Universidad Católica de la Santísima Concepción

Facultad de Medicina, Escuela de Medicina

Depto. De Ciencias Básicas y Morfología
Laboratorio de Bioquímica

PRÁCTICO N° 2
PROPIEDADES DE LAS PROTEÍNAS

Integrantes: Susana Córdova

Dafne Del Mauro
Alessio Espinoza
Valentina Fuentes
Carrera: Medicina
Sección: I
Fecha de realizacion : 5 de mayo, 2010
Fecha de entrega: 12 de mayo, 2010
Docentes encargados : BQ Mirna Munoz, M.Sc.
Dr. Reginald Del Pozo, Ph.D.
1. Resumen
El objetivo de este laboratorio fue evidenciar las
propiedades de las proteínas mediante su reacción
con diversas sustancias y en diferentes
condiciones. Se realizaron 3 experimentos en
laboratorio: Identificación de aminoácidos con
ninhidrina; estos al tener sus grupos aminos libres
reaccionan con esta sustancia produciendo un
compuesto azul violáceo. Para esto, se utilizaron
una solución neutra de aminoácidos y otra caseína
que fueron mezcladas cada una con 0.5 ml de
solución alcohólica de ninhidrina, además de un
control (agua destilada mas ninihidrina). La muestra
de aminoácidos dió resultado positivo mientras que
la de caseína se consideró negativa al tener una
unión más débil con el reactivo. En el segundo
experimento se 4 tubos con soluciones expuestas a
agentes desnaturalizantes como el acido
tricloroacético al 10%(p/v) y temperaturas elevadas
(baño maría). Los primeros dos tubos contenían
caseína la cual, expuesta al calor no se vió
afectada, pero si precipitó al estar en contacto con
el ácido; los otros dos tubos contenían agua
destilada que se expusieron a los mismos agentes,
con resultados negativos. En el último experimento
expusimos la caseína a 9 soluciones de diferentes
pH, a fin de encontrar su punto isoeléctrico al cual
precipita, el cual resultó 4,55.
2. Introducción
Las proteínas son una de las macromoléculas más
importantes que conforman nuestro cuerpo, ya que
realizan diversas funciones. Por lo tanto el estudio
de sus propiedades es y seguirá siendo un medio
importante para conocer los efectos que producen
sus alteraciones y los posibles métodos de
tratamiento. Están compuestas por la asociación de
aminoácidos mediante un enlace peptídico.
Hoy en día es posible secuenciar los aminoácidos
que componen a una proteína, con el fin de conocer
su estructura y propiedades, ya que existe para
cada proteína un segmento de DNA que codifica la
información que especifica su secuencia de
aminoácidos, lo cual ha significado un gran avance
para el reconocimiento de algunas enfermedades
provocadas por el mal funcionamiento de algunas
proteínas, puesto que la secuencia de sus
aminoácidos determina la función que lleva a cabo
una proteína.
Uno de los métodos de reconocimiento de
aminoácidos utilizado en el laboratorio y que será
analizado en el presente informe, es la reacción de
éstos con Ninhidrina, esta sustancia actúa
desaminando el aminoácido y formando un
aldehído que contiene un átomo de carbono menos
que el compuesto original, ninhidrina reducida,
dióxido de carbono y amoniaco. Este último se une
con otra molécula de ninhidrina y con la ninhidrina
reducida formando un producto de color azul o
púrpura.
La estructura de las proteínas está íntimamente
ligada a su función, por tanto cualquier agente que
la dañe también afectará su función. La pérdida de
la estructura tridimensional que es suficiente para
originar la pérdida de la función se denomina
desnaturalización. Entre los agentes que la
producen se encuentran los detergentes, el calor
por sobre los 50°C, los cambios bruscos en el pH
(ácidos y bases fuertes); los cuales rompen los
enlacen no covalentes que estabilizan su
estructura.
Las proteínas tienen un pH característico al cual su
carga neta es cero, al cual se le denomina punto
isoeléctrico. Las proteínas en este punto presentan
su máxima posibilidad para ser precipitadas al
disminuir su solubilidad, debido a que hay menos
repulsiones intermoleculares y esto facilita su
agregación. En el práctico de laboratorio se
aprovechó esta propiedad para determinar el punto
isoeléctrico de la caseína.
Dentro de los objetivos que se plantea alcanzar en
este informe se encuentran:
 Diferenciar aminoácidos de proteínas,
según su reacción con ninhidrina.
 Demostrar que los daños en la estructura
por agentes como el calor y los ácidos
fuertes, como el acido tricloroacético,
producen la desnaturalización de las
proteínas y precipitación.
 Comprender por qué la caseína en su punto
isoeléctrico se hace menos soluble,
además de la incidencia que tiene el pH
sobre ésta.
 Entender la importancia del correcto uso del
material de laboratorio.
3. Materiales
Tubos de ensayo, vaso precipitado 200 ml y 50 ml,
trípode, gradilla, mechero Bunsen, propipetas
(verde, azul), pipeta de 10, 1 y 5 ml, pinza metálica,
rejilla, fósforos, marcador permanente, vórtex,
cronometro.
Reactivos:
  Solución alcohólica de ninhidrina al 0.1% Método Experimental N°1: Identificación de
 Solución neutra de aminoácidos 0.1 M aminoácidos por la reacción de Ninhidrina y su
diferenciación con las proteínas:
 Solución neutra de caseína: 0.5 g de
caseína en 100 ml de buffer fosfato 0.1 M
pH 7.0} Tabla 1. Soluciones con reacción de ninhidrina, y
 Muestra proteica colores obtenidos.
 Acido tricloroacetico (TCA) al 10% p/v}
 Caseína al 0.5% en acetato de sodio 0.1 M Componentes Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3
 Acido acético 1M Sol. neutra de 2.5 ml - -
aminoácidos
 Agua destilada Sol. neutra - 2.5 ml -
caseína
4. Métodos Agua destilada - - 2.5 ml
Sol. alcohólica 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml
Método Experimental N°1: Identificación de
ninhidrina
aminoácidos por la reacción de Ninhidrina y su
Resultados x ox o
diferenciación con las proteínas:
x = positivo
Se preparan 3 soluciones.
o = negativo
Tubo 1. 2,5 ml de sol. Neutra de aminoácidos Tubo Resultados:
2. 2,5 ml Sol neutra de caseína Tubo 3. 2,5 agua
Tubo 1: -morado = 1 min.
destilada. A los 3 tubos agregar 0.5 ml de sol.
-morado intenso =2 min.
Alcohólica de ninhidrina. Agitar en el vórtex y
-morado violáceo =3min.
finalmente someter a baño María por 3 minutos,
Tubo 2:-café = 1 min
observar resultados.
-pálido morado (error por caseína muy
Método Experimental N ° 2: Reconocimiento de concentrada, debería dar lila claro)
proteínas por reacciones de precipitación por Tubo 3: sin color.
desnaturalización por calor y ácido tricloroacético:
Se rotulan 4 tubos de ensayo.
Método Experimental N°2: Reconocimiento de
Tubo 1. 0.5 ml de muestra proteica. Tubo 2. 0.5 ml proteínas por reacciones de precipitación por
de agua destilada. Tubo 3 0.5 ml de muestra desnaturalización por calor y ácido tricloroacético.
proteica + 0.5 ml de TCA 10% Tubo 4 0.5 ml de
agua destilada + TCA 10%. Agitar en el vórtex y Tabla 2. Soluciones para reconocimiento de
luego calentar a baño María durante 3 minutos, proteínas por precipitación
observar resultados. Componente Tubo Tubo Tubo Tubo
1 2 3 4
Método Experimental N°3: Determinación del punto Muestra 0.5 ml - 0.5 ml -
isoeléctrico de la caseína: proteica
Agua - 0.5 ml - 0.5 ml
Se rotulan 9 tubos de ensayo. En el primero se destilada
mezclan 3.2 ml de ac. Acético 1M + 6.8 ml de agua TCA 10% - - 0.5 ml 0.5 ml
destilada, mezclar en el vórtex. A los 8 tubos Resultados:
restantes se le agregan 5 ml de agua destilada. - Agitación en vórtex:
Luego se toman 5 ml del primer tubo y se agregan Tubo 1 = opalescente
al segundo, continuar asi hasta completar los 9 Tubo 2 = opalescente
tubos de manera que se vayan diluyendo. Eliminar Tubo 3 = turbo blanquecino
del último tubo 0.5 ml por exceso. Finalmente Tubo 4 = opalescente
adicionar a todas las muestras 1 ml de sol de - A baño María por 3 min:
caseína en acetato de sodio 0.1M, anotar el efecto Tubo 1 = opalescente
inmediato y el observado 15 minutos después. Tubo 2 = opalescente
Tubo 3 = precipitado blanco inmediato
5. Resultados: Tubo 4 = opalescente
 enlaces disulfuro, puentes de hidrógeno,
Método Experimental N°3: Determinación del punto interacciones hidrofóbicas, puentes salinos, y
isoeléctrico de la caseína: fuerzas de Van der waals. Un pequeño cambio en
la secuencia de aminoácidos ocasionará cambios
Tabla 3. Determinación de punto isoeléctrico para en su estructura acarreando la consecuente
caseína y resultados obtenidos. pérdida de su actividad biológica. Cada aminoácido
T T T T T T T T T de una proteína está en su lugar, con un propósito
mponente 1 2 3 4 5 6 7 8 9 determinado, en su conjunto le confieren a las
proteínas sus propiedades de especificidad. Otra
cada 3.5 3.8 4.1 4.4 4.7 5.0 5.3 5.6 5.9
propiedad de las proteínas que analizaremos en
o
este práctico, corresponde a la solubilidad. Las
ua 6.8 5 5 5 5 5 5 5 5
stilada proteínas globulares, por ejemplo, son solubles en
) agua, producto de que sus radicales polares o
do 3.2 - - - - - - - - hidrófilos se disponen hacia el exterior formando
ético 1M puentes de hidrogeno con el agua. De la misma
) forma, sus radicales hidrófobos se ubican hacia el
. 5 5 5 5 5 5 5 5 5 interior de la proteína, estabilizando la estructura en
ución a
su interacción con el medio. La solubilidad varía
egar al
o dependiendo del tamaño, de la forma, de la
uiente posición de los radicales, y como veremos en el
) 5 práctico, del pH. Un proceso importante que
ml desarrollamos fue la desnaturalización de una
sultados proteína, que consiste en la pérdida de su
mediatos O + + +x +x + + o o estructura tridimensional, es producto de una
sultados
variación significativa en la temperatura, la presión,
spués de O + x xx xxx x++ + o o
min. la electronegatividad, el pH, etc. que tiene por
consecuencia la ruptura de los puentes de
o = no cambia hidrogeno que mantienen la estructura secundaria y
+ = opalescencia terciaria, es así como las proteínas se transforman
x = precipitado en fibras insolubles en agua. Si las condiciones
expuestas a nuestra muestra son suaves, el
Se aprecia que la caseína se torna insoluble en su proceso puede ser reversible. Si en cambio, el
punto isoeléctrico precipitando. El punto isoeléctrico proceso es más drástico, el resultado es definitivo,
corresponde al promedio de los pH donde se por tanto irreversible.
produce la precipitación de la proteína (tubos 4 y 5)
Punto isoeléctrico = (4.4+4.7)/2 = 4.55
Para una clara comprensión de los resultados
vamos a dividir nuestra experimentación en 3
7. Conclusión y discusión
procesos independientes. Con el fin de analizar por
separado las distintas propiedades proteicas que en
La temática del práctico numero 2, hace referencia cada ensayo nos vimos enfrentados.
a las propiedades de las proteínas. Hemos
realizado tres experiencias que nos aportaron clara El primer procedimiento involucra 3 tubos con
evidencia acerca de las características de estas distinta muestra que nos arrojan resultados
macromoléculas. Es fundamental tener presente, diversos, expuestos en la Tabla 1.
para la conclusión de nuestros resultados, que las
proteínas dependen de su estructura tridimensional, Antes de empezar nos planteamos hipótesis que
es decir, de acuerdo a su conformación primaria esperamos corroborar al momento de la
adquieren un orden espacial. La cadena experimentación: para el tubo 1, dedujimos que la
polipeptídica de cada proteína está compuesta por reacción arrojaría un resultado positivo (coloración
un número determinado de aminoácidos dispuestos azul-violáceo), pues la ninhidrina reacciona
espacialmente, unidos por enlaces peptídicos, específicamente oxidando el n-terminal de la
cadena polipeptídica del aminoácido, reduciéndose
a si misma y liberando amoniaco y dióxido de
carbono. Para el tubo 2 concluimos que la muestra
iba a arrojarnos un resultado negativo, por la baja
afinidad de parte de la ninhidrina con las soluciones
proteicas, como lo es la Caseína. Para el tubo tres
indujimos un resultado negativo pues en el agua
destilada la ninhidrina no tiene con que reaccionar.
Nuestras hipótesis se vieron corroboradas en el
paso de la experimentación. Los tubos 1 y 3 se
ajustaron a lo esperado, mientras que el tubo 2 nos
arroja un resultado diverso que nos obliga a
plantear conclusiones al respecto. Si el
procedimiento no reconoce proteína ¿por qué
presenta una coloración lila después de 3 minutos
en baño María? En este paso del procedimiento
presentamos un error de preparación de la muestra
de caseína, la cual se nos fue entregada en una
concentración mayor a la empleada generalmente
en este tipo de reacción. Frente a este error no
podíamos hacer nada más que continuar con el
procedimiento, ya que no está considerado el paso
de medir concentración ni el paso de dilución. Por
tanto al respecto concluimos, que la muestra de
caseína responde negativamente a la ninhidrina
puesto que en las proteínas gran parte de los grupos
amino de sus aminoácidos constituyentes se encuentran
bloqueados por los enlaces covalentes, por lo cual sólo el
NH3 del amino terminal y algunos de los aminoácidos
básicos reaccionan dando un tono violeta muy débil.
Experimento 2:Toda proteína presenta una
solubilidad respeto al medio con el que interactúa,
esta propiedad viene dada por su conformación
espacial y la integridad de sus distintos niveles
estructurales. Cuando alteramos la estructura
secundaria y terciaria, la proteína pierde su
funcionalidad, este proceso lo llamamos
desnaturalización. Los agentes desnaturalizantes
con que trabajamos en esta oportunidad son: un
medio ácido proporcionado por el acido
tricloroacético al 10%(p/v) y temperaturas elevadas
producto del baño María a que sometimos las
muestras. Los 4 tubos que preparamos nos
permitieron deducir lo siguiente:
Tubo 1: la muestra proteica expuesta al calor
durante 3 minutos no presenta ningún tipo de
alteración, no se ven cambios de tonalidad ni
precipitación. Exponemos la muestra a 3 minutos
más si obtener resultado alguno. Deducimos que el
agente desnaturalizante, en este caso el calor
aplicado, no es suficiente para lograr una
desnaturalización total. Los procesos más efectivos
para lograr una desnaturalización son medio acido
o alcalino fuerte, temperaturas elevadas y tiempo
prolongados; en nuestro experimento sólo
cumplimos con una condición de las expuestas, por
tanto la desnaturalización no se lleva a cabo
completamente y los enlaces disulfuro por su fuerza
covalente, permanecen intactos.
Tubo 2: No presenta ninguna sustancia que
desnaturalizar, el agua destilada expuesta al calor
solo se evapora.
Tubo 3: En esta muestra presentamos dos agentes
desnaturalizantes, la temperatura elevada y el
medio ácido (TCA) con lo cual obtenemos una
desnaturalización más efectivas y detectable por los
efectos visibles. Al agitar en vórtex obtenemos una
mezcla turbia y blanquecina que durante el baño
María precipita de inmediato. Por lo tanto la
desnaturalización se lleva a cabo y la muestra
proteica pierda toda actividad biológica y
propiedades físico-químicas.
Tubo 4: No presenta reacción, obtenemos como
resultado el ácido diluido en agua. Con una
concentración menor a la que poseía en una
primera instancia
Para el procedimiento 3 utilizamos caseína, que es
una proteína característica de la leche.
Sabemos, a priori, que el punto isoeléctrico de una
proteína coincide con su estado menos soluble, por
tanto en muchos casos, precipita por su
incapacidad de reaccionar con el medio que la
contiene por su carga neta 0. En cambio, a medida
que aumentamos o disminuimos el pH, la proteína
se tornará más soluble.
Este procedimiento nos permitió obtener el punto
isoeléctrico de la caseína, observando en
soluciones de distinto pH, en cuales la proteína
precipitaba.
Los resultados más fiables de valorar, son los
segundos (ver tabla 3) donde el precipitado de
proteína pasa de estar en una fase en suspensión a
decantar en el fondo del tubo. Las muestras donde
obtuvimos mayor precipitado, correspondieron a la
número 4 y 5, con pH 4.4 y 4.7 respectivamente.
Sin embargo, la mayor cantidad de precipitado la
obtuvimos en el tubo 5. Deducimos por tanto, que el
punto isoeléctrico se encuentra entre los valores de
pH 4.4 y 4.7. Esto nos da como promedio 4.45, no
obstante con el fin de redondear y considerar la
mayor precipitación, es que concluimos que la
caseína posee un pI de 4.6 (valor que se ajusta al  Muñoz. M, Del Pozo. R, Guía de Trabajos
real). A medida que nos alejamos de este valor la Prácticos, Carrera de Medicina 2010,
solubilidad aumenta, por lo tanto, en los valores de Universidad Católica de la Santísima
pH más extremos obtenemos soluciones Concepción, Facultad de Medicina,
transparentes u/o opalescentes débiles, donde la Departamento de Bioquímica.
proteína cargada eléctricamente, no forma  Nelson, D; Cox, M. Lehninger Principios de
agregados. Bioquímica, Tercera Edición, Ediciones
Omega, 2000, Barcelona, España.
Las propiedades proteicas definen la función que
desempeñará en el organismo una proteína en
particular, cualquier alteración en su conformación,
punto isoeléctrico o el medio en donde se
desenvuelven, ocasionará un cese de su actividad
biológica. El conocer dichas características nos
aseguran mantener nuestro organismo en un
estado de equilibrio, velando por el buen
desempeño de todos sus componentes. Tenemos
completa certeza que un alza de temperatura
corporal de tan solo 3 grados con respecto a los
parámetros normales (36.5 C) y mantenido por un
tiempo determinado, puede provocar daños graves
a la salud del paciente, en otras palabras,
desnaturalización de las proteínas. El pH fisiológico
que mantiene nuestro organismo corresponde a
7.4, un alza o diminución de esta medida
ocasionará un desajuste en el desempeño proteico.
Las proteínas de transporte, de regulación,
estructurales, etc. se presentan en una determinada
concentración, alteración en estos niveles pueden
ser causas de afecciones graves. El conocimiento
claro y preciso de todos estos parámetros, nos
asegurará una clara comprensión del aspecto
bioquímico de las patologías, las cuales nos
veremos enfrentados en nuestra práctica
profesional.

8. Bibliografía: