Desarrollo humano

Allium test para evaluar el efecto citotxico y

genotxico de extractos naturales en clulas
meristemticas de Allium cepa
Diana M. Muoz-Solarte*, Nancy Guerrero-Pepinosa**
Resumen
Introduccin: el uso de diferentes compuestos de origen natural para el tratamiento primario de enfermedades se ha incrementado; la mayora de estos compuestos no cuentan con suficientes estudios de
toxicidad que validen su uso teraputico. Los bioensayos son considerados pruebas efectivas para evaluar
efectos txicos de diferentes sustancias con el empleo de plantas. Allium test es un bioensayo para detectar
contaminantes y sustancias potencialmente txicas para la salud. Diversos estudios han demostrado su
potencialidad diagnstica significativa. Metodologa: estudio experimental. Para estandarizar el bioensayo
Allium test, fue necesario organizar tres rplicas, con cuatro Allium cepa con meristemos apicales de dos
centmetros de dimetro. Se realizaron los cortes y el montaje de cada muestra para el posterior anlisis al
microscopio. Resultados: al usar Allium test, el mayor porcentaje de clulas se encuentran en interfase con
un 45%, seguido de un 42% de profase, lo cual evidencia una actividad normal del ciclo celular. Conclusiones: la estandarizacin del bioensayo Allium test en el laboratorio permitir evaluar la citotoxicidad y
genotoxicidad de extractos de origen natural usados para el tratamiento primario de enfermedades.
Palabras clave: Allium cepa, bioensayo, citotoxicidad, fitotoxicidad, genotoxicidad.

Allium Test to Evaluate the Cytotoxic and Genotoxic Effect of Natural Extracts in Meristematic Cells of Allium strain
Abstract

Magster (c) en Biologa,

Universidad de Antioquia.
Coordinadora del Laboratorio de
Ciencias, Fundacin Universitaria
Mara Cano, sede Popayn.

Correo-e:
dianamilenamunozsolarte@fumc.
edu.co
** Magster en Biologa, Universidad de
Antioquia. Docente investigadora,
Fundacin Universitaria Mara
Cano, sede Popayn.
Correo-e:
nancyyadiraguerreropepinosa@
fumc.edu.co
Recibido: 15 de junio del 2012
Aprobado: 10 de octubre del 2012
Cmo citar este artculo: Muoz-Solarte,
D. M. y Guerrero-Pepinosa, N. (2013). Allium
test para evaluar el efecto citotxico y
genotxico de extractos naturales en clulas
meristemticas de Allium cepa. Memorias,
11(19), 83-86.

Introduction: The use of different natural compounds for the primary treatment of diseases has increased; most of these compounds do not have sufficient toxicity studies that validate their therapeutic use.
The bioassays are considered effective tests to evaluate toxic effects of different substances with the use
of plants; Allium is a bioassay test to detect pollutants and potentially toxic substances to health. Several studies have demonstrated significant diagnostic potential. Methodology: Experimental study. To
standardize the Allium test bioassay was necessary to organize three replicates, with 4 apical meristems
Allium strain with two centimeters in diameter, cuts and assembly of each sample were made for subsequent microscopic analysis. Results: By using Allium test, the highest percentage of cells are in interphase with 45%, followed by 42% of prophase, which shows a normal activity of the cell cycle. Conclusions:
Allium bioassay standardization in the laboratory test will assess the cytotoxicity and genotoxicity of
natural extracts used for the primary treatment of diseases.
Keywords: Allium strain, bioassay, cytotoxicity, phytotoxicity, genotoxicity.

Allium test para avaliar o efeito citotxico e genotxico de extratos naturais em clulas
meristemticas de Allium cepa
Resumo
Introduo: o uso de diferentes compostos de origem natural para o tratamento primrio de enfermidades vem aumentando; a maioria desses compostos no conta com suficientes estudos de toxicidade
que validem seu uso teraputico. Os bioensaios so considerados provas efetivas para avaliar efeitos
txicos de diferentes substncias com o emprego de plantas, Allium test um bioensaio para detectar
contaminantes e substncias potencialmente txicas para a sade. Diversos estudos vm demonstrando sua potencialidade diagnstica significativa. Metodologia: estudo experimental. Para padronizar o
bioensaio Allium test, foi necessrio organizar trs rplicas, com 4 Allium cepa com meristemas apicais
de dois centmetros de dimetro, realizaram-se os cortes e a montagem de cada amostra para a posterior
anlise ao microscpio. Resultados: ao usar Allium test, a maior porcentagem de clulas se encontra em
interfase com 45%, seguido de 42% de profase, o que evidencia uma atividade normal do ciclo celular.
Concluses: a padronizao do bioensaio Allium test no laboratrio permitir avaliar a citotoxicidade
e genotoxicidade de extratos de origem natural usados para o tratamento primrio de enfermidades.
Palavras-chave: Allium cepa, bioensaio, citotoxicidade, fitotoxicidade, genotoxicidade.

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Memorias / Volumen 11, Nmero 19 / enero - junio 2013

Introduccin1

cierto tiempo mediante respuestas individuales (reacciones fisiolgicas, etolgicas, morfolgicas, bioqumicas (Fiskesj y Dutka, 1996). En este contexto las
pruebas con plantas vasculares, entre ellas Allium cepa
(Fiskesj, 1988), han demostrado potencialidad diagnstica significativa (Kristen, 1997). La determinacin
de dichos efectos se realiza a partir de la observacin
del crecimiento, el flujo del ciclo celular y las mutaciones cromosmicas del pice radical de la cebolla
(Allium cepa). Las plantas vasculares son ampliamente
reconocidas como excelentes modelos genticos para
evaluar y detectar compuestos con potencial citotxico
y genotxico. Allium cepa es usada para evaluar daos
del adn, como alteraciones cromosmicas y mitticas
(Leme y Marin, 2009).
Algunas pruebas biolgicas tienen la capacidad
para detectar el efecto txico, citotxico y genotxico de compuestos utilizados como tratamiento primario de diferentes enfermedades. Adems, son simples,
rpidos, econmicos y pueden ser ejecutados con diferentes especies. El Allium test ofrece informacin valiosa para evaluar el mecanismo que tiene un agente y
los efectos sobre el material gentico como los efectos
clastognicos (induccin de rupturas cromosmicas en
la divisin celular) y aneugnicos (alteracin en las estructuras de la clula, como el huso mittico) (Fenech,
2000). La efectividad de Allium test se puede evidenciar
con el estudio de Andrioli, Wulff y Mudry (2006), en el
que evaluaron la toxicidad del metronidazol, un agente teraputico usado para infecciones de tipo intestinal
cuyo efecto txico fue identificado con la evaluacin
con varias tcnicas.
Las clulas de los meristemos apicales de cebolla
muestran fcilmente un amplio rango de alteraciones
citolgicas, lo que constituye el trabajo con races de
esa especie vegetal en material biolgico sensible para
detectar sustancias potencialmente peligrosas tanto
para la salud humana como para el medio ambiente en
general. Se han reportado estudios en los que se han
evaluado los efectos citotxicos del algunos extractos
utilizados para fines teraputicos, como el del totumo
(Crecentia cujete) y la chuchuguaza (Maytenus laevis
reiss), en los cuales se evidencian efectos citotxicos y
genotxicos despus de 24 horas de exposicin (Espitia
et al., 2011; Freyre, Estrada y Bolaos, 2009).
Las pruebas de citotoxicidad son utilizadas para determinar la proporcin de clulas que mueren despus
de un proceso como la exposicin a compuestos de diferente naturaleza. Existen varias pruebas para medir
el dao en el material gentico (adn), entre las que se

Actualmente el uso masivo de sustancias a base de extractos de origen natural con propiedades antiinflamatorias, antihistamnicas y antispticas se ha incrementado,
y en la mayora de casos este tipo de sustancias se comercializan sin previos estudios de toxicidad, lo que pone en
riesgo la salud de las personas que las utilizan (Alfredo,
Anaruma, Pio, Joo y Casarotto, 2009).
Los estudios de citotoxicidad y genotoxicidad constituyen un paso importante en la evaluacin toxicolgica
de los medicamentos de origen vegetal que son mezclas
complejas con una o ms acciones teraputicas, en las
que tambin pueden estar presentes compuestos mutagnicos relacionados con el desarrollo de procesos carcinognicos y teratognicos (Nunes et al., 2012).
En los ltimos aos, los bioensayos han cobrado
inters en el campo de la investigacin para evaluar los
potenciales efectos fitotxicos, citotxicos y genotxicos de diferentes compuestos como los extractos de
origen natural que se utilizan ampliamente para tratar
diferentes enfermedades como la hipertensin y los dolores musculares (Asare et al., 2012).
La actividad farmacolgica de los extractos de origen vegetal se asocia con su toxicidad, y el efecto inducido depende de la va de administracin, la dosis y la
susceptibilidad gentica individual.
El objetivo del presente estudio es estandarizar la
tcnica de Allium test para observaciones microscpicas de los pices radicales de Allium cepa, con el fin de
evaluar el efecto fitotxico, citotxico y genotxico de
compuestos de origen natural que se usan en tratamientos teraputicos de uso tpico. Adems, con este tipo de
estrategias investigativas, los investigadores jvenes del
Programa de Fisioterapia de la Fundacin Universitaria
Mara Cano, profundizarn y apropiarn el conocimiento de la estructura y los mecanismos celulares que son
fundamentales para la comprensin y el anlisis de la
funcin del cuerpo humano (Ramrez, 2011).

Fundamento terico
Los organismos biolgicos tienen la capacidad de expresar las alteraciones ms sutiles que operan durante
1
Artculo resultado del proyecto de investigacin Evaluacin citotxica y genotxica del extracto de calendula (Calendula oficinallis)
en clulas meristemticas de Allium cepa, desarrollado en el 2012 en la
Fundacin Universitaria Mara Cano, sede Popayn, por el grupo de investigacin Fisioterapia, cuerpo y movimiento (Ficmos).

Allium test para evaluar el efecto citotxico y genotxico de extractos naturales en clulas meristemticas de Allium cepa

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encuentran las pruebas citogenticas como la cuantificacin de Alteraciones Cromosmicas (ac) y el Intercambio de Cromtidas Hermanas (ich), que han sido
fuente de referencia por su alto grado de resolucin, y
que se pueden visualizar y analizar con la prueba Allium
test.
Las alteraciones cromosmicas se caracterizan
por presentar cambios estructurales y numricos en los
cromosomas de clulas que han sido expuestas a agentes fsicos, qumicos y biolgicos. Este tipo de alteraciones tambin pueden ocurrir de manera espontnea.

el programa estadstico spss 15.0. Para el clculo del im

y la duracin de cada fase del ciclo celular se emplearon las siguientes frmulas:

Metodologa

Al estandarizar Allium test en condiciones de laboratorio se observaron claramente algunas organelas

celulares. Se identificaron los ncleos, los cromosomas teidos de color violeta y las membranas celulares claramente definidas. En todas las clulas se
pudo diferenciar el ncleo densamente teido (figura
1). Para el anlisis al microscopio se escogieron los
campos en los que mayoritariamente hubiera clulas
meristemticas y se procedi a su recuento, para posteriormente calcular el porcentaje de clulas por cada
fase de la mitosis segn recomendaciones de Urteaga
y Lallana (2005). El procedimiento de conteo se repiti en otros campos cuidando que no se solaparan,
hasta obtener los datos de al menos 100 clulas. A su
vez, y asumiendo que la duracin total del ciclo celular de Allium cepa es de 12 horas (Bishop y Klein,
1973), tambin se estim la duracin en minutos de
cada fase del ciclo (tabla 1).

Para estandarizar Allium test se hizo necesario seleccionar cuatro bulbos de Allium cepa de dos cm de dimetro aproximado (tres rplicas), los cuales fueron
asignados al medio agua destilada. Al cabo de las primeras 72 horas, se retiraron las cebollas de sus respectivos tratamientos y se procedi a preparar entre dos y
tres races de dos cm de longitud de cada cebolla para
anlisis al microscopio. Se realiz la tincin y fijacin
de clulas con base en el procedimiento de Fiskesj y
Dutka (1996). Se tuvo en cuenta solamente la parte
apical de entre uno y dos cm y se aadieron dos gotas de la solucin de fijacin Carnoy hasta cubrirlas.
Se fijaron durante diez minutos. El exceso de fijador se
elimin con pipeta y papel de filtro, e inmediatamente
despus se aadi el colorante (orcena actico-clorhdrica). Se flame hasta la emisin de vapores, evitando
la ebullicin. Se dej enfriar y se repiti entre dos y
tres veces durante 15 minutos. Posteriormente se realizaron cortes finos del pice de la raz de la cebolla, se
hizo el squash del tejido y se sellaron los bordes del
cubreobjeto con barniz de uas transparente para evitar la deshidratacin celular.

% IM No cel mitosis (P+M+A+T) x 100

No Total cel.
% IM No cel mitosis (P+M+A+T) x 100

No Total cel.

Resultados

Observaciones microscpicas
Los preparados fueron observados a travs de un microscopio ptico binocular. Se calcul el ndice mittico (im) que estima el porcentaje de clulas en divisin
que existen en un tejido y que por tanto es una medida
de su potencial proliferativo. Teniendo en cuenta que
es una prueba de estandarizacin, para el anlisis de
los datos se tuvo en cuenta el protocolo descrito, y se
aplic estadstica descriptiva para determinar las frecuencias de clulas en cada una de las fases del ciclo
celular. La estadstica descriptiva se realiz utilizando

Nota: Ntese Pared celular (pc) y ncleo (n).

Figura 1. Panormica de clulas meristemticas apicales (40X)

Fuente: elaboracin propia

De acuerdo con la tabla 1, al usar Allium test en condiciones normales, el mayor porcentaje de clulas se en-

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Memorias / Volumen 11, Nmero 19 / enero - junio 2013

cuentran en interfase, con un 45%, seguido de un 42% de

profase. Es evidente una actividad normal del ciclo celular,
resultado que era de esperarse pues las clulas meristemticas del pice de cebollas en el proceso de estandarizacin
solo estuvieron expuestas a agua destilada.
Tabla 1. Porcentaje de clulas en cada fase del ciclo celular y estimacin de la duracin (min) de las fases correspondientes a los
segmentos radicales de Allium cepa
Fases

Tiempo (min)

Interfase

45

324

Profase

42

302

Metafase

57,6

Anafase

21,6

Telofase

14,4

Fuente: elaboracin propia

Muchos investigadores han usado las plantas superiores en estudios de toxicidad, citotoxicidad y genotoxicidad, las cuales constituyen gran valor presuntivo.
Se sugiere incluir los bioensayos con plantas superiores, especficamente Allium cepa en pruebas de rutina
para evaluar el dao cromosmico inducido por sustancias qumicas (Grant, 1992). Por estas razones, la
aplicacin de los bioensayos en la evaluacin del efecto de sustancias cobra importancia en el campo de la
biologa, y para evaluar previamente los compuestos y
extractos de origen natural usados en tratamiento primarios de algunas enfermedades.

Conclusiones
Allium cepa es un organismo que ofrece un modelo
experimental factible de implementar en el laboratorio para evaluar la toxicidad de diferentes sustancias.
El bioensayo Allium test en clulas meristemticas fue
estandarizado en el Laboratorio de Ciencias integradas
de la Universidad Cooperativa de Colombia y la Fundacin Universitaria Mara Cano, Extensin Popayn,
que servir para realizar posteriores evaluaciones de
toxicidad de compuestos y extractos de origen natural
como rnica y calndula.
Cabe resaltar la pertinencia de los estudios experimentales en biologa celular que deben tener en cuenta
los programas de ciencias de la salud, especficamente
fisioterapia, para brindar un abordaje ms analtico a
los procesos biolgicos relacionados directamente con
el funcionamiento del cuerpo humano.

Referencias
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Asare, G. A. et al. (2012). Genotoxicity, cytotoxicity and
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Freyre, S., Estrada, M. y Bolaos, H. (2009). Estudio preliminar de
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