BIOTECNOLOGIA PARA INGENIEROS Sistemas bioldégicos en procesos tecnolégicos Compilado por: ALAN SCRAGG Director honorario y decano del | Tastituto Wolfson de Biotecnologia | Departamento de Biologfa Molecular y Biotecnologia Universidad de Sheffield LIMUSA NORIEGA EDITORES MEXICO © Espafia Venezuela * Colombia; Seurrea, 2 | | ; Yo ee CL rire ncn “PRGER. ANDRES FAOREGAS Roca EA caste: |! VERSION AUTORIZADA EN ESPAROL DE LA BRA PUBLIGADA EN INGLES'CON EL TiTULO: BITECHNOLOGY FOR ENGINEERS. Biotocical SYSTEMS IN TECHNOLOGICAL PROCESSES ©AH.Sorasc/Etus Honwoo LiwrteD COLABORADOAA EN LA TRADUCCION: LEONOR HUERTA, Biotoca. Escuets Nacional. o€ EsTunios Prore- SIONALES IZTACALA. UNtversioab Nacionat Aura- NOMA De México. La PRESENTACION Y OISPOSICION EN CONLUNTO DE BIOTECNOLOGIA PARA INGENIEROS, SISTEMAS BIOLOGICOS EN PROCESOS TECNOLOGICOS SON PROPIEQAD DEL EDITOR. NINGUNA PARTE OE ESTA (BRA PUEDE SER REPRODUCIDA © TRANSMITIDA, MEDIANTE NINGUN SISTEMA 0 METODO, ELECTRONICO (© MECANICO (INCLUYENDO EL FOTOCOPIADO,LA GRA BACION © CUALOUIER SISTEMA OE RECUPCRACION Y ALMACENAMIENTO. OF INFORMACION), SIN CONSEN- TIMENTO POR ESCAITO DEL EDITOR, Denecros nescAvaoos: © 1999, EDITORIAL LIMUSA, S.A. ve C.V. GRUPO NORIEGA EDITORES Ba.oeras 98, Mexico, D.F. CP, 06040 B® (5)821-21-05 01(800) 7-06-91-00 (B (5)512-29-03 limusa@noriega.com.mx 1S. www.noriega.com.mx CANIEM Nom. 121 ‘SEGUNDA REIMPRESION IweReso EN México ISBN 968-18-4708-3 @10 Cinética del crecimiento 1. W. Marison 10.1 ,QUE ES EL CRECIMIENTO MICROBIANO? La microbiologia comprende el estudio de una amplia variedad de sistemas vivientes “inferiores” que incluyen virus, bacterias, algas, hongos simples como las levaduras y Jos mohos, asi como los hongos superiores altamente diferenciados ms grandes como las “‘setas”. En este capitulo se consideraré la cinética del crecimiento de los organismos procari6ticos unicelulares, en particular las bacterias. En un medio de apoyo para el crecimiento adecuado, los microorganismos unicelulares aumentan de tamajio y, por tiltimo se dividen en dos por un proceso de fisién binaria 0 gemacién. De hecho, una célula microbiana no viable se define como aquella que, incubada en medio de apoyo para el crecimiento por un periodo suficientemente largo, es incapaz de aumentar su tamafio o de multiplicarse. Es importante entender que una célula que aparentemente no crece, atin puede ser viable, pero el medio es incapaz de apoyar el crecimiento debido a la disminucién de un nutriente esencial, la presencia 0 produccién de materiales t6xicos 0 un cambio en el medio fisico, como Ja disminuci6n de oxfgeno, pH o temperatura. A menuda, las células pueden vivir en este estado sin crecimiento, particular- mente Como esporas 0 quistes, por periodos largos. Las células microbianas requieren un alto grado de adaptabilidad para responder a cambios tanto en el medio fisico como en el quimico. A diferencia de las formas de vida diferenciadas, multicelulares, los organismos unicelulares responden a cambid& en el medio al exhibir un conjunto diferente de actividades metabélicas. Asf, un microbio facultativo inducira las enzimas necesarias para el metabolismo oxidativo (respiratorio), cuando el oxigeno sea suministrado a un medio anaerobio. Los organismos unicelulares son capaces de existir en una variedad de estados fisiolégicos y pueden cambiar répida- mente de un estado a otro. El crecimiento se puede considerar como el aumento ordenado de todos los constitu- yentes quimicos de un organismo, lo cual, para los organismos unicelutares, conduce a un aumento en el niimero de individuos en la poblacién.192 Cinética del crecimiento {Cap. 19 Se puede considerar el crecimiento al nivel de individuos dentro de una poblacign (ciclo celular) o el crecimiento de poblaciones celulares (ciclo de crecimiento). ¥ crecimiento de las poblaciones celulares se puede subdividir en sistemas cerrados, como el cultivo intermitente y en sistemas abiertos, como el cultivo alimentado por lotes y e| cultivo continuo. 10.2. MEDICION DEL CRECIMIENTO MICROBIANO ‘Antes de considerar el crecimiento de las poblaciones de células microbianas en detale, es importante considerar c6mo puede medirse este crecimiento 10.2.1 Peso seco celular El método més usado para medir el crecimiento microbiano es secar volimenes conocidos de cultivo celular lentamente hasta obtener un peso constante. Cuando se trata de células que sedimentan répidamente, como las levaduras, esto usualmente impli- ca centrifugacién (4-6 x 103 rpm) de muestras del cultivo en tubos de centrifuga prepesados, el lavado de la pastilla celular concentrado con solucién salina isot6nica seguida por recentrifugacién a 4-6 x 103 rpm. Luego, las células concentradas se colocan en un horno a 90°C durante unas 20 horas oa 105°C durante 6 a 10 horas, hasta que hayan alcanzado un peso constante. Para células bacterianas diffciles de concentrar por centrifugacién, las muestras de cultivo se filtran a través de membranas hidrofilicas con un tamajio de poro de 0.2 pm. Las células, retenidas en el filtro, se lavan con solucién salina isotdnica y los filtros se jocan en un horno a 90°C 0 a 105°C hasta obtener un peso constante. El peso de las células secas usualmente se expresa en términos de gx I-!. . En las determinaciones del peso seco celular existen fuentes de error importantes debido a la absorcién de humedad atmosférica por las células secas y los tubos de centrifuga o las membranas durante el enfriamiento. Esto se puede evitar al enfriar en un desecador 0 mediante la determinacién de la cantidad de agua absorbida por las membranas 0 tubos y con Ia correccién adecuada del peso seco medido, La presencia de sélidos en el medio, los cuales se encuentran frecuentemente en muchos medios industriales importantes, requiere que el peso seco medido sea corregido con respecto al peso de los sdlidos. ‘La desventaja principal de estos métodos es que son lentos y requieren muestras relativamente grandes del cultivo. ‘ 10.2.2 Absorcién ‘A menudo se saca ventaja del hecho de que en una celda espectrofotométrica, las células microbianas desvian la luz de modo que la cantidad de ésta que llega al detector del espectrofotémetro, esté relacionada directamente con el niimero de células presentes en la muestra del cultivo de acuerdo con la Ley de Beer. Por lo general, se emplean longitudes de onda de alrededor de 600 nm. Es importante entender que como, la absorbancia es afectada por el tamaiio y la forma de las células, 1a relacién entre 1a absorbancia y cl niimero de células cambia si el tamafio.o.la forma de éstas cambia durante el crecimiento del cultivo.secc. 10.2] del crecimiento microbiano 193 Es comtin que la absorci6n de luz por una suspensién de células se relacione con el peso seco celular. Esto se Ileva a cabo al medir tanto Ia absorbancia como el peso seco de muestras del cultivo y graficar uno contra el otro. La pendiente de esta gréfica producir4 un coeficiente que relacione la absorbancia con el peso seco celular que puede usarse para experimentos posteriores con el mismo organismo criado en condiciones similares, En este método es importante medir el coeficiente para todo el experimento de crecimiento, puesto que no siempre es constante. Es posible que este coeficiente no sea constante a medida que la densidad de células aumenta debido a la respuesta no-lineal del espectrofotémetro a valores de absorcién altos. Por lo tanto, es importante trabajar en el intervalo lineal mediante Ia diluciGn adecuada de las muestras del cultivo, de modo que la absorci6n esté directamente relacionada con la densidad celular. Los medios s6lidos ocasionan otras dificultades. 10.2.3 Peso himedo Este quiere decir simplemente Ia centrifugaci6n o filtracién de muestras del cultivo seguida por el pesado directo. Aunque es un método extremadamente rapido, es importante estandarizar correctamente el procedimiento ya que se mide el agua tanto intracelular como extracelular, lo cual puede ocasionar errores considerables. 10.2.4 Volumen de células empacadas Mediante la centrifugacién de muestras del cultivo en tubos de centrifuga graduados se puede determinar répidamente el volumen de células empacadas (VCE). Este método es muy)inexacto, especialmente cuando se miden pequefios cambios en Ia poblaci6n celular. 10.2.5 Ntmero de células El crecimiento se puede determinar también en términos del ntimero de células por litro. Et ndmero total de células se puede medir colocando muestras de cultivo adecuadamente diluidas sobre porta objetos de microscopios graduados como los de Helber o los hematocit6metros y contando el niimero de células con Ia ayuda de un microscopio. Aunque este método es relativamente rapido y exacto, no distingue entre células viables y no viables, también muy agotador, sin embargo se cuenta con contadores de células autométicos (jy caros!).. La medicién del niimero de células viables en un cullivo, se puede hacer diluyendo muestras del mismo con solucién salina estéril y colocando en seguida volimenes de 0.1 ml sobre la superficie de un medio adecuado de apoyo como el agar. Después de la incubaci6n, se puede contar el nimero de colonias suponiendo que cada colonia se origina de una célula individual. Adem4s de requerir de aproximadamente 24 horas para el crecimiento de tas colonias, este método requiere de una buena técnica de esterilizacién y de cuidado en la dilucién de las muestras. 10.2.6 Masa de un componente celular En los casos donde se dificulte el uso de otros métodos, la cantidad de un componente celular, la cual es una cantidad constante del peso seco total, se puede usar para estimar ‘194 Cinética del crecimiento {Cap. 19 la concentracién de células o de biomasa. Se han usado componentes como el nitrégeno, proteina, RNA, DNA y ATP celulares. Pueden surgir dificultades ya que varia la cantidad de estos componentes en la célula, a menudo considerablemente, du. ante el crecimiento de las células, especialmente cuando las condiciones de éste son diferentes. 10.2.7 Mediciones fisicas El crecimiento de las células microbianas va acompafiado siempre de generaci6n de calor, Recientemente se demostré que hay una relaci6n directa entre la cantidad de calor producido y ia concentraciGn de biomasa. Este método ¢s directo, no requiere de muestreg y es instanténeo, pero €s més adecuado para biorreactores a gran escala puesto que la cantidad de calor generado en escala pequefia puede ser demasiado pequefia para ser medida adecuadamente. Para cultivos aerObicos es posible medir la rapidez de captacién de oxfgeno, ya que se ha demostrado est4 directamente relacionada con la concentracién de biomasa. Es obvio que este método no es adecuado para cultivos anaerébicos. 10.3 CRECIMIENTO EN CULTIVO INTERMITENTE Fl cultivo por lotes o intermitente representa el crecimiento en un sistema cerrado puesto que no se afiade medio nuevo al cultivo. ‘Cuando un medio de crecimiento adecuado se inocula con células, tiene lugar una secuencia de eventos caracteristica Hamada ciclo de crecimiento, el cual se puede escribir por medio de una gréfica del peso seco celular, (X), (g 1) contra el perfodo de incubacién en horas (I) (figura 10.1). Figura 10.1 Ciclo de ereciméento intermitente. Fases del crecimiento: 1, lagi 2, aceleracién; 3, exponencial; 4, desaceleraciGn; 5, estacionari _-declinacién. x, peso seco celular (g 1").sece. 10.3] Crecimiento en cultivo intermitente 195 El ciclo de crecimiento se puede dividir en varias fases distintas: 1) Fase lag. Inmediatamente después de la inoculacién no es posible que ocurra creci- miento aparente durante algdn tiempo. La longitud de la fase lag es variable y depende de los antecedentes previos de crecimiento de las células. Representa un periodo de adaptacién para el crecimiento en un medio nuevo y significa la sfntesis de las enzimas requeridas para la evolucién en este medio. 2) Fase exponencial o fase log. Frecuentemente se habla de ésta como Ia fase de “crecimiento equilibrado”, donde la sintesis de todos los constituyentes celulares aumenta a una rapidez constante, de modo que la poblacién de células se duplica y contintia duplicéndose a intervalos regulares. Esta no es una verdadera fase de crecimiento equilibrado 0 estado estacionario, ya que los nutrientes son consumi- dos continuamente (la concentracién de substrato varfa con el tiempo) y los productos finales del metabolisnio se acumulan. En consecuencia, ef medio cambia continuamente. 3) Fase estacionaria. Esta se caracteriza por ningin crecimiento neto. De hecho, el crecimiento puede estar ocurriendo, pero esté equilibrado por la rapidez de muerte 0 lisis celular. Las células pueden permanecer viables por perfodos largos en esta fase con existencia de metabolismo end6geno, oxidacién y almacenamiento de polimeros, protefnas, etc. Es comiin que la poblacién entre a Ia fase estacionaria como resultado de la disminucién de algdn nutriente esencial formacién de productos t6xicos o de un cambio en medio fisico. 4) Fase de declinacidn. Durante la fase estacionaria la rapidez de desaparicién (muerte) puede volverse mis alta que la rapidez de crecimiento, en cuyo caso disminuye la densidad de células. 5) Fases de aceleracidn y desaceleracién. Estas se mencionan ocasionalmente en las publicaciones, La fase de desaceleracién es importante porque cl crecimiento esta “equilibrado” y la rapidez, de crecimiento varia en funcidn de la concentracion de substrato residual en cultivos limitados por el substrato, 10.3.1 Cinética de crecimiento en un cultivo intermitente Bi crecimiento microbiano unicelular es autocatalitico, de modo que la velocidad de cre- cimiento es proporcional a la concentacién de células ya presente. Durante el crecimiento exponencial, el peso seco celular (0 némero) aumenta como sigue: Xp 2Xp— 4Xp — 8X Xp (10.1) donde X es el peso seco celular (g - I-!) y el intervalo es constante y se denomina tiempo de duplicacién (14). En consecuencia, el néimero de duplicaciones, n, después del tiempo ¢, est4 dado por n=ilty (10.2) Se deduce que Ia densidad celular (X,) después del tiempo, t, se relacionar4 con la densidad presente originalmente (Xq) de acuerdo a: X= Xq2!t = Xo2Ma (10.3)196 Cinética del crecimiento [Cap. 19 Rearregiando y tomando logaritmos, se produce: In (X/Xq) = In 2d (10.4) Por lo tanto, InX,-InXy__In2_ 0.693 095 t ta ty Esto se expresa més cominmente en términos de: (log X,— log X))_ 0.693 fa 2.303 0.6) Una gréfica de log X contra tiempo produce una linea recta con una pendiente de +0,693/t4 (figura 10.1). De la ecuacién (10.5) d(in X) m 0.693 (10.7) dt fe sin embargo, d(In X) (in X) ae at a y puesto que ddnXy) 1 ax xX se puede escribir: pos ee an (10.8) x de ty La ecitaci6n (10.8) se Hama ecuacién de crecimiento, donde yes la rapidez.especifica de crecimiento definida como la, rapidez de aumento de la concentracién celular por unidad de tiempo (h-}), La ecuaci6n (18.8) es la forma diferencial de la ecuacién de crecimiento y se puede usar para describir el crecimiento en cualquier etapa durante el ciclo de éste, en tanto que la ecuacién (10.6) es la forma integral, la cual solamente se aplica durante el crecimiento exponencial donde p es constante. El tiempo de duplicaci6n (4) por lo general es equivalente al tiempo medio de" generacién (tg), el perfodo promedio de un ciclo completo de divisién celular. Ocuren excepciones donde una fracci6n de la poblacién de células no es viable. En el caso especial donde X,/Xq = 2, es decir, donde la poblacién celular se duplica, Ja ecuacién (10.6) se simplifica a: 2.303 log 2 0.693 a "a fa (10.9)sece. 10.4] Factores que afectan la rapidez de crecimiento 197 10.4 FACTORES QUE AFECTAN LA RAPIDEZ DE CRECIMIENTO Los factores principales que afectan la rapidez de crecimiento son la concentracién de substrato, Ia temperatura, el pH y la inhibicién por producto. 40.4.1 Efecto de la concentracién de substrato sobre la velocidad de crecimiento Monod fue el primero en investigar el efecto de Ja concentracién de substrato sobre la rapidez de crecimiento, Encontré que el ciclo de crecimiento procedia cuando se inoculaba medio nuevo con glucosa como tinica fuente de carbono y energia y con todos los otros hutrientes en exceso. y es constante durante la fase exponencial, luego Uende a cero en la fase de desaceleracién, donde la concentracién del substrato se vuelve no saturante. La relacién entre la rapidez especifica de crecimiento, 1, y la concentracién de subs- trato, S, (figura 10.2) es una hipérbola, una curva de saturaci6n similar a la que describe la Rapidez especitica de crecimiento (jh!) ‘Ss. {s) Figura 10.2. Efecto de la concentracién del substrato sobre Ia tasa especifica de crecimiento. cinética enzimética tipo Michaelis-Menten. Monod propuso una expresi6n, la Ecuacin de Monod, para describir esta curva: s K,+8 (10.10) H= Hm donde p es la rapidez especffica de crecimiento (h~!), § es la concentracién de substrato (g - I+}. um es la rapidez especifica de crecimiento maxima y Kg es la constante de Monod (g - d-) que representa la concentracién de substrato que produce la mitad de fp, Durante la fase de crecimiento exponencial, S> Ks y, en consecuencia 1 = Hy, es decir errel cultivo intermitente la poblacién crece a la maxima rapidez posible. Kg representa la afinidad de los organismos por el substrato. En general, los valores de Ks son extremadamente bajos y, en consecuencia, son dificiles de determinar usando las técnicas de cultivo por lote. Para las fuente de carbono y energia, los valores de Kg son aproximadamente de 10-5, para el fosfato, K* y Mg?*, 10°5M, para el O, 10-6 a 10°M, y para vitaminas y elementos traza, 10-8 a 10-®M (tabla 10.1).198 Cinética del crecimiento {Cap. 19 La ecuaci6n de Monod se puede linearizar tomando los recfprocos para obtener la expresi6n: 1 = (10.11) Bn Una gréfica de I/y versus 1/S, produce una linea recta con pendiemte Ks/Hy abscisa al origen -I/Kg y ordenada al origen fly, (figura 10.3). 10.4.2 Efecto de la temperatura Como todas las reacciones quimicas, el crecimiento microbiano es afectado por la temperatura. El crecimiento se describe por: ae = pX-aX (10.12) dt donde 1 es la rapidez. especifica de crecimiento (hr!) y 0: ¢s la rapidez especifica de muerte (h~!). El crecimiento observado es un balance entre el crecimiento y la mortalidad, sin embargo, puesto que las condiciones por lo general son tales que 1 >, ala normalmente es insignificante. Puesto que tanto 1 como « son dependientes de la temperatura, esta suposiciGn no se cumple siempre. Los microorganismos estin divididos arbitrariamente en tres clases dependiendo de la temperatura ptima para su crecimiento (figura 10.4), Estas clases son los psicréfilos (<20°C), mesofilos (20-37°C) y terméfilos (>38°C). TLas curvas de pi versus temperatura, tienen forma similar para las tubs clases, con p duplicandose por cada elevaci6n de aproximadamente 10°C de temperatura. La razén de esto se puede ver haciendo una grifica de Arhenius de Hm (b>!) versus temperatura (figura 10.5). A temperaturas més allas, la relaci6n declina debido a que aumenta el valor de, la rapidez de mortalidad. El crecimiento y la mortalidad se pueden describir por la relaci6n de Arrhenius: p= Ae ERT (10.13) a= Ae ERT (0.14) donde Ay A’ son constantes, B y E” son las energias de activaci6n, R es la constante de los gases (1.98 cal - mol K-!) y Tes la temperatura absoluta (K). Los valores tipicos para Ey £’ son 15-20 kcal - mot! y 60-70 keal - mol“, respectivamente. El aumento de la rapidez de mortalidad (y disminucién de j)) a temperaturas alias, s& debe principalmente a Ja desnaturalizacién termal de las proteénas, la cual provoca ua aumento en el requerimiento energético del mantenimiento celular para mecanismos de reparacién. A bajas temperaturas, los mecanismos regulatorios de la célula son afectados, ademas de las limitaciones difusionales como el transporte de substratos hacia y dentro de la célula. Como resultado, la produccién de biomasa decae a temperaturas extremas.occ. 10.4] Factores que afectan la rapidez de crecimiento 199 ‘abla 10.1 Constante de saturacién K,, valores para la tasa de organismos cultivados sobre diversos substratos. Organismo Substrato K(mg- 1!) E.coli Glucosa 6.8x 102 Manitol 2.0 Lactosa 20.0 Poy 1.6 E.coli (auxdtrofo) Triptéfano 11x 10-3 Aspergillus niger Glucosa 5.0 A. niger (auxdtrofo) Arginina 05 Candida utilis Glicerol 45 C.utilis O, 0.45 Saccharomyces cerevisiae Glucosa 25.0 Pseudomonas sp. Metanol 07 Pseudomonas sp. Metano 04 Klebsiella aerogenes CO, 04 K. aerogenes Mg2+ 0.56 K. aerogenes Ke 0.39 K. aerogenes so? 27 WK, 7 Ss Figura 10.3 Grafica doble recfproca de 1/1 versus [1/S] 10.4.3 Efecto del pH Los microorganismos tienden a crecer en un intervalo limitado de pH y, aun dentro de este intervalo frecuentemente cambian su metabolismo como resultado de un cambio de incluso 1-15 unidades de pH. En general, las bacterias crecen en un intervalo de pH de 4 a8, las levaduras de 3 a 6, los Esto solamente es una mohos de 3 a7 y las células eucaristicas superiores de 6.5 a 75. generalizacién puesto que ciertas bacterias y levaduras crecerén, ‘aunque con menor rapidez, a valores de pH tan bajos como 2 (lactobacilli). Estos diferentes intervalos de pH para el crecimiento, se pueden usar ventajosamente durante las fermen-200 Cinética del crecimiento (Cap. 10 "max () oO 20 40 60 80 Temperatura (°C) Figura 10.4. Intervalos de temperatura para el crecimiento de: 1, psicr6filos; 2, mes6filos; 3, terméfilos. 10 C. utilis: 06 og 08 max (ry A. aerogenes of 32 33 34 35 Temp(K)x10? at 59950 258 to) Temp(C) Figura 10.5 Gréfica de Arrhenius. taciones para reducir la posibilidad de contaminacién. Asf, las fermentaciones de levaduras con frecuencia operan a un pH tan bajo como econémicamente sea posible para evitar la contaminaci6n bacteriana, con una consecuente reducci6n cn los costos de esterilizacisn. Durante las fermentaciones por lo general es necesario controlar el pH, particular ‘mente cuando se forman productos dcidos como el Acido lactico, acético y eitrico 0 cuando os mismos substratos de crecimiento son Acidos o bases, de modo que al consuinirse el pH del medio cambiar4 de manera importante. Un ejemplo es el uso de NH,OH como fuente de nitrégeno. El crecimiento dar4 como resultado el consumo de NH (el nivel de reduccién de N en la célula) dejando un protén en el medio, el cual causa que el pit disminuya. A menudo se usan soluciones amortiguadoras para evitar grandes fluctuaciones de pH en el medio de cultivo, aunque éstas son caras, particularmente 2 escala industrial, y aumenta el contenido de sal en ¢l medio, 10 cual es indeseable si el producto, por ejemplo, la proteina unicelutar (biomasa) serd usada como materia prima para algdn proceso.sece. 10.5] Consumo de nutrientes y formacién de producto 201 10.4.4 Efecto de la concentracién alta de substrato o de producto pn la seccién 10.4.1 se analizé el efecto de ta concentraci6n de substrato sobre la rapidez ge crecimiento, Si la concentraci6n inicial de substrato es aumentada a un valor considera- plemente més alto que la concentraci6n minima de saturaci6n, por ejemplo, >10-20 K,, la rapidez de crecimiento puede comenzar a disminuir debido a la inhibicién por substrato. para substratos como la glucosa u otros carbohidratos, 1a mayorfa de los microbios son capaces de crecer a concentraciones de 100-150 gt, aunque muy pocos crecerén cuando sia aumente a 300-500 g - I!, Después de todo, esta caracteristica es la raz6n por la cual durante muchos siglos, los alimentos como las frutas, han sido conservadas en soluciones con alta concentracién de aziicar. A altas concentraciones de azticar 0 sal la inhibicién probablemente se debe al alto esfuerzo osinético impuesto a las células, el cual causa su deshidratacién y problemas difusionales. Solamente organismos especializados osmotolerantes, como los haldfilos, son capaces de crecer en estos medios. La inhibicién del crecimiento a concentraciones bajas de substrato puede ser el resultado de la inhibicién de enzimas metabélicas clave. Asf, muchas Ievaduras de uso comtin, por ejemplo, Saccharomyces cerevisiae y bacterias como Escherichia coli, son microorganismos facultativos capaces de crecer en presencia o ausencia de oxigeno. En presencia de oxigeno y bajas concentraciones de glucosa, ésta se oxida a CO2 y HzO para generar la energfa requerida para el crecimiento, $i la concentracién de glucosa aumenta (por ejemplo, >2 g para E coli), las enzimas responsables del metabolismo res- piratorio son inhibidas aun cuando el suministro de oxfgeno sea saturante, El resultado es tn crecimiento combinado respiratorio-fermentativo; esta relaci6n disminuye a medida que la concentraci6n de substrato aumenta. A menudo este efecto se denomina efecto de glucosa o efecto Crabtree y se debe a la represién por catabolito de la sintesis de enzimas respiratorias, Este es un efecto importante en los procesos aerébicos de fermentacién industriales, como la producci6n de levaduras para horneado donde a menudo sc usa el cultivo alimentado por lotes 0 el cultivo con aporte de substrato para prevenir la mencio- nada inhibicién por substrato y mantener alta la produccién de biomasa. Con frecuencia, el substrato de crecimiento para algunos organismos ¢s un compuesto t6xico como el fenol, formaldehido, metanol, etc., que apoya el crecimiento a concentra~ ciones bajas, favorece el crecimiento pero se vuelve inhibitorio a concentraciones altas. Un ejemplo es el proceso ICI Pruteen donde Methylophilus methyltrophus se cultiva sobre metanol para obtener biomasa usada como complemento de materia prima. Aqui, otra vez, inistro de substrato para mantener la concentracién a menos de 100 mM para evitar la inhibicién del crecimiento. El crecimiento de poblaciones microbianas también puede ir acompaftado por la formacién de productos finales t6xicos que causan a inhibicién del crecimiento, Un ejemplo obvio es la produccién de etanol por levaduras y bacterias. Arriba de una concentracién de 1-2% el etanol comienza a inhibir el crecimiento. Aproximadamente 4 12% usualmente se logra la inhibici6n total lo cual és la faz6n por la que la mayorfa de los vinos contienen menos de 12% de alcohol. Ciertos organismos, como Zymomonas mobilis, toleran el alcohol y son posibles rendimientos de hasta 15-16%. 10.5 CONSUMO DE NUTRIENTES Y FORMACION DE PRODUCTO Es posible relacionar el consumo de substrato y la formaci6n de producto con el creci- miento al hacer balances del material para cada uno.202 ‘Cinética del crecimiento [Cap.19 Para el crecimiento: acumulaci6n total = crecimiento ~ desaparicién aX = EX - aX (10.15) at Para el consumo de substrato: acumulacién de substrato = alimentacién de substrato — crecimiento ~ formacién de producto — requerimientos para el mantenimiento ns 7 wx DX nx (10.16) dt v Yate Ypis Para Ja formacién de producto: acumulacién de producto = formacién — destrucci6n dP a 4pX — kP (10.17) La ecuacién (10.16) incluye un término que corresponde al suministro de substrato en un cultivo intermitente, En un cultivo intermitente est4ndar: xX gs Ee ag aoe (10.18) at Yue Wi El rearreglo de la ecuacidn (10.18) muestra la relaciGn entre la rapidez especifica de consumo de substrato, qe, y el crecimiento, mantenimiento y formacién de producto: L ds a 4, ~q=+—— = xX dt fa Yovs (10.19) Los productos se pueden formar durante la fase de crecimiento, en cuyo caso la rapidez de s{ntesis del producto se relaciona directamente con la rapidez de crecimiento, © bien, pueden formarse independientemente de la rapidez de crecimiento. Ocasional- mente, la sintesis puede comenzar después de un perfodo de crecimiento previo debido a la acumulacién de algunos metabolitos primarios y, subsecuentemente, relacionarse con el crecimiento (figura 10.6). La sintesis de producto relacionada con el crecimiento, por lo general, est4 asociada con el crecimiento anaerdbico, donde el producto se forma durante las vias catabélicas que participan en la produccién de energfa, como la formacién de Acido léctico durante Ja fermentacién homolictica de ciertos lactobacilli y Leuconostoc sp. y la formacién de ctanol por levaduras y bacterias. Este grupo incluye también a las vitaminas, aminoficidos y ciertos polfmeros de almacenamiento que son intermediarios normales del metabolismo pero que pueden acumularse bajo ciertas condiciones de crecimiento.secc. 10.6} Rendimientos de biomasa y de producto 203 Tiempo Tiempo Figura 10.6 Relaci6n de la sintesis de un producto con el crecimiento: a) asociado al crecimiento; b) parcialmente asociado al crecimiento; c) no asociado al crecimiento. La sintesis de productos no relacionada con el crecimiento a menudo se denomina sintesis de metabolites secundarios. Los antibidticos son los metabolitos secundarios mas famosos. Es dificil relacionar su formacién con el cfecimiento, ya que no existe relacién ene ambas cosas. En consecuencia, se utiliza la rapidez espeeffica de productién, gp, que relaciona la rapidez de sintesis del producto con la concentracién de biomasa (g - ¢~!): eee (10.20) dP xX ft. 10.6 RENDIMIENTOS DE BIOMASA Y DE PRODUCTO Los rendimientos de biomasa y de producto, Yyjy ¥ Yo Fespectivamente, son pardmetros muy importantes, ya que representan la eficacia de conversiGn del substrato en biomasa y productos. Se definen como la masa de biomasa o producto formado por unidad de masa de substrato consumido. Ast a (10.21) a y 2 = 10.22)204 Cinética del crecimiento {Cap. 10 EI método usual para medir los rendimientos es medir la cantidad de biomasa o producto formado y substrato consumido en un perfodo y calcular a partir de fas ecuaciones (10.21) y (10.22): (10.23) ah (10.24) Estos son los coeficientes de rendimiento observados y pueden representar el ren- dimiento global, que es la biomasa 0 producto total formado comparado con el substrato total consumido en el ciclo completo de crecimiento, o bien, pueden medirse en ‘cualquier tiempo durante el ciclo de crecimiento. Es importante entender que los coeficientes de rendimiento no son constantes en toda la fase crecimiento, ya que cambian con la rapidez. de crecimiento debido al requerimiento de energfa para el mantenimiento (m), Pirt dedujo una ecuaci6n que relaciona el efecto del mantenimiento con el rendimiento de biomasa medido: 1 al —— = ——+ — (Laparte de la ecuacién) (10.25) Yn H ¥q donde Y,, es el rendimiento medido y Yo ¢s el rendimiento real. La energfa de mantenimiento es una constante especifica de rapidez que, por lo general, es muy pequefia (tabla 10.2). Tabla 10.2 Requerimientos de energia para el mantenimiento de algunos ‘organismos. Organism 1m (g de substrato consumido - g de células“! - br!) Penicillium chrysogenum 0.022 Aspergillus nidulans 0.029 Aerobacter aerogenes (aersbico) 0.094 A, aerogenes (anaer6bico) 0.473 Los rendimientos tedricos se pueden calcular mediante diversos métodos por compa- racién con rendimientos medidos para determinar la eficacia de un proceso de fermentacién particular. El rendimiento celular teérico se puede determinar por medio del concepto de electrones disponibles o Y,qp. El primero se basa en la determinaci6n del némero de elec- trones disponibles en el substrato Carbonado. Se ha encontrado que se forman 3.14 + 0.11 g de peso seco de células sin cenizas por electrén disponible.sece. 10.7) Cultivo continuo 205 El mimero de electrones disponibles se encuentra al determinar los moles de oxfgeno requerido para oxidar por completo el substrato carbonado a CO, y HO y multiplicando fsto por 4. Asi, I mol de glucosa tiene 24 electrones libres. Este concepto se cumple sin jmportar la naturaleza del substrato de crecimiento u organismos Yrp es el peso seco celular formado por mol de ATP generado durante el catabolismo y tiene valor promedio de 10.5 g de células (mol de ATP). Este valor varia tanto con el organismo como con el substrato y puede tener valores de entre 6 y 29 g - mol-!. También es necesario conocer el ntimero de moles de ATP formados en la via catabélica Para la determinacin de rendimientos tedricos de producto, es necesario conocer la estequiometria que describe la formacién del producto: Asi glucosa ~* 2 etanol + 2CO2 (10.26) En consecuencia cl rendimiento teérico méximo de etanol durante la fermentacién etandlica es de 0.51 g de etanol (g de glucosa). 10.7 CULTIVO CONTINUO En la seccién 10.3 se describié el cultivo intermitente, 0 por lotes, como el crecimiento en un sistema cerrado y se sefial6 que el ciclo de crecimiento no era una propiedad inheren- te de las células microbianas, sino el resultado del crecimiento en un medio limitante de nutrientes. El cese del crecimiento es el resultado del agotamiento de un nutriente escencial o Ja acumulacién de productos téxicos. Aun durante la fase de crecimiento exponencial, la composicién del medio y de las células cambia continuamente, En consecuencia no es po- sible el crecimiento en un estado estacionario que es el crecimiento en un medio sin cambio. El cultivo continuo, por otra parte, es una forma de cultivar células en un sistema abierto, donde la poblacién microbiana se mantiene en un estado continuo de crecimiento balanceado, al eliminar de manera continua algo del cultivo y reemplazo con medio nuevo ala misina rapidez. Hay dos tipos de sistemas de cultivo continuo: 1) el quimiostato, que es operado mediante el suministro de un nutriente esencial limitamte del crecimiento a una rapidez. constante, con el resultado de que la densidad y rapidez de crecimiento del cultivo se ajustan por si mismas al crecimiento; y 2) el turbidostato, que es operado mediante el mantenimiento Ue una densidad constante de células al suministrar medio nuevo a medida que se requiera. El esquema de los dos sistemas se muestra en la figura 10.7. ‘Aunque el método para controlar la rapidez de crecimiento es diferente, los dos sistemas son complementarios y pueden describirse por expresiones cinéticas similares. Un requerimiento basico de ambos sistemas es un método para controlar un volumen de biorreactor constante. Se pueden usar muchos métodos para mantener este volumen constante. El més simple utiliza un tubo de sobreflujo 0 vertedor colocado a una altu- raconstante dentro del recipiente del reactor, de modo que cuando se bombea medio nuevo al reactor, un yolumen igual de cultivo entra al tubo de sobreflujo y pasa al recipiente colector gravimétricamente, También es posible tener conectada una bomba al conducto de salida del cultivo y mantener cuidadosamente la velocidad de bombeo igual a la rapidez de flujo de entrada del medio.206, Cinética del crecimiento (Cap. 10 Depésito acido’ base Lp Sonda de pH Al Rotémetro : Depésito de Contenedor medio de cultivo Entrada de Salida de_ 2° aire 4 Deposito do eftuente Muestras 2) Quimiostato pb - 20 Acido/base Salida de pH aire Entrada de aire —s e T t Tubo do recirculacién Depesito do Fotorutipicador ee htuestras (uz _efluente ) Turbidostato Regulador de la bomba Figura 10.7 Representacidn esquemitica de un quimiostato y de un turbidostato. A, filtros de aire; P, bombas. . Los sistemas més complejos requieren colocar éf reactor completo sobre una balanza © celda de carga y mantener un peso de biorreactor constante al controlar la rapidez de bombeo a la salida Un turbidostato posee ademés un sistema de fotoceldas que monitorea continuamente Ja densidad celular y la mantiene constante al controlar la rapidez del flujo de entrada det medio.gece. 10.7] Cultivo continuo 207 ‘Ademds de controlar el flujo del medio que sale y entra al reactor, también se controlan otros parimetros importantes del medio como son la temperatura, el pH y la tensién de oxégeno disuelto. Puesto que el quimiostato es el sistema mas comin la siguiente teorfa describir et crecimiento en un quimiostato especificamente, aunque esta misma (eoria basica puede describir también el crecimiento en un turbidostato. 40.7.1. Teoria del quimiostato En un quimiostato, la rapidez de crecimiento se determina por la rapidez de suministro de un nutriente escencial que puede ser carbono, niteégeno, fésforo 0 un elemento traza 0 vitamina, Los demds nutrientes escenciales estén presentes en exceso. La capacidad para modificar la rapidez de crecimiento al cambiar la rapidez, de suministro de nutriente nuevo ¢s la ventaja principal del cultivo continuo sobre el cultivo intermitente y explica la propiedad autorregulatoria del quimiostato. Al mantener constante la rapidez de suministo, Elcultivo se puede mantener en un estado estacionario de crecimiento indefinidamente. 10.72 Relacién entre rapidez de dilucién y la concentracién celular La capacidad autorregulatoria de un quimiostato y el crecimiento en estado estacionario se puede expresar mediante una serie de ecuaciones que relacionan las concentraciones del nutriente lumitante y de eélulas con la variable primaria independiente de operacién —la rapidez. de suministro del medio. Esto se hace al elaborar balances de materia, para las células y el substrato limitante, en el bioreactor. ‘Asi, para las células: acumulacién de|células = en célutas — salen células — estado — muerte OX FX FX uy — ax (10.27) dt ¥ v donde 2 rapidez de flujo de suministro del medio (1 - h~); volumen de abajo constante del reactor (1); concentracidn de células en el medio de suministrar (g » I"); concentraci6n de células en el reactor (g- 1"!); rapidez especifica de crecimiento (h-!); rapidez especifica de mortalidad (h-), Con un quimiostato, simple (figura, 10.8), el suministro de medio, por lo general, es estéril (suponiendo que no hay reciclaje de células) yf > o&, En consecuencia, la ecuacién (10.27) se puede simplificar a: . (10.28) El término F/V se denomina rapide: de dilucidn, D, que es el ntimero de yolmenes de medio que pasan a través del reactor por hora; por consiguiente, la ecuacién (10.8) se puede escribir como:208 Cinética del crecimiento {Cap. 10 cp Suministro de_*: Sav Xo medio cto | Volumen del cultivo = V xs fs Efluente Figura 10.8 Quimiostato de una sola etapa que muestra los flujos de nutriente y de biomasa. dx a = -DX+pX=X(u-D) (10.29) It Durante el crecimiento en régimen permanente 0 estado estacionario, AX/dt = 0. Por lo tanto u = D. La ecuaci6n (10.29) muestra que simplemente al variar la rapidez de suministro del medio se puede modificar la rapidez de crecimiento, Esto es valido hasta que D> pp (tasa especifica de crecimiento maxima), En estas condiciones el nutriente ya no limita mas y la expresiOn (11 ~ D) se vuelve negativa. El resultado es una disminucién en la concentracién de células y el agotamiento del cultivo. La rapidez de dilucién critica, Dy, se define como la rapidez de dilucién menor a la cual ocurre el agotamiento. En la practica, D, es aproximadamente igual a i,,. A tasas de dilucién préximas a Dg, el quimiostato se vuclve menos estable, ya que ligeras fluctuaciones en la rapidez de flujo debidas a errores de bombeo, ete., provocan grandes cambios en X. Bajo estas condiciones existen regimenes permanentes inestables que pueden conducir rapidamente al agotamiento. Por lo tanto, la desventaja principal del quimiostato es que tabaja mejor a tasas bajas de dilucién donde los cambios en Xy FS son pequefos y cualquier fluctuacién en Ia rapidez de flujo tiene poco efecto sobre el régimen permanente (figura 10.9). El turbidostato, por otra parte, mahtiene una densidad celular constante al controlar la rapidez de flujo del medio nuevo, En consecuencia, es muy sensible a cambios pequefios en Xy S funciona mejor a tasas de dilucién altas. Por Io tanto, el quimiostato y el turbidostato son complementarios. 10.7.3 Relacién entre la rapidez de dilucién y la concentracién del substrato Esta relaci6n se puede analizar mediante un balance de materia alrededor del quimiostato en relaci6n con el nutriente limitante: acumulaci6n de nutriente = entrada de nutriente — salida — consumo — mantenimiento ~ formacién de producto.sece. 10.7] Cultivo continuo 209 Din") 0. Figura 10.9 Relaci6n entre la biomasa, el substrato, la productividad y la tasa de dilucién @ régimen permanente. PS. 4, See (10.30) at v v Be Yps donde Sp. = concentracién del substrato limitante en el depdsito de medio (g --1); Yuq = cocficiente de biomasa producida (g de peso seco de células formadas por § de substrato consumido); Yoye = Coeficiente de rendimiento de producto (g de producto formado por & de substrato consumido); J = concentracién de substrato limitante en el quimiostato (g ry; m= requerimientos para el mantenimiento (g de substrato consumido por g de peso celular seco por hora); tasa especifica de crecimiento (h~); rapidez especifica de formacién de producto (g de producto formado por 1 por hora). Gp En general, mx < UX/Yqye y puede ignorarse. Asi, tomando el caso donde no se Forman productos, la ccuacién (10.30) se vuelve: (03) (10.32) En el régimen permanente p = D, por lo que rearreglando da: X= Vyg(Sg-5) (10.33) Note que, por convencién, en el régimen permanente X y Sse escriben como X y S.210 Cinética del crecimiento iCap. 10 En Ia ecuacin (10.33) se supone que los coeficientes de rendimiento son inde. pendientes de la rapidez de crecimiento, la cual, como se mencion6 en la seccién 10,6, no siempre es el caso. También se supone que el valor absoluto de X es independiente de todos los nutrientes excepto del nutriente limitante del crecimiento, 10.7.4 Ecuaciones fundamentales del cultivo continuo Las ecuaciones (10.29) y (10.33) representan las ecuaciones basicas del estado estacionario que describen al cultivo continuo, Es necesario contar también con un modelo que relacione Xy S con la rapidez de dilucién D. Esto se hace substituyendo valores de 1 ett la ecuacién de Monod: H= Hm (10.34) a5 1) Eeuaciones del estado no estacionario Para la biomasa: ax SX EX(W-D) (por Ia ecuaci6n 10.29) a substituyendo p por la ecuacién (10.34) xu, eo (D) (1035) at Ras Por la timitante del sustrato BL ngy—y- HX (portmccuacion 10.31) a Yorn substituyendo jt por la ecuaci6n (10.34): as x s i Hae (10.36) dt Yus K,+8 Las ecuaciones de conducta cuantitativa (10.35) y (10.36), se usan raramente en estudios sobre el quimiostato ademés del examen de los estados transitorios que se obtienen durante el cambio de un estado estacionario a otro. 2) Ecuaciones del estado estacionario En el estado estacionario ds/dt = 0, de modo que X y $ se vuelven constantes y son repre- sentados por X y Sy = D. En consecuencia la ecuacién de Monod (10.34) se vuelve:Secc. 10.7] Cultivo continuo 2ul D=—m ——— (10.37) K,+8 Resolviendo la ecuacién para S: KD —— (10.38) Hm —D Ahora X= Yous (Se -S) (10.39) por lo tanto, substituyendo para S en la ecuacién (10.38), se obtiene: - K,D X=Yyx | 5g-—*— (10.40) Hm -D Estas ecuaciones fundamentales, (10.34) y (10.40), que describen el crecimiento en régimen permanente muestran que la concentracién de substrato, 5, en este régimen varfa solamente como funcién de D, mientras que la concentracién de biomasa varia como funcién de D y de Sp (figura 10.9). 10.7.5 Rapidez critica de dilucién Como se describi6 en Ta seccidn 10.7.1, la rapidez critica de dilucién D,, es valor més bajo de D al cual ocurre el agotamiento. En general D, es aproximadamente igual al u,. Sin embargo, D, = ut cuando S'= Sx. Esto es claro puesto que en el agotamiento no hay células permanentes en el quimiostato y, por lo tanto, no se consume substrato. En consecuencia se puede escribir: Ho — (10.41) ese D, En la ccuacin (10.41) se observa que D, varia en funcién de Sp. Por lo tanto, si el valor de Sp es alto en relaci6n con Sp De= thy X= bn 10.42) ‘se Sin embargo, cuando Sz es pequefio, el término K, ya no es insignificante y D, seré MENOF QUE fp : 10.7.6 Productividad En el cultivo continuo, la productividad de biomasa PX (g - I! b-l), se define como: PX =DX (10.43)212 Cinética del crecimiento [Cap. 19 substituyendo (10.43) en (10.40) KD PX =D Yypg | Sp--——— (10.44) Hm ~D En la figura 10.9 se muestra la productividad como funcién de la rapidez de dilucién, La rapidez de diluci6n que da lugar a la productividad maxima, D,,, se puede calcular al hacer cero Ia primera derivada de la ecuaci6n (10.44): Kt =D, fe a} 10.45) K,+8 Por lo general, la rapidez de dilucién que da la productividad maxima no es la misma que aquella que da el rendimiento o conversién maxima de substrato a células, En con- secuencia, a menudo se debe establecer un acuerdo entre la productividad y el substrato residual en el efluente. : La productividad de los productos relacionados con el crecimiento (Pp), se puede describir de forma similar: Dd, Pp=Dp (10.46) donde p representa la concentracién de producto en régimen permanente (g - 1) Puede ser dificil producir productos no relacionados con el crecimiento en el quimiostato. Usando un sistema de una sola etapa, las condiciones limitantes diferentes al carbono, como limitacién de N 0 P, pueden dar como resultado la formacién continua de producto. De manera alternativa, se puede usar una fuente de carbono de meta- bolismo lento de dilucién a bajas tasas, por ejemplo, lactosa para la produccién de peni- cilina. Por desgracia la productividad puede ser baja a estas tasas de dilucién debido a efectos de mantenimiento. Un método excelente, aunque caro, es el uso de un guimiostato de dos etapas. El crecimiento para obtener una densidad alta de células se puede lograr a través de una primera etapa con limite de carbono, cuya salida se ali- menta directamente en la segunda etapa que contiene un medio adecuado en el que, et » crecimiento se mantiene en un minimo mientras se estimula la formacién de producto. En la segunda etapa se puede evitar el agotamiento al aumentar el yolumen del reactor, 10 cual produce una disminuci6n en la rapidez de diluciGn, puesto que el flujo hacia cada etapa debe ser idéntico. 10.7.7 Determinacién de las constantes cinéticas y de rendimiento Puesto que es dificil mantener regimenes permanentes estables cercanos a fi,,, et método més simple para determinar ,, €s usar la ecuacién de Monod y resolver para K, D=Lq —— (10.47)Sece. 10.7) Cultivo continuo 213 y nm ~P) K=5 —— (10.48) D ‘Al operar el quimiostato en condiciones idénticas a un minimo de dos rapideces de diluci6n y determinando $ para cada una, se puede encontrar pi,, al resolver la siguiente ecuacisn: ~~ Um-Pd dD (10.49) Habiendo encontrado fly, Ky S¢ puede determinar substituyendo el valor de },, en la ecuacién (10.47). El rendimiento de biomasa, Y,, se puede determinar a cada régimen permanente a partir de las mediciones de 5 y X con ta ecuacién (10.33): x (Sp- Yys= (10.33) En el quimiostato bajo condiciones de limitaci6n de carbono, una gréfica de Ly versus 1/D, da una linea recta con pendiente m, el requerimiento de energia para el mantenimiento (figura 10.10). La pendiente no pasa por el origen debido al requerimiento de consumo de substrato para el mantenimiento de la integridad y viabilidad celular. La pendiente muestra también que el coeficiente de rendimiento realmente cambia con la rapidez de crecimiento, especialmente si la energfa de mantenimiento es alta. Ma Pendiente = m Figura 10.10 Determinacién del rendimiento de crecimiento real, Yg y del requerimiento de energia de mantenimiento, m. De la ecuacién de Pirt (10.25) UY ye = nil + 1/¥g, es claro que la ordenada al origen da el valor de 1g, el rendimiento de crecimiento real214 Cinética del crecimiento {Cap. 10 En el andlisis anterior, resulta claro que mientras en el cultivo intermitente es diffcil determinar j1,,, Ky ¥ m, estas constantes s¢ obtienen fAcilmente a partir de los datos de un nlimero pequeiio de regimenes permanentes bajo condiciones del cultivo continuo. 10.7.8 Desviaciones de la conducta ideal del quimiostato El estudio previo se ha centrado en el comportamiento ideal de Ios quimiostatos. En ta préctica, con frecuencia se encuentran desviaciones de este comportamiento ideal, las cuales se deben a que la ecuacién de Monod solamente es una aproximacién, ademas de las variaciones en la concentracién de las células y del substrato que no se consideran en la teoria simple. En la figura 10.11 se muestra algunas de las desviaciones mas comimes. Figura 10.11 Desviaciones del comportamiento ideal del quimiostato. I, comportamiento ideal; A-F, véase el texto para la explicacién. El ejemplo A muestra que el coeficiente de rendimiento de biomasa, Y,j, no es constante. En la limitaci6n de carbono, esto se debe al mayor consumo relative de substrato para el mantenimiento a tasas de diluci6n bajas. El ejemplo B se debe a la conversiGn de substrato en polimeros de almacenamiento intracelulares, como el glicégeno y el poli-B-hidroxibutirato bajo condiciones limitantes de nitrégeno o azufre. El ejemplo C muestra que el rendimiento de biomasa varfa en funciGn de la rapidez de dilucién. Esto indica un cambio en el metabolismo, Asf, se ha demostrado que a tasas de di- lucién mayores, algunas levaduras y mobos cambian, de un metabolismo puramente respiratorio, a un metabolismo fermentativo energéticamente menos eficaz. El ejemplo D es un caso donde D, es mayor que fl, Es comin que ocurra como resultado de un mezclado imperfecto, crecimiento en las paredes o agregacién celular. El ejemplo E por lo general, se encuentra cuando el substrato limitante es t6xico aun a concentraciones relativamente bajas. Durante el crecimiento de levaduras sobre fenol, el requerimiento para el mantenimiento es alto a tasas de dilucién bajas, mientras que a tasas de dilucién altas el crecimiento es inhibido por la toxicicidad del substrato.sece. 10.7] Cultivo continuo 215 El ejemplo F es un caso donde D, es mucho menor que jin. Esto puede ocurrir cuando esth presente en el indculo, y no en el suministro al quimiostato, algtin elemento traza 0 yitamina que se requiere para el crecimiento a concentraciones extremadamente bajas. Como resultado, el compuesto se diluye lentamente del cultivo. Otra posibilidad es la limitaci6n del crecimiento por algtin compuesto distinto al substrato que se espera realice esta fanci6n. 40.7.9 Modificaciones a la teoria basica del quimiostato Hasta ahora se ha estudiado Ia teorfa y operacién de un quimiostato de una sola etapa sin modificaciones. Es posible mejorar la eficacia de operacién de un quimiostato al reciclar una proporci6n de las células de la corriente de salida de regreso hacia el fermentador 0 por medio de varios quimiostatos en serie. El reciclaje de células es un método importante de inoculacién continua del quimiostato para estabilizar el sistema, minimizando las perturbaciones del proceso y permitiendo que el quimniostato sea operado a tasas de dilucién mayores que Hy Otra ventaja del reciclaje de células, es la capacidad para operar el quimiostato a valores cercanos a Dp, la rapidez de dilucién que da la maxima productividad celular sin dejar substrato excesivo en el efluente no usado, Normalmente, aD, el substrato permanece en el efluente, Mediante el reciclaje de células se puede mantener una mayor concentracién de biomasa en régimen permanente, que da como resultado mayor consumo de substrato. Esta es una caracteristica valiosa en el tratamiento continuo de aguas residuales para la industria y la agricultura, puesto que permite que la DQO (demanda quimica de oxigeno), se reduzca en mayor grado y a mayor rapidez que en ausencia del reciclaje celular. En la figura 10.12 se muestra el esquema de un quimiostato con reciclaje celular. La tworia de la operacién de este tipo de quimiostato es similar a la teoria basica, excepto que oe, oo medio 1 Recipionte eo det reactor v F (40F. X Fx, Separador de @ pare fuente Células concentradas, Cx Figura 10.12 Representaci6n esquematica de un quimiostato con reciclaje de células, incluye dos términos extra, 7, ka relaci6n de reciclaje y C, el factor por el que se concentra la corriente de salida del quimiostato antes de retomar al mismo, Un balance de materia para lamasa celular y el substrato que incluya el fermentador y al concentrador de células, da:216 ica del crecimiento (Cap. 10 Para la biomasa: acumulacién celular = entrada de células + células en la corriente de reciclaje de reciclaje + crecimiento — salida de células ax | EX, FCX (1+ FX ack oe i eee (10.50) dt " v Vv El mantenimiento y la muerte celular se consideran insignificantes. En condiciones de régimen permanente dX/dt = 0 y D = F/V y la ecuaci6n (10.50) se puede simplificar a: n=D(.+y-10 0.51) La ecuacién (10.51) muestra que la rapidez de dilucién ya no excede a la rapidez de crecimiento porque la expresidn (1 + ¥—y C) siempre es menor que uno debido a que C es mayor que 1. Para el substrato: acumulacién de substrato = substrato en el medio + + substrato en la corriente de reciclaje —‘consumo ~ salida PS, Fi 1+ F, | Se I oe (10.52) at v v Yus v En condiciones de régimen permanente dS/dt = 0 y D = FIV y la ecuacién (10.52) se puede simplificar a: D = 7 (Sp -5) (10.53), La substitucién de ya partir de la ecuacién (10.51), da: Yqis Sp-5) eoaekial (10.54) G+y-10) La ecuacién (10.54) muestra que, con reciclaje, X siempre ser4 mayor por un factor de I+ y-yO. Se puede obtener una expresién para la rapidez de crecimiento en funcidn de la concentracién de substrato substituyendo la ecuacién de Monod en la ecuacién (10.54):secc. 10.7] Cultivo continuo 217 uw DA+y-7C) J=K, =K, ————____ (10.55) Him ~ He BDO +7 = 10) (10.56) Yuis DiL+y~¥C) SS | (d+7-¥) Bm - DU +y-O) Estas ecuaciones estén graficadas en la figura 10.14 y se comparan con un quimiostato sin reciclaje de células. El cultivo continuo de etapas multiples, requiere que la corriente de salida de la primera etapa actiie como corriente de entrada en la segunda etapa (figura 10.13). Este sistema x! wo < xt oI 7 {> E--a x8 Figura 10.13 Quimiostato de dos etapas. permite un alto grado de flexibilidad puesto que la salida de la primera etapa inocula continuamente a la segunda. La segunda etapa se puede operar también con aporte de substrato, de modo que D pueda ser mayor que Uy. Otra posibilidad es la de tener medios diferentes en cada etapa. Un ejemplo seria maximizar la producci6n de biomasa en Ia primera etapa y Ia formaci6n de producto en la segunda etapa o en las subsecuentes. Si se desea, se puede afiadir una corrienie de reciclaje de células a cualquier etapa. Los balances de material del substrato y 1a biomasa se pueden hacer para cada una de las dos etapas de un sistema sin reciclaje celular ni a aporte de medio la segunda218 Cinética del crecimiento (Cap. 19 10 5 P arnt) 1-0 20 Dik) Figura 10.14 Curvas de biomasa y productividad (P) en régimen permanente para un quimiostato de una etapa con (A, B, C)y sin (D, E) reciclaje celular. tim = 1 bl; Y= 0.5; Ky = 0.2 gl-ts Sy = 10 gi}; C=2; g = 05. Las curvas B y E son las productividades volumétricas y A y B son las concentraciones de biomasa. La curva C es la concentracién celular del efluente etapa. Ya se han estudiado los balances para la primera etapa. Para la biomasa (es la segunda etapa): acumulacién celular = entrada — salida + crecimiento FK OFX, +1 Xy (10.57) = ete Bajo condiciones de régimen permanente dX>/dt = 0 y Dy = F/V2: hobs [ _ 4 (10.58) — % r Para el substrato: acumulaci6n de substrato = entrada — salida - consumo ass Fs, x 1. tt (10.59) a Yous En condiciones de régimen permanente: D; Yuys 5 - Sp) ‘ (10.60) be A partir de estas ecuaciones, es claro que si no se aporta nutriente a la segunda etapa la rapidez de crecimiento seré menor que la rapidez. de dilucién, y el crecimiento neto en la segunda etapa seré pequefio. Este sistema permite el estudio de eventos no relacionados con el crecimiento.sece, 10.7] Cultivo continuo 219 La adici6n de nutriente a la segunda etapa, causa una densidad mayor de biomasa en régimen permanente y una rapidez de crecimiento mayor que H, (ecuaciones (10.61) y (10.62)): eax Do (10.61) Vz Xp se ae foe = %« 2 fr oy (10.62) Lye ie Vo donde F’ y S’ son Ia rapidez de flujo (1 b-!) y la concentracién del substrato limitante (g I") en el medio agregado a la segunda etapa. 10.7.10 Ventajas del cultivo continuo sobre el cultivo por lotes Las ventajas principales son: 1) La rapidez de crecimiento se puede controlar y mantenér indefinidamente. 2) Se puede examinar el efecto de cambios en los parémetros fisicos 0 quimicos, sobre el crecimiento y la formacién del producto a una tasa de crecimiento constante. 3) La concentracién de biomasa se puede mantener constante variando la tasa de dilucion. 4) Se puede mantener el crecimiento limitado por un substrato y estudiar los cambios en la composicién y actividad metabélica celular modificando el nutriente limitante del crecimiento, 5) Con la técnica de pulso y cambio se puede optimizar la composicién del medio para la formacién de biomasa y producto. Esta técnica se tiene que inyectar (pulsar) nutrientes directamente en el quimiostato y observar Jos cambios en X y ‘S. $i X aumenta, el nutriente se afiade al depésito de suministro y se establece un nuevo régimen permanente. Luego, se repite el procedimiento, 6) A menudo, se puede mantener la produccién de metabolitos secundarios en forma simulténea con el crecimiento. 7) Permite la determinacién exacta de las constantes cinéticas, energfa de manteni- miento y rendimientos del crecimiento reales. 8) Los resultados obtenidos en el cultivo continuo con frecuencia son mds con- fiables y reproducibles. 9) Mayores productividades por unidad de volumen y menor pérdida de tiempo en tiempo improductivo que incluye limpieza, preparacién, esterilizacion del medio, etc. A menudo el cultivo continuo es mas econémico debido a estos factores y porque es menos laborioso y requiere menor capital inicial. 10) El cultivo en quimiostato se puede usar para mantener cultivos mezclados en condiciones de crecimiento en régimen permanente. En el cultivo por lotes, un organismo crecerd més que otro,220 Cinética del crecimiento (Cap. 19 11) Los quimiostatos se pueden usar para mantener una presiGn de seleccién para los mOfilos, cepas osmotolerantes 0 mutantes con altas tasas de crecimiento y rendimiento. 10.7.11 Desventajas del cultive continuo comparado con el cultivo en lote Las desventajas principales son: 1) No siempre se puede lograr la produccién de algunos productos no relacionados con el crecimiento, los cuales a menudo requieren de técnicas de cultivo in- termitente alimentado. 2) El crecimiento en las paredes y la agregacin de células puede causar desgaste o evitar el crecimiento en régimen permanente real. 3) El crecimiento continuo por largos perfodos puede ocasionar la pérdida de la cepa original debido a que es adoptada por una cepa que crece mds rapido. 4) A menudo, el crecimiento de organismos filamentosos es dificil debido a la viscocidad y naturaleza heterogénea del cultivo que evita el crecimiento en régimen permanente, 5) El crecimiento por perfodos largos puede ocasionar problemas de contaminacién, 6) Para perfodos de crecimiento extensos, la planta y el equipo auxiliar deben ser confiables y de la mejor calidad para evitar Ia interrupcin mecénica, etc. 10.8 APLICACIONES DEL CULTIVO CONTINUO | Hay innumerables aplicaciones del cultivo continuo que van desde la seleccién de cepas de alto rendimiento hasta el estudio de ta regulaci6n metab6lica y de la interaccién de poblaciones microbianas mixtas. Aqui se estudiarfn solamente los principios del cultivo de enriquecimiento continuo. 10.8.1 Cultivo de enriquecimiento continuo Se puede elegir el medio de crecimiento y las condiciones de cultivo para seleccionar cepas con mejores rendimientos de biomasa y producto a tasas de crecimiento mayores. Asf, se puede seleccionar cepas termofiticas al operar altas temperaturas, en tanto que se pueden seleccionar mutantes irreprimibles al desarrollar cultivos en presencia de un represor. Un ejemplo del tiltimo caso, es el crecimiento de E. coli en presencia de glucosa y lactosa. En el cultivo por lotes, las enzimas requeridas para la utilizacién de lactosa son inducibles y son reprimidas por la presencia de la glucosa. El crecimiento en presencia de ambos substratos daria como resultado un patrn de crecimiento diduxico, mediante el cual Ja lactosa no serfa utilizada para el crecimiento hasta haber agotado la glucosa del medio. En el cultivo continuo es posible superar la represi6n catabélica mediante Ia glucosa y obtener el crecimiento simulténeo sobre ambos substratos. Ademds, al operar el quimiostato bajo estas condiciones a altas tasas de dilucién, se puede seleccionar mutantes Constitutivas que sintetizan las enzimas del metabolismo de 1a lactosa aun en ausencia del inductor.um 0.60, 0.50, Ss {s} Figura 10.15 Efecto del surgimiento de un mutante en un quimiostato. Cuando un mutante aparece dentro de un quimiostato puede alcanzar al cultivo causando el desgaste de la cepa original en el quimiostato, puede no tener ninguna voniaja de seleccién,y ser eliminada del cultivo inmediatamente, o bien las dos cepas pueden coexistir. El resultado depende de las tasas relativas de crecimiento de las dos copas (figura 10.15). ‘Cuando Ia cepa X crece bajo condiciones de limitaci6n de carbono en un quimiostato y se origina un mutante A, B 0 C dentro del cultivo, la rapidez de acumulacién dé los mutantes se puede describir por: aX FX x = entrads salida ye (10.63) dr v v donde X‘ es el mutante A, B oC. En la figura 10.15 (a), la concentracién del substrato limitante est4 dada por S, a la rapidez de dilucién operante D. A esta concentracién, el mutante A tiene una rapidez de crecimiento de 1, de modo que su rapidez de acumulacién esta dada por:a 222 Cinética del crecimiento {Cap.ig dA ——=Ha--DA (10.64) dt dyldt es negativa y, en consecuencia, el mutante A es eliminado y la cepa X permanece, En la figura 10.15 (b), a la concentraci6n de substrato limitante S, el mutante B crece ‘una rapidez pp que es mayor que la rapidez de dilucién. Asi: dB —=)1gB --Dp (10.65) dt En este caso dB/dr es positiva y B se acumula, Como resultado, la concentraci6n de substrato caer4 a S” con el establecimiento de un nuevo régimen permanente donde tp = D. En este punto, el organismo X no puede competir puesto que dX/dt = y,X — D, y dX/dt es : negativa. Por consiguiente el mutante es retenida y la poblaci6n original, X, es agotada, En la figura 10.15 (c), el resultado dependerd de la tasa de dilucién usada. AD = 03h, el mutante C se agotaré a D = 0.6 br! el mutante substituiré a la cepa original en el cullivo, | mientras que a D = 0.5 D, ambos organismos permanecerdn como un cultivo mixto estable, Esta situacién contrasta con el cultivo por lotes, donde cualquier mutante que surja capaz de utilizar el substrato serd retenido sin importar la tasa de crecimiento. La situaci6n descrita auf con respecto a las mutantes, también se puede aplicar directamente a la entrada de un contaminante en el cultivo. El contaminante seri retenido o eliminado dependiendo de su rapidez de crecimiento con respecto a la de la poblacién original y de la rapidez, de dilucién operacional. 10.9 LISTA DE SiMBOLOS factor de concentracién de Ia biomasa durante el reciclaje de células tasa o rapidez de dilucién (h~!) tasa de diluci6n critica (h~!); menor valor de D al cual ocurre el agotamiento taza de dilucién que da la productividad maxima (h-!) F, E” energia de activacion (kcal - mol!) F rapidez de flujo (1 - b-!) F rapidez de flujo del medio de reposicion hacia la segunda etapa de un quimiostato doble (1 b-!) rapidez de destruccién del producto (h-!) constante de saturacién; concentracién de substrato a la cual p= H,, (g - h!) m — coeficiente de mantenimiento (g de substrato consumido (g de peso seco celular"! - h-) niimero de generaciones productividad volumétrica (g «I>! - h-}) productividad volumétrica de biomasa (g «1+! - h-!) = Dy productividad volumétrica de producto (g «1-1 hr!) = D, Concentiacién de producto a régimen permanente (g- 1-4) Gp tasa especifica de formaci6n de producto (g de producto (g de peso seco celular)! - h-!)Cap. 101 Bibliografia 223 dg tasa especifica de consumo de substrato (g de substrato (g de peso seco celular)! -h-!) R _ constante de los gases (1.98 cal mol - K+!) S$ concentraci6n del substrato limitante (g -F!) Sp concentracién inicial del substrato limitante (g - 1-1) Sg concentracién de substrato limitante en el suministro de medio (g - I!) 3 concentracién de substrato limitante a régimen permanente en la primera etapa (g-1-!) Jy concentracién de substrato limitante a régimen permanente en la segunda etapa de un quimiostato de dos etapas (g - 11.) S’ — concentracién de substrato limitante en el suministro de medio a la segunda etapa de un quimiostato de dos etapas (g - -!) tg Gempo de duplicacién (b) T temperatura absoluta (K) V__ volumen de cultivo (trabajo) (1) Vz volumen del cultivo en la segunda etapa de un quimiostato de dos etapas (1) X —_ concentracién de biomasa (peso seco celular) (g « I-!) Xp concentracién de biomasa en la corriente de entrada (g rr) X, — concentracién de biomasa al tiempo t (g Fh X — concentracién de biomasa a régimen permanente (g- I!) X— concentracién de biomasa a régimen permanente en la segunda etapa de un quimiostato de dos etapas (g - I>!) Yys Coeficiente de rendimiento de biomasa: g de peso seco celular formado por g de substrato consumido (g - g-!) Ypyg_ Coeficiente de rendimiento de producto: g de producto formado por g de substrato consumido (g « g-!) Yq rendimiento real de biomasa (seccién 3.24.) (g - !) @ —_ tasa de mortalidad especifica (h~!) relacién de reciclaje celular (secci6n 4.1.8) HH tasa espeeifica de crecimiento (h-!) lasa especifica de crecimiento en la segunda etapa de un quimiostato de dos etapas (h-}) Hm lasa especifica de crecimiento maxima (h-}) BIBLIOGRAFIA Aiba, S., Humphrey, A. E., and Millis, N. F. (1973) Biochemical Engineering, 2nd edn. Academic Press, New York and London. Batley, E. H. (1987) Energetics of Microbial Growth, John Wiley and Sons, New York Bauchop, T. and Elsden, S. R. (1960) The growth of microorganisms in relation to their energy supply. J. Gen. Microbiol., 23, 457. Herbert, D. (1961) A theoretical analysis of continuous culture systems. 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