de un activador vegetal corriente arriba de los genes phb modicados Para obtener la transcripcin de las zonas de codicacin sintticas en plantas superiores, las zonas de codicacin han de estar bajo el control de un activador vegetal localizado cerca del terminal 5 de la zona de codicacin. Adems, es prctica frecuente aadir un punto de poliadenilacin al terminal 3 de la zona de codicacin a n de asegurar la expresin apropiada del gen en las plantas superiores. Adems, para la seleccin de las plantas transformadas, ha de estar presente un gen que permita sobrevivir nicamente a las plantas transformadas en las condiciones de seleccin. Dicho gen se denomina marcador seleccionable. Se utilizaron dos activadores diferentes para expresar los genes phb modicados: el activador 35S de CaMV y el activador CRB. El activador 35S de CaMV (del virus del mosaico de la colior) es considerado un activador constituyente que produce niveles relativamente elevados de transcripcin en una amplia variedad de tejidos en dichas especies de plantas superiores (Benfey, P.N. y Chua, N.-H., Science 250: 959-966, 1990). En cambio, el activador CRB aislado del gen
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CRB de la protena de almacenamiento de semillas 12S de Arabidopsis thaliana favorece altos niveles de transcripcin casi exclusivamente en el embrin de las semillas en desarrollo (Pang, P.P., Pruitt, R.E., y Meyerowitz, E.M., Plant Mol. Biol. 11: 805-820, 1988).
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1.2.1. Adicin del activador 35S de CaMV corriente arriba de los genes phb modicados A n de colocar el activador 35S de CaMV corriente arriba de los genes phbA, phbB y phbC modicados y para satisfacer los dems requisitos de la expresin de una zona de codicacin en las plantas superiores, se utiliz el vector del plsmido pBI121 (Clonetech, CA). Este vector contiene el gen de la neomicina II fosfotransferasa como marcador seleccionable. Para construir las fusiones de los genes 35S-TPSS-phbA de CaMV y 35S-TPSS-phbB de CaMV, se digirieron los plsmidos pUC-TPSS-Thio y pUC-TPSS-Red con las enzimas de restriccin XbaI y SacI. El fragmento de restriccin de 1,6 kbp del pUC-TPSS-Thio y el fragmento de 1,1 kbp del pUC-TPSS-Red se separaron de los dems fragmentos mediante electroforesis en gel de agarosa. Los fragmentos de ADN puricados se ligaron a pBI121 escindido con los mismos enzimas y se clonaron en el interior de E. coli. Los plsmidos recin creados pBI-TPSS-Thio y pBI-TPSS-Red contienen el gen phbA y el gen phbB, respectivamente, modicados para el direccionamiento al plstido y situados corriente debajo de un activador vegetal (Figura 4). Para construir la fusin del gen 35S-TPSS-phbC de CaMV, se digiri el plsmido pUC-TPSS-Syn con EcoRI y los extremos alternados se rellenaron con T4 ADN polimerasa. El plsmido se digiri posteriormente con XbaI. El fragmento de ADN de 2,2 kbp se separ de los dems fragmentos mediante electroforesis en gel de agarosa. El fragmento de ADN puricado se clon en el interior de pBI121 escindido por el enzima de restriccin SmI/XbaI. El plsmido resultante, denominado pBI-TPSS-Syn (Figura 4), tiene el gen phbC procedente de A. eutrophus modicado para el direccionamiento de plstido clonado en la orientacin correcta, en comparacin con el activador de CaMV y el punto de adenilacin de pBI121, as que es de esperar que se exprese en las plantas superiores. Estos constructos es de esperar que satisfagan todos los requisitos para la expresin elevada de los genes y el direccionamiento de las protenas correspondientes, es decir la 3-cetotiolasa modicada, la acetoacetil-CoA reductasa modicada y la phb sintetasa modicada, al estroma del plstido. 1.2.2. Adicin del activador especco de la semilla corriente arriba de los genes phb modicados

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Para la clonacin de las zonas de codicacin modicadas de phb corriente abajo del activador de CRB, se utilizaron los vectores pBIB (Becker, D., Nucleic Acids Res. 18: 203, 1990). Estos vectores contienen todas las funciones que se necesitan para la transformacin de la planta. Existen dos versiones del vector: pBIB-Kan lleva el gen de neomicina II fosfotransferasa como marcador seleccionable, pBIB-Hyg el gen de higromicina fosfotransferasa. A n de simplicar el procedimiento de clonacin posterior, el activador CRB debera de estar ligeramente modicado mediante la eliminacin del punto de restriccin XbaI en la posicin 993. Por consiguiente el plsmido nAt4011 (Pang, P.P., Pruitt, R.E. y Meyerowitz, E.M., Plant Mol. Biol. 11: 805-820, 1988) se digiri con BamHI y EcoRI y tras la puricacin del fragmento de 3,5 kbp se clon en el interior de pBR322 (Bolvar, F., Rodrguez, R.L., Greene, P.J., Betlach, M.C., Heyneker, H.L. y Boyer, H.W., Gene 2: 95-113, 1977) para producir pBR322-CRB. Tras el corte del nico sitio XbaI de pBR322-CRB, se rellenaron los extremos alternos con desoxirribonucletidos mediante incubacin con T4 ADN polimerasa y se volvi a ligar el plsmido. El plsmido resultante no contena el sitio XbaI en la zona del activador CRB. A n de obtener el activador CRB con los puntos de restriccin adecuados en uno de los extremos de la secuencia, se llev a cabo una reaccin en cadena de polimerasa utilizando los cebadores de oligonucletidos indicados en la Tabla 1. Se clon el fragmento XbaI de 1,1 kbp en pK19 (Pridmore, R.D., Gene 56: 309-312, 1987) para crear pK-CRB. A n de clonar la zona de codicacin de TPSS-phbA detrs del activador CRB, se digiri el plsmido pUC-TPSSThio con las enzimas de restriccin XbaI y SacI y el fragmento de ADN de 1,6 kbp se puric por electroforesis en gel de agarosa. Este fragmento se lig al vector pBIB-Hyg escindido por XbaI y SacI. Ya que sera muy til tener un marcador seleccionable diferente combinado con cada uno de los tres genes phb, el gen de higromicina II fosfotransferasa del vector pBIB-Hyg se sustituy posteriormente por el gen de la acetolactato sintetasa, que proporciona resistencia a la clorsulforona en las plantas transformadas (Haughn, G.W., Smith, J., Mazur, B. y Somerville, C.R., Mol. Gen. Genet. 211: 266-271, 1988). Para realizar esto, se escindi el plsmido resultante mediante HindIII y BamHI para eliminar el gen de higromicina II fosfotransferasa. Los extremos alternos del plsmido se rellenaron con desoxirribonucletidos mediante T4 ADN polimerasa. El fragmento XbaI de 5,8 kbp del plsmido pGH1 (Haughn, G.W., Smith, J., Mazur, B. y Somerville, C.R., Mol. Gen. Genet. 211: 266-271, 1988) se insert posteriormente en el plsmido preparado. El constructo resultante se denomin pBIB-C-TPSS-Thio. El activador CRB se aadi a continuacin al constructo clonando el fragmento XbaI de 1,1 kbp de pK-CRB en el interior del nico punto XbaI de pBIB-C-TPSSThio. Un clon que contiene el activador en la orientacin correcta para la expresin apropiada del phbA modicado se denomin pBIB-CCN-Thio (Figura 5). A n de clonar la zona de codicacin TPSS-phbB detrs del activador CRB, se digiri el plsmido pUC-TPSS-Red con XbaI y se insert el fragmento XbaI de 1,1 kbp del plsmido pk-CRB. Se seleccion un clon con el activador en
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la orientacin correcta y se denomin pK-CN-Red. El plsmido pK-CN-Red se digiri con EcoRI y PstI para obtener el fragmento de activador/gen y los extremos se rellenaron con desorribonucletidos mediante T4-ADN polimerasa. Se puric el fragmento de 2,2 kbp por electroforesis en gel de agarosa y se lig en el vector pBIB-Kan digerido con SmaI. Un clon que posee el fragmento en la orientacin correcta para una expresin gnica apropiada en vegetales se denomin pBIB-KCN-Red (Figura 5). A n de clonar la zona de codicacin TPSS-phbC detrs del activador CRB en el vector pBIB-Hyg, se digiri el plsmido pUC-TPSS-Syn con EcoRI, los extremos alternos se rellenaron con T4 ADN polimerasa y el plsmido linealizado se cort posteriormente con XbaI. Se separ un fragmento de ADN de 2,2 kbp de los dems fragmentos por electroforesis en gel de agarosa. Se clon el fragmento de ADN puricado en el interior de pBIB-Hyg digerido con las enzimas de restriccin XbaI y SmaI. En este plsmido resultante digerido con XbaI, se clon el fragmento XbaI de 1,1 kbp que contiene el activador CRB obtenido escindiendo el plsmido pk-CRB. Un clon que posea el activador en la orientacin correcta para una expresin apropiada del gen phbC modicado se denomin pBIB-HCN-Syn (Figura 5). En resumen, los plsmidos pBIB-CCN-Thio, pBIB-KCN-Red, pBIB-HCN-Syn se construyen de modo que cuando se transforman en el interior de las plantas, los genes modicados se expresarn de manera especca en las semillas en desarrollo con las protenas que se dirigen al estroma de un plstido en la semilla.
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2. Introduccin de los constructos dentro de Agrobacterium tumefaciens Para permitir la utilizacin de un mtodo de transformacin de vegetales que est mediado por Agrobacterium tumefaciens, los plsmidos de ambas series de constructos se transrieron al interior de la cepa pGV3101 de Agrobacterium tumefaciens por electroporacin (Koncz, C. y Schell, J., Mol. Gen. Genet. 204: 383-396, 1986; Sambrook, J. Fritsch, E.F. y Maniatis, T. Molecular cloning, a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Las colonias bacterianas transformadas con los diversos plsmidos se recubrieron por seleccin para la expresin bacteriana de un gen con resistencia a la kanamicina presente en el plsmido pBI121 y pBIB. 3. Transformacin de las clulas vegetales con Agrobacterium tumefaciens

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En los experimentos expuestos, se utiliz Arabidopsis thaliana como planta modelo para mostrar la produccin de PHB en el plstido. A. thaliana puede ser transformada por un mtodo de transformacin del meristemo mediado por Agrobacterium tumefaciens (Chang, S.S., Perk, S.K. y Nam, H.-G., Abstract en: Fourth International Conference on Arabidopsis Research, Viena, 1990).
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Se cultivaron plantas Rschew de la especie Arabidopsis thaliana en condiciones de luz hasta que las plantas comenzaron a brotar (aproximadamente 3 semanas). Los brotes (aprox. 2 cm) se eliminaron en su base junto con los brotes auxiliares. El sitio de la herida fue infectado por Agrobacterium llevando el plsmido deseado. Se cultivaron las plantas hasta que salieron nuevos brotes (aprox. 1 semana). De nuevo se eliminaron los brotes y el sitio de la herida se infect con Agrobacterium. Se cultivaron las plantas hasta la madurez total y se recogieron las semillas. 4. Seleccin de plantas transformadas

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Se seleccionaron plantas T0 transformadas distribuyendo las semillas obtenidas en las plantas infectadas con varias cepas de Agrobacterium en medio vegetal solidicado de agar-agar que contena el compuesto de seleccin apropiado. Para la seleccin de las plantas transformadas que llevan el T-ADN de pBI-TPSS-Thio, -Red y -Syn de pBIB-KCNRed, se aadi 50 g/ml de Kanamicina al medio. Para la seleccin de las plantas transformadas que llevan el TADN de pBIB-CCN-Thio, se aadi 30 ng/ml de Clorsulforona al medio y 30 g/ml de Higromicina para la seleccin de plantas que llevan pBIB-HCN-Syn. Las concentraciones anteriores de los compuestos de la seleccin impiden el crecimiento de A. thaliana no transformada pero permiten el crecimiento normal de las plantas transformadas. Por trmino medio, se podra aislar un supuesto transformante a partir de las semillas de aprox. 40 plantas infectadas con Agrobacterium. Las plantas resistentes a Kanamicina se denominaron con una combinacin de letras y nmeros. Se recuperaron un total de 14 plantas resistentes a kanamicina procedentes de las semillas de las plantas que fueron infectadas con A. tumefaciens que lleva el plsmido pBI-TPSS-Thio. Estas se denominaron TPSS-Thio GHI1, -GHI2, -GHI3, -GHI4, -L, -STU1, -STU2, -STU3, -STU4, -STU5, -STU6, -YZAA1, -YZAA2 y -YZAA3. Se recuperaron un total de 10 lneas vegetales resistentes a kanamicina procedentes de las semillas de las plantas que fueron infectadas con A. tumefaciens que lleva el plsmido pBI-TPSS-Red. Estas se denominaron TPSS-Red DEF, -GHI1, -GHI2, -MNO1, -MNO2, -P1, -P2, -QR, -STU, y -VWX. Se recuperaron un total de 6 lneas vegetales resistentes a kanamicina procedentes de las semillas de las plantas que fueron infectadas con A. tumefaciens que lleva el plsmido pBI-TPSS-Syn. Estas se denominaron TPSS-Syn-ABC, -GHI1, -GHI2, -JKL, -PQR y -VWX.

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Se recuperaron un total de dos plantas resistentes a clorosulfona procedentes de las semillas de las plantas que fueron infectadas con A. tumefaciens que lleva el plsmido pBI-CCN-Thio. Estas se denominaron CN-Thio 13-3 y -14-1.
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Se recuperaron un total de 6 plantas resistentes a kanamicina procedentes de las semillas de las plantas que fueron infectadas con A. tumefaciens que lleva el plsmido pBI-KCN-Red. Estas se denominaron CN-Red 17-1, -17-3, -171dA, -17-1dB, -17-2K, y -17-3K.
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Se recuperaron un total de 17 plantas resistentes a higromicina procedentes de las semillas de las plantas que fueron infectadas con A. tumefaciens que lleva el plsmido pBI-HCN-Syn. Estas se denominaron CN-Syn-34-1bA, -34-1bB, -34-2A, -34-2B, -34-1 Ha, -34-1 Hb, -34-1 Hc, -34-1G1, -34-1G2, -35-1, -351aA; -35-1aB, -35-2A, -35-2B, -35-2C, -35-3, y -35-1G1. 5. Aislamiento de supuestas lneas transgnicas homozigticas Un criterio mnimo utilizado para producir lneas transgnicas homozigticas fue que toda la descendencia de un vegetal homozigtico es de esperar que sea resistente al marcador de la seleccin. Debido a la presencia de mltiples copias ectpicas del T-ADN insertado en diferentes posiciones en el genoma pueden producir un fenotipo similar, este criterio es el ms til cuando el escenario de la transformacin principal implica la insercin de T-ADN nicamente en una posicin del cromosoma. A n de identicar supuestas lneas homozigticas, las plantas T0 resistentes se cultivaron hasta la madurez en aislamiento reproductivo. Posteriormente varias plantas T1 que demostraron que eran resistentes al medio de seleccin se cultivaron de nuevo hasta la madurez. Se determin a continuacin la secuencia de la resistencia al marcador seleccionable en muestras de aproximadamente 100 semillas de T2 de cada lnea. Si todas las semillas de T2 de una determinada planta eran resistentes al marcador seleccionable, la lnea se consideraba provisionalmente que era homozigtica. 6. Anlisis de las plantas transgnicas obtenidas 6.1. Anlisis de la expresin y del direccionamiento del plstido de las enzimas phb y de su direccionamiento al plstido

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6.1.1. Anlisis de supuestas plantas transgnicas obtenidas tras la transformacin con pBI-TPSS-Thio, pBI-TPSSRed y pBI-TPSS-Syn A n de determinar si las plantas transgnicas transformadas con pBI-TPSS-Thio, pBI-TPSS-Red y pBI-TPSS-Syn producan enzimas operativas localizadas en los cloroplastos, se analizaron las protenas de las plantas transgnicas resistentes a kanamicina mediante anlisis por transferencia Western. Se incubaron las transferencias Western de las protenas de las plantas transgnicas transformadas con pBl-TPSS-Thio con anticuerpos producidos contra la 3cetotiolasa de A. eutrophus. Las transferencias Western de protenas de plantas transgnicas transformadas con pBlTPSS-Red se incubaron con anticuerpos producidos contra la acetoacetil-CoA reductasa y las protenas de las plantas transgnicas transformadas con pBl-TPSS-Syn se incubaron con anticuerpos policlonales de ratones obtenidos contra la PHB sintetasa. Como referencia negativa, se incub un anlisis de un extracto de protenas de una planta transgnica que no contena la enzima supuestamente producida en el anlisis. Como referencia positiva, se incub un extracto de una planta transgnica que produce la enzima en el citoplasma. De las 14 supuestas plantas transgnicas transformadas con el pBI-TPSS-Thio, los extractos de protenas de las 3 plantas, a saber TPSS-Thio GHI1, -L y -STU4 presentaban una seal acusada para la produccin de las 3-cetotiolasas (Figura 6). La enzima apareci en la transferencia Western como un triplete de bandas de 45, 46,5 y 48 kDa. Estas bandas representan la protena correctamente procesada y los productos procesados de manera imprecisa. La 3-cetotiolasa no modicada localizada en el citoplasma aparece a 44 kDa. Por consiguiente, el cloroplasto dirigido, la TPSS3-cetotiolasa procesada correctamente es de esperar que presente un peso molecular de aproximadamente 47 kDa, debido a los 23 aminocidos aadidos procedentes de la subunidad pequea de rubisco. La protena no procesada, que alberga todava el pptido de trnsito completo presentara un peso molecular de aprox. 53 kDa. De las 10 supuestas plantas transgnicas transformadas con pBI-TPSS-Red, todas las plantas excepto P1 y P2 presentaban una seal para la produccin de acetoacetil-CoA reductasa. La intensidad de estas seales variaba y era la ms acusada en TPSS-Red-DEF y -STU (Figura 7). La seal apareca siempre como un triplete de bandas de 28,5, 29,0 y 30,5 kDa que representan las formas procesadas correctamente y las procesadas de manera imprecisa de la protena. La protena no modicada migra a 26,5 kDa. Por consiguiente, sera de esperar que una TPSS-acetoacetilCoA reductasa no procesada presentase un peso molecular de 35 kDa y una forma procesada correctamente de la protena presentase un peso molecular de aproximadamente 29 kDa. Las 6 supuestas plantas transgnicas transformadas con pBI-TPSS-Syn excepto TPSS-Syn-ABC y -PQR presentaban una seal. La intensidad de estas seales variaba y era la ms acusada en la planta TPSS-Syn-VWX (Figura 8). La seal apareca siempre como un triplete de bandas en el tamao de la protena TPSS-Syn (63 kDa) procesada correctamente y una versin ligeramente ms corta que la esperada (60 y 61 kDa). La PHB sintetasa no modicada migra a 60 kDa. En todos los anlisis por transferencia Western realizados, las protenas de las plantas no transformadas no presentaban seal. Las plantas que expresan las enzimas phb en el citoplasma presentaban una seal acusada del tamao
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esperado. Las enzimas PHB modicadas con un pptido de trnsito para el direccionamiento al plstido se procesaron hasta el tamao esperado y por consiguiente se insertaron en su mayor parte dentro del plstido. Adems, se produjeron las bandas con movilidad ligeramente mayor o menor tambin. Las protenas con una movilidad ligeramente mayor que la que era de esperar podran ser generadas por la actividad de la proteasa en los 23 aminocidos de la protena madura de la subunidad pequea de rubisco que se aadieron a las enzimas bacterianas. La extensin creada articialmente podra ser especialmente sensible a las proteasas. Estos resultados indican que para cada constructo que contiene el activador CaMV, las plantas transformadas podran obtenerse produciendo grandes concentraciones de las enzimas esperadas. El aspecto de cada una de estas enzimas en los anlisis por transferencia Western como doblete o triplete de los tamaos esperados indica que las enzimas son transportadas hasta el plstido y tratadas de la manera esperada. Se analiz la actividad de 3-cetotiolasa en las plantas transgnicas obtenidas por transformacin con el pBI-TPSSThio por modicacin secundaria del anlisis descrito por Senior, P.J. y Dawes, E.A., Biochem. J. 134: 225-238, 1973. Se homogeneizaron tejidos congelados de hojas procedentes de plantas T1 heterozigticas resistentes a la kanamicina en tampn Tris y se analiz la actividad de 3-cetotiolasa en los extractos en bruto puricados. Los resultados de estos experimentos se presentan en la Tabla 2. TABLA 2
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Niveles de actividad de 3-cetotiolasa en plantas transgnicas de A. thaliana Muestra Actividad de 3-cetotiolasa a 0,005 0,32 0,30 0,27

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TPSS-Red TPSS-Thio GHI1 TPSS-Thio L TPSS-Thio STU4

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Micromoles de acetoacetil-CoA degradados por minuto por miligramo de protena. Los valores son un promedio de dos a cuatro mediciones.

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Los extractos de plantas no transformadas, plantas transgnicas transformadas con pBI-TPSS-Red y plantas transgnicas transformadas con pBI-TPSS-Thio que no expresaban el gen detectado mediante anlisis por transferencia Western presentan concentraciones muy bajas de actividad de 3-cetotiolasa en las condiciones del anlisis. En cambio, cada una de las plantas transgnicas obtenidas presentan una gran produccin de 3-cetotiolasa en los anlisis por transferencia Western y tambin un aumento de concentracin de actividad de 3-cetotiolasa. Esto indica que la 3-cetotiolasa bacteriana modicada es operativa en las plantas. La actividad especca de la 3-cetotiolasa modicada fue tan activa como la de la 3-cetotiolasa bacteriana no modicada expresada en el citoplasma de las plantas de Arabidopsis. Se analiz la actividad de acetoacetil-CoA reductasa en las plantas transgnicas obtenidas por transformacin con el pBI-TPSS-Red por modicaciones secundarias del anlisis descrito por Senior, P.J. y Dawes, E.A., Biochem. J. 134: 225-238, 1973. Se homogeneizaron hojas procedentes de plantas T1 heterozigticas resistentes a la kanamicina en tampn de fosfato de potasio y se analiz la actividad de la aceoacetil-3 reductasa en los extractos en bruto puricados. Los resultados de estos experimentos se presentan en la Tabla 3. TABLA 3 Niveles de actividad de acetoacetil-CoA reductasa en plantas transgnicas de A. thaliana Muestra TPSS-Syn TPSS-Red DEF TPSS-Red GHI1 TPSS-ReD GHI2 TPSS-Red MNO1 TPSS-Red MNO2 TPSS-Red STU TPSS-Red VWX
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Actividad de acetoacetil-CoA reductasa a 0,047 1,13 0,49 0,75 1,07 0,31 3,39 0,28

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Micromoles de NADPH oxidados por minuto por miligramo de protena. Los valores son un promedio de dos a cuatro mediciones.
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Los extractos de plantas no transformadas, de las transformadas con pBI-TPSS-Thio o de plantas transformadas que no expresaban el gen detectado mediante anlisis por transferencia Western presentan niveles indetectables de actividad de acetoacetil-CoA reductasa. En cambio, cada una de las plantas transgnicas que se obtuvieron al producir la acetoacetil-CoA reductasa en el anlisis por transferencia Western presentaba actividad de acetoacetil-CoA reductasa. El nivel de actividad se correlacionaba con el nivel de produccin observado en la transferencia Western. Esto indica que la acetoacetil-CoA reductasa bacteriana modicada es operativa en las plantas. En las plantas transgnicas obtenidas por transformacin con el constructo pBI-TPSS-Syn no se analiz la presencia de actividad de PBH sintetasa debido a las dicultades tcnicas en la medicin de la actividad de esta enzima en ausencia de actividades de tiolasa y reductasa (Peoples, O.P. y Sinskey, A.J., J. Biol. Chem. 264: 15298-15303, 1989). En resumen, los resultados de estos experimentos indican que las tres enzimas implicadas en la sntesis de PHB modicada por direccionamiento del plstido fueron producidas hasta niveles signicativos en las plantas, se procesaron de la manera esperada para el transporte al plstido y eran enzimticamente activas. 6.1.2. Anlisis de supuestas plantas transgnicas obtenidas tras la transformacin con pBIB-CCN-Thio, pBIBKCN-Red y pBIB-HCN-Syn
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A n de determinar si las supuestas plantas transgnicas transformadas con pBIB-CCN-Thio, pBIB-KCN-Red y pBIB-HCN-Syn producen la enzima apropiada, se analizaron las protenas en las semillas inmaduras. Dado que Pang et al. demostr que el activador especco de la semilla utilizado en estos experimentos dirige una gran expresin gnica entre el da 6 el da 14 tras la fertilizacin de las ores, se recogieron las semillas en este periodo (Pang, P.P., Pruitt, R.E. y Meyerowitz, E.M., Plant Mol. Biol. 11: 805-820, 1988). Se homogeneizaron las semillas inmaduras congeladas en tampn y se separaron las protenas presentes en la fase acuosa mediante electroforesis en gel de SDS poliacrilamida. Se transrieron las semillas a nitrocelulosa y se incubaron con anticuerpos tal como se describi anteriormente. Ambas plantas obtenidas tras la transformacin con pBIB-CNN-Thio presentaban un nivel elevado de expresin de la enzima en la transferencia Western. La enzima apareca como un cuadruplete en tamaos comprendidos entre 43 y 47 kDa. La banda a 47 kDa representa el tamao esperado para la forma procesada correctamente de la enzima modicada (Figura 9). En los anlisis por transferencia Western de las 6 plantas resistentes a kanamicina nicamente el extracto de protenas de la planta 17-3K reaccion con el anticuerpo producido contra la acetoacetil-CoA reductasa. La seal apareca como una banda doble en el tamao de la forma correctamente procesada de la protena (29 kDa) y de una protena ligeramente mayor (31 kDa) (Figura 10). Se analizaron trece de las 17 plantas obtenidas tras la transformacin con pBIB-HCN-Syn. Entre stas, 11 plantas presentaban expresin de bajo nivel de la sintetasa bacteriana modicada. La planta transgnica TPSS-Syn 34-1G1 presenta un nivel aproximadamente cinco veces mayor de expresin que las dems plantas transgnicas. La seal aparece como una banda nica del tamao de la enzima procesada (63 kDa) (Figura 11). Los resultados preliminares de las enzimas PHB modicadas expresadas bajo control del activador especco de la semilla indican que estn siendo sintetizados en las semillas y se procesan de la manera esperada para el direccionamiento al plstido. Tras la obtencin de las lneas homozigticas de las plantas transformadas que expresan un gran nivel de las enzimas phb apropiadas, se emprendern estudios de inmunolocalizacin para demostrar adems que las enzimas estn localizadas en los plstidos. 6.2. Anlisis de la integracin de los genes phb en plantas transgnicas

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A n de comprobar la integracin apropiada de los genes phb en diversas lneas vegetales transgnicas producidas, se analiz el ADN genmico de las plantas transgnicas. Se aisl el ADN de alto peso molecular de las plantas no transformadas de referencia y de las plantas T2 transgnicas transformadas con los plsmidos pBI-TPSS-Thio, pBITPSS-Red y pBI-TPSS-Syn o pBIB-CCN-Thio, pBIB-KCN-Red y pBIB-HCN-Syn. Se digirieron los ADN con las enzimas de restriccin HindIII, se separaron los fragmentos por electroforesis en gel de agarosa y se transrieron a un ltro de niln. En los constructos pBI-TPSS-Thio, pBI-TPSS-Red y pBI-TPSS-Syn, la enzima de restriccin HindIII corta nicamente a uno en el terminal 5 del activador 35S de CaMV (Figura 4). En los constructos pBIBCCN-Thio, pBIB-KCN-Red y pBIB-HCN-Syn, la enzima de restriccin HindIII corta varias veces, pero nicamente en 5 de la zona de codicacin de los genes phb. Los fragmentos detectados que utilizan sondas especcas del gen phb deberan representar por consiguiente los fragmentos de unin de los vectores Ti con el ADN genmico vegetal, o los fragmentos internos de los vectores Ti concatenados. Las inserciones en los plstidos pUC-THIO, pUCRED y pUC-SYN se escindieron mediante el tratamiento con EcoRI y HindIII, se puricaron por electroforesis y se marc con desoxirribonucletidos con 32 P por cebado al azar. Se utilizaron a continuacin los fragmentos del gen phb marcados para sondar los ltros de niln. Se hibridaron los ltros y posteriormente se lavaron en condiciones de elevada restriccin. El resultado de estas hibridaciones del ltro se presentan en la Figura 12 para los constructos pBI15

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TPSS-phb y en la Figura 13 para los constructos pBIB-CN-phb. No se puede detectar ninguno de los tres genes phb en las plantas de referencia no transformadas (Figuras 12 a, b, c y 13 a, b, c, banda C).
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El gen phbA se detect en las tres lneas transgnicas producidas por transformacin por el plsmido pBI-TPSSThio (Figura 12a, banda Thio 1-3) y en las dos lneas transgnicas producidas por transformacin con el plsmido pBIB-CCN-Thio (Figura 13 a, banda Thio 1-2). El gen phbB se detect en las tres lneas transgnicas producidas por transformacin por el plsmido pBI-TPSSRed (Figura 12b, bandas Red 1-7) y en 2 de las seis lneas transgnicas producidas por transformacin con el plsmido pBIB-KCN-Red (Figura 13 b, bandas Red 1 y 5). Aunque las lneas celulares CN-Red 17-3, -17-1dA, -17-1dB y -172K eran resistentes a 50 g/ml de kanamicina, lo que sugiere la integracin del gen NPTII, no se pudo detectar ningn gen phbB. Es probable que solamente el fragmento del vector Ti que alberga el gen NPTII y no el gen phbB, estuviera integrado en el ADN genmico de estas lneas (Figura 13 b, banda Red 2, 3, 4 y 6). El gen phbC fue detectado en las cuatro lneas vegetales transgnicas producidas por transformacin con pBITPSS-Syn (Figura 12c, banda Syn 1-4) y en las seis plantas transgnicas producidas por transformacin con el plsmido pBIB-HCN-TPSS-Syn, que se analizaron (Figura 13 c, banda Syn 1-6). Las lneas vegetales transgncias CN-Syn 34-1bA y CN-Syn 34-1bB son idnticas ya que presentan el mismo modelo de bandas en la transferencia Southern (Figura 13 c, banda Syn 1 y 2). El mismo fenmeno se puede observar para las plantas CN-Syn 34-1Hb y CN-Syn 341G1 (Figuras 13 c, banda Syn 3 y 4) y las plantas CN-Syn 35-1 y CN-Syn 35-1a (Figura 13 c, banda Syn 5 y 6) y est en relacin con el mtodo de transformacin. Se utiliz una serie de cruzamientos sexuales para las lneas vegetales del constructo que contienen las tres enzimas phb en el plstido de todos los tejidos. Las tres lneas transgnicas que expresan grandes cantidades de acetoacetilCoA reductasa en el plstido (lneas TPSS-Red DEF, MNO1 y STU) se polinizaron por cruzamiento con plantas transgnicas que producen grandes cantidades de PHB sintetasa en el plstido (lneas TPSS-Syn GHI1, GHI2 y VWX). Las plantas hbridas TPSS-Red/TPSS-Syn resultantes que expresan la acetoacetil-CoA reductasa y la PHB sintetasa en el plstido no produjeron cantidades mensurables de PHB en las hojas en desarrollo, analizadas por cromatografa de gases (<20 g/g de peso fresco de PHB). Por comparacin, las plantas transgnicas que producen la acetoacetil-CoA reductasa y la PHB sintetasa en concentraciones similares en el citoplasma produjeron PHB (Poirier, Y., Dennis, D.E., Klomparens, K., y Somerville, C.R. Science 256, 520-523, 1992 y la solicitud de patente n de serie 07/732.243). Una razn posible de esta diferencia es que los plstidos no presentan suciente 3-cetotiolasa para soportar la produccin de PHB. Esto es coherente con la prueba de que las etapas iniciales de la serie de reacciones del mevalonato que conducen desde el acetil-CoA hasta el pirofosfato de isopentenilo estn ausentes en los plstidos diferenciados (Kreuz, K. y Kleinig, H. Eur. J. Biochem. 141, 531-535, 1984, Schultz, G. y Schulze-Siebert, D. en Biological Role of Plant Lipids, eds. Biacs P.A., Gruiz, K., y Kremmer, T. (Plenum Publishing Corporation, Nueva York, NY) pgs. 313-319, 1989). A n de demostrar una secuencia de reacciones biosintticas completa de PHB en los plstidos de todos los tejidos, se poliniz por cruzamiento A. thaliana transgnica con una gran cantidad de tiolasa (lnea TPSS-Thio L) con los hbridos TPSS Red/TPSS-Syn. A partir de cinco combinaciones de cruzamientos, se obtuvieron numerosos hbridos que producen PHB y que presentan por consiguiente las tres enzimas necesarias para la produccin de PHB (TPSSThio L/TPSS-Red DEF/TPSS-Syn GHI1, TPSS-Thio L/TPSS-Red STU/TPSS-Syn GHI1, TPSS-Thio L/TPSS-Red STU/TPSS-Syn-GHI2, TPSS-Thio L/TPSS-Red STU/TPSS-Syn VWX, TPSS-Thio L/TPSS-Red MNO1/TPSS-Syn VWX). Se identicaron los hbridos que producen PHB en primer lugar por microscopa de epiuorescencia de los tejidos teidos con azul Nilo A. Las plantas con grandes niveles de uorescencia presentaban niveles mayores de PHB que las plantas con niveles de uorescencia comparativamente menores. Se cuantic a continuacin el PHB producido en estos hbridos por cromatografa de gases y se identic por anlisis GC-MS (Figuras 14 y 15). La cantidad de PHB en las hojas en desarrollo de plantas de 20 a 30 das oscilaba entre 20 g de PHB/g de peso fresco y 700 g de PHB/g de peso fresco (Figura 16 A). Los hbridos triples siguieron acumulando PHB durante la vida de las plantas de modo que en las hojas de las plantas viejas las concentraciones de PHB fueron de 8 a 13 veces mayores que la cantidad en las hojas en desarrollo (es decir, hasta 7 mg de PHB/g de peso fresco) (Figura 16 B). Este aumento en la acumulacin de PHB con el tiempo se observ en las plantas con un contenido inicial bajo de PHB (100 g/g de peso fresco en las hojas en crecimiento que alcanza 1,1 mg/g en las hojas presenescentes) as como en las plantas con un contenido elevado inicial de PHB (700 g/g de peso fresco en las hojas en crecimiento que alcanza 7 mg/g de peso fresco en las hojas presenescentes. En un hbrido TPSS-Thio L/TPSS-Red DEF/TPSS-Syn GHI1, la cantidad mxima de PHB medida en las hojas viejas fue aproximadamente el 14% de su peso en seco (10 mg/g de peso fresco). Las plantas que producen PHB en el plstido presentaron crecimiento y fertilidad natural incluso al nivel mayor de acumulacin de PHB (Figura 17). No se observaron diferencias con el tipo natural en la proporcin de germinacin de las semillas de hbridos que producen alta concentracin de PHB. Sin embargo, las plantas que producen ms de 300 a 400 g de PHB/g de peso fresco en las hojas en desarrollo podran distinguirse de las naturales por inspeccin visual durante las etapas ulteriores de crecimiento. En estas plantas, las hojas presentaban ligera clorosis tras aproximadamente 50 a 60 das de crecimiento, lo que indica que a niveles muy altos de acumulacin de PHB (>3 mg de PHB/g de peso fresco) puede estar afectado algn aspecto del metabolismo de los cloroplastos (Figura 18). La microscopa de transmisin electrnica de las muestras de hojas de hbridos que producen PHB puso de maniesto que los PHB acumulados como aglomeraciones de grnulos translcidos a los electrones de aproximadamente
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0,2 a 0,7 m, se rode de una capa na de material denso en electrones (Figura 19A). Se han descrito grnulos de aspecto similar para el PHB bacteriano (Lundgren, D.G., Pster, R.M., y Merrick, J.M. J. Gen. Microbiol. 34, 441446, 1964) o para PHB en el citoplasma, ncleo y vacuolas de clulas vegetales (Poirier, Y., Dennis, D.E., Klomparens, K. y Somerville, C.R., Science 256, 520-523, 1992 y solicitud de patente n de serie 07/732.243). En las plantas que expresan las enzimas phb dirigidas al plstido, estas aglomeraciones de grnulos se situaron exclusivamente en los plstidos. Esto est en contraste con las plantas transgnicas que expresan la serie de reacciones biosintticas de PHB en citoplasmas con PHB acumulado en el ncleo, vacuolas y citoplasma, pero no en el plstido (Poirier, Y., Dennis, D.E., Klomparens, K. y Somerville, C.R., Science 256, 520-523, 1992 y en la solicitud de patente n de serie 07/732.243). Los grnulos de PHB se distinguieron claramente de los grnulos de almidn en la forma, aspecto y organizacin de los grnulos como se observ mediante el protocolo de jacin de la microscopa electrnica convencional. Los grnulos de PHB son grnulos pequeos, redondos, translcidos a los electrones que forman densas aglomeraciones (Figura 17a). En comparacin, el almidn aparece en forma de grnulos singulares, ms densos que el electrn de forma ovular, rodeados por un rea difusa (Figura 19 B). En los trihbridos que producen nicamente una cantidad de PHB en las hojas en desarrollo, parece por anlisis de microscopa electrnica que no todos los cloroplastos acumulaban PHB. La razn de esto no es conocida. No existen indicaciones para la expresin diferencial de los transgenes en diferentes tejidos. Posiblemente, esto podra reejar simplemente el hecho de que el anlisis por microscopa electrnica permite nicamente la inspeccin de un rea pequea del volumen de plstido total. Ello podra tambin reejar la accin de la supresin conjunta que puede conducir a un mosaico de expresin diferencial, tal como se observa en la Petunia (Jorgensen, R. Trends in Biotechnology 8, 340-344, 1990). En las hojas viejas de los trihbridos que acumulan grandes concentraciones de PHB, casi todos los cloroplastos contenan PHB. A n de adquirir conocimientos en los mecanismos responsables de las diferentes cantidades de PHB producido en varios hbridos, se midi el nivel de actividad de la 3-cetotiolasa y de la acetoacetil-CoA reductasa presente en las plantas productoras de PHB en extractos proteicos puricados de la hoja en bruto. Se analiz la PHB sintetasa por anlisis de transferencia Western. La actividad de la 3-cetotiolasa en plantas hbridas TPSS-Thio L/TPSS-Red/TPSSSyn oscil entre 0,001 y 0,8 u/mg de protena. En cambio, la actividad de la 3-cetotiolasa en las plantas TPSS-Thio L precursoras fue de 0,840,15 u/mg de protena. El anlisis por transferencia Southern de la lnea TPSS-Thio L puso de maniesto 4 bandas que se hibridaron con el gen phbA, que corresponde probablemente a varias integraciones independientes del constructo (Figura 12A, TPSS-Thio banda 2). Por consiguiente, la segregacin de los constructos pBI-TPSS-Thio diferentes pueden haber producido el intervalo de actividades de 3-cetotiolasa en la generacin F1. Dicha variacin se puede eliminar fcilmente utilizando mtodos de cultivo de plantas habituales para desarrollar las lneas de cultivo verdaderas que son homozigticas para los diversos transgenes de inters. La actividad de la acetoacetil-CoA reductasa en plantas hbridas TPSS-Thio L/TPSS-Red TEF/TPSS-Syn GHI1 oscil entre 0,007 y 0,78 u/mg de protena. La actividad de acetoacetil-CoA reductasa en el hbrido TPSS-Red DEF/TPSS-Syn GHI1 que sirvi como precursor en el cruzamiento con TPSS-Thio L fue de 2,09 0,23 u/mg de protena. El anlisis de transferencia Southern y el anlisis de la proporcin de segregacin del marcador seleccionable en la generacin F1 indic que las plantas TPSS-Red TEF albergan el constructo pBI-TPSS-Red en un punto de integracin nico (Figura 12b, TPSS-Red banda 1). El anlisis de transferencia Western indic que la actividad reducida estaba correlacionada con una reduccin de aproximadamente 10 veces de la cantidad de protena en los extractos puricados de plantas productoras de PHB. Asimismo, las plantas hbridas productoras de PHB TPSS-Thio L/TPSS-Red STU/TPSS-Syn GHI1, TPSS-Thio L/TPSS-Red STU/TPSS-Syn GHI2, TPSS-Thio L/TPSS-Red STU/TPSS-Syn VWX y TPSS-Thio L/TPSS-Red MNO1/TPSS-Syn VWX presentaban tambin amplia variacin y actividades de reductasa inesperadamente bajas en comparacin con sus plantas precursoras que estaban correlacionadas con las bajas cantidades de protena en el anlisis de transferencia Western. La razn para la cantidad variable e inusualmente baja de la actividad de la reductasa en los trihbridos no se puede explicar por cambios en el nmero de copia del constructo pBITPSS-Red. Esta variabilidad se cree que es debida al hecho de que todos los transcritos de los genes phb modicados contienen una secuencia comn de 243 bp, es decir la zona de codicacin del pptido de trnsito (TPSS) (Figura 3). La ganancia de uno o ms genes de tiolasa modicados con la zona de codicacin del TPSS podra regular por disminucin otros genes que contienen TPSS, tal como TPSS-Red, por el mecanismo de supresin conjunta (Jorgensen, R. Trends in Biotechnology 8, 340-344, 1990, Seymour, G.B., Fray, G.R., Hill, P. y Tucker G.A. Plant Mol. Biol. 23, 1-9, 1993). La supresin conjunta puede tambin proporcionar una explicacin de por qu en el examen por microscopa de transmisin electrnica, algunas clulas parece que estn llenas de PHB mientras que las clulas adyacentes no presentaban PHB. Por consiguiente, a n de evitar la supresin conjunta y aliviar la expresin variable y baja de los genes phb en las plantas que producen PHB, todos los genes phb deberan estar modicados para el direccionamiento del plstido mediante la adicin de un pptido de trnsito diferente para cada uno de los genes phb introducidos. Las secuencias no estn actualmente disponibles para docenas de diferentes protenas localizadas en los cloroplastos incluyendo las secuencias de sus pptidos de trnsito. Por consiguiente, los mtodos para las mejoras de la presente invencin mediante la sustitucin de parte o todos los pptidos de trnsito aminoterminales utilizados en este ejemplo por el de una protena localizada normalmente en el cloroplasto ser evidente para un experto en la materia. La presencia de PHB sintetasa fue investigada mediante anlisis de transferencia Western de extractos de protena de las hojas de las plantas productoras de PHB. En las plantas hbridas TPSS-Thio/TPSS-Red/TPSS-Syn, la PHB sintetasa no pudo detectarse nunca en la fraccin proteica soluble. Sin embargo, la PHB sintetasa se pudo detectar fcilmente en la transferencia Western de la membrana solubilizada y en las fracciones en forma de partcula de los extractos vegetales. En cambio, en las plantas transformadas solamente con pBI-TPSS-Syn, PHB sintetasa se pudo detectar en la fraccin soluble (Figura 20). Este descubrimiento sugiere que la PHB sintetasa est ntimamente relacionada con los grnulos de PHB formados en las plantas como se demuestra para la PHB sintetasa en bacterias
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(Fukui, T., Yoshimoto, A., Matsumoto, M., Hosokawa, S. Saito, T., Nishikawa, H., y Tomita, K. Arch. Microbiol. 110, 149-156, 1976, Haywood, G.W., Anderson, A.J. y Dawes E.A. FEMS Microbiol. Lett. 57, 1-6, 1989).
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En general, las plantas transgnicas con los niveles mayores de actividades de 3-cetotiolasa y acetoacetil-CoA reductasa presentaban los niveles ms altos de PHB y plantas con bajos niveles de ambas actividades presentaban los niveles ms bajos de PHB. No existi ninguna meseta obvia en la produccin de PHB a los niveles ms altos de actividad enzimtica mensurable. Por consiguiente, parece que la acumulacin de PHB estaba limitada por la cantidad de actividad enzimtica ms bien que por la disponibilidad de acetil-CoA. Por consiguiente, sera posible aumentar la cantidad de PHB producido en las plantas transgnicas ms all de la cantidad descrita en la presente solicitud de patente aumentando la cantidad de varias enzimas phb producidas en las plantas. Una forma de conseguir esto es impedir el fenmeno de la supresin conjunta de los genes phb modicados que poseen el mismo pptido de trnsito (para direccionamiento al plstido) utilizando una secuencia de direccionamiento al plstido diferente para cada uno de los genes phb introducidos en las plantas. Asimismo puede ser posible aumentar la cantidad de enzimas phb producidas en las plantas transgnicas utilizando activadores potentes que conducen a un nivel de expresin mayor que el posible con los activadores CaMV o CRB utilizados en estos experimentos. Debido a que la utilizacin del codn de las secuencias de codicacin bacterianas de los genes phb no es tpico para las plantas superiores, debera tambin ser posible aumentar la expresin de las enzimas alterando la secuencia de codicacin de los genes bacterianos de modo que la secuencia de aminocidos est codicada por codones que son los utilizados ms frecuentemente por la planta superior en la que se expresan los genes. En resumen, las plantas modicadas genticamente para expresar la serie biosinttica de PHB en sus plstidos acumulan PHB en grandes cantidades. Cambiando la colocacin de la produccin de PHB desde un compartimento celular con un ujo bajo a travs de acetil-CoA (citoplasma) hasta un compartimento con un ujo elevado a travs de acetil-CoA (plstido) el nivel mximo de produccin de PHB aument hasta 100 veces (desde aproximadamente 100 g por gramo de peso fresco para la expresin citoplsmica, tal como se describe en Poirier, Y., Dennis, D.E., Klomparens, K. y Somerville, C.R., Science 256, 520-523, 1992 y en la solicitud de patente n de serie 07/732.243, hasta aproximadamente 10 mg por gramo de peso fresco para la expresin del plstido, tal como se describe en la presente solicitud). Las plantas que producen grandes niveles de PHB en los plstidos presentaban crecimiento y vigor normales. Esto indica que PHB no es txico para las plantas y que parece que no es una barrera biolgica para la produccin de PHB en los plstidos. La eliminacin de metabolitos de la serie de reacciones metablicas esenciales del citoplasma parece haber sido la razn para el efecto perjudicial de la produccin de PHB en las plantas que expresan los enzimas de PHB en el citoplasma (Poirier, Y., Dennis, D.E., Klomparens, K. y Somerville, C.R., Science 256, 520523, 1992 y solicitud de patente n de serie 07/732.243). Sin embargo, ya que los grnulos de PHB estaban tambin situados en el ncleo, podra ser posible que la interaccin de los grnulos de PHB con los constituyentes nucleares fuese tambin una causa del efecto perjudicial de la produccin de PHB en estas plantas. Un anlisis similar se realizar con las plantas transgnicas que expresan los genes phb modicados bajo el control del activador CRB especco de la semilla. Las plantas transformadas con pBIB-KCN-Red, que producen una cantidad sustancial de acetoacetil-CoA reductasa en el plstido de las semillas en desarrollo, se polinizarn por cruzamiento con plantas transformadas con pBIB-HCN-Syn, que producen una cantidad sustancial de PHB sintetasa en el plstido de las semillas en desarrollo. La produccin de PHB en las semillas en los hbridos resultantes se analizar mediante anlisis GC-MS y microscopa electrnica. Ya que no es obvio que la cantidad de acetoacetil-CoA endgeno en el plstido de la semilla en desarrollo sea suciente para permitir la produccin de PHB, para crear un trihbrido se introducir la 3-cetotiolasa modicada para el direccionamiento del plstido en el plstido de la semilla en desarrollo. A n de crear un trihbrido que produzca las tres enzimas, los hbridos dobles de reductasa/sintetasa se polinizarn por cruzamiento con plantas transgnicas que expresan la 3-citotiolasa en el plstido de las semillas en desarrollo. La gran cantidad de PHB producido en las semillas de los trihbridos de tiolasa/reductasa/sintetasa resultantes se analizarn por GC-MS y microscopa electrnica. Este mtodo para la produccin de PHB en los plstidos no est limitado a la utilizacin de plantas hbridas producidas por cruzamiento de varias lneas transgnicas. Una aplicacin alternativa preferida del mtodo implicara la colocacin de los tres genes en una molcula de ADN colineal para la introduccin simultnea en el interior de la planta antriona. Se observa adems que el mtodo general para producir grandes niveles de produccin de PHB descritos en la presente memoria son mtodos generalmente aplicables a todas las plantas superiores y que las modicaciones menores de los mtodos que pueden ser requeridas para introducir y producir la expresin de los genes y el transporte de las protenas al interior de los plstidos en otras especies de plantas superiores ser evidente para los expertos en la materia. Materiales y mtodos

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Construccin de ADN recombinantes La cepa DH5 de E. coli que alberga plsmidos se desarroll en caldo de cultivo LB enriquecido con kanamicina (50 g/ml) o ampicilina (50 /ml). Las preparaciones del ADN del plsmido se realizaron por el procedimiento de lisis alcalina descrito por Sambrook, J., Fritsch, E.F y Maniatis, T. Molecular cloning: a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) y si es necesario una puricacin en las minicolumnas mgicas de anidad al ADN (Promega Corp., WI). El ADN del plsmido se escindi con endonucleasas de restriccin segn las recomendaciones de los fabricantes (New England Biolabs, Mass; Promega Corp., WI; Boehringer Mannheim Biochemicals,
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IN; Stratagene, CA), separadas por electroforesis en gel de agarosa y observadas mediante coloracin con bromuro de etidio tal como describen Sambrook, J., Fritsch, E.F y Maniatis, T. Molecular cloning: a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989). Los fragmentos de ADN se recuperaron del gel de agarosa por un mtodo de congelacin y descongelacin y extracciones con fenol. En resumen, el fragmento de agarosa se corta en secciones en piezas muy pequeas con una cuchilla de afeitar, se aade el mismo volumen de fenol (preparado como se describe en Sambrook, J., Fritsch, E.F y Maniatis, T. Molecular cloning: a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)) y se agita a fondo. Se congela y se descongela dos veces la suspensin y posteriormente se centrifuga. El fragmento que contiene sobrenadante se purica adems mediante extracciones con fenol-cloroformo y precipitacin en etanol. En algunos experimentos, los terminales 3 acoplados de los fragmentos de ADN se transformaron en terminales truncados con T4 ADN polimerasa utilizando el protocolo descrito en Sambrook, J., Fritsch, E.F y Maniatis, T. Molecular cloning: a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989). La ligadura de los fragmentos de ADN con terminales unidos o truncados se realiz a 14C durante 16 h en tampn que contena Tris-HCl 50 mM (pH 7,6), MgCl2 5 mM, polietilenglicol 8000 al 5% (p/v), ATP 0,5 mM y ditiotreitol 5 mM descrito por Sambrook, J., Fritsch, E.F y Maniatis, T. Molecular cloning: a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989). Una fraccin de la reaccin de ligadura se transri al interior de E. coli por el mtodo del cloruro de rubidio tal como describe Hanahan, D., J. Mol. Biol. 166: 557-580 (1983). Las bacterias transformadas se colocaron en placas de agaragar que contenan caldo de cultivo LB y 50 g/ml de kanamicina o 50 g/ml de ampicilina. La preparacin de sondas radiomarcadas de ADN y la hibridacin se describen en el apartado siguiente. Los oligonucletidos fueron sintetizados por el complejo bioqumico en la Universidad del estado de Michigan. Se realiz la reaccin en cadena de polimerasa (PCR) utilizando un ciclador trmico de ADN Perkin-Elmer Cetus (Perkin-Elmer, CT). La mezcla de reaccin contena 200 pmoles de 2 cebadores de oligonucletidos por PCR (Tabla 1), 200 ng de plsmido (Tabla 1) y 2,5 unidades de polimerasa Vent en condiciones tampn recomendadas por el suministrador (New England Biolabs Inc, Mass.). El programa del ciclador trmico de ADN para las amplicaciones de las enzimas PHB bacterianas fue el siguiente: 4 min a 95C, 30 ciclos de la secuencia 1,5 min a 97C-2 min a 65C3 min a 72C y por ltimo 7 min a 72C. Para el fragmento de TPSS: 4 min a 95C, 30 ciclos de la secuencia 1,5 min a 95C-2 min a 60C-2 min a 72C y por ltimo 7 min a 72C y para el activador de CRB: 4 min a 95C, 30 ciclos de la secuencia 1,5 min a 95C-2 min a 58C-2 min a 72C y por ltimo 7 min a 72C. Los productos de PCR se aislaron mediante electroforesis en gel de agarosa y se puricaron segn se describi anteriormente. Extraccin y escisin de la endonucleasa de restriccin del ADN genmico
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Se cultivaron plantas naturales y transgnicas en el suelo durante 2 a 3 semanas, se recogi aproximadamente 5 g de material foliar y se congel en nitrgeno lquido. Se extrajo ADN de alto peso molecular de los tejidos vegetales congelados tal como describen Rogers, S.C. y Bendich, A.J., Plant Molecular Biology Manual A6: 1-10 (1988). La escisin en endonucleasa de restriccin con la enzima HindIII en 1 g de ADN se realiz en las condiciones recomendadas por el fabricante (New England Biolabs Inc, Mass.). Electroforesis en gel de agarosa y procedimiento de hibridacin Se realiz el anlisis del ADN por electroforesis en gel de agarosa y la transferencia a membranas de niln (Hybond-N, Amersham, II.) utilizando los procedimientos demostrados descritos por Southern et al. (1975) y Sambrook, J., Fritsch, E.F y Maniatis, T. Molecular cloning: a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989). Los fragmentos especcos del ADN clonado que se deben utilizar como sondas se escindieron a partir del vector con endonucleasas de restriccin apropiadas, se puricaron las inserciones del vector por electroforesis en gel de agarosa y electroelucin. Se marcaron los fragmentos con 32 P-desoxirribonucletidos por el mtodo aleatorio de extensin del cebador utilizando hexmeros segn describe Feinberg, A.P. y Volgelstein, B., Anal. Biochem. 132, 6-13 (1983). Se hibridaron ltros de niln con sondas marcadas y se expusieron sobre la pelcula segn describe Poirier, Y. y Jolicoeur, P., J. Virol. 63, 2088-2098 (1989). Construccin de las protenas de fusin y produccin de anticuerpos

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Para la produccin de anticuerpos contra la 3-cetotiolasa, acetoacetil-CoA reductasa y PHB sintetasa de protenas de fusin de A. eutrophus con la protena que se une a la maltosa, se construyeron malE de E. coli utilizando el vector pIH821 (New England Biolabs Inc, Mass.). Se construy la protena de fusin MALE-Tiolasa puricando el fragmento XhoII-EcoRI de 1,2 kbp del plsmido pUC-Thio (Somerville, C. R., Poirier, Y. y Dennis, D. E., solicitud de patente n de serie 07/732.243), rellenando los extremos con T4-ADN polimerasa y clonndolo en pIH821. El vector se haba preparado por digestin con XbaI y rellenando el extremo con T4-ADN polimerasa. Los clones que llevan la insercin en la orientacin deseada contienen la fusin gnica que manera que el marco de lectura es correcto para obtener la fusin MALE-Thiolasa. El plsmido se denomin pmalE-Thio. Para obtener la protena de fusin MALE-reductasa se digiri el plsmido pUC-Red (Somerville, C. R., Poirier, Y. y Dennis, D. E., solicitud de patente n de serie 07/732.243) con DdeI y SacI. Tras la puricacin del fragmento de 0,7 kbp, se rellenaron los extremos con T4-ADN polimerasa. Se clon el fragmento con los terminales truncados en el XbaI digerido y en el vector pIH821 con los extremos truncados segn se describi anteriormente. El clon que contiene el fragmento en la orientacin exacta para la expresin de la expresin de MALE-reductasa se denomin pmaIE-Red.
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Para la construccin de la protena de fusin MALE-sintetasa se digiri pUC-Syn con NcoI y se rellenaron los extremos con T4-ADN polimerasa. Posteriormente, se digiri el plsmido con HindIII y se clon el fragmento de 1,6 kbp en el pIH821. El vector haba sido preparado mediante digestin con XbaI y rellenando el extremo con T4 ADN polimerasa y digiriendo posteriormente con HindIII. Los clones se denominaron pmaIE-Syn.
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Se transformaron los plsmidos pmaIE-Thio, -Red y -Syn en DH5 y las protenas de fusin se expresaron y puricaron tal como describe el fabricante (New England Biolabs Inc, Mass.). Se inyectaron las protenas de fusin en conejos para producir anticuerpos policlonales utilizando adyuvantes de Freund como inmunoestimulantes. Anlisis de la actividad de 3-cetotiolasa Se homogeneizaron muestras de hojas congeladas (0,1 g) en 200 l de tampn de tiolasa enfriado en hielo que contena Tris-HCl 100 mM (pH 8,0), MgCl2 40 mM y -mercaptoetanol 5 mM. Se puric el homogeneizado por centrifugacin a 10.000 g durante 5 min y se transri el sobrenadante a un tubo fresco. El contenido en protena del extracto se midi por el anlisis de Bradford utilizando el kit de anlisis de protena Bio Rad (Bio Rad Laboratories, CA). Se utilizaron entre 3 y 30 g de extracto de protena vegetal por anlisis. Se analiz la actividad de la enzima 3-cetotiolasa en los diferentes extractos segn el procedimiento de Senior, P.J. y Dawes, E.A., Biochem. J. 134: 225238, 1973. Anlisis de la actividad de acetoacetil-CoA reductasa Se homogeneizaron muestras de hojas congeladas (0,1 g) en 200 l de tampn de reductasa enfriado en hielo que contena KH2 PO4 100 mM (pH 5,5), MgCl2 0,02 mM y -mercaptoetanol 4,0 mM. Se puric el homogeneizado por centrifugacin a 10.000 g durante 5 min y se transri el sobrenadante a un tubo fresco. El contenido en protena del extracto se midi por el anlisis de Bradford utilizando el kit de anlisis de protena Bio Rad. Se utilizaron entre 0,8 y 10 g de extracto de protena vegetal por anlisis. Se analiz la actividad de la enzima acetoacetil-CoA reductasa segn el procedimiento de Senior, P.J. y Dawes, E.A., Biochem. J. 134: 225-238, 1973. Anlisis de transferencia Western

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Para los anlisis de transferencia Western, se utilizaron extractos de protena en bruto preparados segn se describi anteriormente para los anlisis de actividad enzimtica. Para el anlisis de la expresin de la PHB sintetasa se homogeneizaron muestras de hojas congeladas (0,1 g) en 200 l de tampn enfriado en hielo que contena TrisHCl 100 mM (pH 8,0), EDTA 5 mM y -mercaptoetanol 4 mM. Se puric el homogeneizado por centrifugacin a 10000 g durante 5 min y se transri el sobrenadante a un tubo fresco. En algunos experimentos, la membrana y las fracciones en partculas se solubilizaron parcialmente en tampn de extraccin que contena SDS al 1% y se puric otra vez por centrifugacin. El contenido en protena de estas muestras se midi por un mtodo de Lowry modicado (Markwell, M.A.K., Haas, M., Bieber, L.L. y Tolbert, N.E., Anal. Biochemistry 87, 206-210 (1978). Se separaron alcuotas de los sobrenadantes por electroforesis en gel de dodecilsulfatopoliacrilamida (SDS PAGE) segn Laemmli, Nature 227: 680-685, 1970. Se transrieron por electroforesis las protenas a ltros de nitrocelulosa. Se realiz el anlisis de transferencia Western segn se recomienda en el protocolo ECL de transferencia Western (Amersham International plc, Amersham UK). Para el bloqueo de los ltros TBS (Tris-HCl 20 mM, pH 7,6, NaCl 137 mM) con 5% de leche en polvo exenta de grasa se seleccion Tween 20 al 0,12%. Se diluy el primer anticuerpo 1:1000 en solucin de bloqueo antes de incubar los ltros. La reaccin del anticuerpo se detect mediante el sistema de deteccin ECL de transferencia Western (Amersham International plc, Amersham UK). Anlisis de polihidroxibutirato

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Para los anlisis por cromatografa de gases, se extrajeron 20 a 100 mg de material foliar 3 a 4 veces con etanol al 50% y a continuacin con metanol al 100% durante 45 minutos-1 h a 55C. Se extrajeron los residuos secos a 55C con 0,5 ml de cloroformo durante por lo menos 12 h y se transestericaron durante 4 a 6 h en HCl 0,8 M en etanol a 100C. Tras la extraccin con NaCl 0,9 M, se analiz la fase de cloroformo en un cromatgrafo de gases Hewlett Packard 5890 serie II. Se utiliz PHB bacteriano (Sigma) como patrn. Para la observacin de los grnulos de PHB por microscopa de epi-uorescencia se jaron las muestras foliares en glutaraldehdo al 2% en tampn de fosfato 10 mM (pH 7,2) durante 2 h. Se enjuagaron los tejidos en agua y se tieron durante 5 min en azul Nilo A al 1%. Se enjuagaron los tejidos varias veces en agua y se remojaron 1 min en cido actico al 8% seguido de un enjuague nal con agua. Se observaron los grnulos de PHB por microscopa de epi-uorescencia bajo una longitud de onda de excitacin de 546 565 nm (Ostle, A.G. y Holt J.G. Appl. Environ. Microbiol. 44, 238-241, 1982). Microscopa de transmisin electrnica Se jaron muestras de tejidos en glutaraldehdo al 0,8%/paraformaldehdo al 2% en tampn de fosfato 0,01 M (pH 7,2) durante 2 h en un vaco ligero. Tras 4 lavados con tampn de fosfato, se trataron las muestras con tetrxido de osmio al 1% durante 40 a 60 min. Se deshidrataron las muestras en una serie escalonada de etanol y se insertaron en resina de Spurr (Ted Pella Inc.). Se cortaron secciones de 80 a 90 nm, se colocaron en rejillas de cobre y se tieron con acetato de uranilo al 5% durante 30 a 45 min, seguido de tincin con citrato de plomo de Reynolds durante 3 a 4 minutos. Se observaron las secciones en un microscopio electrnico de transmisin JEOL100CX II operado a 80 kV.
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Aunque el ejemplo especco de la invencin descrito en la presente memoria implicaba la planta Arabidopsis thaliana, los genes de Alcaligenes eutrophus y un pptido de trnsito del guisante, la invencin es de utilidad general. Las reivindicaciones correspondientes a la produccin de poli-D-(-)-3-hidroxibutirato y/o de polihidroxialcanoato en los plstidos de las plantas no se limitan a Arabidopsis thaliana ni estn ligadas especcamente a la utilizacin de genes de Alcaligenes eutrophus ni al pptido de trnsito descrito para el direccionamiento del plstido. Las reivindicaciones descritas a continuacin describen un mtodo general para la produccin de polihidroxialcanoato en el plstido de las plantas mediante la introduccin de material de ADN extrao en el interior de las clulas vegetales. Las mejoras en la presente invencin son:
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1 La transformacin de clulas vegetales con material de ADN que codica la informacin que conduce a la produccin en el plstido de una enzima que posee actividad de 3-cetotioasa. La expresin material de ADN extrao se reere al material de ADN que normalmente no est presente en un organismo, pero que se introduce en una clula y reside ya sea integrado en el cromosoma o reside en forma extracromosmica. Un aumento en la actividad de 3-cetotiolasa en los plstidos de las clulas vegetales procede de la introduccin del material de ADN extrao en el interior de las clulas vegetales. 2 La transformacin de clulas vegetales con material de ADN que codica la informacin que conduce a la produccin en los plstidos de una enzima que posee actividad de acetoacetil-CoA reductasa. Un aumento en la actividad de acetoacetil-CoA reductasa en los plstidos de las clulas vegetales procede de la introduccin del material de ADN extrao en el interior de las clulas vegetales. 3 La transformacin de las clulas vegetales con un material de ADN extrao que conduce a la produccin de hidroxiacil-CoA en los plstidos que resulta extraa a la clula vegetal. La transformacin de clulas vegetales con material de ADN extrao que conduce a la produccin de un aumento de concentracin de hidroxiacil-CoA en los plstidos de las plantas. 4 La transformacin de clulas vegetales con material de ADN que codica la informacin que conduce a la produccin en los plstidos de una enzima que posee capacidad de polimerizar hidroxiacil-CoA reductasa de clulas vegetales. Un aumento en la actividad enzimtica conduce a la polimerizacin de hidroxiacilCoA en los plstidos de las clulas vegetales procede de la introduccin del material de ADN extrao en el interior de las clulas vegetales. 5 La produccin de un polihidroxialcanoato, incluyendo poli-D-(-)-3-hidroxibutirato, en los plstidos de clulas vegetales mediante la introduccin de material de ADN extrao dentro de las clulas vegetales. 6 La produccin de polihidroxialcanoato en los plstidos de clulas vegetales, es preferentemente a un nivel mayor de 2 g de polihidroxialcanoato por gramo de material vegetal fresco.

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7 La produccin de polihidroxialcanoato en los plstidos se realiza preferentemente a una concentracin mayor de 2 g de polihidroxialcanoato por gramo de material vegetal fresco, en cualquier clula vegetal para la cual sea posible introducir material de ADN extrao. 8 La produccin de polihidroxialcanoato en los plstidos de plantas hbridas se realiza preferentemente a una concentracin mayor de 2 g de polihidroxialcanoato por gramo de material vegetal fresco, procedente de la polinizacin por cruzamiento entre dos lneas de plantas precursoras que han sido transformadas con material de ADN extrao, pero que por s mismas no producen polihidroxialcanoato en los plstidos o producen polihidroxialcanoato a una concentracin menor que la producida en la planta hbrida. 9 La produccin de polihidroxialcanoato en forma de grnulos en el interior de los plstidos de las clulas vegetales. Las semillas que contienen los genes de las Figuras 3 y 4 se conservan en la Universidad del estado de Michigan, East Lansing, Michigan.

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Se pretende que la descripcin anterior sea nicamente ilustrativa de la presente invencin y que la presente invencin est limitada nicamente por las reivindicaciones adjuntas a la presente memoria a continuacin.
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REIVINDICACIONES 1. Material vegetal transgnico que tiene plstidos, estando dicho material vegetal caracterizado porque contiene un primer segmento gnico que codica un gen modicado de 3-cetotiolasa, destinado al direccionamiento al plstido de la planta un segundo segmento gnico que codica un gen modicado de acetoacetil-CoA reductasa, destinado al direccionamiento al plstido de la planta, y un tercer segmento gnico que codica un gen modicado de polihidroxibutirato (PHB) sintetasa destinado al direccionamiento al plstido de la planta, en el que los segmentos gnicos permiten la produccin de un polihidroxialcanoato (PHA), caracterizado porque cada gen presenta una secuencia de codicacin para un pptido de trnsito y cada pptido de trnsito es diferente. 2. Material vegetal segn la reivindicacin 1, en el que el PHA es polihidroxibutirato (PHB) y en el que las secuencias de codicacin del ADN y del ARN destinadas a la 3-cetotiolasa son tal como se representan en la SEC. ID. n: 1, la acetoacetil-CoA reductasa es tal como se representa en la SEC. ID. n: 2 y la PHA sintetasa es tal como se representa en la SEC. ID. n: 3. 3. Material vegetal segn la reivindicacin 1 2, en forma de embrin, semilla o propgulo de las semillas.

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LISTA DE SECUENCIAS (1) INFORMACIN GENERAL:
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(i) Solicitante: Christopher R. Somerville, Christiane Nawrath, Yves Poirier (ii) Ttulo de la invencin: Procedimiento para la produccin de polihidroxibutirato y polihidroxialcanoatos relacionados en los plstidos de las plantas superiores

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(iii) Nmero de secuencias: 3 (iv) Direccin de la correspondencia: (A) Destinatario: Ian C. McLeod (B) Calle: 2190 Commons Parkway

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(C) Ciudad: Okemos (D) Estado: Michigan (E) Pas: Estados Unidos

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(F) Cdigo postal: 48864 (v) Forma legible por ordenador: (A) Tipo de soporte: Disquete 5,25 pulgadas, almacenamiento 360 kb

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(B) Ordenador: Acer (C) Sistema operativo: MS-DOS (versin 3.3) (D) Programa informtico: Wordperfect 5.1 (vi) Datos actuales de la solicitud: (A) Nmero de solicitud: (B) Fecha de presentacin: (C) Clasicacin: (vii) Informacin sobre aplicaciones anteriores (A) Nmero de solicitud: 08/108.193 y 07/732.243 (B) Fecha de presentacin: 17 de agosto de 1993 y 19 de julio de 1991

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(viii) Informacin del consultor o apoderado: (A) Nombre: Ian C. MacLeod (B) Nmero de registro: 20.931
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(C) Nmero de referencia/etiqueta: MSU 4.1-222 (ix) Informacin de telecomunicaciones: (A) Telfono: (517) 347-4100

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(B) Fax: (517) 347-4103 (2) Informaciones para la SEC ID n 1: (i) Caractersticas de la secuencia:

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(A) Longitud: 1431 pares de bases (B) Tipo: cido nucleico (C) Clase de cadenas: doble

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(D) Conguracin: lineal (ii) Tipo de molcula: (A) Descripcin: ADN genmico (iii) HIPOTTICA: No (iv) CADENA COMPLEMENTARIA: No
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(vi) FUENTE ORIGINAL: (A) Organismo: Alcaligenes eutrophus
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(vii) FUENTE INMEDIATA: (A) Banco: Genmico (xi) DESCRIPCIN DE LA SECUENCIA: SEC ID n: 1:

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(2) Informaciones para la SEC ID n 2:

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(i) Caractersticas de la secuencia: (A) Longitud: 990 pares de bases (B) Tipo: cido nucleico (C) Clase de cadenas: doble (D) Conguracin: lineal (ii) Tipo de molcula:
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(A) Descripcin: ADN genmico (iii) HIPOTTICA: No
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(iv) CADENA COMPLEMENTARIA: No (vi) FUENTE ORIGINAL: (A) Organismo: Alcaligenes eutrophus (vii) FUENTE INMEDIATA: (A) Banco: Genmico (xi) DESCRIPCIN DE LA SECUENCIA: SEC ID n: 2:

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(2) Informaciones para la SEC ID n 3: (i) Caractersticas de la secuencia: (A) Longitud: 2019 pares de bases

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(B) Tipo: cido nucleico (C) Clase de cadenas: doble (E) Conguracin: lineal (ii) Tipo de molcula: (A) Descripcin: ADN genmico

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(iii) HIPOTTICA: No (iv) CADENA COMPLEMENTARIA: No
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(vi) FUENTE ORIGINAL: (A) Organismo: Alcaligenes eutrophus (vii) FUENTE INMEDIATA: (A) Banco: Genmico (xi) DESCRIPCIN DE LA SECUENCIA: SEC ID n: 3:

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