LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA

Ingeniería en Alimentos

Facultad de Química y Biología

Departamento de Biología

USACH

GUÍA DE LABORATORIO N° 4

“Crecimiento bacteriano y factores que afectan el

crecimiento bacteriano; Método turbidimétrico”.

Dra. Denisse M. Bravo Rodríguez

Dr. José Manuel Pérez Donoso

Estudio del crecimiento bacteriano.

Las bacterias tienen la capacidad de adaptarse a distintos ambientes y

de este modo pueden colonizar ambientes muy variados. Que tipo bacteriano es
capaz de crecer en que ambiente dependera de los genes/proteínas que posea
cada microorganismo. En este sentido, distintos tipos bacterianos son
afectados de manera diferente por variaciones en las condiciones de
crecimiento. Las condiciones óptimas de crecimiento para la mayoría de los
organismos de uso rutinario en el laboratorio (especialmente Escherichia coli)
involucran; medio rico (medio LB), 37°C y agitación intensa (para aumentar la
oxigenación del cultivo). El crecimiento bacteriano puede ser evaluado por
varias metodologías, sin embargo la mas sencilla y rutinariamente utilizada es
la determinación de turbidez del cultivo. A medida que aumenta la población
bacteriana, la turbidez del medio de cultivo aumenta. Este aumento puede ser
cuantificado espectrofotometricamente a traves de la absorcion a 600 nm (ver
Figura).

EL CULTIVO DE MICROORGANISMOS

En la naturaleza los microorganismos existen como complejas poblaciones de

muchos tipos diferentes. Nuestro conocimiento de la microbiología se
desarrolló gracias al estudio de especies aisladas, creciendo en ambientes
libres de contaminación de otras formas de vida.
Como todas las formas de vida, los microorganismos requieren de los
nutrientes adecuados para crecer como también de un ambiente favorable. El
medio de cultivo debe contener aquellos nutrientes esenciales para el
crecimiento y este medio debe estar además en las condiciones adecuadas para
el crecimiento, esto es, factores como pH, presión osmótica, oxígeno, etc. Los
medios de cultivo pueden ser de una o dos formas: líquido o sólido.
Ya que la mayoría de los estudios en el laboratorio se realizan con cultivos
puros, esto es, con un único microorganismo, se deberá estar capacitado para
esterilizar un medio de cultivo y mantenerlo en condiciones estériles, libre de
otras formas vivas. Al mismo tiempo, cuando se inocule el medio con el
microorganismo en estudio, esto se deberá hacer en condiciones libres de
contaminación. Esto último se conoce como técnica aséptica.
Debido a que los medios cuando son preparados contienen microorganismos
provenientes de los ingredientes y de los utensilios, tiene que ser esterilizado,
esto es, tratado con temperatura a presión u otros métodos para destruir las
células presentes. Los recipientes en donde se encuentra el medio de cultivo
(tubo, matraz, frasco) deberán ser tapados con tapones de gasa o tapas roscas
sueltas, de manera de impedir la entrada de los microorganismos a los medios
de cultivo, pero permite el intercambio gaseoso.
Inoculación.-
Para crecer un cultivo bacteriano en un medio estéril, un número de células –el
inóculo- debe ser transferido (inoculado) desde otro medio con las
precauciones necesarias para mantener la pureza del cultivo. Este
procedimiento se realiza con un asa microbiológica (asa de nicrón), la que debe
ser calentada a la llama hasta enrojecimiento y luego enfriarla antes de ponerla
en contacto con el cultivo bacteriano. Con esta asa es posible realizar
inoculaciones desde un cultivo bacteriano en medio líquido o desde colonias en
un medio sólido al medio estéril. La cantidad de bacterias que es transferida
es lo suficientemente grande en el asa que no es necesario agitarla en el medio
líquido estéril.
En el procedimiento de inoculación es muy importante calentar el asa hasta
enrojecimiento, tanto antes como después de la transferencia, lo que destruye
cualquier forma de vida en la superficie del asa. Para ello debe sostener el asa
hacia abajo en la llama, calentando todo el alambre y parte del portaasa (ver
figura).
Durante la transferencia, sostenga el tubo con la mano izquierda y tome el
tapón con el dedo meñique de la mano derecha o entre los dedos (no es fácil al
comienzo, pero se logra con la práctica). Mantenga el tubo lo más horizontal
posible durante la inoculación, pero por el mínimo tiempo posible. Las bocas de
los tubos tanto del que se toma el inóculo como del que se inocula, deberán ser
flameadas a la llama antes y después. La llama crea una corriente de
convección disminuyendo la probabilidad de contaminación (ver fugura).

Como es de gran importancia el trabajo con cultivos puros, es necesario que

estas técnicas asépticas sean dominadas.
Después de la inoculación, el cultivo bacteriano deberá ser incubado en un
ambiente adecuado para el crecimiento. Crecimiento significa el desarrollo de
una población de células a partir de una o pocas células. Esta masa de células
hijas se hace visible al ojo desnudo por la turbidez en un medio líquido, o por
una población aislada –una colonia- en un medio sólido. La apariencia del
crecimiento bacteriano es una forma de diferenciación entre las especies
microbianas.
Una forma de preparar un medio sólido de cultivo es agregando un agente
solidificante a un medio de cultivo, el que en frío se solidifica. El más común es
el agar, sustancia obtenida de un alga marina y que se comercializa en forma de
polvo seco. Químicamente, el agar es un galactano, un carbohidrato complejo
compuesto por moléculas de galactosa y no es metabolizado (degradado) por la
mayoría de las bacterias. Se usa generalmente a una concentración de 1,5%,
cuando se siembra sobre su superficie. Otros agentes utilizados para
solidificar los medios de cultivo son: la gelatina a una concentración de 12 –
15%, que es líquida a temperatura sobre 25 C y que es hidrolizada por algunas
bacterias; la sílica gel, una sustancia usada para el cultivo de autótrofos, para
los cuales la materia orgánica debe estar ausente.
Las siguientes actividades tienen como objetivo familiarizarse con el material
usado en microbiología, con los diferenes tipos de medios de cultivo y con las
técnicas asépticas en el aislamiento y transferencia de cultivos puros.

Cultivo bacteriano en medio líquido

Una forma simple de manipular bacterias es creciéndolas en un tubo de ensayo

con medio de cultivo. Existen numerosas recetas de medios de cultivo y su
selección dependerá de la bacteria que quiera crecer.
El crecimiento podrá ser observado de diferentes maneras:

1. Turbidez Esta condición es enturbamiento, más o menos denso.

2. Formación de una película Una pequeña masa de células flotan en la parte
superior del cultivo.
3. Sedimento Un depósito de células decantan en el fondo del medio de
cultivo, pero suben cuando se agita homogenizándose.
4. Mucoide Si las células no se separan cuando suben desde el fondo.

CUESTIONARIO

1. ¿Por qué es importante no enterrar el asa de inoculación en la superficie del

agar?
2. ¿Por qué las bacterias (especialmente las que son mótiles) no crecen a través
del agar en un medio que contiene 97% de agua?

Método turbidimétrico:
Se puede medir la turbidez producida en el medio líquido por el desarrollo
bacteriano. Se mide la cantidad de luz absorbida en un espectrofotómetro. El
método es apropiado cuando ya hay cierta turbidez en el medio, no sirve para
las primeras fases del desarrollo, luego, a medida que las bacterias se
multiplican, la turbidez del cultivo aumenta. Habitualmente la turbidez se
determina a una longitud de onda de 600nm.
Curva de crecimiento clasica de bacterias; en ella se puede describir 4 fases,
la fase lag, la fase de crecimiento exponencial (log), la fase estacionaria y la
fase de muerte celular.

Protocolo

1.- En un matraz con 45 ml de medio LB, agregue un 5 ml de inoculo bacteriano

(el inoculo corresponde a un cultivo bacteriano crecido durante la noche con el
cual se inicia un cultivo nuevo). Deje el matraz en la incubadora a 37°C con
agitación vigorosa.

2.- Inmediatamente tome una muestra de ese cultivo y determine la Abs 600,
este sera su tiempo cero (recuerde antes de medir la absorción, hacer el
blanco en el espectro solo con medio LB).

3.- Tome muestras de 1 ml cada 15 min y determine Abs600

4.- Grafique sus resultados (Abs600 v/s tpo)

Efecto de factores ambientales sobre el crecimiento bacteriano

Para evaluar el efecto de diversos factores ambientales en el crecimiento de E.

coli cada grupo del laboratorio realizará el mismo protocolo descrito
anteriormente pero con UNA de las siguientes modificaciones.

A) Crecer las bacterias a 37 °C sin agitación.

B) Crecer las bacterias a temperatura ambiente sin agitación.
C) Crecer las bacterias a temperatura ambiente con agitación.
D) Crecer las bacterias en medio LB pH 5,5 a 37°C con agitación.
E) Crecer las bacterias en medio LB pH 8,5 a 37°C con agitación.
F) Crecer las bacterias en medio mínimo con agitación y 37°C.
G) Crecer las bacterias en presencia de un agente bactericida (LB mas
K2TeO3 0,05 µg/ml).
 EFECTO DEL LAVADO DE MANOS EN EL NÚMERO DE
MICROORGANISMOS EN LA PIEL

Antes del descubrimiento de los microorganismos, no se había prestado

atención al lavado de manos ni a los métodos de rutina de limpieza de utensilios
y ambiente. Semmelweis fue quien reconoció la relación entre el lavado de
manos y la transmisión de infecciones de la fiebre puerperal (madres recién
paridas). Con el lavado de manos de las personas que atendían a las puérperas,
se disminuyó diez veces la trnasmisión de la enfermedad.

El lavado de manos elimina microorganismos transientes que se acumulan en la

superficie de la piel y también remueve el exceso de la población que es parte
de la flora normal. En esta actividad, Ud. va a determinar la efectividad del
lavado de manos normal sobre el número de microorganismos de la piel.

Materiales

Jabón, agua estéril, tórulas estériles, 6 placas de agar TSA (agar soya
tripticasa).

Protocolo

1.- Con una tórula estéril y humedecida en agua estéril, pásela con rotación
por un área de 10 cm2 sobre la palma de una de sus manos.
2.- Inocule una placa de TSA por toda su superficie.
3.- Lave bien sus manos por 30 segundos como normalmente lo hace.
4.- Repita el procedimiento con la misma palma de su mano.
5.- Inocule otra placa de TSA con la segunda tórula.
6.- Repita el lavado por otros 30 segundos hasta inocular la placa, y hasta
completar 3 min de lavado
7.- Luego de incubar las placas, observe la densidad de crecimiento bacteriano
indicando con ++++= muy alto crecimiento, +++= alto crecimiento, ++=
crecimiento moderado, += poco crecimiento, -= no hubo crecimiento. Si
crecen colonias individuales, cuéntelas y registre el número. Analice
también si hay diferentes tipos de colonias.
Cuestionario

1. Averigüe qué bacterias son habitantes de la flora normal de la piel.

2. ¿Qué significa que hayan diferentes tipos de colonias? ¿Cómo se dio
cuenta de ello? ¿Podría verificar este hecho por otros medios? ¿Cuáles?
3. ¿Son las bacterias de la flora normal patógenas o que pueden causar
enfermedad?
4. ¿Qué es la flora transiente?
5. El jabón común, ¿mata las bacerias? ¿Por qué?
6. ¿Cómo se logra tener las manos realmente libres de bacterias? ¿Es
posible?