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Theoria, Vol.

15 (2): 9-16, 2006 ISSN 0717-196X

Artículo/Article

ALLIUM CEPA COMO BIOMONITOR DE TOXICIDAD


Y GENOTOXICIDAD DE METRONIDAZOL
ALLIUM CEPA AS BIOMONITOR OF METRONIDAZOLE TOXICITY
AND GENOTOXICITY

NANCY BEATRIZ ANDRIOLI*1, ARTURO FEDERICO WULFF2 Y MARTA DOLORES MUDRY1


1
Grupo de Investigación en Biología Evolutiva (GIBE), Depto. de Ecología, Genética y Evolución, Facultad de Ciencias
Exactas y Naturales, Universidad de Buenos Aires, Ciudad Universitaria, Pabellón II, 4to Piso Lab.: 46, (C1428EHA),
Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Argentina.
2
Laboratorio de Genética. Departamento de Ecología, Genética y Evolución, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad
de Buenos Aires, Ciudad Universitaria, Pabellón II, 4to Piso Lab.: 61 (C1428EHA), Ciudad de Buenos Aires, Argentina.
*Autor para correspondencia: nandrioli@hotmail.com

RESUMEN

El metronidazol (MTZ) es un compuesto de uso frecuente como antiparasitario y bactericida. Los estudios
tanto in vivo como in vitro sobre la genotoxicidad del MTZ exhiben resultados contradictorios. Dado que
hasta el momento, el MTZ no fue evaluado en modelos vegetales, se busca caracterizar el discutido efecto del
MTZ al aplicar el test de Allium cepa, un modelo de sensibilidad demostrada para evaluar tanto toxicidad
como genotoxicidad. El análisis fue realizado sobre el crecimiento de las raíces y sobre las células meristemáticas
del ápice. Los resultados evidenciaron que la toxicidad manifiesta sobre el crecimiento de la raíz para las
concentraciones 250 y 500 ug/ml no está asociada a la inhibición del del MTZ sobre las células meristemáticas
no afectan significativamente el ciclo celular y que involucrarían otros mecanismos asociados al crecimiento
de la raíz.
PALABRAS CLAVES: Aberraciones cromosómicas, Allium cepa, crecimiento de raíces, Índice mitótico, Metroni-
dazol.

ABSTRACT

Metronidazole (MTZ) is frequently used as an antiparasitary and bactericide agent. However, genotoxic
effects in different models in vivo and in vitro are contradictory. Since MTZ has not yet been evaluated in
plant systems, the search is focused on describing the controversial effect MTZ produces when the Allium
cepa test is applied a vegetal model which demonstrates sensitivity to genotoxic and toxic screening. The
analysis was done on root growth and the mersitematic cells apex. The results show that the toxicity mani-
fested on the root growth for the 250 and 500 ug/ml is not associated to the inhibition of the mitotic index
(IM). Neither the IM values nor the analisys of anaphases – telophases Allium cepa root which included both
chromosome aberrations and disorganized anaphases did present significant differences for concentrations
10, 50 and 250 ug/ml under Student’ T tests. These results indicate that the mechanism involved in the
MTZ toxic effect on the mersitematic cells do not affect significantly the cell cycle and that could involve
other mechanisms associated with root growth.
KEYWORDS: Allium cepa, Chromosome aberrations, Metronidazole, Mitotic index, Root growth.
Recepción: 15/09/06. Revisión: 10/10/06. Aprobación: 30/11/06.

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INTRODUCCIÓN Por otra parte, entre los estudios en los


que el MTZ arrojó resultados negativos, se
El Metronidazol (MTZ), 1-(hydroxyethyl)- encuentran ensayos con líneas celulares de
2-methyl-5-nitroimidazol, es un agente te- mamíferos en los que el efecto genotóxico
rapéutico utilizado en el tratamiento de in- se registró sólo en condiciones de hipoxia
fecciones tipo trichomoniasis, amebiasis y (Korbelik y Horvarth, 1980) y ensayos de
giardiasis, así como para el tratamiento de corto plazo (ECP) con linfocitos de sangre
infecciones causadas por bacterias anaero- periférica (Hartley-Asp, 1979; Akiol et al.,
bias. Las parasitosis son frecuentes en los 2000; Fahrig and Engelke, 1997).
países tropicales y subdesarrollados, donde En cuanto a los modelos in vivo, estudios
existe una población numerosa, susceptible recientes realizados en distintas cepas de ra-
y desfavorecida por las condiciones climáti- tón atribuyen a la acción del MTZ el aumento
cas, económicas y sociales que facilitan la significativo de micronúcleos (el-Nahas A.E.
proliferación, persistencia y permanencia de and el-Ashmawy I.M, 2004). Estudios pre-
las enfermedades parasitarias (Reyes Rome- vios atribuyen efectos genotóxicos al MTZ,
ro y Navarro Rojas, 1998). Los riesgos toxi- si bien, en algunos casos, el mismo está con-
cológicos potenciales derivados de la utili- dicionado a algún estadio del desarrollo. En
zación de las drogas indicadas para el trata- Neurospora crassa and Saccharomyces cerevisiae,
miento de estas afecciones, deben conside- la mutagenicidad se evidenció sólo en célu-
rar su relación costo-beneficio, teniendo en las vegetativas (Ong and Slade, 1978; Ong
cuenta que estas enfermedades infecciosas et al., 1979; Mhon et al., 1970). El ensayo
están directamente asociadas a los estilos de del letal recesivo en DrosophIla melanogaster
vida y a las condiciones de pobreza y margi- no mostró efecto genotóxico (Kramers,
nalidad que favorecen su diseminación. 1982), sin embargo se encontraron efectos
Los resultados obtenidos al analizar dife- teratogénicos para el mismo modelo (Palermo
rentes dosis y concentraciones de MTZ en et al., 2004).
modelos animales tanto in vivo como in vitro La actividad genotóxica del MTZ en los
son controvertidos (Dobias et al., 1994). Los ensayos in vitro se vinculan a la vía reductiva
modelos in vitro en algunos casos eviden- de metabolización a través de dos mecanis-
cian genotoxicidad, según diferentes pará- mos posibles. Uno es la formación de una
metros que dan cuenta de alteraciones tan- hidroxilamina de corta vida y posteriormente
to en la cinética de la división celular como una amina primaria (Muller, 1981). La hi-
en la estabilidad cromosómica, en trabajos droxilamina reacciona uniéndose covalente-
realizados en cultivos de células CHO (Mudry mente al ADN provocando la pérdida de la
et al., 1994), linfocitos de sangre periférica estructura helicoidal, ruptura de cadena y
(López Nigro et al., 2003; Carballo et al., desacoplamiento de la doble hélice (Edwars,
2004, Gómez Arroyo et al., 2004; Elizondo 1986; Kedderis and Miwa, 1988). Mientras
et al., 1994; Menéndez et al., 2002) y Elec- que el otro se da por la formación de radica-
troforesis de células individuales o Ensayo les libres cuando el ingreso del MTZ a la
de cometa (Rodríguez Ferreiro et al., 2002). célula anaeróbica es seguida de la activación
En otras publicaciones, se estableció una re- biorreductiva del mismo y formación de un
lación inversa entre concentración plasmá- nitro anión debido al gradiente de electro-
tica del MTZ y daño al ADN, atribuyendo nes que se genera a través de componentes
este daño a un metabolito (Elizondo et al., con suficiente potencial redox negativo como
1996; Menéndez et al., 2001). para transferirlos. Los radicales tóxicos pro-

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vocan daños en el ADN, así como en otros lizó la dilución fue el control negativo. Como
componentes celulares (Raheter and Hanel, control negativo para el solvente se utilizó
2003). DMSO 1%.
El objetivo de este trabajo es analizar el
efecto del MTZ al aplicar el test de Allium
cepa, ya que estudios previos indican que es Toxicidad
un biomonitor adecuado tanto para el aná-
lisis de toxicidad como de genotoxicidad Para cada tratamiento, se colocaron 4 bul-
(Fiskesjo, 1985). Su aplicación en el análisis bos de tamaño uniforme (3 cm de diáme-
genotóxico de compuestos químicos y mez- tro) en cubetas de vidrio de 2,5 cm de an-
clas complejas es ampliamente utilizado des- cho, 14 de largo y 10 de alto. Antes de utili-
de su implementación desarrollada por Le- zarlos se les extrajeron las catáfilas exteriores
van en 1938. Numerosos trabajos han sido y el disco inferior fue limpiado de raicillas
incluidos en la base de datos del Centro de sin destruir los primordios que serían expues-
Información sobre Mutágenos Ambientales, tos a las soluciones de MTZ a testear. Se
registros obtenidos con distintas técnicas en sumergieron los bulbos hasta su cuarta par-
Allium cepa demostraron una confiabilidad te en agua durante 24 horas y aquellos en
de un 80% en un estudio en el que se com- los que se observó un crecimiento de las raí-
pararon los resultados del test de Allium cepa ces menor a 2 cm fueron descartados. Para
con otros sistemas de prueba en la evalua- determinar las concentraciones adecuadas
ción de varios compuestos (Grant, 1982). para el test de genotoxicidad se analizó el
En este contexto y dado que el MTZ aún crecimiento de la raíz durante 72 h, se mi-
no ha sido evaluado con ensayos que utili- dieron entre 20 y 30 raíces de cada una de
zan plantas como modelo, consideramos de las concentraciones y se obtuvo el promedio
interés estudiar los aspectos toxicológicos del de longitudes que fue utilizado para el cál-
MTZ en relación con el modelo utilizado. culo de los porcentajes de crecimiento de las
Los análisis realizados en este ensayo in- raíces expuestas a MTZ respecto a los res-
cluyen: crecimiento relativo de la raíz, alte- pectivos controles. Con estos valores se cons-
raciones de anafases-telofases y aberraciones truyó una curva dosis respuesta. Se descar-
cromosómicas. taron las concentraciones mayores a EC 50
para el análisis de genotoxicidad (Fiskesjo,
1985).
MATERIALES Y MÉTODOS

Bulbos de Allium cepa, variedad Valcatorce Genotoxicidad


fueron suministrados por el Instituto Na-
cional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Una vez finalizada las 48 h de exposición de
Tabletas conteniendo 500 mg de metro- las raíces a cada solución, se cortaron y se
nidazol (MTZ), CAS N° 443-48-1 de Lab. fijaron juntas en etanol-acético 3:1.
Phrone-Poulenc Rorer, fueron disueltas en Para el test de genotoxicidad las raíces se
20 ml de dimetilsulfóxido (DMSO), CAS fijaron luego de 48 h de exposición para las
N° 67-68-5 Lab Backer y la solución fue concentraciones de MTZ 0,10, 50 y 250
diluida con agua comercial hasta alcanzar las mg/ml y DMSO 1% y fueron almacenadas
siguientes concentraciones de MTZ: 10, 50, en etanol 70%.
250 y 500 mg/ml. El agua con la que se rea- Las condiciones se mantuvieron constan-

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tes durante todo el ensayo, la temperatura 2. Índice Mitótico (IM) como nº de células
fue de 22 ºC, la aireación constante y los en división cada mil células observadas.
bulbos se mantuvieron en estufa de cultivo 3. Análisis de anafases/telofases; se registra-
protegidos de la luz y de las corrientes de ron las siguientes figuras: fragmentos acén-
aire. tricos, puentes, y cromosomas errantes o
Se realizaron 3 preparados para cada con- rezagados y anafases desorganizados.
centración. En cada uno se colocaron los
meristemas de 2 raíces, se ubicaron las mis-
mas en un portaobjeto con una gota del Análisis estadístico
Orceína aceto-clorhídrica de acuerdo al
método de Tjio y Levan (1950). (Orceína: Los resultados se expresan como medias ±
CAS Nº 1400-62-0 de Biopack) se observa- SD. Los datos fueron analizados con el
ron 500 células por preparado con 1000 X Student t-test, a través del programa Statistica.
en microscopio óptico (Leica DMLB). y se
disgregaron mediante el uso de agujas de
disección. Finalmente se aplicó la técnica de RESULTADOS
“squash”. Los preparados se realizaron en
forma temporaria, de modo que fueron se- Los valores obtenidos para los parámetros
llados con esmalte. analizados en las raíces de Allium cepa ex-
puestas a distintas concentraciones de MTZ
se muestran en la Tabla I.
Evaluación Las longitudes para las concentraciones
250 ug/ml y 500ug/ml fueron significativa-
Los parámetros usados fueron: mente menores respecto a los controles
DMSO y MTZ 0 (p<0.05).
1. Crecimiento de las raíces: longitud de las La concentración 500 ug/ml no fue uti-
raíces luego de 72 horas de exposición. lizada para el análisis de genotoxicidad por

TABLA I. Valores correspondientes a las longitudes de crecimiento, IM y anafases-telofases anormales de


las raíces de Allium cepa para 72 hs. de exposición a diferentes concentraciones de MTZ y controles.

MTZ (ug/ml) Longitud de % de Indice % de anafases Total de


raíces±DS crecimiento mitótico ± SD -telofases células
(cm) relativo (%) anormales observadas
al control ±DS

0 8.11±1.19 100 7.47±2.64 0.24±0.15 9000


DMSO 1% 8.49±1.11 105 6.30±1.92 0.30±0.08 9000
10 7.71±0,67 95 6.09±1.64 0.32±0.13 9000
50 7.32*±1.16 90 5.90±2.86 0.39±0.12 9000
250 5.48*±1.27* 68 6.33±0.47 0.32±0.14 9000
500 4.07±1.05* 49• NA NA NA

* Student t- test p < 0, 05 comparado con los controles MTZ 0 y DMSO 1%


•% de crecimiento de la raíz menor al 50% comparado con el control.
NA: No analizado.

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presentar un crecimiento menor al 50% res- zado con el objeto de caracterizar el efecto
pecto al control. protector de los compuestos tioles sobre sus-
Los valores de IM no presentaron dife- tancias mutagénicas no alquilantes, la hi-
rencias significativas para ninguna de las droxilamina induce un porcentaje elevado
concentraciones analizadas (p>0.05). de aberraciones cromosómicas sobre las cé-
El análisis de anafases-telofases está refe- lulas del mertistema de Allium cepa (Kaul
rido a dos tipos de efectos generales: Efecto and Choudhary, 1975).
clastogénico, resultado de ruptura cromosó- Considerando el resultado del presente
mica, evidenciado como puentes, fragmen- trabajo, podría sugerirse que la vía de reduc-
tos acéntricos y a efectos sobre la segrega- ción que conduce a la formación de hidroxi-
ción y aneugénicos, como resultado de alte- lamina no estaría ocurriendo en las células
raciones a nivel de anclaje de cromosomas meristemáticas. Por otro lado, la formación
al huso mitótico y migración de las cromá- de radicales libres es atribuida a la transfe-
tides, que se manifiestan como cromosomas rencia de electrones que se favorece en célu-
errantes o rezagados y anafases desorganiza- las anaeróbicas o en condiciones de hipoxia.
dos, multipolares y poliploides. Dado que el oxígeno es muy electronegativo,
Este análisis no mostró diferencias esta- la biorreducción de sustancias con bajo po-
dísticamente significativas respecto a los con- tencial redox se encuentra favorecida en con-
troles MTZ 0 y DMSO (p>0.05). diciones de hypoxia y anoxia. El grupo nitro
presenta bajo potencial redox y así su
biorreducción es improbable en células oxi-
DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES genadas como el meristema de la raiz de
Allium cepa (Abreu, 2002; Schmid and
Allium cepa es un organismo que ofrece un Schmid, 1999). La reducción del grupo nitro
buen modelo experimental in vivo para eva- podría ocurrir en estas condiciones cuando
luar la toxicidad y la genotoxicidad de sus- la dosis es elevada por efecto de la ley de
tancias y mezclas complejas. acción de masas (Raheter and Hanel, 2003).
Numerosas publicaciones informan los En este contexto, cabe considerar que en
resultados obtenidos sobre sustancias anali- plantas superiores el sistema de citocromos
zadas utilizando Allium cepa como organis- P450 se encuentra involucrado en procesos
mo de prueba. Aunque el MTZ es un com- de detoxificación (Werc et al., 1990;
puesto que fue evaluado en una amplia va- Sanderman, 1992; Guencheva and Pêgas
riedad de experimentos, tanto in vivo and Henriques, 2003), por lo cual Allium cepa
in vitro en procariontes y eucariontes, pre- constituiría un modelo disponible para el
viamente al presente trabajo, no hay datos análisis de biotransformación de compues-
del efecto de este compuesto en modelos tos quimicos.
vegetales. La ausencia de efectos genotóxicos po-
Algunos químicos relacionados estructu- dría estar asociada a la baja reducción del
ralmente con el MTZ fueron evaluados con grupo nitro en las dosis ensayadas y a la con-
este test dando resultados en algunos casos dición aeróbica y oxidativa de las células
negativos y en otros positivos (Grant, 1982). meristemáticas de Allium cepa.
El dato previo más relevante relacionado es En cuanto al efecto tóxico evidenciado
el obtenido con la hidroxilamina, ya que es por la inhibición de crecimiento de la raíz,
el intermediario más reactivo de la vía éste podría involucrar mecanismos no rela-
biorreductiva del MTZ. En un ensayo reali- cionados con la cinética de división celular,

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dado que la misma no se encuentra afectada dicha reducción ocurra en la zona de elon-
y en cambio interferir con procesos asocia- gación, donde las reacciones de oxidación
dos a la elongación de la raíz, en la zona con- son menos favorables que en la zona meris-
tigua del meristema. En este caso, los meca- temática, lo que podría tener como conse-
nismos afectados podrían estar vinculados cuencia un efecto tóxico evidenciado en la
con el ordenamiento de las microfibrillas de inhibición del crecimiento de la raíz.
celulosa a lo largo del eje mayor de creci- El efecto inhibitorio sobre el crecimien-
miento celular, impidiendo una adecuada to de la raíz de Allium cepa por exposición a
expansión celular (Green and Poethig, 1982). algunos compuestos, debería ser reconside-
Esta interacción podría o no involucrar la rado cuando este efecto no presente correla-
despolimerización de los microtúbulos cor- ción con la inhibición en el índice mitótico
ticales, que controlan el proceso de ordena- y con efectos aneugénicos, y su interpreta-
miento de las microfibrillas de celulosa (Cry ción enmarcada en un contexto que ofrezca
and Palevitz, 1995). Dado que los resulta- una mayor valoración de este modelo expe-
dos no evidencian efectos aneugénicos y C- rimental como biomonitor de toxicidad.
mitosis relacionados con falencias en la
formación del huso por despolimerización,
podría ser que el efecto no sea a nivel de AGRADECIMIENTOS
microtúbulos o bien que el MTZ actúe di-
ferencialmente en la zona de elongación y El presente trabajo se realizó en el marco del
no presente toxicidad en la zona meristemá- Subsidio PIP 5012 otorgado por CONICET.
tica.
Publicaciones recientes atribuyen la re-
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