9. Centrifugacin.

Estudio del hematocrito

Isaac Tnez Fiana, Mara del Carmen Muoz, Pedro Montilla Lpez
Departamento de Bioqumica y Biologa Molecular, Facultad de Medicina, Avda. Menndez Pidal s/n, 14004 -Crdoba

RESUMEN

Las partculas en disolucin pueden sufrir alteracin espacial, es decir, pueden cambiar de posicin con el tiempo. Esto puede ser debido a procesos de difusin (en un gradiente de concentracin, las partculas tienden a ir de la zona de mayor concentracin a la de de menor concentracin) o bien a procesos de sedimentacin. En las siguientes pginas se exponen los principales conceptos tericos y matemticos sobre la centrifugacin, as como su aplicacin y uso, teniendo como objetivo principal el conocimiento bsico de esta tcnica. Palabras Clave: Centrfuga, plasma, sangre, sedimentacin Abreviaturas. rpm: revoluciones por minuto

1. INTRODUCCIN Y OBJETIVOS La centrfuga es una mquina diseada para separar partculas de una disolucin sea cual sea la naturaleza de las mismas. Bsicamente consiste en un motor elctrico que lleva unido un vstago, que a su vez soporta un cabezal o rotor donde se colocan los recipientes con las muestras. Existen don tipos fundamentales de cabezales o rotores, basculantes o de ngulo fijo.

La centrifugacin es una tcnica de transporte basada en el movimiento de las partculas, suspendidas en un medio lquido especfico, impulsadas por una fuerza denominada centrfuga, que tiende a desplazarlas hacia fuera del centro de rotacin. Tanto la viscosidad de la disolucin-muestra (esto es de gran inters para las aplicaciones analticas) como las propiedades fsicas de las partculas afectarn a la sedimentacin individual de las mismas. Este procedimiento separa fundamentalmente las partculas de acuerdo con su masa y su forma. La fuerza centrfuga depende adems, de la velocidad y radio de giro. El radio de giro (x) es la distancia desde el centro de rotacin hasta el extremo del recipiente donde est contenida la muestra. El valor de la aceleracin centrfuga, en funcin de la velocidad de giro , viene dado por la ecuacin: 42 ( rpm )2 G = x = ------------------- x = 0,01966 (rpm)2 x 3600
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donde x es el radio de giro y rpm la velocidad en revoluciones por minuto. El objetivo principal ser el conocimiento correcto de los conceptos bsicos sobre centrifugacin, as como de los diferentes tipos, utilidades y aplicaciones de este procedimiento. 1.1 Ultracentrifugacin La ultracentrfugacin fue ideada en 1923 por el bioqumico sueco Svedberg, puede alcanzar velocidades tan elevadas como 80.000 rpm, de modo que genera campos centrfugos que superan 600.000 g. La ultracentrifugacin se ha convertido en una herramienta indispensable para el aislamiento de protenas, cidos nucleicos y partculas subcelulares. 1.1.1. Sedimentacin La velocidad a la que una partcula sedimenta en la ultracentrfugacin est relacionada con su masa. La fuerza, F (sedimentacin), que acta para sedimentar una partcula de masa m, que est situada a una distancia r del centro alrededor del cual se halla girando con velocidad angular (en rad s), es la fuerza centrfuga (m 2w r) sobre la partcula menos la fuerza de flotacin (V r) ejercida por la disolucin: F = m2 r - V r V es el volumen de la partcula y la densidad de la disolucin. La velocidad con que sedimenta una partcula, est en relacin con su coeficiente de sedimentacin (s). Este coeficiente es reflejo del tamao y forma de la partcula o molcula y de l depende la velocidad con que sta sedimenta. 1.2. Ultracentrifugacin preparativa
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Consiste en aislar los materiales biolgicos para ulteriores investigaciones bioqumicas. Los rotores preparativos contienen tubos cilndricos para las muestras, cuyos ejes pueden ser paralelos, formar un cierto ngulo o ser perpendiculares al eje de rotacin del rotor. La sedimentacin puede llevarse a cabo en una disolucin de una sustancia inerte, tal como sacarosa o CsCl, en la que la concentracin y por tanto la densidad de la disolucin, aumentan desde la superficie hasta el fondo del tubo de centrfuga. Tras la centrifugacin se obtienen dos fracciones, el sedimento y una disolucin sobrenadante que puede separarse por decantacin o aspiracin. La utilizacin de este tipo de gradientes de densidad, aumenta en gran medida la capacidad de resolucin de la ultracentrfuga. Segn las determinaciones a realizar aplicaremos el tipo de gradiente de densidad ms conveniente: Ultracentrifugacin de zona Ultracentrifugacin con gradiente de densidad en equilibrio

1.3. Ultracentrifugacin con gradiente de densidad en equilibrio Separa las partculas de acuerdo con sus densidades. Este tipo de centrifugacin separa mezclas cuyos componentes posen un intervalo en sus densidades. No solo permite la separacin de varios o de todos los componentes de una mezcla en una sola vez, sino que tambin posibilita la realizacin de medidas de tipo analtico en cada uno de ellos. El mtodo consiste en una columna de fluido soporte cuya densidad se incrementa hacia el fondo del tubo. El fluido se confecciona con un soluto asequible de bajo peso molecular en un disolvente en el que las partculas de la mezcla puedan ser suspendidas. Existen dos tcnicas basadas en este mtodo: La centrifugacin zonal y la isopcnica. 1.3.1. Ultracentrifugacin zonal Separa las partculas de acuerdo con sus coeficientes de sedimentacin. La ultracentrifugacin de zona separa las macromolculas basndose ampliamente en sus masas moleculares. 1.3.2. Ultracentrifugacin isopcnica En esta tcnica el gradiente de densidad de la columna viene determinado por el rango total de densidades de las partculas de la muestra. Cada partcula sedimentar en aquella posicin del tubo de centrfuga en la que la densidad del gradiente sea igual a su propia densidad. Centrifugacin de una mezcla uniforme macromolecular disuelta en una disolucin de un soluto denso que se difunde con rapidez, tal como CsCl.
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1.4. Ultracentrifugacin analtica Difiere de la preparativa en que se utiliza fundamentalmente para el estudio de las caractersticas de sedimentacin de macromolculas y estructuras biolgicas, de este modo se sacan conclusiones acerca de parmetros fsico-qumicos de dichos compuestos. Se emplean rotores especiales. La aplicacin ms habitual en los laboratorios de bioqumica es la determinacin de pesos moleculares de macromolculas (protenas y cidos nucleicos fundamentalmente), utilizndose tres mtodos: El de velocidad de sedimentacin El de equilibrio de sedimentacin El de la aproximacin al equilibrio de sedimentacin

1.4.1. Mtodo de velocidad de sedimentacin. Es el ms habitual: la ultracentrfuga se hace funcionar a altas velocidades (70.000 rpm) lo que hace que las partculas del lquido emigren radialmente al disolvente, hacia fuera del centro de rotacin, formndose as un frente de separacin muy definido. 1.4.2. Mtodo de equilibrios de sedimentacin La velocidad requerida es mucho menor (7.000-8.000 rpm). Cuando se establece un equilibrio entre la sedimentacin (bajo la influencia de la fuerza centrfuga) y la difusin del material en la direccin contraria, cesa la migracin neta. As puede calcularse el peso molecular de un soluto a partir del gradiente producido en su concentracin, segn: 2RT ln ( c2 / c1 ) M = ----------------------------2 (1 - vp)(r22 - r21 ) donde: R= constante de los gases ; T = temperatura absoluta; = velocidad angular, p = densidad del disolvente; v = volumen especfico parcial; c1, c2 = concentraciones del soluto a las distancias r1, r2 del centro de rotacin). El excesivo tiempo necesario para conseguir el equilibrio hace que se desestime este mtodo. 1.4.3. Mtodo de aproximacin al equilibrio de sedimentacin. Al comienzo del proceso, la macromolcula est distribuida por toda la clula de manera homognea. Al ponerse en marcha la centrfuga, hay un descenso en la densidad de la disolucin en el menisco al alejarse las molculas de l. En el descenso influye el peso molecular del compuesto, por lo que este parmetro puede calcularse de los valores del descenso de la densidad. El clculo resulta complejo por el gran nmero de variables experimentales que es preciso controlar.
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2. LISTADO DEL MATERIAL NECESARIO Centrifuga de alta velocidad (8.000 12.000 rpm) Plastilina Tubos capilares de 75 mm de largo y 2 mm de dimetro interior y heparina desecada Lector de hematocrito

3. PROTOCOLO A REALIZAR. Adquirir muestra sangunea capilar del pulpejo del dedo o del taln con el tubo capilar hasta 1-2 cm del final Taponar parte seca del tubo con plastilina Colocar en el plato de la centrfuga Centrifugar entre 3 y 5 min Leer la altura del plasma y de los paquetes de hemates (en la misma centrfuga si la posee o en escala aparte)

El ndice hematocrito es el volumen que ocupan las diferentes porciones que se forman al centrifugar un tubo de sangre previamente hecha incoagulable por la adicin de oxalato potsico o citrato sdico. La parte corpuscular por ser ms densa queda en el fondo del tubo, mientras que sobrenada la fraccin plasmtica. La cantidad y proporcin relativa de cada una de estas partes se denomina valor o ndice hematocrito. La medicin del valor hematocrito se fundamenta en la simple centrifugacin de una muestra de sangre incoagulable colocada en un tubo especial (tubo hematocrito) que lleva una escala de diez divisiones y que, tras la centrifugacin, permite medir la altura del volumen que ocupan los glbulos en el fondo del tubo y la del plasma que sobrenada. Los tubos utilizados tienen distintas formas y tamaos, segn los autores que los idearon (Hedin, Hamburger, Westergren, Wintrobe, etc.). Los que son capilares permiten recoger la sangre por puncin digital.

4. RESULTADOS Los resultados obtenidos debern encontrarse en caso de sujetos sanos entre los siguientes rangos segn sexo: Varn: 40,7 50,3% Mujer: 36,1 44,3%

A partir del ndice hematocrito se puede deducir la cifra de hemates. Si los hemates
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son de forma, tamao y contenido en hemoglobina normal o poco alterada, la relacin entre nmero de hemates (Heme) e ndice hematocrito (Ht) es una constante, es decir: Ht K = Heme o sea, que el porcentaje del paquete hematolgico multiplicado por una constante nos proporciona el nmero de hemates por milmetro cbico. Capdevila ha evaluado esta constante en 110.000; as, si suponemos que el valor hematocrito de un paciente es de 40 por 100 (paquete de hemates), si se multiplica por 110.000 da 4.400.000, que representa el n de hemates por milmetro cbico.

5. DISCUSIN El hematocrito es la cantidad y proporcin relativa entre los glbulos y el plasma sanguneo. Si bien este parmetro debe ser visto a la luz del resto de los parmetros presentes en la bioqumica sangunea y en la hematimetra junto con la sintomatologa del paciente, por si slo puede ser ya indicativo de variaciones en las caractersticas sanguneas. Su aumento puede indicar una reduccin en el nmero de hemates (anemia) y su aumento la situacin opuesta (policitemia).

6. BIBLIOGRAFA RECOMENDADA Galindo J (1988): Centrifugacin. En Lozano JA, Tudelo J (eds): Prcticas de Bioqumica. Experimentacin y Simulacin, 1 ed. Editorial Sntesis (Madrid, Espaa), pp. 17 24. Gonzlez de Buitrago JM (1985): Citometra hemtica y otras tcnicas hematolgicas. En Gonzlez de Buitrago JM (ed): Tcnicas de Laboratorio Clnico, 1 ed. Editorial Alhambra (Madrid, Espaa), pp. 36 51. Govantes J, de Lorenzo P, Martn JJ, Martn J (1990): Sangre-Hematopoyesis. En: Manual Morton, 6 ed. Editorial Laboratorios Morton (Madrid, Espaa), pp. 31 35. Stroev EA, Makarova VG (1989): Introduction to laboratory manual in biochemistry. En Stroev EZ, Makarova VG (eds): Laboratory Manual in Biochemistry, 1 ed. Editorial MIR Publishers Moscow (Mosc, Rusia), pp. 15 30.