BIOTECNOLOGIA

PARTE I
Biotecnologa y Agricultura
Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal
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IZQUIERDO, Juan
I.-Captulo1
Hacia una agricultura sustentable: las
alternativas de las ciencias de la vida y
de la biotecnologa
Izquierdo, Juan
1 El contexto del debate
En lnea con las conclusiones de la ltima
Cumbre de la Alimentacin de la FAO y diez
aos despus de la Cumbre de Ro y de la
adopcin de la Agenda 21, la Cumbre Mundial sobre Desarrollo Sustentable organizada
en Johannesburgo, Africa del Sur, por el Programa de las Naciones Unidas para el Medio
Ambiente (PNUMA), reforz que la sostenibilidad es cada vez ms un precepto crucial,
ampliamente aceptado y prioritario en el plano internacional dentro de un contexto integral que involucra la lucha contra la pobreza, el hambre y la malnutricin, la lucha contra las enfermedades infecciosas, la cooperacin tecnolgica, la educacin y la liberalizacin de los intercambios.
Las previsiones indican un importante
aumento de la demanda alimentaria, especialmente en los pases en vas de desarrollo,
lo que implica que para poder dar respuesta
a este reto una de las posibilidades es aumentar la superficie de terrenos cultivados.
Sin embargo, estos terrenos adicionales, limitados por la proteccin indispensable de
los entornos naturales, tan slo representaran una quinta parte del crecimiento de la
produccin mundial de cereales. Por consiguiente, resulta obligatoria la mejora del rendimiento y/o la adaptacin a condiciones
extremas de produccin (sequa, salinidad,
fro, altas temperaturas y otras) en zonas
poco aptas para la agricultura convencional
que permitan intensificar a los cultivos alimenticios y diversificar, sobre la base de especies
de cultivos introducidas o autctonas, alimenticias o volcadas al agroprocesamiento, la
base productiva de los pases de la regin.
En este desafo, en donde las ciencias de
la vida y la biotecnologa tienen un rol central, deben estar juntos todos los actores
del proceso del desarrollo (cientficos, legisladores, expertos en desarrollo, agricultores y
los representantes de la sociedad civil) para

abordar los aspectos tecnolgicos y econmicos, ms urgentes y polmicos, relacionados con el desarrollo y utilizacin segura de
las biociencias y su capacidad de ofrecer soluciones sustentables para la produccin de
alimentos y la reduccin de la pobreza. En
este contexto, la cooperacin entre el mundo desarrollado y el mundo en vas de desarrollo resulta crucial si se quieren lograr los
objetivos relativos a la sostenibilidad.
La seguridad y el uso de organismos
genticamente modificados (OGM) implican
a priori, situar a la ciencia en un contexto de
desarrollo mucho ms amplio, tratando de
asegurar que los agricultores de los pases en
vas de desarrollo formen parte del proceso
colaborativo de investigacin. Compartiendo
el derecho de la sociedad civil a cuestionar,
sobre bases bien informadas, los avances
cientficos y las consecuencias que de ellos
eventualmente pudieran derivar, debe tomarse nota de que un cierto grado de escepticismo es un elemento saludable y esencial
del proceso de demostracin que permite
dar a conocer las cuestiones cientficas apropiadas para as poder proceder a un debate
en toda regla.
2 Movilizar los recursos
El proceso anterior significa movilizar recursos tanto para apoyar a la innovacin y a
la investigacin en biotecnologa, as como
para desarrollar un marco regulatorio alcanzable dentro de las realidades de los pases
de la regin, acompaado por canales de
informacin tecnolgica confiables y honestos, que permitan y promuevan una percepcin pblica crtica pero realista de las ventajas que ofrecen los nuevos desarrollos de las
ciencias de la vida y la biotecnologa. Este
proceso es, en la actualidad, el centro vital
de la cooperacin horizontal que lleva adelante la red REDBIO/FAO (http://
www.redbio.org) con ms de 12 aos de
existencia y un cuerpo de laboratorios de ms
de 650 instituciones de 32 pases de Amrica
latina y el Caribe.
Si la solucin a tal desafo dependiera en
primer y nico lugar de la movilizacin de los
recursos humanos y de los medios financieros, los progresos actuales y futuros de las
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ciencias de la vida y de la biotecnologa, representaran un potencial nada desdeable

para el impulso de una agricultura sustentable y segura en los pases en vas de desarrollo. En concreto, dicha accin podra permitir
abandonar el uso de mtodos ms agresivos
para el ambiente como, por ejemplo, los
mtodos mecnicos y qumicos que inciden
en los costos de produccin, en sus efectos
desfavorables sobre las fuentes hdricas, la
fauna y la flora y sobre la salud de los agricultores.
Este planteamiento no queda exento de
fuertes reticencias en ciertos sectores de la
opinin pblica mundial y especialmente en
Europa, que expresan su desconfianza en
cuanto al uso de organismos modificados
genticamente en el mbito de la agricultura
y la alimentacin. Estas fuerzas compuestas
de variados actores de la sociedad civil representan, a su vez, un fuerte desafo que limita
la movilizacin de los recursos. El tema de los
OGM es ineludible pero no supone ms que
una parte de la totalidad del debate. La salud de los suelos y de los cultivos, el conocimiento real del estado de la biodiversidad,
las producciones vegetales en los lmites
ecoclimticos y la emancipacin tecnolgica
en las zonas rurales son tambin temas que
revisten la misma importancia.
3 Un contexto propicio para la accin
La produccin agrcola en los pases en
vas de desarrollo ha de aumentar en la medida en que contine creciendo el nmero
de bocas que alimentar. Este incremento se
ha de lograr en gran medida con los terrenos agrcolas existentes y mediante el uso de
mtodos que no agoten los recursos de la
tierra o causen daos medioambientales
duraderos. Las perspectivas de las generaciones venideras resultarn daadas irreversiblemente si no se emplean adecuadamente formas sustentables de cultivar la tierra.
La adopcin de mtodos agrcolas
sustentables es un elemento importante en
todo el proceso del desarrollo rural. La Agenda 21 indica que: Con el fin de crear las condiciones para la agricultura y el desarrollo
rural sustentables es preciso reajustar considerablemente la poltica agrcola, ambiental y macroeconmica, a nivel tanto nacio-
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nal como internacional, en los pases desarrollados y en los pases en desarrollo. El

principal objetivo de la agricultura y el del
desarrollo rural sustentables es aumentar
la produccin de alimentos de manera sustentable y mejorar la seguridad alimentaria.
La reciente conferencia Rio+10, celebrada
en Johannesburgo en septiembre de 2002,
reforz el compromiso mundial con los principios del desarrollo sustentable. Entre los
muchos logros importantes de la cumbre hay
que destacar el mejor entendimiento de lo
que representa el desarrollo sustentable y,
en particular, en cuanto a la interrelacin
entre la pobreza, el medio ambiente y el uso
de los recursos naturales.
Amrica latina y el Caribe, como regin
productora y exportadora de alimentos,
debe transformarse en uno de los protagonistas en el campo de las ciencias de la vida y
la biotecnologa. Dentro de este inters superior por ayudar al desarrollo de nuevas tecnologas no se debe olvidar la necesidad de
generar, acceder y compartir los avances con
el mundo desarrollado de un modo justo y
responsable. La regin debe preparar y endosar una declaracin de poltica en donde
las ciencias de la vida y las biotecnologas
son una opcin estratgica para los pases
(http://europa.eu.int/comm/
biotechnology/pdf/com2002-27_en.pdf)
subrayndose con claridad la necesidad de
poner los medios necesarios a la disposicin
de los pases en vas de desarrollo. El progreso en estos mbitos ayudar a la investigacin y a la evaluacin cuidadosa de las aplicaciones potenciales, con el fin de cubrir los temas de seguridad medioambiental y las necesidades locales relacionadas con la reduccin de la pobreza, la mejora de la seguridad
alimentaria y el aumento de la calidad
nutricional.
El desarrollo rural sustentable y la seguridad alimentaria son componentes importantes de las estrategias regionales contra la
pobreza. Habida cuenta de que el sustento
de la poblacin rural depende de una agricultura sostenible, no se podr erradicar la
pobreza sin una modernizacin sustancial de
la produccin agrcola en los pases en vas
de desarrollo.
4 Alimentar sin destruir
Segn las estadsticas de la Organizacin
de las Naciones Unidas para la Alimentacin
IZQUIERDO, Juan
y la Agricultura (FAO), hay alrededor de 800

millones de personas en el mundo que sufren malnutricin. Muchas ms dependen de
aprovisionamientos poco fiables de alimentos a causa de problemas naturales, econmicos o polticos. Las prcticas agrcolas no
sustentables tan slo vienen a sumarse a
todas estas dificultades. El uso adecuado de
las ciencias de la vida y de la biotecnologa
puede contribuir al logro de aumentos
sustentables de la produccin agrcola mediante la transferencia de prcticas de gestin mejoradas, un mejor rendimiento, la
resistencia a plagas y enfermedades y el aumento de la tolerancia al estrs abitico de
las cosechas, el ganado y la pesca. La seleccin adecuada de estas tecnologas reducir
la necesidad de recurrir a sustancias
agroqumicas, de modo que se proteger el
medio ambiente y a los agricultores de sus
efectos negativos. Adems, las ciencias de la
vida y la biotecnologa pueden contribuir a la
conservacin de la diversidad gentica. Por
ejemplo, ya hay proyectos en marcha que
evalan cmo se explotan y se extenan los
ecosistemas a causa del uso humano de los
recursos naturales. Con la informacin recopilada se puede lograr un uso ms razonable
de los ecosistemas que reduzca el riesgo de
prdida de especies esenciales.
5 La creacin de un dilogo responsable
Organizar y promover una Plataforma de
Debate sobre las Ciencias de la Vida, que
permita a los cientficos participar en un debate con las diversas partes implicadas interesadas en las aplicaciones beneficiosas y
en la divulgacin de los nuevos conocimientos, es parte del proceso. En este sentido se
debe organizar un debate informativo y plural sobre el papel de las ciencias de la vida en
un contexto de urgencia econmica y social,
centrado en las necesidades de los pases en
vas de desarrollo y apoyar foros de debate
con la sociedad civil presentando estudios
de cientficos nacionales, cada uno claramente ubicado en su contexto social y econmico. Las presentaciones deben realizarse en
un lenguaje comprensible para los legos en
la materia, porque se evitarn las referencias
a teoras e ideologas y se prestar atencin
a las soluciones prcticas a problemas con-
cretos. Estas presentaciones servirn de valiosa introduccin general a los diversos temas e irn dirigidas a un pblico amplio, con
el fin de que ofrezcan una base para el inicio
del debate pblico.
6 Reforzar los conocimientos
Las ciencias de la vida y biotecnologa
(http://europa.eu.int/comm/
biotechnology/pdf/com2002-27_en.pdf) son
pilares en el contexto de la construccin de
una sociedad y una economa basada en el
conocimiento. Las inversiones en investigacin y desarrollo, en educacin y formacin y
en los nuevos enfoques de gestin tienen
una importancia clave para hacer frente a los
desafos de la biotecnologa y las ciencias de
la vida. Coherente con lo anterior, el
reforzamiento de los vnculos entre la investigacin y otras polticas socioeconmicas y
la necesidad de la participacin de los cientficos en el proceso de creacin de un consenso es parte de la creacin de nuevas asociaciones de investigacin entre los pases desarrollados y los pases en vas de desarrollo,
a fin de aprovechar al mximo las ventajas
de tecnologas prometedoras y el potencial
de la biodiversidad.
El libro Biotecnologa y Mejoramiento
Vegetal, para el cual he tenido el honor de
escribir este captulo, es producto del trabajo de un nmero importante de investigadores jvenes latinoamericanos. La obra representa una contribucin significativa a la
realidad de las instituciones acadmicas y de
investigacin en ciencias agronmicas y biolgicas al aportar conocimientos y el estado
del arte y llenar el vaco temporal en la disponibilidad de un libro en espaol de consulta actual, dando seguimiento a la obra pionera Cultivo de Tejidos en la Agricultura: Fundamentos y Aplicaciones realizada en 1991
y llevada a cabo por el Centro Internacional
de Agricultura Tropical bajo la edicin de los
Drs. William Roca y Luis Mroginski. La Oficina
Regional de la FAO para Amrica Latina y el
Caribe colabor con la edicin de dicho libro
y reafirma el inters por este tipo de material, que provee un conjunto de documentacin consolidada para el uso de estudiantes
y profesionales.
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I.-Captulo 2
El papel de las nuevas biotecnologas
en la produccin agropecuaria
Pagliano, Daniel
1 Introduccin
La nueva economa determina que aquellas naciones que pretendan crecer y generar
riqueza debern necesariamente aceptar el
desafo que implica el aprender a utilizar los
idiomas digital y gentico. Es as entonces
que las empresas e instituciones basadas en
el uso intensivo del conocimiento son fundamentales en la creacin de prosperidad. Empresas de distinto porte han evolucionado y
crecido en el sector de la biotecnologa generando, directa e indirectamente, cientos
de miles de puestos de trabajo en todo el
mundo1 como resultado de inversiones que
se realizaron tanto en el sector pblico como
en el privado, y que hoy se consolidan a
travs de la generacin de un modelo productor de bienes y servicios. Entender este
continuum es vital.
Pero el punto principal es la creacin de
comunidades con visin competitiva. Es as
que desde un tiempo a esta parte muchos
pases desarrollados estn implementando
diferentes estrategias para impulsar el sector
de la biotecnologa como un rea prioritaria
de su economa, no slo por lo que significa
en trminos productivos sino tambin por lo
que significa culturalmente.
Para los pases latinoamericanos es entonces fundamental entender que hay que buscar un lugar dentro de esta nueva economa,
que es una economa de conceptos ms que
una economa de toneladas, y a la vez tratar
de establecer parmetros de desarrollo
sustentables que generen inversin, empleo
genuino y valor agregado.
El incremento de la demanda por factores de productividad y calidad en el producto terminado exige la utilizacin de tecnologas que introduzcan calidad en el material
inicial y que la continen y expandan hasta
The economic contributions of the biotec industry of the US
economy.
Informe realizado por Ernst & Young, Mayo 2000. www.bio.org
1
la obtencin de un producto final de mayor

calidad. Considerando que los sectores productivos ms importantes son la produccin
animal, de granos, hortifruticultura y forestales, la biotecnologa incide fundamentalmente desde el inicio de las cadenas productivas. Son bsicamente nuevas semillas, plantas o animales con nuevas caractersticas
genticas que confieren caracteres sanitarios,
de calidad o adaptativos, los que llevan un
valor agregado biotecnolgico.
A modo de ejemplo, si consideramos al
sector lcteo, las demandas comenzaran en
pasturas con especies forrajeras de alta productividad, seguiran en una gentica animal
que aporte la mejor capacidad de una produccin de calidad, se continan en la industria con elaboracin de productos diferenciados y ms an, sigue en la valorizacin de los
desechos industriales. Hay un continuum tecnolgico donde la suma de los valores agregados en cada tramo expande el valor agregado final.
Por otra parte, la agricultura y la industria
farmacutica comparten ahora una misma
caja de herramientas. El desarrollo de tecnologas que pueden ser usadas en cualquier
campo de la vida es un elemento dinamizador nuevo que permite que un logro en
un campo pueda ser rpidamente traspasado a otro. Los cdigos usados en genmica,
bioinformtica, qumica combinatoria y
protemica tambin son compatibles. Por
todo esto, se habla de una industria de las
ciencias de la vida.
Los pases de la regin poseen una especial habilidad para el agregado de valor a su
produccin agropecuaria mediante la utilizacin de conocimientos de base biolgica. Los
pases poseen no slo el know how (conocimiento) sino tambin la experiencia de
haber llevado esos conocimientos al campo
productivo, como lo demuestran las industrias lctea, forestal, citrcola, cafetera y el
complejo ganadero, entre otros.
Pero es necesario comprender que la actual revolucin existente en las ciencias de la
vida modificar o sustituir progresivamente
tecnologas existentes, permitiendo superar
lmites tcnicos bsicos, haciendo viables nuevos parmetros de productividad y de calidad para productos y procesos existentes,
sentando la base de nuevas industrias.
21
Esto generar cada vez ms cambios sustanciales en toda la cadena productiva

agroalimentaria, donde nuevos patrones tecnolgicos sern los responsables de la aparicin de nuevos productos en los mercados.
Estar preparados o ser parte de estos cambios se torna una cuestin de soberana.
2 Desarrollo de una visin
La sociedad de un pas, como sistema
humano, se mueve en direccin a las preguntas que se formula, y acta en funcin de
stas.
Para el diseo de una visin, la regin
debe lograr entender los cambios que en el
plano mundial se estn procesando. Cualquier tecnologa compleja necesita para su
desarrollo de una infraestructura sustentada
en una comunidad que involucra la investigacin, el gobierno, la educacin, los negocios, las finanzas, la legislacin y otros. Se requiere de varios actores para hacer que una
tecnologa pase por etapas de prueba de
concepto, desarrollo, maduracin, extensin
y finalmente termine con su adopcin.
Es fundamental tener una capacidad de
seguimiento de lo que ocurre mundialmente
en el desarrollo de nuevos productos, programas marcos de investigacin, prioridades
estratgicas de programas de ciencia y tecnologa, etc. Luego de tener estas tendencias mundiales es menester generar una estrategia regional de desarrollo y posicionamiento en el contexto mundial.
Los ejercicios de prospectiva tecnolgica
son una herramienta vlida en este sentido.
De acuerdo con la definicin de la OCDE (Organizacin para la Cooperacin y el Desarrollo Econmico), prospectiva tecnolgica es
un conjunto de intentos sistemticos para
mirar a largo plazo el futuro de la ciencia, la
tecnologa, la economa y la sociedad, con el
fin de identificar aquellas tecnologas genricas emergentes que probablemente generarn los mayores beneficios econmicos y/o
sociales.
El objetivo central de una prospectiva
tecnolgica es la estimacin de las tendencias futuras para llevar a cabo en forma anticipada acciones para disear el futuro deseado. En este sentido la prospectiva tecnolgica identifica aquellas tecnologas emergentes
22
y estima el impacto de stas sobre el mundo

de los negocios y la sociedad en general.
Histricamente, la regin ha invertido de
forma sistemtica en programas de I+D (Investigacin y Desarrollo) en apoyo a la investigacin biolgica aplicada, lo cual ha permitido mantener y aumentar la competitividad
de los sectores productivos de base natural.
En la actualidad, es prioritario para los sistemas de I+D y produccin de la regin tener
una visin prospectiva para poder alcanzar
un nuevo paso en su nivel de desarrollo.
Es prioritario que los lderes comprendan
la profundidad del cambio, los cambios tecnolgicos, econmicos, culturales y que se
promuevan las reformas y los cambios estructurales necesarios para lograr desarrollar sistemas de innovacin propios en biotecnologa. Esto permitir a la regin seguir
liderando el desarrollo de productos y procesos de base biolgica.
Las estrategias de Usuario de Biotecnologa son una posibilidad para aquellos
pases que tengan importantes industrias
agrcolas y agroindustriales, pero que carecen
de industrias productoras de insumos biolgicos. Sin embargo, pases que quieran potenciar estas ltimas y ser parte del mercado del conocimiento, se vern forzados a
acciones ms proactivas y ambiciosas.
3 Interaccin sistema acadmico y sector
privado
Hoy, la mayor parte de la infraestructura
y de las capacidades disponibles en la regin
se encuentran fuertemente orientadas a la
investigacin. Esto es fundamental para
avanzar hacia las etapas de desarrollo y posteriores, que permitan alcanzar los mercados
con productos y servicios. Estas etapas sucesivas necesitan ser practicadas y es fundamentalmente en el sector privado donde deben
articularse, contando con un sistema productivo organizado para hacer demandas al sistema cientfico. La ciencia pura es tan pertinente como la aplicada, pero en el mediano
y largo plazo la nica forma de competir seriamente es a travs de productos y servicios
innovadores.
En la nueva sociedad del conocimiento el
rol que cumplen las universidades se torna
an ms clave. Es importante que las universi-
PAGLIANO, Daniel
dades de la regin puedan analizar y canalizar lo que est pasando en pases como Estados Unidos, Inglaterra, Blgica, Canad y Australia, donde existe una fuerte integracin de
las carreras cientfico-tecnolgicas con escuelas de negocios, integrando la visin comercial al desarrollo de la ciencia y la tecnologa.
En este sentido la regin posee una excelente capacidad cientfica-tecnolgica, pero
debe complementarla con la capacidad de
gestin de la tecnologa. Se requiere, por
ejemplo, del marketing (mercadeo) para
poder vender productos fuera de la regin,
para lo cual habr que estudiar y comprender los mercados que van a recibir nuestros
productos.
Para esto, es menester lograr sinergias
entre cientficos y empresarios, y potenciar
la formacin de nuevas empresas a partir del
reconocimiento de la capacidad de la
biotecnologa de la regin.
4 Conclusiones
Para la regin es muy importante, sin
duda, continuar trabajando en el camino
emprendido, buscando forjar las alianzas estratgicas entre los mbitos pblico y privado de las bioindustrias, coordinando esfuerzos en investigacin y desarrollo hacia obje-
tivos que potencien las capacidades. De esta

forma se podrn lograr mejores parmetros
de competitividad global que permitan continuar con la creacin de emprendimientos y
puestos de trabajo altamente calificados y
as contribuir al desarrollo.
La regin tiene una gran oportunidad
generada por la globalizacin pero, para
aprovecharla, necesita entender que es indispensable involucrar a la comunidad entera y participar activamente para capturarla.
Se debe promover una cultura que favorezca a los emprendimientos y genere un
mayor grado de asociatividad entre las empresas y la capacidad cientfica, as como la
formacin de redes de capital de riesgo que
permitan la generacin de nuevos negocios.
Albert Einstein afirmaba que todos los
imperios del futuro van a ser imperios del
conocimiento, y solamente sern exitosos los
pueblos que entiendan cmo generar conocimientos y cmo protegerlos, cmo buscar
a los jvenes que tengan la capacidad para
hacerlo y asegurarse que se queden en el
pas. Los otros pases se quedarn con litorales hermosos, con iglesias, minas, con una
historia fantstica; pero probablemente no
se queden con las mismas banderas ni con
las mismas fronteras ni, mucho menos, con
un xito econmico.
23
PARTE II
Herramientas Bsicas
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26
RADICE, Silvia
II.-Captulo 1
Morfognesis in vitro
Radice, Silvia
1 Introduccin
cubri el efecto de la leche de coco como estimulante de la formacin de callo sobre el

cultivo de embriones de Datura stramonium.
Skoog y Tsui en 1948, trabajando con cultivos de callo de tabaco, demostraron la existencia de una regulacin qumica en la parte
area y en la raz. Trabajos posteriores en
callos de tabaco y con el agregado de
cinetina, la primera citocinina descubierta, fue
posible demostrar que la diferenciacin de
brotes, races o de ambos, era regulada por
el balance de auxinas/citocininas.
La embriognesis somtica y la
organognesis son dos procesos morfognicos muy frecuentes en el cultivo in vitro de
especies vegetales. La embriognesis somtica es el proceso por el cual se obtiene una
estructura similar al embrin zigtico sin que 2 Tipos de morfognesis. Definiciones
medie la fertilizacin de las gametas, mienEn condiciones de cultivo in vitro, las ctras que por organognesis pueden obtenerse tallos, races o flores. Estos rganos son lulas somticas pueden regenerar embriones
inducidos a partir de una clula o de un gru- (Fig. 1) o brotes, races y/o flores (Fig. 2) como
po de clulas que, segn las condiciones de respuesta a un determinado estmulo. La recultivo, tienen la propiedad
de mantenerse en activa divisin.
Esta totipotencialidad
celular haba sido anunciada
por Haberlandt en 1902,
quien propuso la teora de
que todas las clulas vegetales tienen la capacidad de
regenerar plantas completas. Este autor, sin embargo, no pudo demostrar su
hiptesis debido a que no
pudo lograr la divisin celular porque los medios de
cultivo que empleaba no incluan reguladores del crecimiento, an desconocidos
en ese entonces. Los avances en cultivo de tejidos fueron muy lentos en sus inicios. En 1934, White pudo
mantener en forma ilimitada el crecimiento de races
en medios lquidos a partir
de pices de tomate. Al mismo tiempo se identific el
cido indol actico (AIA),
Figura 1: A-F) Embriognesis somtica obtenida por cultivo in vitro. A, C y E)
que posibilit el manteni- Embriognesis somtica en diferentes fases de crecimiento observada en
miento indefinido in vitro Codiaeum variegatum (L) Blume cultivado en MS + 1 mg l-1 de BAP. B, D y F)
sp a partir
de callos de zanahoria y ta- Embriognesis somtica obtenida en diversos cultivares de Prunus
de embriones zigticos inmaduros cultivados en MS + 0,1 mg l-1 de ANA + 1
baco.
mg l-1 de Kin con una previa induccin en MS + 2 mg l-1 de 2,4-D. Las barras
Posteriormente se des- representan 5 mm.
27
Figura 3: Esquema de los diferentes procesos

morfognicos obtenidos a partir de la siembra in
vitro de diferentes explantes. Las lneas
continuas expresan organognesis o
embriognesis directa mientras que las lneas
quebradas indican que la morfognesis se
obtiene por va indirecta.
generacin es un proceso que comprende

diferentes fases que se suceden de manera
similar para los tres tipos de morfognesis
citadas. De Klerk y colaboradores en 1997
denominaron a estas diferentes fases como
fase de adquisicin de la competencia, fase
de induccin y fase de realizacin.
En la primera fase las clulas no responden al estmulo organognico pero adquieren esa competencia durante una fase de
desdiferenciacin. En la segunda fase o fase
de induccin, las clulas son receptivas al estmulo morfognico y hay una relacin directa entre el tipo, concentracin y combinacin
de reguladores del crecimiento agregados al
medio de cultivo y el rgano a desarrollar. En
la fase de realizacin, la clula sufre las sucesivas divisiones para formar el rgano determinado.
A partir de la siembra in vitro de diferentes explantes relativamente grandes y en
condiciones adecuadas, puede inducirse la
formacin de nuevos rganos de manera directa sin la formacin de callo. Si la forma-
cin es de brotes, races o flores se denomina organognesis directa. Si en cambio se

induce la formacin de embriones somticos,
este proceso se denominar embriognesis
directa (Fig. 1 y Fig. 3). Si por el contrario, a
partir de la siembra de un explante in vitro
se observa la proliferacin de clulas en forma desordenada y sin ninguna funcin predeterminada, se iniciar la produccin
de callos o suspensiones celulares (Fig.
2 A y Fig. 3). La diferenciacin de rganos a partir de callos o morfognesis
indirecta, estar condicionada a la previa formacin de los meristemoides. La
denominacin de morfognesis directa o indirecta fue descripta por primera vez por Hicks en 1980.
Figura 2: A-E) Organognesis somtica obtenida
por cultivo in vitro. A) Callo organognico
obtenido en Abelia sp. (Andr) Rehder cultivada
en MS + 1 mg l-1 de picloran. B) Inicio de brotes
(flechas) en hojas crecidas in vitro de Crimson
Gold (Prunus persica L.) cultivadas en MS + 0,1
mg l-1 de ANA + 1 mg l-1 de Kin. C) Brotes de
Gerbera jamesonii Bolus obtenidos a partir del
cultivo de captulos florales en MS 0,05 mg l-1 de
IBA + 0.75 mg l-1 de BAP + 0,1 mg l-1 de GA3. D)
Brotes florecidos in vitro de Abelia sp. (Andr)
Rehder cultivados en MS + 1 mg l-1 de BAP. E)
Races (flechas) crecidas de callo de Abelia sp.
(Andr) Rehder cultivadas en inducidas en MS + 1
mg l-1 de 2iP, previamente inducidas con 1 mg l-1
de picloran. Las barras representan 5 mm.
28
RADICE, Silvia
3 Histologa de la morfognesis
Despus de 48 horas de realizada la siembra del explante en el medio de cultivo adecuado, a partir de una clula epidrmica o del
mesfilo foliar, como ocurre en las conferas,
se suceden una serie de divisiones mitticas.
As se pueden observar, a travs del estudio
histolgico, pequeas masas de clulas que
contienen un citoplasma denso y grandes
nuclolos. Este conjunto de clulas agrupadas a modo de esferas fueron denominadas
meristemoides por Torrey en 1966, y son los
responsables de la diferenciacin de los nuevos rganos. Este tipo de meristema puede
iniciarse en forma directa a partir de clulas
diferenciadas, pertenecientes a un explante
cultivado in vitro o, indirectamente, a partir
de una clula o grupo de clulas diferenciadas que promueven la proliferacin celular
(Fig. 4 A). Su evolucin determinar el crecimiento de un rgano como, por ejemplo,
una yema adventicia (Fig. 4 B).
Las clulas embriognicas son similares a
las clulas meristemticas debido a que no
son demasiado voluminosas, tienen gran cantidad de ribosomas, citoplasma denso, un
nuclolo agrandado y pequeos granos de
almidn. Estas clulas en general se agrupan
y pueden variar en tamao y nmero. Dentro de un grupo de clulas embriognicas, el
desarrollo de las mismas no est sincroniza-
do. Estas clulas son capaces de dividirse o

de transformarse en embriones segn las
condiciones del medio de cultivo. Seguidamente, las clulas que no desarrollan
proembriones comienzan el proceso de diferenciacin, es decir, se vacuolizan, disminuye
el volumen de ncleo y nuclolo y desaparecen los grnulos de almidn.
Las experiencias demuestran que las clulas embriognicas se desarrollan slo cuando se modifican las condiciones de cultivo.
En general ocurren cuando se reducen las
cantidades de auxina y citocinina o cuando
se elimina la auxina.
Las clulas embriognicas desarrollan
como embriones cuando las condiciones experimentales permiten que stas expresen
su potencial. Pueden ocurrir dos situaciones
ontognicas diferentes, es decir que su origen sea unicelular o pluricelular. En el caso de
iniciarse a partir de una clula, ocurre que estas clulas embriognicas se aslan unas de
otras por una importante modificacin en su
pared celular, en particular por la gelificacin
de la laminilla media. Esta clula, que est
rodeada por un polisacrido mucilaginoso,
sufre divisiones polarizadas formando un
embrin globular, en donde pueden diferenciarse deposiciones de almidn en una etapa previa a la polarizacin de este proembrin. Luego ocurre la formacin de la epidermis y adquiere la simetra bilateral. Sucesivamente se observa el crecimiento de uno
o ms cotiledones, el desarrollo de los tejidos provasculares, la iniciacin de los pices
radicales y de tallo y una progresiva acumulacin de sustancias del tipo almidn, lpidos
y protenas.
En el caso de que los embriones somticos se originen de un grupo de clulas pueFigura 4: A-E) Cortes histolgicos de diferentes
explantes cultivados in vitro. A) Meristemoides
(flechas) observados en cultivo de Silybum
marianum L. en MS + 1 mg l-1 de AIA + 5 mg l-1 de
BAP 10 x. B) yemas adventicias (flechas) en pices
de Fragaria x ananassa Duch. cultivados en Boxus
+ 0,1 mg l-1 de IBA + 0.5 mg l-1 de BAP + 0,1 mg l-1 de
GA3 4 x. C) grupo de clulas embriognicas
(flechas) en Codiaeum variegatum (L) Blume
cultivados en 1 mg l-1 de tidiazurn. 20 x. D)
Embriones somticos en Codiaeum variegatum (L)
Blume cultivados en 1 mg l-1 de tidiazurn 10 x. E)
Embriognesis secundaria en Codiaeum
variegatum (L) Blume cultivados en 1 mg l-1 de
tidiazurn 10 x.
29
den observarse diversos patrones. Los embriones somticos se forman a partir de grupos de clulas epidrmicas y subepidrmicas
(Fig. 4 C). Este tipo de ontogenia de origen
multicelular se llama comnmente budding
o embriognesis adventicia. Estas clulas
pequeas tienen una alta relacin ncleo/
citoplasma, un denso citoplasma y un
nuclolo voluminoso y teido. Se diferencian
de las clulas embriognicas por la falta de
sustancias de reserva, por su delgada pared
celular y su frecuente divisin celular. Estas
estructuras pueden ser denominadas como
proembriones globulares (Fig. 1 A y B). En una
etapa posterior, desarrollan una epidermis,
un tejido provascular, acumulan material de
reserva y tambin sufren la polarizacin. Estas estructuras globulares producen cotiledones y se transforman en embriones somticos
con la formacin de pices de tallo y raz.
Para una misma especie puede ocurrir uno
u otro tipo de inicio segn las condiciones de
cultivo. El desarrollo de un embrin somtico de origen unicelular es comparable a la de
un embrin zigtico. En dicotiledneas, la
etapa globular es seguida por una etapa corazn que se corresponde con la adquisicin
de la simetra bilateral: desarrollo de la epidermis, de los estratos procambiales y, de
manera sucesiva, el desarrollo del pice radical. El pice de tallo se desarrolla ms tarde
en la etapa de cotiledonar. En los embriones somticos de algunas especies hay una
etapa intermedia entre la globular y corazn
llamada oblonga, que corresponde a la individualizacin del pice de la raz y al
procambium en respuesta a la elongacin
axial del embrin somtico debido al transporte de auxinas (Fig. 1 C).
Los embriones de origen multicelular obtenidos por budding muestran la misma
ontogenia que los zigticos, as como tambin la produccin de sustancias de reserva.
Sin el seguimiento histolgico detallado,
la formacin del embrin somtico slo puede ser confirmado por la germinacin (Fig. 1
F). Sin embargo debido al bajo porcentaje
de embriones que llegan a esta etapa, esta
tarea es casi imprescindible para una correcta evaluacin de las respuestas encontradas
con los diversos medios de cultivo empleados.
Los embriones somticos, comparados
con los embriones zigticos de la misma es-
30
pecie, frecuentemente desarrollan de manera anormal o son inmaduros. La anomala

ms frecuente es la formacin doble o triple
del sistema vascular, causada por la pobre
polarizacin del transporte de auxinas. Tambin se puede encontrar un contenido excesivamente alto, reducido o ausente de las
reservas de almidn y/o proteicas, que el
meristema apical o radical no estn desarrollados o que la embriognesis sea repetitiva
o secundaria (Fig. 4 E).
La falta del meristema apical o de una
escasa deposicin de sustancias lipoproteicas
observada en los embriones somticos de
algunas especies, no debe ser tomada como
una anormalidad sino que puede ser sntoma de inmadurez debido a la rpida formacin de los mismos. En este caso una etapa
intermedia que permita la maduracin de las
estructuras formadas permitir incrementar
el porcentaje de embriones somticos capaces de germinar.
4 Factores que afectan los procesos
morfognicos
Los cuatro factores principales que condicionan la obtencin y el crecimiento de nuevos rganos en condiciones in vitro son:
el genotipo
las condiciones qumicas seleccionadas
para realizar el cultivo
las condiciones fsicas seleccionadas para
realizar el cultivo
el explante
El genotipo es un factor determinante
en todos los procesos morfognicos desde
la capacidad del explante para su establecimiento en condiciones in vitro as como tambin para la proliferacin de callo, o la diferenciacin y crecimiento de nuevos rganos.
Por esta causa, no es posible generalizar
metodologas o protocolos de trabajo debido a que los medios de cultivo como las condiciones de cultivo seleccionados, deben ser
especficos para cada situacin en particular.
Un ejemplo de ello es el protocolo empleado por Stamp y Meredith en diferentes
cultivares de Vitis vinifera. En cuatro de ellos
fue posible la obtencin de embriones
somticos a partir de embriones zigticos,
pero estos resultados no se repitieron con el
cultivar Pinot Noir.
RADICE, Silvia
Varios son los compuestos qumicos que

influyen en los patrones morfognicos in
vitro dentro de los cuales podemos considerar:
1. La composicin salina del medio de
cultivo. La composicin salina ms empleada para inducir la formacin de callo, la
organognesis directa o indirecta en la mayora de las especies vegetales, es la de
Murashige & Skoog (1962) (MS). Sin embargo, existen otras formulaciones diseadas
para inducir determinados patrones
morfognicos. Existe, adems, una estrecha
relacin entre la composicin hormonal del
explante y la concentracin de reguladores
del crecimiento agregada al medio de cultivo.
2. Reguladores del crecimiento. Estos
compuestos pueden promover la morfognesis aun cuando la concentracin salina no
sea la adecuada. En condiciones ptimas de
cultivo pueden incrementar significativamente la diferenciacin de rganos. En muchas
de las especies vegetales, para la induccin
de embriones somticos, es necesario el agregado de auxinas como ocurre en Tilia spp.;
sin embargo, para otras, como es el caso del
crotn (Codiaeum variegatum), es suficiente con el agregado de thidiazurn. El
genotipo y el tipo y concentracin de reguladores del crecimiento empleados estn estrechamente relacionados.
3. Antibiticos. En procesos de transformacin es muy comn el agregado de
antibiticos del tipo cefotaxime, kanamicina
y carbenicilina para la eliminacin de
Agrobacterium tumefaciens. En explantes
de hoja de diferentes cultivares de Malus domestica se ha encontrado que 250 mg. L1
de cefotaxime aumentan significativamente
la regeneracin de brotes mientras que 500
mg. L1 de carbenicilina promueven la formacin de callo y la kanamicina inhibe los procesos morfognicos.
4. Carbn activado. En general se usa
para absorber compuestos txicos de la
microatmsfera gaseosa o el exceso de reguladores del crecimiento presentes en el medio de cultivo. E.K. Pettersson y su equipo de
colaboradores de la Swedish University of
Agriculture, Suecia, demostraron que este
compuesto puede promover la embriognesis somtica debido a ciertos compuestos que
se incorporan por difusin al medio de cultivo.

5. Agar. Otro aspecto importante a tener en cuenta es la consistencia del medio
de cultivo. Puede emplearse como semislido
o lquido. El agente gelificante ms empleado en el cultivo in vitro es el agar extrado
de diversas algas marinas. Las diferentes calidades existentes en el mercado modifican la
expresin morfognica debido a que pueden
contener sustancias inhibitorias o promotoras del crecimiento. Tal es el caso del cultivo
de hojas de Actinidia chinensis, cultivadas
en una solucin de MS con el agregado de
0,1 mg.L-1 de AIA + 1 mg.L-1 de BAP, donde
se observ una respuesta morfognica diversa segn el tipo de agar seleccionado. Por
ejemplo, cuando el gelificante empleado fue
Chubut-agar, de produccin nacional, se observ una gran diferenciacin de yemas adventicias, mientras que con el agregado de
agar SIGMA R slo se indujo la proliferacin
de callo.
En caso de seleccionar medios de cultivo
lquidos, la respuesta morfognica observada vara de manera considerable. El cultivo
lquido es imprescindible cuando se busca
promover la morfognesis indirecta a travs
de suspensiones celulares. Para ello es necesario cultivar los callos en medio lquido con
agitacin para permitir que las clulas se disgreguen y puedan diferenciar races, brotes
o embriones somticos en forma aislada.
La seleccin del medio de cultivo lquido
o slido depende, adems, de la especie
empleada. En Cymbidium spp, por ejemplo,
se ha observado que el empleo de medio de
cultivo lquido promueve una mayor diferenciacin de protocormos respecto del mismo
medio gelificado. A su vez, este proceso puede mantenerse durante varios subcultivos
mientras que en medio de cultivo gelificado
se observ que los protocormos tienden a
formar tallos.
6. Atmsfera gaseosa. Es un factor determinante en los procesos morfognicos y
est condicionada por el tipo y tamao de
envase seleccionado as como tambin el sistema de cobertura del mismo. Las tapas usadas en cultivo in vitro varan desde el tapn
de algodn, papel de aluminio, pelcula de
resinite transparente o tapas rgidas de
polipropileno. El intercambio gaseoso es di-
31
ferente para cada tipo de tapa; en consecuencia, la atmsfera interna tambin sufrir variaciones.
En condiciones in vivo la atmsfera contiene 78 % de nitrgeno; 21 % de oxgeno y
0,035 % de dixido de carbono. En cultivos
in vitro se han registrado, adems, etileno y
otros compuestos hidrocarbonados.
El nivel de oxgeno disponible para el
explante condiciona el crecimiento y los procesos morfognicos. En general se necesita
una buena aireacin para obtener cualquier
tipo de proceso morfognico. En alfalfa se
puede obtener un buen incremento de material a partir de suspensiones celulares
embriognicas cuando la solucin se satura
con 70% de oxgeno en la solucin. Por el
contrario, una tensin de oxgeno del 5 %
estimula la produccin de plantas a partir de
anteras de tabaco.
La concentracin de dixido de carbono
(CO2) en la atmsfera gaseosa in vitro vara
segn la respiracin y la actividad
fotosinttica de las plantas. En condiciones
de oscuridad, el CO2 se incrementa mientras
que, en condiciones de luz disminuye. En trabajos realizados con Ficus lyrata se han encontrado concentraciones variables que van
del 0,5 al 8,5 %, segn el tipo de sello o tapa
empleados. Estas concentraciones superiores
a 1 %, generalmente txicas para las condiciones in vivo, probablemente no son
limitantes para la actividad fotosinttica.
La presencia de etileno en condiciones in
vitro promueve diversas respuestas. Para el
cultivo de clulas, callos y anteras, su acumulacin tiene efectos inhibitorios. La cantidad
de etileno producida in vitro vara con la especie, el tipo de explante, la concentracin
de citocininas en el medio de cultivo, el tipo
de agar seleccionado y con la luz. Una forma
de incorporar etileno al envase de cultivo es
a travs de la esterilizacin del material de
diseccin realizada con el material embebido en alcohol y flameado con mechero
Bunsen. En muchos casos, el etileno acta
como promotor de la morfognesis, pero luego es inhibitorio del crecimiento de los rganos diferenciados.
Entre las condiciones fsicas podemos

mencionar los efectos de la temperatura, la
humedad relativa y la luz.
32
1. La temperatura de incubacin de los

cultivos es un factor importante a tener en
cuenta. Si bien en las condiciones naturales
de cultivo las plantas tienen diferencias trmicas durante el da y la noche, las temperaturas in vitro se mantienen casi estables. Es
importante sealar que cuanto ms se asemejen las condiciones in vitro a las ptimas
de crecimiento de la especie estudiada, mayor ser la respuesta esperada. En cultivos de
hojas de Streptocarpus x hybridus sometidos a diferentes temperaturas, se observ
que la regeneracin mayor de brotes se obtuvo a 12 C, mientras que por encima de los
30 C casi no hubo diferenciacin.
2. La humedad relativa (HR) como medida de la cantidad de vapor de agua contenida en la atmsfera gaseosa, es otro de los
parmetros fsicos a tener en cuenta. La HR
depender del sello o cobertura del envase
empleado. Si este cierre es hermtico, la humedad interior ser del 100 %. Si existe la
posibilidad de un intercambio gaseoso, la
humedad interna puede descender a niveles
cercanos al 50 %. Este importante descenso
del contenido de HR puede promover una
prdida veloz de agua del medio de cultivo,
variando la concentracin de sus compuestos hasta llegar a niveles txicos (Debergh,
comunicacin personal).
3. La luz suministrada a los cultivos debe
ser evaluada en cuanto a la calidad, intensidad y perodo de suministro. La respuesta
morfognica de un explante puede variar
segn se le proporcione luz o no. Para estimular la formacin de callo es comn que se
prefiera la oscuridad. El suministro de luz favorece la diferenciacin de rganos.
Tal como ya se seal anteriormente, los
procesos morfognicos dependen del
genotipo seleccionado, pero, adems, debe
sumarse el efecto del explante seleccionado.
El tratamiento de la planta madre, las condiciones fsicas y fisiolgicas en las que sta se
encuentre y el sector del cual se tome el
explante determinarn a su vez la respuesta
morfognica en condiciones in vitro. Un
ejemplo muy interesante es la diferente respuesta morfognica observada sobre hojas
de Camellia japonica cultivadas en un mismo medio de cultivo, segn la porcin de la
lmina que se cultive. Estos resultados fueron obtenidos por Pedroso y Pais (1993) des-
RADICE, Silvia
pus de seis semanas de cultivo in vitro previa inmersin del explante en una solucin
de IBA (1 mg l1) durante 20 minutos (Fig. 5).
5 Lecturas recomendadas
BUDDENDORF-JOOSTEN, J.M.C. and WOLTERING, E.J.
1994. Components of the gaseous environment and their
effects on plant growth and development in vitro. Plant
Growth Regulation 15: 1-16.
DE KLERK, G.J., Arnholdt-Schmitt B., Lieberei R. and
Neumann K.H. 1997. Regeneration of roots, shoots and
embryos: physiological, biochemical and molecular
aspects. Biologia Plantarum 39 (1): 53-66.
GEORGE, E. 1993. Plant propagation by tissue culture
Part 1 The technology. Butler and Tanner Ltd (ed). Gran
Bretaa. 1361pp.
Figura 5: Esquema de las diferentes respuestas

morfognicas obtenidas despus de seis semanas de
cultivo in vitro de hojas de Camellia japonica L. segn
la porcin de la lmina cultivada. 1. organognesis
indirecta, 2. embriognesis somtica directa, 3.
regeneracin directa de races, 4. callo organognico.
HICKS, G.S. 1980. Patterns of organ development in plant

tissue culture and the problem of organ determination.
Bot. Rev. 46: 1-23.
WILLIAMS, E.G. and MAHESWARAN, G. 1986. Somatic
embryogenic factors influencing coordinated behavior
of cells as an embryogenic group. Ann. Bot. 57: 443-597.
33
II.-Captulo 2
Establecimiento de cultivos de tejidos
vegetales
Mroginski, Luis; Sansberro, Pedro;
Flaschland, Eduardo
1 Introduccin
El cultivo de tejidos en su acepcin amplia puede ser definido como un conjunto
muy heterogneo de tcnicas que presentan
en comn el hecho de que un explante (una
parte separada del vegetal que pueden ser
protoplastos clulas desprovistas de pared
celular clulas, tejidos u rganos) se cultiva
aspticamente en un medio artificial de composicin qumica definida y se incuba en condiciones ambientales controladas. La imprecisin de esta definicin puede generar muchas polmicas, pero es actualmente aceptada.
Generalmente es comn dividir las tcnicas del cultivo de tejidos en dos grandes grupos: a) cultivos en medios semislidos y b)
cultivos en medios lquidos, los que a su vez
pueden ser agitados (mediante el empleo
de agitadores de uso continuo) o estacionarios. Tambin es frecuente dividir al cultivo
de tejidos atendiendo a los niveles de complejidad en cultivo de rganos, cultivos celulares y cultivo de protoplastos. Para el establecimiento de los cultivos utilizando cualquiera de los sistemas es necesario tener en cuenta algunos aspectos generales comunes relacionados con el explante, la asepsia, el medio de cultivo y las condiciones de incubacin.
La discusin de estos aspectos constituye el
objetivo de este captulo. Adicionalmente se
incluye el tema de la aclimatacin de las plantas regeneradas in vitro, que es de gran importancia en la mayora de las aplicaciones
del cultivo de tejidos en la agricultura.
2 Explante
Varios factores deben ser tenidos en cuenta en la eleccin del explante apropiado para
el establecimiento de los cultivos in vitro,
entre ellos:
1. Objetivo del cultivo: si bien es difcil tratar de clasificar las aplicaciones que se persiguen con el cultivo de tejidos, se podra
esquematizarlas en aplicaciones para:
Estudios bsicos. En este caso, los

explantes cultivados pueden ser diversos. Si
lo nico que se quiere lograr es un sistema
de callos para estudiar algn proceso fisiolgico, se puede cultivar cualquier rgano, tejido o clula viva. En este caso en que lo nico que se busca es la induccin de callos lo
ideal es cultivar explantes jvenes, derivados
de semillas en germinacin, donde se obtienen respuestas rpidas y, en general, hay
menores problemas de contaminacin con
microorganismos.
A veces se hace uso del cultivo de tejidos
porque representa un sistema experimental
que simplifica la complejidad generada por
los fenmenos de correlacin entre las distintas partes que normalmente estn presentes en una planta entera. El explante que se
usar estar condicionado por lo que se quiere estudiar. Un buen ejemplo lo constituye el
cultivo de ovarios fecundados del tomate
para estudiar los requerimientos nutricionales
durante el crecimiento de los frutos. Asimismo, el cultivo de vulos ha sido muy til para
estudiar aspectos relacionados con la formacin de las fibras en algodn. El cultivo de
discos de tallos brind una valiosa ayuda para
estudiar la rizognesis in vitro.
Obtencin de plantas con sanidad
controlada. Es muy comn la utilizacin del
cultivo de tejidos para la obtencin de plantas libres de virus (ver VIII.-9). El explante ideal
para ello es el meristema (dependiendo de
la especie, de 0,2-0,5mm de longitud) consistente del domo y de un par de primordios
foliares.
Micropropagacin. En este caso depender del sistema que se quiere utilizar. Si
lo que se quiere explotar es la brotacin de
meristemas, los pices terminales y los segmentos uninodales de ramas jvenes constituyen excelentes explantes. En este caso el
cultivador de tejidos debe conocer perfectamente la biologa de la reproduccin de la
planta para aprovechar aquellos explantes
que en forma natural son propgulos.
En cambio, si se pretende micropropagar
mediante el empleo de semillas sintticas (ver
35
V.-2) el explante original deber posibilitar la

induccin de la embriognesis somtica. En
este caso, la utilizacin de embriones zigticos
inmaduros u hojas, suelen ser frecuentes
como explantes.
Obtencin de hbridos interespecficos. Una de las primeras aplicaciones del
cultivo de tejidos en la agricultura lo constituy su empleo como ayuda para la obtencin de hbridos derivados de cruzamientos
interespecficos, donde se produce el aborto
temprano de embriones. En estos casos, el
explante cultivado es el embrin cigtico en
estadios tempranos de su desarrollo. Con la
misma finalidad tambin se utilizan ovarios
u vulos fecundados.
Obtencin de plantas de semillas con
embriones rudimentarios. Para esta finalidad los explantes pueden ser semillas (por
ej. orqudeas) o bien, se aslan los embriones
en un estado temprano de desarrollo (corazn) como en el caso de yerba mate o de
algunas variedades de duraznero.
Obtencin de plantas haploides (considerando como haploide a un esporofito que
contiene el complemento gamtico de
cromosomas). En este caso, los explantes
ms utilizados son las anteras, aunque tambin pueden emplearse microsporas aisladas,
vulos y ovarios no fertilizados.
Induccin de variacin somaclonal. En
este caso se pueden utilizar varios explantes,
pero si la finalidad de su utilizacin es la aplicacin en planes de mejoramiento gentico
de plantas, los explantes utilizados deben
posibilitar la regeneracin de plantas enteras.
Produccin y/o conversin de sustancias tiles. Se puede utilizar una gran variedad de explantes. Explantes de races suelen
ser muy utilizados.
Obtencin de hbridos somticos.
Para esta finalidad se recurre a la fusin de
protoplastos. En la mayora de los casos se
aslan los protoplastos de mesfilos de hojas y de suspensiones celulares.
Conservacin e intercambio de
germoplasma. Los meristemas son los
explantes preferidos para el desarrollo de sistemas de conservacin a mediano y largo
plazo (cro- conservacin con nitrgeno lquido) y para el intercambio de material
gentico.
36
Establecimiento de suspensiones celulares. En este caso se recomienda iniciar los

cultivos a partir de explantes extrados de
semillas en germinacin (hipoctilo, epictilo,
cotiledones, races).
2. Posibilidad de contaminacin con
microorganismos. De ser posible, se deben
cultivar explantes de plantas dadoras que
crecen en condiciones de invernadero, con
ello se reduce sustancialmente las tasas de
contaminacin. Por otra parte, es recomendable evitar el uso de explantes sucios (races, rizomas) que provienen de plantas crecidas en macetas o en el campo, dado que en
la mayora de los casos no es posible conseguir una buena desinfeccin de los mismos.
3. Edad fisiolgica. Este es un aspecto de
gran influencia en la morfognesis. Como
regla general se puede decir que cuando ms
joven e indiferenciado se encuentre el
explante a cultivar, mejor ser su respuesta
in vitro. Es por ello que los meristemas
apicales y axilares son ampliamente usados
en numerosas especies. En el caso de la
micropropagacin de plantas leosas, la
edad del explante es un factor crtico. Si los
tejidos son jvenes, la micropropagacin tiene mayores posibilidades de ser exitosa que
con tejidos maduros. Este hecho genera la
necesidad de realizar tratamientos de rejuvenecimiento de las plantas dadoras de
explantes.
4. Tamao. En general, cuanto ms grande sea el explante mayores sern las posibilidades de inducir la proliferacin de callos o la
regeneracin directa de rganos. Sin embargo, a mayor tamao de explante tambin
son mayores las probabilidades de que los
cultivos se contaminen con microorganismos.
Tambin es necesario tener en cuenta que
existe un tamao mnimo del explante, que
depende de la especie y del material vegetal, por debajo del cual no es fcil lograr el
establecimiento de los cultivos. Los explantes
muy pequeos suelen requerir del empleo de
medios ms complejos o de los denominados medios acondicionados.
5. Epoca del ao. Es un factor que suele
tener mucha importancia en la micropropa-
MROGINSKI, Luis; SANSBERRO, Pedro; FLASCHLAND, Eduardo
gacin y que generalmente est asociado al

grado de dormicin que presentan ciertos
explantes (yemas, por ejemplo) y tambin
con la posibilidad de mayor o menor proliferacin de microorganismos.
3 Asepsia
Uno de los principales problemas que se
presentan cuando se tratan de establecer los
cultivos es el de la contaminacin de los mismos con diversos tipos de microorganismos
(hongos, levaduras, bacterias, fitoplasmas,
virus). El ambiente generado por explantemedio de cultivo-condiciones fsicas de
incubacin es altamente propicio para la proliferacin
de
muchos
de
estos
microorganismos que pueden provocar la
destruccin de los cultivos. Es difcil cuantificar el impacto de estas prdidas, pero en
promedio, en laboratorios dedicados a la
micropropagacin se lo puede estimar en alrededor del 10%. En el mejor de los casos,
estos microorganismos no destruyen los cultivos pero compiten con el explante por los
nutrientes del medio de cultivo o bien lo
modifican. Es muy difcil conseguir cultivos
estrictamente aspticos dado que en la mayora de los casos es altamente probable que
los mismos contengan virus y fitoplasmas, por
lo que en la prctica, cuando se refiere a cultivos aspticos, en general se quiere significar que son cultivos donde no se produce la
proliferacin de hongos y bacterias.
Dos son las fuentes de contaminaciones:
a) microorganismos presentes en el interior
o en la superficie de los explantes y b) fallas
en los procedimientos de cultivo en el laboratorio. La correcta deteccin de estas fuentes y del tipo de microorganismo son aspectos importantes para el xito de los cultivos,
pues por un lado ayuda a determinar la fuente de contaminacin y por otro lado, ayuda
a la planificacin de los procedimientos para
controlarlos. Varios gneros de bacterias
(Pseudomonas, Xanthomonas, Erwinia,
Enterobacter, Agrobacterium, Bacillus,
Micrococcus, Staphylococcus, Lactobacillus,
Mycobacterium, Corynebacterium) y de
hongos
filamentosos
(Aspergillus,
Penicilium,
Fusarium,
Alternaria,
Cladosporium y Neurospora) estn frecuentemente en los cultivos . Es conveniente ins-
peccionar visualmente con la ayuda de un

microscopio estereoscpico los cultivos en
forma peridica (por lo menos semanalmente). Tambin se pueden realizar pruebas con
medios de cultivo diferenciales y test
bioqumicos especficos.
Para evitar y/o minimizar las contaminaciones de los cultivos con microorganismos
es necesario:
1) Conocer el material vegetal con que se
trabaja y los posibles contaminantes especficos.
2) Realizar una adecuada preparacin de
la planta dadora de explantes, cultivndola
preferentemente en invernaderos tratadas
con productos qumicos que eliminen
patgenos y eventuales microorganismos
endfitos.
3) Proceder a la desinfeccin superficial de
los explantes mediante el uso de compuestos qumicos con el objeto de eliminar los
microorganismos con el menor dao posible
para el explante. Si bien no es posible recomendar un procedimiento general, se puede sealar que el procedimiento ms popularizado consiste en una doble desinfeccin
mediante la inmersin de los explantes en
etanol (70%v/v) durante 20-60 segundos seguido de hipoclorito de sodio 1 -3%, contenido en el agua de lavandina comercial, durante 3 a 30 minutos, dependiendo de la naturaleza del explante. Algunos procedimientos
se basan en el empleo de nicamente etanol
o de hipoclorito de sodio. Finalmente, es
necesario eliminar los restos de estos productos mediante varios lavados con agua destilada estril.
En este ltimo punto hay que aconsejar
que se utilice agua destilada estril de reciente preparacin, dado que est demostrado
que el almacenaje prolongado del agua estril puede ser la causa de contaminaciones
con bacterias. Es aconsejable realizar estas
operaciones de desinfeccin superficial en
una cmara de transferencia con aire estril.
En lugar del hipoclorito de sodio se puede utilizar hipoclorito de calcio (6 -12 %) o el
cloruro de mercurio (0,1-1,5%). Es preciso recomendar extrema cautela con el empleo
de este ltimo compuesto, dado que es altamente txico y adems no es removido con
facilidad del explante.
37
En los casos en que no se utilice etanol, la

adicin de agentes tensoactivos junto con el
desinfectante es una prctica recomendada.
Entre los ms usados figuran Tween-20 (0,01
0,1%) o unas gotas de Triton. El lavado previo de los explantes con agua corriente y
detergentes, ayuda a una mejor desinfeccin.
La inmersin de los explantes en soluciones conteniendo sustancias antibiticas y /o
antimicticas (gentamicina, sulfato de
estreptomicina, ampicilina, tetraciclina,
carbenicilina, sulfato de gentamicina,
pentacloronitrobenceno, rifampicina,
anfotericina B, benomil, carbendazim) puede ser de utilidad, pero deben ser utilizados
en casos excepcionales. Estos productos tienen el inconveniente de que alteran la composicin de los medios de cultivo y adems
pueden ser metabolizados por los explantes.
Ultimamente han aparecido soluciones
biocidas que matan bacterias y hongos, previenen la germinacin de esporas y a altas
concentraciones pueden eliminar contaminaciones de microorganismos endfitos. Uno
de estos compuestos es el PPM (Plant
Preservative Mixture). Otro ejemplo es el
denominado G-1, un compuesto derivado de
los furfurales de la caa de azcar. Este compuesto, qumicamente: 1-(5-bromofur-2-il)-2bromo-2-nitroeteno fue desarrollado en la
Universidad Central de las Villas (Cuba) y tiene efecto bactericida y fungicida de amplio
espectro.
En los casos en que se utilicen plntulas
crecidas in vitro como plantas dadoras de
explantes, es necesario desinfectar las semillas para su cultivo y germinacin y luego es
aconsejable desinfectar tambin las plntulas
resultantes.
En algunos materiales vegetales se utiliza
la preincubacin de los explantes mediante
lo cual stos son desinfectados suavemente
y precultivados durante 24 horas en un medio conteniendo sacarosa, y finalmente son
desinfectados nuevamente y cultivados.
4) Emplear medios e instrumentos de cultivo esterilizados, es decir, liberados completamente de cualquier microorganismo vivo o
esporas. Para la esterilizacin, en la mayora
de los casos se hace uso del calor en sus diversas formas: llama directa, calor hmedo
(en forma de vapor abierto o bajo presin),
calor seco (aire caliente). Se pueden usar hor-
38
nos a microondas. El agua caliente tambin

puede ser usada. En el caso de sustancias
termolbiles, la esterilizacin se puede hacer
mediante filtracin a travs de filtros
bacteriolgicos.
No es posible recomendar ningn sistema de esterilizacin dado que la exitosa destruccin de los microorganismos depende de
mltiples factores entre los que interesan el
tamao del recipiente, el tiempo de esterilizacin y la naturaleza de la sustancia a esterilizar. Sin embargo, se pueden dar algunas
sugerencias:
La esterilizacin en estufas mediante
calor seco (aire caliente) es recomendable
para esterilizar recipientes de vidrios secos
(pipetas, cpsulas de Petri, tubos). En estos
casos, 2-4 horas en estufas a 180-200 C brindan excelentes resultados.
La esterilizacin con calor hmedo con
vapor bajo presin (en autoclave o en una
olla a presin), es el procedimiento ms
empleado para la esterilizacin de los medios
de cultivo (salvo, como se indic ms arriba,
para aquellos que posean componentes
termolbiles). En este caso, lo ms comn es
usar una presin de 1.46 kg.cm-2 durante 20
minutos, con lo que prcticamente se destruyen todas las formas de vida. Es importante que en todos los puntos del autoclave
se alcance dicha temperatura, para lo cual
hay disponibles cintas detectoras colorimtricas.
5) Cultivar los explantes en una cmara de
transferencia con aire estril (gabinete de
flujo laminar), localizada en un ambiente limpio y no expuesta a corrientes de aire. De no
disponer este equipamiento, se pueden sustituir con cuartos esterilizados previamente
con luz ultravioleta (nunca exponerse a la luz
UV en forma directa). La mesada de trabajo
y las paredes del gabinete deben ser desinfectadas previamente con etanol al 70%. De
la misma manera deben ser desinfectados
exteriormente todos los recipientes (conteniendo medios de cultivo, agua, etc.) que ingresen en el rea del aire estril.
Los operarios constituyen frecuentemente una importante fuente primaria de contaminacin, por lo que es recomendable que,
antes de comenzar a trabajar laven sus manos y antebrazos con abundante agua y jabn y se desinfecten con etanol al 70 %. La
utilizacin de guardapolvos, guantes y mscaras protectoras de la boca y de la nariz, as

como los gorros protectores de los cabellos,
ayudan a reducir sensiblemente los niveles de
contaminacin.
Los instrumentos de trabajo (pinzas,
pipetas, tijeras, agujas, cpsulas de Petri)
deben ser esterilizados antes de su uso. Muchos de estos instrumentos pueden ser colocados en etanol al 95% y, antes de ser usados, se deben flamear cuidadosamente en
la llama de un mechero. Tambin es necesario flamear la boca de los recipientes que contienen los medios de cultivo antes y despus
de cultivar el explante.
6) Incubar los cultivos en cmaras o cuartos de cultivo, cerrados, libres de corrientes
de aire y bien higienizados. En lo posible se
debe restringir la circulacin de personas, y
los recipientes con cultivos contaminados
deben ser rpidamente eliminados de este
sector. Es conveniente que antes del lavado,
estos cultivos sean esterilizados.
4 Medios de cultivo
Un medio de cultivo puede ser definido
como una formulacin de sales inorgnicas y
compuestos orgnicos requeridos para la
nutricin y manipulacin de los cultivos. Existen numerosas formulaciones, cada una de
las cuales comprende entre 6 y 40 compuestos. Para dar una idea de la cantidad de
formulaciones disponibles, George y col., luego de revisar ms de 3.000 trabajos cientficos describen en dos tomos (casi 1.000 pginas en total) ms de 2.000 medios de cultivo. Tambin dos empresas multinacionales
ofrecen para la venta ms de 60 medios cada
una, listos para su utilizacin especialmente
en la micropropagacin comercial de plantas.
En la Tabla 1 se presentan tres medios que
son muy usados en la actualidad.
Bsicamente, los medios de cultivo se
componen de:
Una fuente de carbono
Nutrientes minerales
Sustancias vitamnicas
Sustancias reguladoras del crecimiento
Agente gelificante (en el caso de medios semislidos)
Otros compuestos
Fuente de carbono: Prcticamente todos

los cultivos son hetertrofos (comparativamente unos pocos son auttrofos) y por
ende necesitan del suministro de una fuente
de carbono. La sacarosa, en concentraciones
de 2 al 5%, es el azcar ms utilizado. En
algunos medios se la reemplaza por glucosa.
En casos particulares se cita el empleo de
maltosa o galactosa. Tambin myo-inositol
(100 Mg/L) suele ser incorporado a los medios resultando un mejor crecimiento de los
cultivos.
Nutrientes minerales: Los medios de cultivo deben suministrar los macro y micronutrientes esenciales para el crecimiento de
las plantas enteras. En general se destacan
las concentraciones relativamente altas de
nitrgeno y potasio. El nitrgeno es suministrado en forma de amonio y/o nitrato. Tambin se pueden utilizar urea, glutamina y casena hidrolizada. Es fundamental que el hierro sea incorporado conjuntamente con un
agente quelante (Na2EDTA), lo que lo hace
disponible en un amplio rango de pH.
Sustancias vitamnicas: De todas las que
comnmente se incorporan a los medios,
pareciera que la tiamina es la nica realmente imprescindible para el buen crecimiento de
los cultivos.
Sustancias reguladoras del crecimiento:
En la mayora de los casos los medios utilizados para el establecimiento de los cultivos contienen auxinas (ANA, 2,4-D, AIA, IBA, NOA,
Dicamba, Picloram) y/o citocininas ( BA, CIN,
ZEA, 2iP, Thidiazurn). Las giberelinas (especialmente GA3) son requeridas en algunas
ocasiones para el cultivo de meristemas o
para la elongacin de brotes. El ABA, es usado en algunos casos.
Agente gelificante (en el caso de medios semislidos): El agar (entre 0,6 y 1%)
es el compuesto ms utilizado. Tambin pueden emplearse Agargel (0,40-0,60%),
Transfergel (2-2,60%), Phytagel (0,250,40%), agarosa (0,80-0.90%) y Gelrite
(0,10-0,20%).
Otros compuestos: Muchas sustancias,
de variada composicin qumica, suelen ser
adicionadas a los medios bsicos. Adems de
la glicina, otros aminocidos se pueden agregar a los medios. Es el caso de L-tirosina,
asparagina y cistena, aunque hay que tener
presente que en dosis altas pueden inhibir el
39
crecimiento de los cultivos. El carbn activado (0,1 a 5%) suele ser incorporado al medio, dado que es probable que absorba
metabolitos txicos para los cultivos.
En algunos medios se incorporan cidos
orgnicos como el mlico, el ctrico, el pirvico
y el succnico y es frecuente el empleo de Lglutamina y de casena hidrolizada. An hoy
se siguen utilizando ciertas sustancias de composicin qumica indefinida como el agua de
coco (5 a 15%), jugo de tomate y pur de
banana. Tambin en ocasiones es necesaria
la incorporacin de agentes antioxidantes (Lcistena, cido ascrbico, polivinilpirrolidona)
para prevenir el ennegrecimiento tisular causado por la oxidacin de polifenoles presentes en los explantes. Este ennegrecimiento
puede causar la muerte de los mismos.
La preparacin de los medios de cultivo
puede llevarse a cabo de diferentes maneras, en lecturas recomendadas se citan
manuales de laboratorio donde se describe
detalladamente este punto.
calidad e intensidad de luz, fotoperodo, humedad atmosfrica e higiene. Estas condiciones se logran con el empleo de cmaras
climatizadas o cuartos especialmente preparados con aire acondicionado (fro-calor), una
buena y uniforme circulacin de aire en el interior, dotados de un buen sistema de alarma para interrumpir la iluminacin en caso
de no funcionar el aire acondicionado.
En general, los cultivos son incubados a
temperatura constante de 25-28 C, con ciclo de luz/oscuridad de 16/8horas. La luz es
generalmente provista por lmparas
fluorescentes del tipo luz da con una
irradiancia de entre 50 y 200mol.m-2.s-1.La
humedad atmosfrica debe ser elevada (8090%).
6 Aclimatacin de las plantas
regeneradas in vitro.
Durante el perodo de incubacin, los cultivos son expuestos a condiciones ambientales dismiles al ambiente externo.
Tabla 1: Composicin de tres medios bsicos usados en el cultivo La atmsfera interna se caracteriza
in vitro de tejidos.
por presentar una considerable variacin diurna en la concentracin de
CO2, humedad relativa elevada, temperatura constante e intensidad
lumnica baja. A su vez, el medio de
cultivo compuesto por concentraciones elevadas de azcares (en aquellos sistemas heter-trofos y
semiauttrofos de micropropagacin), sales y reguladores del crecimiento, sumado a la ausencia de
microorganismos, generan anormalidades morfolgicas, anatmicas y fisiolgicas que las plantas debern corregir cuando son transferidas al ambiente externo. Este perodo de
adaptacin al nuevo hbitat es llamado fase o etapa de aclimatacin.
La estrategia a implementarse durante el mencionado ciclo deber contemplar el control minucioso de los
parmetros ambientales (humedad,
temperatura y luz) de tal manera que
permita disminuir la deshidratacin y,
al
mismo
tiempo, estimular la fotosntesis con
5 Condiciones ambientales para la
el
objeto
de generar un rpido crecimiento
incubacin.
de los plantines.
La incubacin de los cultivos se debe lleEl retraso en el desarrollo de la cutcula y
var a cabo en condiciones controladas. Por la escasa funcionalidad del aparato estomlo menos en lo que se refiere a temperatura, tico que presentan las hojas de la mayora
40
de las especies cultivadas in vitro, determinan una alta tasa de transpiracin que puede ocasionar la muerte por deshidratacin.
El control de este proceso fisiolgico es de
vital importancia durante la aclimatacin, teniendo en cuenta que la disminucin de la
transpiracin ser gradual y depender de la
rehabilitacin de los estomas, as como tambin del desarrollo de la cutcula. El equipamiento necesario estar sujeto a la especie, pudiendo utilizarse desde tneles de
polietileno para plantas que posean un elevado control de la transpiracin (por ej.
Malus pumila o Agave tequilana) o bien, a
travs del empleo de cmaras climatizadas
(Fig.1) equipadas con sensores que permiten
un descenso paulatino de la humedad relativa. En algunos casos puede resultar necesaria la aplicacin exgena de ABA (hormona
involucrada en el control del cierre de los
estomas) o bien, el empleo de sustancias
antitranspirantes que forman una capa
semipermeable en la superficie de la hoja. En
este ltimo caso debern tomarse algunas
precauciones debido a que pueden observarse reacciones de fitotoxicidad.
Resulta imprescindible evitar la exposicin
a temperaturas extremas tanto en la fase
area como en el substrato. Mediante el
empleo de extractores y/o acondicionadores
de aire combinados con un sistema de niebla, es posible establecer la temperatura de
la fase gaseosa entre los 25 y 30 C durante
la estacin estival, mientras que en la poca
invernal es necesario, a veces, el empleo de
mantas trmicas o serpentinas, sea de agua
o aire caliente a nivel del substrato, para
mantener la temperatura por encima de los
18-20 C.
Sin lugar a dudas, la opcin ms econmica es el empleo de la luz natural, disminuyendo su irradiancia (20-50%) mediante el
agregado de mallas de sombreado (saram).
No obstante, en aquellas latitudes donde el
nivel medio de luz natural es bajo y los das
son cortos durante una parte considerable
del ao, la luz artificial puede ser aplicada
como complemento de la luz natural. Las lmparas tubulares fluorescentes del tipo luz
da son empleadas en horticultura para prolongar el fotoperodo. Asimismo, las lmparas tubulares de sodio alta presin presen-
tan una distribucin espectral de la energa

adecuada para estimular fotosntesis y se
emplean para tal fin en una amplia variedad
de cultivos.
Otro aspecto importante a tener en cuenta lo constituye la eleccin del sustrato; siendo el adecuado aquel que permita el normal
crecimiento y desarrollo de las races. Se puede emplear: arena, perlita, turba, vermiculita,
o mezclas de ellos, teniendo la precaucin de
realizar una esterilizacin previa. Es conveniente el agregado de fertilizantes, ya sea a
travs del sustrato (fertilizantes de liberacin
controlada) o bien, mediante el sistema de
riego (fertilizantes solubles); emplendose
proporciones ricas en fsforo (N-P-K: 9-45-15)
y potasio (N-P-K: 4-25-35) que favorecern el
desarrollo radicular y la rustificacin de las
plantas.
En todo momento deber realizarse un
riguroso control fitosanitario emplendose
antibiticos, fungicidas e insecticidas de uso
universal.
En la Figura 1, se detalla un modelo de
cmara de aclimatacin diseada por los autores y empleada por el Laboratorio de Cultivo de Tejidos del Instituto de Botnica del
Nordeste. Bsicamente, est compuesta por
una fase area construida en aluminio y
policarbonato alveolar (9) y un recipiente o
batea (11) que contiene grnulos de arcilla
expandida a fin de facilitar el drenaje. Mediante el agregado de arena u otro substrato
adecuado, esta cmara puede ser utilizada
tanto para el enraizamiento ex vitro de los
brotes obtenidos en la etapa de multiplicacin, como as tambin, para el enraizamiento
convencional (a raz desnuda) de estacas
de tallos u hojas.
La humedad relativa de la fase area es
controlada por un sensor (6) ubicado por
encima de la tubera de riego (4). El sistema
humidificador est compuesto por picos tipo
fog y es alimentado por una bomba de
bajo caudal y alta presin (13). Con el propsito de evitar el goteo que pudiese ocasionar el agua remanente en las caeras, el
sistema consta de una vlvula solenoide de
descarga y desage (7). La fase gaseosa es
renovada en forma intermitente mediante
el empleo de extractores ubicados en ambos
extremos de la cmara (3) los que, conjunta-
41
7 Agradecimientos
Los autores agradecen
al Ing. Pablo F. Luna por
la planificacin digital de
la cmara de aclimatacin. A la Secretara General de Ciencia y Tcnica
(UNNE) y al Establecimiento La Cachuera por el
aporte financiero recibido
para construir la misma.
8 Lecturas
Recomendadas
GEORGE, E.F.; D.J.M. PUTTOCK y
H.J. GEORGE. 1987. Plant Culture
Media . Vol. 1 (Formulations and
Uses). Exegetics Limited.
England. 567 pg.
GEORGE, E.F.; D.J.M. PUTTOCK y
H.J. GEORGE. 1988. Plant Culture
Media . Vol. 2 (Commentary and
analysis). Exegetics Limited.
England. 420 pg.
HURTADO, D.V. y MERINO, M.E.
1991. Cultivo de Tejidos
Vegetales. Ed.Trillas. Mxico. 232
pg.
Figura 1: Diseo de una CMARA DE ACLIMATACIN
mente, introducen o extraen aire, generando un movimiento masal.

Debido a la latitud geogrfica en que se
encuentra, la cmara est equipada con un
acondicionador de aire (3000 frigoras) para
evitar situaciones de estrs trmico en poca estival. A su vez, y dado que la mayora de
las especies estudiadas son originarias de climas tropicales y subtropicales, el sistema
cuenta con mantas trmicas que son colocadas por debajo de los tubetes, manteniendo la temperatura del substrato durante el
invierno. En este ltimo caso se agrega un
material aislante entre la leca (10) y la malla
de hierro (16) de tal manera de dirigir el calor
hacia la fase area.
42
PREZ PONCE, J.N. 1998.

Propagacin y Mejora Gentica
de Plantas por Biotecnologa.
Instituto de Biologa de
Plantas.Santa Clara. Cuba. 390
pg.
POSPOSILOVA, J.; I. TICHA, P. KADLECEK, D. HAISEL, S.
PLZAKOVA. 1999. Acclimatization of micropropagated
plants to ex vitro conditions. Biologia Plantarum 42: 481497.
ROCA, W.M. y L.A. MROGINSKI. 1993 (segunda edicin).
Cultivo de tejidos en la Agricultura: Fundamentos y
aplicaciones. CIAT. Cali, Colombia, 970 pg.
TORRES, A.C.; L.A. CALDAS y J.A. BUSO. 1998. Cultura de
Tecidos e Transformacao Gentica de Plantas. (Vol.1)
Embrapa. Brasil.509 pg.
TORRES, A.C.; L.A. CALDAS, y J.A. BUSO. 1999 Cultura de
Tecidos e Transformacao Gentica de Plantas. (Vol.2)
Embrapa. Brasil.355 pg.
II.-Captulo 3
Herramientas bsicas de ingeniera
gentica
Gmez, Marisa; Echenique, Viviana
1 Introduccin
Hasta aproximadamente 1970 el ADN era
la molcula de la clula que planteaba ms
dificultades para su anlisis bioqumico. Excesivamente larga y qumicamente montona,
la secuencia de nucletidos del ADN slo
poda ser estudiada por caminos indirectos,
tales como la determinacin de la secuencia
de protenas, del ARN o por el anlisis
gentico. Actualmente es posible separar regiones determinadas del ADN, obtener cantidades ilimitadas de esos fragmentos y determinar incluso la secuencia de esos
nucletidos. Estos adelantos tcnicos forman
parte de la tecnologa del ADN recombinante, constituida por una mezcla de tcnicas, algunas de las cuales son nuevas, pero
otras son adaptaciones de procesos naturales de la gentica microbiana que han sido
estudiados y se conocen en profundidad.
2 Gentica microbiana
En los procariotas existen mecanismos de
intercambio gentico que permiten tanto la
transferencia de genes como la recombinacin. La recombinacin gentica en procariotas ocurre porque se transfieren fragmentos
de ADN homlogos desde un cromosoma
donador a una clula receptora por uno de
estos tres procesos:
Transformacin: es un proceso por
cual el ADN libre del medio ambiente se incorpora en una clula receptora, trayendo
aparejado un cambio gentico. Esto ocurre
slo en algunas especies bacterianas. El movimiento de las molculas de ADN a travs
de la membrana y dentro del citoplasma de
la clula receptora es un proceso activo, que
requiere energa. Una clula que es capaz de
tomar una molcula de ADN y ser transformada se dice que es competente. Estas clulas secretan el factor de competencia, que es
una pequea protena que induce la sntesis

de 8 a 10 nuevas protenas requeridas para
la transformacin.
Transduccin: es un proceso por el cual
el ADN se transfiere de una clula a otra por
medio de un virus (que en el caso de
hospedadores bacterianos se denomina
fago). Puede ocurrir de dos maneras. En la
llamada transduccin generalizada, una
fraccin del ADN celular, que puede proceder de cualquier porcin del genoma del
hospedador, pasa a formar parte del ADN
de la partcula vrica madura, reemplazando
al genoma del fago. En la transduccin especializada, que ocurre slo en algunos fagos
atemperados (aquellos que se integran en el
genoma como parte de su ciclo biolgico), el
ADN de una regin especfica del cromosoma
del hospedador se integra directamente en
el genoma del fago, reemplazando algunos
de sus genes. En ambos casos, la partcula
vrica transductora es normalmente defectiva
como virus, ya que los genes vricos han sido
reemplazados. No todos los fagos pueden
transducir, ni todas las bacterias son
transducibles. Pero el fenmeno est lo suficientemente extendido para suponer que
desempea un importante papel en las
transferencias genticas que se producen en
la naturaleza.
Conjugacin: es un proceso de transferencia gentica que requiere contacto de
clula a clula y que est mediado por un
plsmido. Consiste en la transferencia de
una copia de este plsmido al nuevo
hospedador. Sin embargo, otros elementos
genticos resultan a veces movilizados durante la conjugacin, como pueden ser otros
plsmidos o grandes bloques del cromosoma
del hospedador. La conjugacin requiere una
clula donadora, que contiene un tipo particular de plsmido conjugativo, y una clula
receptora que carece de l. El contacto se
realiza a travs del filamento o pelo sexual,
que permite el apareamiento especfico y que
poseen slo las clulas donadoras. Constituye un puente de conjugacin a travs del
cual pasa el ADN.
3 La clonacin molecular
El desarrollo de la tecnologa del ADN
recombinante y la clonacin molecular han
43
aportado sofisticados procedimientos que

permiten el aislamiento, purificacin y
replicacin de fragmentos especficos de
ADN. La finalidad de la clonacin molecular
es aislar gran cantidad de genes especficos,
en forma pura. El procedimiento implica esencialmente dos etapas (Fig 1):
Creacin del ADN recombinante, que
consta de dos pasos:
1) Aislamiento del ADN de partida. Este
puede ser ADN genmico, ADN sintetizado
a partir del ARNm por transcripcin reversa
(ADNc por copia), ADN amplificado por
la reaccin en cadena de la polimerasa o sintetizado in vitro. Si se parte de ADN
genmico, generalmente se corta con
enzimas de restriccin para obtener los fragmentos a clonar.
2) Unin de los fragmentos de ADN a un
vector de clonacin utilizando una ligasa de
ADN. Un vector es una molcula de ADN que
vehiculizar al fragmento de inters. Los
vectores de clonacin estn diseados de
forma tal que permiten la recombinacin de
ADN forneo en un sitio de restriccin del
vector, sin afectar su replicacin. A fin de seleccionar las clulas que incorporaron el vector,
el mismo lleva genes marcadores (por ejemplo un gen de resistencia a antibiticos).
Introduccin del ADN en una clula
hospedadora donde se replicar (amplificacin): ste es realmente el verdadero evento de clonacin, en el cual el ADN
recombinante es multiplicado para producir
varias copias idnticas. Involucra tres pasos:
1) Introduccin y mantenimiento del
ADN recombinante en un organismo
hospedador. La molcula de ADN
recombinante se introduce en el organismo
hospedador, que puede ser procariota (bacterias) o eucariota (levaduras, clulas de mamferos cultivadas). En el caso de la utilizacin de sistemas bacterianos, la introduccin
se realiza por los procesos naturales de la
gentica microbiana (transformacin,
transduccin, conjugacin) o modificaciones
especficas de los mismos. Tambin se utiliza
ampliamente la introduccin del ADN mediante electroporacin (descargas elctricas
que crean poros en la membrana celular permitiendo la introduccin del ADN).
2) Deteccin y purificacin del clon deseado. La transferencia del ADN al hospedador
44
a menudo genera un grupo de clones que

portan el vector. A fin de separar las clulas
que incorporaron el plsmido de las que no
lo hicieron se inoculan las clulas en un medio slido (agarificado) que contiene el antibitico al cual son resistentes las clulas que
poseen el vector. Slo stas sobrevivirn. Luego deber buscarse especficamente aquellas
clulas que poseen el fragmento de inters.
Para ello puede utilizarse la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) o la hibridacin molecular con una sonda especfica.
3) Crecimiento y amplificacin de las clulas hospedadoras que incorporaron el ADN
recombinante deseado para su aislamiento,
estudio, etctera
ADN forneo
a insertar
Ligacin
Vector
plasmdico
Gen de resistencia
a antibitico
Molcula de ADN
recombinante
Introduccin en la
clula hospedadora
Seleccin de las clulas que contienen molculas de ADN

recombinante por crecimiento en presencia de antibitico
Figura 1: Pasos bsicos en la clonacin de un

fragmento de ADN.. En primer lugar el ADN a clonar y
el vector (plsmido) se cortan con la misma enzima de
restriccin. Luego se ponen en contacto en presencia de
una ligasa para obtener una molcula de ADN
recombinante que se introduce en bacterias que
multiplicarn el plsmido junto con el fragmento de
inters (Modificado de Watson y col., 1992).
GMEZ, Marisa; ECHENIQUE, Viviana
4 Herramientas y procedimientos
implicados.
Endonucleasas de restriccin
La habilidad para clonar cualquier gen o
secuencia de ADN de inters, depende, en
gran medida, de un tipo especial de enzimas
denominadas endonucleasas de restriccin,
que son enzimas que cortan la molcula de
ADN en sitios especficos denominados sitios
de restriccin. Estas enzimas reconocen secuencias especficas de 4 a 8 bases. Las diferentes endonucleasas de restriccin son
producidas por distintos microorganismos,
para los cuales constituyen un mecanismo de
defensa contra el ataque de fagos. Cuando
el ADN de un fago ingresa en la clula
bacteriana, sta lo degrada gracias a su batera de enzimas de restriccin. Para proteger su propio ADN, las bacterias contienen
enzimas (metilasas) que se encargan de
modificar (metilar) ciertas bases en los sitios
que reconocen sus propias enzimas de restriccin, de manera que ya no pueden reconocer dichos sitios de clivaje. La metilacin
ocurre rpidamente despus de la replicacin,
catalizada por metilasas producidas por el
microorganismo.
Las enzimas de restriccin se denominan
utilizando la primera letra del gnero y las
dos primeras letras de la especie que la produce, seguidas por un nmero que indica el
orden en que han sido identificadas las
enzimas correspondientes a la misma especie (Tabla 1). Una interesante caracterstica
de las enzimas de restriccin es que comn-
mente reconocen secuencias de ADN que son

palndromes (conjunto de caracteres que se
lee de igual manera de derecha a izquierda
que de izquierda a derecha). Adems producen cortes en las dos cadenas. Muchas
enzimas de restriccin estn compuestas de
dos unidades idnticas, cada una de las cuales reconoce y corta una de las cadenas.
Como las secuencias reconocidas son relativamente cortas y frecuentemente palindrmicas, tales enzimas siempre hacen cortes en
ADN bicatenarios y tales cortes no estn sujetos a correccin por enzimas de reparacin.
Gracias a este mecanismo pueden destruir el
ADN extrao.
Ciertas enzimas como EcoRI producen
cortes escalonados que crean colas cortas de
cuatro bases de cadena simple en cada extremo del fragmento. Estas colas tienden a
asociarse a una cadena complementaria por
apareamiento de bases, por eso se denominan extremos cohesivos o pegajosos
(sticky ends) (Fig. 2 A). Los extremos
cohesivos pueden unirse permanentemente
a secuencias complementarias de otro fragmento con colas producidas de la misma
manera (corte con la misma enzima), adicionando la enzima ADN ligasa, que cataliza la
formacin de nuevos puentes fosfodisteres
y las apropiadas condiciones de renaturalizacin. Esta cohesividad permite unir fragmentos de ADN no homlogos, una caracterstica de relevancia para la creacin del ADN
recombinante.
Existe otro tipo de enzimas de restriccin,
como HindII, que cortan el ADN en el centro
Organismo
Designacin
Secuencia
Nota
Bacillus subtilis
BsuRI
Genera extremos romos
Escherichia coli
EcoRI
Escherichia coli
EcoRII
Escherichia coli
EcoRV
Haemophilus
influenzae
HindII
5..GGCC..3
3..CCGG..5
5..GAATTC..3
3..CTTAAG..5
5..CCAGG..3
3..GGTCC..5
5..GATATC..3
3..CTATAG..5
5..GTPyPuAC..3
3..CAPuPyTG..5
Genera extremos
cohesivos
No palindrmica
Genera extremos romos
Pu: cualquier purina
Py: cualquier pirimidina
Tabla 1: Secuencias reconocidas y sitios de restriccin de diferentes endonucleasas de restriccin
45
Figura 2: Mecanismo de corte del ADN por las enzimas de restriccin.. a. Corte en secuencias palindrmicas
originando extremos cohesivos (ej. enzima EcoRI). b. Corte en el centro de la secuencia de reconocimiento de la
enzima, originando extremos romos (ej enzima Hind II). c. Incorporacin de extremos cohesivos a un fragmento de
extremos romos por la transferasa terminal. (Modificado de Watson y col., 1992).
de la secuencia de reconocimiento (en el mismo punto, en ambas cadenas) produciendo

extremos romos (blunt-ends), es decir que
las bases estn apareadas en sus extremos,
y por lo tanto no presentan tendencia para
unirse con las bases complementarias (Fig. 2
B). Esto puede solucionarse adicionando extremos cohesivos por medio de la transferasa terminal, enzima que permite adicionar
colas de poliA o poliT, que se comportarn como extremos cohesivos (Fig. 2 C).
Vectores de clonacin
Como se mencionara ms arriba, un
vector es una molcula de ADN que
vehiculizar al fragmento de inters y permitir su amplificacin. Los vectores de
clonacin ms utilizados derivan del genoma
viral o de plsmidos bacterianos. Un vector
de clonacin tiene tres componentes esenciales:
1. Un origen de replicacin
2. Un gen marcador fcilmente seleccionable
3. Al menos un sitio nico de restriccin
46
Los vectores de clonacin de ltima generacin son muy prcticos y sencillos de

manejar. Incluyen un sitio mltiple de
clonacin o sitio de restriccin mltiple
(polylinker), que es un segmento corto de
ADN con muchos sitios de restriccin diferentes, cada uno de ellos nico para el vector
(Fig. 3 A). Este sitio suele formar parte del
marco abierto de lectura (ORF) de un gen
responsable de alguna caracterstica
fenotpica, por lo que resulta sencillo confirmar si tras la restriccin y ligado se ha insertado efectivamente un fragmento de ADN,
ya que la inclusin de este interrumpe la secuencia del vector, lo cual redunda en la prdida de funcionalidad del gen mediante
inactivacin por insercin.
Los vectores pueden clasificarse de la siguiente manera:
A) Plsmidos: son molculas de ADN circular, de doble cadena, extracromosmicas,
presentes en las bacterias, que poseen propiedades muy tiles como vectores de clonacin:
Figura 3: Vectores de clonacin. a. Sitio de restriccin

mltiple: corto segmento de ADN con varios sitios de
restriccin, cada uno de ellos nico para el vector. b.
Plsmido pBR322 con los sitios de restriccin de BamHI
y PstI dentro de los genes marcadores (genes de
resistencia a la tetraciclina y ampicilina, respectivamente).
(Modificado de Watson y col., 1992).
1. Pequeo tamao que permite mayor

facilidad de aislamiento y manipulacin.
2. Son circulares, lo que hace que el ADN
sea ms estable durante su aislamiento qumico.
3. Su replicacin transcurre independientemente del ADN nuclear en la clula bacteriana.
4. Existen mltiples copias en la clula,
dependiendo del plsmido y de la especie
hospedadora, puede haber de varias a numerosas copias (por ej. 1.000 a 3.000 copias
de pBR322 por clula).
5. La presencia de genes de resistencia
a los antibiticos que actan como marcadores seleccionables facilita la deteccin y
seleccin de los clones que los contienen.
6. El tamao de los insertos que se pueden clonar puede ser considerable; sin embargo, si son mayores de 10 kb, el plsmido
se hace generalmente inestable.
Aunque en el ambiente natural los

plsmidos conjugativos generalmente se
transfieren por contacto clula a clula, los
plsmidos vectores de clonacin generalmente han sido modificados a fin de evitar su
transferencia por conjugacin y as lograr su
contencin biolgica. Sin embargo, en el
laboratorio es posible realizar la transferencia a la clula hospedadora por transformacin, utilizando choque de calor, o por
electroporacin.
Los primeros plsmidos utilizados como
vectores de clonacin existan en forma natural. El plsmido pBR322 constituye una generacin posterior de vectores construidos in
vitro (Fig 3 B). En este plsmido, el sitio de
restriccin de BamHI est dentro del gen de
resistencia a la tetraciclina, y el sitio para PstI
est dentro del gen de resistencia a la
ampicilina. Si se inserta un trozo de un ADN
en uno de estos sitios, la resistencia al antibitico conferida por el gen que contiene
este sitio se pierde (inactivacin por insercin).
Por tanto, cuando pBR322 es digerido con
BamHI y se liga a un ADN, y luego se aslan
los clones transformados, aquellos
transformantes que posean resistencia a la
tetraciclina y ampicilina no portan ningn
ADN clonado. Aquellas clulas que continan
siendo resistentes a la ampicilina pero sensibles a la tetraciclina, contienen el plsmido
con el fragmento del ADN clonado. Como la
resistencia a la ampicilina y a la tetraciclina
pueden determinarse independientemente
en placas con agar, resulta fcil aislar bacterias que contengan los clones deseados y eliminar las clulas que no los contengan.
B) Bacterifagos o fagos:
Fago : tiene un mapa gentico complejo. Se conoce la secuencia completa de sus
48.502 pares de nucletidos y la funcin de
sus genes. El tercio central del cromosoma
contiene genes que son requeridos para la
lisogenia (estado integrado) pero no para el
ciclo ltico (ciclo productivo de nuevas partculas virales). Esa parte central (de aproximadamente 15 kb) del cromosoma puede ser
cortada con enzimas de restriccin y substituida por un fragmento de ADN forneo
(Fig. 4 A). La molcula resultante de ADN
recombinante puede ser empaquetada en
las cabezas del fago in vitro. Las partculas
47
del fago pueden inyectar el ADN

recombinante en E. coli, que se replica produciendo colonias bacterianas que contienen
los fragmentos a clonar.
El fago l silvestre no es indicado como
vector de clonacin porque tiene demasiados sitios para enzimas de restriccin. Para
obviar esta dificultad se han construdo fagos
l modificados (Charon), en los cuales los sitios de restriccin no deseados han sido alterados de manera tal que la correspondiente enzima no los reconozca.
Es un vector de clonacin particularmente til porque:
1. Se conoce bien su estructura, secuencia y funcionamiento
2. Puede insertar mayor cantidad de ADN
que la mayora de los plsmidos (entre 10 y
20 kb)
3. El ADN puede ser eficientemente empaquetado in vitro dentro de las partculas
del fago
4. Las partculas del fago son mucho ms
eficientes en la infeccin de las clulas
hospedadoras (transfeccin) que la transformacin.
Fago M13: es un fago filamentoso que
contiene ADN monocatenario y se replica sin
matar a su hospedador. Para poder utilizarlo
como vector de clonacin es necesario disponer de una forma bicatenaria, ya que las
enzimas de restriccin slo trabajan sobre
ADN de doble cadena. El ADN bicatenario
de M13 puede obtenerse de clulas infectadas, donde se encuentra en forma
replicativa bicatenaria. La mayor parte del
genoma del tipo silvestre contiene informacin gentica esencial para la replicacin. Existe, sin embargo, una pequea regin llamada secuencia intergnica que puede ser utilizada como sitio de clonacin. Es posible
clonar ADN de longitudes variables (hasta
5kb), sin afectar la viabilidad del fago. El ADN
monocatenario de M13 y de sus vectores
derivados ha sido extremadamente til para
secuenciar ADN.
Tanto en el fago l como en M13 se ha
insertado un fragmento funcional de lacZ, el
gen de E. coli que codifica para la enzima galactosidasa (-gal), que es utilizado como
gen marcador. En el inicio de este gen se ha
insertado un sitio mltiple de clonacin. Por
lo tanto, los fragmentos de ADN clonados
en el polylinker interrumpen el gen lacZ y
48
anulan la actividad de la -galactosidasa.

Cuando esta enzima hidroliza un compuesto qumico denominado X-gal, se libera un
colorante azul relativamente insoluble. El Xgal se incorpora al medio de cultivo en placa
de Petri, donde crecern las clulas
hospedadoras del ADN recombinante. Si el
ADN clonado se insert en el polylinker y
desactiv la -galactosidasa, no se producir pigmento azul y las clulas formarn colonias que se vern blancas en la placa de
Petri. En caso contrario, las colonias de las
clulas hospedadoras se vern de color azul.
C
Figura 4: Vectores de clonacin.. a. Utilizacin del
fago. 1. Dos sitios de restriccin EcoRI en el ADN del
fago. 2. Regin central no esencial del fago 3. El ADN
forneo puede reemplazar al segmento no esencial del
ADN del fago 4. Unin con ADN ligasa, se eligen las
condiciones para que el ADN hbrido tenga la longitud
adecuada para ser empaquetada dentro de la partcula
del fago y 5. Empaquetamiento del ADN hbrido
aadiendo extractos celulares que contengan las
partculas de la cabeza y cola para permitir la formacin
de partculas viables del fago. b. Cromosoma artificial
de levadura (YAC). ARS: origen de replicacin, CEN:
centrmero, TEL: telmeros, URA. gen marcador
seleccionable par el desarrollo en medio con uracilo.
Modificado de Watson et al., 1992). c. Cromosomas
artificiales de bacterias (BAC) (Modificado de Griffith et
al., 2000).
C) Csmidos:
Son vectores hbridos, que combinan las
caractersticas ventajosas de los plsmidos
bacterianos y del fago . Cos proviene de
sitio cohesivo (cohesive site), en referencia a las secuencias terminales de simple cadena de 12 bases complementarias en el
cromosoma de maduro. El sitio cos es reconocido por el sistema de empaquetamiento de ADN de , que hace cortes escalonados que originan los extremos
cohesivos complementarios en el cromosoma
maduro del fago. Poseen la habilidad del
plsmido para replicarse autnomamente en
las clulas de E. coli y la capacidad de
empaquetamiento in vitro del cromosoma
de . Contienen el origen de replicacin y los
genes de resistencia a los antibiticos de su
plsmido parental. La principal ventaja de los
csmidos como vectores es su habilidad para
insertar fragmentos de ADN de 35 a 45 kb.
D) Fsmidos (fagmidos):
Son vectores que combinan las caractersticas de un fago filamentoso (M13) y un
plsmido (pBR323) y contienen tanto el origen de replicacin del fago como del
plsmido. Normalmente la replicacin depende del plsmido, pero cuando una clula que
contiene un fsmido se infecta con un fago
de tipo silvestre, el origen del fago es responsable de la replicacin y se generan copias
monocatenarias. Este ADN monocatenario

es empaquetado en viriones y puede aislarse fcilmente y ser utilizado para secuenciar.
Habitualmente, los fsmidos pueden transportar de forma estable un fragmento de
ADN clonado mayor que un vector tpico
derivado de M13.
E) Cromosomas artificiales:
Estos vectores se desarrollaron con el
objetivo de clonar grandes segmentos de
cromosomas eucariticos. En la preparacin
de mapas fsicos de genomas se utilizan
vectores como los csmidos, los YAC
(cromosomas artificiales de levaduras), los
BAC (cromosomas artificiales de bacterias) y
los PAC (cromosomas artificiales basados en
el fago P1).
Los YAC son minicromosomas de levadura creados por ingeniera gentica que
pueden contener insertos de ADN de 200 a
500 kb (Fig. 4 B) y contienen un origen de
replicacin y un centrmero de levadura, dos
telmeros en los extremos del cromosoma,
un marcador seleccionable y un sitio mltiple de clonacin.
Los BAC se basan en el plsmido F de
7kb de E. coli y pueden llevar insertos de 300
kb, aunque el promedio es de 100 kb (Fig. 4
C). Los PAC son equivalentes. Aunque los BAC
y los PAC aceptan fragmentos menores que
los YAC tienen algunas ventajas:
Figura 5: Mtodo de hibridacin de Southern. a. Inclusin del ADN en el gel de agarosa. b. las molculas de ADN
migran a travs del gel dependiendo de su tamao y forma, c. transferencia de las molculas de ADN del gel a una
membrana por capilaridad (S. Solucin tampn, M: mecha, A gel de agarosa, N: membrana de nitrocelulosa, P:
papel de filtro y peso), d. incorporacin de la sonda e hibridacin con las molculas de ADN, f: deteccin por
autorradiografa, contacto de la membrana con el filme autorradiogrfico, g: revelado de la autorradiografa,
observacin de las bandas hibridadas. (Modificado de Micklos et al., 1990).
49
1. Son menos complejos y por lo tanto

ms fciles de construir. Pueden amplificarse
en bacterias y manipularse con la tecnologa
bsica de los plsmidos bacterianos.
2. Contienen menor cantidad de insertos
hbridos (insertos compuestos por dos o ms
fragmentos no contiguos en el genoma) que
los YAC. Estos insertos hbridos pueden entorpecer los intentos de ordenar los clones
Por estos motivos los BAC han reemplazado a los YAC como vectores en la construccin de mapas fsicos de cromosomas enteros.
Estos vectores simplifican mucho el proceso de secuenciacin, ya que an organismos simples como el nemtodo
Caenorhabditis elegans poseen enormes
cantidades de ADN (100 Mb). En este caso
se necesitaran 2.500 csmidos para contener el genoma completo (el inserto promedio de un csmido es de 40 kb). Los YAC
pueden aceptar 1Mb, por lo cual el proceso
se simplifica.
5 Anlisis molecular de ADN, ARN y
protenas: hibridacin.
La hibridacin es la construccin artificial de un cido nucleico bicatenario por
apareamiento (emparejamiento) de bases
complementarias de dos cidos nucleicos
monocatenarios. Para que exista la formacin
de hbridos estables debe haber un alto grado de complementaridad. Se define formalmente como sonda (probe) a un fragmento determinado de ARN o ADN marcado
qumica o radiactivamente, utilizado para localizar determinadas secuencias de cidos
nucleicos mediante hibridacin.
Anlisis de ADN por hibridaciones
Southern Blot
La electroforesis en gel es una poderosa herramienta para separar macromolculas
de diferentes tamaos y cargas. Las molculas de ADN tienen esencialmente una carga
constante por unidad de masa, por lo tanto se pueden separar en geles de agarosa o
acrilamida, casi completamente, sobre la base
de su tamao o conformacin. Los geles de
agarosa o acrilamida actan como tamices
moleculares, retardando el pasaje de las
molculas ms grandes en relacin con las
ms pequeas. Los geles de agarosa actan
50
como mejores tamices para las molculas ms

grandes, mientras que los de acrilamida separan mejor las molculas pequeas. Los procedimientos utilizados, para separar cidos
nucleicos y protenas tienen el mismo principio, pero involucran algunas diferencias de
tcnicas debidas a las caractersticas particulares de cada clase de molculas.
En 1975 E. M. Southern, public un nuevo procedimiento que permiti a los investigadores ubicar los genes y otras secuencias
de ADN sobre fragmentos de restriccin
separados por electroforesis en gel. La principal caracterstica de esta tcnica es la transferencia de las molculas de ADN que han
sido separadas por electroforesis en gel a una
membrana de nylon o nitrocelulosa. Esta
transferencia se denomina Southern Blot, en
honor al cientfico que desarroll la tcnica
(Fig. 5). Para realizarla, el ADN es desnaturalizado (abierto en sus dos cadenas), sea antes o durante la transferencia, ubicando el
gel en una solucin alcalina. Una vez completada la transferencia, el ADN es inmovilizado
sobre la membrana por exposicin a elevada temperatura o a radiacin UV. Una sonda de ADN conteniendo la secuencia de inters es entonces incubada con el ADN inmovilizado. La sonda slo va a hibridar con
molculas de ADN que contienen la secuencia de nucletidos complementaria a su secuencia. El excedente de sonda no hibridada
se elimina mediante repetidos lavados de la
membrana. Las sondas pueden marcarse por
diferentes mtodos: con elementos radioactivos, por mtodos qumicos que producen color o luminiscencia, etc. Luego de la
hibridacin, la membrana se somete a diferentes procedimientos para poner en evidencia la sonda, de acuerdo al mtodo con el
que haya sido marcada.
Anlisis de ARN por transferencia e
hibridacin: Northern Blot
De manera similar al tratamiento realizado con las molculas de ADN, las molculas
de ARN tambin pueden ser separadas por
electroforesis en geles de agarosa, transferidas a membranas y analizadas. La transferencia de ARN se denomina Northern blot,
en reconocimiento al hecho de que el procedimiento es la imagen de espejo de la tcnica Southern blot.
Ambos procedimientos son esencialmen-
Figura 6: Reaccin en cadena de la polimerasa. a) Los tres pasos de un ciclo de PCR. En primer lugar se eleva la
temperatura de la reaccin para separar las hebras de ADN (1) y a continuacin la temperatura baja nuevamente, lo
que permite que los cebadores o primers se peguen a las regiones adecuadas de la hebra de ADN (2), y entonces
se ensamblan, actuando como lmites de la regin de la molcula que va a ser duplicada. Para terminar, se eleva la
temperatura nuevamente y la Taq polimerasa comienza a copiar (3), y sobre la plantilla crece una hebra nueva
complementaria (4). Despus de varios ciclos se obtienen mltiples copias del fragmento en cuestin. b) La PCR es
una reaccin donde el nmero de copias del gen de inters crece exponencialmente. c) Verificacin de un producto
de PCR sobre un gel de agarosa. En primer calle se observa un producto de aproximadamente 1850 pares de bases
(bp) de longitud, en la calles 2 y 4 fragmentos de 800 bp, en la calle 3 fall la amplificacin y en la calle 5 se han
formado tres bandas debido a que el primer ha encontrado complementariedad en ms de un sitio en el genoma.
51
te idnticos. Sin embargo, las molculas de

ARN son muy sensibles a la degradacin por
ARNasas. Por lo tanto, se debe tener mucha
precaucin para evitar la contaminacin de
los materiales con estas enzimas. Adems, la
mayora de las molculas de ARN contienen
estructuras secundarias (producidas por
apareamiento complementario intracadenas), por lo tanto deben mantenerse desnaturalizadas durante la electroforesis para
poder separarlas sobre la base de su tamao. La desnaturalizacin se provoca incorporando formaldehdo u otro qumico
desnaturalizante a la solucin tampn (buffer) utilizada en la electroforesis. Despus
de la transferencia a la membrana apropiada, las molculas de ARN pueden hibridar con
sondas de ADN o ARN.
Anlisis de protenas por transferencia e inmunodeteccin o Western Blot
La electroforesis en gel de poliacrilamida
es una herramienta muy importante para la
separacin y caracterizacin de protenas.
Debido a que muchas de las protenas estn
compuestas por dos o ms subunidades, los
polipptidos individuales son separados por
electroforesis en presencia del detergente
dodecil sulfato de sodio (SDS), que desnaturaliza las protenas. Los polipptidos separados por electroforesis tambin pueden ser
transferidos del gel a una membrana de nitrocelulosa y pueden ser detectados utilizando anticuerpos especficos. Esta transferencia de protenas se denomina Western
blotting y se realiza utilizando una corriente
elctrica para trasladar las protenas del gel a
la superficie de la membrana. Despus de la
transferencia, la protena de inters es identificada colocando la membrana con las protenas inmovilizadas en una solucin que contiene un anticuerpo contra esa protena. El
anticuerpo est conjugado (marcado) ya sea
con istopos radioactivos, que permiten la
deteccin por autorradiografa, o con
enzimas que producen un producto visible
cuando se adiciona el sustrato correspondiente.
6 La reaccin en cadena de la polimerasa
(PCR)
La PCR es una tecnologa poderosa que
involucra la sntesis enzimtica in vitro de
52
millones de copias de un segmento especfico de ADN. La reaccin se basa en la hibridacin y extensin de un par de oligonucletidos, sintetizados artificialmente, utilizados como iniciadores o cebadores (primers)
que delimitan una secuencia de ADN de doble cadena que se desea amplificar.
Un ciclo de PCR comprende tres etapas
(Fig. 6): desnaturalizacin de la doble cadena, unin de una secuencia de ADN (primer) a la hebra simple y replicacin del
ADN a partir del primer. La doble cadena
de ADN se desnaturaliza por elevacin de la
temperatura a 92-95C. Luego la temperatura se baja rpidamente a 35-60C, dependiendo del tamao y secuencia del oligonuclotido utilizado, permitiendo la hibridacin
ADN-ADN de cada primer con las secuencias
complementarias que flanquean la regin
objetivo. Luego, se eleva la temperatura a
72 C para que la Taq polimerasa (una ADN
polimerasa termoresistente aislada de
Thermus aquaticus, bacteria que vive en
fuentes termales) realice la replicacin a partir de cada extremo 3 de los primers. Este
ciclo es repetido por algunas decenas de veces y, como el producto de cada
polimerizacin sirve como molde para el siguiente, cada ciclo duplica la cantidad de
producto del anterior. El resultado de la reaccin es un fragmento de ADN de doble
cadena, cuyos extremos corresponden a los
extremos 5 de los primers y su tamao a la
distancia entre los mismos. A pesar de que
se forman molculas ms largas a partir del
molde original en cada ciclo, se acumulan solo
a una tasa lineal y no contribuyen significativamente a la masa final de secuencia blanco.
Despus de apenas 20 ciclos se logra ms
de un milln de veces la cantidad inicial de
la secuencia de inters. Esta escala de amplificacin permite, por lo tanto, iniciar el proceso con cantidades mnimas de ADN (del
orden de pico o nanogramos) y terminar la
reaccin con grandes cantidades de una secuencia de inters. La versatilidad de esta
reaccin es enorme y la combinacin de la
PCR y la secuenciacin constituye una poderosa herramienta para el anlisis de genes.
La tecnologa de PCR es de suma utilidad
para amplificar ADN a partir de fragmentos
clonados en distintos vectores. Solo se nece-
sita un par de iniciadores complementarios a

los sitios del vector que flanquean el fragmento para amplificar cualquier fragmento independientemente de su secuencia. Puede
amplificarse ADN de material embebido en
parafina por varios aos, de material momificado, de restos fsiles, etc. Se utiliza para
detectar enfermedades genticas, determinar el sexo en embriones humanos, para
clonar genes, para mutagnesis in vitro y para
mapeo y secuenciacin de genomas, entre
otras aplicaciones.
RT-PCR
La reaccin de PCR en unin con la transcripcin reversa (RT-PCR) puede ser utilizada para el estudio de ARNm casi a nivel de
una clula individual. Esta tcnica puede utilizarse para determinar la presencia o ausencia de un transcripto, para estimar el nivel
de su expresin y para el clonado de ADNc
sin la necesidad de construir una genoteca.
Consiste en la sntesis de una cadena de ADN
a partir de ARNm por medio de la
transcriptasa reversa (enzima extrada de
virus tumorales cuyo material gentico es
ARN), que utiliza ARN como molde para sintetizar una hebra de ADN. La cadena complementaria se sintetiza por PCR .
Subsecuentes ciclos de PCR nos permiten tener cantidades apropiadas del ADNc para
diversas manipulaciones genticas.
PCR cuantitativa
La clave en la PCR cuantitativa es la posibilidad de detectar el nivel de amplificacin
de una secuencia de inters, con el objeto
de estimar la cantidad de esa secuencia en la
muestra original. Para llevar a cabo esta deteccin existen varios mtodos pero casi todos basados en la utilizacin de otro fragmento de ADN (sonda) complementario a
una parte intermedia del ADN que se quiere
amplificar. Esta sonda lleva adherida una
molcula fluorescente y otra molcula que
inhibe esta fluorescencia (quencher), de
tal forma que slo cuando la sonda es desplazada de su sitio por accin de la ADN
polimerasa la molcula fluorescente se libera de la accin del quencher y emite fluorescencia al ser iluminada con un lser. La
fluorescencia detectada durante cada ciclo
de la PCR ser proporcional a la cantidad
de ADN que se est amplificando. En gene-
ral para que sea vlida esta tcnica requiere

realizar en paralelo una curva patrn en las
mismas condiciones para conocer la cantidad
total de ADN que se est amplificando. Existen varios tipos de PCR cuantitativa. La ms
moderna y sofisticada es la llamada PCR en
tiempo real.
PCR en tiempo real
La PCR en tiempo real es una tcnica que
ha ganado mucha importancia en los ltimos
aos debido a que ofrece la posibilidad de
cuantificar el nmero de copias de un
transgen incorporadas en un genoma.
Como se explicara ms arriba, se basa en la
deteccin de un informador fluorescente
cuya seal aumenta en proporcin directa
con la cantidad de producto de PCR en la
reaccin. Se emplea un ciclador trmico que
tiene acoplado un sistema de deteccin capaz de captar y cuantificar la seal emitida
por el informador al final de cada ciclo. Se
pueden utilizar diferentes reactivos
fluorescentes como agentes intercalantes
(SYBR green) que se unen a la doble cadena de ADN dando un incremento de la fluorescencia a medida que aumenta la cantidad
del producto de PCR. Tambin se pueden
emplear sondas que tienen unidas un
fotocromo informador y un fotocromo
quencher (TaqMan ). Cuando ambos
fotocromos estn unidos a la sonda, el informador no emite seal, pero cuando sta
hibrida con la secuencia de inters, durante
la reaccin de PCR, la enzima Taq polimerasa,
mediante su actividad de exonucleasa, cliva
al fotocromo informador, liberndolo del
resto de la sonda y permitiendo la emisin
de una seal fluorescente. Se monitorea esta
seal que se va acumulando en los sucesivos
ciclos de PCR. De este modo, es posible estimar la cantidad de la secuencia original
expresada en nmero de copias por
genoma o en unidad de masa.
En la Parte IX, Captulo 4, se detalla ms
este punto y se aplica esta tcnica para la
deteccin de organismos genticamente
modificados (OGM).
7 Genotecas
Una genoteca (gene library) es una
coleccin de fragmentos de ADN clonados
que representan en su conjunto el ADN to-
53
tal de un organismo de inters o bien el

ADNc, que representa el conjunto de genes
que se estn expresando en un rgano o
tejido determinado o bajo una situacin particular o momento de crecimiento o desarrollo. En el primer caso hablamos de una
genoteca genmica, donde se encuentran
todas las secuencias que se expresan y no se
expresan en el organismo y en el segundo
de una genoteca de ADNc, donde se encuentran slo las secuencias expresadas.
Estas genotecas carecen de un catlogo
a travs del cual se pueda saber cul es el clon
que contiene una secuencia de inters. Por
ello es necesario realizar un relevamiento de
todas las colonias utilizando una sonda con
la secuencia de cido nucleico que tenga que
sea complementaria a la secuencia o gen
buscados. Parte de esta secuencia puede ser
conocida o puede deducirse de la secuencia
de aminocidos de la protena purificada.
Alternativamente, puede buscarse la protena producida por un gen clonado usando
anticuerpos contra la protena o a travs de
un anlisis funcional.
Una de las principales dificultades en el
clonado de ADN genmico es que algunas
secuencias estn representadas una sola vez
en el genoma y es difcil hallarlas. Para obviar
esta dificultad puede clonarse directamente
el ADNc, ya que el nmero de copias del
ARNm en el tejido es ms elevado. El problema se plantea cuando no se sabe en qu circunstancias o en qu tejido se expresa un gen
en particular. Pero existen varias formas de
determinarlo. Actualmente es posible clonar
un ADNc a partir de mensajeros poco abundantes en la clula, con concentraciones de
1 a 2 molculas por clula.
Genotecas de ADNc
El primer paso en la construccin de una
genoteca de ADNc consiste en el aislamiento del ARN del cual es posible separar el
ARNm tomando ventaja de la caracterstica
cola de poliadeninas que posee en su extremo 3. Para ello se empaqueta en una columna de celulosa a la cual se unen
oligonucletidos compuestos slo por
desoxitimina oligo(dT), a travs de la cual
pasa el ARN quedando el mensajero unido a
la timina a travs de la cola de poliA. Este es
luego eluido de la columna utilizando una
solucin tampn adecuada.
54
Estas colas de poliA tambin son utilizadas en el prximo paso de clonado. La reaccin consiste en poner en contacto el ARNm
aislado con oligo(dT) de 12 a 20
desoxitiminas que actan como cebadores o
primers para la transcriptasa reversa. El producto de la reaccin es un hbrido ARN-ADN.
El problema que tiene esta tcnica es que si
el ADNc es muy largo, al comenzar en el extremo 3, muchas veces no se llega al extremo 5. Para salvar esta dificultad existe otra
tcnica donde se utilizan primers al azar. Estos constan de 6 a 10 nucletidos de longitud y estn confeccionados de manera de
representar muchas secuencias diferentes,
por lo que la reaccin comienza a partir de
muchos sitios diferentes, no slo del extremo 3. Por cualquiera de los dos mtodos se
obtiene un hbrido ARN-ADN, a partir del cual
se obtienen molculas de ADN de doble cadena que puede clonarse en el vector apropiado.
El primer mtodo desarrollado para obtener la segunda cadena tomaba ventaja de
una vuelta o giro que da la hebra recin
sintetizada, como un efecto de cambio de
rumbo de la transcriptasa reversa al llegar al
final de la cadena de ARN. Este artefacto provee un cebador adecuado para la sntesis de
la segunda cadena de ADN y puede eliminarse una vez obtenida la segunda cadena, con
una nucleasa S1, perdindose parte de la
secuencia correspondiente al extremo 5 del
mensajero.
Existe una segunda tcnica, que presenta dos ventajas sobre la anterior. Una es que
genera molculas de ADNc ms largas y la
segunda es que contiene prcticamente toda
la secuencia correspondiente al extremo 5.
Se basa en la utilizacin de la enzima RNasaH,
que reconoce molculas hbridas ARN-ADN y
digiere la cadena de ARN dejando trozos
pequeos que permanecen unidos a la primera cadena del ADNc y sirven como primers
para la ADN polimerasa I, que usa el ADNc
original como molde para sintetizar la hebra
complementaria de ADN. Slo queda un pequeo segmento de ARN en el extremo 5.
La segunda cadena de ADN tiene algunos sectores no unidos que son sellados por una
ligasa de ADN.
Estas molculas de ADNc de doble cadena estn listas ahora para ser insertadas en
un vector, que puede ser un

plsmido o un derivado del
fago l. Para ello se utiliza la
transferasa terminal, que
adiciona colas de poliA o
poliT, o se agregan
adaptadores, que son sitios
artificiales de reconocimiento de alguna enzima de
restriccin que se unen a los
extremos de la secuencia. Se
trata de oligonucletidos artificiales (8-12 bp) que se
unen al fragmento utilizando una ligasa de ADN y son
cortados con la enzima de
restriccin apropiada (Fig. 7
a). Ambos procedimientos
sirven para generar extremos
cohesivos a fin de unir el fragmento al vector, que posee
extremos cohesivos cortados
por la misma enzima.
Los plsmidos son introducidos en bacterias por
transformacin (choque trmico o electrofusin), y se seleccionan por la caracterstica del gen marcador del
plsmido. Si se trata de
fagos, los vectores son empaquetados in vitro para
formar partculas vricas, que
introducirn su ADN en el
hospedador apropiado por
infeccin de un csped de
bacterias crecido sobre la superficie de una placa de agar
(Fig. 7 a). Si bien los vectores
plasmdicos son ms fciles
de manipular, las genotecas
construidas en los fagos poFigura 7: Clonado de ADNc de doble cadena en un fago. a) Para ello se le deben adicionar hebras de cadena
simple complementarias a los sitios de restriccin del ADN del fago. El ADN del fago se prepara cortando con una
enzima de restriccin, en este caso EcoRI, y se purifican los dos brazos del fago. Mientras tanto se adicionan al ADNc
los adaptadores que llevan sitios EcoRI. Para ello se utiliza una ligasa. Previamente, el ADN se trata con una metilasa,
que metila los sitios de reconocimiento de la enzima de restriccin, a fin de protegerlo de la accin de la enzima. Los
adaptadores se cortan con la enizma de manera de generar extremos cohesivos que puedan acoplarse con el ADN
del fago, cortado con la misma enzima. Se genera as una serie de molculas recombinantes dispuestas en tandem,
flanquedas por los sitios cos. Este ADN recombinante se empaqueta formando partculas infecciosas del fago, que
se utilizarn para infectar un csped de bacterias. Esto se visualizar como placas o calvas. Cada placa surge de una
molcula recombinante individual, que se propaga ahora como un fago. b) Una vez construda la genoteca puede
localizarse un gen en la misma por hibridacin con una sonda marcada apropiadamente (Modificado de Watson et
al., 1992).
55
seen fragmentos de mayor tamao.

Como resultado del cultivo en placa
(plaqueo) de la genoteca, se obtienen cientos de miles a un milln de placas de fagos
(zonas claras o de lisis resultado de la produccin de particulas vricas) o, en el caso de
vectores plasmdicos, colonias bacterianas,
cada una conteniendo un fragmento
clonado, distribuidas sobre la placa de agar.
A fin de realizar la bsqueda de un gen particular (screening), la genoteca es replicada
en membranas de nylon o nitrocelulosa, de
manera tal que el patrn de placas en la caja
original se vea exactamente reproducido en
la membrana de nylon o filtro (Fig. 7 B).
Bsqueda del gen clonado: Eleccin de
la sonda
La bsqueda se lleva a cabo por hibridacin con una sonda de cido nucleico, lo
cual requiere un conocimiento previo de la
secuencia de inters. En algunos casos, donde parte del gen ha sido clonado, este se
utiliza para buscar las partes faltantes. Si se
usa una sonda donde la homologa es completa, el screening puede realizarse en condiciones de alta rigurosidad (es decir, con
lavados ms fuertes, temperatura elevada y
concentracin salina baja, que tienden a despegar lo que se ha unido inespecficamente).
Si la sonda no es completamente homloga
el screening deber realizarse a menores
temperaturas y utilizando concentraciones
salinas ms elevadas en los lavados. Si no se
tiene conocimiento previo de la secuencia
puede construirse una sonda a partir de la
secuencia de aminocidos de la protena.
Cuando se utiliza esta estrategia, el tamao
mnimo de la sonda debe ser de 15 a 16
nucletidos (que permite encontrar secuencias nicas en genotecas de ADNc
eucariticos. Generalmente se utilizan sondas
de 17 a 20 nucletidos (correspondientes a
6 aminocidos contiguos). Otra consideracin
a tener en cuenta cuando se construye la
sonda es que existe ms de un codn o
triplete para definir la mayora de los
aminocidos (es lo que se conoce como la
degeneracin del cdigo gentico), por lo
que un aminocido puede estar especificado por hasta 6 codones diferentes. Por ello,
estas sondas oligonucleotdicas estn constituidas por una mezcla de todas las combinaciones posibles. Una de ellas corresponde-
56
r a la secuencia correcta del gen buscado. El

problema de esta estrategia es el elevado
nmero de falsos positivos que pueden dar
las secuencias adicionales. Una variante consiste en usar un menor nmero de
oligonucletidos o uno solo pero de mayor
longitud (35-75 nucletidos), eligiendo una
regin de la protena que contenga el menor nmero posible de codones degenerados, utilizando el conocimiento de los
codones ms probables para la especie en
estudio.
Existen otras tcnicas para localizar genes
en las genotecas de ADNc, como hibridacin
diferencial, si se trata de genes expresados
en diferentes tejidos o la utilizacin de sondas de regiones conservadas en familias de
protenas para encontrar genes relacionados
o bien la utilizacin de vectores de expresin.
Genotecas Genmicas
Un genoteca genmica puede obtenerse
de cualquier tejido, ya que todas las clulas
de un organismo tienen la misma constitucin gentica. Como se mencionara previamente, se encuentran en ella no slo secuencias expresadas y no expresadas sino tambin las correspondientes secuencias
regulatorias.
Pueden utilizarse fagos como vectores,
pero sucede que muchos de los genomas
eucariotas son muy grandes, por ejemplo el
de mamferos contiene 3x109 pb de ADN. Si
el promedio tpico de inserto es de 15.000
pb, se necesitarn unos 200.000 fagos para
contener el genoma completo. Para asegurar que todas las secuencias estn representadas al menos una vez, los clculos estadsticos dicen que debern analizarse aproximadamente de 1 a 2 millones de fagos.
Muchos genes eucariticos tienen ms de
1000 kb, por lo que deben ser clonados como
un conjunto de fragmentos parcialmente
superpuestos. Para esto pueden utilizarse
csmidos, que pueden contener unas 45 kb.
Para hacer una genoteca con estos vectores
el ADN se corta con enzimas de restriccin
de manera de dejar fragmentos de tamao
apropiado. El csmido se empaqueta in vitro
en fagos que se usan para infectar E. coli .
Una vez dentro de la clula el csmido se replica y puede recuperarse de la clula como
un plsmido.
Cuando se trata de genomas muy grandes, como es el caso del humano o de varias
especies vegetales y animales la utilizacin de
csmidos resulta ineficiente. Por ello en estos casos se utilizan los YAC y BAC.
A) Genotecas genmicas en cromosomas artificiales
La capacidad de clonar fragmentos de
ms de 100 kb es crucial para la genmica
estructural, funcional y comparativa de organismos complejos. El primer sistema de
clonado de grandes fragmentos de ADN fue
informado en 1987 por Burke y colaboradores. Este sistema estaba basado en YAC, que
permitan clonar y mantener fragmentos de
ms de 1000 kb en levaduras. Debido a esta
ventaja el sistema fue rpidamente adoptado para los proyectos de genmica. Sin embargo, tienen algunos problemas que limitan
su utilizacin, como el alto nivel de
quimerismo o insertos hbridos (artefacto
que resulta de la unin de fragmentos no
contiguos en el genoma original en un mismo clon), la inestabilidad de los insertos y la
dificultad de purificar los
insertos clonados.
Para minimizar estos
problemas se desarrollaron
sistemas alternativos que
utilizan bacterias en lugar
de levaduras: los BAC y los
PAC, que son vectores de
clonacin de copia simple.
Cuando se los utiliza para
transformar plantas se los
llama BIBAC. BAC y PAC
pueden contener establemente fragmentos mayores de 300 kb en E. coli.
Para preparar una
genoteca genmica, el ADN
se corta con enzimas de
restriccin o, para evitar la
presencia de fragmentos
demasiado largos o cortos,
se fragmenta al azar. Un
paso crtico en el proceso es
el aislamiento de molculas
intactas de ADN de elevado peso molecular, esencialmente ADN cromosmico. Para ello las clulas se
embeben en bloques de
agarosa de baja temperatura de gelificacin y se
tratan con en-zimas y otros
Figura 8: Bsqueda de imgenes en una genoteca genmica. Utilizacin de la reaccin en cadena de la polimerasa
para buscar un gen especfico en una genoteca de BACs. Las 180 placas de cultivo, de 96 pocillos, contienen un
genoma vegetal completo. Estas placas se replican, de a 4, en filtros o membranas. Todos los clones de un mismo
filtro son juntados y varios de estos conjuntos de clones son agrupados para preparar agrupaciones de conjuntos.
El ADN de estos conjuntos se aisla y se amplifica por PCR utilizando primers especficos para el gen de inters. Como
control positivo se utiliza un ADN vegetal, tambin amplificado por PCR. La reaccin se analiza sobre un gel de
agarosa. Un resultado positivo indica la presencia del gen en el ADN genmico del vegetal y tambin en uno de los
clones. En este caso en el conjunto que contena los filtros 1-3. Cuando se chequean los conjuntos individuales se
encuentra que el clon positivo pertenece al filtro 1. El producto de PCR se hibrida luego con este filtro y esto nos dar
la posicin exacta en la placa de 96 pocillos donde se encuentra el gen de inters (Modificado de Watson et al.,
1992).
57
reactivos para separar el ADN de las protenas celulares y del RNA. La funcin del bloque de agarosa es proteger a las grandes
molculas, que, embebidas en esta matriz,
se someten a la digestin con enzimas de
restriccin que realicen cortes poco frecuentes (rare cutters). La preparacin de
ADN de alta calidad en plantas es ms complicada que la correspondiente para el caso
de animales debido a la presencia de la pared celular, que dificulta el embebido en
agarosa de bajo punto de gelificacin. Para
obviar esta dificultad se aslan los ncleos y
se trabaja con ellos directamente. Si se desea separar estos fragmentos por
electroforesis, los bloques de agarosa conteniendo el DNA digerido pueden ser directamente embebidos en la matriz del gel que
se correr.
B) Separacin de grandes trozos de
ADN: electroforesis de campo pulstil
Las tcnicas estndares de separacin de
ADN en geles de agarosa no son adecuadas
para molculas mayores de 10 kb. Esta limitacin ha sido subsanada con una tcnica llamada electroforesis de campo pulstil, por
la cual el campo elctrico que conduce a las
grandes molculas de ADN a travs del gel
cambia peridicamente de orientacin. De
esta manera pueden separarse molculas tan
grandes como los cromosomas de levaduras
(200 a 3000 kb) (ver VII.-1). La separacin de
las molculas de este tamao depende de
su relativa facilidad o dificultad para reorientarse en respuesta a direcciones cambiantes
de un campo elctrico. Esta tcnica puede
utilizarse para hacer mapas fsicos a gran escala.
C) Preparacin de una genoteca de BAC
El procedimiento consiste en 4 pasos,
preparacin del vector, aislamiento y digestin del ADN y seleccin de los fragmentos por tamao, transformacin de las bacterias y ensamblado de la genoteca
El vector debe estar bien purificado, digerido y defosforilado (cuando se corta con
una sola enzima, se eliminan los fosfatos terminales, para evitar la recircularizacin). La
digestin del ADN es crtica para obtener fragmentos adecuados para clonar. Los fragmentos son seleccionados por electroforesis de
campo pulstil y se separan de la matriz de
agarosa por digestin de la misma con
58
agarasa o gelasa, o por elucin del ADN

desde el gel. Esto permite construir
genotecas con fragmentos de tamaos similares, de aproximadamente 150 kb.
Estas genotecas de grandes insertos son
consideradas recursos de largo plazo para investigacin genmica y deben ser mantenidas continuamente, especialmente cuando
son utilizadas para proyectos de secuenciado
y mapeo a gran escala. En general, cuando
se va a construir una genoteca debe elegirse
cuidadosamente el genotipo de la especie
utilizada como fuente de ADN, el tipo de inserto, etc. ya que la misma puede utilizarse
para variados propsitos. Si en lugar de una
genoteca de BAC se hace una de BIBAC, se
tiene la ventaja adicional de poder usar directamente los fragmentos para transformar
plantas
utilizando
Agrobacterium
tumefaciens
En la Fig. 8 se esquematiza la bsqueda
de un gen en una genoteca de BAC. Ms
detalles acerca del ensamblado de los distintos fragmentos clonados pueden encontrarse en el captulo correspondiente a genmica.
Genotecas de cromosomas especficos o de segmentos de cromosomas
Cuando se busca un gen que se sabe est
ubicado en un cromosoma especfico simplifica mucho el trabajo hacer una genoteca de
ese cromosoma solamente. Se trata de una
tcnica que permite separar cromosomas
metafsicos teidos con un colorante fluorescente (Hoechst 33258) (para regiones ricas en AT) y cromomicina A (para regiones
ricas en GC) y tratados de manera que el ADN
no se desnaturalice. Los cromosomas teidos
fluorescern cuando se expongan a luz UV
(de longitudes de onda de 361 y 363 nm)
(Hoechst 33258) o 458 nm (cromomicina A).
Las cantidades y proporciones de colorantes
varan para cada cromosoma y una computadora reconoce el patrn fluorescente tpico de cada cromosoma. Algunos
cromosomas son muy similares, por lo que
no pueden ser separados. Se necesita un
milln de cromosomas para hacer una
genoteca. Equipos automticos pueden hacer este trabajo en unas pocas horas.
Tambin puede microdisectarse un
cromosoma, tomando un segmento del mismo que tenga la regin de inters. En principio se utiliz esta tcnica para cromosomas
grandes, fcilmente distinguibles por

microscopa de contraste de fase. Actualmente, la combinacin con PCR posibilita la
aplicacin de la tcnica a cualquier
cromosoma. Estos son teidos con Giemsatripsina y las bandas deseadas son cortadas
con agujas de vidrio ultrafinas y clonadas.
Primers posicionados en el vector permiten
amplificar secuencias desconocidas. El ADN
amplificado se clona en un vector apropiado
y la localizacin cromos-mica de cada clon
se determina utilizando hibridacin in situ
(ver III.5)
8 Secuenciacin
Una vez que se ha obtenido el clon con
el fragmento de inters, el paso siguiente es
secuenciarlo. La determinacin de la secuencia puede realizarse por el mtodo qumico
de Maxam y Gilbert o por el mtodo
enzimtico de Sanger. El primero consiste
en la utilizacin de un compuesto que destruye selectivamente una o dos de las 4
bases que constituyen el ADN. Se realizan
4 reacciones de sntesis de ADN, marcando
un extremo de las molculas, dependiendo
de la base a destruir (G, A+G, T+C, C). De esta
forma, se generan fragmentos de distinto
tamao en funcin de la distancia de la base
destruida al extremo marcado radiactivamente del fragmento a secuenciar. Los productos de las 4 reacciones se corren lado a
lado en un gel de poliacrilamida y la secuencia del fragmento se determina a travs del
patrn de bandas, despus de efectuada una
autorradiografa para revelarlas.
El mtodo de Sanger, se basa en el mismo principio y consiste en preparar 2,3didesoxinucletidos (ddNTP) de cada una
de las 4 bases. Estas molculas pueden ser
incorporadas al ADN por el ADN polimerasa
de E.coli porque tienen un 5trifosfato normal, pero no pueden formar un enlace
fosfodister con el nucletido siguiente,
por lo que el crecimiento de la cadena se
detiene. En la mezcla de la reaccin se incluye la cadena a secuenciar, una proporcin
controlada de uno de los 4 ddNTP con su
desoxinucletido normal y los otros 3 dNTP.
Cuando se agrega polimerasa la reaccin
comienza a partir del primero hasta que se
introduce en la cadena un ddNTP, con lo
cual su crecimiento cesa. Con una proporcin correcta ddNTP:dNTP, se generan una
serie de fragmentos de distinta longitud,
dependiendo de la distancia de la ltima base
incorporada al extremo marcado del ADN.
Estos fragmentos son separados en un gel
de poliacrilamida, donde, previa autorradiografa, se determina el patrn de bandas, que
refleja la secuencia del ADN. Al principio, la
posicin de cada banda revelada en la pelcula radiogrfica se anotaba manualmente,
luego, los digitalizadores de imgenes posibilitaron la lectura directa de la pelcula. Existen actualmente secuenciadores automticos que realizan la electroforesis en gel y determinan autom-ticamente la secuencia utilizando un sistema de deteccin con lser.
Messing desarroll una serie de vectores
de clonado basados en el fago filamentoso
M13, muy tiles para el secuenciado
enzimtico. La ventaja es que slo una de
las cadenas del vector es empaquetada en
las cabezas del fago (ver Vectores de
clonacin). Este ADN de simple cadena es
ideal para utilizar con el mtodo de Sanger.
Clonando el inserto en M13, en las dos
orientaciones posibles, se obtiene una o la
otra hebra del ADN a secuenciar. Para ello se
utiliza un primer que se posiciona en un lugar adyacente a la regin de policlonado de
M13, que se llama primer universal, ya que
se puede utilizar para secuenciar cualquier
clon recombinante.
Actualmente se utilizan fsmidos (ver
Vectores de clonacin). La adicin de un
fago ayudante (helper phage) a las clulas que lo contienen, hace que el ADN del
mismo, de simple cadena, sea replicado,
empaquetado y extrado de la clula. Al ser
de menor tamao (aprox. 3000 bp) que M13
permite la insercin de fragmentos de ADN
ms largos.
Los proyectos de secuenciacin
genmica han requerido mtodos de
secuenciado ms veloces y econmicos. Para
ello se ha desarrollado una tcnica llamada
Multiplex, que permite manejar mayor cantidad de muestras en menor tiempo. Se utilizan 20 vectores plasmdicos que permiten
construir 20 genotecas diferentes a partir del
mismo ADN. Cada vector lleva dos secuencias nicas que flanquean al sitio de
clonado, que pueden ser usadas como eti-
59
quetas (tags) para el ADN clonado y estarn presentes sobre cada fragmento a ser
secuenciado. Se toma un clon de cada una
de las genotecas plaqueadas (20 colonias) y
se mezclan. Se hace crecer el cultivo, se asla
el ADN y se secuencian los plsmidos utilizando el mtodo Maxam y Gilbert. Los productos de 12 conjuntos de reacciones de
secuenciacin se corren en un gel y se transfieren a una membrana de nylon. El filtro se
hibrida secuencialmente (es decir, se despega una sonda para luego hibridar con las siguiente y as sucesivamente), utilizando como
sonda la etiqueta de cada uno de los 20
vectores. En cada caso se van leyendo las
secuencias correspondientes a cada uno de
los distintos vectores. De esta manera, una
sola reaccin produce datos de 20 clones a
la vez.
Actualmente existen equipos robotizados que pueden llevar a cabo dos de las reacciones ms limitantes en el proceso de
secuenciado: la deteccin de las bandas de
ADN y la traduccin de un patrn de bandas en uno de secuencia. Estos equipos utilizan nucletidos marcados con fluorocromos.
Se utilizan 4 colorantes diferentes, que al ser
exitados por lser emiten luz de diferente
longitud de onda. Los colorantes pueden
utilizarse para marcar el primer universal de
secuenciacin de M13 o cada uno de los 4
terminadores de cadena didesoxi. En este
caso, cada mezcla de reaccin con un
terminador diferente se marca con un colorante diferente. Cuando la reaccin es completada, los productos de las 4 reacciones se
mezclan y se corren en una sola calle de un
gel, en un secuenciador automtico. A medida que los fragmentos pasan a travs del l-
60
ser, sus marcas fluorescentes se excitan y

emiten luz que se detecta mediante un
fotomultiplicador. Despus de ser procesada
por una computadora, la secuencia es mostrada como una serie de picos o cromatograma, donde cada uno de los 4 colores representa a un nucletido diferente (rojo:
timina, verde: adenina, negro: guanina y
azul: citosina).
9 Lecturas Recomendadas
FTTERER, J.; GISEL, A; IGLESIAS, V.; KLOTI, A.; KOST, B.;
MITTELSTEN SCHEID, O.; NEUHAUS, G.; NEUHAUS-URL,
G.; SCHROTT, M.; SHILLITO, R.; SPANGENBERG, G.;
WANG, Z.Y. 1995. Standard Molecular Techniques for
the Analysis of Transgenic Plants. En Gene Transfer to
Plants. Potrykus, Y.; Spangenberg, G. (eds.). Springer Lab
Manual.
GRIFFITHS, A.; MILLER, J.; SUZUKI, D.; LEWONTIN, R.;
GELBART, W. 2000. An introduction to the genetic
analysis. Sptima Edicin. W:H:Freeman, N:York. 860 pp.
MICKLOS, D. ; FREYER, G. 1990. DNA Science. Cold Sprong
Harbor Lab. Press. Carolina Biol. Supply Comp. 477. pp.
MADIGAN, M.; MARTINKO, J.; PARKER, J. BROCK. 1998
(Octava Edicin). Biologa de los Microorganismos.
Prentice Hall.
NEWTON, C.; GRAHAM, A. 1997 (Second Edition). PCR.
Springer. N. York.
SAMBROOK, J.; SMITCH, E.F.; MANIATIS, T. 1989 (Second
Edition). Molecular cloning: a laboratory manual. Cold
Spring Harbor Laboratomy Press. Cold spring Harbor.
SOUTHERN, E.M. 1975. Detection of specific sequences
among DNA fragments separated by gel electrophoresis.
J.Mol. Biol. 98:503-517
WATSON, J. D.; GILMAN, M.; WITKOWSKI, J.; ZOLLER,
M. 1992 (Second Edition). Recombinant DNA. Scientific
American Books. N. York.
II.- Captulo 4
Marcadores Moleculares
Picca, Aurora; Helguera, Marcelo;
Salomn, Nelly; Carrera, Alicia
1 Introduccin
entre genes), insensible a los efectos ambientales, codominante, de rpida identificacin

y simple anlisis y de posible deteccin en los
estadios tempranos del desarrollo de la planta.
En los anlisis genmicos, se han utilizado varios tipos de marcadores genticos:
morfolgicos, isoenzimas, protenas y marcadores basados en ADN.
2 Marcadores morfolgicos
Desde sus comienzos, el objetivo del mejoramiento vegetal ha sido seleccionar

genotipos superiores a partir del reconocimiento de fenotipos superiores. El grado de
xito en este proceso depende de i) el control gentico de la caracterstica, es decir el
nmero de genes que la codifican y controlan (herencia monognica o polignica) y las
relaciones interallicas (dominancia o
aditividad), ii) el grado de influencia ambiental que se mide normalmente a travs del
parmetro de heredabilidad. Una serie de
tcnicas moleculares de gran desarrollo en los
ltimos veinte aos permiten conocer la informacin gentica que los organismos portan. Funcionan como sealadores de diferentes regiones del genoma y se los conoce en
forma genrica como marcadores moleculares. Son ampliamente utilizados en
gentica humana, vegetal, animal y
microbiana. Permiten evidenciar variaciones
(polimorfismos) en la secuencia del ADN
entre dos individuos, modifiquen stas o no
su fenotipo. En relacin a los vegetales son
de utilidad en estudios evolutivos y de
gentica poblacional, manejo de bancos de
germoplasma, identificacin, proteccin legal
de germoplasma, mapeo, seleccin asistida
por marcadores y clonado de genes.
Para que un carcter sea considerado un
marcador gentico debe mostrar una variacin experimentalmente detectable entre los
individuos de la poblacin y un modo de herencia predecible segn las leyes de Mendel.
Esta variacin puede ser considerada a diferentes niveles biolgicos, desde cambios
fenotpicos heredables significativos hasta la
variacin de un solo nucletido. Un marcador ideal debe ser: altamente polimrfico o
variable dentro y entre especies, de herencia
mendeliana no episttica (sin interaccin
Son caractersticas fenotpicas de fcil

identificacin visual tales como forma, color,
tamao o altura. Muchos de ellos se convierten en importantes descriptores, a la hora
de inscribir nuevas variedades. Por ejemplo,
alrededor de 50 caracteres de plntula, tallo,
hoja, espiga, espiguilla y cariopse se utilizan
para inscribir e identificar variedades de trigo
en la Secretara de Agricultura Ganadera Pesca y Alimentacin. Este tipo de marcadores
contribuy significativamente al desarrollo
terico del ligamiento gentico y a la construccin de las primeras versiones de mapas
genticos. Un gran nmero de marcadores
morfolgicos ha sido mapeado en tomate y
maz. En girasol, los primeros hbridos se obtuvieron utilizando el color de hipoctile
como marcador ligado al gen ms de
androesterilidad; de este modo las plantas
verdes que eran androestriles se utilizaban
como lneas maternas y las plantas con
antocianas que eran frtiles se eliminaban del
lote de produccin al comienzo de su desarrollo.
Las principales limitaciones de los marcadores morfolgicos se encuentran en: i) nmero reducido de marcadores disponibles en
cada poblacin, ii) bajo nivel de polimorfismo,
iii) pueden producir alteraciones fenotpicas
que dificultan el desarrollo de la planta, iv)
varios se hallan bajo control polignico, v)
dominancia, vi) muchos de ellos se expresan
en estado de planta adulta, lo cual prolonga los tiempos de evaluacin en los programas de mejoramiento. No obstante, los
marcadores morfolgicos permanecen como
caracteres tiles en la identificacin de materiales dado que representan un conjunto de
genes que pueden ser evaluados con mtodos sencillos y a bajo costo.
61
3 Isoenzimas
Se definen como diferentes formas
moleculares de una enzima, que poseen una
actividad cataltica comn, es decir actan
sobre el mismo sustrato. Ciertos cambios en
el ADN que codifica estas enzimas (mutaciones) pueden resultar en cambios en la composicin de aminocidos, originando protenas con la misma actividad biolgica pero con
diferente carga neta y por tanto con diferentes velocidades de migracin en un campo elctrico. Estas diferencias determinan
patrones caractersticos de migracin
electrofortica de las formas iso-enzimticas.
Varios factores determinan el patrn de
bandas o zimograma:
1) Nmero de genes que las codifican.
La presencia de varios genes codificando para
una misma enzima ha sido atribuida a procesos de duplicacin gnica y subsecuente divergencia a travs de mutaciones diferentes
en cada caso.
2) Estados allicos. El proceso ms simple de generacin de nuevas formas
enzimticas es la mutacin de un gen estructural; las variantes allicas se denominan
aloenzimas. Estos marcadores muestran
codominancia
3) Estructura cuaternaria de los productos proteicos. La enzima funcional puede
estar compuesta por un nmero variable de
sub-unidades. En las formas ms simples o
monomricas los individuos homocigotas presentan una banda y los heterocigotas simplemente la suma de ambas. Cuando la estructura cuaternaria se vuelve ms compleja,
encontramos enzimas activas compuestas
por dmeros, tetrmeros, etc.. En este caso
el individuo heterocigota presenta bandas
adicionales no presentes en los homocigotas,
que se generan por la combinacin de subunidades codificadas por los distintos alelos
o loci. (Fig. 1).
4) Compartimentalizacin subcelular. Se
encuentran formas enzimticas localizadas
en citoplasma, cloroplasto o mitocondria,
codificadas todas por genes nucleares pero
con diferentes velocidades de migracin.
Las isoenzimas se obtienen por
homogenizacin del tejido (semilla, raz, hoja)
62
Figura 1: Locus isoenzimtico Pgd-3 en girasol. Variantes

allicas a y b. Genotipos parentales P1, P2 homocigotas y
F1 heterocigota
en soluciones buffer y se analizan mediante electroforesis en un soporte slido, generalmente almidn. El gel puede ser cortado
en capas horizontales y cada una se destina
a una solucin de revelado especfica que
consta de un sustrato, un colorante y
cofactores, disueltos en un buffer apropiado.
La preparacin del gel es relativamente simple y el equipamiento es de bajo costo.
Las enzimas se clasifican de acuerdo a su
funcin y se representan con una sigla de tres
letras. Por ejemplo: dehidrogenasas (alcohol
dehidrogenasa ADH, glutamato dehidrogenasa GDH), oxidasas (peroxidasas PRX),
hidrolasas (fosfatasas cidas ACP, esterasas
EST), isomerasas (fosfoglucoisomerasa PGI) y
transferasas (fosfoglucomutasas PGM). Los
loci en general se representan con las tres
letras sealadas en tipo cursiva y se agrega
un nmero para designar al locus y una letra
para el alelo, de acuerdo a distancias decrecientes de migracin. Por ejemplo: Adh-1a,
Adh-1b, Adh-2a, Adh-2b, Adh-2c.
Las isoenzimas han tenido un rol prominente en estudios de poblaciones vegetales
para determinar variabilidad y estructura
gentica, sistemtica y biologa evolutiva as
como en descripcin de germoplasma e identificacin de variedades. Su aplicacin en la
construccin de mapas se ha visto limitada
por el nmero de marcadores isoenzimticos
disponibles, en general menor a 50 y por su
reducido polimorfismo, 2-4 alelos. Por otro
lado, las formas enzimticas extradas de hoja
o raz (no as las de semilla) presentan variaciones en relacin a las condiciones ambientales de crecimiento y a la edad del tejido, lo
cual afecta la reproducibilidad de los
zimogramas. No obstante, estos loci representan importantes marcas de referencia
para relacionar mapas obtenidos a partir de
PICCA, Aurora; HELGUERA, Marcelo; SALOMN, Nelly; CARRERA, Alicia
distintos marcadores de ADN.

4 Protenas de reserva
El endosperma de los cereales es el principal componente de la semilla ya que representa aproximadamente el 80-90% de su
peso seco. Almidn y protenas son las dos
macromolculas ms importantes. El contenido de protena vara segn la especie y el
manejo de cultivo a campo. Los valores ms
altos se dan en trigo y avena (10-17%) y los
ms bajos en maz y arroz (6%). La concentracin de protenas en los cereales es apreciablemente menor que en las leguminosas
ya que en stas los rganos de reserva o
cotiledones son capaces de almacenar hasta
un 40% de su peso seco en protenas.
Las protenas del endosperma fueron estudiadas ya a comienzos del siglo pasado por
Osborne, quin dio las bases para las clasificaciones actuales. La misma se basa en la
solubilidad relativa en diferentes solventes:
albminas solubles en agua, globulinas en
solucin salina, prolaminas en alcohol y
glutelinas en cidos o lcalis. Para el grupo
de las prolaminas se ha asignado un nombre
especfico para cada uno de los cereales. De
esta manera en maz se la denomina zena,
en cebada hordena, en avena avenina y en
trigo gliadina. En el caso especfico de trigo a
las glutelinas se las conoce con el nombre de
gluteninas.
En la mayora de los cereales las
prolaminas y glutelinas estn codificadas por
varios genes relacionados conformando familias. Durante la evolucin de estos genes
se han detectado duplicaciones, translocaciones, inserciones de elementos mviles
entre otros re-arreglos cromosmicos. Estos
cambios genticos han generado un alto nivel de polimorfismo proteico entre especies,
as como entre variedades de la misma especie. Adems, el anlisis gentico de cruzamientos ha demostrado que la variacin en
el patrn de protenas es debida a la existencia de variantes allicas en cada locus.
Las glutelinas se analizan en geles
discontinuos de poliacrilamida con dodecil
sulfato de sodio, en medio bsico (SDS-PAGE)
utilizando diferentes tamaos de poros (tamiz molecular) (Fig. 2). El fraccionamiento de
las prolaminas se realiza en electroforesis ci-
Figura 2: Fraccionamiento de Gluteninas en variedades

de trigo por SDS-PAGE para su correlacin con variables
de calidad industrial.
da (A-PAGE), en geles continuos, utilizando

el principio de diferencias en la carga elctrica. La visualizacin se realiza en ambos casos
mediante tincin con Coomassie Brilliant Blue
R250.
En trigo pan, Triticum aestivum, los genes
estructurales para las dos principales protenas, gluteninas y gliadinas, estn confinados
al conjunto de los cromosomas homelogos
(cromosomas parcialmente homlogos pertenecientes a los tres genomas) 1 y 6. Los
genes para las subunidades de gluteninas de
alto peso molecular (GAPM) estn ubicados
en el brazo largo de los cromosomas 1A,1B y
1D, cercanos al centrmero. Las gluteninas
de bajo peso molecular (GBPM) son codificadas por genes ubicados en los brazos cortos
de ese mismo grupo de cromosomas, distantes del centrmero.
El patrn electrofortico de las gliadinas
muestra cuatro grupos proteicos denominadas a, b, g y w gliadinas. Las fracciones g y w
se encuentran codificadas por genes del
cromosoma 1 de los tres genomas, prximos
al grupo de genes correspondientes a GAPM.
Los genes de las fracciones a y b se ubican en
el brazo corto de los cromosomas 6A, 6B y
6D.
La localizacin cromosmica de los genes
de protenas en trigo se ha establecido principalmente utilizando materiales aneuploides
tales como nulismicos o tetrasmicos de la
variedad Chinese Spring. La posicin relativa
del locus sobre el cromosoma fue determinada por cruzamientos entre lneas con contenidos contrastantes de protena y determinando la frecuencia de recombinacin en
la progenie. La posicin cromosmica de estas protenas ha sido estable a lo largo de la
63
evolucin y han sido usadas como marcadores para el estudio de la homeologa

cromosmica de la Tribu Triticeae.
5 ADN y marcadores moleculares
Un marcador de ADN es simplemente un
punto de referencia en un cromosoma, que
puede o no corresponder a un gen. Diversas
tcnicas de biologa molecular se encuentran
disponibles para detectar variabilidad en la
secuencia de ADN. La reaccin en cadena de
la polimerasa (PCR), las enzimas de restriccin, la separacin electrofortica de los fragmentos de ADN, las sondas marcadas y las
hibridizaciones son algunas de las tcnicas
que permiten obtener un nmero virtualmente ilimitado de marcadores moleculares y cubrir la totalidad del genoma de un organismo (para ms detalles ver II.- 3)
Los marcadores moleculares pueden ser
clasificados en tres grupos:
A) Marcadores basados en la hibridacin
del ADN: los ms utilizados en plantas son
los RFLP restriction fragment length
polymorphisms o polimorfismos en la longitud de fragmentos de restriccin de ADN.
Este tipo de estudio involucra la deteccin
de un segmento especfico (marcador
molecular) en el ADN de estudio por hibridacin con un fragmento marcado
radiactivamente de secuencia complementaria al marcador (sonda). En el proceso, el ADN
en estudio es digerido por medio de una
enzima de restriccin. Este tipo de enzimas
corta el ADN en una secuencia determinada
o sitio de restriccin. La variabilidad gentica
presente en el marcador molecular se observa como diferencias en la secuencia del ADN
genmico debidas a duplicaciones, deleciones,
inserciones, etc. que modifican la distancia
entre pares de sitios de restriccin y generan
fragmentos polimrficos (de diferentes tamaos). Los fragmentos clivados por la enzima de restriccin se separan por su tamao
mediante electroforesis y se transfieren a una
membrana donde son hibridados con la sonda. En el proceso, la sonda hibrida solamente con fragmentos de ADN inmovilizados en
la membrana que presenten la secuencia complementaria a la misma. Para visualizar los
polimorfismos se expone la membrana a una
64
placa radiogrfica La ventaja de los RFLPs radica en que son altamente reproducibles,
codominantes y multiallicos. A su vez cuentan con la desventaja de ser muy laboriosos,
difciles de automatizar, requieren de infraestructura adecuada para mantener las sondas, trabajar con radiactivos, lo que los hace
relativamente caros.
Los minisatlites o VNTR variable
number of tandem repeats son repeticiones en tandem de secuencias del genoma que
contienen de 9 a 100 pares de bases. El nmero de repeticiones es variable pero en general es menor a 1000. Existen dos formas
de detectar los VNTR ya sea por hibridacin
o por tcnicas de PCR. El ADN genmico es
digerido con enzimas de restriccin que reconocen los sitios de restriccin que
flanquean las repeticiones en tandem, separado electroforticamente e inmovilizado en
una membrana. Cuando la enzima de restriccin corta las secuencias adyacentes a un locus
hipervariable, la longitud de los fragmentos
de restriccin producidos en diferentes individuos vara con el nmero de repeticiones
de minisatlites. Estos fragmentos con diferentes longitudes son detectados utilizando
sondas diseadas a partir de las secuencias
de ADN que flanquean las repeticiones o a
partir de las repeticiones mismas. Estos fragmentos pueden ser considerados como un
tipo especfico de RFLP. La diferencia bsica
entre RFLP y VNTR reside en el tipo de sonda utilizada. En la tcnica de VNRT las sondas estn constituidas por secuencias
homlogas a las secuencias repetidas de los
minisatlites, por lo tanto todos los locus
hipervariables son detectados simultneamente, mientras que en RFLP, las sondas son
homlogas a secuencias nicas del genoma,
detectando as uno o pocos loci cada vez. De
esta manera, en el autoradiograma al contrario del patrn simple de bandas obtenido por RFLP (una banda para genotipos
homocigotas o dos bandas para genotipos
heterocigotas), para minisatlites se obtiene
un perfil complejo de bandas mltiples. Una
ventaja de los VNRT, es que adems de explorar el polimorfismo en la longitud de los
fragmentos de restriccin en cada locus
hipervariable, utilizan tambin el polimorfismo en el nmero y distribucin de estos
loci a lo largo del genoma, posibilitando as
la visualizacin simultnea de diversas regiones del mismo. Las limitaciones para esta tcnica, son las mismas descriptas oportunamente para RFLP. Los minisatlites tambin pueden ser detectados mediante la amplificacin
por PCR de los segmentos conteniendo diferente nmero de repeticiones, utilizando
primers o cebadores, que flanqueen dichos
segmentos.
hebras del ADN en estudio presenten sitios

de hibridacin con el oligonucletido en
orientaciones opuestas suficientemente cercanas (menos de 3000bp) como para permitir la amplificacin. La secuencia del
oligonucletido es aleatoria al igual que los
sitios de hibridacin, por lo que la secuencia
amplificada es desconocida. El polimorfismo
que se observa entre distintos individuos consiste en la presencia o ausencia de fragmentos de ADN amplificado (Fig. 3).
DAF DNA amplification fingerprinting y AP-PCR arbitrary primer PCR
son tcnicas similares a RAPDs. DAF involucra
el uso de primers arbitrarios de longitud tan
corta como 5 pares de bases. Esto reduce la
especificidad del apareamiento con el ADN
molde y resulta en un perfil ms complejo de
bandas. La visualizacin se lleva a cabo por
medio de geles de poliacrilamida teidos con
plata. AP-PCR utiliza primers ligeramente ms
largos que la tcnica anterior (aprox. 20 pares de bases). Los productos de amplificacin
son marcados radiactivamente y tambin
pueden ser resueltos por electroforsis en
geles de poliacrilamida
La ventaja de estas tcnicas consiste en
B) Marcadores basados en la amplificacin del ADN: mediante la reaccin de PCR

polymerase chain reaction o reaccin en
cadena de la polimerasa de ADN. Esta tcnica se basa en la sntesis enzimtica de millones de copias de un segmento especfico
de ADN en presencia de una polimerasa de
ADN termoestable. Para ello se utilizan dos
oligonucletidos llamados cebadores o
primers. El segmento de ADN a amplificar
esta compuesto por dos hebras (a y b), la
secuencia de uno de los oligonucletidos
hibrida en uno de los extremos del segmento y es complementaria a la hebra a, el segundo oligonucletido hibrida en el otro extremo del segmento y es complementario a
la hebra b. Para que exista amplificacin del
fragmento es imprescindible
que ambos oligonucletidos
hibriden en secuencias complementarias presentes en
las hebras del ADN en estudio. La presencia de mutaciones en el sitio de hibridacin
de cualquiera de los
oligonucletidos impide la
amplificacin del fragmento.
La necesidad de disponer
de informacin previa acerca
de la secuencia del ADN a amplificar para disear oligonucletidos, limit inicialmente
el desarrollo de marcadores
Figura 3: RAPDs en DNA genmico de trigo candeal.
basados en la reaccin de
Genotipos parentales K y D y progenie F7.
PCR en plantas. La primera
solucin a este problema vino de la mano de que son rpidas y sencillas, de bajo costo de
los RAPDs random amplified polymorphic implementacin, automatizables y no radioDNAs o fragmentos polimrficos de ADN activas. La desventaja, adems de su baja
amplificados aleatoriamente. Esta tcnica reproducibilidad, es que es un marcador dose basa en la utilizacin de un nico minante (al observar un fragmento es impooligonucletido de 10bp que hibrida al azar sible determinar si el mismo se origin de una
con el ADN en estudio. Para que se genere o dos copias de la secuencia amplificada).
un fragmento RAPD es necesario que las dos
La disminucin en los costos de secuen-
65
ciacin y PCR, junto a la creciente informacin sobre genomas animales y vegetales han
permitido el desarrollo de marcadores basados en PCR con diferentes caractersticas,
entre ellos los ms frecuentemente utilizados
en plantas son: SSR simple sequence
repeats o microsatlites y AFLPs
amplified fragment length polymorphisms.
Los microsatlites (SSR), son regiones
genmicas hipervariables constituidas por
repeticiones en tandem de unos pocos pares de bases (1 a 4) flanqueadas por secuencias de copia nica. La base gentica del
polimorfismo detectado en microsatlites se
basa en la variabilidad del nmero de repeticiones en tandem y consecuentemente del
tamao del microsatlite amplificado en individuos de una especie. El microsatlite amplificado por PCR es sometido a electroforesis
en geles de alta resolucin que permiten detectar diferencias de 2, 3 o 4 nucletidos que
corresponden al mnimo polimorfismo de longitud en un microsatlite. Por el alto
polimorfismo que presentan por locus
(multialelismo) se los considera los marcadores ideales para el mejoramiento en especies
autgamas como el trigo. Estos marcadores
son codominantes, genoma-especficos y altamente polimrficos en comparacin con los
RFLPs y RAPDs. Su implementacin en un laboratorio requiere de mayor infraestructura
y presupuesto que los RAPDs.
C) Marcadores mixtos: AFLP (polimorfismo en la longitud de fragmentos amplificados de ADN) puede considerarse como una
combinacin de RFLP y RAPDs. Esta tcnica
consiste en esencia de cuatro etapas: 1) el
ADN genmico es cortado con enzimas de
restriccin (generalmente una de corte raro
y otra de corte frecuente). 2) adaptadores
de ADN de doble cadena se adhieren en forma especfica a los extremos de los fragmentos obtenidos en el paso anterior, generando as el molde para la amplificacin del ADN.
3) una fraccin de los fragmentos obtenidos
es amplificada selectivamente por la accin
de primers especficos que fueron diseados
para reconocer la secuencia de los
adaptadores ligados en el segundo paso, el
sitio de la enzima de restriccin, ms una a
tres bases selectivas al azar agregadas en el
66
extremo 3. El uso de bases selectivas al azar

permite la amplificacin de slo un grupo de
fragmentos de restriccin (aquellos en que
coincide la secuencia del adaptador + sitio de
restriccin + bases selectivas). 4) anlisis de la
subpoblacin de fragmentos amplificados
mediante su desnaturalizacin por electroforesis en geles de alta resolucin (poliacrilamida) y visualizacin por autoradiografa o
por tincin con nitrato de plata (Fig. 4). Su
implementacin en laboratorio requiere de
una infraestructura y presupuesto similar a los
microsatlites. Estos marcadores presentan
un alto poder de deteccin de la variabilidad
gentica, ya que se explora simultneamente el polimorfismo de ausencia/presencia de
sitios de restriccin (como los RFLP) y la ocurrencia o no de amplificacin a partir de secuencias arbitrarias (como los RAPDs). La base
del polimorfismo es la ausencia o presencia
de fragmentos amplificados de un tamao
determinado y al igual que en los RAPDs, no
es posible distinguir individuos heterocigotas
por lo que se trata de un marcador dominante. Es un marcador mucho ms robusto
Figura 4: AFLPs en trigo candeal. Cinco combinaciones

de primers para las enzimas de restriccin Pst I y Mse I
en las variedades K y D.
que los RAPDs, ya que en la amplificacin se (ARNm transcripto a ADN utilizando la enziutilizan oligonucletidos ms largos, que au- ma transcriptasa reversa). La ventaja de los
mentan significativamente la especificidad de ESTs, al ser derivados de ARNm maduro es
la reaccin sin perder las ventajas de la am- que generalmente se ven libres de intrones
plificacin de secuencias al azar (no requiere y de ADN repetitivo. Esto implica que los ESTs
informacin previa de secuencia de ADN). representan genes funcionales y son por lo
Otra ventaja de los AFLPs es el nmero de tanto ms tiles como marcadores
fragmentos (marcadores) resueltos por moleculares que las secuencias annimas.
electroforesis que oscila entre 30 - 50 contra
En una variante conocida como CAPs
los 4 10 de RAPDs.
cleavage amplified polymorphic
Para una utilizacin ms eficiente en pro- sequence, los productos de amplificacin de
gramas de mejoramiento de marcadores secuencias especficas se digieren con una
RFLPs, RAPDs y AFLPs existe la posibilidad de enzima de restriccin. Este mtodo permite
transformarlos en marcadores PCR alelo-es- identificar individuos heterocigotas, por lo
pecficos, que son econmicos, robustos y de que se comporta como marcador codomisencilla implementacin en cualquier labora- nante. La informacin para la secuencia de
torio.
los primers utilizados en CAPs puede proveExisten distintas estrategias para la con- nir de un banco de genes o de clones
versin de marcadores RFLP, RAPDs y AFLPs genmicos o de cDNA. Recientemente meen marcadores PCR alelo-especficos, en ge- diante CAPS ha sido posible seleccionar planneral ligados a un caracter de inters agro- tas de trigo hexaploide portadoras del alelo
nmico. Se conocen como STS sequence- 2NS, proviente de una translocacin de
tagged sites. En estos casos se aisla el frag- Triticum ventricosum que contiene genes de
mento de ADN polimrfico del gel, se clona, resistencia a roya Lr37, Sr38, Yr 17 (Fig. 5).
se secuencia y se disean
oligonucletidos especficos de
alrededor de 20 pb, para ser utilizados como cebadores. Cuando se parte de un fragmento
RAPD, el marcador derivado mediante este proceso es conocido
como SCAR regin amplificada de secuencia caracterizada. El paso siguiente es detectar el alelo de valor agronmico Figura 5: CAPS en trigo. Calle 1 planta control (sin amplificacin). Calles
superior, por ejemplo un alelo 2, 3, 6 y 7 plantas homocigotas para el alelo 2AS (275 pb = 166 + 109).
4 y 5 homocigotas 2NS (285 pb). Calles 8 y 9 plantas heterocigotas
asociado a la resistencia a un pa- Calles
2AS/2NS.
tgeno y el marcador entonces
se hace evidente con una simple
reaccin de PCR. El problema que enfrentan
Existen tcnicas de alta resolucin que
estas estrategias suele ser el bajo nivel de permiten detectar mutaciones a nivel de un
polimorfismo entre variedades de una espe- solo nucletido conocidas como SNPs sincie (trigo, soja, etc), lo que disminuye las po- gle nucleotide polymorphisms. Entre ellas,
sibilidades de encontrar mutaciones tiles los SSCPs single-strand conformational
para desarrollar estos marcadores. De todos polymorphism tienen la capacidad de demodos, existen antecedentes exitosos de tectar cambios de un solo nucletido en fragdesarrollo de marcadores de PCR alelo-espe- mentos de ms de 1000 pares de bases. La
cficos en trigo para locus altamente tcnica de SSCPs se basa en la movilidad de
polimrficos como pueden ser alelos de las cadenas simples del ADN en geles de
gluteninas.
poliacrilamida no desnaturalizantes, moviliLos ESTs expressed sequence tags son dad que depende tanto de su tamao como
similares a los STSs y sirven para los mismos de su secuencia. Las cadenas simples de ADN
propsitos pero derivan de clones de cDNA tienen tendencia a formar apareamientos
67
intramoleculares de bases que resultan en

una conformacin dependiente de la secuencia y con una movilidad especfica en geles
de acrilamida. Por lo tanto cambios en la secuencia del ADN, aunque sea de un solo par
de bases, causan modificaciones en la conformacin y consecuentemente en la movilidad electrofortica. Los SSCPs pueden detectarse clivando el ADN con enzimas de restriccin, separando los distintos fragmentos segn su conformacin por corrida en un gel.
Posteriormente se realiza una hibridacin de
Southern a partir del gel con fragmentos especficos como sondas para la hibridacin.
Otra metodologa para obtener SSCPs consiste en la amplificacin de un fragmento especfico por PCR y posterior corrida
electrofortica en geles de alta resolucin.
De la descripcin realizada, se desprende
que los marcadores varan ampliamente en
el grado de complejidad del mtodo, el modo
de herencia, el nivel de polimorfismo y en los
factores costo y tiempo, de gran importancia cuando los objetivos del estudio incluyen
el anlisis de un nmero elevado de individuos. La tabla 1 resume algunos aspectos
importantes a considerar a la hora de elegir
el tipo de marcador a utilizar.
Tabla 1: Comparacin entre algunos sistemas de

marcadores moleculares.
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Biology. Advances in Plant Sciences Series. Vol. 4.
Portland, Oregon. 268 p.
II.-Captulo 5
2 Anlisis del cariotipo
Citogentica
Poggio, Lidia; Naranjo, Carlos A.
1 Introduccin
Los estudios citogenticos han permitido
realizar valiosos aportes al conocimiento de
los mecanismos de aislamiento reproductivo
y modos de especiacin en plantas. La
especiacin hbrida es muy comn en el reino vegetal, en especial la especiacin por
poliploida. En estos casos la citogentica, a
travs del anlisis genmico, ha contribuido
a la resolucin del origen y evolucin de distintos grupos taxonmicos. Mutaciones
cromosmicas que alteran la morfologa de
los cromosomas jugaran un papel importante en la determinacin de los mecanismos
de aislamiento reproductivo y distintos modos de especiacin. Aun sin alterar la morfologa de los cromosomas, existen ejemplos
en los que mutaciones gnicas que afectan
el apareamiento han sido determinantes en
la evolucin de distintos grupos. La
citogentica brinda valiosos aportes para la
resolucin de problemas taxonmicos, evolutivos y aplicados. Esta disciplina tiene grandes ventajas pero tambin limitaciones y sus
aportes deben ser complementados con estudios provenientes de otros campos. Sin
embargo es importante sealar que trabajar en biologa o gentica de eucariontes,
usando tcnicas clsicas o moleculares, pero
desconociendo las caractersticas y el comportamiento de sus cromosomas puede llevar a
errores en la interpretacin de causa y efecto de muchos fenmenos. En esta contribucin se explicar brevemente la informacin
que la citogentica puede brindar, con el
anlisis del cariotipo, anlisis meitico en
hbridos y poliploides, estudio de la variacin
intra e interespecifica en el tamao del
genoma y con la citogentica molecular (hibridacin in situ, FISH, GISH), exponiendo
como ejemplos, algunos aportes realizados
por nuestro grupo de trabajo.
Las caractersticas estructurales y cuantitativas de los cromosomas (cariotipo) son

importantes en investigaciones bsicas
(taxonmicas y evolutivas) y aplicadas. Los
taxnomos y evolucionistas estn familiarizados con el hecho de que los cromosomas
son parte de un sistema dinmico que est
moldeando el proceso de evolucin. Esta variacin se expresa en caractersticas fcilmente analizables como el nmero, forma y tamao de los cromosomas y no est relacionada con complejidad gentica u
organsmica. Es importante analizar tambin,
la cantidad y localizacin de heterocromatina
(ADN repetitivo no codificante) mediante
distintas tcnicas de bandeo, y caracterizar
citoqumicamente distintos tipos de
heterocromatina utilizando fluorocromos, y
en algunos casos, identificar ADN satlite y
relacionarlo con bandas heterocromticas.
Adems, deben localizarse las regiones organizadoras del nucleolo (NOR). Es frecuente y
normal la existencia de variacin cariotpica
interespecfica. Por otro lado, aunque menos
frecuente, tambin puede existir variabilidad
cariotpica intraespecfica manifestada como
polimorfismos o politipismos cromosmicos.
Varios parmetros del cariotipo pueden
ser alterados por rearreglos estructurales. En
algunos casos puede variar el nmero
cromosmico y la simetra del cariotipo. Un
ejemplo de este caso lo constituyen las fusiones cntricas entre cromosomas con
centrmero subterminal produciendo
cromosomas metacntricos de mayor tamao, con o sin eliminacin de regiones
centromricas. El fragmento con centrmero
puede persistir como un cromosoma supernumerario o cromosoma B. En otros casos
no se encuentra variacin en el nmero
cromosmico ya que en muchos gneros el
nmero y, a veces, la morfologa cromosmica
es constante entre las distintas especies que
lo componen.
En Bulnesia (Zygophylaceae) siete de las
nueve especies que lo componen son
diploides (2n=26). Sin embargo existen diferencias importantes interespecficas en cuanto a la morfologa cromosmica, simetra del
cariotipo y tamao del genoma. El cariotipo
de B. retama es el ms asimtrico ya que
69
posee un cariotipo
bimodal por adicin de
heterocromatina en 24
de los 26 cromosomas
del complemento.
El nmero cromosmico tambin puede
variar por poliploida.
Nuevos nmeros bsicos que no tengan relacin directa con los
ancestrales pueden surgir si ocurren nuevas reestructuraciones o hibridacin entre poliploides con distintos nmeros bsicos.
Variaciones en el
cariotipo pueden ocurrir sin cambios notorios
en el exofenotipo. Sin
embargo rearreglos en
condicin heterocigota
pueden ocasionar disturbios en el apareamiento meitico e iniciar aislamiento reproductivo. Si se dan las
condiciones adecuadas
para la fijacin de estos
rearreglos pueden iniciarse eventos especiognicos que involucren
rearreglos cromosmi- FIGURA 1. A-E = Bandeo C. A, C, E = metafases mitticas. B, D = interfases. A, B =
cos. Estos procesos Zea luxurians. C, D = Zea mays ssp. mays. E = Bulnesia retama, las flechas sealan
el nico par de cromosomas metacntricos eucromticos.- F = Metafase I. Eulophia
pueden conducir, en paiveana
ssp. borealis, n = 42; las flechas muestran ejemplos de asociacin
algunos casos, a la exis- secundaria de bivalentes.- G, H = Zea luxurians x Z. diploperennis , n = 10; G =
tencia de especies Metafase I, 8 bivalentes y 4 univalentes, la flecha seala un bivalente heteromorfo;
crpticas o hermanas, H = Anafase I, 2 puentes (flechas) y 2 fragmentos (cabeza de flecha).- I, J = Zea mays
ssp mays, diacinesis. n = 10; I = dos grupos de 5 bivalentes y un cromosoma B; J =
con pocas diferencias a Asincrona meitica, 5 bivalentes en Metafase I y 10 cromosomas en Anafase I.- K =
nivel bioqumico o Zea luxurians x Z. perennis, 2n=30; metafase I, 5 trivalentes, 5 bivalentes y 5
morfolgico pero con univalentes. A-D y F-K poseen el mismo aumento. Las barras representan 10 micrones.
diferencias cromos- Ver explicacin extensa de las figuras en: Poggio et al., 1986a y b, 1999; Tito et al.,
1991.
micas que las mantendran aisladas reproductivamente.
matina constitutiva compuesta por secuenUn anlisis ms preciso de la variacin cias cortas repetidas en tandem. La
cariotpica puede obtenerse empleando tc- heterocromatina constitutiva es un componicas de bandeo que revelan marcadores nente aditivo del genoma y presenta, en
cromosmicos (secuencias de ADN altamen- muchos grupos, variacin intra e
te repetidas ricas en AT o GC, regiones orga- interespecfica. Aunque no contiene genes
nizadoras del nucleolo, etc.). El bandeo C es activos podra tener importancia en eventos
el que se utiliza de rutina y revela heterocro- regulatorios, en el desarrollo y en la organi-
70
POGGIO, Lidia; NARANJO, Carlos A.
zacin tridimensional de los cromosomas en

el ncleo. Bennett (1983, 1988) crea el trmino cariotipo natural para referirse al ordenamiento de los cromosomas de acuerdo a
la posicin real que los mismos ocupan en el
ncleo interfsico. Se han postulado varios
modelos que explican la organizacin
supracromosmica en los ncleos eucariontes
estableciendo que si bien sta no es universal, es indudable que la informacin gentica
no est contenida caoticamen-te en el ncleo sino que est ordenada de acuerdo a
patrones que actualmente no conocemos.
3 Anlisis meitico en hbridos y
poliploides
Una especie diploide con reproduccin
sexual para ser frtil debe poseer un comportamiento meitico normal, o sea que debe
poseer buen apareamiento entre
cromosomas homlogos y consecuentemente formacin de bivalentes. Ello determina
que exista buena segregacin y formacin de
gametos balanceados y frtiles. En general
el grado de apareamiento meitico es una
medida de la homologa que existe entre los
cromosomas. Esto es cierto cuando son normales los genes que regulan fisiolgicamente
todas las etapas y procesos de la divisin
meitica.
Estos principios han permitido realizar
rpidas evaluaciones de la homologa
genmica entre dos entidades por medio del
estudio meitico de su hbrido F1, cuando
stos han sido posibles de obtener
artificialmente o se los ha encontrado en
poblaciones naturales. Si el hbrido analizado es frtil y posee formacin de bivalentes
se puede concluir que hay afinidad
(homologa) entre los genomas parentales.
El grado de irregularidades meiticas es una
estimacin de diferencias gnicas y estructurales de las entidades en estudio. Configuraciones meiticas anormales como univalentes, bivalentes heteromrficos o multivalentes en Profase-Metafase I y, en estados posteriores (puentes, fragmentos, cromosomas
con cromtidas desiguales, husos multipolares, etc.,), pueden deberse a heterocigosis
para distintos tipo de rearreglos estructurales.
Si el hbrido es estril habr que analizar

si el aislamiento reproductivo postcigtico
obedece a causas gnicas o cromosmicas.
La formacin de univalentes podra significar
falta de homologa entre los cromosomas de
los progenitores y, en estos casos, el
poliploide artificial debera poseer meiosis
regular y fertilidad elevada. Sin embargo podra ocurrir que aunque las especies
parentales tuvieran una elevada homologa
en cuanto a las secuencias de ADN, los
hbridos fueran estriles, con formacin de
univalentes en su meiosis. Esto ltimo podra
deberse a la accin de genes que interfieren
con el proceso normal de apareamiento (formacin del complejo sinaptonmico, ocurrencia y/o posicin de sobrecruzamientos) o alteran la disposicin espacial de los genomas
en el ncleo provocando asinapsis.
En algunos casos la formacin de
univalentes en los hbridos se debera a divergencia cuantitativa en el nmero de copias de secuencias de ADN altamente repetidas. Este mecanismo disminuye el valor
adaptativo del heterocigota por provocar
disturbios en la alineacin estructural de los
cromosomas.
Otro caso frecuente en la naturaleza es
la existencia de hbridos diploides con formacin regular de bivalentes y desarrollo normal de los estados II de la meiosis, pero elevada esterilidad. Este fenmeno es muy comn en hbridos entre distintas especies de
Amaranthus, Prosopis y Bromus entre otros.
Stebbins (1971) ha denominado a este fenmeno hibridez estructural crptica y ocurrira cuando las especies progenitoras se diferencian en pequeos rearreglos estructurales. En estos casos se pueden formar
bivalentes pero se segregan combinaciones
gnicas inviables a las gametas.
El comportamiento meitico puede tambin verse alterado por interacciones particulares ncleo - citoplasmticas. En los
hbridos el citoplasma puede ejercer una accin diferencial sobre la condensacin
cromosmica de los genomas parentales o
en el ritmo de contraccin cromosmica durante la meiosis (alociclia genmica). Cuatro
lneas aloplsmicas fueron obtenidas por el
Ing. Agr. L. Mazoti utilizando maz (Zea mays
ssp mays) como progenitor masculino recurrente durante al menos 10 retrocruzas so-
71
bre teosinte como progenitor femenino. Estas lneas presentaron comportamiento

meitico regular con formacin de bivalentes.
Todas las lneas aloplsmicas presentaron
caractersticas citolgicas en comn. Una de
estas caractersticas es que, en mas del 50 %
de las clulas analizadas en Diplotene Metafase I, los 10 bivalentes se distribuyeron en dos grupos de cinco bivalentes cada
uno. Si bien este comportamiento meitico
fue descripto en hbridos y en razas nativas
de maz, en las lneas aloplsmicas se observa con mayor claridad y frecuencia. Otra caracterstica observada en las lneas
aloplsmicas es que, en aproximadamente
20-40% de los meiocitos en Profase I,
Metafase I y Anafase I, los dos grupos de 5 II
presentan una leve asincrona en su comportamiento meitico (es decir que, por ejemplo, un grupo de 5 II inicia la Anafase I mientras que el resto de los bivalentes permanecen en Metafase I). La drstica separacin en
dos grupos de 5 II en la mayora de las clulas
sugiere que la interaccin citoplasma de
teosinte-nucleo de maz influencia la distribucin espacial de los cromosomas en el ncleo. La presencia de dos grupos de 5 II y la
asincrona de los mismos en lneas
aloplsmicas de maz sugiere que el citoplasma de teosinte promueve la separacin y
asincrona de dos genomas diferentes con 10
cromosomas cada uno (x=5). Evidencias
citogenticas de la naturaleza poliploide del
maz y especies afines se discutirn con mayor detalle en la prxima seccin.
Citogentica de poliploides. El estudio
meitico de poliploides e hbridos entre
taxones con distinto nivel de ploida aporta
mayor informacin que el realizado en
hbridos diploides puesto que se puede analizar la afinidad relativa de distintos genomas
en el mismo fondo gentico. En estos casos
la formacin de multivalentes es decisiva para
establecer las relaciones entre genomas.
En el gnero Larrea el hbrido estril entre la especie diploide L. divaricata (2n=26)
y L. cuneifolia (2n=52) hemos encontrado,
en MI, 13 II y 13 I en un gran porcentaje de
las clulas analizadas, indicando que L.
divaricata o una especie muy afn sera un
progenitor de L. cuneifolia. El anlisis de las
asociaciones meiticas en especies e hbridos
del gnero Zea nos revel la naturaleza
72
alotetraploide del maz y especies relacionadas con 2n=20 cromosomas. En hbridos con
2n=30 cromosomas (Z. diploperennis x Z.
perennis y Z. mays ssp mays x Z. perennis) la
configuracin meitica ms frecuente fue 5
III + 5 II + 5I. Zea perennis, con 2n=40
cromosomas present, con frecuencia elevada, 5 IV + 10 II. Estas configuraciones slo
pueden ser claramente explicadas proponiendo dos genomas (A y B) de 5 cromosomas
cada uno, siendo AmAm BmBm y ApAp
ApAp Bp1Bp1 Bp2Bp2 las frmulas genmicas
postuladas para maz y Zea perennis, respectivamente. Nuestro grupo de trabajo ha
encontrado, en especies e hbridos con 2n=20
cromosomas, formacin frecuente de dos
grupos de 5 II cada uno en MI. Este doble
huso observado sera una evidencia de la
existencia de genomas ancestrales con 10
cromosomas cada uno. Adems, en alrededor del 50 % de las clulas observadas en algunas lneas de maz e hbridos interespecficos se observ asociacin secundaria de
bivalentes, sugiriendo la existencia de
homeologa entre los genomas ancestrales
A y B postulados.
Tratamientos premeiticos con soluciones
diluidas de colchicina (0,5 x 10 -4) en el gnero Helianthus indujeron apareamiento
homelogo y formacin de multivalentes en
especies que, aunque tienen origen
poliploide, posean meiosis regular con formacin de bivalentes. Los resultados obtenidos sugirieron que estos tratamientos pueden inducir apareamiento intergenmico.
Este tratamiento produce el mismo efecto
que alelos mutantes de genes que controlan
el apareamiento, permitiendo recombinacin
entre genomas que normalmente no
recombinaran. Hemos realizado tratamientos con soluciones diluidas de colchicina en
maz y Z. perennis con la finalidad de detectar recombinacin entre los genomas A y B
postulados anteriormente. El maz tratado
mostr en Diplotene-MI de 1 a 5 IV mientras
que el maz testigo slo form bivalentes.
Estos resultados sugirieron que en maz existen genomas homelogos (Am y Bm) con 5
cromosomas cada uno. El tratamiento en Zea
perennis di como resultado un incremento
en la frecuencia de IV sealando tambin
manifestacin de homeologa dentro de los
genomas A y B. El tratamiento con colchicina
de los hbridos con 2n=30 cromosomas, Z.

diploperennis x Z. perennis y Z. perennis x
Z. mays ssp mays dieron resultados diferentes. En Z. diploperennis x Z. perennis el tratamiento con colchicina provoc un aumento en la frecuencia de trivalentes, no observndose nunca IV VI. En cambio el hbrido
Z. perennis x Z. mays ssp. mays tratado con
colchicina, no slo mostr un aumento en el
porcentaje de III sino que el 43% de las clulas analizadas en Diacinesis -MI mostraron IV
y VI. Estos resultados permitieron concluir que
si se comparan los genomas Am-Bm Ad-Bd y
Ap-Bp, slo son homelogos los genomas
Am y Bm.
El anlisis conjunto de los datos obtenidos en nuestro laboratorio no slo confirma
la naturaleza alopoliploide del maz y especies afines con 2n=20 cromosomas, sino que
sugiere que en estas especies existen genes
(semejantes al Ph descripto en trigo) que
impiden el apareamiento entre genomas
homelogos.
En Amaranthus la configuracin
cromosmica de 8 II + 17 I observada en el
hbrido A. hybridus (2n=32) x A. spinosus
(2n=34), conjuntamente con la asociacin
secundaria de bivalentes observada en especies e hbridos con meiosis regular apoyaron
la hiptesis de que las especies actuales de
Amaranthus con 2n=32 cromosomas son
poliploides con x=8. EL nmero n=16 sera un
nmero bsico derivado y n=17 habra surgido por trisoma primaria.
Se han dado varios ejemplos en los cuales el anlisis meitico ha permitido dilucidar
el origen y postular modos de especiacin en
varios grupos. Como ya se ha discutido, el
apareamiento puede estar bajo control
gentico (por ejemplo genes tipo Ph) y a
menudo estos genes pueden constituir un
sistema mucho mas simple que los que controlan caracteres diagnsticos de especies y
gneros.
El establecimiento de sistemas taxonmicos basados en relaciones genmicas deben en lo posible estar apoyados por estudios citogenticos completos (cariotipo, bandeo C y fluorescente, contenido de ADN,
etc.), morfolgicos, bioqumicos y moleculares.
Adems de la utilidad en estudios
taxonmicos y evolutivos el conocimiento de
la meiosis es de importancia fundamental en

estudios aplicados. En la produccin de
hbridos o poliploides de importancia
agronmica se debe lograr un mximo de
fertilidad y esto est relacionado con el comportamiento cromosmico. Aunque no siempre la esterilidad es de origen cromosmico,
ste es un parmetro que debe ser controlado.
4 Variacin intra e interespecifica en el
tamao del genoma: evolucin y
significado adaptativo
Durante el proceso evolutivo ocurren cambios cuantitativos y cualitativos en el contenido de ADN total. En Angiospermas el tamao del genoma es muy variable entre grupos, oscilando entre 0,2 pg en Arabidopsis
thaliana a 127,4 pg en Fritillaria assyriaca
no estando esta variacin relacionada necesariamente con nivel de ploidia. El contenido de ADN (valor C) se evala mediante
microdensitometra o citometra de flujo. Si
se descarta la variacin en el nivel de ploida,
las principales causas de variacin (intra o
interespecfica) del contenido de ADN serian:
aneuploida, polimorfismo numrico para
cromosomas accesorios o supernumerarios,
reordenamientos cromosmicos con perdida
o duplicacin de material gentico y variacin
en el nmero de copias de secuencias no
codificantes.
La variacin del tamao del genoma se
encuentra, a grandes rasgos, relacionada con
diferencias en la complejidad organsmica
pues los virus tienen genomas mas pequeos que las bacterias y stas a su vez menores que el de eucariotas. Sin embargo en organismos superiores se encontr que el aumento en el valor C no estaba relacionado
con complejidad organsmica, ni era explicable por la existencia de mayor nmero de
genes funcionales (el contenido de ADN de
un alga unicelular, por ejemplo, puede ser
igual al de una angiosperma leosa). Esta
paradoja o enigma del valor C (C: contenido
de ADN del genoma haploide no replicado)
fue explicada, en parte, cuando se demostr
que en Angiospermas la variacin del tamao del genoma involucra cambios en la cantidad y proporcin de secuencias de ADN repetidas. Los estudios moleculares han reve-
73
lando gran complejidad dentro de los

genomas existiendo, adems del ADN
codificante, secuencias repetidas que no codifican tales como ADN satlite, minisatlites,
microsatlites, y elementos transponibles.
En general, la relacin ADN gnico, no
gnico disminuye con el aumento del tamao del genoma y en angiospermas con elevado contenido de ADN las secuencias repetidas pueden representar hasta el 90% del
ADN total. Estos resultados explican la naturaleza de la variacin pero plantean
interrogantes acerca del significado evolutivo de esta arquitectura repetida del genoma:
cul es el origen, funcin y/o significado de
esta variacin? cul es el papel del ADN repetido, tpicamente no codificante?, qu
relacin poseen estos cambios con la fluidez
y plasticidad del genoma en plantas? y cual
es la direccin, distribucin y extensin de
estos cambios en distintos grupos vegetales?.
Un enfoque para comprender el significado del tamao del genoma fue analizar las
relaciones que existan entre el contenido de
ADN y caractersticas celulares, organsmicas
y geogrficas. En varios grupos de plantas se
vio que las variaciones en el contenido de
ADN total estn correlacionadas positivamente con: volumen o longitud cromosmicas,
rea y volumen celular, porcentaje de
heterocromatina, longitud del complejo
sinaptonmico, duracin del ciclo mittico,
duracin de la meiosis, tiempo mnimo de
generacin, factores fenolgicos, latitud y
altitud. Bennett (1987) crea el trmino
nucleotipo para referirse a los aspectos del
ADN nuclear que afectan al fenotipo independientemente del ADN codificante. En la
literatura existen muchos datos que sugieren
que el tamao del genoma posee significado adaptativo y que los parmetros
nucleotpicos juegan un papel importante en
la evolucin, diversificacin y adaptacin a
distintos ambientes, limitando el rango de
expresin fenotpica que puede ser alcanzado por accin gnica.
Por otro lado, varios autores opinan que
las secuencias de ADN no gnico que pueden variar en el genoma no poseen significado adaptativo constituyendo ADN egosta,
parsito o ignorante. Otros investigadores
sealan que no puede descartarse la existencia de mecanismos moleculares que generen
74
ADN repetido no codificante que, en forma

oportunista, acte como mutgeno y /o
agente regulador.
En algunos organismos se ha demostrado que la transposicin de elementos mviles retrovirales pueden alterar la dinmica del
genoma provocando una inestabilidad que
se puede traducir en una sbita explosin de
variabilidad. Se conocen procesos de escisininsercin de elementos mviles produciendo
por ejemplo, plantas variegadas. Estos procesos pueden, adems, producir reestructuraciones cromosmicas alterando el orden y
posicin de los genes. Estos cambios rpidos
pueden ser potentes mecanismos evolutivos
ya que concomitantemente con el aislamiento reproductivo que implica la diferencia en
rearreglos estructurales, los mismos pueden
involucrar efectos de posicin que, en algunos casos, poseen valor adaptativo. Todos
estos procesos tienen, adems relevancia en
aspectos aplicados ms inmediatos ya que
un cambio en la posicin de un gen puede
cambiar la expresin o la funcin bioqumica
del mismo.
Se ha demostrado que el genoma de las
plantas es inestable y responde al estrs provocado por alteraciones genmicas, ambientales, cromosmicas o citoplasmticas. Estos
factores fsicos, bioqumicos o genticos inducen mecanismos de inestabilidad
insercional o modifican el numero de copias
de secuencias de ADN no codificante. La hibridacin, en la naturaleza o en prcticas de
mejoramiento, ha sido, en algunos casos, un
factor que desencadena mecanismos de aumento de ADN repetido. Otros experimentos han mostrado que la interaccin entre el
genoma y el medio resulta en una rpida
generacin de variacin. En lino, por ejemplo, se encontraron diferencias en el nmero de copias de ADN repetido entre lneas
que crecan en medios con diferentes
nutrientes. En lneas aloplasmicas de maz
hemos encontrado que el citoplasma de
teosinte provocaba activacin de elementos
transponibles concomitantemente con aumento de secuencias de ADN repetido correspondientes a las zonas heterocromticas.
El anlisis del contenido de ADN ha permitido evaluar rpidamente fenmenos de
aneuploida y poliploida generados por estrs
durante prcticas de cultivo de tejidos.
La variabilidad intraespecfica en el contenido de ADN fue informada y probada en

varios grupos taxonmicos. El maz y especies silvestres relacionadas constituyen un
ejemplo de variacin intraespecfica donde
est bien demostrada la variacin en el contenido de ADN debida a variacin en porcentaje de heterocromatina (ADN repetido)
y en el nmero de cromosomas supernumerarios. En veintiuna razas nativas de maz del
noroeste argentino ubicadas a lo largo de un
gradiente altitudinal encontramos una correlacin lineal negativa significativa entre el
contenido de ADN de los cromosomas normales (A) y la altitud de cultivo, esto significa
que el contenido de ADN de los cromosomas
del maz es menor en lugares de cultivo elevado, sugiriendo que las diferencias no pueden ser al azar y obedecen a procesos selectivos. Es interesante sealar que esta disminucin del contenido de ADN de los
cromosomas A se correlaciona con un aumento en la frecuencia de cromosomas accesorios no codificantes (B). Aunque se desconocen las causas de este cline discordante entre dos tipos de ADN supernumerario no
codificante (ADN repetido- cromosomas B),
su repetibilidad en distintos ambientes sugiere que existen fuerzas selectivas involucradas
en su mantenimiento. La presencia de
cromosomas accesorios (heterocromticos,
no codificantes sin funciones vitales para el
organismo), en razas nativas de plantas cultivadas tales como maz y centeno, es una
de las incgnitas actuales de la biologa evolutiva y aun no se comprende el papel que
pueden jugar los mismos en futuros planes
de mejoramiento. El particular modo de herencia de estos cromosomas accesorios (con
mecanismos de impulso que hacen que se
hereden con mayor frecuencia que la esperada por herencia mendeliana) abre un nuevo campo de investigacin en lo que se refiere a su utilidad como portadores de genes
tiles en programas de mejora.
En resumen, la evolucin del genoma
eucariota ha involucrado casos de amplificacin, divergencia, reamplificacin y delecin
de secuencias de ADN repetido. Estos procesos han llevado a grandes diferencias en el
tamao del genoma, quedando aun muchas
cuestiones por resolver en lo que se refiere a
los mecanismos moleculares involucrados, la
frecuencia con que ocurren estos eventos y

la relacin de los mismos con factores ambientales, genticos fisiolgicos. Resolver
estas cuestiones permitir comprender el
papel de la variacin del tamao del genoma
en la evolucin y analizar la relevancia de la
variacin del contenido de ADN con relacin
a caractersticas de importancia agronmica.
5 Citogentica molecular: resolucin de
problemas bsicos y aplicados
El hallazgo de tcnicas para identificar
genomas y cromosomas en preparaciones de
rutina ha representado un gran progreso en
la citogentica vegetal, ya que disponer de
marcadores cromosmicos permite estudiar
la organizacin del genoma y la arquitectura
nuclear. Las tcnicas de bandeo (C, fluorescente) permiten revelar zonas de ADN altamente repetido (heterocromatina constitutiva), pero no diferencian la composicin
molecular del ADN. En ausencia de bandas
marcadoras no es posible identificar
cromosomas con morfologa similar. Adems
en especies algamas suele existir
polimorfismo para nmero y posicin de zonas heterocromticas, lo que dificulta la caracterizacin cromosmica y la deteccin de
regiones introgresadas. Un notable ejemplo
de polimorfismo y politipismo para bandas
heterocromticas lo constituye el estudio de
lneas y razas nativas de maz. Los marcadores moleculares combinados con la
citogentica resultaron ser de gran utilidad
para entender la organizacin cromosmica
y la distribucin fsica de las secuencias repetidas. El gran potencial de las tcnicas de hibridacin in situ resulta de combinar informacin acerca de la morfologa nuclear o
cromosmica con la informacin molecular de
la estructura de las secuencias. Aunque estas
tcnicas se conocen desde 1969 utilizando
marcacin radioactiva, en plantas se comenz a aplicar a fines de la dcada del 80 debido a la gran disponibilidad de secuencias
clonadas para utilizar como sonda. Adems,
la posibilidad de utilizar ADN genmico total
como sonda ( GISH) y modernos sistemas de
marcacin y deteccin no radioactivos han
impulsado el uso de esta tcnica en forma
rutinaria, complementando los resultados
obtenidos por metodologas ms clsicas.
75
Mediante la aplicacin de estas tcnicas se

obtienen datos que podrn ser utilizados en
estudios de sistemtica, filogenia,
biodiversidad, evolucin, mejoramiento y
biotecnologa.
La hibridacin in situ (ISH) de sondas de
cidos nucleicos en preparaciones cromosmicas involucra cuatro pasos fundamentales que son: 1) Obtener una sonda marcando secuencias de ADN; 2) reaccin de hibridacin entre la sonda y el ADN blanco
(cromosomas), ambos desnaturalizados previamente. Las secuencias complementarias de
la sonda y del ADN de los cromosomas
hibridarn, en relacin a su homologa, en
un sitio citolgico; 3) remocin de la sonda que no se uni o que se hibrid en forma
inespecfica; 4) Deteccin de la hibridacin y
visualizacin de la hibridacin a travs de
fluorocromos.
Una de las aplicaciones de esta tcnica
(FISH o fluorescent in situ hybridization) es
la obtencin de un mapa fsico, funcional y
estructural del genoma utilizando secuencias
de distinto origen como sondas. El anlisis
de la organizacin fsica de secuencias repetidas, genes, secuencias clonadas (BACs, ESTs,
ver II_3), rDNA, transgenes, retrovirus, etc.,
permite identificar cromosomas, analizar la
arquitectura nuclear del genoma y verificar hiptesis acerca de la relacin entre posicin y
funcin de determinadas secuencias. Otras
aplicaciones de esta tcnica consisten en determinar la distribucin y posicin de material cromosmico extraespecfico, la existencia de apareamiento y recombinacin
intergen-mica, la existencia de segregacin
preferencial (responsables de herencia no
mendeliana de algunos tipos cromosmicos),
la presencia y tipo de rearreglos
cromosmicos y analizar la segregacin de
determinados cromo-somas en estudios evolutivos y planes de mejora. Estos son relevantes para comprender la relacin entre estos
fenmenos y variaciones en la expresin
gnica.
La hibridacin in situ utilizando ADN
genmico total como sonda (GISH o Genomic
ISH) revela homologas especficas del ADN,
principalmente en lo que respecta a secuencias repetidas y ha permitido realizar aportes relevantes en estudios evolutivos,
biosistemticos y en mejoramiento vegetal.
76
Esta tcnica ha facilitado, por ejemplo, el reconocimiento de especies parentales en

hbridos y poliploides, analizar afinidades
genmicas interespecficas, detectar reestructuraciones cromosmicas, corroborar que en
el ncleo existen dominios espaciales de
genomas o secuencias particulares, detectar
la existencia de apareamiento intergenmico
y recombinacin. Adems, permite analizar
la organizacin nuclear y desarrollo
cromosmico en especies e hbridos; detectar la presencia de cromosomas o segmentos cromosmicos introgresantes en planes
de mejoramiento; analizar afinidades
genmicas interespecficas en cuanto a variacin en secuencias de ADN repetitivo disperso y determinar la naturaleza del apareamiento meitico en generaciones segregantes de
hbridos y poliploides. Es importante sealar
que las relaciones obtenidas mediante GISH
no son afectadas por genes que producen
disturbios en el apareamiento meitico
(asinapsis, desinapsis, apareamiento
homelogo o heterlogo).
Como ya fue mencionado, el ADN repetido es el mayor componente del genoma en
la mayora de los eucariontes. En maz, por
ejemplo, el genoma est dominado por elementos repetidos, siendo la mayora de stos del tipo disperso (como, por ejemplo,
retroelementos), los que ocuparan el 33- 62%
del genoma. En el gnero Zea, por ejemplo,
existen variaciones intra e interespecficas en
el tamao del genoma. Su valor (2C) en especies con 2n = 20 oscila, en lneas y razas
argentinas de maz, entre 4,9 y 6,9 pg (5700
Mpb) y es de 9,2 pg (8878 Mpb) en Z.
luxurians. Estas variaciones, tanto intercomo intraespecficas se deberan principalmente a diferencias en la heterocromatina,
reveladas por bandeo C y DAPI, que corresponderan a secuencias repetidas en
tandem. Sin embargo, tanto este tipo de
ADN repetido en tandem, como as tambin el disperso correspondiente a los
retrotransposones, pudieron haber experimentado amplificaciones y diversificaciones
durante la evolucin de las especies del gnero Zea. La tcnica GISH es, en la actualidad, la herramienta adecuada para revelar
tales amplificaciones y divergencias. Esta tcnica puede discriminar en forma directa aquellos genomas que presentan secuencias tan
divergentes que no existe hibridacin cruza-
FIGURA 2. A-B, FISH: Zea luxurians (2n=20, A = las zonas amarillas brillantes muestran hibridacin con la sonda
Knobs de maz marcada don digoxigenina y revelada con FITC; B = contratincin con DAPI, las zonas intensamente
hibridadas en A coinciden con las zonas DAPI (+) de B.- C y D = Zea mays ssp. parviglumis , ncleo interfsico; la
mayora de las zonas DAPI (+) observadas en D muestran fuerte seal de hibridacin en C; se utiliz sonda Knob
de maz marcada con dioxigenina y revelada con FITC. E = Zea mays ssp. mays (2n=20 + 5 cromosomas B),
hibridacin con sonda rDNA pta71 de trigo, marcada con biotina y revelada con Cy3, se sealan (puntas de flechas)
los organizadores nucleolares en cromosomas y ncleo interfsico. F = Prometafase I meitica de la F1 Zea mays ssp.
mays x Zea perennis (2n=30); se observan III, II y I; la seal de hibridacin se encuentra en un trivalente (sealado
con flecha), se utiliz como sonda rDNA (pta71) como fue indicado en E. G-I = clula de Tricepiro; G = hibridada con
sonda de ADN genmico total de centeno marcado con dioxigenina y revelada con FITC (GISH), se observan 14
cromosomas con fuerte seal de hibridacin indicando que Tricepiro posee 14 cromosomas de centeno. H = igual
clula rehibridada con la sonda pSc119.2 marcada con biotina y que da fuerte seal con Cy3 (en rojo), permiti
reconocer los genomas de trigo presentes en Tricepiro. I = contratincin con DAPI. La barra representa 10 micrones,
todas con igual aumento. Ver explicacin extensa de las figuras en: Ferrari et al., 2001, 2004; Poggio, et al.,1999a,b
y 2000.
77
da entre ellas. El uso de ADN genmico total

como sonda especie-especfica tiene algunas
ventajas sobre sondas clonadas pues el ADN
genmico total incluye un rango muy amplio
de secuencias mltiple copia y es por lo tanto improbable que exista slo un lugar afn a
la sonda. Esto es una ventaja cuando se necesita una amplia especificidad, ya que una
sonda clonada sera homloga de algunos
pocos cromosomas o segmentos de
cromosomas. En los casos en que la divergencia sea leve, puede modificarse el nivel de
exigencia en la hibridacin y utilizar DNA no
marcado como bloqueante. Esta modificacin consiste en agregar a la mezcla de hibridacin ADN no marcado en alta concentracin. Este bloqueo no slo aumenta la diferenciacin entre la especie que se usa como
sonda y la que se usa como bloqueante, sino
que reduce la hibridacin cruzada con otras
especies, ya que muchas plantas de la misma
familia comparten muchas secuencias. Para
diferenciar especies y cuando la resolucin es
importante se requiere bloqueo y estricto
control de exigencia.
Estudios de hibridacin in situ (FISH, GISH)
mostraron que el cereal sinttico Tricepiro
(2n=6x=42) est compuesto por 28
cromosomas de trigo, 14 de centeno y pequeas zonas de introgresin de Thynopyrum. Mediante el uso de sondas repetidas particulares se logr identificar la totalidad de los cromosomas de Tricepiro. Experimentos con GISH han demostrado que
Bromus setifolius (2n=28), es uno de los progenitores de B. pictus (2n=70), gramnea
patagnica de potencial importancia
forrajera. En el genero Zea la tcnica GISH
nos ha permitido: analizar la afinidad
genmica entre subespecies de la seccin Zea,
y entre maz, teosinte y gneros relacionados. Mediante GISH hemos demostrado que
existen zonas de alta homologa entre
Tripsacum dactyloides (una de las especies
que pudieron haber estado involucradas en
el origen del maz) y Zea mays spp. mays. Estas zonas coinciden con regiones controladoras de la apomixis y secuencias
neocentromricas. Estos resultados apoyan
hiptesis planteadas previamente sobre la
existencia de zonas de homologa entre ambas especies que favoreceran el intercambio
78
gentico y la transferencia de genes de importancia para el mejoramiento del maz.

Estudios realizados en especies de la seccin
Luxuriantes permiti determinar, mediante
tcnicas de FISH, que Zea luxurians presentara secuencias telomricas de ADN altamente repetitivo. El anlisis de estas secuencias
marcadoras en meiosis nos permiti resolver
la constitucin cromosmica de las complejas configuraciones meiticas que se observan en hbridos intra e interseccionales. Estos resultados permitieron corroborar las frmulas genmicas planteadas para las distintas especies, avalando la hiptesis propuesta sobre el origen poliploide del maz y especies afines. Las mismas tcnicas, aplicadas en
razas de maz que presentan polimorfismo
numrico para cromosomas B, permitieron
postular hiptesis acerca del origen de los
mismos.
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luxurians, Z. diploperennis and Z. perennis: meiotic
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hybridization (GISH). Genome 42: 993-1000.
POGGIO, L., CONFALONIERI, V., COMAS, C., GONZALEZ,
G. & NARANJO, C. A. 2000. Evolutionary relationships in
79
PARTE III
Mtodos
para generar variabilidad
81
82
CARDONE, Susana; OLMOS, Sofa; ECHENIQUE, Viviana
III.-Captulo 1
Variacin somaclonal
Cardone, Susana; Olmos, Sofa;
Echenique, Viviana
1 Introduccin
El comportamiento celular normal es el
resultado de una compleja cascada de programas genticos que son sensibles a la
disrupcin por estreses biticos y abiticos.
El cultivo in vitro per se puede ser muy
estresante para las clulas vegetales e
involucra procesos mutagnicos durante el
establecimiento del explanto, la induccin de
callo, la formacin de embriones y la regeneracin de plantas. Por esta va es posible obtener variacin, de origen nuclear y/o
citoplasmtica, que podra ser utilizada para
el mejoramiento vegetal. Este proceso, denominado variacin somaclonal por Larkin
y Scowcroft (1981), involucra cambios en las
plantas regeneradas que son transmitidos a
la progenie. Asimismo cabe citar la ocurrencia in vitro de interacciones no especficas que
no generan variacin estable y transmisible,
pero que conducen a cambios en la expresin gnica. Dichos cambios, denominados
epigenticos, son tambin considerados
por algunos autores como variacin
somaclonal mientras que otros slo incluyen
en la misma los cambios estables.
Los mecanismos por los cuales ocurre la
variacin somaclonal no han sido completamente dilucidados, pero entre sus causas se
mencionan alteraciones en el cariotipo, mutaciones puntuales, recombinacin somtica
e intercambio de cromtidas hermanas,
rearreglos gnicos somticos, elementos
genticos transponibles, amplificacin y/o
metilacin del ADN y cambios en el ADN de
las organelas. Por ello, aunque los caracteres
morfolgicos (como por ejemplo el hbito de
crecimiento, la morfologa floral, etc.) son
fciles de evaluar, muchos aspectos de la variacin suceden sin manifestarse en cambios
morfolgicos evidentes. Una diferencia estructural en un producto gnico puede no
alterar su actividad biolgica lo suficiente
como para producir un fenotipo modificado.
Por ello, la variacin debe analizarse a varios

niveles.
Esta variacin depende del genotipo, de
la fuente de explanto, del tiempo en que el
material ha estado sometido al cultivo in
vitro, de las condiciones y composicin del
medio de cultivo y de la va de regeneracin,
donde la embriognesis somtica generara
menores alteraciones que la organognesis.
Los cambios producidos son generalmente indeseables, pero la aparicin ocasional de
caracteres no encontrados en las poblaciones naturales y que representan una ventaja desde el punto de vista agronmico permite utilizar este fenmeno en programas de
mejora vegetal. Se ha utilizado en algunos
casos para conferir caracteres deseables a
cultivares de importancia econmica, entre
los que se incluyen resistencia a enfermedades, tolerancia a suelos cidos y a salinidad.
El desarrollo de nuevos cultivares por esta
tcnica involucra un balance entre la cantidad de variacin inducida y el mantenimiento de los caracteres agronmicos del cultivar.
Como ejemplo puede citarse el caso de
somaclones de pasto bermuda, Cynodon
dactylon, donde se encontr resistencia a la
oruga militar en un cultivar que reuna otras
buenas caractersticas, dando origen al cultivar Brazos-R3.
Si bien desde el punto de vista prctico
no resulta una tcnica muy eficiente en todos los casos, debido a que no es posible
predecir ni dirigir el tipo de variacin y se hace
menester trabajar con grandes poblaciones
de plantas, es necesaria la compresin del
mecanismo para evitarlo en casos donde se
quiere fidelidad gentica, como en la
micropropagacin, la conservacin de
germoplasma y la transformacin de plantas.
Tambin, en algunos casos, puede representar una fuente rpida y fcilmente accesible
de variacin para ser utilizada en programas
de mejoramiento, especialmente para especies con sistemas genticos limitados y/o de
base gentica estrecha, como en el caso de
la apomixis, donde la variabilidad dentro de
las poblaciones naturales o cultivadas es limitada.
Los primeros casos de variacin
somaclonal fueron registrados en plantas de
reproduccin agmica como la caa de azcar y la papa, pero el fenmeno ha sido ob-
83
servado en monocotiledneas como trigo,

maz, avena, arroz, pasto miel (Paspalum
dilatatum) y pasto llorn (Eragrostis curvula)
y en dicotiledneas como tabaco, tomate,
zanahoria y col, entre muchas otras especies.
2 Factores relacionados con la aparicin
de variacin somaclonal
La aparicin de la variacin somaclonal
depende de varios factores, entre los que se
han citado: el genotipo, el tipo de explanto,
la va de regeneracin, la composicin del
medio de cultivo utilizado, los reguladores de
crecimiento y la duracin del perodo de cultivo.
Genotipo. En general se asume que la frecuencia de cambios depender de variaciones preexistentes en el genotipo y de las
interacciones que surgen entre el genotipo y
el proceso de cultivo. En arroz, ciertas variedades estables muestran niveles de variacin
que oscilan entre el 0 y el 1%, mientras que
en otras, consideradas inestables, oscilan
entre el 10 y el 27%. En Kalanchoe, especie
ornamental, la variacin somaclonal es
genotipo dependiente y se la utiliza como
una herramienta para la obtencin de variedades.
El nivel de ploida es otro factor a tener
en cuenta. Por ejemplo en raigrs (Lolium
multiflorum) y en papa se observ que las
variedades diploides muestran estabilidad,
mientras que las tetraploides tienden a generar aneuploidas durante el cultivo de tejidos. La explicacin ms razonable es que los
poliploides, con ms de dos juegos completos de cromosomas, estn tamponados,
y por lo tanto toleran la ganancia o prdida
de cromosomas, pudiendo as cumplir con los
requisitos impuestos por la regeneracin. En
los diploides, la prdida o la alteracin de
cromosomas que llevan genes vitales impedir la regeneracin de las plantas, llegando
con xito a esta etapa slo aquellos
explantos que tengan su complemento
cromosmico completo.
Existen evidencias de una mayor inestabilidad en hbridos interespecficos cultivados
in vitro, si se los compara con las especies
parentales. Como ejemplo puede citarse el
caso de los hbridos obtenidos de la cruza de
Hordeum vulgare x Hordeum jubatum,
84
donde el cultivo in vitro gener entre un 5%

y un 10% de regenerantes haploides que contenan slo el genoma de Hordeum vulgare.
Por esta causa ciertos cruzamientos
interespecficos suelen utilizarse como metodologa para la obtencin de haploides.
Explanto. La variacin tambin puede ser
una consecuencia de quimerismo en el
explanto original. Las quimeras son mosaicos
genticos. Esto significa que dentro de una
misma planta existen clulas con diferente
constitucin gentica, lo cual se debe a una
serie de cambios producidos durante el desarrollo en el ADN nuclear de ciertos tipos
celulares. Si estos tejidos se utilizan como
explantos y sus clulas son inducidas a dividirse y rediferenciarse, las diferentes lneas
celulares podran entonces dar origen a plantas genticamente diferentes. Por lo tanto,
la utilizacin de explantos con tejidos quimricos preexistentes puede resultar en una
fuente extra de variacin. Sin embargo, la
recuperacin de quimeras a partir de
explantos no quimricos es un fenmeno frecuente que puede ocurrir a partir de procesos organognicos.
La utilizacin de explantos con tejidos
organizados como esquejes radicales o
caulinares sera una buena opcin si es necesario mantener estabilidad gentica durante el cultivo in vitro. Sin embargo, diferentes
genotipos reaccionan de manera distinta,
an con explantos seguros. Parecera que
el cultivo de meristemas aislados sera la mejor opcin para minimizar el riesgo de variacin somaclonal. Sin embargo, esto no debera tomarse como regla. Utilizando tcnicas moleculares fue posible detectar la ocurrencia de variacin en plantas de frutilla y
paraso obtenidas a partir de meristemas.
El cultivo de protoplastos parecera inducir, en ocasiones, inestabilidad gentica, como
fue observado en papa y Nicotiana. Esto,
en ocasiones, ha sido asociado a los mayores tiempos en cultivo involucrados en la regeneracin de plantas a partir de explantos
tan pequeos.
La va de regeneracin tambin tiene un
rol importante en la ocurrencia de alteraciones en plantas obtenidas in vitro. En especies de los gneros Pennisetum, Panicum, y
Lolium la variacin observada en cultivos
embriognicos es relativamente menor que
la que aparece en cultivos organognicos.

Esto probablemente se debe a la gran presin de seleccin impuesta en la formacin
de los embriones, mayor que la requerida
en la formacin de vstagos. Se postula que
el gran nmero de genes requeridos para la
iniciacin y maduracin de embriones
cigticos y somticos impedira la acumulacin
de mutaciones deletreas. Sin embargo, se
observaron variantes en plantas de caf, apio
y caa de azcar regeneradas a travs de
embriognesis somtica. En estos casos se
observ que algunos fenotipos anormales de
embriones somticos se asemejan a los
mutantes del desarrollo embrionario obtenidos en Arabidopsis y maz.
La mayor parte de la variacin obtenida
in vitro parece provenir de la fase de callo.
La iniciacin de un callo puede ser anloga a
la respuesta de las plantas a heridas, que se
sabe que activan elementos transponibles y
estimulan la induccin de enzimas y productos especficos que se inducen tambin en
situaciones de estrs. Cuando comienza la
divisin celular a partir de tejidos diferenciados, que dar origen a un callo, se incrementa
el riesgo de inestabilidad cromosmica. La
variacin que ocurre en los nmeros
cromosmicos en la primera fase de la induccin del callo sera el resultado de fragmentacin nuclear seguida por mitosis de los fragmentos nucleares, combinada con la mitosis
normal de los ncleos intactos (ncleos
euploides).
La naturaleza del callo tambin puede
afectar el nivel de variacin obtenida. Un callo verdadero es una masa de clulas
desdiferenciadas
que
proliferan
desorganizadamente, lo cual probablemente genera considerable variacin. En varias
monocotiledneas, el callo representa, a
menudo, una masa de rganos suprimidos o
proembriones ms que un tejido completamente desorganizado. Este tipo de callo
mantiene un alto grado de estabilidad
gentica, como se ha observado en esprrago. En un estudio realizado en Cymbopogon
se observ que muchas de las plantas regeneradas a partir de callos de semilla fueron
anormales, mientras que las obtenidas por
callos de inflorescencias fueron muy semejantes a las plantas de las cuales provenan los
explantos. En ocasiones tambin fue posible
observar variacin en plantas obtenidas por

regeneracin directa, es decir, sin que medie
un proceso previo de desdiferenciacin celular y formacin de callo.
Medio de cultivo. El estado fsico del
medio de cultivo tambin influye en el nivel
de variacin obtenida. Un mismo explanto
puede tener diferente comportamiento si se
lo cultiva en medio slido o en medio lquido. Otro factor importante es la temperatura, que puede inducir inestabilidad cariotpica
o puede incrementar el nmero de plantas
albinas.
Los reguladores de crecimiento, principalmente el 2,4-D (cido 2,4 diclorofenoxiactico) han sido sealados como inductores
de inestabilidad. Ejercen profundos efectos
sobre la respiracin celular, el consumo de
azcares y en el control de la divisin celular.
Por ello se especula acerca de su rol indirecto
en la induccin de cambios en el metabolismo celular y tisular de plantas creciendo in
vitro. Si bien el modo de accin herbicida del
2,4-D no es totalmente comprendido, aparentemente involucra un incremento sustancial en la transcripcin que puede alterar la
estructura de la cromatina, siendo utilizado
en gramneas como inductor de
aneuploidas. Lo que algunos autores sugieren es que el 2,4-D induce desdiferenciacin
y este proceso sera el generador de los cambios.
La fragmentacin nuclear amittica citada anteriormente observada en algunas
plantas regeneradas tambin se reconoce
como causa de aneuploida. Este fenmeno
es causado por una relacin especial
auxina:citocinina.
El 2,4-D, el AIA (cido indolactico) y el
ANA (cido naftalenactico) han sido sealados como los responsables de los incrementos en la metilacin de la citosina que tiene
lugar durante el cultivo in vitro. Los sectores
en el ADN, donde la citosina se encuentra
metilada en posicin 5 son considerados puntos calientes de mutacin, ya que la
desaminacin de una 5-metil citocina resulta
en un cambio de la base de citocina a timina.
Las auxinas naturales y sintticas tienen una
elevada correlacin con el porcentaje de 5metil citocina, las citocininas no tienen efecto en este sentido.
85
Estudios tendientes a analizar los efectos

de los reguladores de crecimiento sobre la
regeneracin de plantas a partir de
protoplastos, realizados en papa, indicaron
que la variacin en el tipo y concentracin
de reguladores de crecimiento en los estadios iniciales de cultivo no generara variacin
gentica. Sin embargo, si el cambio en la composicin de los reguladores ocurre en el estadio que va desde el crecimiento del callo a la
iniciacin de los vstagos, se generan elevados niveles de variacin gentica. Estos datos sugieren que la fase de callo sera un perodo sensible en el cual la manipulacin hormonal afecta la estabilidad de las plantas
regeneradas, de manera que las hormonas
induciran la inestabilidad gentica sin ser,
necesariamente, el origen de la misma.
Otro factor a considerar es la deficiencia
de oxgeno que se genera durante el curso
del cultivo. La tensin de oxgeno de las clulas en la superficie del callo es diferente a la
de aquellas clulas que se encuentran situadas profundamente en la masa del mismo.
La anaerobiosis resultara en la produccin de
etanol, el cual podra comportarse como un
mutgeno.
Tambin existen especies de plantas que
producen compuestos mutagnicos durante
el cultivo. Un efecto similar podra tener la
acumulacin de metabolitos producidos por
las propias clulas durante el proceso. Se ha
mencionado que las condiciones de cultivo
in vitro podran afectar los niveles de resistencia celular al efecto de los metabolitos que
normalmente se encuentran presentes en los
tejidos en bajas concentraciones.
La edad del cultivo es otro factor que
afecta el nivel de variacin, aumentando la
proporcin de variantes en cultivos envejecidos y tambin en plantas obtenidas a travs
de varios subcultivos. Esto se ha observado
en ajo, maz, avena, tabaco, triticale y raigrs
triploide. La variacin puede minimizarse realizando subcultivos frecuentes de explantos
no envejecidos. El nmero ptimo de
subcultivos podra estimarse empricamente
luego de realizar pruebas de fidelidad
gentica en las plantas regeneradas a travs
de subcultivos subsecuentes. Una observacin
comn es que en los perodos prolongados
de cultivo hay una prdida de totipotencia y
que esto sucedera debido a la acumulacin
86
de mutaciones y a la alteracin de los genes

que son responsables de la regeneracin. Sin
embargo, un estudio realizado por nuestro
grupo de trabajo en la UNS, en colaboracin
con el IBONE, demostr que las variaciones
se producen al azar en los diferentes
subcultivos, no habiendo una relacin lineal
entre el nmero de subcultivos y la cantidad
de variacin obtenida en plantas
micropropagadas de paraso gigante. La variacin en este caso se detect mediante la
tnica de RAPD a lo largo de de 10 subcultivos
(Olmos y col., 2002).
La deficiencia o exceso de minerales tambin podra afectar la estabilidad gentica in
vitro. Se ha observado que las deficiencias o
excesos de azufre, fsforo, nitrgeno, calcio
y magnesio pueden resultar en cambios
genmicos. En la variedad de lino Stortmont
Cyrrus se detectaron cambios genticos estables y heredables inducidos por una alta
fertilizacin del suelo con fsforo o con nitrgeno. Varias lneas estables obtenidas,
fundamentalmente una llamada L y otra
llamada S, denominadas genotrofos, se
caracterizaron por poseer diferentes contenidos de ADN nuclear, de ADN repetitivo y
diferencias a nivel del ADN ribosomal.
3 Cambios genmicos producidos
durante el cultivo de tejidos
Las plantas poseen una amplia capacidad
de acomodarse a las situaciones cambiantes
de su entorno, pero en algn momento esa
capacidad de amortiguacin se vuelve deficiente y los organismos caen en un estado
de crecimiento subptimo que podra inducir a mecanismos generadores de cambios
genmicos. Las bases metablicas de la
interaccin entre el estrs y estos cambios
son desconocidas. Sin embargo, en la literatura se menciona la posibilidad de ocurrencia de alteraciones a nivel del ADN a consecuencia de diferentes estreses ambientales,
dependiendo de la intensidad del estrs y
del estado de diferenciacin de las clulas en
el momento de experimentarlo. Estos cambios ocurren probablemente debido a un
mecanismo de respuesta al estrs que comprende la prdida del control del ciclo celular. En el caso de un callo, la desdiferenciacin
que se produce durante la induccin del mis-
mo provoca en las clulas una serie de procesos metablicos que resultan en

reordenamientos genmicos que podran
dar lugar a fenotipos alterados.
Entre las alteraciones genticas registradas durante el cultivo in vitro pueden citarse
mutaciones gnicas, cambios cromosmicos que involucren la estructura o el nmero de los cromosomas y activacin de
elementos genticos transponibles. Tambin existen anomalas, como el intercambio
entre cromtidas hermanas o el crossing
over somtico, que pueden alterar su frecuencia de aparicin en plantas regeneradas
respecto de plantas que no pasaron por cultivo in vitro.
Varias hiptesis han intentado explicar y
relacionar la serie de eventos que tienen lugar durante el cultivo in vitro, como por ejemplo las perturbaciones del ciclo celular, las
aberraciones estructurales y numricas, los
cambios en la metilacin y las mutaciones
gnicas. Kaeppler y Phillips (1993) han propuesto una base molecular comn para todos estos eventos mutagnicos. Tal mecanismo podra afectar la expresin gnica y la
estructura de la cromatina. Un posible mecanismo involucra alteracin en los patrones de
metilacin. Esta hiptesis establece que el
estrs inducido por el proceso de cultivo in
vitro, al involucrar efectos hormonales y
desbalance en el conjunto de nucletidos,
provoca alteraciones en los patrones de
metilacin del ADN. Estas alteraciones podran afectar la expresin de genes especficos, incluyendo elementos transponibles y/
o podran afectar la estructura de la
cromatina de una manera ms global,
involucrando, por lo tanto, a un gran nmero de genes. Los cambios en la metilacin del
ADN podran estar relacionados con la
replicacin tarda de la heterocromatina, que,
en definitiva resulta en eventos de ruptura
cromosmica.
El mecanismo por el cual se producen los
cambios en metilacin no ha sido totalmente dilucidado. Kaeppler y Phillips (1993) indican que plantas bajo estrs severo de
nutrientes o de agua no presentan estos cambios de metilacin encontrados en los
regenerantes de cultivo in vitro. Esto podra
indicar que la variacin en metilacin no es
una respuesta general a todos los estreses.
El cultivo de tejidos podra representar, por

lo tanto, un tipo muy particular de estrs que
podra inducir una respuesta nica y un perfil
particular de mutacin. Un posible efector de
esta variacin en la metilacin sera la alta
concentracin de reguladores de crecimiento utilizada para inducir a las clulas a crecer
en cultivo. El 2,4-D provoca cambios en la estructura de la cromatina en pices de raz de
echalote y tambin en cultivos de clulas humanas. Las auxinas podran ejercer el mismo
efecto durante el cultivo de tejidos vegetales.
Se cree, adems, que los cambios en los
modelos de metilacin causados por el cultivo de tejidos no seran aleatorios. En este
sentido, en raigrs se ha propuesto la existencia de puntos calientes de inestabilidad
en el ADN genmico.
Los puntos de ruptura de muchas de las
alteraciones estructurales presentes en las
plantas regeneradas se hallan en zonas
heterocromticas, de manera que parecera
que la variacin somaclonal no es al azar y
que habra loci especficos que tendran mayor tendencia a la mutacin. Los cambios
estructurales que no estn asociados a cambios en el dosaje gnico o a cambios en la
regulacin suelen pasar desapercibidos
fenotpicamente, pero pueden causar infertilidad.
Por otra parte ocurren tambin cambios
genmicos que involucran alteraciones en el
nmero de cromosomas, como aneuploidas
y poliploidas. La poliploida es el ms comn
de estos fenmenos y estara relacionada con
fallas en la mitosis, mientras que la
aneuploida puede surgir por segregacin
desigual en la mitosis o por fragmentacin
nuclear, seguida de mitosis. A veces estos
cambios en el nmero cromosmico pueden
afectar el fenotipo a travs de dosajes
gnicos alterados. En papa, por ejemplo, se
observaron fenotipos aberrantes por
aneuploida o por duplicacin cromosmica;
sin embargo, no todos los regenerantes
aneuploides o poliploides pudieron detectarse a nivel fenotpico.
Los cambios pueden ocurrir tambin en
el genoma de los plstidos y las
mitocondrias. Como ejemplo puede mencionarse la restauracin parcial de la fertilidad
en plantas de sorgo androestriles obteni-
87
das in vitro. Tambin puede citarse el caso

del cultivo in vitro de plantas androestriles
de maz con citoplasma T (susceptibles a
Helminthosporium maydis), que condujo a
la reversin de la androesterilidad y de la susceptibilidad. Estos cambios se corresponderan con mutaciones en el ADN mitocondrial.
Otro caso de variacin debida al cultivo
in vitro es el albinismo, problema que se presenta frecuentemente en el cultivo de
anteras en las Gramneas. El anlisis de los
genomas de cloroplastos de plantas albinas
de trigo obtenidas a partir del cultivo de
anteras revel la presencia de deleciones y
rearreglos. Si bien parecera que los tejidos
somticos son menos sensibles a la variacin,
tambin se ha observado albinismo en plantas regeneradas a partir de los mismos.
Como puede apreciarse a travs de los
casos mencionados, son varios los mecanismos que conducen a la variacin somaclonal.
Como se mencionara anteriormente existen,
adems, variaciones epigenticas, que no
son estables y que son el resultado de cambios en los patrones de metilacin del ADN y
de amplificaciones gnicas, provocados por
las condiciones microambientales del cultivo
de tejidos. Caractersticas tales como el acostumbramiento a la citocinina y la resistencia
a heladas pueden citarse como ejemplos de
este tipo de variacin.
La comprensin de los mecanismos por
los cuales ocurre la variacin somaclonal ayudara a comprender y definir los procesos celulares de respuesta al estrs y permitira definir cmo los mismos actan en los procesos
de evolucin (Kaeppler et al., 2000).
4 Niveles de deteccin de la variacin
somaclonal
Es evidente que los mecanismos que operan para inducir variacin son numerosos y
diversos, y probablemente actan simultneamente, conduciendo a cambios en caracteres cuali y cuantitativos. Detectar y analizar los distintos niveles de modificaciones
genmicas generadas por cultivo in vitro reviste inters desde un punto de vista prctico, ya que las mismas podran ser potentes
fuentes de material para seleccionar caracteres de inters y, desde un punto de vista terico, ya que posibilitaran realizar estudios
88
bsicos acerca de la variacin y el posible control de la misma.

La ocurrencia de variacin somaclonal
puede detectarse con marcadores
fenotpicos, bioqumicos y moleculares. La
correlacin de dichos marcadores con caracteres agronmicos es un requisito relevante
para su implementacin en los programas de
mejoramiento. Se citan a continuacin algunos ejemplos de la utilizacin de marcadores
de varios tipos en la evaluacin de la variacin somaclonal..
La utilizacin de marcadores morfolgicos para detectar variantes somaclonales
ha sido exitosa y citada en varios trabajos de
investigacin. El examen visual y la utilizacin
de un analizador de imgenes posibilitaron
la diferenciacin entre fenotipos normales y
aberrantes de plantas regeneradas de
Pelargonium x hortorum Ro. Plantas de
(man) presentaron variaciones epigenticas
en altura, tamao de hojas, nmero y peso
de semillas. El cultivo in vitro de yemas de
anan dio como resultado plantas que exhiban cambios estables en el tamao de frutos, tasa de proliferacin de vstagos y color
y textura de las hojas; el cultivo de tejidos
de violeta africana, variedad Crimson Frost,
result en un 67% de variacin en el color de
las flores de las plantas regeneradas.
A nivel fisiolgico, se detectaron y seleccionaron variaciones en cultivo de clulas
y tejidos por presentar resistencia a enfermedades, tolerancia a herbicidas, sales, diferencias de crecimiento en condiciones de pHs
variables, entre otros, tanto para cereales
como para plantas frutales. La mayora de
estos estudios se basaron en la
implementacin de una alta presin de seleccin durante la etapa de regeneracin celular mediante la adicin de agentes selectivos en el medio de establecimiento y regeneracin, tales como inculos, toxinas, herbicidas, condiciones de pH extremas o concentraciones salinas elevadas.
El estudio del cariotipo permite detectar
cambios en el nmero y estructura de los
cromosomas. De esta manera podran detectarse translocaciones, inversiones, deleciones
y duplicaciones. Los cambios cariotpicos constituyen una fuente importante de variacin
que muchas veces es subestimada cuando se
realizan recuentos cromosmicos. Por esto
mismo existen otras tcnicas que estiman

cambios cariotpicos con mayor eficiencia,
como por ejemplo el bandeo cromosmico.
Esta tcnica fue aplicada a suspensiones celulares de Brachycome dichromosomatica
(2n = 4), donde permiti detectar rearreglos
importantes en individuos donde el nmero
cromosmico permaneci estable. La hibridacin in situ es otra de las tcnicas que podra aportar informacin til para detectar
cambios genticos estructurales.
Entre los marcadores bioqumicos utilizados para analizar progenies de plantas regeneradas pueden mencionarse las
isoenzimas, que permitieron detectar entre
un 24 a 35% de variacin en plantas de
Populus tremuloides regeneradas a travs
de callos. Esta variacin fue detectada mediante electroforesis en geles de almidn utilizando los sistemas isocitrato deshidrogenasa (IDH) shiquimato deshidrogenasa
(SKDH), malato deshidrogenasa (MDH),
fosfoglucoisomerasa (PGI) y 6-fosfogluconato - deshidrogenasa (6-PGD). Los patrones
electroforticos permitieron caracterizar a las
plantas fenotpicamente normales y anormales. Sin embargo, las plantas albinas obtenidas en este estudio no presentaron
polimorfismos en los loci estudiados.
En otros casos el anlisis isoenzimtico no
permiti detectar variacin. El estudio de lneas de callos derivadas de embriones
cigticos y de embriones somticos de abeto (Picea glauca x engelmannii) utilizando
15 sistemas isoenzimticos no evidenci la
presencia de variacin somaclonal en 25 loci
analizados. Los patrones isoenzimticos de
lneas isognicas de Trifolium pratense L. que
diferan en su capacidad de regeneracin, resultaron idnticos para los sistemas de
peroxidasas, glutamato deshidrogenasas, alcohol deshidrogenasas y esterasas.
Las isoenzimas, por lo tanto, pueden proveer informacin til acerca de la variacin
generada in vitro. Sin embargo, se estn analizando los productos de genes expresados,
cuya regulacin puede estar en cierta medida afectada por factores ambientales o fisiolgicos. Por otro lado, slo se transcribe y traduce una pequea proporcin del genoma.
Por ello, los mtodos de anlisis a nivel
molecular pueden proporcionar mucha informacin, ya que las secuencias de ADN son
esencialmente las mismas en todas las clulas vivas de la planta, independientemente

del estado fisiolgico o de desarrollo de las
mismas. Los marcadores moleculares presentan varias ventajas a la hora de detectar
inestabilidad gentica debido a su amplia
cobertura del genoma y a que no son
influenciados por el ambiente ni por los estados fenolgicos de las plantas.
Utilizando RAPD pudo detectarse la existencia de polimorfismos en plantas de
Triticum tauschii obtenidas mediante
callognesis. Los RAPD para diagnosticar fidelidad gentica en plantas regeneradas por
cultivo in vitro han sido utilizados en Pinus
mariana (Mill), Festuca pratensis Huds., Picea abies, Quercus suber L.y Panax
notoginseng.
En Phalaenopsis se ha encontrado correspondencia entre variaciones morfolgicas y
moleculares, pudindose discriminar plantas
normales de variantes morfolgicas mediante la combinacin de perfiles RAPD generados por 38 cebadores. En otros casos no ha
sido posible realizar esta asociacin, probablemente debido a la necesidad del empleo
de un mayor nmero de cebadores. En
Pelargonium x hortorum Ro el empleo de
un conjunto de 13 cebadores permitieron la
deteccin de polimorfismos en solamente el
50% de las plantas con fenotipos aberrantes.
En Mentha arvensis se obtuvieron perfiles
RAPD polimrficos con 12 cebadores en las 6
plantas fenotpicamente diferentes obtenidas por micropropagacin.
En otro estudio se observ que no todas
las plantas de Musa de fenotipo anormal
(enanas) obtenidas presentaban el mismo
patrn de bandas. En este mismo gnero, la
tcnica permiti detectar polimorfismos en
plantas micropropagadas de fenotipo normal. Esto indicara que la variacin molecular
no siempre se expresa a nivel fenotpico y viceversa.
Existen otros ejemplos que corroboraran
esta afirmacin, tal es el caso de la palmera
datilera (Elaeis guineensis Jacq.), donde no
se detectaron polimorfismos en plantas regeneradas que haban presentado fenotipos
florales anormales o el de plntulas
micropropagadas de Populus deltoides, donde a travs de la utilizacin de microsatlites
se detectaron polimorfismos en plantas
89
fenotpicamente normales.
Otros marcadores moleculares utilizados
con xito para la evaluacin de variacin
somaclonal, como los AFLP, permitieron detectar en banana la existencia de diferencias
a nivel molecular entre plantas regeneradas
de fenotipo normal y aberrantes.
A veces, para detectar un cambio es necesario realizar pruebas especficas. Por ejemplo, se evaluaron somaclones de Cynodon
dactylon en laboratorio, invernculo y a campo para resistencia a la oruga militar. Un
somaclon, el Brazos-R3 (Croughan y col.,
1994), tena un rendimiento a campo equivalente al del cultivar madre, pero adems
era resistente a dicho insecto. Esto fue debido a que produca menores niveles de un
estimulante para la alimentacin del insecto. Es decir que mantena los caracteres
agronmicos positivos del cultivar parental,
pero tena un cambio en la produccin de un
metabolito secundario que confera resistencia a la oruga.
5 La variacin somaclonal y su aplicacin
en el mejoramiento gentico de las
plantas
La base del mejoramiento gentico es la
optimizacin de interacciones gnicas. Para
lograr combinaciones gnicas ptimas o superiores se requiere de diversidad gentica.
Esta diversidad, que se encuentra normalmente en las poblaciones de individuos, puede provenir de cruzamientos sexuales, mutaciones inducidas (fsicas o qumicas o producidas por ADN-T o por elementos transponibles
o retrotrasposones), hibridacin somtica y
transformacin gentica. La variacin
somaclonal proveera una fuente adicional de
variabilidad gentica, utilizable en programas
convencionales de mejoramiento.
Algunas de las ventajas que presenta la
variacin somaclonal pueden resumirse de la
siguiente manera:
Es relativamente poco costoso generarla: requiere de un laboratorio de rutina y facilidades de campo.

Constituye una forma rpida de generar variabilidad gentica, particularmente
para cultivos con base gentica estrecha y
90
que son difciles de mejorar a travs de tcnicas tradicionales.

Es exitosa para eliminar uno o pocos
defectos en cultivares bien adaptados.
Puede utilizarse para mejorar especies
de propagacin sexual y vegetativa.
Las tasas de mutacin son relativamente altas si se comparan con las tasas de mutaciones espontneas. La variacin
somaclonal ocurre con una frecuencia de 1
mutacin cada 100 plantas regeneradas, en
contraste con la tasa esperada de mutacin
espontnea de 10-7 10-9 mutaciones por par
de nucletidos por generacin.
El conocimiento de las condiciones que
generan inestabilidad gentica durante el
cultivo in vitro permitira utilizar el fenmeno como estrategia de mejoramiento y permitira eludirlo en aquellos casos en que se
requiera estabilidad gentica, como en la
micropropagacin, la conservacin de
germoplasma y la transformacin gentica.
El nivel de cambios no deseados es menor que cuando se utilizan mutgenos qumicos o fsicos, ya que, en el caso de la variacin somaclonal, la mayora de los cambios
deletreos producidos son eliminados por el
filtro que representa la regeneracin de plantas.
Entre las desventajas cabe mencionar:
En algunos casos, las variantes

somaclonales no han avanzado de la etapa
de laboratorio o invernculo, probablemente debido a que el material seleccionado tiene poca importancia prctica.
La escasa regeneracin de plantas en
cultivos de largo trmino. Generalmente en
estos casos existe prdida de la capacidad
morfognica.
La regeneracin est limitada a
genotipos especficos que pueden no ser de
mucho inters para los mejoradores.
Algunos somaclones son inestables (originados por variacin epigentica).
Algunos presentan alteraciones no deseables como aneuploida, esterilidad, etc.
Desde el punto de vista productivo y comercial, una variante somaclonal debera
cumplir los siguientes requerimientos:
Involucrar caracteres agronmicamente

tiles.
El nivel de expresin del carcter debe
superar al de sus progenitores.
El carcter mejorado debe estar combinado con todos los otros caracteres
agronmicos de la variedad que son importantes para el cultivo.
La variacin debe ser heredable (o bien
estable) en las generaciones subsiguientes.
En general, los mejoradores buscan en los
somaclones caracteres de importancia prctica. La estrategia es utilizar cultivares altamente adaptados para modificar
unos pocos caracteres, ya que resulta
ms
sencillo
mejorar
selectivamente una variedad corriente que crear una nueva.
etapa de multiplicacin de semillas, que permitir realizar pruebas agronmicas en diferentes ambientes, al menos en dos aos distintos, para evaluar los efectos del componente ambiental en la expresin del carcter. El programa finaliza con la etapa de multiplicacin de semillas para el lanzamiento de
la variedad nueva al mercado.
Una modificacin para la produccin de
nuevas variedades est basada en el empleo
de variantes gametoclonales (Fig. 1). Si se
utilizan clulas haploides como fuente de tejido, las variantes obtenidas se denominan
variantes gametoclonales. Los gametoclones
5.1 Estrategias para la seleccin

de variantes tiles
Las estrategias que se han utilizado para obtener variacin
somaclonal comprenden:
a) La obtencin de plantas por
cultivo de clulas o tejidos, que luego son analizadas para el carcter
deseado.
La Figura 1 resume los pasos a
seguir para la obtencin de un cultivar por variacin somaclonal. Para
este fin se cultiva la mejor variedad Figura 1: Estrategia para la produccin comercial de variantes
disponible y se seleccionan, entre las somaclonales (izquierda) y gametoclonales (derecha) en arroz.
plantas regeneradas, aquellas que
expresen el carcter de inters. Estas plan- se refieren a regenerantes haploides duplitas (generacin R0) se emplean para generar cados, derivados del cultivo de anteras. Esta
progenies sexuales (en el caso de plantas con metodologa tendra la ventaja de permitir
este tipo de reproduccin), sobre las cuales recuperar caracteres recombinantes adems
se vuelve a realizar la seleccin para el carc- de los que pudieran surgir in vitro. Las planter agronmico buscado, tratando de mantas haploides obtenidas son duplicadas metener a la vez todas las caractersticas favora- diante la exposicin al alcaloide colchicina. Las
bles de la variedad. En plantas autgamas, evaluaciones a campo se realizan en forma
como trigo, arroz y cebada, se considera conjunta a medida que los nuevos materiaaceptable la evaluacin de la estabilidad del les van siendo multiplicados, de manera de
carcter hasta la generacin R4. A partir de aumentar las replicas bajo diferentes condieste momento pueden realizarse cruzamien- ciones ambientales.
tos de las plantas R4 selectas con las lneas
b) La seleccin a nivel celular, seleccin
parentales a fin de determinar, mediante el
anlisis de segregacin, la base gentica del in vitro, que se hace con el objetivo de obcarcter mejorado. Posteriormente viene la tener resistencia a estreses biticos o
91
abiticos y se utiliza generalmente para caracteres tales

como resistencia a toxinas
fngicas, herbicidas, concentraciones salinas elevadas y
temperaturas extremas.
Mediante esta estrategia
pueden cultivarse explantos
de distintos genotipos y observarse el comportamiento
de los callos frente al agente
selectivo, en condiciones de laboratorio. Una vez seleccionados los genotipos resistentes
se procede a la regeneracin
de las plantas, que son analizadas para ver si expresan la
resistencia a campo y luego
son introducidas en el programa de mejoramiento.
La seleccin efectuada sobre cultivos celulares in vitro
puede llevarse a cabo mediante dos modalidades:
- Seleccin directa en un
solo paso, donde el agente de
seleccin es utilizado en concentraciones dobles o triples Figura 2: Seleccin in vitro de plantas de arroz tolerantes a altas
de la MIC (concentracin m- concentraciones de aluminio
nima que produce un 100 %
racin de callo en el medio de cultivo al que
de inhibicin).
- Seleccin en varios pasos, donde la con- se ha adicionado aluminio es indicadora de
centracin del agente selectivo es gradual- la tolerancia del genotipo al metal en cuesmente incrementada en cultivos sucesivos y tin. Una vez que se han regenerado las plantas se requieren posteriores evaluaciones a
frecuentes.
El primero es un mtodo simple y efecti- campo, en suelos con concentraciones elevo, ya que las clulas sensibles al agente mo- vadas de aluminio, a fin de corroborar la toriran, permitindo el crecimiento de las tole- lerancia evidenciada in vitro por los materiarantes. Sin embargo, elevados niveles de les.
A continuacin se citan ejemplos donde
estrs seran deletreos a nivel celular, eliminando materiales que tal vez, con un mayor se combin la seleccin in vitro con la subsinivel de diferenciacin tisular hubiesen sido guiente regeneracin de plantas:
capaces de regenerar plantas tolerantes. La
- Produccin in vitro de plantas de arroz
eleccin de un mtodo u otro depender de
un monitoreo preliminar que proporciona resistentes a concentraciones txicas de aluuna indicacin acerca de la reaccin del teji- minio. Se obtuvieron plantas resistentes utido vegetal a las concentraciones letales y lizando distintas concentraciones de aluminio en el medio de cultivo. Por otro lado, se
subletales del agente selectivo.
En la Figura 2 se representan las etapas observ la aparicin de plantas resistentes a
de la seleccin in vitro. En el ejemplo dife- partir de callos de variedades susceptibles
rentes lneas de arroz son evaluadas para to- mantenidos en medio de cultivo desprovislerancia al aluminio. La induccin y la prolife- to de aluminio. Estos estudios indicaran que
92
el cultivo in vitro per se puede originar modificaciones tiles en el genoma de arroz.

- Obtencin de resistencia a Fusarium
oxysporum en clavel. El cultivo de segmentos internodales de dos cultivares de clavel
susceptibles a Fusarium oxysporum f.sp.
dianthi permiti, luego de dos ciclos de seleccin, la obtencin de callos resistentes que
se utilizaron para regenerar plantas. El 32%
de las plantas regeneradas a partir estos callos evidenci considerable resistencia al patgeno en experimentos de campo.
La bsqueda de variantes a nivel celular
permitira verificar y seleccionar fenotipos
adecuados entre millones de clulas, con una
inversin menor en tiempo, espacio y dinero
y ha sido extensamente utilizada en diferentes cultivos. Sin embargo, no existe total garanta de que la resistencia manifestada in
vitro se expresar a nivel de la planta entera. Hay diferentes explicaciones para este fenmeno, como por ejemplo que la resistencia o tolerancia observada se deba a cambios
epigenticos, a la naturaleza quimrica del
material, al uso de toxinas no especficas (en
el caso de resistencia a enfermedades), a la
complejidad del carcter a ser seleccionado
(como por ejemplo la resistencia a salinidad
o sequa) o a la falla de las clulas para expresar el carcter cuando se diferencian.
En ambos casos (a y b) la obtencin de
resistencia slo ser posible si sta existe en
la poblacin original (entonces el cultivo servira slo para recuperar los genotipos tiles)
o bien si surge por variacin somaclonal durante el proceso de cultivo.
6 Variantes somaclonales liberadas
comercialmente
La variacin somaclonal fue utilizada para
la produccin de variedades comerciales con
caracteres agronmicos superiores en diferentes especies. A continuacin se enumera,
para cada especie, el carcter agronmico seleccionado y el centro de investigacin responsable de dicho logro: en geranio,
aquitectura florar (Purdue Univ., USA); en
batata: calidad de races y arquitectura de la
canopia (North Carolina Research Service,
USA); en caa de azcar: resistencia a estrs
y a enfermedades (Sugarcane Research Cen-
tre, Fiji); en maz: contenido de triptfano

(Molecular Genetic, USA); en tomate y apio:
contenido de materia seca y rendimiento,
respectivamente (DNA Plant technology of
New Jersey, USA); en arroz: resistencia a enfermedades (Plantech Research Institute,
Japan y Univ. Agricultural Sciences, Hungary);
en mostaza: rendimiento (ICAR, India).
Las primeras observaciones de variacin
en caracteres morfolgicos fueron realizadas
en arroz y otras especies a partir de 1968.
Diez aos ms tarde se inform en detalle la
variacin obtenida en la progenie de plantas de arroz cultivadas in vitro y autopolinizadas. Tambin se encontraron alteraciones en la altura de la planta, la longitud del
tallo y otras caractersticas en alfalfa.
En arroz, la variacin somaclonal result
en el mejoramiento de varios caracteres cuantitativos, incluyendo parmetros morfolgicos, caracteres agronmicos y tolerancia a
estreses biticos y abiticos.
Pueden mencionarse adems otros ejemplos de variacin somaclonal en cultivos agrcolas de inters, como por ejemplo caa de
azcar, donde se obtuvieron somaclones
provenientes del cultivar Pindar resistentes a
una virosis transmitida por fidos. Paralelamente, tambin por variacin somaclonal, se
seleccion el cultivar Ono, que presenta resistencia al downy mildew, causado por
Sclerospora sacchari.
En papa, el cultivo de protoplastos obtenidos de suspensiones celulares cromosmicamente variables produjo gran cantidad de
variantes somaclonales del cultivar Russet
Burbano, que presentaron resistencia a
Phytophthora infestans, a Alternaria solana
y a la colonizacin por fidos que transmitan el virus Y de la papa (PVY) y el virus del
enrrollamiento de la hoja (PLRV).
Se encontr tambin tolerancia a
glifosato en somaclones de cebada regenerados en medios conteniendo el herbicida.
En sorgo se encontr variacin somaclonal
estable para altura, nmero de macollos,
mayor produccin de granos y mayor nmero de semillas y tolerancia a suelos cidos y a
sequa.
La incidencia de variacin somaclonal en
banana se encuentra extensamente documentada. En el caso de cultivares comerciales de banana Cavendish en Taiwn se obtu-
93
vo resistencia a la Raza 4 de Fusarium

oxysporum f. sp. Cubense. Estos cultivares
no haban podido ser mejorados por mtodos tradicionales. No obstante, para lograr
una variedad con rendimiento equiparable a
las variedades no resistentes se necesitaron
varios ciclos de micropropagacin adicionales, que permitieron combinar ambas caractersticas en un somaclon.
Otros ejemplos donde se han obtenido
cultivares por variacin somaclonal son tabaco (tolerante a aluminio y resistente a herbicida), trigo (resistente a Helminthosporium
sativum) y alfalfa (resistente a Fusarium
oxysporum).
Se han detectado tambin caracteres interesantes modificados por esta tcnica para
su explotacin comercial en ornamentales,

como por ejemplo variacin en el color de
las flores en gerbera, clavel y crisantemo.
En gramneas forrajeras puede citarse
variacin cromosmica en Festuca
arundinacea y pasto llorn (Eragrostis
curvula), albinismo en Lolium perenne y
Festuca pratense, cambios en la morfologa
de planta, forma y tamao de hoja y espiga,
desarrollo floral, vigor, y supervivencia en
somaclones de Lolium y Festuca
arundinacea, variacin isoenzimtica en
Festuca arundinacea; disturbios reproductivos y resistencia al moteado de hoja en pasto bermuda (Cynodon dactylon).
En el laboratorio de Gentica del Dpto.
Figura 3: Obtencin de variantes somaclonales de pasto llorn, Eragrostis curvula (Schrad.) Nees a partir del cultivo
de inflorescencias A) Formacin de callos, B) Masa de callo a partir de la cual comienza a evidenciarse morfognesis.
C) Estudio histolgico de los mismos callos mostrando clulas embriognicas y D) embriones somticos. E) En el
mismo callo se observaron embriones bipolares y tambin F) organognesis. G) Plntula completa en el momento
de salir del tubo de ensayo. H) Las plantas llevadas al campo fueron frtiles (I). J) Cromosomas en el pice radical de
la planta donadora de explanto, 2n=4x=40 apomctica. K) Cromosomas de una regenerante primaria (R0) obtenida a
partir de la anterior 2n=2x=20, sexual L) Isoenzimas de peroxidasas de las descendientes de la planta R0, mostrando
variacin, lo cual indica la presencia de sexualidad. M) Idem anterior, pero malato deshidrogenasas.
94
de Agronoma de la UNS se llev a cabo un

proyecto para obtener somaclones de pasto llorn (Fig.3). Se trabaj con varios
cultivares de esta gramnea apomctica y luego de la evaluacin de gran nmero de plantas se seleccionaron los siguientes materiales:
- Una planta diploide sexual, obtenida a
partir de un cultivar tetraploide apomctico.
Dicho material est en proceso de
registracin, y est siendo utilizado en estudios de apomixis.
- Dos plantas hexaploides apomcticas a
partir de un cultivar tetraploide apomctico.
Dichas plantas dieron origen a dos nuevos
cultivares de Eragrostis curvula, muy
promisorios por sus caractersticas forrajeras,
que estn en proceso de registro.
La variacin in vitro en trigo y en otros
cereales como cebada es altamente dependiente del genotipo. En plantas regeneradas
de triticale y trigo se informaron variaciones
a nivel del ADN mitocondrial y de protenas
de la semilla, como las gliadinas. A nivel
fenotpico, se han informado cambios estables en longitud de la espiga, nmero de granos por espiga, peso de 100 granos, densidad y biomasa de la espiga, mayor contenido de protena en grano sin reduccin del
rendimiento, aristas, altura de la planta, fertilidad, nmero de macollos, color del grano,
tiempo de espigazn, dureza, sensibilidad al
cido abcsico, color de las glumas, entre otros
caracteres morfolgicos. Las mutaciones observadas han sido de dominantes a recesivas
y viceversa. El nico antecedente en nuestro
pas de bsqueda de variacin somaclonal en
trigo es un estudio acerca de la estabilidad in
vitro de tres cultivares de trigo con elevados
niveles de inestabilidad cariotpica espontnea. Se evaluaron caracteres tales como estructura cromosmica, patrn de gliadinas,
color del grano y de las glumas, tipo de aristas, niveles de clorofila y morfologa de la
planta, detectndose slo una translocacin
no descripta previamente y un patrn diferente de gliadinas como consecuencia del cultivo in vitro, sugiriendo que esta tcnica no
es efectiva para inducir variacin que pueda
ser utilizada en programas de mejoramiento
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96
III.-Captulo 2
Hibridacin somtica
Polci, Pablo; Friedrich, Pablo
1 Introduccin
La mejora gentica de las plantas cultivadas en procura de incrementar la produccin
viene siendo practicada por el ser humano
desde hace miles de aos, seguramente desde el inicio mismo de la agricultura. Para ello,
el hombre ha empleado los cruzamientos con
el fin de incrementar la variabilidad gentica,
paso inicial en el proceso de mejoramiento.
De esta manera la hibridacin entre especies
diferentes permiti aumentar de modo significativo la productividad de diversos cultivos, como por ejemplo los cereales. Sin embargo, en otros cultivos esta estrategia no
result exitosa a causa de esterilidad sexual
o incompatibilidad gentica.
La hibridacin somtica, es decir, la obtencin de plantas hbridas a partir de la fusin de clulas o de protoplastos derivados
de clulas somticas, surgi hace unos 30 aos
como una herramienta muy promisoria para
sortear problemas de incompatibilidad
precigtica.
Esta tcnica, si bien presenta algunas limitaciones, como una elevada esterilidad o
imposibilidad de regenerar plantas en algunos casos, demostr ser til en la mejora
gentica de plantas, principalmente por permitir la introgresin limitada de genes de especies silvestres en los cultivos. Se utiliza, por
ejemplo, cuando se quiere transferir resistencia a enfermedades o tolerancia a estreses.
Tambin permite la obtencin de citoplasmas
hbridos (cbridos). La hibridacin asimtrica
y cibridizacin sirve como puente para la
transferencia de genes individuales
La tcnica de fusin de protoplastos se
desarroll en la dcada de 1950-60, a partir
de la observacin de que ciertos virus pueden inducir la fusin de clulas animales. Sin
embargo, recin en la dcada de 1980-90 tuvo
un mayor auge debido a la aparicin de mtodos qumicos y elctricos ms apropiados
para la fusin de clulas vegetales. La pared
presente en estas clulas representa una
barrera que normalmente impide la fusin

entre ellas. Por ello, la obtencin de plantas
hbridas somticas requiere del previo aislamiento de protoplastos mediante la digestin enzimtica de las paredes celulares, para
luego proceder a la fusin de protoplastos
de distintos tipos parentales (distintos
genotipos) y posterior regeneracin de plantas a partir de los productos de fusin. La
hibridacin somtica en plantas comenz a
desarrollarse a principios de 1970 con la aplicacin de mtodos qumicos de fusin, y se
extendi en los 80 con el empleo de mtodos de electrofusin.
Es relevante destacar que, a los fines del
mejoramiento gentico, el sistema de
protoplastos no slo se emplea para la obtencin de hbridos somticos, sino que tambin constituye un material apropiado para
la incorporacin de ADN exgeno. Asimismo,
la fusin de protoplastos tiene un uso mucho ms amplio que el estrictamente de inters agronmico; en tal sentido, es de gran
utilidad en estudios de biologa celular as
como para otras aplicaciones biotecnolgicas,
por ejemplo, la produccin de anticuerpos
monoclonales.
2 Hibridacin somtica vs. hibridacin
sexual
Con relacin a su potencialidad para producir hbridos, existen diferencias importantes entre la fusin de protoplastos somticos
y el cruzamiento sexual:
La hibridacin sexual entre organismos
de diferentes especies est limitada por barreras de incompatibilidad. En algunos casos
estas barreras son precigticas, es decir, no
permiten que se produzca la fecundacin. Tal
limitacin no existe en la fusin de
protoplastos, dado que este proceso es noespecfico, permitiendo la fusin de clulas de
orgenes muy diversos, incluso de organismos
muy distanciados filogenticamente (por
ejemplo, clulas animales y vegetales). Ello no
significa que pueda regenerarse un organismo viable y frtil a partir de cualquier tipo de
combinacin entre clulas. De hecho, la bsqueda de hbridos de inters agronmico ha
demostrado que el principal aporte de esta
metodologa es la introgresin, en los cultivos, de genes provenientes de plantas silvestres emparentadas.
97
La hibridacin sexual ocurre normalmente por fusin de clulas haploides (n +

n), mientras que en la hibridacin somtica
se fusionan dos protoplastos con sus
genomas completos (2n + 2n) o con uno de
ellos conteniendo slo parte de su genoma.
Otra diferencia est dada por la herencia de los genes extranucleares, esto es,
plastdicos y mitocondriales. Mientras que en
la reproduccin sexual el genoma
citoplasmtico es aportado casi exclusivamente por la gameta femenina, en la hibridacin somtica se combinan organelas de
ambos progenitores, produciendo nuevas
combinaciones de genes citoplasmticos.
3 Hibridacin somtica vs.
transformacin gentica
bridacin somtica pero no por transformacin gentica. Sin embargo, en la actualidad,

con las nuevas herramientas aportadas por
la genmica se est avanzando en el conocimiento de todos los genes involucrados en
diversas vas metablicas. Estos podran ser
transferidos en conjunto va transgnesis.
4 Tipos de hbridos somticos
Cuando se realiza la fusin de protoplastos se obtienen clulas con el aporte de
cromosomas de dos o ms ncleos (Fig.1.) Si
los protoplastos involucrados en la fusin
proceden de distintos tipos parentales se
originan heterocariones, y si proceden del
mismo tipo parental se originan homocariones. Cuando en el heterocarin ocurre
la fusin de los ncleos (cariogamia), se forma una clula hbrida.
A partir de una clula hbrida, que contiene dos genomas completos, se puede regenerar una planta que, segn cual haya sido
el destino del material gentico nuclear durante las divisiones celulares que siguen a la
fusin, puede ser de tres tipos:
1. Hbrido simtrico, que tiene el
genoma nuclear completo de cada tipo
parental.
2. Hbrido asimtrico, que tiene el
genoma nuclear completo de uno de los
parentales y slo una parte del genoma nuclear del otro parental.
La preponderancia que han tomado las

tcnicas de transformacin gentica ha relegado a la hibridacin somtica a un papel de
menor significacin como herramienta
biotecnolgica aplicada al mejoramiento de
los cultivos. Comparando ambas metodologas, podemos destacar las siguientes diferencias:
En la transformacin gentica se incorporan uno o pocos genes exgenos en una
planta, mientras que en la hibridacin
somtica el nmero de genes introducidos
es mayor dado que se transfieren
cromosomas de una especie a
otra o se combinan dos
genomas completos.
La hibridacin somtica
permite transferir caracteres sin
necesidad de contar con un conocimiento detallado de los mecanismos moleculares que determinan la expresin de dichos caracteres. Por el contrario, la transformacin gentica requiere la
previa identificacin y aislamiento de los genes que determinan
la expresin del carcter de inters.
Caracteres tales como productividad, tolerancia a ciertos tipos de estrs, resistencia horizontal a enfermedades y otros
son polignicos, por lo que su Fig. 1. Destino del material gentico nuclear y extranuclear en la fusin
transferencia es factible por hi- de protoplastos.
98
POLCI, Pablo; FRIEDRICH, Pablo
3. Cbrido, que contiene el genoma nuclear completo de uno de los parentales, reteniendo slo material gentico extranuclear
del otro parental.
Es usual que en el proceso de regeneracin de plantas hbridas ocurra una eliminacin gradual de cromosomas de uno de los
tipos parentales, producindose de este
modo hbridos asimtricos o cbridos. La prctica de la hibridacin somtica en plantas
demostr que, en general, los hbridos
asimtricos y cbridos son ms valiosos que
los simtricos producidos entre plantas alejadas filogenticamente. Por esta razn se
han desarrollado mtodos para inducir la hibridacin asimtrica o cibridacin, alterando
el genoma de uno de los protoplastos
parentales. En este caso se dice que se transfiere parte del genoma de un protoplasto
donante a uno receptor. Por lo tanto, teniendo en cuenta el material de partida empleado para la fusin, pueden producirse tres tipos de clulas hbridas:
1. Clulas hbridas simtricas, por fusin
de dos protoplastos con sus genomas completos.
2. Clula hbrida asimtrica, por fusin
de un protoplasto conteniendo su genoma
completo con otro conteniendo su ncleo
inviable o slo una parte de su genoma nuclear. Los protoplastos donantes son irradiados con rayos X o Gamma, lo que provoca la
fragmentacin de los cromosomas. Una vez
producida la fusin, dichos fragmentos tienden a eliminarse en las sucesivas mitosis, pero
algunos de ellos pueden integrarse con el
genoma del receptor produciendo un hbrido asimtrico. El tratamiento de irradiacin
parece no tener efectos deletreos o
mutagnicos sobre los genomas de
organelas, probablemente debido a que
cada clula posee varias copias de ellas. Tambin puede producirse una clula hbrida
asimtrica fusionando protoplastos receptores con microprotoplastos, conteniendo uno
o pocos cromosomas. Los microprotoplastos
se obtienen induciendo la formacin de
microncleos por tratamientos con agentes
antimicrotbulos.
3. Cbridos, por fusin de un protoplasto
conteniendo su genoma nuclear completo
con un protoplasto enucleado o con su ncleo inviable. Los protoplastos enucleados o

citoplastos pueden obtenerse centrifugando
los mismos a alta velocidad en un gradiente
de densidad isosmtico. Asimismo, el mtodo de irradiacin con rayos X o Gamma puede generar cbridos en casos en que se produzca la eliminacin total de los fragmentos
cromosmicos. Los protoplastos que poseen
su genoma nuclear completo (receptores),
pueden ser tratados previamente con
inhibidores metablicos. En este caso slo
pueden sobrevivir, por complementacin
metablica, los heterocariones conteniendo
el ncleo del receptor y el citoplasma del donante enucleado.
La segregacin de los plstidos y
mitocondrias de los dos tipos parentales tambin constituye una fuente importante de
variabilidad en la regeneracin de plantas
hbridas. Es frecuente que ocurran
recombinaciones de los genomas mitocondriales de ambos tipos parentales, pero ello
es poco comn entre plstidos. Dado que las
organelas segregan independientemente
unas de otras, la regla es que al cabo de pocas divisiones mitticas las clulas formadas
contengan plstidos provenientes de uno u
otro tipo parental. As, una clula hbrida origina una colonia de clulas que exhiben diferentes combinaciones de genes citoplasmticos, pero con una mayor frecuencia de clulas que poseen mitocondrias recombinantes
y plstidos de uno u otro tipo parental. El
destino que sufre el material gentico nuclear
y extranuclear durante las divisiones celulares determina que, a partir de una poblacin
de clulas hbridas similares, se puedan regenerar plantas con diferentes combinaciones
de genes nucleares, plastdicos y mitocondriales.
La Figura 2 muestra un esquema de las
etapas involucradas en la hibridacin
somtica, las cuales son tratadas a continuacin.
5 Aislamiento de protoplastos
El desarrollo de mtodos enzimticos de
aislamiento a partir de 1960 brind la posibilidad de obtener grandes cantidades de
protoplastos vegetales. Ello tuvo gran influen-
99
establecerse en forma emprica las

condiciones ptimas para un sistema
determinado. Las etapas del aislamiento y los factores a considerar en
cada una de ellas se describen a continuacin:
1.
Seleccin del material de
partida. Influye en el resultado del
aislamiento as como en el proceso
de regeneracin posterior. Generalmente se emplean hojas y clulas en
cultivo lquido o slido. Cuando se
emplean hojas, la edad y las condiciones de cultivo de la planta afectan
el rendimiento. Se obtienen mejores
resultados con hojas jvenes totalmente expandidas que con hojas viejas. (Fig. 3A.). Para facilitar el contacto de las enzimas con las clulas, las
hojas suelen cortarse en trozos pequeos, muy finos en el caso de las
monocotiledneas. Algunas veces se
extrae la epidermis inferior antes de
colocar la hoja en la solucin
Figura 2: Materiales y procesos involucrados en la hibridacin
enzimtica, como sucede con las
somtica.
dicotiledoneas. Cuando se emplean
cia en diferentes reas de la biologa y la clulas en suspensin, se obtienen mejores
biotecnologa de plantas, dada la utilidad de resultados si se encuentran en la fase
los protoplastos como sistema experimental exponencial de crecimiento.
para estudios fisiolgicos, bioqumicos y
2. Tratamiento enzimtico. La concentramoleculares, as como para su aplicacin al cin de la enzima y el tiempo de incubacin
mejoramiento gentico.
requeridos para lograr la liberacin de los
Los protocolos de aislamiento emplean protoplastos dependen del producto comerenzimas fngicas con actividad celulasa y cial utilizado. El pH generalmente se ajusta
pectinasa, siendo necesario en algunos casos en un rango de 4,7 a 6, y la temperatura enel agregado de hemicelulasas. Las celulasas y tre 25 y 30 C. La duracin del tratamiento
hemicelulasas degradan la pared celular, en enzimtico y la relacin volumen de solucin/
tanto que las pectinasas digieren la matriz cantidad de tejido influyen en el rendimiende pectina que mantiene adheridas a las c- to. Durante el aislamiento se produce la lisis
lulas. El uso de enzimas disponibles comer- de algunas clulas, que liberan enzimas
cialmente posibilit el aislamiento de hidrolticas y compuestos oxidantes que pueprotoplastos de prcticamente cualquier te- den daar los protoplastos, por lo que se
jido vegetal, siempre que el mismo no est suelen agregar inhibidores de proteasas y
lignificado. Se ha podido aislar protoplastos antioxidantes tales como el Polivinilpirrolide una gran cantidad de especies vegetales dona-10. El agregado de un estabilizador
y regenerar plantas a partir de los mismos, osmtico a la solucin enzimtica es esencial
permitiendo el uso de este sistema para la para evitar la ruptura de los protoplastos a
propagacin clonal y la modificacin gentica medida que son liberados, siendo ms estade plantas.
bles si la solucin es ligeramente hipertnica.
El nmero de protoplastos aislados, su Para ello se utilizan solutos osmticamente
viabilidad y la pureza de la suspensin obte- activos, comnmente manitol o sorbitol, en
nida dependen de varios factores, debiendo concentraciones que varan entre 0,3 a 0,8
100
6 Mtodos de fusin
6.1 Mtodos qumicos
Figura 3: Aislamiento de protoplastos de tabaco. A.

Eliminacin de las nervaduras centrales y seccionado de
la hoja en trozos pequeos. B. Digestin enzimtica de
las paredes celulares. C. Centrifugacin y obtencin de
protoplastos libres de restos de tejidos vegetales.
M segn el tipo de protoplasto. La solucin

enzimtica es por lo general suplementada
con sales, comnmente CaCl2, que incrementan la estabilidad de la membrana (Fig. 3B).
3. Limpieza y purificacin de los
protoplastos. Una vez lograda la liberacin
de los protoplastos, se procede a la remocin de las enzimas y de los restos de tejido
y de clulas rotas. La suspensin se pasa por
un filtro de nylon o metlico con un dimetro de poro (30-100 mm) que permita el paso
de los protoplastos y retenga los restos de
tejido y grupos de clulas no digeridas. Posteriormente, se efectan 3 4 lavados
centrifugando la suspensin por 5 minutos a
baja velocidad (50-100 g). Finalmente, los
protoplastos sedimentados se resuspenden
en una solucin salina que contenga un estabilizador osmtico. De este modo se eliminan las enzimas y restos celulares. Para lograr una mayor pureza de la suspensin es
conveniente centrifugarla en un gradiente de
densidad (Fig. 3C). Para el recuento de
protoplastos se emplea un hemocitmetro.
La viabilidad se determina generalmente
empleando colorantes que son incorporados
(rojo neutro, diacetato de fluorescena) o
excluidos (azul de Vean) por las clulas viables; tambin pueden evaluarse la actividad
fotosinttica (emisin de fluorescencia) y la
respiratoria (consumo de O2).
Los primeros casos informados de fusin

controlada y reproducible de protoplastos
vegetales y de regeneracin de hbridos
somticos se produjeron a principios de la
dcada de 1970, empleando nitrato de sodio
como agente fusgeno. La frecuencia de formacin de heterocariones en tales casos era
muy baja. Posteriormente, se lograron mejores resultados fusionando protoplastos de
clulas del mesfilo de Nicotiana en un medio conteniendo alta concentracin de Ca++
(50 mM) y pH elevado (10,5). Sin embargo,
el fusgeno que alcanz mayor aceptacin
es el polietilenglicol (PEG) debido a que, en
comparacin con los otros agentes qumicos,
produce mayor proporcin de heterocariones y, para muchos tipos celulares, resulta
menos txico. Adems, el tratamiento con
PEG genera una mayor proporcin de
heterocariones binucleados, con menor ocurrencia de fusiones entre ms de dos
protoplastos.
El procedimiento de fusin con PEG ms
ampliamente utilizada es, en lo esencial, una
combinacin del mtodo original del PEG y
el de CA++ y pH elevados. Los protoplastos
de dos tipos parentales se mezclan en una
solucin conteniendo 15 a 45 % de PEG (peso
molecular de 1500 a 6000), durante 15 a 30
minutos. La temperatura de incubacin ptima para inducir la fusin es de 35 a 37 C
pero, en la prctica, suele ajustarse a 24 C.
La densidad de protoplastos adecuada para
la formacin de heterocariones es de 4 a 5 %
(volumen de protoplastos/volumen de suspensin). La remocin del PEG se lleva a cabo
en forma gradual, siendo esto fundamental
para asegurar una elevada frecuencia de
heterocariones. Para ello, la suspensin se
somete a sucesivos lavados con una solucin
alcalina (pH 9-11) de CaCl2 10-50 mM, disminuyendo progresivamente la concentracin
de PEG con cada lavado.
En la fusin de los protoplastos ocurren,
en forma sucesiva, los siguientes eventos: (1)
las membranas plasmticas de protoplastos
adyacentes entran en ntimo contacto, (2)
se producen alteraciones en sitios localizados
101
de las mismas, formndose puentes

citoplasmticos entre protoplastos vecinos,
y (3) las interconexiones citoplasmticas se
expanden, provocando la fusin. La carga
negativa neta de la superficie de las membranas produce la repulsin entre ellas; el tratamiento con Ca++ y pH elevados neutraliza
las cargas superficiales, favoreciendo el contacto entre protoplastos. El PEG actuara
como un puente molecular causando alteraciones en las membranas plasmticas que
promueven la adhesin y formacin de puentes citoplasmticos entre protoplastos vecinos, producindose finalmente la fusin.
6.2 Electrofusin
En 1973 se descubri que pulsos de elevado potencial elctrico en un rango muy
estrecho de intensidad y duracin conducen
a un incremento reversible, experimentalmente controlable, de la permeabilidad de
la membrana celular. Este efecto se denomin ruptura elctrica reversible para enfatizar
la habilidad de la membrana para reparar
tales perturbaciones. El voltaje mnimo para
un protoplasto (umbral) con el cual se produce la formacin de poros disminuye a mayor duracin del pulso elctrico. Este fenmeno de ruptura reversible tambin es aplicado en la tcnica de electroporacin, con la
que se pueden introducir en las clulas construcciones de ADN y otras molculas de alto
peso molecular.
El mtodo de electrofusin en esencia
involucra dos pasos:
1. Los protoplastos, colocados en un medio de baja conductividad entre dos electrodos, se ponen en contacto al aplicar corriente alterna de alta frecuencia (0,5 a 1,5 MHz)
en un campo elctrico no uniforme. Las cargas se separan dentro de las clulas formando un dipolo y generando, por lo tanto, un
potencial de membrana. La fuerza del campo a ambos lados de una clula es diferente
(campo no uniforme), dando origen a una
fuerza neta que la empuja a una regin de
mayor intensidad de campo (hacia uno de
los electrodos). Este proceso se denomina
dielectroforesis. La polaridad de la clula
incrementa el campo local no uniforme, atra-
102
yendo a las clulas vecinas. Luego, los

protoplastos se aproximan unos a otros y
forman cadenas paralelas a las lneas de campo aplicadas (Fig. 4A).
La fuerza ejercida sobre la clula bajo condiciones dielectroforticas depende (1) de la
intensidad de campo elctrico, (2) del
gradiente del campo, (3) del volumen del
protoplasto y (4) de la diferencia entre las
constantes dielctricas de la clula y su ambiente (as como la correspondiente diferencia entre sus conductividades).
2. El segundo paso consiste en la aplicacin de uno o ms pulsos cortos de corriente
directa de 15 a 100 seg., con una intensidad de campo elevada (1 a 3 Kv/cm), suficiente para causar la ruptura reversible de la
membrana. Para que esto ocurra es necesario que el voltaje crtico de membrana sea
alcanzado en cuestin de nanosegundos a
microsegundos. Ocurre entonces la fusin de
las dos clulas cuyas membranas estn en
estrecho contacto (1 a 2 nanmetros de distancia). El proceso de resellado es principalmente atribuido a las molculas lipdicas debido a que su coeficiente de difusin es dos
rdenes de magnitud mayor que el de las
protenas. Durante este proceso pueden formarse puentes lipdicos entre las membranas
de las dos clulas. En otras palabras, las membranas no se vuelven a sellar separadamente en la zona de contacto. Los puentes formados de esta manera, con continuidad
citoplasmtica entre las dos clulas, conducen a un radio de curvatura muy pequeo y
a altas tensiones superficiales. Como consecuencia se forma una nueva clula esfrica,
ya que el proceso es favorecido energticamente (Fig. 3B y C). La ruptura es reversible si el nmero y el tamao de los poros
son pequeos en relacin con el total de la
superficie de la membrana. Fuerzas de campo supra crticas, as como tambin largos
perodos de exposicin, rompen reas mayores de membrana y pueden producir la
destruccin total de la clula
La frecuencia de fusin depende de varios factores:
El genotipo.
La procedencia de los protoplastos
dentro del mismo genotipo. Diferentes poblaciones de protoplastos exhiben frecuen-
Figura 4: Electrofusin de protoplastos de mesfilo de

pasto llorn. A. Dielectroforesis de clulas. Las diferencias
en intensidad de campo elctrico hacen que las clulas
se muevan hacia la zona cercana al electrodo. B.
Aplicacin de pulsos cortos de corriente directa, que
inducen la formacin de poros en la membrana,
generando puentes entre las membranas de las clulas
adyacentes. C. Los puentes con continuidad
citoplasmtica poseen un radio de curvatura muy
pequeo. Las altas tensiones superficiales generadas en
ese sector conducen a la formacin de una nueva clula
esfrica.
cias de fusin diferentes, aun cuando provengan del mismo genotipo. En general, los
protoplastos obtenidos a partir de hojas se
fusionan ms fcilmente que los provenientes de raz o de cultivos celulares.
El tamao de los protoplastos. Los
ms grandes se fusionan ms fcilmente.
La densidad de los protoplastos.
El nmero, la duracin y la fuerza de
los pulsos de corriente directa. La duracin
del pulso elctrico es de 15 a 50 seg. El tiempo requerido para la fusin que sigue a la
aplicacin de un pulso vara desde pocos segundos a varios minutos. Esto probablemente est relacionado a la diferencia de fluidez
de la membrana en los distintos tipos celulares y a las propiedades del citoesqueleto dentro de la clula.
El medio de fusin. Un factor de limitacin en la agregacin dielectrofortica de
las clulas es la conductividad elctrica del medio; si sta es muy alta, hay mucho flujo de
corriente en la solucin y se producen
calentamientos y turbulencias que impiden
la formacin de cadenas.
El potencial osmtico del medio de fu-
sin. La inclusin de iones en el medio puede incrementar el porcentaje de fusin. Sin

embargo, existe la limitacin de que la
dielectroforesis debe realizarse en un medio
de baja conductividad; el medio de fusin
usualmente consiste en manitol (cuya concentracin se ajusta segn los protoplastos
empleados) y CaCl2 1 mM. Valores bajos de
presin osmtica en el medio de suspensin
de los protoplastos pueden favorecer el proceso de fusin.
La longitud de las cadenas de
protoplastos formadas durante la dielectroforesis, que adems depende de factores
como la densidad de protoplastos, fuerza del
campo elctrico y tiempo durante el cual es
aplicado. Cadenas ms largas darn mayor
frecuencia de fusin que las cadenas cortas.
Pulsos de corriente ms largos y de mayor
voltaje producen un aumento de los eventos de fusin mltiple; obviamente, pulsos
muy largos y voltajes muy elevados pueden
matar a los protoplastos.
La composicin y propiedades de la
membrana plasmtica pueden ser afectadas
por la actividad metablica de los
protoplastos y por el tipo de enzimas empleadas en el proceso de aislamiento, influyendo en consecuencia en el proceso de fusin.
Las condiciones experimentales deben
ajustarse de modo de obtener la mayor frecuencia de fusin posible (nmero de
protoplastos fusionados sobre el total de
protoplastos), intentando maximizar la proporcin de heterocariones (productos de la
fusin de protoplastos diferentes) formados
por sobre la de homocariones (productos de
la fusin de protoplastos del mismo tipo
parental), y minimizando la ocurrencia de
eventos de fusin mltiple (fusin de ms de
dos protoplastos). La proporcin de cada uno
de los dos tipos de protoplastos en la suspensin puede fijarse a fin de incrementar la
formacin de heterocariones por sobre la de
homocariones. El tipo de protoplasto con
mayor tendencia a fusionar se mezcla con el
de menor tendencia a fusionar en una relacin de 1:5 a 1:10. As, durante la formacin
de cadenas, los protoplastos ms fusionables
estarn mayoritariamente en contacto con
los menos fusionables, y stos a su vez esta-
103
rn ligados entre ellos mismos. Seleccionando las condiciones duracin y voltaje de los
pulsos que promuevan slo la fusin de los
protoplastos ms fusionables, los productos
sern mayormente heterocariones.
Sin embargo, aun cuando las condiciones
de fusin puedan fijarse de modo de incrementar la frecuencia de fusin y la proporcin de heterocariones formados, la fusin
de protoplastos a gran escala (macrofusin),
tanto por mtodos qumicos como elctricos,
resultar en una mezcla de protoplastos
parentales, homocariones y heterocariones.
Esto conlleva la necesidad de emplear mtodos de seleccin de los hbridos somticos
obtenidos. Una tcnica alternativa que ofrece la ventaja de no requerir una posterior
seleccin de heterocariones, aunque demanda mayor manipulacin, es la microfusin o
electrofusin de pares de protoplastos. Esta
tcnica se basa en los mismos principios que
la electrofusin a gran escala pero est diseada para inducir la fusin en pares seleccionados de protoplastos. Este sistema emplea
microelectrodos de platino fijados a un soporte montado debajo del condensador de
un microscopio invertido. Los pares de
protoplastos seleccionados se colocan en
microgotas de medio de fusin sobre un soporte, recubiertas por aceite mineral. En cada
evento de fusin, los microelectrodos se
posicionan a cada lado de una microgota
conteniendo un par de protoplastos, y se
aplican los pulsos elctricos. Despus de la
fusin, los heterocariones resultantes son
transferidos a gotas con medio de cultivo
para la posterior regeneracin de plantas
hbridas. La tasa de fusin es de aproximadamente 30 pares de protoplastos fusionados y transferidos a medio de cultivo por
hora, pudiendo alcanzarse frecuencias de fusin cercanas al 50 %.
Ventajas de la electrofusin:
1. El proceso entero puede ser seguido
bajo microscopio por lo que los hbridos pueden ser fcilmente identificados y transferidos a un medio nutritivo o selectivo.
2. Puede preseleccionarse el nmero de
clulas a ser fusionadas. Las formaciones de
dos clulas son favorecidas por bajas densidades en la acanaladura entre los electrodos.
104
Para obtener productos de multifusin deben emplearse elevadas densidades.

3. El proceso de fusin es sincrnico, ya
que el pulso provoca la fusin de todas las
clulas expuestas al campo.
4. Se obtienen elevadas plasmogamia (80
- 100 %) y cariogamia.
5. La viabilidad de las clulas fusionadas
es muy buena.
6. Este mtodo ofrece ventajas sobre otros
como el del PEG, que: -requiere condiciones
no fisiolgicas -las frecuencias de formacin de
heterocariones binucleados son bajas y variables -resultan txicos para diversos tipos celulares- el fusgeno debe ser removido antes
del cultivo de los protoplastos y tiene bajo
rendimiento de clulas fusionadas.
7 Seleccin de heterocariones
La fusin de protoplastos a gran escala
produce una mezcla de tipos parentales y
productos de fusin. Si no se efecta una
previa seleccin de las clulas hbridas, la regeneracin de plantas y la posterior identificacin de los hbridos demandar mucho trabajo y recursos. Dicha seleccin es particularmente necesaria cuando se emplean mtodos qumicos, que producen una baja proporcin (<10%) de clulas hbridas. Por el contrario, los mtodos elctricos no requieren
necesariamente del posterior proceso de seleccin dado que normalmente producen frecuencias de fusin muy elevadas o porque,
en el caso de la microfusin, no se generan
mezclas heterogneas de protoplastos debido a que se fusionan dos clulas por vez.
Cualquiera que sea el caso, la condicin de
hbrido debe verificarse en la planta regenerada mediante diferentes anlisis que se explican ms adelante.
La seleccin de clulas hbridas puede llevarse a cabo empleando los siguientes mtodos:
Seleccin sobre la base de caracteres
morfofisiolgicos. En ciertos casos es posible diferenciar los callos hbridos de los
parentales. Por ejemplo, en algunos cruzamientos, los callos hbridos poseen un color
intermedio al de los parentales.
Cuando se produce un cruzamiento entre un parental con capacidad para regene-
rar planta con uno recalcitrante, los hbridos

somticos normalmente regeneran plantas,
ya que este carcter se comporta como dominante. Si los protoplastos del genotipo
respondedor son tratados con inhibidores
metablicos irreversibles (iodoacetamida,
dietilpirocarbamato, etc.) no sobrevivirn, y
solamente podrn regenerarse los hbridos.
Seleccin por complementacin. La seleccin se produce porque el medio de cultivo resulta restrictivo para el crecimiento de
los parentales, pero no para el de los hbridos.
La complementacin puede lograrse por las
siguientes vas:
a) Empleando dos parentales con defectos metablicos o genticos no allicos. Si
dichos caracteres son recesivos, la fusin produce una clula hbrida en la que los defectos se anulan por complementacin. Por
ejemplo, la fusin de dos variedades albinas
no allicas (nucleares) de tabaco, permiti
obtener plantas verdes.
AAbb (albina) x aaBB (albina)
AAaaBBbb (verde)
Asimismo, a partir de dos lneas mutantes
no allicas de tabaco deficientes en nitrato
reductasa, se obtuvieron colonias capaces de
crecer en un medio conteniendo nitrato
como nica fuente de nitrgeno.
b) Fusionando parentales que expresan
caracteres dominantes tales como resistencia a antibiticos o herbicidas. Para ello se
emplea una lnea resistente a cierta droga, y
otra resistente a una segunda droga, efectundose la seleccin de las clulas hbridas
en un medio conteniendo ambas drogas a
concentraciones que resultan letales para las
lneas parentales.
c) Una lnea que presente una mutacin
autotrfica (por ejemplo: albinismo, deficiencia a nitrato reductasa) y un carcter dominante (por ejemplo, resistencia a antibiticos
o herbicidas) es de gran utilidad para la seleccin. Los hbridos producidos por el cruzamiento de estos parentales con cualquier
genotipo silvestre pueden ser seleccionados
en medio mnimo suplementado con el antibitico o herbicida, que no permite el crecimiento de los parentales.
Seleccin por aislamiento de los
heterocariones o clulas hbridas. Es el sistema ms confiable y de ms amplio espectro de aplicacin. El aislamiento puede realizarse de dos maneras:
a) Seleccin mecnica directa utilizando
tcnicas de micromanipulacin con micropipeta. Puede realizarse cuando los protoplastos parentales presentan rasgos que los
distinguen al microscopio, permitiendo reconocer las clulas hbridas. Por ejemplo, al fusionar protoplastos del mesfilo (verdes) con
protoplastos de suspensiones celulares (incoloros). Tambin pueden colorearse las clulas de ambos progenitores con diferentes
colorantes vitales, como el rojo neutro y azul
brillante de cresilo.
b) Citometra de flujo. Los protoplastos
parentales se marcan con diferentes colorantes fluorescentes; por ejemplo, rodamina
(rojo) y fluorescena (verde amarillento). El
aislamiento de los heterocariones marcados
con ambos colorantes se realiza utilizando un
citmetro de flujo (FACS, fluorescenceactivated cell sorter), que es preciso y muy
rpido. El equipo posee fotoclulas que detectan fluorescencia, pudiendo separar los
protoplastos marcados con un solo fluorocromo (parentales) de aqullos doblemente
marcados (hbridos).
8 Cultivo de protoplastos
La habilidad para regenerar plantas a
partir de clulas y tejidos en cultivo es un componente esencial en la biotecnologa para la
manipulacin gentica y el mejoramiento
vegetal. Esto resulta relativamente fcil para
las dicotiledneas herbceas, pero ha sido
bastante difcil para las monocotiledneas,
particularmente las gramneas.
Los protoplastos se cultivan en cajas de
Petri en medio lquido o semislido, rico en
compuestos orgnicos e inorgnicos, suplementado con reguladores del crecimiento, y
en presencia de un estabilizador osmtico.
Suelen ser cultivados en cajas de Petri con medio agarificado, donde se mezcla la solucin
de protoplastos con un medio de cultivo lquido a 40C conteniendo 1,2% de agar,
perferen-temente agarosa (Fig. 5AyB). Los
protoplastos quedan, as, atrapados en el
medio semislido y, luego de varios das, se
ven las colonias formadas (Fig. 5C). Sin em-
105
bargo, el medio lquido da mejores resultados por varias razones: (a) los protoplastos
de varias especies slo pueden dividirse en
medio lquido, (b) la presin osmtica del
medio puede ser fcilmente reducida a los
pocos das en cultivo, (c) la densidad celular
puede ser modificada agregando medio de
cultivo o las clulas con especial inters pueden ser aisladas y cultivadas a alta densidad,
(d) la degradacin de algunos componentes
del medio por la poblacin de protoplastos
puede producir algunas sustancias citotxicas,
cuya concentracin alrededor de las clulas
ser menor en el medio lquido. Una tcnica
muy eficiente que combina medio slido y
lquido es la de cultivo en perlas de agarosa,
donde los bloquecitos con los protoplastos
inmovi-lizados en agarosa son cortados en
cuatro mitades y colocados en medio lquido, donde se cultivan en continua agitacin.
Los protoplastos regeneran la pared celular luego de uno a cuatro das en cultivo. La
presencia de pared es esencial para lograr una
divisin regular. Luego de dos a tres semanas, producto de mitosis sucesivas, se forman
microcolonias derivadas cada una de una clula, que dos semanas despus se pueden ver
a simple vista. Estos callos son transferidos a
un medio de cultivo y a condiciones apropiadas para regenerar plantas (Fig. 5).
Los principales factores a tener en cuenta para el cultivo de protoplastos son:
Los requerimientos nutricionales: se han
utilizado en muchos casos los mismos medios
de cultivo que se utilizan en el cultivo de clulas y tejidos, pero en general son enriqueci-
dos con vitaminas, azcares, aminocidos,

reguladores de crecimiento y tambin con
aditivos inespecficos como leche de coco,
hidrolizado de casena, extracto de levadura, etctera.
El potencial osmtico del medio de cultivo: los protoplastos requieren de proteccin osmtica antes de regenerar la pared
celular. Normalmente se ajusta con el agregado al medio de cultivo de manitol o
sorbitol.
La densidad celular: la densidad inicial
de protoplastos vara de 104 105 protoplastos/ml de medio de cultivo. Los cultivos
con altas densidades producirn, a partir de
cada protoplasto, colonias que debern separarse tempranamente para evitar quimeras. Si deseamos colonias bien separadas para
asegurar que provengan de un solo
protoplasto, la densidad inicial debe ser baja,
de 100 500 protoplastos/ml. Hay protoplastos de varias especies y tipos que no logran dividirse a bajas densidades de cultivo.
Para estos casos se desarroll la tcnica de
cultivo con clulas nodrizas o alimentadoras.
Esta tcnica consiste en exponer una suspensin de 106 protoplastos/ml a rayos X a dosis que inhiben la divisin celular, pero que
quedan metablicamente activas. Estas clulas se plaquean en un medio agarificado, y
luego se colocan por sobre stas los
protoplastos sin irradiar, de los cuales se formarn las colonias. Tambin suele utilizarse
papel de filtro para separarlas de las clulas
nodrizas. Otra tcnica utilizada es el cultivo
en microgota, donde se puede cultivar hasta
un solo protoplasto. Cada microgota
contiene entre 0,25 - 25 l de medio
de cultivo, logrando densidades de 2
4 x 103 proto-plastos/ml. Con ayuda de
un micromani-pulador se coloca la clula y se la cubre con aceite mineral para
evitar la deshidratacin del medio.
Los tratamientos fsicos: tratamientos de choque elctrico y trmico
estimulan la divisin de los protoplastos.
Las condiciones de cultivo: en geFigura 5: Cultivo de protoplastos de tabaco. A. Protoplastos de neral los protoplastos son sensibles a
mesfilo. B y D. Cultivo de los protoplastos en perlas de agarosa
suspendidas en medio lquido. C. Detalle de la formacin de la luz, por lo cual durante el cultivo se
callo a partir de protoplastos. E. Callo en medio de regeneracin. los mantiene en oscuridad o bajo luz
F. Desarrollo de plantas a partir de callos de protoplastos. G. muy tenue.
Planta regenerada.
El origen de los protoplastos: el
106
estado fisiolgico del tejido del cual provienen y la calidad de los protoplastos son muy
importantes para obtener una elevada eficiencia en la respuesta al cultivo.
el ADN amplificado al azar) o Southern blot,

empleando sondas de ADN repetitivo especfico de especie o de genes de ARN
ribosomal.
9 Identificacin de las plantas hbridas
10 Logros y tendencias de la hibridacin

somtica
La condicin de hbrido debe verificarse

en la planta regenerada aun cuando se haya
efectuado algn tipo de seleccin para el cultivo de las clulas hbridas. A tal fin es conveniente efectuar diferentes evaluaciones, lo
que permite una mejor caracterizacin del
hbrido. Comnmente se llevan a cabo los
siguientes estudios:
1. Morfolgicos. Los hbridos somticos
pueden presentar rasgos morfolgicos caractersticos. Los mismos pueden ser intermedios a los de los parentales, la suma de ellos,
u otros completamente nuevos.
2. Citolgicos. El anlisis del complemento cromosmico permite revelar si el hbrido
posee el total de cromosomas de cada
parental, si se han fusionado ms de dos
protoplastos, el grado de aneuploida y posibles translocaciones intergenmicas. Mediante hibridacin in situ empleando sondas de
ADN repetitivo especfico de especie puede
evaluarse con ms profundidad la contribucin de los genomas parentales y reestructuraciones cromosmicas en el hbrido.
3. Isoenzimticos. El patrn de bandas
isoenzimticas del hbrido debe mostrar bandas de ambos parentales, pudiendo haber
otras bandas que resultan de nuevas combinaciones de las subunidades enzimticas.
Habitualmente se analizan los patrones de
glucosa-6-fosfato deshidrogenasas, fosfoglucoisomerasas, glutamato oxalacetato
transaminasas, esterasas, peroxidasas y
fosfatasas cidas. Las isoenzimas son extremadamente variables entre tejidos vegetales, por lo que para el anlisis se deben emplear los mismos tejidos u rganos, y en el
mismo estado fenolgico.
4. En el mbito del ADN. La demostracin de la presencia de ADN de ambos
parentales es la prueba ms directa de la hibridacin. El anlisis de ADN es independiente del tejido empleado y de la edad de la
planta. Puede llevarse a cabo por RFLP
(polimorfismos en la longitud de los fragmentos de restriccin), RAPD (polimorfismos en
La hibridacin somtica ha permitido producir hbridos que no se haban podido obtener por cruzamientos sexuales, incrementando as el flujo de genes en los cultivos. La
tabla 1 muestra algunos ejemplos de hbridos
somticos que presentan algunas ventajas
agronmicas.
En sus inicios, algunos esperaban que la
hibridacin somtica permitiera producir nuevas especies que expresaran las caractersticas deseadas de ambos progenitores. Por
ejemplo, por hibridacin entre tomate y
papa, se busc producir plantas que desarrollaran tomates en la parte area y tubrculos
en la raz (pomato). La experiencia mostr
que difcilmente puedan lograrse estos
hbridos espectaculares, debindose ms bien
dirigir la tcnica hacia la introgresin de pocos genes silvestres en las especies cultivadas
mediante hibridacin asimtrica o cibridacin,
manteniendo las caractersticas generales del
cultivo.
Uno de los factores que dificulta la obtencin de hbridos simtricos es la progresiva prdida de cromosomas de uno de los
parentales, que normalmente ocurre durante la regeneracin. Si bien la fusin de
protoplastos permite sortear las barreras
precigticas, siguen existiendo barreras
genmicas que resultan en la eliminacin espontnea de cromosomas durante las divisiones celulares. El mecanismo que determina la eliminacin de cromosomas no est
bien comprendido, pero generalmente se
retienen los cromosomas del parental que
tiene el ciclo celular ms corto. Uno de los
factores que puede producir incompatibilidad
genmica es el estado de diferenciacin de
los tipos celulares involucrados en la fusin.
Por ejemplo, cuando se fusionan clulas en
fase de crecimiento activo con clulas del
mesfilo, que no se dividen, generalmente
se pierden los cromosomas de estas ltimas.
Los hbridos somticos o sexuales entre
especies silvestres y cultivadas contienen
107
Tabla 1: Ejemplos de hbridos somticos que exhiben

algn carcter de inters agronmico
muchas caractersticas no deseadas de la primera, adems de aqullas deseadas. El

retrocruzamiento con la especie cultivada es
requerido para remover los genes no deseados del parental silvestre, pero ello no siempre es posible debido a que los hbridos suelen ser estriles. La hibridacin asimtrica y la
cibridacin tienen la ventaja de incorporar
slo uno o pocos caracteres provenientes del
parental silvestre en la especie cultivada, y producir plantas con mayor fertilidad.
Algunos caracteres deseables estn codificados por el genoma extranuclear, tales
como la androesterilidad citoplasmtica y
ciertos tipos de resistencia a enfermedades
y a herbicidas. Para estos casos es de particular utilidad la cibridacin, dado que es un
mtodo simple para transferir estos genes.
11 Algunos ejemplos
oryzicola, Triticum
monococcum (+)
Pennisetum americanum, Festuca
arundinacea (+)
Lolium multiflorum. El primer caso
de regeneracin de
plantas maduras de
hbridos intergenricos (simtricos y
asimtricos) en gramneas fue el Festulolium.
A pesar de los
esfuerzos realizados,
la aplicacin de esta
estrategia no ha
conducido a la obtencin de nuevos
hbridos de especies
importantes, fundamentalmente debido a problemas de
baja o nula fertilidad. Los mtodos
actuales de transferencia de genes aislados han desplazado el inters en la hibridacin somtica. Sin embargo son una excelente herramienta para estudiar las interacciones ncleo-citoplasmticas entre genomas.
BHOJWANI, S.S.; RAZDAN, M.K. 1996. Protoplast isolation
and culture. Somatic hybridization and cybridization. En:
Plant Tissue Culture: Theory and Practice, Capitulos 12 y
13. S.S. Bhojwani y M.K. Razdan (eds.) Elsevier,
Amsterdam. pp. 337-406.
LINDSEY Y JONES, 1992. Biologa celular de la ingeniera
gentica. En: Biotecnologa vegetal agrcola, Captulo 6.
Editorial ACRIBIA, S.A., Zaragoza. pp.105-142.
MATSUMOTO, K. 2001. Hbridos somticos. Biotecnologa Ciencia & Desenvolvimiento, 20,mayo / junio: pp.
26-28.
ZIMMERMANN, U. 1983. Electrofusion of cells: principles
and industrial potential. Trends in Biotechnology, 1,5:
pp. 149-156.
Se han obtenido hbridos intergenricos

de Panicum maximum (+) Pennisetum
americanum (Ozias-Atkins et al., 1986),
Saccharum officinalis (+) Pennisteum
americanum, Oriza sativa (+) Echinochloa
108
III.-Captulo 3
Transformacin gentica
Daz, Marina L.; Zappacosta, Diego C.;
Franzone, Pascual M.; Ros, Ral D.
1 Introduccin
El mejoramiento gentico vegetal se origin hace aproximadamente 10.000 aos,
cuando el hombre se hizo agricultor y comenz la domesticacin de las plantas. En el siglo XX, con la incorporacin de los cruzamientos sexuales, el conocimiento de la biologa
floral de las especies, los avances de la
gentica y de la estadstica experimental,
entre otros, se desarrollaron los mtodos de
mejoramiento actualmente utilizados. El
mejoramiento gentico se basa en la existencia de variabilidad gentica para los caracteres que se desea mejorar y la reproduccin sexual para la incorporacin de los
mismos. Este hecho hace que el aprovechamiento de la variabilidad est restringido por
barreras de cruzabilidad. El reciente desarrollo de mtodos no sexuales para transferir
genes, como la transformacin gentica,
permite superar esta limitacin, abriendo
nuevas perspectivas en el mejoramiento de
las plantas.
La ingeniera gentica o transformacin
gentica, tcnica conocida como del ADN
recombinante, permite introducir en plantas
genes provenientes no slo de otras especies vegetales muy alejadas desde el punto
de vista evolutivo sino incluso de hongos, virus, bacterias y animales. Conviene destacar
que la transformacin de plantas es una tecnologa que aporta variabilidad gentica conocida sin alterar el fondo gentico. Este ltimo aspecto es de gran importancia ya que
la creacin de cultivares es un proceso
acumulativo; es decir que se desea incorporar caractersticas favorables sin perder las
mejoras logradas anteriormente. El
germoplasma transgnico es posteriormente incorporado al proceso de mejoramiento,
el cual depender de la especie y del tipo de
cultivar a obtener.
En 1983 se informaron los primeros experimentos de expresin de un transgen (gen
introducido) en clulas vegetales y al ao siguiente se obtuvieron las primeras plantas

transgnicas (tabaco y petunia). Desde entonces se ha extendido la aplicacin de esta
tecnologa a unas 120 especies. Las plantas
transgnicas obtenidas hasta la fecha se desarrollaron por diversos mtodos, los que han
sido modificados para cada especie en particular, aumentndose de esta forma la eficacia de los mismos.
Entre sus aplicaciones se encuentran la
obtencin de plantas con resistencia a virus,
insectos, hongos y bacterias, tolerancia a
herbicidas y a estreses abiticos y modificacin de la calidad nutritiva de los cultivos entre otras. Asimismo, a travs del uso de
transgenes es posible modificar la expresin
de genes presentes en el genoma de la planta. La transformacin gentica tambin constituye una herramienta til para estudios
bsicos que permiten conocer y/o profundizar acerca de la estructura y funcin de genes
especficos, aspecto particularmente relevante en la era genmica (ver VII.-1).
2 Requerimientos para la obtencin de
plantas transgnicas
Para todas las tcnicas de transformacin
desarrolladas hasta el momento es necesario disponer del transgen (secuencias
regulatorias y codificante clonadas en un
vector de transformacin) y de una metodologa eficiente para la transferencia al
genoma vegetal. Una vez introducido el gen
de inters en la clula, se induce el desarrollo
de plantas mediante distintas tcnicas de
cultivo de tejidos. Se procede luego al anlisis molecular de las plantas regeneradas in
vitro para identificar aquellas que porten y
expresen el o los transgenes en los niveles
deseados. Finalmente, a travs de experimentos de campo y laboratorio se estudia el comportamiento de los individuos transgnicos
y su descendencia.
Por lo tanto, los elementos bsicos que
se requieren en trabajos de transformacin
gentica en plantas son:
1. Un sistema de cultivo de tejidos que
permita regenerar plantas completas y frtiles.
2. Vectores apropiados, que permitan el
109
clonado del gen de inters y/o su transferencia al tejido blanco de transformacin.

3. Un protocolo de transformacin (sistema de transferencia de genes y de seleccin
del material transformado).
4. Herramientas de anlisis para detectar
la presencia del transgen y los productos del
mismo en la planta.
Antes de iniciar la descripcin de los tem
anteriores, resulta importante destacar que
para lograr una planta transgnica deben
ocurrir tres procesos en la misma clula:
a) El transgen debe ser transferido al interior de la clula,
b) El transgen debe integrarse al ADN
celular y
c) Se debe regenerar una planta completa a partir de la clula transgnica en la que
se verificaron los procesos a y b.
Dado que las clulas tienen diferente competencia o capacidad de respuesta para cada
uno de estos procesos, la puesta a punto
de un protocolo de transformacin eficiente requiere maximizar la cantidad de clulas competentes para todos ellos de manera simultnea.
2.1 Cultivo de tejidos vegetales
Los mtodos de transformacin ms utilizados actualmente se basan en la obtencin de clulas transgnicas y posterior recuperacin de plantas completas y frtiles a
partir de las mismas a travs del cultivo y seleccin in vitro. Esto es posible gracias a la
propiedad de totipotencia expresada por las
clulas vegetales (ver II.-1). En la mayora de
las especies se observa una importante influencia del genotipo en la respuesta al cultivo in vitro. Por ello, cuando se usa esta tecnologa con fines de mejoramiento gentico
es muy importante conocer la respuesta
morfogentica de distintos genotipos con
adaptacin local. En el cultivo in vitro, un prolongado perodo de subcultivos puede inducir la aparicin de variacin somaclonal no
deseable, ya que es conveniente introducir
slo las modificaciones que se desean y en
forma controlada (ver III.-1).
110
2.2 Construccin del vector

Para introducir un transgen es necesario
que el mismo sea incorporado previamente
en un vector (por ejemplo un plsmido). Para
ello se digiere el ADN extrado de un organismo, cualquiera que sea su origen, con enzimas
de restriccin. Estas endonucleasas tienen la
capacidad de reconocer en el ADN secuencias especficas compuestas por pocos
nucletidos y posteriormente producir cortes
en las mismas. Los fragmentos de restriccin
as obtenidos pueden ser ligados
enzimticamente a vectores de clonado,
obtenindose, de este modo, clones de ADN
recombinante (ver II.-3)
Figura 1: Estructura molecular del transgen
Un transgen est compuesto por una secuencia codificante (regin comprendida entre los codones de iniciacin y terminacin
de la traduccin) y por secuencias regulatorias
que determinan el tejido, el momento del
desarrollo y el nivel de expresin del transgen
en la planta. La adecuada expresin de los
transgenes es un aspecto importante en la
obtencin del fenotipo deseado en la planta transgnica. Muchas veces los genes utilizados provienen de bacterias y usualmente
no pueden expresarse eficientemente en
clulas eucariotas. Por ello, para optimizar la
expresin del transgen es necesario reemplazar las secuencias regulatorias bacterianas por
otras aptas para su expresin en clulas vegetales. En este contexto, la secuencia ms
importante es el promotor, sitio del ADN al
cual se une la enzima ARN-polimerasa para
iniciar el proceso de transcripcin (Fig. 1).
Cabe destacar que la expresin gnica es controlada por las secuencias regulatorias y no
depende de la secuencia codificante. Por lo
tanto, una secuencia codificante aislada de
un gen A, puesta bajo el control de un promotor aislado de un gen B, se expresar de
acuerdo con el patrn de expresin de dicho
promotor. Asimismo, en la eleccin del pro-
DAZ, M.L.; ZAPPACOSTA, D.C.; FRANZONE, P.M.; ROs, R.D.
motor a utilizar en la construccin del

transgen, hay que considerar la especie vegetal a transformar, ya que su nivel y patrn
de expresin pueden variar al ser utilizados
en especies distintas a la de origen del mismo. Dentro de los promotores se distinguen
aquellos constitutivos, que permiten la expresin del gen en toda la planta en forma
continua, los inducibles que responden a
factores ambientales y finalmente los especficos de tejido que permitirn la transcripcin en determinados rganos y tejidos (Tabla 1). Los promotores pueden ser modificados con el fin de aumentar la expresin de
los genes que regulan, pueden truncarse,
adicionrseles un intrn o unrseles secuen-
nidos en el mismo experimento. La solucin

para evitar los efectos de posicin es dirigir la secuencia de inters a sitios especficos
del genoma vegetal, elegidos por su patrn
de expresin adecuado y estable. Esto se
puede lograr usando sistemas de recombinacin heterloga sitio-especficos o mediante reemplazo gnico por recombinacin
homloga.
2.3 Mtodos de transformacin
La pared celular impide la entrada del ADN

en la clula, constituyendo un obstculo que
todos los mtodos de transformacin
gentica tienen que superar de algn modo.
Estos mtodos pueden dividirTabla 1: Promotores usados en transformacin gentica de plantas
se en:
Constitutivos
Promotores
nos (nopalina sintetasa de Agrobacterium)

35 S (virus del mosaico del coliflor)
Ubi (ubiquitina de maz)
Act 1 (actina de arroz)
TA 29 (tapete de la antera de tabaco)

faseolina (cotiledones de poroto)
Especficos de tejido TobRB 7 (raz de tabaco)
patatina (tubrculo de papa)
glutenina (endosperma de trigo)
subunidad pequea de Rubisco inducible por luz
alcohol deshidrogenasa-1 inducible por
Inducibles
anaerobiosis
protena de shock trmico inducible por calor
cias de otros promotores. Al momento de

elegir el promotor debe tenerse en cuenta
tambin la planta a transformar ya que algunos de ellos son menos activos en
monocotiledneas, como el 35S; por otra
parte el de ubiquitina 1 (ubi1) de maz es
uno de los ms efectivos en gramneas. Adems, es necesario que el transgen disponga
de una regin no traducida en el extremo 3
del mismo, que incluya la seal de corte y
poliadenilacin (terminador), necesaria para
el correcto procesamiento del transcripto
correspondiente.
Por otra parte el nivel y patrn de expresin del gen tambin puede estar afectado
por la posicin del mismo en el genoma de
la planta transformada (efecto de posicin).
Esto puede deberse a la presencia de otras
secuencias regulatorias cercanas, a la estructura de la cromatina, al patrn de metilacin,
etc. La cantidad de protena producida por
el transgen comnmente vara ms de 100
veces entre individuos transformantes obte-
a) Transformacin mediada por Agrobacterium, vector

biolgico que participa del proceso de transferencia.
b) Mtodos de transformacin gentica directa, tambin llamados fsicos, mediante los cuales, por distintos mecanismos, se introduce el ADN
en la clula.
2.3.1 Transformacin mediada por

Agrobacterium
Las especies del gnero Agrobacterium
son bacterias Gram-negativas aerbicas obligadas que viven en el suelo. Ellas son capaces de desarrollar un crecimiento saproftico
o parastico. El gnero comprende cuatro
especies fitopatognicas, dos de ellas ampliamente estudiadas (A. tumefaciens y A.
rhizogenes). Ambas especies son capaces de
infectar una amplia variedad de especies de
dicotiledneas y tienen como blanco de infeccin a las heridas, atacando clulas individuales y provocando su proliferacin. A.
tumefaciens causa tumores, enfermedad
que se conoce como agalla de la corona y
A. rhizogenes induce la proliferacin de races dando lugar a la enfermedad denominada raz en cabellera. La capacidad
patognica de estas bacterias esta asociada
a la presencia de megaplsmidos (150-200
kilo pares de bases o Kb) llamados Ti (por
111
tumor-inducing
o inductor de tumores) o Ri (por
root-inducing o
inductor de races),
presentes en algunas de las agrobacterias. Se demostr
que durante la patognesis un fragmento de estos
plsmidos llamado Figura 2: Estructura del T-DNA
T-DNA
(por
transfer-DNA), es transferido a la clula estn involucrados genes cromosmicos (chv
vegetal, donde se integra al ADN A, chv B, chv E, cel, psc A y att), se produce
cromosmico de la planta y cuya expresin el procesado y la transferencia del T-DNA,
causa proliferacin de clulas de la planta a mediados por los genes vir (por virulencia)
travs de la sntesis y alteracin de la respues- que son inducidos por azcares y compuesta a hormonas vegetales. El T-DNA contiene tos fenlicos, como la acetosiringona, produgenes que se expresan eficientemente en la cidos por clulas vegetales heridas. Se conoclula vegetal infectada y producen sntesis ce con mucho detalle la etapa de la
de hormonas vegetales (llamados oncogenes patognesis que ocurre en la bacteria (ver
porque son los responsables de la prolifera- revisin de Gelvin, 2000). La regin de virucin anormal del tejido) y genes que provo- lencia (de alrededor de 30 Kb) est organizacan la sntesis de opinas (fuente de carbono da en operones esenciales para la transferencia del T-DNA (vir A, vir B, vir D, vir G) o
y nitrgeno para la bacteria).
A. tumefaciens es el caso ms estudiado que permiten incrementar la eficiencia de la
y utilizado en la transformacin de plantas. transformacin (vir C, vir E). El ingreso de
El T-DNA est delimitado por dos repeticio- Agrobacterium en la era genmica permitines directas imperfectas de 25 pares de ba- r avanzar en el conocimiento de la
ses (bp) que lo flanquean, llamadas bordes interaccin de esta bacteria con las plantas.
El desarrollo de la patognesis de planderecho e izquierdo (Fig. 2). Estos bordes son
los nicos elementos en cis necesarios para tas por Agrobacterium representa una situadirigir el procesamiento del T-DNA. Cualquier cin nica en la naturaleza: la transferencia
fragmento de ADN ubicado entre estos bor- de un elemento gentico (T-DNA) de un ordes puede ser transferido a la clula vegetal. ganismo procariota a un organismo eucariota
Contrariamente a lo que sucede con otros superior, con su subsiguiente integracin y
tipos de secuencias mviles de ADN, el T-DNA expresin en el genoma hospedador. Este
no codifica los productos que median su mecanismo de ingeniera gentica natural es
transferencia. El T-DNA es una regin relati- aprovechado para la transferencia de genes
vamente grande (ca. 20 Kb) que contiene de inters a las plantas, para lo cual, los
genes con secuencias regulatorias (promoto- oncogenes y genes de sntesis de opinas, son
res y seales de poliadenilacin) tpicamente reemplazados por un marcador seleccionable
y el gen a transferir (Fig. 2). El mtodo llamaeucariticas.
Desde la dcada de 1950-60 se sabe que do del explante (Horsch y col., 1984) conlos tumores de la agalla de la corona se desa- siste en inocular un explante con A.
rrollan si hay A. tumefaciens patognicas en tumefaciens, dejar la bacteria en contacto
presencia de heridas. Un aspecto destacable con el explante durante un cierto tiempo, en
de esta bacteria es que usa la respuesta de la l se produce la transferencia del T-DNA que
planta a las heridas (cicatrizacin y defensa) contiene un gen marcador seleccionable y el
como quimioatractivo y activador del proce- o los transgenes de inters. Posteriormente
so de patognesis. Luego de la adhesin de se transfieren los explantes a un medio de
la bacteria a la clula vegetal, etapa en la que cultivo que contiene un antibitico que ac-
112
ta como bacteriosttico y el agente selectivo correspondiente al gen marcador

seleccionable utilizado. Una vez completado
el protocolo de cultivo y seleccin in vitro se
recuperan las plantas transgnicas (Fig. 3).
Anlisis por hibridacin del T-DNA en plantas transgnicas y su progenie han demostrado que el T-DNA se incorpora al ADN
cromosmico y se hereda en forma estable.
Los plsmidos Ti sin oncogenes se denominan desarmados, son de gran tamao
y resulta difcil introducir genes en su T-DNA
usando tcnicas habituales de ADN
recombinante. Por esta razn se han desarrollado dos sistemas de vectores para introducir genes en Agrobacterium: los vectores
cointegrados, que deben formar estructuras
cointegradas para replicarse en A.
tumefaciens y los vectores binarios, que son
capaces de replicarse en forma autnoma en
esta bacteria. En los vectores cointegrados,
la insercin del ADN que contiene los
transgenes dentro del T-DNA de un plsmido
Ti desarmado se logra por recombinacin
homloga. Sobre la base de la capacidad de
los genes de virulencia de actuar en trans,
movilizando el T-DNA presente en otro
plsmido, se construyen vectores denominados binarios que contienen un T-DNA no
oncognico en un plsmido pequeo, con un
origen de replicacin de amplio espectro de
hospedantes, caractersticas que permiten su
fcil manipulacin gentica usando E. coli
como husped. La introduccin de este
plsmido a una cepa de Agrobacterium que
contenga un plsmido llamado helper de
virulencia (con la regin vir intacta y sin TDNA) la hace apta para la transferencia del
T-DNA a las clulas vegetales. Si bien ambos
tipos de vectores son herramientas eficientes para la transformacin, se aprecia una
notable preferencia por el uso de vectores
binarios.
La integracin del T-DNA en el ADN
cromosmico de la planta se produce al azar,
por recombinacin ilegtima, preferencialmente en regiones con actividad transcripcional y con la participacin de protenas
de la bacteria y de la planta. Este sistema de
transformacin permite transferir fragmentos de ADN de hasta 150 Kb. Para ello se utilizan vectores especiales que tienen caractersticas tanto de cromosomas artificiales de
bacterias (BACs) como de vectores binarios.

El uso de estos vectores permite clonar fragmentos de ADN de gran tamao y posteriormente transferirlos al genoma vegetal va
A. tumefaciens. Esta tecnologa es de gran
utilidad para el clonado posicional de genes.
Ms de 600 especies vegetales son
hospedantes naturales de A. tumefaciens.
Estas pertenecen en su mayora a dicotiledneas y gimnospermas y ms raramente a
monocotiledneas. Para muchas de ellas se
han puesto a punto protocolos de transformacin gentica basados en este vector. El
inters en el desarrollo de este tipo de tecnologa hizo que se expandiera el rango de
hospedantes de A. tumefaciens a especies
que no son susceptibles en condiciones naturales a este patgeno. Esto fue posible
debido al amplio conocimiento que se tiene
de esta patognesis. As, se ha puesto nfasis en la utilizacin de A. tumefaciens como
vector de transformacin en gramneas y se
han desarrollado protocolos en varias especies de este grupo (arroz, maz, cebada, trigo
y gramneas forrajeras). Cabe notar que su
aplicacin es actualmente una rutina en arroz
y maz.
La transformacin con A. rhizogenes tiene fundamentalmente dos aplicaciones: la
produccin de races con alta tasa de crecimiento capaces de sintetizar metabolitos
secundarios como productos farmacuticos,
aditivos alimentarios y cosmticos, y por otra
parte representa una valiosa herramienta
para la estimulacin de la rizognesis en especies recalcitrantes, por ejemplo, leosas.
La puesta a punto de un protocolo eficiente y reproducible de transformacin mediada por Agrobacterium es un proceso complejo en el que adems de tener muy buen
conocimiento de la respuesta al cultivo in
vitro de la especie a transformar, hay que
considerar aspectos tales como el genotipo
vegetal, la cepa bacteriana, el tejido blanco
de transformacin, la induccin de los genes
de virulencia y el control del estrs durante
todo el proceso.
2.3.2 Transformacin directa o por
mtodos fsicos
La primer metodologa de transformacin
gentica de plantas desarrollada fue la de A.
113
Figura 3: Comparacin de tcnicas de transformacin

directa e indirecta
tumefaciens. Inicialmente esta tecnologa no

result de utilidad para abordar la transformacin de especies de gran importancia econmica como los cereales, debido a que no
son hospedantes naturales de esta bacteria.
Este hecho condujo al desarrollo de los mtodos fsicos de transformacin. En ellos el
transgen es introducido en la clula vegetal
mediante distintas tcnicas que se detallan
a continuacin.
- Transformacin de protoplastos
La introduccin y expresin de ADN for-
114
neo en protoplastos fue el primer

mtodo de transferencia directa claramente demostrado en plantas y
esto se debi a que se dispona,
para algunas especies, de procedimientos eficientes para la regeneracin a partir de protoplastos. Se
basa en el hecho de que la pared
celular es la principal barrera para la
introduccin de ADN en las clulas
vegetales por lo que sta es
temporariamente removida. Los
protoplastos pueden ser aislados en
forma mecnica o por un proceso
enzimtico que digiere la pared. As
se obtiene una suspensin conteniendo millones de clulas individuales lo que favorece la transformacin
de clulas aisladas.
Los protoplastos pueden ser
transformados utilizando polietilenglicol (PEG), electroporacin,
microinyeccin o liposomas. La
transformacin de protoplastos
mediada por PEG es el mtodo ms
comnmente usado. Tanto el PEG
como la electroporacin producen
poros en la membrana plasmtica
por alteracin de la polaridad de la
misma y por ellos penetra el ADN
forneo. En el ltimo caso se someten los protoplastos a un campo
elctrico. Ambas tcnicas permiten
el tratamiento de un gran nmero
de protoplastos al mismo tiempo.
La microinyeccin es un mtodo difcil y laborioso que consiste en la introduccin de ADN dentro de
protoplastos individuales mediante
el uso de capilares de inyeccin y
micro-manipulador y aunque con
esta metodologa es necesario manipular las
clulas individualmente, es posible lograr un
alto grado de integracin del ADN forneo.
Cabe notar que el cultivo de protoplastos
es la metodologa ms sofisticada de cultivo
in vitro de plantas por lo cual representa
gran complejidad experimental y no est disponible ms que para algunas especies y dentro de ellas particularmente en genotipos modelo. Por ello se desarrollaron metodologas
alternativas de transformacin directa como
la electroporacin de tejidos, el uso de fibras
de carburo de silicio para facilitar la entrada corporar de manera permanente la informadel ADN en las clulas en cultivo y el bombar- cin gentica transferida. A pesar de la desdeo con microproyectiles o micropartculas.
ventaja que representa el bajo nmero de
- Bombardeo de micropartculas
transformantes producido por un solo epiEs un proceso por el cual micropartculas sodio de bombardeo, la versatilidad de la
cubiertas con ADN son aceleradas por un gas aceleracin de partculas para introducir
comprimido e introducidas en clulas vege- transgenes ha superado muchas de las batales. Esta tcnica se ha ido perfeccionando rreras asociadas a otros mtodos de transy actualmente es la ms difundida entre los formacin, como son el rango de huspedes
mtodos de transformacin directa. Inicial- de Agrobacterium y las dificultades inherenmente, la fuerza impulsora de las partculas tes al cultivo y regeneracin de protoplastos.
estaba dada por plvora, pero
luego fue reemplazada por el Tabla 2: Comparacin entre mtodos de transformacin del genoma
sistema de helio comprimido nuclear
Mtodo biolstico
Agrobacterium
que brinda una mejor regulacin de la fuerza, distribucin
Especies a transformar
- dicotiledneas y algunas
- sin limitaciones
monocotiledneas
de microproyectiles y mayor
Eficiencia de transformacin
- alta
- baja
reproducibilidad entre bombar- Tipo de integracin en el - aleatoria en regiones con
- aleatoria
transcripcin
genoma vegetal
deos. Se utilizan micropro- bajo nmero de copias
- multicopia en tandem
yectiles de oro o tungsteno
independientes
- precisa
- imprecisa
(qumicamente inertes) cuyos
Construccin de vectores
- compleja
- simple
tamaos van desde 0,5 a 3 Dependencia del genotipo
- mayor
- menor
vegetal
mm, que al ser disparados a
grandes velocidades pueden
La biolstica ha demostrado ser la mejor opatravesar pared y membranas de la clula cin para la produccin de plantas
vegetal bombardeada sin causarle daos le- transgnicas de soja, sorgo, papaya, esprratales (Klein y col., 1987). Para el bombardeo go, caa de azcar y trigo.
se puede emplear cualquier tipo de explante
vegetal, desde clulas o protoplastos hasta 2.3.3 Transformacin directa vs. indirecta
plntulas completas, pasando por tejidos organizados en embriones y meristemas. El
Con el transcurso de las investigaciones
explante es generalmente sometido a un tra- se ha logrado optimizar los protocolos de
tamiento osmtico pre y posbom-bardeo, transformacin para muchas especies vegeque produce plasm-lisis celular, evitando tales; igualmente, en la actualidad, ambas
que el impacto y la penetracin de las part- vas de transformacin presentan ventajas y
culas daen las clulas (Fig. 3). Los vectores desventajas que las hacen ms o menos conplasmdicos que se usan en este tipo de provenientes para los distintos fines. En la Tacedimiento slo requieren un origen de bla 2 se presenta una comparacin entre la
replicacin que permita un alto nmero de transformacin del genoma nuclear mediacopias de los mismos en E. coli, aspecto que da por A. tumefaciens y el mtodo biolstico
facilita en la prctica la preparacin del ADN como representante de los mtodos de
necesario en grandes cantidades para la transformacin directa.
transformacin gentica por este mtodo.
Uno de los procesos necesarios para obEsta tcnica, sin embargo, tiene manifies- tener plantas transgnicas es la integracin
tas limitaciones. Algunas especies oponen del transgen al ADN cromosmico. Con reuna resistencia natural a la penetracin de lacin a este proceso existen diferencias enlas partculas, dada por cutculas endurecidas, tre ambos mtodos. A. tumefaciens posee
paredes celulares lignificadas o superficies un mecanismo natural muy eficiente para
vellosas. Sin embargo, la principal limitacin transferir, al ncleo celular, el T-DNA que condel mtodo contina siendo la baja relacin tiene el transgen y producir una integracin
entre el total de clulas sometidas al bom- aleatoria en regiones cromosmicas con acbardeo y el nmero de clulas que logran in- tividad transcripcional. Generalmente, los
115
patrones de insercin de transgenes son ms

sencillos en comparacin a los producidos por
el mtodo biolstico. As, el nmero de copias que se incorpora es bajo y cuando hay
ms de una copia, suelen distribuirse en loci
independientes, lo que facilita la posterior
eliminacin de las copias no deseadas por
segregacin. Por otra parte, el mecanismo
involucrado hace que se transfiera un segmento de ADN definido: el T-DNA, acompaado de protenas que lo protejen de la accin de nucleasas. Por el contrario, en el mtodo biolstico el ADN transferido no est
asociado a protenas, por lo que al ser parcialmente degradado, slo parte del mismo
llega al ncleo donde se produce, con baja
eficiencia, la integracin al azar en el ADN
cromosmico. En este mtodo es comn que
se produzcan inserciones de varias copias del
transgen en un mismo sitio del genoma con
distinto grado de reordenamiento de la secuencia del transgen. Este ltimo aspecto es
considerado como una desventaja ya que
tanto desde el punto de vista de la percepcin pblica como el de la optimizacin de la
expresin de los transgenes, es deseable disponer de inserciones simples y bien definidas molecularmente. Esto es particularmente relevante cuando se tiene por objetivo el
desarrollo de productos comerciales. As, el
fenmeno de silenciamiento de transgenes
(prdida de su expresin), observado en algunos casos, puede resultar de la presencia
de varias copias del transgen. Por otra parte,
cuando se utiliza el mtodo biolstico, el segmento de ADN plasmdico que se integra al
ADN cromosmico no est definido, como
en el caso de T-DNA, sino que es de longitud
variable.
La construccin de vectores es mucho
ms sencilla en el caso del mtodo
biolstico. Este aspecto puede resultar importante en el contexto del desarrollo de proyectos de investigacin, en los cuales muchas
veces se requiere utilizar un nmero considerable de vectores diferentes.
Es conveniente destacar que en ambos
mtodos la integracin del transgen en el
genoma se produce al azar. Como consecuencia de ello, diferentes plantas
transgnicas provenientes de un mismo experimento, presentan inserciones en distintos sitios del genoma receptor. As, la expre-
116
sin fenotpica de un transgen ser diferente en distintas plantas que contienen el mismo transgen, por lo cual, para clarificar la situacin se considera a cada una de ellas
como eventos de transformacin distintos.
La aplicacin de cualquiera de estos mtodos de transformacin al mejoramiento
vegetal depende, en gran medida, de la disponibilidad de genotipos con muy buena
respuesta al cultivo in vitro. Finalmente,
cabe mencionar que en el caso de A.
tumefaciens, debido a que se trata de una
interaccin biolgica entre una planta y una
bacteria, la dependencia del genotipo es
mucho ms acentuada, ya que influyen tambin en la eficiencia de transformacin, tanto el genotipo de la planta como el de la
bacteria.
2.3.4 Genes de seleccin e informadores
En el proceso de obtencin de plantas
transgnicas, los genes marcadores
seleccionables (Tabla 3), generalmente de
origen bacteriano, cumplen un rol de relevancia, sea para poner a punto un protocolo de
transformacin o como acompaantes de
genes de inters que se desean introducir. El
gen marcador seleccionable otorga a las clulas transgnicas que lo expresan una importante ventaja, con respecto a las clulas no
transgnicas, al permitirles crecer en un medio de cultivo que contiene el agente selectivo correspondiente. Entonces, si el gen marcador codifica para una protena que confiere resistencia a agentes fitotxicos como
antibiticos o herbicidas, las clulas que lo
expresen podrn crecer y desarrollarse en
medio de cultivo que contenga dichos agentes selectivos mientras que las clulas no
transgnicas no lo harn (seleccin negativa). En otros casos, la ventaja estar dada
por la posibilidad de utilizar diferencialmente
un sustrato. As, el gen man A de E. coli permite a las clulas vegetales que lo expresan
utilizar la manosa como fuente de carbono,
lo cual no es posible para las clulas no
transgnicas (seleccin positiva). Es necesario tener en cuenta que algunas especies pueden poseer una resistencia natural a los agentes selectivos antes mencionados, por lo que
es importante evaluar este aspecto cuando
se elige el gen de seleccin a utilizar, as como
Tabla 3: Genes marcadores utilizados comnmente en transformacin de

plantas
Marcadores
Seleccionables (Agente selectivo)

npt II (kanamicina, paromomicina, G418)
hph (higromicina)
pat o bar p
( hosphinotricina, bialaphos)
CP 4 (glifosato)
man A (manosa 6 fosfato)
2.4 Tcnicas de deteccin

del transgen y sus
productos
Visualizables (Fenotipos asociados)
Luego de la seleccin in
vitro, las plantas regeneradas deben ser analizadas
por mtodos moleculares
para identificar aquellas
que porten y expresen los transgenes en los
niveles deseados. Para ello se emplean tcnicas como:
- Reaccin en cadena de la polimerasa
(PCR): con el uso de primers homlogos a
la secuencia del transgen se puede determinar la presencia del mismo. Esta tcnica permite hacer un screening rpido de las plantas regeneradas, aunque tiene algunas limitaciones, un resultado positivo indica solamente que en la muestra existe una secuencia que amplifica con los primers utilizados
pero no indica si el transgen se encuentra incorporado al genoma de la planta. Para
maximizar la robustez de esta prueba es necesario utilizar temperaturas de annealing
o apareamiento de primers altas (ms de 60
C) y primers relativamente largos (ms de
20 nucletidos). Una variacin de esta tcnica, PCR en tiempo real, resulta de utilidad
para evaluar el nmero de copias del
transgen incorporadas al genoma de la clula vegetal.
gus A (color azul ndigo)

luciferasa (luminiscencia)
gfp (fluorescencia verde)
el agente selectivo y las concentraciones del

mismo.
En la puesta a punto de las metodologas
de transferencia de genes son asimismo de
gran utilidad los genes marcadores
visualizables o informadores que posibilitan
la observacin directa de las clulas que los
expresan (Tabla 3). Estos genes codifican para
protenas que no estn presentes en las clulas vegetales y producen un fenotipo caracterstico de fcil y rpida observacin. As, el
gen gus A proveniente de E. coli codifica para
la enzima -glucuronidasa. Esta protena
puede ser detectada cualitativamente por
tincin histoqumica, en presencia de un
sustrato especfico, por la produccin de un
precipitado azul-ndigo de fcil visualizacin.
Este marcador tambin puede ser detectado cuantitativamente usando tcnicas fluoromtricas. Como ejemplo de la aplicacin de
estos mtodos de deteccin podemos mencionar el estudio de la expresin de un promotor en una especie vegetal. Para ello se
puede construir un vector con la secuencia
codificante de gus A y con una secuencia de
terminacin de transcripcin, y estudiar en
plantas transgnicas el patrn de expresin
espacio-temporal del promotor (en qu tipo
de clulas y cundo se expresa) por tincin
histoqumica y su nivel de expresin por
fluorometra.
Recientemente, el gen de la protena
fluorescente verde, gfp (green fluorescent
protein), aislado de una medusa, se ha convertido en un gen marcador visualizable in
vivo muy utilizado. Cuando se ilumina con
luz ultravioleta o luz azul, tejidos que contienen clulas que expresan este gen, se observa un brillo verde fluorescente. Al ser ste un
ensayo no destructivo, es decir que permite
conservar vivo el material en estudio, representa una herramienta de utilidad para
visualizar diferentes etapas del proceso de
transformacin.
- Hibridacin southern o Southern

blotting: es una de las herramientas
moleculares ms poderosas para caracterizar
las plantas transgnicas. Adems de indicar
la presencia o no de la secuencia de inters,
da informacin acerca de la integracin de la
misma en el genoma de la clula husped
(nmero de copias integradas y nmero de
loci en los cuales se produjo la integracin).
En la Fig. 4 se representa el anlisis de un
caso hipottico de transformacin mediante Agrobacterium, aunque ste es aplicable
tambin a plantas obtenidas por mtodos
directos. El esquema 4-a representa parte del
vector que contiene el gen de inters y el gen
marcador. Si se utiliza como sonda el T-DNA
completo y la digestin del ADN genmico
se realiza con enzimas de restriccin que no
cortan dentro del T-DNA, el nmero de bandas del patrn representa el nmero de si-
117
Hind III
BI
Eco RI
Sal I
Gen Marcador
1 2 3
4 5
c) 1 2 3 4 5
Ausente dentro del

T -DNA
Sonda:
T-DNA (frag.Hind III)
2 3
T-DNA (frag.Hind III)

> 2 kb
Sitio de corte: Un sitio (Eco RI) entre

el marcador y el transgen
Sonda:
Transgen
Frag: tamao
cantidad
d) 1 2 3
4 5
Uno interno (Eco RI) Un sitio (EcoRI) entre

el marcador y el transgen
> 5 kb
e) 1
BD
3 kb
Sitio de corte:
Frag: tamao
Hind III
Gen de Inters
2 kb
b)
Sal I
> 3 kb
Igual que en d)
Gen marcador
> 2 kb
f)
2 3
Dos sitios (Sal I) dentro del

transgen
Fragmento (Sal I) del transgen
1 kb
Uno
Figura 4: Patrones de Hidridacin de Southern (Modificado de Bhat y Srinivasan, 2002)
tios de insercin. El tamao de las bandas

ser mayor que el T-DNA ya que se estn utilizando enzimas que cortan por fuera de ste.
Plantas transgnicas obtenidas en forma independiente tendrn patrones de hibridacin diferentes (4-b). Por otra parte, si la enzima tiene un sitio de corte nico dentro del
T-DNA, utilizando la sonda antes mencionada, sta dar dos seales de hibridacin para
118
cada sitio de insercin independiente del TDNA (4-c). La aparicin de un nmero impar
de bandas indica que en un mismo sitio se
insertaron mltiples copias, ocurrieron
rearreglos o se produjo el truncado del TDNA. Si se digiere la muestra con una enzima
de restriccin que posee un sitio nico de
corte entre el gen marcador y el gen de inters y utilizando como sonda el gen marca-
dor, se obtendr una sola banda por cada

insercin independiente (4-d). Si la membrana se hibrida con el gen de inters (4-e) aparecer un patrn que tendr el mismo nmero de bandas que el anterior. La ausencia
de una banda es indicativo de la insercin de
una copia truncada de uno de los genes por
lo que se pierde el sitio de corte. La aparicin
de una banda del tamao del T-DNA puede
indicar la presencia de repeticiones en
tandem. Para estimar el nmero de copias
del transgen en un locus transgnico, se deben utilizar enzimas de restriccin con sitios
flanqueantes del transgen y como sonda, el
transgen. Se observar una sola banda del
tamao del transgen; sin embargo, la intensidad de la seal variar entre las distintas
plantas analizadas de acuerdo con el nmero de copias del mismo (4-f). Para realizar la
comparacin es necesario utilizar simultneamente estndares conteniendo un nmero
conocido de copias del transgen. Esta determinacin no es del todo precisa ya que existe mucha variabilidad en los resultados debido a diferencias en la digestin de las muestras y a la degradacin que sufre el ADN.
En lo que respecta a la cuantificacin, esta
tcnica ha sido reemplazada en gran medida, en los ltimos aos, por la PCR en tiempo real o real time PCR, antes mencionada, dado que esta ltima resulta menos costosa en reactivos y tiempo y requiere menos
cantidad de material vegetal para realizar el
anlisis.
- Anlisis de ARN: Las tcnicas de RTPCR (transcripcin reversa seguida de PCR)
con la hidridacin de ARN o Northern
blotting pueden resultar valiosas herramientas para detectar los transcriptos de inters
presentes en la muestra. La RT-PCR presenta algunas ventajas frente al Northern
blotting: se requiere poca cantidad de material, posee una alta sensibilidad y la muestra
es de fcil preparacin. Por otra parte, la hibridacin del ARN utiliza como sonda el
transgen, ofrece informacin sobre el tamao del transcripto y permite su cuantificacin.
- ELISA y Western blotting: aquellas
plantas que poseen la secuencia de inters y
la expresan como transcripto, pueden ser
analizadas con estas tcnicas inmunolgicas
a fin de determinar la presencia de la protena codificada por el transgen.
La actividad de la protena debe ser medida, sea por ensayos bioqumicos o por
bioensayos, a fin de interpretar correctamente el fenotipo de la planta obtenida. Adems, es conveniente confirmar la estabilidad
meitica de los transgenes estudiando su
transmisin sexual a la generacin siguiente.
Estas tcnicas se encuentran descriptas
detalladamente en la seccin II.3 y su aplicacin para el anlisis de plantas transgnicas
en Register (1997) y en Bhat y Srinivasan
(2002).
Finalmente, el comportamiento de los
individuos transgnicos se estudia en laboratorio, invernculo y campo. Cabe aclarar que
para realizar experimentos de invernculo y
de campo es necesario contar con autorizacin de la Comisin Nacional Asesora de
Biotecnologa Agropecuaria (CONABIA) (ver
IX.-3).
3 Aporte de la transformacin gentica a
la variabilidad gentica
Como ya se mencion, la transformacin
gentica permite introducir variabilidad
gentica novedosa en las diferentes especies
vegetales. Analizando con ms detalle este
concepto podemos considerar que este aporte puede ser realizado de diferentes maneras. As, este puede consistir en:
a) La expresin de secuencias codificantes
no existentes en la especie (ejemplo: protenas insecticidas de origen bacteriano).
b)La expresin de nuevas formas allicas
de genes que ya estn presentes en el
genoma (ejemplo: tolerancia al glifosato en
soja).
c) La expresin de secuencias codificantes
presentes en el genoma pero bajo el control
de nuevas secuencias regulatorias que modifican su nivel o patrn de expresin (ejemplo: protenas relacionadas a la patognesis).
d)La inhibicin de la expresin de genes
residentes en el genoma .
Para lograr la inhibicin de la expresin
gnica se pueden usar diferentes tcnicas:
cosupresin, antisentido y la denominada
interferencia del ARN. Todas ellas se basan
en un proceso denominado silenciamiento
gnico post-transcripcional. Este involucra la
degradacin del ARN mensajero producido
119
por un gen determinado. La cosupresin

consiste en la obtencin de plantas
transgnicas que expresan un transgen homlogo del gen residente que se desea silenciar. La tcnica del ARN antisentido
involucra la sntesis de molculas de ARN que
son complementarias al ARNm producido
por la transcripcin del gen que se quiere silenciar. El transgen consta de la secuencia
codificante del gen cuya expresin se desea
alterar pero con la orientacin invertida,
cuando esta secuencia se transcribe genera
ARN que hibrida con el ARNm formando una
hebra doble que bloquea la traduccin. Como
resultado de este mecanismo las clulas
transformadas producirn poco o ningn
producto proteico. Esta tcnica ha sido utilizada para obtener variedad de tomates
(FlavrSavr) la que mantiene su firmeza durante mas tiempo luego de la cosecha debido a que la enzima responsable de la rotura
de la pared celular, la polygalacturonidasa, se
expresa en un 10% del nivel normal. La interferencia del ARN es parte de un mecanismo regulatorio natural de la expresin
gnica que es actualmente muy estudiado y
es la metodologa ms eficiente, y por ello la
ms utilizada, para silenciar genes en plantas. La tcnica se basa en la construccin de
transgenes cuyo producto final es un ARN.
Este contiene parte de la secuencia
transcripta del gen a silenciar en forma de
repeticin invertida. Como consecuencia de
esta estructura , cuando este tipo de
transgen se transcribe en la planta se genera un ARN de doble cadena que dispara el
mecanismo de degradacin dependiente de
la secuencia antes mencionado (Agrawal et
al., 2003). El uso de una secuencia espaciadora
entre las repeticiones confiere a las construcciones mayor estabilidad durante las manipulaciones en bacterias. Este tipo de construcciones se denominan ARN hairpin.
Adems, se observ que el uso de un intrn
como secuencia espaciadora, produce un
silenciamiento ms eficiente en la planta. Esta
metodologa es una herramienta muy valiosa para los proyectos de genmica funcional
para poner en evidencia la funcin de genes
clonados mediante su inactivacin. Otra posibilidad es utilizarla para la obtencin de
plantas transgnicas mejoradas mediante la
inactivacin de genes endgenos cuya expre-
120
sin es indeseada (Kusaba, 2004). Una interesante aplicacin de inters agronmico de

esta tecnologa fue la obtencin de plantas
transgnicas de caf que no contienen
cafena.
4 Obtencin de plantas transplastmicas
Las clulas vegetales contienen tres
genomas: el nuclear, el plastdico y el
mitocondrial. Los mtodos presentados en
las secciones precedentes tienen como blanco de transformacin al genoma nuclear. Sin
embargo, en los ltimos aos la obtencin
de plantas transplastmicas ha recibido notable atencin (Maliga, 2002). As, el genoma
de los plstidos (plastoma) se ha convertido
en un blanco atractivo para la ingeniera
gentica ya que esta tecnologa ofrece una
serie de ventajas sobre la transformacin del
genoma nuclear:
1. Se pueden obtener altos niveles de
expresin de los transgenes y elevados niveles de acumulacin de las protenas codificadas por ellos (hasta el 47% de las protenas
solubles totales). Cabe notar que el nivel de
acumulacin observado a partir de transgenes
nucleares es generalmente inferior al 1%.
2. Es posible expresar un transgen
opern con varias secuencias codificantes
bajo el control de un mismo promotor.
3. No se observa efecto de posicin debido a que la integracin del transgen est
dirigida a un sitio particular del plastoma. Esto
hace que no sea necesario obtener una gran
poblacin de transformantes, a diferencia de
lo que actualmente ocurre con las plantas
transgnicas nucleares.
4. No se observa silenciamiento de
transgenes.
5. Para las especies que tienen transmisin materna de los plstidos (la mayora).
Se minimiza la dispersin de los transgenes
por el polen debido a la ausencia de transmisin de los plstidos por el mismo.
6. A pesar de la naturaleza eminentemente procariota del sistema gentico de los
plstidos, se ha demostrado que estas
organelas pueden procesar protenas
eucariotas permitiendo su correcto plegamiento y la formacin de puentes disulfuro
gracias a la presencia de protenas
chaperonas
endgenos.
sistemas
enzimticos
Los protocolos existentes para la obtencin de plantas transplastmicas se basan en

la transferencia de genes por el mtodo
biolstico, un eficiente proceso de cultivo y
seleccin in vitro, y la utilizacin de vectores
con secuencias homlogas al genoma del
cloroplasto. A diferencia de lo que ocurre en
la transformacin del genoma nuclear, la integracin dirigida de los transgenes en el
plastoma se realiza mediante recombinacin
homloga. Para lograr esto, los vectores contienen los transgenes de inters flanqueados
por secuencias con alta homologa al ADN
plastdico. La homologa entre el ADN del
vector y del ADN del cloroplasto determina
la potencialidad del plsmido para ser utilizado en la transformacin gentica del
plastoma. En este contexto, la existencia de
secuencias altamente conservadas en el
plastoma de varias especies es explotada para
el diseo de vectores universales, potencialmente tiles en la transformacin de los
cloroplastos de numerosas especies. La expresin exclusivamente plastdica de los
transgenes queda asegurada a travs de la
utilizacin de promotores especficos del
cloroplasto, cuya transcripcin tiene caractersticas tpicamente procariticas.
5 Importancia y aplicaciones de las
plantas transgnicas
Las primeras plantas transgnicas experimentales fueron obtenidas a mediados de
los aos 80. La disponibilidad de esta tecnologa permiti importantes avances en el rea
del conocimiento de la biologa vegetal. Por
otra parte, se constituy en una herramienta disponible para el mejoramiento gentico
vegetal (ver aspectos para esta aplicacin en
Birch, 1997) y el gran esfuerzo realizado en
este sentido tuvo como consecuencia la llegada al mercado, a partir de 1995, de los primeros cultivares transgnicos. Es destacable
la rpida adopcin que tuvieron estos productos. As en el 2002 se cultivaron en el
mundo 58,7 millones de hectreas con plantas transgnicas. El 99% de este rea global
se cultiv en 4 pases (USA, Argentina, Canad y China) mientras que el 1% restante se
distribuy en 12 pases. Esta superficie estuvo ocupada prcticamente por 4 cultivos: soja
(62%), maz (21%), algodn (12%) y canola
(5%). Los caracteres modificados que presentaron estos cultivos fueron resistencia a herbicidas (75%), resistencia a insectos (17%) o
una combinacin de ambos (8%). En la Argentina los eventos con autorizacin de
comercializacin son los siguientes: soja (tolerancia a glifosato), maz (resistencia a
lepidpteros, tolerancia a glufosinato de
amonio) y algodn (resistencia a
lepidpteros, tolerancia a glifosato). La
CONABIA (ver en la pgina de la Secretara
de Agricultura, Ganadera, Pesca y Alimentos,
Repblica
Argentina;
http://
www.sagpya.mecon.gov.ar/), ha autorizado
desde el ao 1991, 520 solicitudes para liberaciones a campo, en distintas especies y con
diferentes eventos de transformacin.
Los cultivos transgnicos actuales corresponden a lo que se denomina la primera
generacin que tiene por objetivo el aumento de la productividad de los cultivos, la reduccin en el uso de agroqumicos, la conservacin de la tierra arable, el agua y la energa, la reduccin de la contaminacin del
ambiente y los beneficios para la salud humana derivados de estos aspectos. Se considera que la segunda generacin de cultivos
transgnicos tendr ms beneficios directos
para los consumidores. Estos comprenden el
mejoramiento de la calidad nutricional (protenas, aceite, vitaminas y minerales), la eliminacin de alergenos, la fitoremediacin (es
decir la recuperacin de ambientes contaminados mediante el uso de plantas) y la utilizacin de plantas como bioreactores para la
expresin de protenas recombinantes con
fines tales como la produccin de vacunas
comestibles, anticuerpos y otras protenas de
uso teraputico o industrial. Esta aplicacin
se conoce como molecular farming (produccin de molculas en la granja) y presenta numerosas ventajas para la produccin en
gran escala de estas protenas en particular
en lo que respecta a costos, practicidad y seguridad. Sin embargo an quedan algunos
aspectos que limitan su potencial como
biorreactores como son la calidad y homogeneidad del producto final. En los ltimos
10 aos, se han desarrollado varios sistemas
de expresin basados en plantas y en la ac-
121
tualidad se producen ms de 100 protenas

recombinantes en diferentes especies vegetales, generndose un estrecho vnculo entre la agricultura y muchas ramas de la industria. Un ejemplo destacable es el arroz dorado, llamado as por la pigmentacin amarilla que tienen sus granos debido a que acumula altos niveles de provitamina A en el
endosperma. La tercera generacin de cultivos transgnicos se basar en la informacin producida por los proyectos genmicos
y tendr por objeto aspectos tales como la
modificacin de la arquitectura de la planta,
la manipulacin de la floracin, el mejoramiento de la eficiencia fotosinttica, la manipulacin de la heterosis y la apomixis, etc.
6 Perspectivas
La continuidad en el desarrollo de tecnologa de transferencia de genes en plantas
es importante tanto para ampliar el rango
de especies a transformar como el de
genotipos dentro de cada especie. En los ltimos aos se nota un creciente inters en el
control del nivel de expresin de transgenes
as como de su regulacin espacial y temporal. La expresin de los genes nucleares
eucariticos est controlada en varios niveles que involucran la transcripcin propiamente dicha, el procesamiento, transporte y estabilidad de los transcriptos y su
traducibilidad, as como la estabilidad, modificacin y compartimentalizacin del producto proteico final. Por otra parte, es necesario
aprovechar la experiencia acumulada en cuanto a la expresin de transgenes, de modo
de disear protocolos de transferencia que
minimicen las posibilidades de silenciamiento
gnico. En este contexto, est recibiendo
notable atencin el estudio de la
recombinacin homloga como mecanismo
para la transformacin del genoma nuclear
(ver revisin de Hanin y Paszkowski, 2003).
Del anlisis comparativo de mtodos presentado cabe destacar dos aspectos actualmente en desarrollo. Por un lado, contina
el inters en extender el uso de la transformacin mediada por A. tumefaciens a especies que no son hospedantes naturales de la
bacteria. Por otro lado, como fuera anteriormente mencionado, los mtodos de transformacin gentica actualmente en uso re-
122
quieren de genotipos con una excelente respuesta al cultivo in vitro, lo cual resulta en
una clara limitacin cuando se desea aplicar
esta tecnologa a los materiales usados por
los mejoradores, los que generalmente no
poseen esta caracterstica. Por ello, se est
tratando de reducir y si es posible evitar la
fase de cultivo in vitro durante el proceso de
transformacin, lo que permitir ampliar el
rango de genotipos a los cuales se podr
aplicar esta moderna tecnologa. As, se desarroll un mtodo eficiente y reproducible
de transformacin in planta para
Arabidopsis thaliana. Este consiste en infiltrar con vaco plantas adultas de esta especie, con una suspensin de A. tumefaciens
de modo que los tejidos y rganos
reproductivos sean invadidos por la bacteria.
Posteriormente se propuso una simplificacin
de este mtodo que consiste en reemplazar
el tratamiento de vaco y sumergir la
inflorescencia en una suspensin bacteriana
que incluye un surfactante. Las plantas
transgnicas que se obtienen por
autofecundacin de las plantas as transformadas, son hemicigotas y se demostr que
esta metodologa produce la transformacin
de la gameta femenina.
El logro de determinados objetivos como
puede ser el redireccionamiento de una ruta
metablica o la modificacin de un carcter
complejo de inters agronmico como por
ejemplo la resistencia durable a enfermedades fngicas, requiere de la integracin de
mltiples transgenes y de la expresin coordinada de los mismos en la planta
transgnica. Este tema est recibiendo notable atencin (ver revisin de Franois y col.,
2002).
Los mtodos de transformacin que hemos descripto se basan en la utilizacin de
genes marcadores seleccionables. Sin embargo, hay razones por las cuales la presencia
del marcador no es deseable en plantas
transgnicas que se liberan al ambiente. Hay
un manifiesto rechazo por parte del pblico
con respecto a la utilizacin de genes de resistencia antibiticos y en determinadas situaciones, el uso de genes de resistencia a
herbicidas puede ser inconveniente. Por otra
parte, desde un punto de vista experimental puede ser necesario transformar una misma planta varias veces con distintos trans-
genes y con la metodologa convencional no

hay ms que un nmero limitado de genes
marcadores disponibles. Por ello se consideran estrategias alternativas para la obtencin
de plantas transgnicas libres de marcadores (Puchta, 2003). La estrategia que ha recibido ms esfuerzo hasta ahora, plantea la
remocin va cruzamiento sexual del marcador seleccionable luego de haber obtenido
la planta transgnica. Una posibilidad para
ello es cotransformar, esto implica que el
transgen de inters y el marcador seleccionable estn presentes en vectores distintos
y que posteriormente se separen los genes
por segregacin luego de la reproduccin
sexual. Sin embargo, esta puede ser una alternativa poco atractiva en circunstancias
particulares como cuando no se dispone de
un protocolo eficiente de cotransfor-macin
o cuando no se desea reproducir sexualmente
la planta transgnica. Otra opcin dentro de
esta lnea es la utilizacin del sistema de
recombinacin sitio-especfica de origen viral
Cre/lox. Ms recientemente se ha propuesto como estrategia alternativa el desarrollo
de mtodos de transformacin que no usen
marcadores seleccionables. La idea subyacente es incrementar la frecuencia de transformacin a travs del uso de genes que promuevan la regeneracin.
Finalmente, las plantas transgnicas actualmente cultivadas comercialmente, en su
mayora resistentes a herbicidas nos permiten ganar experiencia y acumular el conocimiento necesario para desarrollar nuevas y
mejores generaciones de productos.
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123
III.-Captulo 4
Polinizacin y fertilizacin in vitro.
Picca, Aurora; Cardone, Susana
1 Introduccin
Muchas plantas con flores producen menos frutos maduros que flores, y los frutos, a
su vez, generan menos semillas que el nmero de vulos disponibles para la fecundacin.
Considerando que la produccin de polen no
es el factor limitante, existen diferentes razones que explican esta situacin. En ocasiones, a pesar de la ocurrencia de la polinizacin, la fecundacin no puede llevarse a cabo.
Otras veces, la fecundacin ocurre normalmente pero el embrin aborta en forma precoz. En cualquiera de estas circunstancias, las
tcnicas de cultivo in vitro y manipulacin de
clulas aisladas son apropiadas para lograr el
proceso completo de desarrollo del embrin
y del endosperma y la obtencin de semillas
normales.
En este captulo se utilizarn indistintamente los trminos fecundacin y fertilizacin como sinnimos, refirindose a la
unin de las gametas masculina y femenina
para originar un nuevo individuo.
La tcnica de fertilizacin o polinizacin
ovular in vitro fue desarrollada por Kanta
et al. en 1962, quienes demostraron que en
algunas especies de papaverceas los granos
de polen tenan la capacidad de germinar in
vitro directamente sobre los vulos en cultivo. En estas condiciones el tubo polnico alcanzaba el saco embrionario para concretar
la fertilizacin, con la consiguiente formacin
de semilla normal en el mismo medio de cultivo. Esta tcnica desarrollada en Papaver
somniferum, ha sido luego empleada en varias especies de plantas como Dianthus
caryophyllus, Nicotiana tabacum, N. rustica,
Argemone mexicana, Eschechlozia
californica, Petunia violacea, Antirrhinum
majus y Dicranostigma franchetianum.
Bajo el nombre de polinizacin in vitro
se suele englobar a varias tcnicas que si bien
poseen puntos en comn, difieren en otros.
Entre ellas se pueden citar la polinizacin in
vitro de vulos, la polinizacin placental
in vitro y la polinizacin estigmtica in

vitro. En todos los casos la gameta femenina es fecundada por clulas espermticas liberadas por el tubo polnico, en forma casi
idntica a la va natural.
El trmino fertilizacin in vitro se utiliza para aquellos casos donde la fusin de
las gametas aisladas se logra por distintos
mtodos como electrofusin, alta concentracin de calcio o elevado pH.
A veces la fertilizacin ocurre normalmente, pero el embrin no puede alcanzar la
madurez debido a una ruptura del equilibrio
entre el mismo y el endosperma o por anomalas en el desarrollo embrionario que impiden una nutricin normal. Esto es lo que
se conoce como barreras posfertilizacin o
poscigticas, que pueden contrarrestarse
con el rescate de los embriones y su posterior crecimiento en un medio nutritivo adecuado.
2 Fertilizacin in vitro
Durante aos, los cientficos utilizaron
tcnicas de fertilizacin in vitro de gametas
aisladas tanto en animales como en plantas
inferiores. Sin embargo, estos mtodos no
pudieron ser aplicados a las plantas superiores hasta comienzos de la dcada de los noventa. Esto se debi a que la fertilizacin in
vitro de las gametas aisladas de plantas superiores es un proceso muy diferente al que
ocurre in vivo, y tambin lo es de los sistemas animales y de las plantas inferiores, donde las gametas son de vida libre.
El hecho ms notable de la fertilizacin
in vivo de las angiospermas es el de la doble fecundacin, que es un proceso muy
complejo en comparacin con lo que acontece en todos los dems seres vivos. Esto
ocurre en el saco embrionario, que se halla
profusamente cubierto por el tejido materno. Los ncleos espermticos se encuentran
dentro de los granos de polen o tubos
polnicos. Durante la fertilizacin, el tubo
polnico llega hasta el aparato ovular, desorganizndose entonces el ncleo vegetativo.
Las dos clulas espermticas contenidas en
el tubo, se vuelcan en una de las sinrgidas,
la misma se desorganiza y uno de los ncleos
espermticos se fusiona con la osfera para
dar el cigoto, que luego producir el embrin.
125
la clula espermtica con la ovoclula, dando

como resultado un cigoto, un embrin y finalmente una planta madura.
Estudios posteriores (1998,1999) posibilitaron el desarrollo de endosperma in vitro
de maz a partir de la fusin por pares de
clulas espermticas y nOsfera en fusin con uno de
cleos secundarios aislados.
los gametos
La fusin del ncleo de la clula espermtica puede ocurrir con uno de los dos nNcleos polares
cleos polares o con los nSaco embrionario
recibiendo al segundo cleos secundarios y se comSaco embrionario
gameto
pleta aproximadamente dos
horas despus de la fusin in
Sinrgida que
vitro de las clulas. Los esturecibi el extremo
dios in vitro sobre los primedel tubo polnico
ros eventos despus de la
fusin de las clulas y ncleos
indicaron que las primeras
clulas del endosperma resultante desarrollan un tejiTubo polnico
polnico
Tubo
do caracterstico capaz de
autoorganizarse en forma
Figura 1: Corte longitudinal de un vulo mostrando la doble fecundacin
en angiospermas.
separada del tejido materno.
meninas y masculinas sino que deben ser inducidas a fusionarse en ausencia de las clu- 2.1 Aislamiento y seleccin de las
las asociadas. Las tcnicas de micromani- gametas
pulacin desarrolladas durante los aos 80
Se han desarrollado mtodos de aislapermitieron el aislamiento y la fusin in vitro
de gametas femeninas y masculinas de miento y seleccin de gametas para una
angiospermas. La combinacin de estas tc- amplia variedad de especies vegetales entre
nicas con mtodos de cultivo de clulas ni- ellas maz (Zea mays), trigo (Triticum
cas posibilitaron la fertilizacin in vitro. Se aestivum), cebada (Hordeum vulgare),
pudo concretar de esta manera el desarrollo raygrass (Lolium perenne) y algunas
de cigotos y de endospermas en forma indi- brasicceas.
Los pasos a seguir son los siguientes:
vidual in vitro, lo cual demuestra que cigotos
a) Conocer exhaustivamente la morfoloy endosperma son capaces de autoorganizarse en cultivo, independientemente del ga floral de la especie a utilizar con el objetitejido materno. Tanto los cigotos obtenidos vo de ubicar el saco embrionario y sus clulas
in vitro como los que son aislados despus constituyentes.
b)Aislar las gametas masculinas a partir
de la polinizacin in vivo desarrollan embriones normales y posteriormente plantas fr- de los granos de polen mediante choque
osmtico y/o de pH.
tiles en cultivo.
c) Aislar el saco embrionario y las gametas
En 1989 se fusionaron por primera vez
gametas aisladas de maz in vitro (Zea mays). femeninas mediante microdiseccin individual
Llev tres aos ms regenerar plantas en asociacin con maceracin enzimtica.
hbridas frtiles, va embriognesis cigtica, a Este paso es crtico y limitante ya que puepartir de esos cigotos cultivados individual- den obtenerse pocas gametas femeninas y
mente. Actualmente puede reproducirse in el proceso de manipulacin es muy delicado.
vitro el ciclo completo de vida de una planta El tratamiento de las espigas no polinizadas
superior, comenzando con la electrofusin de con 2,4-D, que induce a la expansin del ova-
El otro ncleo masculino se reunir con dos

ncleos femeninos secundarios para dar la
clula madre del endosperma triploide (Fig.
1).
Para que la fertilizacin tenga lugar in
vitro no slo deben aislarse las gametas fe-
126
PICCA, Aurora; CARDONE, Susana
Figura 2: Fertilizacin in vitro mediante

electrofusin.
rio, facilita el proceso, resultando en ovarios
ms grandes y vulos ms blandos, incrementando la eficiencia en el aislamiento de
las ovoclulas.
Fertilizacin in vitro propiamente dicha.
Esta puede ser realizada mediante la
microinyeccin de clulas espermticas o ncleos espermticos aislados en clulas individuales obtenidas de los sacos embrionarios
o por electrofusin (Fig. 2). En este ltimo
caso las gametas se ponen en contacto en
una cmara de electrofusin por alineacin
dielectrofortica y se fusionan mediante pulsos elctricos. Los productos de fusin pueden ser entonces cultivados en una solucin
con clulas nodrizas y algunos de ellos desarrollarn en proembriones.
2.2 Fusin de las gametas
Muchos de estos estudios, algunos de los
cuales datan de 1994, fueron realizados en
maz, donde las gametas masculinas se obtienen a partir de granos de polen fresco
sometidos a un shock de pH en una solucin
0,5 M de manitol. Las ovoclulas y los
protoplastos de las clulas centrales se aislan
de vulos por tratamiento con enzimas

celulolticas y microdiseccin manual. Las
gametas femeninas y masculinas aisladas se
colocan de a pares, bajo condiciones de esterilidad, en un medio de fusin simple compuesto por manitol y cloruro de calcio (CaCl2).
El uso de microagujas de vidrio permite poner en contacto las gametas femeninas y
masculinas a fin de facilitar y dirigir la fusin.
La adhesin y posterior fusin de las gametas
es rpida (aproximadamente 10 segundos).
A los 20 minutos de realizada la fusin, deja
de visualizarse el ncleo masculino y 20 horas
despus es posible visualizar mediante contraste de fases la presencia de dos ncleos,
de manera similar a lo que se observa in vivo.
En 1995 se logr la fertilizacin exitosa de
trigo a travs de la electrofusin de
ovoclulas con clulas espermticas. En promedio, la frecuencia de fusin suele ser del
30%, pero bajo condiciones ptimas es posible alcanzar frecuencias superiores al 55%. Dos
das despus de la fusin elctrica aproximadamente el 60% de los productos de fusin
comenz a dividirse y cerca del 90% de ellos
form estructuras multicelulares y en unos
pocos casos microcallos.
Pese a que se ha tomado al maz (Zea
mays L) como sistema vegetal modelo en el
cual estudiar los procesos de fusin de
gametas y posterior embriognesis, tambin
se han realizado trabajos exitosos de fusin
de gametas en trigo (Triticum aestivum L.)
obteniendo como resultado estructuras
multicelulares y en algunos casos del tipo de
microcallos.
Los recientes progresos relacionados a los
sistemas de fertilizacin in vitro as como los
proyectos de genmica posibilitarn una
mejor comprensin de los procesos de reconocimiento gamtico, fusin, seales
intracelulares, eventos tempranos de activacin del huevo y formacin del cigoto.
3 Polinizacin in vitro
En muchos casos el polen no puede germinar sobre el estigma de la propia flor aunque ste se halle receptivo. Este hecho puede deberse a barreras genticas o fisiolgicas. Algunas de estas barreras de
prefertilizacin o precigticas se deben a:
127
a) la incapacidad del polen de germinar

en estigmas extraos
b)la incapacidad del tubo polnico para alcanzar el vulo debido a una lenta velocidad
de crecimiento o a una excesiva longitud del
estilo. En estos casos, el ovario aborta antes
de que el tubo polnico alcance la base del estilo o sin que la alcance en absoluto
c) el hecho que el tubo polnico se deshaga en el estilo.
La polinizacin in vitro de vulos con el
desarrollo posterior de embriones ha sido
exitosa en 14 familias de Angiospermas, resultando ms adecuada su aplicacin en aquellas especies que poseen ovarios grandes y
que contienen muchos vulos. No obstante,
con el tiempo se desarrollaron varias tcnicas de polinizacin in vitro ms sofisticadas
ampliando con esto las posibilidades de aplicacin. Entre estas tcnicas se encuentran:
- La polinizacin estigmtica, que consiste en cultivar el pistilo in vitro y colocar el
polen sobre el estigma.
- La polinizacin placental, donde los
vulos se ponen en contacto con el polen a
travs de un corte en la parte superior del
ovario o quedan directamente expuestos por
remocin de la pared del ovario.
- La polinizacin de vulos aislados que
se cultivan directamente sobre el medio de
cultivo.
- El injerto del estilo, en el cual los granos de polen germinan en un estilo compatible y luego se los une al ovario de la planta
madre que se desea fertilizar.
Es de esperar que en todos estos casos el
polen germine en pocas horas, y que despus
de la polinizacin, tenga lugar la fertilizacin.
En la polinizacin placental in vitro los
porcentajes de supervivencia son muy buenos, ya que los vulos no resultan daados
durante las manipulaciones involucradas en
su aislamiento. El cultivo junto con la placenta
incrementa, en general, las posibilidades de
un rpido desarrollo embrionario. El cultivo
de vulos aislados (separados de su placenta)
es un procedimiento mucho ms complicado y que ha sido empleado con xito slo en
pocas especies de plantas.
Para que las tcnicas sean exitosas es
128
crucial realizar el aislamiento de los vulos y

del polen en el estado fisiolgico adecuado,
por lo que es indispensable realizar un estudio de la duracin de los distintos estadios
del desarrollo de ambos. Este estudio consiste en:
a) Determinar los tiempos de antesis, dehiscencia de las anteras y polinizacin.
b)Precisar el momento en que el estigma
est receptivo
c) Especificar el momento adecuado para
la polinizacin.
d)Establecer el tiempo adecuado para
recoger el polen.
Experimentalmente se intent la polinizacin in vitro de vulos de varias especies
de angiospermas con polen proveniente de
varias especies de gimnospermas. El anlisis
embriolgico de los vulos de Melandrium
album, fijados tres das despus de la polinizacin con polen de Pinus wallihiana, revel
la presencia de remanentes de tubos
polnicos y embriones de 2-clulas en los sacos embrionarios.
4 Cultivo de vulos y embriones in vitro
El cultivo de vulos es un procedimiento
muy complejo debido a que la manipulacin
del material es difcil. El vulo es una estructura delicada, muy pequea, altamente
hidratada, que puede ser daada con suma
facilidad. Es imprescindible realizar la
microciruga con rapidez para evitar que los
tejidos sufran desecacin durante el proceso. Pese a las dificultades de la tcnica, en
algunos cruzamientos interespecficos como
los realizados en papa, algodn y Hevea
brasiliensis, se comprob que el cultivo de
vulos completos es ms exitoso para el rescate de embriones que el cultivo de los embriones aislados.
El rescate de embriones consiste en aislar
los embriones de los vulos de una planta y
cultivarlos en un medio estril que contenga
los nutrientes esenciales que les permita concluir su desarrollo normal y germinar. Esta
tcnica es relativamente fcil de llevar a cabo
en embriones maduros y sus posibilidades de
xito son muy buenas. Las dificultades
incrementan cuanto ms inmaduro sea el
embrin a rescatar, ya que los requerimientos nutricionales son ms especficos en las

etapas tempranas de desarrollo del embrin.
El cultivo de vulos y de embriones vegetales se emplea en mejoramiento vegetal
cuando se desea:
- sortear algunas de las barreras de
autoincompatibilidad
- rescatar embriones abortivos derivados
de la hibridacin interespecfica o
intergenrica
- superar problemas de abscisin precoz
del fruto
- recuperar embriones de cruzas
interespecficas que conducen a la obtencin
de haploides
- acortar el perodo de latencia que ocurre en algunas semillas por presentarse
inhibidores del desarrollo del embrin, en el
endosperma o en la cubierta de la misma.
El cultivo de embriones ha ayudado tambin al mejoramiento gentico de especies
leosas que tienen dificultad en la
germinacin de sus semillas como en Taxus
mairei o con escasa produccin de semillas
como es el caso de Pseudotsuga macrolepis
y constituye una herramienta interesante en
estudios bsicos de biologa reproductiva ya
que permite analizar la embriognesis in
vitro.
4.1 Factores externos que condicionan el
cultivo de vulos y de embriones
Entre los factores externos ms importantes que afectan el cultivo de vulos y de embriones se citan el medio de cultivo, la
osmolaridad y los reguladores de crecimiento.
El vulo presenta una gran cantidad de
requerimientos nutricionales, que varan con
el estadio de desarrollo del mismo y que es
necesario identificar para cada especie en
particular. Es importante adems obtener un
medio de cultivo adecuado para favorecer la
germinacin de los granos de polen y permitir el desarrollo de los vulos fertilizados hasta semillas maduras. En general, todos los
medios de cultivo para germinacin de los
granos de polen poseen altas concentraciones de sacarosa y de cido brico.
Un aspecto fundamental a tener en cuen-
ta en el rescate de embriones es la seleccin

correcta de un medio de cultivo que pueda
soportar los cambios progresivos de requerimientos durante las distintas etapas del desarrollo embrionario. Se pueden reconocer
dos fases en el desarrollo embrionario con
respecto a la nutricin: la fase heterotrfica
en la que el embrin es dependiente del
endosperma y dems tejidos maternos que
lo rodean, y la fase autotrfica, en la cual el
embrin es capaz de sintetizar las sustancias
requeridas para su crecimiento a partir de
sales minerales y azcares. La etapa crtica de
pasaje de una fase a otra vara con las especies. Este cambio de requerimientos
nutricionales hace que, cuando crecen in
vitro, sea imprescindible la transferencia de
los embriones de un medio de cultivo a otro
para garantizar un ptimo crecimiento. Entre los medios de cultivo ms difundidos podemos citar el de Murashige & Skoog,
Monnier, Randolph & Cox, Gamborg, Liu y
col., etctera.
El agua de coco y los extractos de
endospermas han sido muy tiles, activando
el crecimiento y desarrollo de los embriones
en el cultivo de vulos de algunas especies
vegetales.
No existe demasiada evidencia acerca de
la absoluta necesidad de los reguladores de
crecimiento para el desarrollo de los embriones extrados, sean inmaduros o maduros,
fuera de su rol en la ruptura de la dormicin.
La concentracin osmtica es un factor
importante en el desarrollo de vulos y embriones, dependiendo del estado de madurez de los mismos. La sacarosa presente en
los medios de cultivo no slo provee la fuente de carbono necesaria para el crecimiento
sino que adems mantiene la osmolaridad
requerida para cada etapa del desarrollo. Est
demostrado que una presin osmtica elevada previene la germinacin precoz de los
embriones inmaduros, evitando as la ocurrencia de malformaciones estructurales. A
medida que van creciendo, los embriones
necesitan ser transferidos a medios con progresivas disminuciones en los niveles de sacarosa.
Los embriones de la mayora de las especies presentan un buen crecimiento en un
rango de temperaturas que va de los 25C a
los 30C. Aunque algunos estudios indican
129
que la luz no es crtica para el crecimiento de

los embriones, se demostr que en el caso
de la cebada la luz disminuye las probabilidades de germinacin precoz en los embriones
inmaduros.
5 Aplicaciones
La polinizacin placental in vitro puede
ser empleada para superar las barreras de
autoincompatibilidad e incompatibilidad cruzada. Los granos de polen de plantas
autoincompatibles son capaces de germinar
directamente sobre los vulos y llevar a cabo
el proceso completo de la reproduccin
sexual. En algunas combinaciones de cruzamientos, la polinizacin directa de los vulos
permite que se superen las barreras de incompatibilidad precigtica, obtenindose
embriones hbridos y aun plantas hbridas
imposibles de obtener mediante tcnicas
convencionales, como es el caso de Zea mays
x Z. mexicana, Nicotiana tabacum x N.
amplexicaulis, Melandrium album x Viscaria
vulgaris, M. Album x Silene schafta, etc. En
aquellos cruzamientos en los que la barrera
de incompatibilidad se encuentra a nivel del
ovario como en Trifolium repens x T.
hybridum, es necesario rescatar los vulos
recin fecundados.
La polinizacin placental in vitro tambin se emplea como va para la obtencin
de plantas resistentes a estreses ambientales, ya que permite seleccionar para la fecundacin aquellos granos de polen que tuvieron capacidad de germinar bajo diferentes
condiciones de estrs. La polinizacin in vitro
con polen obtenido de plantas de maz creciendo a temperaturas elevadas condujo a
la obtencin de plantas tolerantes a estrs
por calor. En Brassica rapa, la seleccin de
polen a baja temperatura tuvo un efecto
positivo en el crecimiento de la progenie en
condiciones de fro, logrando acumular ms
peso seco que en progenies normales. Se
podra entonces seleccionar para la fecundacin aquellos granos de polen que hayan sido
capaces de germinar bajo condiciones de
estreses ambientales, en este caso trmico,
acelerando as la obtencin de plantas resistentes.
Dentro de las aplicaciones del cultivo de
embriones est la del rescate de embriones
130
para la produccin de plantas haploides,

donde se cultivan embriones que se forman
por partenognesis o por eliminacin de
cromosomas luego de la hibridacin
interespecfica o intergenrica. Los embriones
haploides en algunos casos se distinguen
morfolgicamente de los normales, de manera que se extraen y se los cultiva in vitro
en medios y condiciones de cultivo adecuados (ver IV.-1). Otras veces es necesario esperar a obtener las plantas para determinar
el nivel de ploida. Esta tcnica se ha utilizado con xito en cebada, trigo y tabaco.
El cultivo de embriones se utiliza tambin en el caso de plantas que sufren el aborto de los mismos en estadios tempranos del
desarrollo debido a la incompatibilidad con
el endosperma, como en la produccin artificial del triticale. Precisamente fue en este caso
donde la tcnica de cultivo de embriones junto con la aplicacin de colchicina fueron de
fundamental importancia en la transformacin del triticale en cultivo comercial, para
superar el alto grado de incompatibilidad del
cruzamiento inicial y la marcada esterilidad
que posea la F1. El perfeccionamiento de
estas dos metodologas fue decisiva para la
produccin de un gran nmero de triticales
hexaploides y octoploides, cruzando el centeno con trigos duros y harineros, respectivamente, con un alto grado de fertilidad.
Tambin se emplea el cultivo de embriones en casos en que el endosperma no se
desarrolla normalmente, como sucede en los
cruzamientos de cultivares diploides y
tetraploides de Citrus, o cuando el mismo se
desintegra despus de la fecundacin, como
en Oenothera biennis x O. muricata o O.
biennis x O. lamarckiana. Esta tcnica tambin es de utilidad para sortear barreras de
dormicin o en casos donde la viabilidad de
la semilla es baja, como en yuca y otras especies del gnero Manihot.
El cultivo in vitro de embriones es una
alternativa para el intercambio de semilla a
travs de fronteras internacionales. En un
proyecto de mapeo de genes con resistencia
al virus del mosaico en yuca, desarrollado
entre CIAT (Centro Internacional de Agricultura Tropical, con sede en Colombia) y IITA
(Instituto Internacional de Agricultura Tropical, con sede en Nigeria) donde fue necesario trasladar stocks de semillas desde
Sudamrica al continente africano, el cultivo

de embriones result ser un excelente mtodo para transferir germoplasma con mnimos
riesgos fitosanitarios.
El cultivo de embriones inmaduros tambin puede ser aplicado como complemento del mejoramiento convencional, entre las
estrategias utilizadas para disminuir el tiempo necesario en la obtencin de un nuevo
cultivar. Por ejemplo en soja se requieren
unos diez aos para este fin. Si se consiguen
realizar varias generaciones por ao, en
contraestacin, se acelera el proceso. El cultivo de embriones inmaduros ahorrara adems el tiempo de maduracin de la semilla.
Cultivo de nucelas. Existen pocos
explantos que poseen la capacidad de producir callos embriognicos. Las inflorescencias
y los embriones inmaduros se utilizan para
este fin en los pastos y en los cereales, constituyendo excelentes herramientas para la
transformacin de plantas. En las plantas leosas los explantos de tejidos maduros pierden la capacidad de regeneracin, se ha inducido entonces con xito la embriognesis
somtica a partir de nucelas de vulos jvenes. Este es el caso de Citrus sp, Vitis
vinifera, Malus domesticus, Psidium
guajava y Pyrus serotina. En estas especies
tambin permiten acortar el perodo de
siembra a floracin.
Otro sistema que puede utilizarse en algunos experimentos bsicos es la obtencin
de un embrin a partir de cigotos
transgnicos o micromanipulados. Para ello
son importantes la fertilizacin in vitro de
gametas aisladas y el cultivo de los productos de fusin hasta la obtencin de una planta. Bajo esas condiciones el embrin no se
diferencia de los embriones obtenidos in
vivo. En maz tambin es posible cultivar los
cigotos fertilizados in vivo dentro de sacos
embrionarios parcialmente aislados.
5.1 El cultivo de vulos y embriones y la
embriognesis somtica para dilucidar
aspectos bsicos del desarrollo en
plantas
Las plantas parecen poseer un programa
embriognico especfico preestablecido que
puede dispararse en respuesta a condiciones
especficas. La embriognesis cigtica se dispara por la fertilizacin mientras que la
somtica lo hace a travs del cultivo de tejidos.

El estudio de los eventos moleculares que
tienen lugar durante la embriognesis temprana es actualmente uno de los campos
principales de la biologa vegetal. Los embriones somticos constituyen una excelente
herramienta para estudiar los procesos de
desarrollo en plantas, ya que facilitan el acceso a gran cantidad de embriones libres. En
su medio natural los embriones cigticos ofrecen dificultades debido a su pequeo tamao y al hecho de estar inmersos en el tejido
materno.
Los embriones vegetales son morfolgicamente simples pero molecularmente
complejos. A diferencia de lo que ocurre en
los embriones animales, donde los patrones
de expresin gnica se hacen ms complejos
a medida que progresa el desarrollo, en los
embriones vegetales se encontraron unos
20.000 ARN, nmero similar al encontrado
en rganos ms complejos como hojas, races, flores, anteras, etc., donde los ARN que
son especficos de un estadio determinado
constituyen una modesta fraccin del total,
representando, sin embargo, a un gran nmero de genes. En algodn, por ejemplo, el
10% de los ARN presentes en embriones en
la fase media de maduracin son nicos de
aquel estadio.
Muchos de estos genes especficos de
estadio han sido clonados como ADNc, pero
en general se trata de genes expresados
mayoritariamente, como aquellos de las
protenas de reserva de la semilla. Estos ADNc
resultaron ser marcadores tiles de la diferenciacin celular, como el gen inhibidor de
la tripsina de Kunitz, cuyo ARN se acumula
en el polo micropilar del embrin globular
(por donde penetra el ncleo espermtico al
saco embrionario) antes de que sea evidente la diferenciacin celular. La expresin de
este gen es uno de los primeros indicadores
moleculares de polaridad en la transicin del
embrin globular a uno de simetra bilateral
con forma de corazn.
Para estudiar el desarrollo en plantas, al
igual que en el caso de animales, se ha recurrido al uso de mutantes. El organismo modelo en este caso es Arabidopsis thaliana,
que es una planta de genoma pequeo y ci-
131
clo de vida muy corto, lo cual la hace apta

para estudios genticos. Se han detectado
dos tipos de mutantes, letales embrionarios
y con alteraciones en el patrn de desarrollo.
Calculando el nmero de mutantes letales embrionarios que se encontraron, algunos investigadores han concluido que existen unos 4.000 genes expresndose durante la embriognesis. En el punto superior de
esta compleja va se encuentran genes reguladores principales (master regulators) y
slo de 40 a 50 genes que afectan el patrn
embriognico.
Entre las mutaciones estudiadas se encuentran bio1, que es letal y detiene la
embriognesis en el estadio de corazn temprano. No es un gen regulador principal y sus
efectos se ven revertidos en presencia de
biotina. Otra mutacin es raspberry. Estos
mutantes quedan bloqueados en el estado
globular y poseen protuberancias en las clulas externas lo que le da el aspecto de una
frutilla. El bloqueo se presenta en un estadio
anterior a la formacin de rganos, momento en el que ya existe diferenciacin celular.
En maz tambin se han encontrado
mutantes letales embrionarios. En algunos se
encuentran inhibidos el desarrollo del embrin y el endosperma. En otros, slo el embrin.
Una importante conclusin a la que permitieron arribar estos mutantes es que el
embrin de Arabidopsis est constituido por
el ensamblaje de dos patrones superpuestos,
uno a lo largo del eje apical-basal y el otro a
lo largo del eje radial.
Ninguno de los mutantes encontrados
fueron mutantes tempranos, lo cual sugerira un control de los primeros estadios del
desarrollo embrionario por parte de genes
maternos, como sucede en animales. Sin
embargo, se han identificado pocos genes
maternos que afecten el desarrollo en plantas y el hecho de que se puedan formar los
embriones somticos o que se puedan desarrollar embriones producto de la fertilizacin
in vitro inducira a sospechar que los genes
maternos no juegan un rol primordial. Un gen
materno encontrado en Arabidopsis es sin1
(short integument 1). Este gen afecta la formacin de vulos, el tiempo de floracin y el
desarrollo embrionario. No se sabe si real-
132
Preglobular
Globular
Embrin maduro
Corazn
Torpedo
Figura 3: Estados de la embriognesis de Arabidopsis

thaliana.
mente se requiere para la embriognesis o si

los defectos observados se deben a las limitaciones impuestas por los defectos en el
tejido materno. Los embriones provenientes
de madres sin1/sin 1 tienen grandes defectos morfogenticos. Embriones con ese
genotipo en madres normales tienen un desarrollo normal (Fig. 3).
Un gen embrionario muy importante es
GN/EMB30. No se sabe si es un regulador
principal y acta muy temprano en el desarrollo, durante la primera divisin celular del
cigoto. En los mutantes las dos clulas resultantes no son diferentes, como ocurre en
embriones normales, donde la primera divisin celular es asimtrica.
El sistema mejor estudiado en relacin
con la embriognesis somtica es el de suspensiones celulares de zanahoria (Daucus
carota). En este sistema, la remocin del cido 2,4-diclorofenoxiactico (2,4-D) genera un
respuesta embriognica por la cual los agregados celulares forman embriones que crecen de a millares en un medio lquido. La disponibilidad de gran cantidad de embriones
creciendo sincrnicamente en un medio lquido representa un buen sistema para estudiar
los eventos genticos involucrados en el desarrollo embrionario. Los primeros estudios
tendientes a identificar patrones de expresin gnica relacionados con la embriognesis
somtica fueron realizados en 1981. Utilizando electroforesis bidimensional se encontra-
ron pocas diferencias entre patrones

proteicos de embriones somticos y clulas
en proliferacin, aunque, en virtud de lo expresado anteriormente, se esperara un patrn ms complejo.
Habra varias explicaciones para esta inconsistencia. Una es que los productos de
genes individuales involucrados en el desarrollo embrionario no fueran muy abundantes como para ser detectados en las
genotecas de ADNc. Otra es que la sincronizacin fuera slo aparente, particularmente en estadios tardos y que estas diferencias
enmascararan las diferencias entre estadios.
Otra es que las constelaciones gnicas
involucradas en la embriognesis somtica
podran estar ya activadas en las clulas proliferando en cultivo. Algunos estudios indicaran que muchos de los genes expresados en
los embriones somticos ya estaran hacindolo en las masas proembriognicas. Uno de
estos genes es el SERK que se expresa en
clulas competentes. Se conoce la secuencia
de su ADNc y codificara para una protena
receptora con repeticiones ricas en leucina del
tipo protena quinasa. La expresin de este
gen est correlacionada con la aparicin de
clulas competentes en cultivos primarios derivados de explantos de hipoctilos. La expresin contina en las masas proembriognicas y persiste hasta el estadio de
embrin globular.
Se encontr una lnea celular (ts11) sensible a la temperatura (letal condicional) que
en la temperatura restrictiva detiene su desarrollo en el estadio de corazn. Este efecto es revertido al colocar las clulas en un
medio condicionado proveniente de suspensiones celulares normales. El compuesto responsable de la reversin result ser una
endoquitinasa acdica. Aparentemente, esta
enzima puede hidrolizar un sustrato que se
encuentra en las paredes celulares vegetales
y liberar un compuesto indispensable para
disparar la embriognesis somtica. Tal
sustrato no pudo ser identificado pero se
encontr un lipoligosacrido de Rhizobium,
NodRlv-R (Ac, C18:4), que puede rescatar a
estas lneas celulares mutantes a fin de que
prosigan los procesos de embriognesis
somtica. Hasta el momento no se ha encontrado cul es la sustancia en clulas vegetales que produce este efecto.
El programa de eventos que tiene lugar
durante la embriognesis somtica es muy

elaborado como para estar regulado solamente por el 2,4-D. La perturbacin causada
por la deprivacin de este regulador del crecimiento debe disparar una serie de eventos
clave que involucran la accin de factores de
crecimiento ms especficos y fuerzas
biofsicas que confieren informacin
posicional y de desarrollo.
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134
PARTE IV
Mtodos para acelerar programas
de mejoramiento
e identificacin varietal
135
136
POLCI, Pablo; CONTI, Vernica; MIRANDA, Rubn
Identificacin de Haploides
IV.-Captulo 1
Obtencin de plantas doblehaploides
Polci, Pablo; Conti, Vernica; Miranda, Rubn
1 Introduccin
Comentarios generales sobre los

haploides
Para referirnos al trmino haploide es
necesario conocer previamente el origen de
dicha denominacin, y definir algunos conceptos bsicos sobre el tema.
Si consideramos haploide al individuo que
posee un solo juego de cromosomas de la
especie, no estaramos incluyendo en esta
clasificacin a aquellos individuos derivados
de especies poliploides, cuya constitucin
gentica es igual a la de los gametos normales de dicha especie. Por ejemplo, un
autopoliploide AAAA (2n = 4x) dara lugar a
individuos haploides AA (n = 2x), que por
tener dos juegos cromosmicos (AA) no podran ser incluidos en la definicin. Por lo tanto, una solucin sera denominar como
haploides a los individuos originados a partir de especies diploides, que posean un solo
juego de cromosomas (n = x), llamando
polihaploides a aquellos individuos con una
composicin cromosmica igual que la
gamtica normal de la especie, que tengan
dos o ms juegos cromosmicos (n > x). Otra
posibilidad sera considerar el trmino
haploide en un sentido ms amplio, comprendiendo en ste a todos los individuos
que posean una constitucin cromosmica
igual a la de los gametos normales de la especie (n = 2n/2). Llamaramos de esta manera monoploides y polihaploides a los individuos provenientes de plantas diploides (2n=
2x) y poliploides (2n> 2x) respectivamente.
De aqu en adelante, a los fines prcticos y
en concordancia con la segunda definicin,
nos referiremos al trmino haploide indistintamente del nivel de ploida de la especie en
cuestin, como a aquellos individuos que
poseen la mitad del nmero cromosmico
normal contenido en las clulas somticas de
la especie.
Varios procedimientos facilitan la bsqueda de haploides en muestras grandes en

nmero de individuos. Algunos de ellos son:
- Morfologa: Las plantas haploides son,
en general, ms pequeas que las diploides,
tanto en sus partes vegetativas como florales. Esto se debe principalmente a la disminucin en el tamao de sus clulas. Es lgico
pensar que el fenotipo ms pequeo de las
plantas puede ser una primera aproximacin
en la bsqueda de haploides. Si esta disminucin de tamao fuera notable en las semillas, sera muy fcil realizar una seleccin mecnica, aunque sucede en pocas especies.
- Poliembriona: La presencia de
poliembriona facilita la deteccin de embriones haploides; no obstante ello, debe realizarse el control citolgico correspondiente.
El porcentaje de embriones gemelos observados vara con la especie y el genotipo.
- Genes marcadores: Con este fin puede
utilizarse cualquier par de alelos cuyos
fenotipos dominante y recesivo sean fcilmente distinguibles. En la prctica, conviene
utilizar marcadores que posean manifestaciones fenotpicas claras en semilla o en plntula
y de esta manera hacer una seleccin ms
econmica en tiempo y esfuerzo. Para identificar haploides en una variedad que se supone homocigota, se realizan cruzamientos
con otra variedad que sea homocigota para
el alelo alternativo. La mayor parte de la descendencia ser heterocigota (diploide), con
fenotipo dominante. Los individuos que aparezcan con el fenotipo recesivo seran
haploides, obtenidos por partenognesis o
andrognesis, segn sea el fenotipo recesivo
materno o paterno, respectivamente.
Antecedentes
El valor de los haploides es conocido desde 1922, cuando se descubri la produccin
espontnea de los mismos. Actualmente son
ms de cien las especies vegetales capaces
de producirlos in vivo. Sin embargo, la frecuencia con la cual se producen es muy baja,
con valores que van de 0,001 a 0,01 %.
Entre los casos de haploida espontnea
es comn la poliembriona, que, con una
gran variacin entre los distintos genotipos,
ocurre en una amplia gama de especies, gneros y familias. En estos casos es frecuente
137
das mundiales de produccin. A pesar de que

cada ao se liberan al mercado numerosas
variedades, no persisten demasiado. Los
objetivos de mejoramiento a largo plazo no
podrn ser alcanzados a menos que se genere mucha variabilidad gentica que pueda
ser utilizada con estos fines y que existan
mtodos que acorten el tiempo necesario
para la obtencin de variedades.
El advenimiento de las tcnicas biotecnolgicas y los avances en biologa molecular
han permitido el desarrollo de nuevas herramientas de gran utilidad en el mejoramiento vegetal. Entre stas, la produccin de
haploides y doblehaploides es una herramienta interesante ya que permite acortar el tiempo requerido para la obtencin de
nuevas variedades, siendo un buen
complemento para los programas
de mejoramiento tradicionales. En
algunos casos, las poblaciones
haploides o doblehaploides (DH)
carecen de genotipos heterocigotas y sirven para encontrar
genotipos raros, especialmente en
el caso de caracteres recesivos, ya
que stos no quedan enmascarados por los alelos dominantes. Estas poblaciones presentan mayor
variacin gentica aditiva y ausencia de varianza gentica debida a
Figura 1: Obtencin de plantas haploides por cultivo de anteras.
la dominancia, si se las compara
En estudios de andrognesis in vitro se con poblaciones segregantes. Es decir que se
ha detectado especial facilidad para regene- eliminan las complejidades del estado
rar haploides a partir de anteras aisladas o heterocigota y se facilita enormemente el
de granos de polen en miembros de la fami- anlisis gentico. De esta manera pueden
lia de las solanceas Tambin se han encon- distinguirse las mutaciones recesivas de fortrado resultados sorprendentes en numero- ma inmediata, haciendo que el proceso de
sos gneros de las crucferas, gramneas y de seleccin sobre una poblacin de haploides
las ranunculceas, aunque resulta comn resulte ms eficiente (Fig. 2).
La produccin de haploides es una alterobservar diferencias significativas, incluso dentro de un mismo gnero. No se ha logrado, nativa biotecnolgica de gran importancia y
sin embargo, el mismo xito en especies ha resultado exitosa en varios cultivos, entre
ellos cebada, arroz y trigo.
arbreas y arbustivas.
Un sistema de produccin de DH debe
cumplir con tres requisitos bsicos para su
2 Importancia de los haploides y
utilizacin en programas de mejoramiento:
aplicaciones en el mejoramiento vegetal
- Debe producir lneas DH eficientemente
Los mtodos tradicionales para el mejo- a partir de todos los genotipos.
- Los DH obtenidos deben ser normales
ramiento vegetal han sido practicados por
cientos de aos. Actualmente se ha llegado y estables.
Estos deberan representar una muestra
a una etapa en donde estos mtodos son
insuficientes para hacer frente a las deman- al azar del conjunto de gametos parentales.
la aparicin de haploides procedentes de una

sinrgida del saco embrionario, puesto que
se ha comprobado en muchas especies que
las clulas antpodas degeneran antes de la
fecundacin.
En 1966, Guha y Maheshwari descubrieron que las anteras de Datura innoxia Mill.
generaban plantas haploides al ser cultivadas in vitro. Este proceso, confirmado posteriormente por Nitsch y Nitsch (1969) en
tabaco, se ha utilizado para producir
haploides en numerosas especies. En el caso
de Datura innoxia, las frecuencias de induccin son casi del 100% y el rendimiento es de
ms de mil plntulas o callos por antera en
condiciones ptimas (Fig. 1).
138
trigo de ciclo invernal es de aproximadamente diez aos, a travs

Gametos
Ab
aB
del mejoramiento tradicional (Fig.
3).
AaBb
Generacin F
La biotecnologa se presenta
hbrido intervarietal
como una alternativa atractiva no
AB Ab
aB
ab
Gametos F
slo para reducir el tiempo de
obtencin de los genotipos deseados, sino tambin para lograr
una economa de mano de obra
y espacio en el campo experiCultivo de anteras
Autofecundacin
mental.
Genotipos posibles despus del
Genotipos posibles despus de un Ciclo
En las plantas autgamas,
cultivo
de
anteras:
de autofecundacin de la F1:
Plantas haploides AB Ab aB ab
con los mtodos convencionales
Ab
aB
ab
AB
de mejoramiento, la homocigosis
AB AABB AABb AaBB AaBb
prctica se logra recin luego de
Ab AABb AAbb AabB Aabb
seis a ocho generaciones de
aB
AaBb AaBb aaBB aaBb
Duplicacin con colchicina
ab
AaBb Aabb aaBb aabb
autofecun-dacin, mientras que
Plantas doblehaploides
* La probabilidad de ocurrencia de los recuadros
AABB AAbb aaBB aabb
con una tcnica de produccin de
internos es de 1/16 (1/4 x 1/4)
1/4
1/4 1/4 1/4
haploides, seguida de duplicacin
cromosmica, es posible llegar a
Figura 2: Ventaja del uso de haploides en el mejoramiento cuando los
homocigosis completa en una gecultivares parentales difieren, tericamente, en dos pares de genes. Si el
genotipo buscado es, por ejemplo, el doble recesivo aabb, se tiene, por neracin.
En las plantas algamas, la
autofecundacin convencional, una probabilidad de 1/16 de encontrarlo.
Si se induce haploida, el mismo genotipo tendr una probabilidad de produccin de homocigotas resulocurrencia de porque no se producirn los genotipos heterocigotas.
ta de gran importancia. Al trabajar con especies de polinizacin
Entre las aplicaciones ms importantes de cruzada se favorece naturalmente la heterolos doblehaploides en el mejoramiento ve- cigosidad, y, de ser posible la autofecungetal podemos citar:
dacin, la obtencin de homocigotas se ve
dificultada por la endogamia.
Acortamiento de los programas de
En plantas bulbosas, rboles frutales y
mejoramiento
forestales la homocigosis juega un rol muy
El desarrollo de nuevos cultivares por los importante en el aceleramiento de los promtodos tradicionales actuales comprende gramas de mejoramiento. Debido al prolontres etapas fundamentales:
gado tiempo requerido para alcanzar la fase
(a) Generacin de variabilidad gentica,
sea por medio de hibridaciones sexuales intra
Progenitor A
x
Progenitor B
e interespecfica, por induccin de mutaciones, o por transformacin gentica.
(b) Recuperacin de progenies homocigotas a travs de generaciones repetidas de
F 1
autofecundacin o retrocruzamiento, selec6-7 ciclos
cionando a favor de los caracteres de inteSeleccin
De
@
rs.
Autofecundacin
(c) Evaluacin del comportamiento de los
@
nuevos materiales en ensayos comparativos
a campo.
Lneas puras
Estos pasos son bsicos en un programa
(homocigosis prctica: F7-8)
de mejoramiento, pudiendo existir otras etapas en funcin del modo reproductivo de la Figura 3: Representacin esquemtica de los pasos
especie. As, por ejemplo, el tiempo requeri- requeridos para la obtencin de lneas puras en un
do para la obtencin de un nuevo cultivar de programa de mejoramiento tradicional.
AAbb
aaBB
Generacin parental
1/4
1/4
1/4
1/4
1/4
1/4
1/4
1/4
139
adulta, el proceso de mejoramiento resulta

extremadamente largo, aun siendo posible
la autopolinizacin.
Generacin de poblaciones de mapeo

Diversos tipos de poblaciones pueden ser
utilizadas para el mapeo gentico de plantas. La eleccin del tipo de poblacin se realiza en funcin de los objetivos de la investigacin y del tiempo y recursos disponibles.
Las poblaciones de mapeo con el mayor contenido de informacin son aquellas obtenidas a partir del cruzamiento entre dos
indivduos homocigotos contrastantes. En las
plantas F 1 obtenidas, el desequilibrio de
ligamiento es mximo, y las poblaciones derivadas a partir de estas plantas F1 procuran
explorar este desequilibrio. Para especies de
autofecundacin o que toleran la autofecundacin pueden utilizarse poblaciones F2, Fn,
RILs (Recombinant Imbreed Lines), derivadas
de retrocruzas y doblehaploides.
Las poblaciones de doblehaploides representan la variabilidad gentica entre los progenitores luego de ocurrida una meiosis (F1),
y son especialmente indicadas cuando se realizan estudios con QTL (quantitative trait
loci), ya que al obtenerse genotipos 100 %
homocigotas se dispone de poblaciones estables o inmortales de mapeo. Esto permite analizar la misma poblacin en diferentes aos y localidades, debido a la constante
disponibilidad de semilla, obtenindose estimaciones mas precisas de los parmetros de
los caracteres cuantitativos a ser mapeados.
Estudio de especies poliploides
La induccin de haploides en plantas
poliploides facilita el trabajo de investigacin
y mejoramiento, ya que permite manejar niveles de ploida menores para los estudios
de herencia y la combinacin de caracteres
de inters.
Fusin de protoplastos
Al fusionar dos protoplastos haploides se
origina uno diploide que puede duplicarse y
llevar a la obtencin de un hbrido
interespecfico o intergenrico, siendo esto
una ventaja importante cuando se trabaja
en hibridacin somtica.
Variacin gametoclonal
140
La andrognesis in vitro provee un excelente sistema para analizar, a nivel

esporoftico, la variacin debida a
recombinacin y segregacin meitica. Las
variantes gametoclonales expresan el carcter recesivo en la R 0, a diferencia de las
somaclonales,
que
requieren
de
autofecundacin y anlisis de progenie. Algunos logros de esta tcnica:
- Frutos de tomate con mayor contenido de slidos
- Plantas enanas de arroz con granos
ms largos y con elevados niveles de protenas de reserva y ms macolladoras.
- Plantas de Datura innoxia con contenidos ms elevados de alcaloides en las hojas.
- Plantas de tabaco con mayor resistencia a bajas temperaturas.
- Plantas de Brassica napus con mayor
contenido de aceite del cido ercico en las
hojas. Este aceite se usa como lubricante en
la industria.
Mutagenesis
Si se aplica mutagnesis a un sistema de
haploides, se obtienen mutantes slidos,
logrndose la homocigosis del mutado rpidamente luego de la duplicacin con
colchicina. Entre los agentes mutagnicos
ms frecuentemente utilizados se encuentra
la N-metil-N-nitrosurea (20 mM), los rayos
(0,5 krad) y el etil metil sulfonato.
Transformacin gentica
Rige el mismo principio que para
mutagnesis. La transformacin de haploides
permite la obtencin del transgen en
homocigosis luego de la duplicacin con
colchicina. Puede realizarse con PEG,
microinyeccin o utilizando Agrobacterium
tumefaciens.
Produccin de plantas homogamticas
Asparagus officinalis es una especie cultivada, dioca, en la cual las plantas femeninas son XX y las masculinas son XY. De esta
manera, para obtener una poblacin de
plantas deben cruzarse ambos tipos, lo que
dar una progenie constituida por 50 % de
plantas XX y 50 % de plantas XY. Sin embargo, desde el punto de vista del productor, es
deseable la obtencin de una poblacin cons-
tituida solamente por plantas XY, que tienen un menor contenido de fibra y son, por
lo tanto, preferidas por los consumidores.
Por este tratamiento se han obtenido

haploides de Triticum monococcum.
2) Polinizacin retrasada: la castracin de
las flores y la posterior polinizacin
Progenitor masculino
en el lmite de la madurez receptiva
XY
del estigma permiten obtener hasta
Formacin de gametos
un 30 % de haploides en trigo.
3) Polinizacin con polen inviable:
X
Y
a) Utilizando polen extrao (tpiPlantas haploides
co de cruzamientos interespecficos),
Cultivo de anteras
incapaz de fecundar a la especie en
X
Y
cuestin, puede servir de estmulo
Duplicacin
para inducir haploida, como sucede
cromosmica
Homocigotos,
XX
YY
en el cruzamiento entre Solanum
hembra y supermacho
tuberosum x S. phureja (papa silvestre). El polen de la papa silvestre contiene slo un ncleo generativo, proFormacin de
ducto de una gametognesis anorGametos
X
Y
gametos
mal, por lo cual la fertilizacin doble
no logra producirse, pero se forman
XY
embriones haploides por partenogHbrido
nesis.
b) Utilizando polen previamente
irradiado.
Para solucionar este problema y obtener 100
4) Cultivo de ovarios: puede ser eficaz
% de plantas masculinas se ide un sistema para obtener haploides a partir de cruzaque consiste en el cultivo de anteras y mientos interespecficos.
diploidizacin de plantas YY, llamadas
supermachos. La ventaja de estas plantas es
II. Andrognesis: desarrollo de un gameque, al ser cruzadas con plantas XX darn to masculino.
100 % de plantas XY, como se muestra en el
esquema:
1) Cultivo de anteras: se ha inducido
Con este sistema, en 1990 fue liberada haploida en mono y dicotiledneas, siendo
una variedad llamada Andrea (es un hbrido ms fcil en las ltimas. Es una tcnica simple
obtenido como se mencionara anteriormen- que, dependiendo del genotipo y de las conte). Andrea es una variedad muy homog- diciones de cultivo permite obtener elevados
nea, de alto rendimiento y de excelente cali- nmeros de plantas en tiempos relativamendad.
te cortos. Ha sido ms difcil en los cereales;
no obstante ello, se obtuvieron haploides de
3 Obtencin de Haploides
arroz, trigo, cebada con diferentes grados de
dificultad.
Como se mencionara anteriormente, las
2) Cultivo de micrsporas: en 1974 Nitsch
plantas haploides aparecen en muy baja fre- indujo la regeneracin de plantas haploides
cuencia en la naturaleza, siendo necesaria la de Nicotiana terbium y Datura inoxia a parposterior ocurrencia de duplicacin tir de cultivos en suspensin de micrsporas,
cromosmica para la obtencin de semillas. previo choque trmico a baja temperatura
Por ello, la produccin artificial de haploides de las flores. Este mtodo tiene la ventaja
de producir haploides masivamente (ms de
resulta siempre ms efectiva.
7000 plantas por botn floral en tabaco), y
de permitir la aplicacin de diferentes trata Origen de los haploides
mientos a las micrsporas como transformaI. Ginognesis: desarrollo de un gameto cin o mutagnesis para luego obtener plantas por embriognesis partiendo de una nifemenino no fecundado. Se logra por:
1) Castracin y aislamiento de las flores. ca clula inicial. Para conseguir diferenciar
141
plantas a partir de micrsporas es necesario

quebrar el mecanismo responsable de la asimetra en la primera mitosis del polen.
III. A partir de alguna clula haploide del
saco embrionario distinta del gameto femenino (sinrgidas o antpodas).
IV. Cruzamientos interespecficos o
intergenricos con eliminacin cromosmica: se produce la fertilizacin de manera
de que se forme un cigoto diploide, que, a lo
largo de las sucesivas divisiones mitticas, va
perdiendo el genoma del individuo que aport el gameto masculino, como sucede en los
cruzamientos entre Hordeum vulgare y H.
bulbosum.
V. Interaccin ncleo-citoplasma: utilizando lneas de sustitucin y restauracin nuclear se encontr que los individuos con
citoplasma de Aegilops caudata y ncleo de
Triticum aestivum o Triticale mostraban una
frecuencia de haploida del 3,1% y del 52,9%
respectivamente. Esto se debe a que ciertas
interacciones entre un citoplasma y un ncleo extrao inducen haploida.
Figura 4. Produccin de callos y plantas a partir del cultivo

de anteras de Triticum aestivum. A. Callo blanco y
compacto sobre una antera(flecha). B. Detalle del callo
sealado en (A). C. Callo transferido a medio de cultivo
para regenerar planta. D. Plntula de trigo regenerada a
partir de callo, con sistema radicular en formacin. E.
Planta haploide completa finalizando la etapa de
rusticacin, creciendo sobre sustrato inerte (Perlita).
VI. Semigamia: el ncleo del gameto masculino penetra en la ovoclula pero sin fusionarse con el ncleo femenino. Ambos ncleos
comienzan a dividirse independientemente,
produciendo un individuo haploide con tejidos de origen materno y paterno.
los mtodos de cultivo in vitro durante las

ltimas dcadas han permitido obtener buenos resultados con gramneas (Fig. 4), aun en
aquellas consideradas recalcitrantes.
La capacidad de respuesta al cultivo de
anteras, denominada capacidad andrognica, puede ser evaluada a travs de la produccin de callos y de plantas verdes, y su
eficiencia es altamente dependiente de:
Mtodos ms utilizados para la obtencin de plantas haploides:

Entre los mtodos disponibles actualmente para la obtencin de doblehaploides, los
ms utilizados son la hibridacin interespecfica e intergenrica y la andrognesis.
- Cultivo de Anteras: Consiste en el cultivo de anteras inmaduras en un medio de
induccin, donde las micrsporas competentes originarn callos, que sern luego transferidos a un medio apropiado para la regeneracin de plantas (Fig. 1).
En algunas especies de dicotiledneas el
nmero de plantas obtenidas por cada cien
anteras cultivadas es muy elevado. En cambio en las gramneas la tcnica no ha sido
tan exitosa. Sin embargo, los progresos en
142
a) El genotipo: es quizs el factor ms

importante que afecta al cultivo de anteras.
En la naturaleza, la haploida es controlada
por el gen hap, llamado gen inhibidor de la
haploida. Existe suficiente evidencia que sugiere que la andrognesis in vitro tambin
est bajo control gnico y que este carcter
puede ser transferido desde clones con alta
respuesta a otros no respondedores. Se ha
hallado variabilidad en la respuesta entre
especies y aun dentro de ellas. En cebada y
trigo los caracteres de induccin de callos y
regeneracin de plantas son altamente heredables, y ha sido sugerido que ambos caracteres estaran controlados por muchos
genes. Por lo tanto, el mejoramiento de la
capacidad andrognica no parece difcil, sien-
do la identificacin de genotipos con gran

capacidad de respuesta un paso indispensable para su incorporacin en los bloques de
cruzamiento.
b) El % de albinismo: La ocurrencia de
plantas albinas representa un serio problema para la aplicacin del cultivo de anteras
en programas de mejoramiento de cereales.
La incidencia depende no solo de la especie
sino tambin de la variedad, citndose valores de 50, 70 y 100 % para tres variedades
diferentes de arroz (Wang y col., 1978).
Bernard (1980) ha sugerido que las altas temperaturas incrementan la diferencia entre la
velocidad de replicacin del material nuclear
y el de las organelas, resultando en un desarrollo retardado o incompleto de los
plstidos, lo cual conducira a la produccin
de fenotipos albinos. De acuerdo con este
autor, el desarrollo de un sistema
fotosinttico funcional es promovido por el
tratamiento con bajas temperaturas, aunque
no siempre un pretratamiento con fro reduce incidencia de albinismo.
c) Las condiciones de crecimiento de las
plantas donantes: la edad y las condiciones
ambientales en que crecen las plantas afectan considerablemente la capacidad
andrognica de las mismas. Los factores ambientales ms crticos son el fotoperodo, la
intensidad de luz, la temperatura, la nutricin y la concentracin de CO2. Estos factores incidiran en la capacidad de producir las
divisiones celulares morfognicas que conducen al desarrollo de embrioides y la regeneracin de plantas. Este ltimo paso es crtico
dentro de todo el proceso, es altamente
dependiente de la calidad del callo y est
asociado fuertemente a toda la historia previa del cultivo. En general, se ha informado
que la utilizacin de anteras de las primeras
floraciones favorece la respuesta andrognica,
mientras que las colectadas al final de la estacin muestran una menor respuesta al cultivo, generando una menor cantidad de
embrioides. En Brassica napus, el crecimiento de las plantas a bajas temperaturas mejora la produccin de embrioides obtenidos
a partir de anteras.
d) El estado de desarrollo de las
microsporas: en la fase gametoftica de las
plantas, que comienza luego de la meiosis,
las micrsporas sufren inicialmente una divisin mittica asimtrica que da origen a dos
clulas de distintos tamaos: la generativa,

ms pequea y con un ncleo altamente condensado; y la vegetativa, ms grande y con
un ncleo difuso. En las gramneas, el ncleo
generativo se divide nuevamente originando dos ncleos espermticos. Uno generar
el endosperma triploide al fusionarse con los
dos ncleos polares del saco embrionario,
mientras que el segundo fertilizar a la
oosfera produciendo el cigoto diploide, que
constituir el primer paso de la nueva fase
esporoftica. Los embrioides haploides se originan in vitro a partir de una de las vas que
se enuncian a continuacin. Cuando la primer divisin mittica de la micrspora es
asimtrica, los haploides se originan por repetidas divisiones de la clula vegetativa, de
la generativa o de ambas. Cuando la primer
divisin mittica es simtrica, ambas clulas
resultantes contribuyen al desarrollo del
haploide. Por lo tanto, una clula gamtica
masculina puede revertir su desarrollo
gametoftico hacia el grano de polen y dar
origen directamente a un nuevo individuo.
En general, las micrsporas que se encuentran en la primera divisin mittica son las
que mejor responden. Esto vara levemente
con la especie vegetal, pero esta reversin
no es posible luego de iniciada la deposicin
de almidn. El estado ms apropiado para
los cereales es el de micrspora uninucleada
media y tarda.
e) Los pretratamientos: distintos tipos de
estrs aplicados durante el estado adecuado pueden enmascarar el programa
gametoftico e inducir la expresin de genes
especficos del desarrollo esporoftico. Si bien
las bajas temperaturas son consideradas
como el mejor pretratamiento, tambin
otros pueden estimular la andrognesis,
como el calor, el choque osmtico, la
centrifugacin de las anteras o hasta una incisin en la parte superior de la inflorescencia
donante. Tambin se citan la poda, la pulverizacin con etrel, la irradiacin, la reduccin
en la presin atmosfrica, la anaerobiosis, el
tratamiento en una atmsfera saturada de
agua y la aplicacin de gametocidas. Las bajas temperaturas aplicadas sobre la planta
madre, sobre las yemas florales jvenes o
sobre las anteras, generalmente estimulan la
embriognesis. El fro estimula la divisin
mittica simtrica de las micrsporas. Esto se
143
debera a una alteracin en la orientacin del

huso que conducira a una primera mitosis
anormal del grano de polen. Por otra parte,
se ha mencionado que las bajas temperaturas retardan el envejecimiento de la pared
de la antera, lo cual aumentara la supervivencia y la viabilidad del polen. En general,
las temperaturas citadas varan entre 2 y 10
C y la duracin del tratamiento de 2 a 30
das. Es importante determinar la temperatura adecuada para cada especie vegetal, aun
para variedades dentro de la misma especie.
En algunas especies, tales como Capsicum
annun, avena y algunos genotipos de trigo
se ha logrado xito con un choque con alta
temperatura. Temperaturas de 30 - 35C durante los primeros 1 a 4 das del cultivo ayudaron a inducir la andrognesis en varias especies de gnero Brassica.
f) La composicin del medio de cultivo:
es otro de los factores importantes para el
xito en el cultivo de anteras. No existe una
recomendacin general y las variaciones dependen de la especie a cultivar.
Medios de induccin: dos tipos de

estrs, osmtico y nutricional, han sido identificados como causas disparadoras de la induccin de embriognesis en las micrsporas
de mono y dicotiledneas. En tabaco, el cultivo de las anteras en un medio carente de
sacarosa durante los primeros 6 das de la
etapa de induccin permiti una mxima respuesta andrognica. Los carbohidratos cumplen dos roles fundamentales en los medios
de induccin ya que actan como osmolito y
como nutriente. Los agentes gelificantes representan otro aspecto importante en la
evolucin de los medios de induccin. Tradicionalmente se utiliz agar como gelificante
de los medios de cultivo, debido a su disponibilidad y bajo costo. Pero en 1973 se detect una mejor respuesta andrognica en
tabaco cuando las anteras fueron cultivadas
en un medio solidificado con agar y suplementado con carbn activado. En medios lquidos la adicin de Ficoll (polmero sinttico de
sacarosa, inerte, no inico y de alto peso
molecular) incrementa la tensin superficial
y la viscosidad del medio. De esta manera,
las anteras y callos flotan sobre el medio lquido y se desarrollan en condiciones
144
aerbicas, permitiendo elevadas tasas de

embriognesis y de produccin de plantas
verdes. En cuanto a los reguladores de crecimiento, la mayora de los cereales requiere
de la presencia de auxinas y de citocininas en
el medio de cultivo y las respuestas parecen
depender de los niveles endgenos de tales
reguladores. Por ejemplo, para lograr la induccin en trigo es indispensable el uso de
2,4-D (cido 2,4 diclorofenoxiactico) en concentraciones de 1,5 a 2 mg/l. Existen otras
sustancias que, adicionadas al medio de cultivo, ayudan en la estimulacin de la
andrognesis, como la glutamina y el inositol.
Tambin se citan otros compuestos
inespecficos como extracto de papa, de
batata, de mandioca, de trigo germinado y
de endospermas de arroz y de maz. En ocasiones, si el medio se suple con leche de coco,
los granos de polen desarrollan directamente en embrioides.
Medios de regeneracin: la variedad

de medios de regeneracin citada es menor
cuando se la compara con la de los medios
de induccin. Los ms utilizados son modificaciones derivadas del medio MS, con concentraciones de carbohidratos similares a las
utilizadas en los medios de cultivo de tejidos
tradicionales (30gr/l de sacarosa), utilizando
agar (0,6 %) como gelificante, auxinas menos
poderosas, y un balance hormonal a favor
de las citocininas.
g)Las condiciones de incubacin: las caractersticas ideales de cultivo son especficas
para cada especie, y aun para cada genotipo
dentro de una misma especie. Estas afectan
particularmente la tasa de absorcin final de
nutrientes y la regeneracin de plantas verdes. La duracin e intensidad lumnica, la temperatura y la orientacin de las anteras sobre el medio de cultivo pueden tener un efecto considerable en algunas especies.
y Cultivo de Micrsporas: comprende la

obtencin de individuos haploides a partir de
micrsporas aisladas. Las espigas son
pretratadas y las micrsporas liberadas son
colocadas en un medio de cultivo donde desarrollarn embriones haploides, que sern
luego transferidos a un medio de regeneracin para originar plntulas (Fig. 5).
Figura 5. El diagrama muestra las diferentes etapas del cultivo de anteras y

de micrsporas aisladas. Para el cultivo de anteras, las etapas requeridas a
partir de anteras hasta la obtencin de las plantas haploides pueden describirse
como sigue: a) yema floral previo a la antesis, 1b) anteras, 1c) anteras en
cultivo, 1d) y 1e) proliferacin de las anteras, 1f) callo haploide, 1g)
diferenciacin de callo, h) planta haploide. Para el cultivo de micrsporas
aisladas: a) yema floral previo a la antesis, 3b) micrsporas aisladas de una
antera, 3c) cultivo de micrsporas, 3d) estado multinucleado, 3e) y 3f) embrin
en desarrollo.
Este sistema es considerado el de mayor

potencial para la produccin de doblehaploides, debido a que induce a los miles de
micrsporas que contiene una flor a dividirse
y producir embriones. La ausencia de la pared de la antera podra mejorar la nutricin y
eliminar las restricciones fsicas para la
andrognesis.
El cultivo de micrsporas tiene la ventaja
de originar embriones de similar tamao y
etapa fisiolgica debido a que pueden separarse las micrsporas de tamaos semejantes por centrifugacin diferencial. La optimizacin de los diferentes pasos crticos para
el xito de esta tcnica puede llevar a la obtencin de una alta cantidad de plantas verdes con menores costos y esfuerzos.
Entre los factores determinantes de la
eficiencia del mtodo podemos citar:
(a) Genotipo: se han citado cultivares de
cebada con una alta respuesta al cultivo de
micrsporas, en contraste con otros menos
respondedores.
(b) Albinismo: al igual que en el cultivo
de anteras el nmero de plantas albinas depende del genotipo, y tambin se ve influido por la densidad de cultivo de las
micrsporas.
(c) Condiciones de crecimiento de la
planta donadora: el mantenimiento de las
plantas en condiciones controladas de fotoperodo y

temperatura es esencial y
debe ser ajustado en funcin
de la especie. Se han citado
resultados en cebada cuando las plantas son cultivadas
en ambientes libres de
patgenos, con alta humedad relativa (60-80%),
fotoperodo de 16 hs. de luz,
y adecuado rgimen de fertilizacin y riego. Cuando las
plantas crecen estresadas,
sea por riego excesivo, sequa, enfermedades, o la aplicacin de algn plaguicida, la
respuesta al cultivo de
micrsporas es menor.
(d) Estado: Como se citara anteriormente para el cultivo de anteras,

es imprescindible el chequeo del estadio correcto para que conserven su capacidad
androg-nica.
(e) Pretratamientos: los pretratamientos
ms utilizados consisten en el uso de fro,
estrs osmtico, presencia o ausencia de determinados nutrientes, etc. Se ha demostrado que los nutrientes disponibles durante el
pretratamiento constituyen un factor decisivo que determina la calidad de los embriones originados.
(f) Densidad de cultivo: La densidad de
las micrsporas en cultivo afecta el desarrollo de las mismas y el nmero que entrarn
en divisin. Existe una concentracin mnima
para el desarrollo de las micrsporas, y una
densidad ptima para una mayor regeneracin. Las condiciones ms favorables deben
ser ajustadas en cada caso y para cada
genotipo en particular.
(g) Medio de induccin: Se han estudiado diferentes concentraciones de azcares,
distintas fuentes de nitrgeno orgnico, y la
adicin de diferentes auxinas al medio. En
general se sugiere la sustitucin de sacarosa
por maltosa como fuente de carbohidratos,
la disminucin de la concentracin de nitra-
145
to de amonio, el agregado de
glutamina, y el empleo de APA (cido fenil actico) como auxina para favorecer la induccin (Kasha y col.,
2001).
(h) Medio de regeneracin: la
composicin del medio de regeneracin puede afectar el vigor y supervivencia de las plntulas.
Kasha et al. (2001), trabajando
con cebada, encontraron en este
mtodo una manera eficiente de produccin de DH, con una mejor respuesta y una menor dependencia del
genotipo que en el caso del cultivo
de anteras. A esto se le suma la ventaja de contar con una elevada cantidad de micrsporas haploides en un
estado fisiolgico uniforme, que constituyen excelentes blancos para la
mutagnesis, la seleccin y la transformacin.
- Hibridacin interespecfica e
intergenrica: en este caso los
haploides se originan a travs de la
eliminacin del genoma del
polinizador. El sistema de hibridacin
de trigo x Hordeum bulbosum, inicialmente descubierto y empleado
con xito en cebada, ha sido considerado superior al cultivo de anteras
por tres razones:
(a) La produccin de haploides es
ms fcil.
(b) El tiempo requerido para la regeneracin de plantas es menor.
(c) La eficiencia en la regeneracin
de plantas parece ser mayor.
Figura 6. Produccin de haploides de Triticum aestivum por

cruzamientos de trigo x maz (Zea mayz). A. Espigas de trigo
cortadas en el campo y castradas en el laboratorio. B. Plantas de
maz (donantes de polen) crecidas en invernculo. C. Desgrane de
espigas para realizar la desinfeccin de los granos y posterior rescate
de embriones. D. Grano con dos embriones haploides
(poliembriona). E. Embriones inmaduros rescatados y creciendo
in vitro. F. Planta rusticada. G y H. Plantas con 3-5 macollos con sus
races sumergidas en solucin de colchicina para la duplicacin
cromosmica. I. Plantas tratadas con colchicina y llevadas a macetas
con tierra en cmara de crecimiento.
La gran limitante de este sistema lo constituye el hecho de que la mayora de los

cultivares de trigo no pueden cruzarse con
H. bulbosum debido a la presencia de los
genes de incompatibilidad, Kr1 y Kr2, y al desconocimiento del estado de estos genes en
los genotipos de trigo y de H. bulbosum
involucrados en los cruzamientos, debido a
que los genotipos se seleccionan sobre la
base de criterios agronmicos y no a un sistema de compatibilidad de cruzamientos con
H. bulbosum. Para sortear estos inconvenientes se ha sugerido como alternativa realizar
146
los cruzamientos, en el caso de trigo, utilizando maz como polinizador (Fig. 6). Luego de
la fertilizacin del vulo de trigo por el polen
de maz, durante las primeras mitosis del
cigoto, los cromosomas del maz son eliminados. Esto se debe a una incompatibilidad
entre los cinetocoros de estos cromosomas
y las fibras de los husos acromticos que hace
que en las primeras anafases los cromosomas
de maz vayan quedando rezagados en el
citoplasma, donde finalmente son degradados. El resultado de este proceso es un em-
brin haploide de trigo. Seguidamente, los

embriones inmaduros deben ser rescatados
en un medio de cultivo apropiado.
A travs de las cruzas con maz se han
obtenido haploides de trigo de cultivares tanto compatibles como incompatibles con H.
bulbosum, lo cual sugiere que el sistema de
incompatibilidad no afecta al mtodo de trigo x maz, por lo que sera menos dependiente del genotipo.
4 Duplicacin cromosmica
Despus de la duplicacin cromosmica,
ya sea espontnea o inducida, se logra la
homocigosis y se restaura la fertilidad. La planta haploide, sin duplicar, es estril por lo que
no podra producir semillas.
Entre las tcnicas que han sido utilizadas
para la duplicacin de haploides cabe mencionar:
(a) Duplicacin espontnea durante la
etapa de callo o de rescate de embriones.
(b) Regeneracin de plantas doblehaploides a partir de callos de mdula de plantas haploides de tabaco (Kasperbauer y
Collins, 1972).
(c) Sustancias qumicas: aunque se conocen casos mediante agentes qumicos tales
como acenafteno, hidrato de cloral, sulfanilamida, etc., la mayor eficacia se ha logrado con
la colchicina y el xido nitroso.
La aplicacin del xido nitroso bajo presin (2-6 atmsferas) resulta de especial inters por su fcil penetracin en los tejidos y
la rpida desaparicin de los mismos cuando
cesa la presin. Puede utilizarse en flores recin polinizadas. La ventaja que presenta
este tratamiento es que, al poder ser aplicado durante la primera divisin mittica del
vulo fecundado, se ve reducida la aparicin
de quimeras. Por otro lado, los residuos de
este agente resultan menos txicos para la
planta que otros que se aplican en forma lquida, aunque la frecuencia de aneuploides
puede ser muy elevada.
La accin de la colchicina fue descubierta en 1937 y desde entonces ha pasado a
ser prcticamente el agente diploidizante
ms importante Esta droga acta impidiendo el autoensamblaje de la tubulina,
inhibiendo as la formacin de los
microtbulos del huso y, en consecuencia, la
segregacin anafsica de las cromtides. Afecta por lo tanto slo a las clulas que se encuentran en divisin. Puede aplicarse a
plntulas, plantas adultas, semillas,
micrsporas y anteras.
El tratamiento puede realizarse utilizando una solucin acuosa donde se sumergen
las races, dejando fuera la parte area. Tambin se puede hacer llegar la solucin al interior de la planta utilizando una jeringa con la
dosis deseada (microinyeccin), o por absorcin de la solucin a travs de los tallitos decapitados, sobre los que se vierte.
Otra forma de hacerlo es tratar los callos
con colchicina antes de trasladarlos al medio
de regeneracin. Este ltimo mtodo permite la obtencin de gran nmero de
doblehaploides, pero presenta la desventaja de que la mayora de las plantas as obtenidas son mosaicos cromosmicos.
Otra alternativa, para micrsporas y
anteras, es la adicin del agente duplicador
directamente en el medio de induccin, antes de la primer mitosis. La diploidizacin en
este momento requiere menos tiempo y esfuerzo y ha sido utilizada en programas de
mejoramiento de trigo, maz, Tritordeum y
arroz. El problema de la suplementacin del
medio de induccin con colchicina es que reduce la embriognesis en trigo, si bien en
Oryza sativa y Brassica la puede incrementar. La duracin del tratamiento y la concentracin de la solucin varan para cada especie.
Cualquiera que sea el mtodo con que se
duplique la planta, un macollo o slo una
yema floral, lo importante es lograr que las
semillas que stas produzcan sean viables.
5 Consideraciones finales
La eleccin de los progenitores y la seleccin son etapas decisivas en un programa de
mejoramiento que avanzar luego generacin tras generacin, hacia una homocigosis
que permita entrar en las etapas de evaluacin. Ganar tiempo en estos casos puede significar una reduccin de costos muy importante y una ms temprana entrada en el
mercado de la nueva variedad. En el caso de
una especie autgama como el trigo es posible ganar generaciones haciendo dos cosechas en un ao, especialmente en aquellos
cultivares de corto ciclo vegetativo. Esto, sin
147
embargo, dificulta la observacin de algunas

caractersticas agronmicas importantes, que
no pueden ser observadas en los genotipos
en esas condiciones, atentando contra una
seleccin eficiente. Para los trigos de tipo invernal y facultativos, con ligeros requerimientos de vernalizacin, esta ganancia de generaciones no es posible o es difcil.
La produccin de individuos doblehaploides que puedan participar anticipadamente en la etapa de evaluacin agronmica
se plantea como una solucin promisoria a
este problema, reduciendo los tiempos y presupuestos.
Muchos interrogantes, sin embargo, quedan an sin resolver, limitando la aplicacin
extensiva de esta tecnologa a algunos modernos programas de mejoramiento vegetal.
Algunas preguntas a las que debemos
encontrar respuestas son:
En que generacin segregante se aplica
el mtodo de doblehaploides?
Cul es el nmero de individuos doblehaploides derivados de un cruzamiento, representativo de la variabilidad gamtica creada en la cruza, que permita un aprovechamiento integral, comparable al logrado con
el mtodo convencional de seleccin a campo?
Cmo superar la escasa cantidad de semilla producida?
Es una tcnica alternativa, o complementaria del mejoramiento tradicional?
La eficiencia en la produccin de
doblehaploides justifica su alto costo dentro
de un plan de mejoramiento?
paracin a los mtodos tradicionales de mejoramiento, por lo cual en la mayora de los

programas slo genotipos lite son sometidos a este sistema. Si bien el costo de produccin de los DH depende directamente del
mtodo elegido y la eficiencia lograda, la aplicacin de esta metodologa al mejoramiento vegetal se vislumbra ms bien como una
herramienta complementaria al mejoramiento tradicional, y que en ningn modo intentara reemplazarlo.
De acuerdo con Mujeb-Kazi (1998), las

generaciones segregantes adecuadas para
producir doblehaploides son la F2 y F3. Si eligiramos individuos F3, que ya cuentan con
un ao de seleccin a campo durante la F2 generacin que ha mostrado la mayor
varianza gentica entre los dos padres- estaramos evitando producir un gran nmero de
plantas doblehaploides que no sern
agronmicamente promisorias. No obstante, debemos considerar que seran necesarios varios cientos de individuos DH para que
el proceso tenga posibilidades de xito agronmico.
En general, la produccin de doblehaploides resulta en un gasto excesivo en com-
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IV.-Captulo 2
Aplicaciones de los marcadores
moleculares
Carrera, Alicia; Tranquilli, Gabriela;
Helguera, Marcelo
Las herramientas descriptas en II.-4 se
utilizan en numerosas reas relacionadas con
el mejoramiento vegetal y el anlisis de la
biodiversidad. A continuacin se describen
algunas de esas aplicaciones. Cada uno de
estos campos posee una base terica en ocasiones compleja y muchos de ellos requieren
del uso de programas de estadstica avanzada. De este modo, el presente captulo debe
ser considerado como una introduccin a los
temas considerados.
1 Identificacin de genotipos Pureza
varietal
El control de la pureza varietal y la discriminacin de variedades protegidas (es decir,
registradas) requieren de una adecuada identificacin de los materiales. Esta identificacin
se basa tradicionalmente en el uso de
descriptores morfolgicos y fisiolgicos. En la
mayora de los cultivos, la utilizacin de recursos genticos similares en diferentes programas de mejoramiento ha reducido la eficiencia de discriminacin por marcadores
fenotpicos. Por otro lado, varios de los caracteres usados como descriptores presentan
limitaciones en cuanto al nmero restringido
de variantes, influencia ambiental y dependencia del estadio de desarrollo de planta.
Como alternativa para resolver estos problemas, los polimorfismos moleculares de protenas y ADN resultan de utilidad en la determinacin de los criterios DUS (distincin,
uniformidad y estabilidad). Se utilizan localmente como datos complementarios de los
descriptores morfolgicos y fisiolgicos para
el registro de los cultivares, en aquellos casos
en que las diferencias entre materiales no son
conspicuas. ISTA (International Seed Testing
Association) y UPOV (Union Pour La
Protection Des Obtenions Vegtales) son
entidades internacionales que han desarrollado protocolos para estandarizar los anlisis de laboratorio para identificacin de
cultivares y reglamentar la utilizacin de diferencias moleculares en el control de la pureza varietal, la discriminacin de variedades
protegidas y en el otorgamiento de nuevas
patentes. Con el objeto de evitar el registro
de variedades esencialmente equivalentes,
UPOV ha establecido umbrales mnimos de
diferencias moleculares sobre la base de distancias genticas obtenidas a partir de caracteres tradicionales. En la actualidad se dispone de patrones moleculares varietales para
una extensa lista de especies. Como ejemplo podemos mencionar al trigo pan
(Triticum aestivum L.), para el que se desarroll una matriz de identificacin varietal
sobre la base de marcadores microsatlites
de ADN, que permite la individualizacin de
variedades argentinas. (Manifesto y col.,
1998). A partir de datos moleculares es posible obtener distintos ndices de distancia
gentica y generar esquemas ramificados o
dendrogramas, que ponen en evidencia la
similitud gentica de los materiales (Ver VI.1).
La pureza varietal es uno de los principales requisitos de la semilla comercial. En la
produccin de semilla hbrida la heterogeneidad intralote puede originarse por falta de
uniformidad en las lneas parentales, polinizacin cruzada espontnea o mezcla de semillas durante la cosecha o embolsado. Los
individuos fuera de tipo pueden identificarse mediante el patrn molecular. Del mismo
modo pueden establecerse las relaciones de
descendencia entre una serie de lneas
parentales y sus hbridos.
Se ha observado que an despus de 5-6
generaciones de autofecundacin, una lnea
puede no haber alcanzado completa uniformidad para ciertos marcadores moleculares.
Esto puede interpretarse como una porcin
residual del genoma que permanece segregando. Cuando la evaluacin de estos lotes
muestra uniformidad morfolgica, fisiolgica
y de caracteres agronmicos, pueden aceptarse ciertos niveles de variacin molecular sin
expresin fenotpica evidente. El mejorador
considerar en cada caso los niveles mximos
de variacin admisibles. Sin embargo, la ocurrencia de polimorfismos moleculares
149
intravarietales puede representar una

limitante para el uso de marcadores como
descriptores complementarios en la inscripcin de nuevos cultivares.
2 Uso en bancos de germoplasma
Las prcticas de la agricultura moderna
han generado una prdida de diversidad en
la mayora de las especies cultivadas. El reemplazo paulatino de las variedades primitivas por los cultivares hbridos de indudables
ventajas econmicas ha producido una reduccin en el nmero de genotipos que se
cultivan. La erosin gentica puede tener graves consecuencias para el cultivo, principalmente en relacin a su vulnerabilidad sanitaria. Este proceso puede ser atenuado mediante la creacin de bancos de
germoplasma, que constituyen un componente vital de los programas de mejora. Las
colecciones pueden mantenerse como bancos de semilla, a campo o in vitro.
Los recursos genticos de una especie cultivada comprenden i) cultivares antiguos y de
reciente obtencin ii) poblaciones locales
mantenidas por los productores, landraces
iii) poblaciones silvestres de la misma especie
o formas maleza y iv) especies relacionadas.
Los marcadores moleculares permiten caracterizar las accesiones o muestras a ser incluidas en las colecciones, estudiar el proceso de
domesticacin, establecer relaciones
filogenticas y colaborar en la eleccin de las
estrategias de conservacin. El procedimiento consiste bsicamente en analizar los materiales mediante marcadores proteicos o de
ADN y calcular medidas de diversidad (nivel
de polimorfismo, riqueza allica, presencia de
alelos nicos) y de similitud gentica. Esta informacin luego se complementa con datos
geogrficos (procedencia de las accesiones,
distribucin), pedigr y datos histricos de
obtencin.
La informacin generada por los marcadores resulta de inmediata aplicacin en los
procesos de acopio (dnde colectar, qu intercambios realizar), conservacin (identificacin de duplicados en las colecciones,
monitoreo de los cambios en la composicin
gentica que puedan ocurrir durante la multiplicacin o conservacin de los materiales),
caracterizacin (diversidad gentica de la co-
150
leccin) y distribucin eficiente de los recursos genticos hacia los usuarios.

Veamos algunos ejemplos. En casos como
el girasol (Helianthus annuus), el anlisis de
diversidad molecular ha demostrado que el
proceso de domesticacin ha reducido considerablemente la base gentica de los materiales cultivados con relacin a las poblaciones silvestres. Por el contrario, en poroto
(Phaseolus vulgaris) y olivo (Olea europea),
las formas cultivadas conservan gran parte
de la variabilidad presente en las poblaciones de los centros de origen en Amrica y
Europa, respectivamente. La comparacin
entre los materiales silvestres y cultivados de
una especie permite adems identificar los
lugares de origen del cultivo, conocidos como
centros de domesticacin. Una vez que los
recursos genticos disponibles han sido caracterizados, es posible decidir cules seran
los cruzamientos que ms contribuiran a la
expansin de la base gentica.
Frecuentemente, limitaciones en cuanto
a espacio fsico y presupuesto, hacen que los
centros nacionales e internacionales de recursos genticos deban restringir el nmero
de entradas a conservar en el banco de
germoplasma. La informacin reunida a partir de datos moleculares y morfolgicos puede contribuir a establecer una coleccin ncleo o representativa de la variabilidad total. Esta coleccin central debera incluir los
caracteres que estn presentes en numerosas accesiones o comunes, pero tambin los
denominados componentes raros y aquellos presentes en pocas accesiones de manera bastante frecuente.
La mayor parte de los polimorfismos
moleculares carecen de expresin fenotpica
y son selectivamente neutros, siendo la deriva gnica el proceso ms importante para el
cambio de frecuencia en las poblaciones. Una
gran parte de ellos se encuentran en regiones no codificantes del genoma. En contraste, los genes que codifican los rasgos
morfolgicos poseen un fuerte efecto
fenotpico y han estado sometidos a intensas presiones de seleccin en las distintas
etapas del mejoramiento; podran, por lo
tanto, constituir una muestra de genes
atpica con respecto a la mayora de genes
de una especie. Estos caracteres representan
grupos de genes sometidos a diferentes fuer-
CARRERA, Alicia; TRANQUILLI, Gabriela; HELGUERA, Marcelo
zas de seleccin a lo largo del proceso de

domesticacin. Los marcadores moleculares
combinados con datos morfolgicos,
agronmicos y de origen, conforman una
base de datos integral que permite describir
la variacin gentica en colecciones de
germoplasma.
3 Mapeo gentico
Un mapa gentico de una especie animal o vegetal muestra la distribucin linear
de un grupo de genes y marcadores en cada
uno de los cromosomas que constituyen el
genoma de un organismo. Este mapa esta
basado en el concepto clsico de ligamiento:
si dos o ms genes o marcadores estn fsicamente cercanos sobre el mismo cromosoma, sus alelos se heredan usualmente juntos a travs de la meiosis. Las proporciones
en que estos genes segregan en una poblacin se apartan de las esperadas bajo la ley
de Mendel de segregacin independiente. La
mayor parte de los gametos contendrn las
mismas combinaciones allicas que los padres; slo aquellos meiocitos que experimenten un intercambio entre cromtides no hermanas o crossover generarn gametos con
combinaciones allicas diferentes de las
parentales (recombinantes). El fundamento del mapeo gentico reside en la relacin
directa entre la frecuencia de
recombinacin y la distancia fsica entre los
loci. Es as como determinando la frecuencia
de recombinacin entre dos genes, uno puede estimar la distancia de mapa entre los mismos, siendo la unidad de mapeo equivalente a una frecuencia de recombinacin del 1%.
Usualmente esta distancia se expresa en
centimorgan (cM). La relacin entre frecuencia de recombinacin y distancia fsica es
distorsionada por factores tales como la distribucin no al azar de los entrecruzamientos,
las diferencias entre organismos, la presencia de hot spots o sitios de alta frecuencia
de recombinacin y la evidencia de control
gentico de la recombinacin. No obstante,
el uso de la intensidad de ligamiento como
estimador de la distancia gentica genera un
modelo de la disposicin linear de genes y
marcadores de gran utilidad en mltiples
reas del estudio genmico.
Recordemos que el grado de recombinacin

gentica (r), tambin conocido como fraccin
de recombinacin, es la proporcin de
gametos recombinantes, nr sobre el total de
gametos.
r = nr / n
Para tres loci, ABC, ligados en ese orden,
las fracciones de recombinacin entre los tres
se relacionan a travs de la siguiente expresin:
rAC = rAB + rBC 2C rAB rBC
donde 2rAB rBC representa la frecuencia
esperada de entrecruzamientos dobles y C,
el coeficiente de coincidencia, una medida
de la independencia con la que ocurren
quiasmas (entrecruzamientos) en regiones
cercanas.
La fraccin de recombinacin no es aditiva
a lo largo del cromosoma y la desviacin respecto de la aditividad aumenta con la distancia entre los loci. De este modo se han
desarrollado funciones de mapa tales
como Haldane o Kosambi que tornan aditiva
la fraccin de recombinacin.
Funcin de Haldane : m = - 0.5ln (1-2r),
donde m representa unidades de mapa
gentico.
Si un marcador resulta estar genticamente ligado a un gen que controla un carcter de inters agronmico, la seleccin de
este marcador resulta en la seleccin indirecta del gen de inters. Este hecho constituye
el fundamento del proceso denominado seleccin asistida por marcadores moleculares, aplicado en el mejoramiento gentico
vegetal y animal (ver seccin correspondiente en este captulo). La eficiencia del proceso
de seleccin indirecta basado en la
cosegregacin del marcador y del gen, es una
funcin de distancia, expresada como la probabilidad de recombinacin gentica entre
el marcador y el gen; por lo tanto, cuanto
ms prximos estn el marcador y el gen en
cuestin, ms eficiente ser la seleccin.
Este anlisis puede aplicarse tanto en caracteres cualitativos como cuantitativos. La
diferencia entre un carcter cuantitativo y uno
cualitativo se basa en la magnificacin del
151
efecto de sustitucin de un alelo por otro en

un determinado locus (Falconer, 1988). Si el
efecto de la sustitucin allica sobre la variacin fenotpica total del carcter es pequeo, se considera el carcter como cuantitativo o QTL (quantitative trait loci). Si el efecto
de la sustitucin de un alelo por otro es grande en relacin con la variacin fenotpica total, el carcter es cualitativo (genes de herencia simple). En general, la mayora de los
caracteres de importancia econmica y/o
agronmica, principalmente aquellos relacionados con la productividad, poseen herencia cuantitativa o fenotipos complejos.
En el contexto del mejoramiento vegetal

los mapas genticos posibilitan:
~ La cobertura y anlisis de genomas
completos
~ La descomposicin de caracteres
genticos complejos (QTL) en componentes mendelianos
~ La localizacin de regiones
genmicas que controlan caracteres de
importancia agronmica
~ La cuantificacin del efecto de estas
regiones en la caracterstica estudiada
~ La canalizacin de esta informacin
en programas de mejoramiento
Para incorporar un carcter de inters

agronmico en un mapa gentico es necesario cumplir con una serie de premisas:
1- Desarrollar una poblacin segregante
para el carcter agronmico en cuestin.
2- Caracterizar la poblacin segregante
utilizando marcadores moleculares polimrficos (con diferencias en la secuencia de ADN
entre los parentales). Para construir un mapa
mnimo es deseable disponer de al menos
cuatro marcadores moleculares por cada
cromosoma del genoma en estudio. Cuanto
mayor sea el nmero de marcadores incorporados al mapa, mayor ser su resolucin y
la probabilidad de identificar algn marcador
ligado al carcter agronmico de inters.
3- Evaluar fenotpicamente el carcter
agronmico, sobre los individuos de la poblacin segregante. Este punto es crucial, ya
que si la evaluacin del carcter en la poblacin de mapeo no es clara, es imposible incorporarlo al mapa gentico.
4- Identificar marcadores ligados al carcter agronmico (cosegregacin entre
fenotipo del carcter y fenotipo del marcador). Para esta instancia, al igual que para la
construccin del mapa gentico, se pueden
utilizar herramientas informticas especficas
tales como los programas Mapmaker,
MapmakerQTL, Genemap, etctera.
La construccin de un mapa gentico genera informacin bsica sobre la estructura y

organizacin de un genoma tal como
reordenamientos cromosmicos (inversiones,
translocaciones, duplicaciones) e identificacin de regiones con alta densidad de genes.
Por otro lado un mapa gentico constituye
el punto de partida para proyectos de
clonado posicional de genes (ver seccin 6
de este captulo).
Cuanto mayor sea la distancia gentica

entre los parentales que darn origen a la
poblacin de mapeo, mayor ser la probabilidad de detectar marcadores polimrficos, que es un punto crtico para identificar
marcadores ligados al carcter en estudio.
152
4 Seleccin asistida por marcadores

El advenimiento de nuevas tcnicas
moleculares ha facilitado el anlisis gentico
de caracteres de inters agronmico y la seleccin asistida por marcadores moleculares.
Un argumento frecuentemente utilizado en
contra de la seleccin asistida por marcadores es que el mejoramiento de caracteres de
herencia simple no necesita de marcadores
para seleccin si los fenotipos son fcilmente identificables. Si bien esto es correcto, en
estos casos, la utilizacin de marcadores en
un programa de mejoramiento puede aportar una ventaja muy importante basada en
su naturaleza molecular y es que la seleccin
se independiza del fenotipo y el ambiente.
Estas caractersticas permiten identificar rpidamente genotipos nicos en poblaciones
segregantes e incorporar varios genes de inters en un fondo gentico, proceso tambin
denominado piramidizacin o apilamiento de genes.
Los ejemplos ms claros para ilustrar la
utilidad de la seleccin asistida por marcadores moleculares en la piramidizacin de genes
se observan en los casos en que interacciones
gnicas como la epistasis (efectos de ciertos

genes sobre la funcin de otros) enmascaran la presencia de un gen, dificultando su
seguimiento mediante el fenotipo. Esta situacin se presenta con los genes de resistencia
a enfermedades, cuando se desea sumar en
un genotipo resistente a una determinada
enfermedad otros genes de resistencia al
mismo patgeno, como estrategia de resistencia durable.
Otro impacto de la seleccin asistida por
marcadores moleculares es el menor tamao de las progenies mantenidas en un programa. Con la seleccin asistida, el nmero
de generaciones necesarias para la estabilizacin de los genotipos es menor, ya que la
heredabilidad de los caracteres es prxima a
100%, aumentando la ganancia gentica.
Tambin es posible incrementar la velocidad
de un programa de mejoramiento, ya que al
independizarse la seleccin del ambiente y
de la expresin del fenotipo, se logra adelantar el nmero de generaciones por ao.
En la Figura 1 se representa un programa de

retrocruzas asistida por marcadores
moleculares como ejemplo de la utilizacin
de esta herramienta en el mejoramiento vegetal.
La utilidad potencial que los marcadores
moleculares presentan en el proceso de mejoramiento gentico resulta clara. Sin embargo, a pesar de ello, el uso actual de estas herramientas en algunos casos es limitado. Diversos son los factores que determinan esta
situacin. Por un lado podramos considerar
los de orden tcnico y por otro los de ndole
econmico. Dentro de los primeros, adems
de lo mencionado en prrafos anteriores respecto de la necesidad de contar con el mapa
gentico, con alta resolucin y de una poblacin segregante, debemos tener en cuenta
el paso siguiente que es la validacin de los
marcadores que se identifiquen como
promisorios para el seguimiento de caracteres de inters, es decir, la confirmacin de
determinados marcadores como herramien-
Figura 1. Esquema de un programa de retrocruzas, asistido por un marcador especfico para el gen de resistencia
a roya de la hoja del trigo Lr47. Pavon: variedad donora de la fuente de resistencia. PI Gaucho: variedad
susceptible recurrente. BC: generacin de retrocruza.
153
ta efectiva de seguimiento o seleccin de un

gen particular. La validacin es un aspecto
fundamental previo a la implementacin de
estas herramientas en programas de mejoramiento, y su importancia reside en que la
mayora de los marcadores disponibles hasta el momento derivan de regiones del
genoma que, como ya fuera indicado, son
neutras y en que la asociacin con caracteres
de inters est determinada por ligamiento
gentico en la poblacin evaluada. Dado que
ese ligamiento puede no mantenerse en otro
germoplasma, es necesario confirmar en los
materiales de mejoramiento que el carcter
deseado est determinado por gen/es presentes en el locus marcado. Desde este punto de vista, el mejor marcador es aquel que
reconoce sitios polimrficos que estando
dentro del gen son los determinantes de la
variacin fenotpica observada. Estos marcadores, tambin llamados diagnstico o funcionales, pueden ser usados en forma
confiable en poblaciones en los que no se
hayan mapeado previamente, sin correr el
riesgo de que la informacin de inters se
pierda por recombinacin. (Andersen y
Lbberstedt, 2003). Como ejemplo podemos
mencionar al marcador desarrollado para el
gen denominado Pinb-D1. Este gen codifica
para una de las protenas relacionada con
textura de grano en trigo y se ha observado
que la mutacin de una base especfica dentro de su secuencia implica el cambio de un
aminocido (de glicina a serina) en la protena codificada y que esto es suficiente para
determinar un mayor grado de dureza de
grano. Para este gen, se ha desarrollado un
marcador cuyo polimorfismo esta dado por
dicha mutacin, y esto asegura que su uso
sea vlido para identificar la presencia de esta
caracterstica, sea en poblaciones de mejoramiento como en la caracterizacin de
germoplasma.
Sin dudas, la disponibilidad de marcadores diagnstico aumentar progresivamente
a partir de nuevos conocimientos que surjan
de los proyectos genmicos emprendidos en
diversos cultivos de inters econmico.
Dentro de los factores de ndole econmico, la limitante en la adopcin de esta tecnologa ha sido la relacin entre el costo de
la misma y el valor comercial de la semilla
mejorada. En los programas de mejoramien-
154
to de aquellas especies donde el material de

cultivo es hbrido, en general se observa mayor uso de seleccin asistida por marcadores
moleculares. Es esperable que esta tendencia se modifique con el tiempo, ya que el permanente avance tecnolgico ha permitido
simplificar las metodologas a aplicar, por
ejemplo, sustituyendo marcadores basados
en hibridacin (RFLP, por ejemplo) por marcadores basados en amplificacin (RAPD,
AFLP), reduciendo costos y tambin aumentando la eficiencia en el proceso de seleccin.
5 Mapeo comparativo
La comparacin de mapas de ligamiento
entre diferentes especies se denomina
mapeo comparativo. Si un grupo de marcadores moleculares mantiene el orden y sus
relaciones de ligamiento entre dos especies
se dice que son colineares o que muestran
sintenia.
Los mapas comparativos en vegetales
comenzaron a realizarse a partir del desarrollo de los marcadores RFLP y de la posibilidad
de obtener hibridacin entre las secuencias
de ADN utilizadas como sondas con
genomas distintos a los utilizados para la
obtencin de las mismas. Es decir, a partir de
los RFLP fue posible identificar sitios comunes en distintas especies que servan como
puntos de referencia para la comparacin de
sus genomas. Es as que los mapas comparativos dieron las primeras evidencias de que el
ligamiento de grupos de genes podra haberse conservado a travs de largos perodos
evolutivos. Estudios en diversos grupos
taxonmicos han revelado una estrecha relacin entre los genomas de las especies comprendidas dentro de cada grupo. Esto se ha
observado, por ejemplo, entre especies pertenecientes a las Solanceas (tomate, papa,
pimiento), entre Arabidopsis y cultivos del
gnero Brassica, y dentro de las gramneas
entre especies pertenecientes a la tribu
Triticeas (trigo, cebada, centeno) as como
entre especies pertenecientes a distintas
subfamilias taxonmicas, tal el caso de arroz,
maz y sorgo. Es importante sealar que los
tamaos de los genomas de las especies comparadas, en general, son significativamente
diferentes. Sin embargo, a pesar de esa gran
variacin en el tamao del genoma, el orden
linear de los genes se encuentra altamente

conservado.
La utilidad de los mapas comparativos
puede apreciarse desde distintos puntos de
vista. Por un lado, aportan informacin muy
valiosa para conocer los cambios producidos
en la estructura cromosmica (inversiones,
translocaciones, duplicaciones, deleciones)
durante el proceso evolutivo que lleva a la
diferenciacin de especies a partir de un antecesor comn, as como tambin permiten
evaluar niveles de ploida. Por ejemplo, a partir de la comparacin de mapas moleculares,
ciertas especies consideradas inicialmente
diploides han modificado su estatus. Sobre
la base de estudios citogenticos, el maz
posee un comportamiento meitico que corresponde al de una especie diploide tpica.
Sin embargo, numerosos loci RFLP de arroz
estn representados dos veces en el genoma
de maz por lo que actualmente se considera
que el maz desciende de un poliploide ancestral.
Por otro lado, los mapas comparativos
posibilitan la transferencia de informacin
entre especies con genomas simples y bien
caracterizados, tales como Arabidopsis y
arroz, a especies con genomas ms complejos tales como trigo, cebada y avena. Este
ha sido tal vez el objetivo principal para impulsar el desarrollo de estos mapas. Las notables similitudes observadas entre genomas
fue la base sobre la que se postul el uso de
especies modelos, como arroz o Arabidopsis,
a partir de las cuales estudiar y avanzar en el
conocimiento de genomas ms complejos.
Asimismo, partiendo del supuesto de que los
genes que gobiernan aspectos fundamentales de la biologa vegetal muy probablemente estn conservados entre distintas especies, y el hecho de que la variacin en el tamao de los genomas de especies relacionadas se debe fundamentalmente a variacin
en la cantidad de ADN no codificante y no a
una variacin en el nmero de genes, la idea
de llegar a la identificacin, clonado y estudio de genes en las especies modelo se vio
fortalecida. De este modo la informacin
generada podra hacerse extensiva a una
amplia gama de especies, incluyendo las cultivadas, facilitando as el estudio en estos
organismos.
6 Clonado posicional
El clonado posicional de un gen es un
claro ejemplo de la utilizacin de informacin
gentica (disposicin espacial de genes),
molecular (secuencia nucleotdica de genes)
y del funcionamiento (expresin de los
genes) de un genoma (conjunto de genes)
para identificar al gen responsable de un carcter particular.
El primer paso para lograr esto es seleccionar parentales que sean contrastantes
para el gen en cuestin; por ejemplo, una
variedad de trigo susceptible y otra resistente a la roya de la hoja, para desarrollar una
poblacin de mapeo segregante para el gen
de resistencia (Stein y col., 2000). Una vez
seleccionados los parentales se desarrolla una
poblacin segregante para el carcter, la ms
sencilla es una F2.
Posteriormente, se caracteriza esta poblacin utilizando marcadores moleculares
(microsatlites, RFLP, AFLP, RAPD) que cubran
todo el genoma del organismo en estudio
(en este caso trigo).
El siguiente paso es determinar el
fenotipo de los individuos que constituyen
la poblacin de mapeo (en este caso plantas
resistentes o susceptibles a roya de la hoja).
Una vez obtenida la informacin fenotpica
y molecular de la poblacin de mapeo, con
la ayuda de programas especficos de computacin (por ejemplo, Mapmaker QTL), se
identificarn marcadores ligados genticamente al carcter en una regin especfica del genoma.
Una vez identificada la regin cromosmica portadora del gen responsable del carcter, se satura dicha regin con nuevos
marcadores moleculares. El objetivo es delimitar el intervalo del genoma al fragmento
mnimo posible que contenga al gen de inters. Muchos de estos marcadores pueden
obtenerse del mapeo comparativo, identificando las regiones cromosmicas colineares
de las especies ms estudiadas, por ejemplo
en plantas, arroz, Arabidopsis, maz, sorgo,
tabaco, etctera.
Una vez reducido al mnimo el intervalo
de genoma portador del gen de inters, el
paso siguiente es obtener la secuencia
nucleotdica del mismo. Una forma de hacerlo es mediante una caminata cromosmica.
155
La caminata se inicia seleccionando clones de

una genoteca de trigo (BAC library, Ver
Captulo II.-3) con los marcadores que
flanquean al intervalo portador del gen. Los
dos grupos de BAC (uno para cada marcador) son digeridos con enzimas de restriccin
para identificar en cada grupo fragmentos
compartidos y no compartidos. Se estima
que, en cada grupo los BAC seleccionados
deben tener en comn al menos un fragmento de digestin (el fragmento que posee la
secuencia del marcador). Los fragmentos no
compartidos corresponden a los extremos de
estos BAC parcialmente solapados entre s.
Estos extremos se utilizan como nuevos marcadores para extender la caminata
cromosmica en ambos sentidos. Este proceso se hace simultneamente con ambos
grupos de BAC hasta que se superpongan y
se forme un continuo o contig de BAC. Este
contig contiene la secuencia del gen en estudio. El paso siguiente consiste en la
secuenciacin del contig. A partir de esta informacin, y por anlisis de secuencia, se determinan los genes presentes, posibles candidatos del carcter en estudio. La prueba
definitiva para establecer el hallazgo del gen
en cuestin es la prueba de complementacin. Esto consiste en transformar una planta que carece del carcter en estudio (por
ejemplo es susceptible a un patgeno) con
cada uno de los genes candidatos y determinar cul de ellos le confiere el carcter (en
este caso resistencia al patgeno).
En algunos genomas (por ejemplo, arroz),
la regin cromosmica colinear a trigo puede estar secuenciada, y a partir de esta informacin se puede tener una primera estimacin del nmero de genes candidatos para
la resistencia al patgeno en la regin
cromosmica homloga a trigo en arroz. En
el caso del trigo pan, que posee un genoma
extremadamente grande (16000Mb/
genoma haploide) es crtico obtener un intervalo genmico lo ms pequeo posible,
ya que si bien posee aproximadamente el
mismo nmero de genes que arroz, su
genoma haploide es diez veces mayor, y la
diferencia est constituida principalmente
por ADN repetitivo no codificante que dificulta el clonado posicional. Como ejemplo,
para el clonado posicional del gen Vrn-1 que
controla el momento de floracin del trigo
156
se utiliz una poblacin de trigo diploide

(Triticum monococcum) de 3095 individuos
F2, para llegar a delimitar un intervalo de 0.03
cM que contena dos genes candidatos para
Vrn-1 (Yan et al. 2003). Esta regin present una densidad de genes de uno cada 70000
pares de bases, la mitad del valor promedio
de fragmentos contenidos en un BAC.
7 Distribucin de la variabilidad gentica
en poblaciones naturales
Las especies estn constituidas por unidades o demos ms o menos aislados denominados poblaciones. Una especie vegetal
raramente se extiende en forma continua e
ininterrumpida. En general adopta una distribucin en parches. El nmero de individuos en cada poblacin, el modo reproductivo (autogamia-alogamia), las distancias
inter-demos, el tipo de polinizacin (gravedad-anemfila-entomfila), la accin del
hombre en la fragmentacin del hbitat y el
origen histrico (especies nativas-especies
introducidas) determinan en conjunto una
distribucin de la variacin gentica propia
de cada especie.
Los programas de conservacin utilizan a
menudo informacin acerca de la distribucin
de la variacin gentica para establecer prioridades y estrategias de manejo. El estudio
de los componentes de la variacin dentro
y entre poblaciones colaboran en la definicin de las unidades a conservar y se convierten en elementos importantes para la toma
de decisiones relacionadas con la proteccin
de la biodiversidad. Es deseable que las poblaciones seleccionadas para formar parte de
las reas protegidas, contengan la mayor diversidad gentica posible de modo de asegurar el mayor potencial evolutivo.
A partir de marcadores codominantes
como las isoenzimas pueden ser obtenidos
parmetros de diversidad:
P: nmero de loci polimrficos/nmero
total de loci analizados.
A: nmero promedio de alelos por locus
He: heterocigocidad esperada promedio
(1- fi2, fi : frecuencia allica)
Ho: heterocigocidad observada
Tambin se calculan coeficientes de
endogamia (F) a partir de la heterocigocidad
observada y esperada, e ndices de simili-
tud (I) o distancia gentica (D) que cuantifican la semejanza o diferencia gentica entre
poblaciones a partir de las frecuencias allicas
(Ver VI.-1 ).
La diversidad gentica cuantificada por
marcadores moleculares puede mostrar por
ejemplo, que en una especie nativa de inters forestal todas las poblaciones presentan
altos niveles de variabilidad gentica y son
bastante similares entre s. En este caso la
decisin de cules poblaciones formarn parte del programa de conservacin podra basarse en consideraciones exclusivamente prcticas ya que las poblaciones son genticamente equivalentes. Por el contrario, una
especie compuesta de poblaciones con niveles bajos de variabilidad en cada unidad pero
con alto grado de diferenciacin entre poblaciones, requerir que los esfuerzos de proteccin sean dirigidos hacia tantas poblaciones como sea posible, ya que cada una de
ellas posee una identidad gentica diferente. Poblaciones de especies endmicas, con
niveles de diversidad gentica extremadamente bajos y un reducido nmero de individuos, son normalmente ingresadas a la categora de especies en peligro de extincin.
En este punto, es importante recordar
que los marcadores moleculares representan
variacin gentica esencialmente neutra, es
decir se encuentran sometidos a la accin de
fuerzas evolutivas no selectivas tales como
deriva o flujo gnico. Las decisiones finales
de un programa de conservacin deberan
por lo tanto combinar los datos obtenidos a
partir de marcadores moleculares junto con
la evaluacin de ciertos rasgos morfolgicos,
fisiolgicos o reproductivos, que son crticos
en el proceso de adaptacin y supervivencia
de las poblaciones en su hbitat.
El conocimiento de los componentes de
variacin entre y dentro de las poblaciones
naturales puede utilizarse adems en situaciones de repoblamiento, es decir, la introduccin de individuos en reas en proceso
de declinacin. De acuerdo a la informacin
obtenida por la caracterizacin molecular, es
posible seleccionar la las poblaciones
donadoras sobre la base de la similitud
gentica con la receptora, de modo de evitar los efectos indeseables de la depresin
por exogamia.
Las malezas de mayor impacto en la agri-
cultura mundial son en general especies introducidas. En el nuevo territorio, libre de

presiones selectivas tales como especies competidoras o patgenos caractersticas del
ecosistema de origen, la especie introducida
es capaces de establecerse y colonizar todos
los territorios que renan determinadas condiciones ambientales. La caracterizacin
gentica de las poblaciones de malezas puede aportar informacin de utilidad en los programas de control. Mediante diferentes marcadores moleculares puede establecerse si las
poblaciones actuales provienen de un solo
evento de introduccin, con unos pocos individuos iniciales o por el contrario, ocurrieron mltiples eventos de introduccin. Adems, determinados marcadores informativos
pueden establecer con bastante precisin
cul es el lugar de origen de las poblaciones
introducidas, y en este caso rastrear enemigos naturales que pudieran ser tiles como
control biolgico de la especie invasora. Del
mismo modo puede ser analizada la variabilidad gentica de patgenos o parsitos vegetales tales como razas de royas, virus,
nematodos, etc. y a partir de esta informacin disear programas de control ms eficaces.
El tipo de reproduccin de una especie
vegetal determina en gran parte la distribucin de variabilidad gentica entre poblaciones. Los mecanismos reproductivos pueden
clasificarse en los tres tipos bsicos: alogamia,
autofecundacin y apomixis (ver Captulo
VIII.-3). En realidad existen combinaciones de
estos tipos bsicos, con porcentajes variables
de cada uno de ellos, segn las especies, y
aun dentro de las poblaciones, con formas
obligadas o facultativas. El estudio de marcadores moleculares en diferentes plantas de
una poblacin y su progenie ha contribuido
a determinar el tipo de reproduccin de numerosas especies vegetales.
8 Estimacin del flujo gnico
El flujo gnico entre poblaciones vegetales ocurre mediante el movimiento de polen
o de semillas. La morfologa de semilla y polen, los mecanismos de dispersin, el tipo de
polinizacin, etc., hacen que la contribucin
de estas dos vas al flujo total vare de acuerdo a la especie. Los marcadores moleculares
157
permiten cuantificar cada uno de estos procesos. Si el flujo gnico se produce bsicamente a travs de polen, los marcadores de ADN
de organelas, como por ejemplo cloroplastos,
no sern transferidos de una poblacin a otra
porque este tipo de informacin es slo heredada por va materna. En contraste, si el
flujo gnico se realiza principalmente a travs de semillas, tanto los marcadores de herencia materna como los de herencia
biparental o nuclear, sern transmitidos entre poblaciones. Mediante el uso de marcadores altamente polimrficos como los
microsatlites es posible determinar cul ha
sido la planta donadora del polen de cada
semilla por ejemplo, en especies arbreas. En
este caso, por un lado se obtiene informacin acerca de la distancia de transporte de
polen y adems constituye un test de paternidad.
La estimacin del flujo gnico ha cobrado especial relevancia en los estudios tendientes a evaluar el efecto sobre el ambiente de los materiales genticamente modificados. Dicho efecto comprende diferentes
facetas. Por un lado la posibilidad de que
poblaciones silvestres cercanas a las formas
cultivadas, adquieran el transgen mediante
fecundacin cruzada, generando cambios en
la dinmica poblacional, competitividad o
relacin con otro miembros de la comunidad
bitica tales como polinizadores, patgenos,
etc.. Esta potencial transferencia de genes se
torna preocupante cuando se trata de flujo
gnico hacia poblaciones silvestres catalogadas como malezas. En este escenario los
marcadores moleculares de ADN o
isoenzimas constituyen herramientas muy
tiles. Los individuos de una determinada
poblacin pueden ser analizados y comparados con su progenie, producto de una polinizacin libre. Los alelos que no estaban presentes en la poblacin materna son atribuidos al ingreso externo de polen del cultivo.
Evaluando poblaciones a distancias crecientes desde una determinada fuente de polen, el flujo gnico puede ser cuantificado, y
cuando esta informacin se complementa
con datos de compatibilidad sexual,
polinizadores y clima se arriba a una serie de
conclusiones que pueden aplicarse al cultivo
en gran escala de variedades transgnicas. A
modo de ejemplo, con el objeto de estable-
158
cer el riesgo ambiental de la liberacin de

girasol genticamente modificado en la Argentina, se est realizando un estudio que
comprende el relevamiento de las especies
silvestres del gnero Helianthus, su distribucin y el grado de intercambio gentico en
las zonas de contacto cultivo-silvestre (Ver IX.2).
Se trate de variedades transgnicas o no,
los procesos de hibridacin de formas cultivadas de base gentica estrecha con silvestres alteran los niveles de diversidad gentica
de las poblaciones naturales, produciendo
una erosin de los recursos genticos vegetales, con potencial aplicacin en mejora.
Nuevamente la estimacin del flujo gnico y
la determinacin de la variabilidad gentica
mediante marcadores pueden contribuir a
atenuar los procesos de homogenizacin
gentica y dar tiempo a la evaluacin de las
poblaciones naturales en cuanto a rasgos
como resistencia a enfermedades o
parmetros de calidad.
9 Filogenia
La filogenia intenta reconstruir las relaciones jerrquicas de descendencia entre especies o grupos de especies y utiliza esta informacin como criterio de clasificacin biolgica. El conocimiento de la filogenia y diversidad gentica de los recursos silvestres
permite optimizar los procesos de hibridacin
con los materiales cultivados. Cultivos importantes como trigo, girasol, tomate, poroto,
arroz cuentan con numerosas especies y gneros silvestres relacionados, con potencial
uso en el mejoramiento gentico mediante
cruzamientos.
Los marcadores RFLP son particularmente tiles dado que estn basados en reacciones de hibridizacin, lo que garantiza la
homologa de los segmentos que se comparan entre los diferentes taxa. RAPD no requiere un conocimiento previo del genoma
en estudio y puede ser aplicado a diferentes
especies pero la interpretacin de los datos
parte de asumir que los productos de amplificacin de iguales tamaos son homlogos.
El procedimiento consiste bsicamente
en calcular un ndice de distancia gentica
sobre la base del nmero de bandas en comn y luego realizar un anlisis de agrupa-
miento (UPGMA) o rbol filogentico

(Neighbour Joining), que refleje las relaciones entre los taxa. Establecer cul es el rbol
correcto entre todos los posibles es una tarea difcil que en parte es resuelta mediante
el uso de mtodos estadsticos, como tcnicas de re-muestreo, que generan ndices de
consistencia o confiabilidad para cada rbol.
Las relaciones establecidas de este modo se
comparan luego con vas filogenticas propuestas a partir de datos citogenticos,
morfolgicos, ecolgicos, cruzamientos, etctera.
Los polimorfismos en los fragmentos de
restriccin de ADN de cloroplasto resultan
tiles para establecer relaciones filogenticas
en el mbito de familias y gneros debido a
su tasa de evolucin ms lenta y a su modo
de herencia uniparental. Para los niveles de
especie e infraespecficos es conveniente complementar con marcadores de origen nuclear,
entre los cuales las sondas para ARN
ribosmico 45S y ADNc son frecuentemente
usadas.
El mapeo comparativo ha permitido conocer el tipo de reorganizacin genmica
que ha operado durante el proceso de
especiacin. Cuando se compara el orden de
los marcadores moleculares del girasol,
Helianthus annuus, y especies relacionadas
como H. petiolaris y H. anomalus se observa que las especies poseen zonas colineares
y zonas no colineares, originadas estas ltimas en cambios estructurales como inversiones y translocaciones. Adems se ha comprobado que H. anomalus es una especie resultante de la hibridacin entre las dos especies mencionadas, que conserva el mismo
nmero cromosmico de las especies
parentales.
Mediante marcadores isoenzimticos es
posible dilucidar las especies parentales
ancestrales de una especie alopoliploide,
como ocurri con el tabaco y el algodn. Basta con examinar las variantes moleculares de
las especies candidatas diploides y compararlas con las de la especie poliploide derivada.
El modo de herencia de un locus
isoenzimtico, es decir, dismico vs. polismico, permite adems caracterizar una
especie en cuanto a su origen alo- o
autopoliploide, respectivamente.
En la evolucin del gnero Citrus ha operado la hibridacin natural a travs de reproduccin sexual pero tambin estn presentes mecanismos apomcticos que constituyen
barreras al intercambio de genes. La taxonoma de este grupo resulta particularmente
compleja ya que no puede ser aplicado el
concepto biolgico de especie. Marcadores
de ADN han permitido esclarecer las relaciones de este polimrfico grupo que incluye
naranjas, limones, limas y mandarinas.
Los estudios moleculares ms recientes
han colocado al tomate, previamente denominado Lycopersicon esculentum, dentro
del gnero Solanum, pasndose a denominar Solanum lycopersicon. Los estudios sobre ADN de cloroplasto y la similitud de los
mapas de ligamiento constituyen evidencias
de que el tomate y la papa comparten un
antecesor comn muy reciente. Esta informacin resulta de gran aplicacin en el mejoramiento de estos cultivos as como en la comprensin de la evolucin de los genomas.
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160
PARTE V
Mtodos de propagacin y
conservacin de germoplasma
161
162
OLMOS, Sofa; LUCIANI, Gabriela; GALDEANO, Ernestina
V.-Captulo 1
Micropropagacin
Olmos, Sofa; Luciani, Gabriela;
Galdeano, Ernestina
1 Introduccin
La micropropagacin consiste en la propagacin de un genotipo a gran escala a travs del empleo de tcnicas de cultivo de tejidos. El cultivo es as una herramienta muy til
en los programas de mejoramiento, ya que
tiene el potencial de producir plantas de calidad uniforme a escala comercial, a partir de
un genotipo selecto y con una tasa de multiplicacin ilimitada.
Esto es posible gracias a la propiedad de
totipotencia que tienen las clulas vegetales; esto es la capacidad de regenerar una
planta completa cuando estn sujetas a los
estmulos adecuados. As, las clulas
somticas de cualquier tejido podran formar
tallos, races o embriones somticos de acuerdo con la competencia que posean y al estmulo que reciban.
Esta regeneracin ocurre en fases consecutivas: la fase de desdiferenciacin, donde
las clulas se vuelven competentes para responder ante cualquier estmulo organognico
o embriognico; la fase de induccin, donde las clulas se determinan para formar un
rgano o embrin, y la fase de realizacin,
donde se forma el rgano o embrin propiamente dicho. Estas fases estn directamente afectadas por el balance hormonal del
medio de cultivo, por lo cual la optimizacin
de los protocolos de regeneracin debe realizarse teniendo en cuenta los requerimientos intrnsecos de cada genotipo en cada fase
del cultivo. As, en general, puede decirse que
el proceso de desdiferenciacin generalmente es promovido por una auxina, la fase de
induccin por un balance hormonal especfico del rgano o embrin a formarse y la fase
de realizacin, por una disminucin de la concentracin hormonal en el medio de cultivo.
2 Etapas de la micropropagacin
La regeneracin de plantas in vitro presenta cuatro etapas principales: 1) estableci-
miento del cultivo, 2) desarrollo y multiplicacin de vstagos, 3) enraizamiento y 4) aclimatacin de las plntulas. Generalmente, las
etapas de enraizamiento y aclimatacin pueden combinarse en condiciones ex vitro. En
algunos casos tiene importancia considerar
una etapa previa (Etapa 0), que es la etapa
de preparacin de los explantos para el establecimiento.
Etapa 0: Preparacin del material vegetal

El empleo de explantos que se encuentran expuestos a bajos niveles de patgenos
puede resolver el problema de la contaminacin por hongos y bacterias durante el establecimiento del cultivo in vitro. Los factores
que influyen sobre la calidad del explanto son:
1) El tipo de rgano que sirve como explanto,
2) la edad ontognica y fisiolgica del mismo, 3) la estacin en la cual se colecta el
material vegetal, 4) el tamao y 5) el estado
sanitario general de la planta donante.
La planta donante debe elegirse sobre la
base de una seleccin masal positiva para las
caractersticas agronmicas deseables. Una
vez seleccionados los individuos, es preciso
definir el tipo de explanto a establecer en
condiciones in vitro. En general, los rganos
jvenes o bien rejuvenecidos son los que tienen mejor respuesta en el establecimiento
que los obtenidos a partir de materiales adultos.
Se recomienda colectar explantos primarios a campo durante la estacin primaveral
y estival, cuando existe una brotacin activa
de las yemas, ya que el empleo de yemas en
estado de dormicin ocasiona serios problemas de contaminacin.
A fin de lograr explantos de ptima calidad es conveniente hacer crecer las plantas
donantes por un tiempo mnimo en condiciones de invernculo. De esta forma es posible incidir directamente sobre el estado sanitario y la calidad de los explantos mediante
el control de la intensidad lumnica, temperatura y reguladores de crecimiento. Para especies
ornamentales
tropicales
y
subtropicales se recomienda mantener las
plantas donantes en condiciones de alta temperatura (25C) y baja humedad relativa
(75%), a fin de reducir la proliferacin de
patgenos.
163
Los procesos morfognicos de floracin,

dormicin y bulbificacin son controlados por
el fotoperodo y la temperatura. Controlando estos factores tambin es posible obtener plantas donantes y explantos ms homogneos durante todo el ao. Pueden aplicarse adems pretratamientos con reguladores de crecimiento a las plantas donantes,
as como tambin a los explantos mismos.
En especies leosas suele utilizarse como
pretratamiento la inmersin de los explantos
primarios en soluciones con citocininas a fin
de inducir la brotacin de yemas.
Etapa 1: Establecimiento del cultivo

El objetivo de esta etapa es establecer
cultivos viables y axnicos. El xito est determinado por la edad de la planta donante, la edad fisiolgica, el estado de desarrollo y el tamao del explanto. En esta etapa
los principales procesos a controlar son la
seleccin, el aislamiento y la esterilizacin de
los explantos.
Los materiales que demuestran tener
mayor capacidad regenerativa son los obtenidos de tejidos meristemticos jvenes, sean
yemas axilares o adventicias, embriones o
semillas en plantas herbceas y aquellos tejidos meristemticos que determinan el crecimiento en grosor, como el cambium en las
plantas leosas. En este sentido, es importante sealar que el empleo de yemas adventicias (tambin llamadas yemas formadas
de novo) est asociado con una mayor probabilidad de ocurrencia de variantes
somaclonales respecto de los sistemas de
propagacin, basados en la regeneracin a
partir de yemas axilares o embriones
somticos.
La obtencin de cultivos axnicos puede
lograrse trabajando tanto sobre aspectos
preventivos como curativos. Una accin preventiva la constituye el empleo de mtodos
de verificacin de patgenos en los
explantos. Esto puede realizarse mediante
anlisis especficos para las enfermedades del
cultivo, tales como DAS-ELISA o PCR, anlisis
generales para patgenos cultivables como
el empleo de medios de cultivo para el crecimiento de bacterias y hongos y mtodos
especficos para la deteccin e identificacin
de patgenos intracelulares como virus,
viroides y bacterias. La realizacin de estos
164
anlisis directamente sobre las plantas donantes, previo establecimiento, presenta dos
ventajas. En primer lugar, el empleo de tejidos maduros permite visualizar los sntomas
ms marcados de la enfermedad; en segundo lugar, la carga de patgenos es mayor y
por lo tanto la precisin del sistema de deteccin aumenta. Por otro lado, las plantas
enfermas pueden tratarse con tcnicas adecuadas para la eliminacin de patgenos
como la termoterapia, la quimioterapia a travs de la aplicacin de antibiticos, desinfectantes, antivirales y el cultivo de meristemas.
La desinfeccin superficial incluye varios
pasos: el lavado de los explantos con agua
corriente, el empleo de etanol al 70% por 1
minuto, seguido de concentraciones variables
de hipoclorito de sodio (0,5 a 1,5% de cloro
activo) con unas gotas de tensoactivos para
favorecer su penetracin y actividad. Posteriormente, los explantos deben ser enjuagados al menos tres veces con agua destilada
estril.
Algunos patgenos permanecen latentes
y se expresan cuando son transferidos a un
medio de cultivo nuevo. En general, estos
patgenos incluyen los patgenos superficiales del material vegetal, los patgenos
endgenos y los patgenos propios del manejo en laboratorio. En la Etapa 1 tambin
pueden observarse infecciones por bacterias
y hongos asociados a trips que sobreviven a
los tratamientos de esterilizacin y por
patgenos endgenos latentes dentro del
sistema vascular, resultado de una esterilizacin inefectiva de los explantos. Estos
patgenos latentes podran manejarse mediante el empleo de bacteriostticos o
antibiticos en el medio de cultivo.
Etapa 2: Multiplicacin
El objetivo de esta etapa es mantener y

aumentar la cantidad de brotes para los nuevos ciclos de multiplicacin sucesivos y poder
destinar parte de ellos a la siguiente etapa
de produccin (enraizamiento, bulbificacin,
etc.). Es importante sealar que en esta etapa, cualquiera que sea la va de regeneracin
empleada, es conveniente evitar la formacin
de callo para disminuir el riesgo de variacin
somaclonal. En esta etapa, los medios de
cultivo, los reguladores de crecimiento como
auxinas, citocininas y cido giberlico y las
condiciones de crecimiento juegan un papel implementacin a escala comercial. Los

crtico sobre la multiplicacin clonal de los biorreactores son equipos que contienen
explantos.
aproximadamente 2 litros de medio de cultiAmbas vas de regeneracin, organog- vo lquido estril y donde los embriones
nesis y embriognesis, pueden darse en for- somticos pueden regenerar y madurar a
ma directa o indirecta. Esta ltima implica la partir de suspensiones celulares, sustentados
formacin de callo. En general, la organo- por la circulacin permanente de nutrientes
gnesis conduce a la produccin de vstagos y de aire (Fig.1). Hoy en da, el empleo de
unipolares que enrazan en etapas sucesivas, biorreactores para la micropropagacin a gran
mientras que por embriognesis somtica se escala est limitado por dos motivos crticos.
forman embriones bipolares
a travs de etapas ontognicas similares a la embriognesis cigtica.
La organognesis puede
darse por induccin de yemas
axilares o adventicias. La induccin de yemas axilares
comprende la multiplicacin
de yemas preformadas, usualmente sin formacin de callo.
La induccin de yemas adventicias comprende la induccin
de tejido meristemtico localizado mediante un tratamiento con reguladores de
crecimiento, conduciendo a la
diferenciacin del primordio y
desarrollo del vstago, esto
ltimo generalmente en au- Figura 1: Embriognesis somtica en zanahoria. A partir de clulas del floema
sencia del regulador de creci- se obtienen los embriones somticos que son un excelente sistema de
miento que indujo la propagacin clonal. Los biorreactores permiten el cultivo a gran escala de
los mismos.(Gentileza Dr. Miguel Pedro Guerra)
organognesis.
La principal desventaja del
primer mtodo es que el nmero de yemas En primer lugar, el declinamiento de las lneas
axilares por explanto limita la cantidad de celulares (clones) por efecto de la variacin
vstagos. Esto se ve compensado, sin embar- somaclonal y segundo, por los altos costos
go, por un aumento en la tasa de multiplica- asociados con la conversin de estos embriocin con los sucesivos subcultivos. La forma- nes somticos en plntulas.
cin de yemas adventicias ofrece mayor poLas condiciones culturales en las cuales
tencial para la produccin de vstagos, ya crece el explanto son el resultado de la
que la induccin de vstagos ocurre en sitios interaccin de tres factores: el estado del
distintos al de los meristemas.
explanto o material vegetal, determinado en
La embriognesis somtica es una va ms parte por el medio de cultivo, el recipiente
conveniente porque permite saltar las eta- de cultivo y el ambiente externo o condiciopas de formacin de yemas y enraizamiento nes de crecimiento del cuarto de cultivo. La
regenerando plantas en una forma mucho capacidad de respuesta de los explantos a
ms rpida y eficiente, disminuyendo adems un mismo medio de cultivo cambia con el
el riesgo de variacin somaclonal. A su vez, la nmero de subcultivos, el tipo de explanto
disponibilidad de protocolos para la obten- subcultivado y el mtodo del repique. Por
cin de embriones somticos es clave para la esto mismo, el medio de cultivo debe
automatizacin de la micropropagacin y la optimizarse a fin de lograr la mayor tasa de
consecuente reduccin de costos para su multiplicacin vegetativa. Comnmente se
165
emplea como medio basal el medio MS completo sugerido por Murashige & Skoog (1962)
suplementado con 3% de sacarosa como
fuente de carbono. A este medio se le adicionan adems reguladores de crecimiento,
tanto del tipo de auxinas como de citocininas.
La etapa de multiplicacin generalmente
comprende dos perodos, la fase de induccin y la fase de multiplicacin propiamente
dicha. La primera implica, generalmente, el
empleo de concentraciones elevadas de reguladores de crecimiento (generalmente de
auxinas ms que citocininas) para favorecer
la desdiferenciacin. La segunda etapa requiere del empleo de un balance hormonal
adecuado para favorecer los procesos de diferenciacin y multiplicacin celular. En este
caso, el sistema es ms dependiente de reguladores del tipo de las citocininas. En algunos casos, como ocurre en la formacin de
embriones somticos, se requiere de una tercera y cuarta etapa, denominadas de maduracin y de germinacin respectivamente,
cuya duracin vara entre 1 a 2 semanas. Para
la etapa de maduracin se adiciona ABA (cido absccico) al medio basal en rangos de 5 a
20 micromolar, seguido del subcultivo a un
medio basal conteniendo AG (cido
giberlico) en concentraciones de 0,1-1
micromolar, cuyo fin es lograr la germinacin
de los embriones obtenidos.
Los tipos de auxinas (a) y citocininas (b) y
los rangos de concentracin ms empleados
se mencionan a continuacin: a) IBA (cido
3-indolbutrico): 0,1-2 M; 2,4-D (cido 2,4diclorofenoxiactico): 4-35 M; AIA (cido 3indolactico): 0,1-2 M ; ANA (cido
naftalenactico): 1-5 M; y, picloram: 1-10
M; b) BA (N6-benciladenina): 1-20 M; CIN
(cinetina): 0,1-1 M; ZEA (zeatina): 1-10 M;
2ip (isopentiladenina): 1-5 M ; y, TDZ
(tidizuron): 0,01-1 M.
Los tipos de reguladores, sus combinaciones y rangos de concentraciones deben ser
optimizados para cada especie, genotipo y
etapa de multiplicacin determinada. Los
cultivos se incuban en luz a 272 C con 14
horas de fotoperodo e intensidad lumnica
moderada (100 mol m-2 s-1).
La presencia de compuestos fenlicos
oxidados se encuentra asociada con tejidos
vegetales sometidos a situaciones de estrs,
tales como aquel provocado por el dao
mecnico producido durante el aislamiento
del explanto de la planta madre.
Estos compuestos se encuentran en ge-
166
neral en las plantas en estado reducido y el

ataque de patgenos producira su oxidacin
y liberacin. Esto inhibira el crecimiento de
los mismos, daando, indirectamente, a los
explantos. Estas sustancias (quinonas,
fitoalexinas y protectores de auxinas) son
muy lbiles y fcilmente oxidables. Por esto
mismo, durante el establecimiento y multiplicacin in vitro es necesario emplear estrategias tendientes a disminuir el estrs de las
plantas y limitar al mnimo la produccin y
oxidacin de los compuestos fenlicos. Para
ello se emplean agentes absorbentes de
fenoles en el medio de cultivo, tales como el
carbn activado y la polivinilpirrolidona o
antioxidantes como el cido ascrbico, la
modificacin del potencial redox con agentes reductores, la inactivacin de las
fenoloxidasas con agentes quelantes o la reduccin de su actividad o afinidad por el
sustrato utilizando un bajo pH, o bien cultivando in vitro en condiciones de oscuridad.
Es recomendable adems lograr que la tasa
de intercambio gaseoso entre los ambientes
del recipiente y externo sea ptima,
evitndose la acumulacin de CO 2 y de
etileno.
En este sentido, el sellado del recipiente
es importante, el intercambio gaseoso es
ms limitado con el empleo de una tapa de
plstico que con un film de polietileno extensible. La utilizacin de una tapa perforada con
tapn de gomaespuma es altamente recomendable (Fig. 2).
Los principales problemas que pueden
presentarse durante los sucesivos subcultivos
in vitro son la vitrificacin y la produccin
de compuestos fenlicos por los explantos.
La vitrificacin consiste en un proceso de
morfognesis anormal con cambios anatmicos, morfolgicos y fisiolgicos que producen hojas de una apariencia vidriosa. Este fenmeno est regulado por dos factores clave que son la humedad relativa y el potencial agua, y afecta a dos procesos fisiolgicos
fundamentales: la fotosntesis y la transpiracin. Debido a la disfuncin metablica asociada, las plantas se vuelven hetertrofas y
transpiran excesivamente debido a un mal
funcionamiento estomtico y a cambios estructurales en las paredes celulares. La principal consecuencia de la vitrificacin es la baja
supervivencia de las plntulas obtenida du-
Figura 2: Plantas de tabaco creciendo in vitro en un

recipiente de vidrio con tapa metlica perforada y tapn
de gomaespuma, que evita la acumulacin de CO2, etileno
y excesiva humedad en el ambiente de cultivo.
rante la aclimatacin ex vitro. Por ello, es fundamental conocer el rol de los distintos factores que inciden negativamente sobre el
desarrollo morfognico normal (auttrofo) in
vitro. Estos factores son el ambiente de cultivo, los componentes orgnicos e
inorgnicos del medio, los reguladores de crecimiento, la luz y la temperatura. Una baja
humedad relativa, elevada irradiacin, la remocin de la fuente de carbohidratos del
medio de cultivo y la defoliacin de las plantas para estimular la formacin de hojas nuevas estimulan la fotosntesis y otras actividades metablicas de las hojas en forma normal. Otras estrategias para lograr un ptimo
crecimiento implican el empleo de retardantes del crecimiento para estimular la formacin de hojas nuevas despus del
transplante. O bien, el empleo de altos niveles de CO2 (antagonista del etileno) para estabilizar la va de lignificacin y prevenir la
vitrificacin a travs de la inhibicin de la
hiperhidratacin, la hipolignificacin y la formacin de aernquima.
Etapa 3: Enraizamiento y aclimatacin
En esta etapa se produce la formacin de

races adventicias. En las especies herbceas
es relativamente fcil mientras que en las
especies leosas es complicado por su limitada capacidad rizognica.

El enraizamiento puede realizarse tanto
en condiciones in vitro como ex vitro. En el
primer caso pueden emplearse varios tipos
de sustratos y reguladores de crecimiento
(auxinas) para promover la rizognesis. Los
sustratos incluyen: medio solidificado con
agar, perlita y/o vermiculita humedecidas con
medio nutritivo o agua. En un medio solidificado con agar, los nutrientes se reducen de
1/2 a 1/4 de la composicin original, y la sacarosa se reduce a una concentracin final
de 1-2%. Medios con baja concentracin salina, como el WPM (Lloyd & Mccown, 1980) y
GD (Gresshoff & Doy, 1972), incrementan el
porcentaje de enraizamiento de vstagos
axilares en plantas latifoliadas. El empleo de
agar presenta ventajas y desventajas sobre
la rizognesis. Por un lado, el enraizamiento
de especies forestales en agar se favorecera
al producirse una rizognesis ms sincrnica
como resultado del contacto ntimo de las
estacas con el medio de cultivo. Sin embargo, las races producidas por este mtodo son
usualmente delgadas y no se forman races
cabellera. Adicionalmente, el empleo de agar
est asociado con la formacin de callo en la
base de las estacas, que conduce al establecimiento de conexiones vasculares interrumpidas entre races y vstagos.
Comnmente, a fin de proceder a su
enraizamiento, los vstagos de buen tamao provenientes de la etapa de multiplicacin y provistos de al menos 4-5 yemas, se
colocan durante perodos cortos en soluciones con concentraciones elevadas de auxinas.
La auxina ms utilizada es el IBA (cido 3indolbutrico), que puede utilizarse a concentraciones de 1-10 M durante pocas horas.
Alternativamente se pueden emplear niveles ms bajos de auxinas (0.1 a 1M ), pero
manteniendo la induccin por un perodo
ms prolongado (3 a 7 das). Luego los vstagos se transfieren a un medio de cultivo
basal desprovisto de reguladores de crecimiento para permitir el desarrollo de las races. Aproximadamente 20 das despus del
tratamiento de induccin es posible la obtencin de una adecuada cantidad de races
funcionales que permitan continuar hacia la
etapa de aclimatacin.
Es importante acentuar que el uso de
167
auxinas a elevadas concentraciones es contraproducente porque induce la formacin de

callo en la base de las estacas. Por ello, para
cada cultivo es necesario optimizar un protocolo de rizognesis que minimice la formacin de callo y maximice la tasa de rizognesis
y supervivencia de las plantas.
El enraizamiento ex vitro permite que el
enraizamiento y aclimatacin se logren simultneamente y que raramente se forme callo
en la base de las estacas, asegurando as una
conexin vascular continua entre el vstago
y la raz. Sin embargo, el estrs asociado a la
evapotranspiracin acelerada de las plantas
durante las etapas iniciales del trasplante
puede reducir considerablemente la tasa de
supervivencia. Por ello, es conveniente contar con instalaciones de invernadero o cmaras de crecimiento adecuadas para brindar
temperatura y humedad relativa moderadas,
que permitan lograr la rusticacin de las plantas en forma progresiva. Bajo condiciones ex
vitro se utilizan diferentes sustratos, mezclas
de tierra y arena y/o abonos, los cuales conviene que estn debidamente esterilizados.
3 Propagacin de especies leosas
El empleo de clones en programas de
reforestacin genera al menos un 10 % de
incremento en ganancia gentica en relacin
con el empleo de plantas regeneradas por
semillas de rboles selectos. Sin embargo, la
mxima ganancia gentica puede ser obtenida mediante el empleo conjunto de propagacin sexual y agmica. La reproduccin
sexual es importante para la introduccin de
genes nuevos, prevenir los efectos de la
endogamia y el mejoramiento de caractersticas controladas por efectos aditivos de
genes. La reproduccin asexual, por otro
lado, permite la multiplicacin de individuos
o grupos de individuos seleccionados de una
poblacin lite, que exhiben una significativa ganancia gentica debida a efectos no
aditivos de genes.
Tradicionalmente, las especies forestales
fueron propagadas vegetativamente mediante el enraizamiento de estacas, de
braquiblastos en conferas, as como tambin
por injertos. La propagacin por estacas de
Cryptomeria japonica (kiri), Populus (lamo)
y Salix (sauce) ha sido llevada a cabo duran-
168
te siglos en Asia y Europa. Sin embargo, para

la mayora de los rboles propagados por estacas se observa una rpida prdida de capacidad de rizognesis al aumentar la edad
de la planta donante de las estacas. En este
sentido, una de las principales ventajas de la
micropropagacin es la capacidad potencial
de desarrollar protocolos de multiplicacin
optimizados para multiplicar rboles adultos
que han demostrado ser fenotpicamente
superiores.
3.1 Mtodos de Micropropagacin
Los trabajos pioneros en el cultivo de tejidos cambiales de especies forestales condujeron, en el ao 1940, a la formacin de yemas adventicias en Ulmus campestris. Durante la dcada del 40 se publicaron logros adicionales en al produccin separada de vstagos y races en especies latifoliadas. En 1950
se public por primera vez la obtencin de
organognesis en conferas, con la formacin
de vstagos a partir de callos de Sequoia
sempervirens. En la dcada 1970-80 se obtuvieron las primeras plantas de lamo
(Populus tremuloides) y Pinus palustris. En
ambos casos la formacin de plntulas se logr va organognesis. Luego del ao 1975
la micropropagacin de especies latifoliadas
se realiz a travs de la regeneracin indirecta, pasando por una etapa de callo.
Actualmente, la multiplicacin in vitro de
conferas y latifoliadas se logra a travs de
tres vas, 1) brotacin de yemas adventicias,
2) produccin de yemas adventicias y 3)
embriognesis somtica.
La brotacin de yemas adventicias emplea pices de vstagos, yemas laterales y
microestacas. Es el principal mtodo utilizado para especies latifoliadas. En las conferas, la elongacin de las yemas axilares a partir de braquiblastos de plantas adultas no ha
sido muy exitosa. En latifoliadas de clima templado los mejores explantos los constituyen
las yemas y vstagos en activo crecimiento
ms que las yemas en estado de dormicin.
Los vstagos se colectan en primavera y a
principios del verano a fin de obtener material con reducido nivel de contaminacin. Alternativamente, las yemas en dormicin pueden ser colectadas y brotadas en condiciones ambientales controladas.
Para la induccin de vstagos, tanto en

gimnospermas como en angiospermas, se
requiere el empleo de citocininas. Las ms
usadas son la N6-benciladenina (BA) y el
tidiazurn (TDZ).
Los medios basales ms usados para
angiospermas son el MS (Murashige & Skoog,
1962) o el WPM (Lloyd & Mccown, 1980). Para
el caso de gimnospermas, el empleo de medios reducidos en sales minerales y baja cantidad de nitrgeno resulta mucho mejor que
el empleo de un medio altamente salino y
nitrogenado como el MS.
La induccin de yemas adventicias es el
mtodo ms empleado para gimnospermas
y angiospermas. En este caso, las yemas se
inducen directamente sobre el explanto en
general sin previo pasaje por una etapa de
callo. En general, cuanto ms joven es el tejido, tanto mayor es la respuesta a los tratamientos que conducen a la organognesis de
novo. Los explantos ms frecuentes son
embriones cigticos maduros, seguidos de
cotiledones y epictilos de plntulas. Generalmente se utiliza BA a concentraciones
mayores o iguales a 5 ppm como nica fuente de induccin o en combinacin con otras
citocininas. La adicin de auxinas puede ser
beneficiosa, aunque en conferas se ha encontrado que promueve la formacin de callo y reduce el proceso de organognesis.
En algunos casos, como en Populus spp.,
la formacin de yemas adventicias se logra a
partir de un callo originado a partir de tejido
cambial.
El mtodo llamado multiplicacin mediante ndulos meristemticos es un mtodo
tambin utilizado para pino radiata y lamo.
En este caso se obtiene bsicamente un tejido meristemtico (no un verdadero callo)
usando relaciones altas de auxina/citocinina
para luego inducir la produccin de vstagos.
La disponibilidad de protocolos va
embriognesis somtica para especies forestales es an limitada. En las angiospermas los
primeros embriones somticos se obtuvieron
de Santalum album, donde sin embargo no
fue posible la obtencin de plantas completas. Veinte aos despus pudieron lograrse
plantas completas de abeto (Picea abies),
una gimnosperma. En las gimnospermas los
mayores xitos se lograron empleando como
explantos embriones cigticos maduros e
inmaduros. En la mayora de los casos los

embriones se originan en forma indirecta a
partir de callos embriognicos o bien, directamente, desde el explanto. En las conferas
puede ocurrir un proceso de poliembriona,
previa formacin de callo que conduce a una
alta tasa de multiplicacin inicial. En general,
los medios de cultivo ms efectivos para estos fines contienen elevados niveles de sales
y suministran nitrgeno tanto como NH4+ y
NO3-. Las auxinas ms comnmente empleadas en el medio de induccin son el 2,4-D
(cido 2,4-diclorofenoxiactico) y el ANA (cido naftalenactico), en concentraciones mayores de 2 M. En algunos casos es necesario
adems el empleo de alguna citocinina, generalmente en concentraciones mayores a 1
M si se trata de BA y entre 0,1-1 M en el
caso del TDZ.
3.2 Condiciones de cultivo
Los explantos jvenes de especies leosas, particularmente angiospermas, a menudo secretan al medio de cultivo polifenoles
oxidados, visibles como pigmentos marrones
y/o negros. Se observa tambin que en los
explantos de rboles adultos el problema se
acenta. Por ello se recomienda el empleo
de explantos primarios juveniles.
Los tipos de explantos ms utilizados
para el establecimiento in vitro son los segmentos nodales de explantos juveniles, las
yemas axilares obtenidas por rejuvenecimiento de plantas adultas, y los embriones
cigticos y plntulas obtenidas de semillas de
origen sexual.
La desinfeccin de los mismos se logra
mediante inmersin en etanol al 70 % (1 a 2
minutos) seguido de una solucin de
lavandina comercial conteniendo de 0,8 a 2,4
% de hipoclorito de sodio durante 5-30 minutos. En la mayora de los casos se emplean
agentes tensoactivos, tales como Tritn y
Tween20 , adicionados en la solucin de
lavandina. En todos los casos los explantos
son lavados finalmente varias veces con agua
destilada estril.
Los medios basales ms empleados son
el MS, formulado por Murashige & Skoog
(1962), diludo a la mitad o a un cuarto de su
formulacin original o el WPM, formulado por
Lloyd & McCown (1981). Como medios de
169
blanco y negro
Figura 3: Etapas de la micropropagacin en plantas de paraso gigante, Melia azedarach var. gigantea L. (Olmos
et al., 2002): A) Huerto semillero de paraso gigante con ejemplares de seis aos de edad, provincia de Misiones,
Danzer Forestacin S.A. Las semillas de los genotipos seleccionados fueron empleadas para generar una poblacin
de plantas donantes de explantos. B) Etapa 0, Preparacin del material vegetal: plantas de origen sexual de 6 meses
de edad crecidas en condiciones de invernadero y utilizadas como donantes de meristemas. C) Etapa 1: Establecimiento
del cultivo: vstagos desarrollados a partir de meristemas luego de 30 das sobre medio de establecimiento (Medio
basal de Murashige y Skoog, 1962 (MS) suplementado con 2,22 M 6-bencil amino-purina (BAP) + 0,29 M cido
giberlico (GA3) + 0,25 M cido 3-indolbutrico (IBA). D) Etapa de Multiplicacin: vstagos luego de 30 das sobre
medio de multiplicacin (medio MS suplementado con 2,22 M BAP, estos vstagos fueron empleados como
explantos para los subcultivos siguientes o para pasar a la etapa de enraizamiento. E) Explantos provenientes de la
etapa de multiplicacin con problemas de vitrificacin y presencia de callo. En estos casos, el medio de multiplicacin
para los cultivos subsiguientes fue modificado reduciendo la concentracin de BAP a 0,44 M. F) Vstago enraizado
en medio de MS con la concentracin salina reducida a la mitad, suplementado con 9,89 M IBA durante 2 das,
seguido por el subcultivo en medio basal durante 30 das hasta estar listo para pasar a la etapa de aclimatacin.
multiplicacin se emplean adems el BTM

(broadleaved tree medium, Chalupa, 1983)
y el medio de Prinet y Lalonde (1983). Los
reguladores de crecimiento ms utilizados son
el cido naftale-nactico (ANA) y la
benciladenina (BA). Tambin han sido efectivas auxinas como el cido indol-butrico (IBA)
y el cido 2,4-diclorofenoxiactico (2,4-D) y
citocininas como la 2- isopentil amino purina
(2iP), cinetina (CIN), zeatina (Z) y tidiazurn
(TDZ).
En general, los cultivos se incuban a 272
C con 14 horas de fotoperodo e intensida-
170
des lum-nicas moderadas.

En la Fig. 3 se muestran las etapas de la
micropropagacin de plantas de paraso gigante, Melia azedarach var. gigantea L. (Olmos et al., 2002).
3.3 Problemas asociados a la
micropropagacin de especie leosas
Es mucho ms difcil propagar material
adulto que juvenil ya que los primeros son
recalcitrantes, es decir, difciles de regenerar.
Sin embargo, an en estos casos es posible
extraer ex-plantos de mayor capacidad

regenerativa mediante dos formas: 1) seleccionando los tejidos ms juveniles dentro de
un rbol o 2) induciendo el rejuvenecimiento del rbol donante antes de aislar los
explantos.
Para seleccionar el material ms juvenil en
una planta adulta hay que considerar el fenmeno de topfisis. Este es un proceso por
el cual el tipo de crecimiento de un nuevo
individuo est determinado por la posicin
que ocupaba en la planta adulta. Esto es ocasionado por efecto del envejecimiento fisiolgico e implica que los explantos ms
reactivos in vitro se encuentran en las yemas
de las reas basales del tronco y races.
A su vez, el rejuvenecimiento es un proceso de reversin temporaria de las caractersticas adultas que permite lograr material
vegetal en estado de juvenilidad. En general, a fin de contrarrestar los efectos debidos
a la topfisis, se recomienda emplear tejidos
juveniles y un tamao de explanto muy pequeo.
La juvenilidad puede lograrse por dos
mtodos. En primer lugar, mediante el empleo de rganos juveniles separados de plantas adultas, la utilizacin de estacas
enraizadas o bien de brotes epicrmicos. En
segundo lugar, mediante el rejuvenecimiento de partes adultas, la iniciacin de yemas
adventicias y embriones (en este caso se logra un rejuvenecimiento total por el inicio de
un nuevo ciclo ontognico), del injerto de
yemas adultas sobre pies juveniles, de tratamientos con reguladores de crecimiento
(como citocininas como el BA), por la poda
severa (recepado de rboles adultos) y a travs del cultivo in vitro de meristemas.
Tanto los atributos de supervivencia a
campo, como la tasa de crecimiento, el
plagiotropismo y la susceptibilidad a enfermedades de las plantas, tienen una correlacin directa con la calidad de los vstagos
durante el cultivo in vitro. Un problema crucial
a resolver en cada sistema de propagacin
es la calidad diferencial de las races de las
plantas regeneradas en relacin con aquellas obtenidas por semillas. Por ejemplo, las
plantas regeneradas de Pinus elliotti suelen
tener una raz principal no ramificada y gruesa. En cambio, las plantas obtenidas a travs
de semillas tienen races ms delgadas y de
mayor crecimiento lateral que permiten comparativamente un mejor anclaje y una mayor resistencia a los vientos.
4 Propagacin de especies herbceas
La micropropagacin de especies herbceas est orientada a proveer material libre
de patgenos, propagar material seleccionado por su mayor rendimiento o por su mayor resistencia a enfermedades y estreses
ambientales, conservar la diversidad especfica en bancos de germoplasma, obtener
material para estudios fisiolgicos y genticos
y sentar las bases para la aplicacin de tcnicas de ingeniera gentica.
Existe una gran variedad de protocolos,
desarrollados en funcin de la especie y de
los objetivos de la propagacin. Existen protocolos generales para monocotiledneas
como en el caso ciertos cereales (trigo, maz,
cebada, avena, arroz), pasturas (pasto
bermuda, festuca alta, raigrs, pasto llorn)
y hortcolas (cebolla, ajo, puerro); protocolos generales para dicotiledneas que incluyen especies hortcolas (tomate, papa, pimiento y zanahoria) y leguminosas forrajeras
(alfalfa, man, trbol blanco) y protocolos
para especies modelo como Arabidopsis y
tabaco.
En todos los casos, las formas de propagacin son las mismas. Se emplean vas de
regeneracin por formacin de yemas
axilares, yemas adventicias y embriognesis
somtica. En los dos primeros casos, el sistema de propagacin a travs de la organognesis directa asegura la estabilidad gentica
de las plantas regeneradas y se emplean
cuando el objetivo es la propagacin clonal
a gran escala. La embriognesis u organognesis indirecta, con formacin de callo, se
emplea en cambio para generar variabilidad
en programas de mejoramiento.
En el caso de ajo y cebolla, por ejemplo,
las etapas de la micropropagacin incluyen
tanto la multiplicacin de yemas axilares por
el cultivo de meristemas, la formacin directa de yemas adventicias en explantos obtenidos a partir de placas basales o umbelas
inmaduras y la formacin indirecta de yemas
adventicias y/o embriones somticos obtenidos a partir de callos que provienen de distintos tipos de explantos (meristemas, bro-
171
tes, placa basal races). En el caso de alfalfa

y otras leguminosas como soja y man, la
micropropagacin es llevada a cabo por la va
de la embriognesis somtica, donde los
embriones se obtienen utilizando tejidos juveniles (embriones, cotiledones y pecolos)
como explantos. En algunos casos como pasto llorn (Eragrostis curvula) es posible la
regeneracin de plantas mediante embriognesis, organognesis y regeneracin directa
a partir de los explantos.
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172
V.-Captulo 2
Semilla sinttica
Rey, Hebe Y.; Mroginski, Luis A.
1 Concepto
Resulta difcil determinar como se origin
la idea de producir semillas sintticas o artificiales. Estas son el resultado de la aplicacin
en agricultura del fenmeno de embriognesis somtica, descripto por primera vez en
1958 por Jakob Reinert y F.C.Steward y colaboradores. Sin embargo, un gran propulsor
de su utilizacin para la propagacin a gran
escala de plantas fue Toshio Murashige, quien
en un simposio realizado en 1977 en Ghent
(Blgica) present formalmente la idea de la
produccin de las semillas sintticas, entendiendo como tal a un simple embrin somtico encapsulado. Esta semilla se diferencia
de la semilla verdadera en que el embrin es
somtico (producido por el fenmeno conocido como embriognesis somtica) y no
cigtico, y que si tiene endosperma y cubierta, stos son artificiales (Fig.1 a y b). Esta semilla, puesta en condiciones adecuadas, germina (Fig.1 c) y se convierte en una planta
(Fig.1 d). Muchos grupos de investigacin han
contribuido al desarrollo de tales semillas.
Entre ellos se deben destacar el grupo
liderado por Keith Walker de la Compaa
Monsanto, quien a partir de mediados de la
dcada que va de 1970 a 1980 trabaj especialmente con alfalfa. Tambin hay que mencionar la labor de Robert Lawrence de la
Union Carbide, quienes comenzaron los trabajos con especies forestales, lechuga y apio.
Otros investigadores como Drew, Kitto y
Janick realizaron sus trabajos con zanahoria.
El aporte del grupo liderado por Keith
Redenbaugh de la Plant Genetic Inc. fue muy
importante, especialmente por su descubrimiento de que hidrogeles como el alginato
de sodio podan utilizarse para producir semillas artificiales que podan germinar en condiciones de invernadero.
Existe otro tipo de semilla sinttica, diferente del definido ms arriba, donde, en lu-
Figura 1: a) Partes de una semilla sinttica. b, c y d)

Obtencin de plantas de Arachis pintoi (2n=3x=30)
mediante semillas sintticas (las barras verticales indican
3 mm).
gar de encapsular embriones somticos se

encapsulan yemas. Este tipo de semillas sintticas de una utilizacin muy restringida
no ser tratado en este captulo.
2 Tipos de semillas sintticas
Las semillas sintticas pueden fabricarse
de diferentes maneras (Fig. 2). Bsicamente
pueden utilizarse embriones hidratados, tal
como resultan del proceso de embriognesis
somtica, o bien pueden ser desecados. En
algunos casos estos embriones estn protegidos por cubiertas protectoras. De esta manera se pueden distinguir 5 tipos bsicos de
semillas sintticas:
1) Semillas sintticas con embriones
desecados sin cubierta (Tipo 1, Fig. 2). Se
173
de los embriones somticos tal como resultan del proceso de embriognesis somtica,
sin ningn tipo de cubierta protectora. Este
sistema ha sido desechado en la prctica por
la escasa conversin de embriones en plantas.
4) Semillas sintticas con embriones
somticos hidratados suspendidos en un gel
viscoso (fluid drilling)(Tipo 4,
Tabla 1: Ejemplos de semillas sintticas basadas en la desecacin de Fig. 2). Inicialmente fue desarrollaembriones sin cubierta protectora.
do en zanahoria y ms recientemente en batata; consiste en la
Especie
% humedad en la semilla % conversin en plantas
inclusin de varios embriones en
Apium graveolens
10-13
35-85
una especie de tubo que contieDactylis glomerata
13
5-30
Medicago sativa
8-20
33-95
ne un gel viscoso.
5) Semillas sintticas con
dad de este tipo de embriones por un ao, embriones somticos hidratados y provisaproximadamente, en condiciones de labo- tos de una cubierta protectora (Tipo 5, Fig.
2). Es el sistema ms usado. Por esta razn,
ratorio.
2) Semillas sintticas con embriones de aqu en adelante, cuando se mencione
somticos desecados y provistos de cubier- semilla sinttica se referir a este tipo. Tieta protectora (Tipo 2, Fig. 2). Esta tcnica ha ne la ventaja de que los embriones no estn
sido utilizada en zanahoria y apio, donde los sujetos a la desecacin, que constituye la prinembriones fueron recubiertos con cipal causa de los bajos valores de conversin
polyoxietileno y luego desecados. Los resul- en plantas. Si bien se han ensayado numetados han mostrado que es factible lograr rosas sustancias para encapsular a los embriouna buena supervivencia de stos; sin embar- nes somticos (agar, gelrite, gomas), una de
go, la conversin en plantas es realmente la tcnicas ms utilizadas consiste en lograr
la formacin de una cubierta protectora de
baja.
3) Semillas sintticas con embriones alginato de calcio, compuesto que no es txihidratados sin cubierta (Tipo 3, Fig. 2). Es el co para el embrin y permite una rpida
sistema ms simple; consiste en la utilizacin encapsulacin. El proceso es muy simple y
consiste bsicamente en sumergir a los
embriones somticos en una solucin de
Explante
alginato de sodio al 2%, pasndolos luego a una solucin acomplejante de, por
Cultivo e induccin de la
ejemplo, 100 mM de Ca (NO3)2 (Fig. 3).
embriognesis somtica
Con esta tcnica se genera una semilla
sinttica consistente en un embrin somtico recubierto con una cubierta
Embriones somticos
seminal y provisto de un endosperma
artificial (Fig.1 a y b). Eventualmente esDesecados
tas cpsulas pueden ser recubiertas por
Hidratados
sustancias tales como polioxieti-lenglicol,
que sirve para mantener una adecuada
Gel Viscoso Encapsula do hidratacin de las cpsulas y embriones.
Encapsulado
Este procedimiento ha posibilitado la
obtencin de semillas sintticas de nu1
2
3
4
5
merosas especies de inters econmico,
entre las que pueden mencionarse alfalSiembra en el suelo
fa, zanahoria, apio y especies forestales
como Picea abies, Pinus radiata,
Figura 2: Tipos de semillas sintticas.
Santalum album y Pseudotsuga
trata de un sistema muy simple donde los
embriones son desecados hasta alcanzar
porcentajes de humedad del 8 al 20% y no
estn provistos de ningn tipo de cubierta
protectora. En el caso de alfalfa, embriones
sometidos a la desecacin mostraron porcentajes de conversin en plantas de hasta el
95% (Tabla 1). Es posible mantener la viabili-
174
REY, Hebe Y.; MROGINSKI, Luis A.
tores que regulan

la
embriognesis
somtica. Sin
embargo, en
muchos casos, la base
A
B
C
D gentica de
este fenmeno no est
completamente dilucidado. En alI
E
falfa es un carcter hereF
H
G
dable, codificado por dos
genes dominantes de segregacin independiente.
Una vez
inducida la
Figura 3: A-D) Induccin de la embriognesis somtica,E)) seleccin de embriones somticos, F) embriognesis
inmersin de los embriones en alginato de sodio,G) acomplejamiento con nitrato de calcio, H)
somtica, el
lavado, I) semilla sinttica (i)
segundo
menziesii.
3 Produccin de semillas sintticas
En la Fig.4 se esquematizan 6 aspectos
que deben tenerse en cuenta para la produccin y manipulacin de las semillas sintticas.
En primera instancia es necesario contar
con un sistema eficiente de induccin de
embriognesis somtica in vitro, es decir, la
produccin de embriones sin la necesidad de
la fusin de gametas. Estos embriones deben ser estructuras bipolares perfectas (con
un polo que genere el vstago y el otro la
raz) capaces de convertirse (germinar) en
plantas enteras (ver II.-2).
Si bien la existencia de embriognesis
somtica ha sido informada en centenares
de especies de angiospermas y gimnospermas, en muchos casos no es de utilidad
para iniciar la produccin de semillas sintticas debido a la baja tasa de produccin de
embriones aptos para la encapsulacin.
En los ltimos aos se han hecho notables avances en el conocimiento de los fac-
Induccin de la embriognesis somtica
Produccin sincronizada y en gran escala de los

embriones somticos
Maduracin de los embriones somticos
Encapsulamiento mecanizado
Almacenamiento de las semillas sintticas
Siembra en invernadero o a campo

Figura 4: Etapas en la produccin de las semillas
sintticas.
175
paso consiste en lograr una produccin

sincronizada, a gran escala, de los embriones.
Es fundamental contar con embriones simples, en estado cotiledonar, que no se fusionen entre s y que no generen embriones secundarios. A fin de seccionarlos se han desarrollado diferentes procedimientos basados
en filtros y equipos clasificadores automticos. Para la produccin a gran escala se han
diseado biorreactores y sistemas mecanizados de encapsulamiento adaptados a las
particularidades de cada especie.
Gran parte de la investigacin se halla
centrada en lograr una adecuada maduracin
de los embriones, que es un factor esencial
para la obtencin de altos valores de conversin en el suelo. En alfalfa se ha demostrado la necesidad del empleo de tratamientos con cido abscsico, maltosa y de
pretratamientos con temperaturas bajas
(4C).
El almacenamiento de las semillas sintticas es otro aspecto importante a tener en
cuenta. Lo ideal sera que las semillas sintticas tuvieran un comportamiento similar al de
la mayora de las semillas verdaderas y permanecieran viables por mucho tiempo. Los
resultados obtenidos con semillas sintticas
de muchas especies muestran que an hay
que trabajar arduamente para que ello ocurra. La criopreservacin con nitrgeno lquido (ver V.3) podra resolver este punto.
Por ltimo, si bien muchos factores inciden negativamente para que ello ocurra, lo
ideal sera que la semilla sinttica fuera sembrada directamente en el suelo, rindiendo
elevados porcentajes de conversin en plantas. Actualmente, en la mayora de los casos,
las semillas sintticas son sembradas primeramente en cmaras climatizadas o en invernaderos para luego ser llevadas al campo.
contra agentes patgenos.

Generalmente, la carencia de embriones
de calidad es el factor limitante para la produccin de semillas sintticas. Los mismos
deben poder generarse rpidamente, en
grandes cantidades, sin fusionarse entre s ni
formar callos. Deben desarrollarse de manera sincronizada y convertirse rpidamente en
plantas. Es adems altamente deseable que
conserven su viabilidad por largo tiempo en
condiciones de laboratorio o preservados en
refrigeradores comerciales.
El endosperma sinttico tiene que proteger y nutrir al embrin hasta que germine y
pueda crecer autotrficamente. En este punto es preciso recordar que si bien los embriones somticos son muy similares a los embriones cigticos, carecen de las sustancias de
reserva necesarias para su conversin en
plntulas. El endosperma sinttico generalmente est compuesto de los mismos medios de cultivo que se usan para inducir la
germinacin in vitro de los embriones. Estos
medios contienen macro y micronutrientes,
vitaminas, sacarosa y sustancias reguladoras
de crecimiento. La composicin de este
endosperma lo hace susceptible al ataque de
patgenos, por lo que tambin se incorporan compuestos de accin fungicida y
bactericida. Es comn el agregado de 1-5 mg/
L de benomyl y de algunos antibiticos como
cefotaxina o ampicilina.
La dureza de la cpsula puede afectar, por
accin mecnica o por dificultar la respiracin,
la conversin de los embriones en plantas.
En general, la dureza debe ser del orden de
0,2 y 2 Kg/cm2 de presin, y puede obtenerse
mediante una adecuada manipulacin de la
concentracin de alginato y de los tiempos
de la reaccin de acomplejamiento.
4 Calidad de la semilla sinttica
5 Ventajas del empleo de semillas

sintticas
Otro aspecto de gran importancia tecnolgica es el contar con semillas sintticas que,
adems de no generar variantes somaclonales, tengan un alto porcentaje de conversin en plantas cuando stas son sembradas
en el suelo. Este aspecto se ve afectado por
varios factores, entre los que figuran el tipo
de embrin, la calidad del endosperma sinttico, la dureza de la cpsula y la proteccin
La mayora de las plantas de inters econmico son propagadas mediante semillas

verdaderas. Estas constituyen excelentes
propgulos que pueden ser producidos a bajo
costo, en forma rpida, y pueden ser sembrados mecnicamente. Adems, la mayora
de ellas pueden ser conservadas fcilmente
por mucho tiempo. Sin embargo, existen
muchas plantas que no se propagan median-
176
te semillas verdaderas y lo hacen a travs de

sus partes vegetativas, como es el caso, entre otras, de la caa de azcar, mandioca,
ajo, frutilla, papa, batata, varios rboles y
plantas ornamentales. Otras especies tienen
semillas de baja calidad (muchas conferas) o
presentan dificultades para la germinacin
(como, por ejemplo, la yerba mate). En otras
un alto grado de heterocigosis hace que las
poblaciones derivadas de semillas sean muy
heterogneas (t, yerba mate, paraso), lo
que hace muy recomendable su propagacin
asexual. Tambin es el caso de muchos
hbridos y de plantas que no producen semillas verdaderas o bien el caso de ciertas plantas transgnicas. En todas estas situaciones
el uso de semillas sintticas resultara ventajoso. Las plantas podrn ser clonadas y sembradas en el campo utilizando sembradoras
similares a las que hoy se emplean con las
semillas verdaderas. Adicionalmente las semillas sintticas podrn actuar como transportadoras de reguladores de crecimiento,
microorganismos y pesticidas que se quieran
incorporar durante la siembra. De esta manera, los costos de los transplantes se vern
reducidos, las poblaciones sern genticamente uniformes y podrn ser comercializados ciertos hbridos resultantes de costosas manipulaciones manuales.
En la Tabla 2 se sealan algunas especies
para las cuales sera necesario contar con un
sistema de semilla sinttica.
La falta de una difusin masiva de esta
tecnologa en la actualidad obedece a razones tcnicas, ya que en muchas especies an
no se ha logrado inducir eficientes sistemas
que permitan la generacin de grandes cantidades de embriones somticos de calidad,
y econmicas. Los clculos realizados en rela-
Tabla 2. Necesidad de contar con semillas sintticas en algunas plantas leosas

subtropicales de inters para la Argentina y estado actual de su desarrollo.
Especie
Agua
(Chrysophyllum
gonocarpum )
Araucarias
(Araucaria spp.)
Algarrobo
(Prosopis spp)
Ctricos *
(Citrus spp.)
Eucaliptos*
(Eucalyptus spp.)
Mango
(Mangifera indica)
Paraso
(Melia azedarach)
Pinos* (Pinus spp.)
Quebracho
(Schinopsis
balansae)
T
(Camellia sinensis)
Toona (Toona
ciliata)
Yerba mate (Ilex
paraguariensis)
Estado de desarrollo
Estado de
Inters en contar con de la induccin de la desarrollo de la
semillas sintticas
Embriognesis
produccin de la
Somtica
semilla sinttic
a
XXX
---
XXX
XX
---
XXX
---
---
XX
XXX
XXX
---
XX
---
XXX
XX
XXX
XX
XX
---
X
---
XXX
XXX
---
XXX
---
---
XXX
---
Ref.:
* depende de la especie --- Nulo, X
escaso,
XX
regular, XXX elevado
177
cin a alfalfa indican que su costo de produccin supera en casi cien veces el costo de produccin de la semilla verdadera. Sin embargo, este costo es casi similar o incluso inferior
al de la produccin de semillas verdaderas
para algunos hbridos de alcaucil, geranio y
gerbera.
6 Conclusiones
Si bien el uso de semilla sinttica en la
agricultura es an incipiente y slo es utilizada en ciertos grupos de rboles forestales,
las perspectivas para esta tecnologa son altamente promisorias, pudiendo llegar a convertirse, en un futuro cercano, en el principal
mtodo de propagacin de plantas. Si bien
los progresos logrados en los ltimos 20 aos
han sido notables, existe an la necesidad
de realizar estudios bsicos sobre embriognesis somtica para luego abordar los aspectos industriales de la produccin a gran escala de semillas sintticas, tanto de
angiospermas como de gimnospermas. En la
Argentina, la mayor demanda proviene del
sector de productores de plantas leosas,
donde el desarrollo de esta tecnologa es an
incipiente (Tabla 2). Existe, sin embargo, la
capacidad tcnica y humana para encarar
este desafo.
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178
V.-Captulo 3
Conservacin de germoplasma in vitro
Scocchi, Adriana; Rey, Hebe
1 Introduccin
Desde sus inicios, el hombre ha dependido bsicamente de los vegetales como fuente de energa. Al aumentar rpidamente el
tamao de la poblacin, se han ido
implementando tcnicas de explotacin, en
particular agropecuarias, que han contribuido a la destruccin de las poblaciones vegetales pioneras, que fueron el producto de siglos de evolucin. Por otro lado, las tcnicas
modernas de produccin de variedades
mejoradas, altamente homogneas, han
provocado la reduccin de la variabilidad
gentica de las especies cultivadas, ocasionando una verdadera erosin gentica.
Es en este contexto en que se recurre a
las fuentes genticas originales de variabilidad, las que se deben preservar adecuadamente. Cuando se habla de preservacin de
germoplasma hay que subrayar que el objetivo es conservar, con la mayor integridad
posible, la variabilidad gentica de las poblaciones seleccionadas.
2 Mtodos empleados para la
conservacin de germoplasma
La estrategia a seguir para la conservacin
de germoplasma depende de la naturaleza
del material vegetal, y est definida por la
duracin de su ciclo de vida, el modo de reproduccin y el tamao de sus individuos. De
acuerdo con estas caractersticas se han intentado diversas alternativas de conservacin, que van desde el tradicional banco de
semillas hasta el mantenimiento de reas de
reserva. Sin embargo, en muchos casos el
mantenimiento no es posible y en otros resulta sumamente costoso, siendo muy elevados los riesgos de prdidas por manipulacin o desastres naturales. Por ello se ha buscado implantar nuevas estrategias para conservar los recursos genticos en una forma
ms eficiente.
Los mtodos de conservacin de

germoplasma pueden dividirse en mtodos
in situ y mtodos ex situ.
Los primeros se basan en la conservacin
de las plantas en sus hbitat naturales e incluyen la conservacin en parques nacionales y en reservas ecolgicas, lo cual requiere
de un considerable espacio fsico e implica
altos costos, asociados a la necesidad de
mano de obra especializada, control permanente de enfermedades y malezas, a la par
que las plantas estn expuestas a las inclemencias del clima y de los incendios. Por otra
parte, los mtodos de conservacin ex situ
se basan en el mantenimiento del material
biolgico en bancos de semillas, bancos de
cultivo in vitro, colecciones de plantas (en
campo, viveros o jardines botnicos).
En general, los bancos de semillas constituyen uno de los mtodos ms convenientes para la conservacin de germoplasma ex
situ, porque permiten almacenar una gran
variabilidad gentica en forma econmica y
prctica. Para la conservacin de semillas el
International Plant Genetic Resouces
Institute (IPGRI) recomienda su desecacin
hasta un 3-7% de humedad y su almacenamiento a bajas temperaturas (-18C). Este
protocolo de conservacin es, en general, el
ms recomendado para la mayora de las
especies que se propagan por semillas y cuyas semillas resisten la desecacin sin que ello
implique prdida de viabilidad. A las semillas
que presentan estas caractersticas se las denominan semillas ortodoxas, como por
ejemplo las semillas de arroz, trigo, avena,
tabaco, tomate y lechuga. Sin embargo, en
ciertos casos este mtodo de conservacin
no es aplicable porque la especie se propaga, en la prctica, vegetativamente, (como
la mandioca, papa, caa de azcar, pltanos
y bananos), o bien porque sus semillas pierden rpidamente la viabilidad cuando son sometidas a procesos de desecacin. A estas
semillas se las denominan semillas recalcitrantes. Las semillas de numerosas especies
que viven en zonas tropicales o subtropicales
se incluyen en esta categora, como por ejemplo las de coco, cacao, frutales tropicales perennes y diversas palmeras.
Otro mtodo de conservacin de
germoplasma ex situ, es mediante el cultivo
in vitro de tejidos. El descubrimiento de la
179
totipotencialidad de las clulas vegetales y la

posibilidad de desarrollar plantas normales y
completas a partir de diferentes explantes
ha permitido pensar en el establecimiento
de bancos de germoplasma utilizando el cultivo de tejidos vegetales. Algunos de los primeros estudios sobre el mantenimiento in
vitro del germoplasma fueron realizados en
mandioca en el Centro Internacional de Agricultura Tropical (CIAT) y en papa en el Centro Internacional de la Papa (CIP). En 1980
se reconoci el potencial de los mtodos del
cultivo in vitro para la conservacin de especies de plantas consideradas difciles (este
trmino se refiere a las especies propagadas
vegetativamente en forma obligada o que
tienen semillas recalcitrantes). En estos casos,
la conservacin de los genotipos se realiza
mediante el mantenimiento de plantas vivas
o mediante el cultivo in vitro de pices
caulinares o de nudos.
El mantenimiento de los recursos
fitogenticos mediante los mtodos de cultivo in vitro se logra generando cambios en
el ambiente de cultivo que permiten
desacelerar el crecimiento de las clulas y de
los tejidos. El objetivo es aumentar al mximo el perodo de transferencia del cultivo. Es
esta necesidad la que estimul algunos de
los primeros estudios sobre el mantenimiento in vitro del germoplasma de diversas especies. Este mtodo cubre un amplio espectro de tcnicas que implican el cultivo, bajo
condiciones de asepsia, de rganos o fragmentos de rganos (meristemas, semillas,
embriones somticos, embriones cigticos,
hojas, tallos, races, yemas, polen, anteras,
callos o protoplastos), en un medio de cultivo artificial definido, bajo condiciones ambientales controladas.
Esta tcnica ha sido utilizada para mantener colecciones en crecimiento mnimo,
para lo cual se requiere: reducir la temperatura, reducir las condiciones de luminosidad,
modificar el medio de cultivo, adicionar al
mismo inhibidores osmticos o retardantes
del crecimiento, deshidratadores de tejido o
modificar la fase gaseosa del recipiente de
cultivo. La modificacin de uno o ms de estos factores es usada para la conservacin de
numerosas especies, como por ejemplo para
la conservacin de microestacas de Manihot
esculenta; de vstagos de especies de
180
Fragaria, Ipomoea, Rubus, Musa,

Saccharum, Zingiber, Ananas, Coffea,
Dioscorea y de microtubrculos de Solanum.
Estas tcnicas de almacenamiento se realizan
a mediano plazo, es decir, se basan en reducir el metabolismo celular y con ello reducir el
crecimiento y el nmero de subcultivos durante meses hasta un ao, sin que ello afecte la viabilidad de los cultivos.
Desde hace varios aos en el Laboratorio
de Cultivo in vitro del Instituto de Botnica
del Nordeste (IBONE), en la Facultad de Ciencias Agrarias de la UNNE, se llevan a cabo
experimentos referidos a la conservacin de
germoplasma de paraso (Melia azedarach).
Utilizando como explantes meristemas de
clones selectos de paraso mantenidos durante 12 meses a tasas de crecimiento reducidas
(medios de cultivo subptimos o empobrecidos y en condiciones de oscuridad) se logr
mantener con xito y regenerar plantas de
paraso que actualmente se encuentran en
la etapa de evaluacin a campo (Fig. 1).
En el IBONE tambin se realizan experimentos tendientes a optimizar las tcnicas
de conservacin in vitro a largo plazo, que
consisten en el almacenamiento a la temperatura del nitrgeno lquido (-196C)
crioconservacin, con lo cual se consigue la
supresin del crecimiento hasta llegar a un
estado de suspensin animada. En el mencionado Instituto se ha logrado la
crioconservacin de meristemas de paraso
mediante la tcnica de encapsulacin-deshidratacin (Fig. 1).
El uso de la crioconservacin para el almacenamiento de germoplasma ofrecen varias ventajas en relacin con las tcnicas tradicionales, pues permiten la conservacin a
largo plazo (aos), con bajos costos de mantenimiento, fcil manipulacin de las muestras y no dependen del suministro elctrico.
Luego del informe, en 1968, acerca de la
crioconservacin de clulas de lino y de los
resultados satisfactorios que se obtuvieron
con la crioconservacin de meristemas de
frutilla en el Instituto de Biotecnologa de
Plantas en Saskatoon, Canad, en 1985 se
iniciaron algunas investigaciones colaborativas entre el CIAT y el IPGRI para desarrollar
esta tcnica para meristemas de mandioca.
A partir de estos estudios numerosos trabajos han dado muestras de la importancia de
esta tcnica, de sus usos y aplicaciones.
SCOCCHI, Adriana; REY, Hebe
con el tipo de propagacin de la especie. Por ejemplo, en el caso de

la mandioca, especie que se propaga principalmente por va
asexual (mediante
estacas), en el
CIAT se conserva
su germoplasma
in vitro mediante
el cultivo de microestacas y tambin
de meristemas,
con lo cual paralelamente a la conservacin se consigue el saneamiento de los cultivares. Actualmente se estn realizando estudios
tendientes a desarrollar protocolos
para la crio-conservacin de meristemas.
Deshidratacin
La deshidratacin del explante
es un paso crucial
para el xito de la
crio-conservacin,
ya que es necesario eliminar toda el
agua libre presenFigura 1: Estrategias para la conservacin de germoplasma de paraso (Melia azedarach
te en el tejido veL.), desarrolladas en el Laboratorio de Cultivo in vitro de Tejidos Vegetales. IBONE.
getal, minimizanFacultad de Ciencias Agrarias. UNNE.
do as posibles daos debidos a conLa crioconservacin consta de seis pasos: gelacin. La deshidratacin del tejido puede
realizarse en una cmara a 0C o en cmaras
Seleccin del material a crioconservar hermticamente cerradas utilizando sustanCuando se realiza la seleccin del mate- cias higroscpicas como silica gel o glicerol (5
rial a crioconservar se debe tener la absoluta - 20%), o sometiendo al explante a una coseguridad de que a partir del mismo se ob- rriente de aire en un flujo laminar de aire estendrn plantas completas. El explante se- tril.
leccionado depender del objetivo de conservacin y est estrechamente relacionado
Aclimatacin
181
La aclimatacin puede realizarse en forma rpida o lenta. La aclimatacin rpida

consiste en colocar el explante directamente
en nitrgeno lquido, con o sin la adicin
exgena de crioprotectores. La aclimatacin
lenta se realiza bajando gradualmente la temperatura (0.1-3C/min.). Este punto debe ser
manejado cuidadosamente, pues una deshidratacin excesiva de las clulas puede exponerlas a una alta concentracin interna de
solutos. Por esta razn, el material generalmente se congela lentamente, a una velocidad adecuada, hasta alcanzar una temperatura prxima a los -40 C. Luego se lleva directamente a la temperatura del nitrgeno
lquido (-196 C).
A fin de preparar (aclimatar) el explante
para enfrentar las bajas temperaturas a las
que ser sometido, se utilizan sustancias
crioprotectoras como azcares (sacarosa, glucosa), alcoholes (glicerol, etileglicol, manitol
y sorbitol), dimetilsulfxido (DMSO) y
polivinilpirrolidona (PVP). Tambin pueden
utilizarse soluciones de vitrificacin, que son
una combinacin de varios crioprotectores
tales como el PVS2, que est compuesto por
30% de glicerol, 15% de etilenglicol, 15% de
DMSO y 0.04M de sacarosa. Tanto los
crioprotectores como las soluciones de
vitrificacin actan fundamentalmente como
agentes anticongelantes, aumentando la viscosidad del tejido vegetal y reduciendo la
permeabilidad de las clulas.
Almacenamiento
De acuerdo al material vegetal que se utilice, se presentan dos grandes sistemas:
- Sistemas secos: comprenden todos
aquellos tejidos vegetales endgenamente
resistentes y tolerantes a las bajas temperaturas y a la deshidratacin.
- Sistemas hidratados: son todos aquellos tejidos vegetales no tolerantes a las bajas temperaturas y a la deshidratacin, por
lo cual se requiere de una proteccin
exgena. Esta proteccin puede lograrse a
travs del uso de crioprotectores o bien por
la utilizacin de soluciones de vitrificacin.
Los sistemas secos, por tratarse de tejidos ms resistentes, necesitan de una me-
182
nor preparacin para el almacenamiento y

comprenden aquellas especies que habitan
zonas fras y/o templadas. En cambio, los sistemas hidratados son ms susceptibles a las
bajas temperaturas y estn representados
por todas aquellas especies que habitan zonas tropicales y subtropicales, las cuales no
estn adaptadas para soportar temperaturas inferiores a 0C. Por este motivo estos tejidos deben ser protegidos exgenamente
mediante el uso de crioprotectores.
Descongelamiento y rehidratacin
Cuando se desea recuperar el explante
mantenido en nitrgeno lquido se puede
realizar un descongelamiento rpido en bao
de agua (generalmente 1-2 min. a 30-40 C)
o en forma lenta, sometiendo al explante a
la temperatura del laboratorio o a una corriente de aire en el flujo laminar de aire estril.
Tests de viabilidad
Los tests de viabilidad nos permiten comprobar la/s zona/s del tejido que ha/n muerto y cul/es ha/n sobrevivido al fro. La evaluacin de la viabilidad puede llevarse a cabo
en forma visual, realizando el re-cultivo y determinando la capacidad de regeneracin,
utilizando TTC (cloruro de 2,3,5TrifenilTetrazolio) que colorea el tejido que ha sobrevivido a la crioconservacin o midiendo la
conductividad elctrica, que permite estimar
el dao producido en las membranas celulares.
Tcnicas de almacenamiento del material a preservar
En la ltima dcada han surgido numerosas tcnicas que combinan el uso de
crioprotectores y de soluciones de vitrificacin
con tcnicas de deshidratacin y
encapsulacin, las cuales bsicamente pueden resumirse en tcnicas de:
- Encapsulacin-deshidratacin
- Vitrificacin
- Encapsulacin-vitrificacin
- Desecacin
- Precultivo
- Precultivo-desecacin
- Gotita congelada.
En la Tabla 1 se detallan las especies y
Tabla 1: Utilizacin de tcnicas de crioconservacin en diferentes explantes de algunas especies de inters agronmico.
Tcnica
Empleada
Explante y Especie
Suspensiones celulares de Catharanthus roseus.

Meristemas de 125 variedades de Solanum spp.
Meristemas de Dioscorea alata, Malus domestica, Pyrus spp. y
Morus spp.
EncapsulacinApices de Pyrus spp., Malus spp., Saccharum spp. y Solanum
Deshidratacin
tuberosum
Apices caulinares de Camellia japonica, Coffea racemosa x
Coffea sessiliflora, Citrus spp, y de Saccharum spp.
Embriones somticos de Elaeis guineensis.
Clulas nucelares de Citrus sinensis.
Lneas celulares embriognicas de Pinus silvestris.
Suspensiones celulares y callos embriognicos de Gossypium
hirsutum.
Meristemas de Pyrus communis, Malus spp y de Pyrus
spp., Ipomoea batata, Manihot esculenta (15 genotipos),
Prunus spp., y de Solanum spp.
Meristemas, polen y anteras de Arachis hypogaea.
Vitrificacin
pices de Ananas comosus, Colocasia esculenta.
Yemas adventicias de Guazuma crinita Mart., Populus alba.
Semillas de Bletilla striata
Semillas y protocormos de Dendrobium candidum.
Suspensiones celulares embriognicas de Oryza sativa.
Embriones somticos de Abies cephalonica
Semillas, embriones cigticos, polen, anteras y suspensiones
celulares
de Triticum spp.
Meristemas, segmentos nodales, segmentos de raz y yemas
Encapsulacin- adventicias de Guazuma crinita, y de Fragaria x ananassa.
Vitrificacin
Apices de Dyanthus cariophyllus, Armoracia rusticana,
Lilium spp. y de Wasabia japonica
Meristemas de Morus spp.
Embriones somticos de Cucumis melo, y de Elaeis guineensis
Embriones somticos y ejes embriognicos de Camellia japonica.
Desecacin
Ejes embriognicos de Junglans cinerea.
Ejes embriognicos y semillas de Gossypium hirsutum.
Semillas de Pinus silvestris, y de Apium graveolens.
Meristemas de Musa spp.
Embriones cigticos de Triticum aestivum, Phaseolus vulgaris
y Oryza spp.
Precultivo
Polen y anteras de Oryza spp
Lneas celulares y callos de Oryza sativa.
Embriones somticos de Phoenix dactylifera, Coffea spp.,
PrecultivoPyrus spp., Cucurbita spp., Cocos nucifera, y de Elaeis
Desecacin
guineensis (aplicada como rutina a 80 clones).
Gotita
Congelada
Apices de 150 variedades de Solanum tuberosum.
explantes en los cuales cada una de estas

tcnicas ha sido empleada con resultados
satisfactorios.
-Encapsulacin-Deshidratacin
La tcnica de encapsulacin-deshidratacin se basa en la metodologa aplicada a las
semillas sintticas, en la cual un explante es

recubierto por una matriz de alginato de
sodio y polimerizado en una solucin de cloruro de calcio, formando un gel de alginato
de calcio alrededor del explante. Una vez
encapsulados, los explantes son pretratados,
generalmente con sacarosa (desde 0.3 has-
183
ta 1.5M), que acta como crioprotector. En

especies tolerantes al fro la exposicin de las
plantas madres a bajas temperaturas durante varias semanas, previo a la
criopreservacin, incrementa la supervivencia.
La deshidratacin puede llevarse a cabo
sometiendo las cpsulas de alginato (conteniendo a los explantes) a una corriente de
aire en el flujo laminar o exponindolas en
cmaras hermticamente cerradas con silica
gel. Las cpsulas, as deshidratadas, pueden
sumergirse directamente en nitrgeno lquido o bien pueden ser llevadas a un descenso
lento de temperatura.
- Vitrificacin
Esta tcnica involucra el pretratamiento
de las muestras con soluciones de vitrificacin,
como el PVS2, ya mencionado, o bien otra,
compuesta por 40% de etilenglicol, 15% de
sorbitol y 6% de albmina srica bovina.
Luego de la exposicin a las soluciones de
vitrificacin (generalmente a una temperatura de 0C, a fin de disminuir los riesgos de
fitotoxicidad), las muestras pueden ser sumergidas directamente en nitrgeno lquido o a
travs de un descenso lento de la temperatura. Las soluciones crioprotectoras recomendadas en los protocolos de vitrificacin son
generalmente txicas para las clulas. El tiempo de exposicin a la solucin debe estar relacionado con el tamao del explante y la
misma debe ser removida rpidamente luego del descongelado.
- Encapsulacin-Vitrificacin
La tcnica de encapsulacin-vitrificacin es
una combinacin de las tcnicas de
encapsulacin-deshidratacin y vitrificacin.
Las muestras son encapsuladas en alginato
de calcio y sometidas a vitrificacin durante
el enfriamiento. La supervivencia del material vegetal cuando se utiliza esta tcnica es
un 30% mejor que cuando se usa la de
encapsulacin-deshidratacin. Esto puede
explicarse debido a que las cpsulas de
alginato de calcio reducen la toxicidad de las
soluciones de vitrificacin.
- Desecacin
La tcnica de desecacin es un proceso
muy simple que slo requiere la deshidratacin del material vegetal, la cual es crucial para
184
el xito de la crioconservacin. Esta tcnica

consiste en someter al explante a una corriente de aire en un flujo laminar o en cmaras
hermticamente cerradas, que contienen
silica gel, luego de lo cual se realiza un enfriado rpido sumergiendo el material directamente en nitrgeno lquido.
- Precultivo
La tcnica del precultivo involucra la incorporacin de crioprotectores (durante distintos tiempos que dependen del explante)
antes del congelamiento. Como ejemplos
pueden citarse la adicin de altas dosis de
sacarosa para la crioconservacin de
meristemas de Musa spp.; la utilizacin de
polietilenglicol (PEG) y DMSO en el caso de
embriones cigticos de Triticum aestivum y
Phaseolus vulgaris; la utilizacin de sacarosa
y DMSO o glicerol en semillas, embriones
cigticos, polen y anteras de Oryza spp., y la
utilizacin de cido abscsico para la conservacin de lneas celulares y de callos de Oryza
sativa.
- Precultivo-Desecacin
Esta tcnica es una combinacin de dos
de las tcnicas descriptas anteriormente. Las
muestras son tratadas con crioprotectores,
parcialmente desecadas y luego sometidas a
enfriamiento rpido o lento. Generalmente
en el precultivo se emplean azcares como
sacarosa o glucosa. La duracin del tratamiento es variable, desde horas, como en el caso
de la conservacin de embriones maduros de
Cocos nucifera, donde el cultivo dura 11-20
hs., hasta das, como en el caso de embriones somticos de Elaeis guineensis, que dura
7 das.
- Gotita congelada
Esta tcnica ha sido aplicada con xito en
pices de Solanum tuberosum. Consiste en
pretratar el material con DMSO por 2-3 hs.
en medio lquido y formar una microgota (2.5
ml), la cual se suspende sobre papel de aluminio y luego se sumerge directamente en
nitrgeno lquido. Este procedimiento es una
adaptacin de la tcnica clsica desarrollada
para meristemas de mandioca.
Esta tcnica ha sido satisfactoriamente
aplicada en 150 variedades de Solanum
tuberosum, con un porcentaje de supervivencia del 40%.
3 Conclusiones
Los recursos fitogenticos constituyen un
reservorio de informacin gentica imprescindible para la solucin de muchos de los problemas a los que se enfrenta la agricultura.
Los mtodos para asegurar su conservacin
son diversos y cada uno de ellos posee sus
ventajas e inconvenientes. Por ello, se considera que el conjunto de tcnicas de conservacin in situ y ex situ son mtodos complementarios, no excluyentes, para lograr el
objetivo comn de preservar los recursos
fitogenticos, como parte esencial de una
estrategia global para la conservacin de la
biodiversidad.
En la ltima dcada se han producido
avances significativos en el desarrollo de tcnicas in vitro de conservacin. La disponibilidad de bancos de germoplasma in vitro, tanto en condiciones de crecimiento lento como
la conservacin a temperaturas ultrabajas
(crioconservacin), han contribuido a dicho
avance. Las tnicas de crecimiento lento son
utilizadas como rutina en centros internacionales tales como el CIAT (Cali, Colombia),
donde se aplican a la conservacin de
germoplasma de mandioca y para la conservacin de germoplasma de papa en el CIP
(Centro Internacional de la Papa, Per). Las
tcnicas de crioconservacin ofrecen una alternativa muy valiosa cuando se piensa en

conservar los recursos fitogenticos por tiempo ilimitado (aos), si bien hasta el momento slo se aplica como rutina para la conservacin de lneas celulares en laboratorios de
investigacin y para la conservacin de algunos genotipos pertenecientes a los gneros
Rubus spp., Pyrus spp., Solamun spp. y
Elaeis guineensis.
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Roca, W.M. y L.A. Mroginski (eds.) CIAT (31) :697-714.
185
PARTE VI
Mtodos de anlisis de la
variabilidad
187
188
OLMOS, Sofa y DI RENZO, Miguel
VI.-Captulo 1
Consideraciones estadsticas y
biolgicas para estimar variabilidad
gentica
Olmos, Sofa; Di Renzo, Miguel
1 La variacin biolgica
La variabilidad gentica es un hecho universal en las poblaciones reproductivas y una
condicin preliminar necesaria para el cambio evolutivo y para la respuesta al mejoramiento gentico mediante seleccin o hibridacin. Por otra parte son conocidos los peligros que implica la uniformidad y la falta de
diversidad en las especies cultivadas y en los
animales domsticos, como consecuencia de
la erosin gentica.
La variacin que presentan los individuos
de una poblacin puede ser discontinua o
continua. Los caracteres cualitativos de variacin discontinua, como los marcadores
moleculares, permiten clasificar a los individuos sin ambigedades, ya que estos caracteres estn regidos por uno o por pocos
genes y el ambiente no tiene efecto en su
manifestacin fenotpica. En cambio, los caracteres cuantitativos, representados por la
mayora de los caracteres de inters agronmico, presentan variacin continua y los
fenotipos, que estn determinados por
poligenes y por efectos ambientales, son difciles de clasificar en categoras discretas. Para
su anlisis deben emplearse mtodos
biomtricos, que no miden el efecto de genes
individuales o de segmentos cromosmicos
especficos, sino de todo el genoma.
Durante los ltimos aos ha surgido un
consenso entre los mejoradores y genetistas
moleculares sobre la conveniencia del uso de
marcadores moleculares para asistir a la seleccin de caracteres cuantitativos (MAS,
Marker Assisted Selection). La biotecnologa
ha colaborado mediante la construccin de
mapas genticos saturados, esto es, con innumerables marcadores moleculares a lo largo de los cromosomas, que permiten ubicar
regiones de actividad cuantitativa (QTL,
Quantitative Trait Loci). De esta manera, un
carcter de variacin contnua puede ser

manejado como si se tratara de un carcter
de herencia mendeliana mediante la
introgresin de un fragmento de cromosoma
conteniendo un QTL por retrocruzamientos
sucesivos en las variedades comerciales. Los
QTL representan un nuevo sistema de enfocar el estudio bsico y el manejo prctico de
los sistemas polignicos y de la gentica cuantitativa.
2 Experimento cientfico
La ciencia, que tiene como objetivo la
explicacin y la prediccin de los hechos, cuenta con el mtodo cientfico como un procedimiento que contempla un proceso en flujo desde los hechos observados hasta la
proposicin de hiptesis explicatorias. Un
requisito fundamental en toda ciencia fctica
es la contrastacin de las hiptesis planteadas, poniendo a prueba las mismas mediante una confrontacin con la experiencia.
El diseo experimental crea artificialmente
las condiciones para la contrastacin de la hiptesis y brinda la metodologa estadstica
correspondiente para el anlisis de los datos.
El experimento cientfico, que como queda dicho es un ensayo destinado a probar la
validez de una hiptesis, se basa en la reproduccin de ciertos fenmenos bajo condiciones controladas con el objeto de medir el
efecto que produce la modificacin de uno o
varios factores en estudio (tratamientos) sobre la variable dependiente.
El ensayo, cuidadosamente diseado,
deber ser lo ms simple posible, evitando
los errores tendenciosos y sistemticos
(biass=sesgo) de manera tal que los datos
recavados provean conclusiones con un amplio rango de validez. Por otra parte, para
magnificar el efecto de los tratamientos y
disminuir el error experimental, se procura
minimizar el efecto de otros factores no controlados que ejercen influencia en las observaciones. Esto se logra utilizando materiales
y condiciones experimentales lo ms homogneas posibles. De esta manera, las variaciones observadas se debern casi exclusivamente a los tratamientos.
Para conocer el efecto de los factores
controlados y el de los factores no controlados (error experimental) sobre el material
189
experimental es necesario formular claramente una hiptesis, utilizar un diseo experimental apropiado y analizar e interpretar los
resultados obtenidos.
Por ejemplo, la aplicacin de distintos tratamientos (ej.: distintas dosis de fertilizante
= causa), producen variaciones sobre una caracterstica de inters (ej. rendimiento = efecto):
- Variable independiente: es la causa que

afecta los resultados del experimento y est
representada por los distintos niveles del factor cuyo efecto se quiere medir (tratamientos) o que se quiere controlar (bloques).
- Variable dependiente: variable respuesta o simplemente variable es el rasgo o
carcter de inters cuyas mediciones constituyen los datos u observaciones del experimento. Ej. rendimiento (kg./ha), dimetro
de colonia (mm); (variables continuas), tiempo a panojamiento (das), tamao de camada, nmero de colonias (nmero), grado de
respuesta a un patgeno (tolerante, intermedio, susceptible), (variables discretas). La
variacin de estos datos permite cuantificar
el efecto del factor al que est sometido el
material.
3 Hiptesis estadstica
Terminologa
- Factor: es la causa cuyo efecto se quiere
medir (ej. fertilizante, competencia, medio de
cultivo)
- Nivel: es cada una de las categoras o
alternativas del factor en estudio (ej. dosis
de un fertilizante, densidades de siembra, pH
de los medios de cultivo).
- Tratamiento: Es cada nivel del factor en
estudio. Si se estudia el factor fertilizante,
cada dosis (o nivel) es un tratamiento distinto. Si se prueba el efecto de concentraciones
crecientes de un fertilizante los tratamientos
tendran un orden natural (discreto ordinal);
pero si se prueban distintas combinaciones
de fertilizantes (NPK), no habra un orden
entre los tratamientos (discreto categrica).
Cuando se estudian dos (o ms) factores simultneamente, los distintos tratamientos
resultan de la combinacin de cada nivel de
un factor con cada nivel del otro factor. Por
ejemplo, si se estudia el efecto de fertilizante y competencia, cada tratamiento resulta
de la combinacin de una dosis de fertilizante y una densidad de siembra determinada.
190
Como se indicara previamente, el experimento cientfico es un ensayo destinado a

probar la validez de una hiptesis. Las hiptesis estadsticas plantean supuestos referentes a algn parmetro poblacional. Por lo
general se utiliza la hiptesis nula (Ho), que
se refiere a la igualdad entre los parmetros
probados. Frente a la Ho se plantea una hiptesis alternativa (Ha).
Para determinar si un tratamiento tuvo
algn efecto, se considera a la Ho como la
ausencia de efectos, lo que equivale probar
la igualdad entre las medias de los tratamientos. La Ha plantea que al menos una de las
medias difiere significativamente del resto, o
sea que al menos uno de los niveles del factor probado tiene efecto sobre la variable de
inters. Las hiptesis estadsticas tambin
prueban otras caractersticas poblacionales,
como por ejemplo la igualdad entre varianzas
o entre coeficientes de regresin.
El ensayo y las pruebas de significancia
permiten calcular la probabilidad a favor de
la hiptesis nula. Es decir que P es la probabilidad que la Ho sea verdadera. Si la probabilidad calculada es igual o mayor que un nivel
de significancia preestablecido (de 0,05 por
ejemplo), la Ho no se rechaza y se infiere que
no hay diferencias significativas entre las
medias de los tratamientos. Se concluye que
los tratamientos no tienen efecto significati-
vo en la variabilidad del carcter estudiado y

las diferencias observadas no son mayores
que las que se produciran por azar. En cambio si la probabilidad calculada es pequea
(P0,05) se rechaza la Ho y se infiere, de
acuerdo con la Ha, que hay diferencias significativas entre los tratamientos. Si P0,01 se
dice que las diferencias son altamente significativas.
El nivel de significancia, generalmente

designado por , representa hasta qu punto, en trminos de probabilidad, estamos
dispuestos a aceptar un error de tipo I, es
decir, rechazar una Ho que sea verdadera.
Esto conlleva a que aceptemos una Ho como
verdadera con una probabilidad 1-. Si se fija
= 0,05 estamos dispuestos a aceptar el error
tipo I aproximadamente una de cada 20 veces.
4 Anlisis univariado
Los anlisis univariados emplean una variable dependiente, mientras que los anlisis
multivariados comparan muestras sobre la
base de dos o ms variables que estn relacionadas.
La significancia estadstica de una diferencia entre dos medias puede verificarse mediante una prueba t o mediante una prueba
F. Ambas son equivalentes, t2 = F. La prueba
F, que es un cociente de varianzas, es una
generalizacin de la prueba t, especialmente
til cuando se comparan ms de dos tratamientos. En el anlisis de la varianza (ANOVA),
por ejemplo, se utiliza la prueba F para verificar la igualdad de medias.
Prueba F
Una prueba F consiste en un cociente
entre dos varianzas:
F = s2entre / s2dentro
Para realizar la prueba F resulta necesario
descomponer la varianza total (s2total) en dos
componentes: s2entre y s2dentro
El anlisis de la varianza es un procedimiento aritmtico que permite la descomposicin de la varianza total en varianzas parciales. El cociente entre las varianzas permite
obtener un valor de F calculado (Fc), el cual
se compara con un F de tabla (Ft) para un
determinado nivel de significacin (por ejemplo = 0,05) y los grados de libertad de los
tratamientos y del error. Los programas de
computacin calculan directamente el P (la
probabilidad) del test.
Varianza total
Se puede considerar a la variacin total
como la resultante de dos fuentes de variacin: una fuente de variacin debida a las
diferencias entre grupos o tratamientos, sealadas por los promedios de stos y otra
debida a la diferencia dentro de los tratamientos, que se calcula sobre la base de las
diferencias entre las observaciones de cada
tratamiento.
Varianza entre tratamientos
Para aislar la variacin entre los grupos
necesitamos suprimir la variacin dentro de
los tratamientos. Podemos obtener este resultado haciendo a todos los individuos de
un mismo grupo iguales entre s e iguales a la
media del grupo. Mediante esta operacin,
la variacin entre los grupos no se modifica
mientras que toda la variacin dentro del
grupo queda anulada.
Varianza dentro de tratamientos
Para obtener la varianza dentro de los
grupos debemos tener en cuenta solamente la variacin entre las observaciones de un
mismo tratamiento. La variacin dentro de
un tratamiento se debe a las desviaciones
que presentan los valores individuales en ese
grupo en relacin con la media de ese grupo.
5 Anlisis multivariado
El anlisis multivariado brinda los mtodos estadsticos para el anlisis conjunto de
dos o ms variables que pueden estar
interrelacionadas. Esta rama de la estadstica comprende procedimientos y tcnicas
para la sntesis, la presentacin y el anlisis
multidimensional de caracteres, tanto cualitativos como cuantitativos, obtenidos a par-
191
tir de un nmero de individuos, una OTU

Operational Taxonomic Unit, objetos o
tratamientos.
Debido a que las variables se consideran
en forma simultnea, estas tcnicas permiten realizar interpretaciones ms complejas
a las que surgen mediante la utilizacin de
mtodos univariados. El anlisis multivariado
colabora en la comprensin ms adecuada y
completa de las ciencias biolgicas; por tal
motivo, en este captulo se brindar un panorama simplificado y algunos comentarios
sobre las tcnicas ms usuales con la finalidad de poder discernir y elegir la metodologa ms apropiada para analizar la informacin que se disponga.
Hay algunas razones que justifican el anlisis conjunto de diferentes variables en lugar
de analizar cada variable separadamente por
mtodos univariados. Por ejemplo, cuando
se trata de probar hiptesis mediante procedimientos de inferencia estadstica. En este
caso, la aplicacin del anlisis univariado a
cada una de las variables aumenta el error
Tipo I mientras que la aplicacin del anlisis
multivariado preserva el valor de y aumenta en muchos casos el poder del test (1-). El
anlisis multivariado utiliza las relaciones (correlaciones) entre las variables o entre los
objetos que el mtodo univariado directamente no considera. El anlisis multivariado
aprovecha estas relaciones para buscar en los
datos patrones o estructuras enriqueciendo
as la descripcin de los mismos. En el captulo siguiente (VI.2) se desarrollarn en ms detalle algunas metodologas multivariadas,
seleccionandose aquellas que se utilizan con
mucha frecuencia y que no requieren demasiados conocimientos previos.
Anlisis exploratorio y confirmatorio
Con los datos provenientes de observaciones realizadas sobre un hecho en particular es necesario, en primer lugar, realizar un
anlisis exploratorio. Posteriormente, mediante las inferencias realizadas a partir de
este anlisis y con la informacin que se pueda disponer acerca de los mecanismos que
originan el proceso biolgico, es posible desarrollar un anlisis confirmatorio y as plantear un modelo descriptivo de causalidad, el
que, a su vez, es confirmado mediante una
prueba de bondad de ajuste.
192
En otras palabras, toda investigacin llevada a cabo especialmente en reas nuevas,

donde existen pocos antecedentes, comienza con una exploracin de los datos con el
objeto de reconocer cualquier estructura o
patrn no aleatorio que requiera una explicacin. En una segunda etapa, es posible que
surja la necesidad de formular la pregunta,
lo cual es a menudo ms interesante que buscar la respuesta subsiguiente, ya que el objetivo primordial es, en primer lugar, generar
hiptesis interesantes que promuevan estudios ms avanzados. En este caso, los mtodos que estn diseados para responder a
preguntas especficas no seran necesarios. En
cambio resultaran apropiados aquellos mtodos que puedan detectar un patrn de
comportamiento no previsto en los datos y
que, adems, abran un amplio campo de posibles explicaciones del proceso. Estas tcnicas generalmente se caracterizan por el nfasis puesto en la utilizacin de representaciones visuales y grficas y por la carencia de
modelos estocsticos, donde la significacin
estadstica de los resultados pierde importancia.
La aplicacin de los anlisis confirmatorios
se vuelve ms apropiada cuando el investigador tiene en mente hiptesis bien definidas. Es aqu donde son necesarias las pruebas de significacin estadstica. Sin embargo,
no existe una divisin muy estricta entre tcnicas exploratorias y confirmatorias. Por ello
sera importante que el investigador tenga
una perspectiva flexible y pragmtica para
analizar sus datos y una experiencia suficiente que le permita elegir la herramienta analtica adecuada. El error ms grave que se podra realizar en este sentido sera arribar a
conclusiones que expliquen causas a partir de
datos exploratorios y descriptivos sin haber
realizado ningn tipo de diseo experimental para probarlos. Se plantea como causa
probable de esta tendencia generalizada el
mal uso semntico entre las terminologas estadsticas y las biolgicas. El uso estadstico
de trminos como efectos o variable independiente no implica causalidad.
Sntesis de mtodos: objetivos y limitaciones
Los anlisis multivariados ms comnmente adoptados, en orden decreciente, son:
anlisis de componentes principales, anlisis lineales. Cuando se utilizan combinaciones de

de funciones discriminantes, anlisis de variables hay que considerar que el coeficienagrupamientos o clusters, regresin mltiple, te que afecta a una variable representa la
anlisis multivariado de la varianza, anlisis contribucin de esta variable a la combinade correspondencia, coordenadas principa- cin lineal y que este valor depende de las
les, anlisis factorial, correlacin cannica, otras variables incluidas en el anlisis. No se
modelos logartmicos lineales, escalamiento considera correcto el empleo de estos coefimultidimensional, y la regresin logstica ml- cientes individuales para la interpretacin de
tiple.
dichas correlaciones.
En la Tabla 1 se mencionan los objetivos
Antes de aplicar cualquier tcnica de angenerales de los mtodos de anlisis lisis resulta imprescindible realizar un examen
multivariado ms utilizados. Los procedimien- inicial de los datos. El examen inicial, bsicatos enumerados del 1 al 7 utilizan combina- mente, consiste en la evaluacin de datos
ciones lineales de las variables, estos mto- faltantes, identificacin de outliers (fuera
dos son ms eficientes con datos continuos, del rango o fuera de tipo) y cuando el anlimientras que aquellos mtodos enumerados del 8 al Tabla 1. Objetivos y limitaciones de los 12 tipos de anlisis multivariados ms
comnmente utilizados.
12, comprenden mtodos
no lineales y son ms apropiados cuando se cuenta
con datos binarios.
Los mtodos lineales
son apropiados cuando se
quiere interpretar combinaciones ptimas de variables (por ejemplo, componentes principales en ACP
(anlisis de componentes
principales), factores en AF
(anlisis factorial, funciones
discriminantes en AD (anlisis discriminante). Quienes
aplican mtodos lineales,
usualmente asumen que
los valores de las variables
incrementan o decrecen
regularmente y que entre
ellas no hay interacciones.
Estas relaciones no lineales
en el MANOVA aparecen
en los trminos de las
interacciones y pueden revelar efectos no lineales importantes en el anlisis de
datos experimentales.
Para examinar con mayor
eficiencia datos binarios
(presencia/ausencia) y datos en rangos, se pueden
usar otros modelos donde
las variables se combinan
acordes con funciones no
193
sis multivariado a emplear as lo requiera, verificar si se cumplen los supuestos bsicos de

normalidad, homogeneidad de varianzas,
independencia de error y linealidad.
Por otro lado, y al igual que en el anlisis
univariado, hay que tener precauciones con
el uso del nivel de significancia () que se
adopte, de las subsiguientes inferencias es-
194
tadsticas y de las conclusiones a que se arriba luego del anlisis. Las conclusiones confirmatorias solamente se justifican si los
estudios estuvieron basados en un muestro apropiado. Esto significa que la
inferencia est justificada
en relacin a la forma en
que los datos fueron tomados y en que el experimento fue realizado, ms
que en la tcnica de anlisis en s misma.
Las inferencias slo estn justificadas cuando los
datos son tomados de
una muestra grande y bien
definida. Cuando esto no
ocurre, los valores de probabilidad directamente
no se deberan informar y
las conclusiones a las que
se arriba slo deberan limitarse a los datos utilizados y a las condiciones en
las que se desarroll el experimento. De la misma
manera resulta poco aconsejable elaborar generalizaciones demasiado amplias cuando los estudios
se realizan sobre casos
particulares o especficos
que no son representativos.
A menudo sucede que
el investigador prefiere o
necesita interpretar las variables en forma separada
cuando maneja un grupo
de variables correlacionadas. En estos casos sera
ms apropiado utilizar mtodos univariados, con el complemento de
pruebas de Bonferroni ajustadas. Sin embargo, cuando sea posible, la consideracin conjunta de las variables, mediante la aplicacin
del anlisis multivariado, puede brindar conclusiones ms fuertes que las logradas a travs de un grupo de comparaciones simples.
Si se tiene cuidado durante el proceso de in-
terpretacin de resultados, las combinaciones de variables (componentes, factores, etc.)

podran ser de significativa importancia para
estudiar un proceso. El uso racional de la estadstica multivariada, el modelamiento y el
conocimiento biolgico pueden ayudar al investigador a disear con criterio un experimento crucial y a llegar a conclusiones consistentes.
Como dijimos anteriormente, el anlisis
multivariado aprovecha las relaciones entre
las variables para buscar patrones o estructuras en los datos. En este sentido, podra
encontrarse un origen de patrones cuando
se realizan mediciones sobre grupos de objetos similares. Pueden existir casos donde no
se conoce a priori si los grupos estn ya formados, cuntos son, o cules objetos pertenecen a cada grupo; es all donde habra que
ver qu tipo de anlisis es ms apropiado.
En general, en esta etapa se podran usar
mtodos como los de ordenamiento de objetos (donde se logra la reduccin de dimensiones entre las variables o entre objetos a
una o pocas dimensiones). Otra posibilidad
es hacer anlisis de agrupamientos donde los
objetos se clasifican en categoras jerrquicas sobre la base de matrices de similitud
entre los mismos. En el primer caso, los objetos son representados en un espacio grfico
en los cuales los ejes constituyen gradientes
de combinaciones de variables. El mtodo de
anlisis de componentes principales (ACP),
que es un ejemplo de anlisis por ordenamiento, utiliza para tal fin las estructuras de
los autovectores (tambin llamados eigens
races latentes) de la matriz de correlacin
o bien de una matriz de varianza-covarianza
entre las variables originales.
El ACP y el anlisis factorial (AF) tienen
como objetivo encontrar una estructura ms
simple reduciendo la dimensionalidad de las
variables sin perder informacin. Para simplificar el anlisis de los datos se reduce el nmero de variables a un pequeo nmero de
ndices o factores. Algunas diferencias entre
estas dos tcnicas son que las componentes
principales estn definidas como una combinacin lineal de la variables originales y no
estn basadas en un modelo estadstico particular y por lo tanto no se requiere el cumplimiento de supuestos previos. En el AF las
variables estn expresadas como una combi-
nacin de factores, est basado en un modelo especial y requiere el cumplimiento de

distintos supuestos. Por otra parte mediante el ACP se busca explicar una gran parte de
la varianza total, mientras que con el AF se
enfatiza el estudio en las relaciones entre las
variables explicadas con las covarianzas o correlaciones. El AF resulta apropiado cuando
el objetivo consiste en encontrar un grupo
de variables similares, altamente correlacionadas, y postular que esas similitudes provienen del hecho de que stas son variables
latentes o factores que actan en forma
particular sobre el proceso estudiado.
Cuando el investigador est interesado
en definir grupos homogneos de objetos y
estudiar la estructura natural de las observaciones puede aplicar el anlisis de clusters. El
objetivo consiste en descomponer un conjunto de objetos en dos o ms grupos basados en la similitud de los objetos debido a
una serie de caractersticas especificadas. El
uso tradicional de clusters ha sido para propsitos exploratorios. Dado que no es una
tcnica de inferencia estadstica, para que los
clusters de objetos exhiban la mayor homogeneidad interna y la mayor diferenciacin
entre clusters slo se requiere que la muestra sea representativa y que las variables no
sean multicolineales. En este anlisis, adems,
slo se deben incluir aquellas variables que
contribuyan a caracterizar los objetos y que
se encuentren relacionadas con los objetivos
del anlisis. Este anlisis es similar al AF, la
diferencia es que ste agrupa a variables,
mientras que el anlisis de clusters agrupa a
objetos. Se recomienda que un anlisis de
clusters sea posteriormente complementado
con un anlisis de funciones discriminantes
(AD) sobre los grupos previamente identificados.
El escalamiento multidimensional (EMD),
involucra una serie de tcnicas que ayudan al
analista a identificar dimensiones subyacentes en la evaluacin de objetos. Es especialmente utilizado en ciencias del comportamiento, ya que permite identificar dimensiones no conocidas que afectan el comportamiento. Se basa en evaluaciones comparativas de objetos cuando las bases de comparacin son desconocidas o indefinibles. Se
transforma el comportamiento de quienes
perciben los objetos en distancias, las que fi-
195
nalmente se representan en un espacio

multidimensional. Si bien mediante el anlisis de clusters los objetos se agrupan de acuerdo con sus caractersticas, con el EMD no se
enfoca el inters en los objetos en s sino ms
bien, en cmo stos son percibidos. Esta tcnica mide la correlacin o covarianza de los
estmulos derivados de las caractersticas de
los objetos a ser evaluados. As, las representaciones grficas enfatizan las relaciones entre los estmulos que se estudian.
El anlisis de correspondencia (AC) es un
procedimiento de ordenacin apropiado
para datos de frecuencias (tablas de contingencia). En este caso, la distincin entre objeto y variable es menos relevante porque
stos son ordenados en forma simultnea.
Cuando los objetos o individuos se renen
en dos o ms grupos, definidos a priori, frecuentemente se plantea el problema de
cmo describir las diferencias entre grupos
sobre la base de un conjunto de variables. El
propsito bsico del AD es estimar la relacin que existe entre una variable dependiente cualitativa (machos vs. hembras o
genotipos resistentes vs. genotipos susceptibles) y entre un grupo de variables independientes cuantitativas con distribucin normal.
Lo mismo que en el caso de ACP y AF, el AD
se basa en la posibilidad de encontrar una
combinacin lineal de las variables originales.
Como caracterstica, el AD permite identificar aquellos grupos ya formados a los cuales
pueden ser asignados nuevos objetos en estudio (individuos, genotipos). Posibilita adems la identificacin de cul o cules de las
variables independientes contribuye ms a
la diferenciacin entre grupos.
El anlisis multivariado de la varianza
(MANOVA) es un procedimiento de inferencia estadstica usado para evaluar la
significancia de la diferencia entre los grupos,
que se hallan delimitados sobre la base de
las distintas variables independientes discretas o tratamientos. Es una extensin del
ANOVA, slo que las diferencias se establecen teniendo en cuenta simultneamente
dos o ms variables dependientes cuantitativas de distribucin normal. Por ello este
anlisis es particularmente til cuando los
datos provienen de diseos experimentales.
Tambin pude ser considerado como una
extensin del AD, aunque en ste la nica
196
variable dependiente es categrica y las variables independientes son cuantitativas,

mientras que el MANOVA involucra un grupo de variables dependientes cuantitativas
y las variables independientes son cualitativas.
Las correlaciones cannicas (CC) reducen
las dimensiones de dos grupos de variables
provenientes de un mismo conjunto de objetos o individuos de manera que se puedan
estudiar las relaciones conjuntas entre los
grupos. Es similar al AD slo que en las CC las
variables (no los objetos o individuos) son
divididas en grupos, por lo que el inters se
centra sobre las relaciones entre los grupos
de variables. Por ejemplo, las CC se pueden
utilizar cuando interesa conocer la relacin
existente entre los patrones de marcadores
moleculares, que representan diferentes
genotipos, y algunas caractersticas ambientales donde viven los individuos muestreados.
La regresin mltiple (RM) se considera
el mtodo apropiado cuando se presume
que los valores de una variable continua dependen de los valores que tomen las otras
variables. Esta tcnica, que explora todo tipo
de relaciones dependientes, tiene como objetivo predecir los cambios en una variable
dependiente cuantitativa en respuesta a los
cambios en las distintas variables independientes o predictoras. Los modelos de RM
constituyen la base para la estimacin de
parmetros en gentica cuantitativa. Son
ejemplos de su aplicacin la descomposicin
del valor genotpico en el efecto medio de
cada alelo y las interacciones debidas a dominancia y epistasis, el clculo de la estabilidad de los genotipos mediante la descomposicin de la interaccin genotipo ambiente, el parecido entre parientes, la ubicacin y
la utilizacin de QTL mediante marcadores
moleculares.
La ecuacin de regresin es una combinacin lineal de las variables independientes
que mejor predicen la variable dependiente.
La seleccin de las variables con mayor poder de prediccin se realiza mediante aproximaciones secuenciales, llamadas estimaciones
stepwise (pasos inteligentes). Mediante
los coeficientes de regresin estandarizados
es posible determinar la importancia relativa
de cada variable predictora. Las variables in-
dependiente y dependiente deben ser cuantitativas si bien, mediante transformaciones

previas, es posible incluir variables independientes no mtricas. La aplicacin del anlisis
de RL permite predecir una variable dependiente binaria (0,1). Es importante tener en
cuenta que para asignar causalidad en forma justificada es necesario disponer de una
cantidad adecuada de datos biolgicos experimentales.
Si se cumplen los supuestos bsicos, en
especial la normalidad de las variables, no hay
mayores diferencias entre la RL y el AD, slo
que en el caso que sea posible formar ms
de dos grupos, este ltimo resulta el ms
apropiado. Los modelos logartmicos lineales (LOGL) comprenden a otros anlisis que
permiten mostrar las relaciones que existen
entre variables categricas.
Lecturas recomendadas
EVERITT, B.S.; DUNN, G. 1991. Applied
Multivariate Data Analysis. E. Arnold,
London.
HAIR, J.F.; ANDERSON, R.E.; TATHAM, R.L.;
BLACK, W.C. 1995. Multivariate Data Analysis.
4ta. Ed. Prentice Hall - Upper Saddle River,
New Jersery.
MANLY, B.F. 1986. Multivariate Statistical
Methods. A Primer. Chapman and Hall,
London.
RENCHER, A.C. 1995. Methods Of Multivariate Analysis. J. Wiley & Sons, Inc. New York.
197
VI.-Captulo 2
Mtodos para estimar variabilidad
gentica
Winzer, Nlida; Di Renzo, Miguel; Olmos, Sofa
1 Introduccin
La informacin procesada a partir de las
tcnicas que se desarrollan en este libro pueden ser de diversos tipos y puede tratarse,
por otro lado, del anlisis de una sola variable o de varias variables evaluadas en cada
individuo o muestra.
Los anlisis estadsticos a utilizar dependen de estos dos aspectos, tipo de datos y
nmero de variables, y, adems, de qu objetivo se haya planteado el investigador.
Si se trata de una sola variable se podrn
aplicar las tcnicas aprendidas en un curso
bsico de estadstica (comparacin de dos
medias, anlisis de la varianza, anlisis de regresin, pruebas chi-cuadrado, etc.), o bien
alguna de sus generalizaciones.
En este captulo se desarrollarn en ms
detalle algunas metodologas multivariadas.
Se han seleccionado aquellas que se utilizan
con mucha frecuencia y que no requieren
demasiados conocimientos previos.
Los datos multivariados se ordenan en
una matriz. A efectos de unificar el lenguaje
se considerar que cada fila de la matriz representar un individuo, una muestra, una
especie; en definitiva, una OTU (Operational
Taxonomic Unit). Las columnas representarn los caracteres o variables que se observan en cada OTU.
2 Tipo de datos
DATOS DOBLE ESTAD: Son los tambin llamados datos binarios o dicotmicos. Estos datos se presentan cuando el carcter puede
tomar slo dos estados posibles. Habitualmente se codifican como 0 1.
Hay que reconocer dos tipos de situaciones donde pueden aparecer datos binarios.
a) Datos de presencia o ausencia. Slo se
registra la presencia ausencia del carcter.
Ejemplo: Presencia o no de una banda

en una corrida electrofortica de isoenzimas
o marcadores moleculares.
b) Datos doble estado excluyentes. El carcter tiene slo dos estados posibles y la
asignacin del 0 el 1 es indistinta.
Ejemplos: Carcter: Sexo. Codificacin:
Hembra = 0, Macho = 1,
Hembra = 1, Macho = 0.
Tipo de Fruto: dehiscente indehiscente.
Clasificacin de hojas: paripinadas
imparipinadas.
La distincin entre uno u otro tipo de dato
binario es importante al momento de seleccionar la medida de asociacin.
DATOS MULTIESTADO CUALITATIVOS: El carcter
puede tomar un conjunto finito de estados.
Ejemplos: Margen de la hoja: aserrado,
lobulado, entero.
Color de la flor: blanca, roja o rosada.
Disposicin de fololos en el raquis:
alternos, subopuestos, opuestos.
Identificacin de los nucletidos presentes en una determinada secuencia de ADN:
A,C, T, G.
Identificacin de los aminocidos esenciales presentes en una protena: Gly, Ala, Ser,
Thr, Cys, Val, Ile, Leu, Pro, Phe, Tyr, Met, Trp,
Asn, Gln, His, Asp, Glu, Lys, Arg.
Clases de embriones somticos: globular,
acorazonado, torpedo, cotiledonar.
DATOS MULTIESTADO CUANTITATIVOS DISCRETOS: estn asociados a valores de conteo.
Ejemplos: Nmero de hileras por espiga,
nmero de macollos por planta, nmero de
inflorescencias.
DATOS MULTIESTADO CUANTITATIVOS CONTNUOS:
Representan propiedades que se pueden
expresar en una escala contnua.
Ejemplos: Biomasa de plantas, peso de
semillas, longitud de partes verdes, concentracin de protena del grano, frecuencia relativa de un alelo.
3 Medidas de asociacin y distancia
Un objetivo frecuente suele ser la descripcin del grado de parecido que hay entre las
199
OTUs,. Para ello ser necesario medir ese grado de similitud.
J12 =
a
a+b+c
Se describirn a continuacin algunas de

las medidas que aparecen con mayor frecuencia en la literatura.
Es la proporcin de caracteres presentes

que comparten, respecto al total de caracteres presentes en las 2 OTUs.
Hay dos tipos de medidas: los ndices de

asociacin y las distancias. Los primeros miden el grado de similitud: Cuanto ms parecidas sean 2 muestras, mayor ser su asociacin. Las segundas miden el grado de disimilitud: cuanto ms parecidas son 2 muestras
menor ser su distancia.
DICE
1
0
Se puede probar que Jaccard siempre

dar un valor de asociacin menor que Dice,
salvo cuando toman el valor 0 1, caso en
que siempre coinciden. Ms an, ambos estn relacionados mediante la ecuacin J = D/
(2-D) D = 2J/(1+J). Esta relacin tiene como
consecuencia, entre otras, que en un Anlisis
de Cluster, cuando se usa ligamiento simple
o completo, den los mismos grupos, slo que
con distintos valores de asociacin.
Este es un proceso tpico en el anlisis de

la informacin a partir de bandas. Primero
se codifica la informacin, se construye la
matriz de datos y, en este caso, se calcularon
A
Dos de los ndices que comparten

este criterio son Jaccard y Dice.
JACCARD
200
Ejemplo: Como resultado de la aplicacin

de la tcnica RAPD sobre 6 muestras se registr la siguiente informacin sobre la presencia o ausencia de 8 bandas generadas por un
cebador:
OTU 1
1
0
a
b
c
d
Si los datos son de presencia/ausencia, un criterio vlido es considerar

que dos muestras son ms parecidas
cuantos ms unos compartan. La
coincidencia de ceros no aporta a
la similitud porque puede estar generado por falta de informacin (la no
amplificacin de un fragmento RAPD
no informa si esto es producido por
la carencia del sitio de hibridacin del
cebador o bien como consecuencia
de una mutacin de punto en dicho
sitio, por ejemplo).
2a
a
=
+
+ (a + c)
(a
b)
2a + b + c
2
Es la proporcin de caracteres copresentes respecto al promedio de los caracteres presentes en cada OTU.
Para datos binarios es usual trabajar con

medidas de asociacin. Entonces, para caracterizar a dos OTUS existen 4 valores a considerar:
a = N de caracteres donde ambas muestras coinciden en el 1;
b = N de caracteres donde la primera
muestra tiene un 1 y la otra un 0;
c = N de caracteres donde la primera
muestra tiene un 0 y la otra un 1;
d = N de caracteres donde ambas muestras coinciden en el 0.
La suma de estos 4 valores dar el total
de caracteres medidos.
OTU 2
D12 =
1
2
3
4
5
6
7
8
A
1
1
0
1
1
0
1
0
1
2
3
4
5
6
7
8
Codificacin
B
0
1
1
1
1
0
0
0
C
0
0
1
0
0
1
0
1
D
1
1
1
0
0
0
0
0
E
1
1
0
1
1
0
1
0
F
0
1
1
1
1
1
1
1
Matriz de Datos
1
1
0
0
1
1
0
A
B
C
D
E
F
2
1
1
0
1
1
1
3
0
1
1
1
0
1
Bandas
4
1
1
0
0
1
1
5
1
1
0
0
1
1
6
0
0
1
0
0
1
Asociacin de Jaccard
A
B
C
D
E
F
7
1
0
0
0
1
1
8
0
0
1
0
0
1
Asociacin de Dice
1
0.5
0
0.333
1
0.5
0.5
1
0.167
0.4
0.5
0.571
0
0.167
1
0.2
0
0.429
0.333
0.4
0.2
1
0.333
0.25
1
0.5
0
0.333
1
0.5
0.5
0.571
0.429
0.25
0.5
1
A
B
C
D
E
F
1
0.667
0
0.5
1
0.667
0.667
1
0.286
0.571
0.667
0.727
0
0.286
1
0.333
0
0.6
0.5
0.571
0.333
1
0.5
0.4
1
0.667
0
0.5
1
0.667
0.667
0.727
0.6
0.4
0.667
1
WINZER, Nlida; DI RENZO, Miguel y Sofa OLMOS
las matrices de asociacin de Jaccard y Dice a

efectos de observar las caractersticas mencionadas ms arriba.
Entre las muestras A y C no se observaron bandas en comn, por lo tanto a = 0 y
tanto Jaccard como Dice dan 0.
Por otro lado, A y E comparten la presencia de las mismas bandas: a = 5, b = 0, c = 0.
Tanto Jaccard como Dice dan 1.
Entre B y E: a = 3, b = 1, c = 2. Por lo tanto, de las 6 bandas presentes en una u otra
muestra comparten 3. As Jaccard vale 0.5. El
total de bandas de B es 4 y el total de bandas detectadas en E es 5. El promedio de
estos totales da 4,.5 por lo que la asociacin
de Dice da (3/4,5) = 2/3 = 0,667.
Se observa tambin que, salvo los 0 y los
1, todos los valores de Jaccard son menores
que los de Dice.
Adems, ambas matrices son simtricas:
la asociacin entre A y E es la misma que la
que se da entre E y A. Por eso, basta mostrar
la mitad de la matriz de asociacin.
Esta observacin ser vlida para todas
las medidas que se presenten en este captulo.
Si los datos son binarios pero de estados
equivalentes, 2 muestran debern considerarse ms asociadas tanto cuando comparten unos como ceros, ya que la codificacin que se les asigna es indistinta.
Un ndice recomendable por su simplicidad es el de Simple Matching o de Concordancia Simple:
SM12 =
SIMPLE MATCHING
a+d
a+b+c+d
Simplemente es la proporcin de caracteres que comparten las dos muestras.

Si se piensa que la matriz de datos anterior corresponde a 8 caracteres binarios de
estados equivalentes la matriz de asociacin
con el ndice de Simple Matching dar:
A
B
C
D
E
F
0.625
1
0
0.375
1
0.5
0.625
0.5
1
1
0.625
0
0.5
1
0.5
0.625
0.5
0.250
0.5
1
Se observa que A y E comparten todos

los caracteres, por lo tanto tienen la mxima
asociacin. En cambio C y E no coinciden en
ninguno, su asociacin es 0. La asociacin
entre C y D y entre D y E es 0,5, lo que significa que coinciden en la mitad de los caracteres evaluados.
Adems de las que se han definido hasta
ahora, existen muchas otras medidas para
datos binarios. Tambin se pueden definir
medidas de distancia o asociacin para distintos tipos de datos multiestado. Para no
extender en demasa esta seccin se presentarn algunas distancias definidas especficamente para frecuencias allicas.
4 Distancias genticas
Se pueden clasificar en 2 grupos: las basadas en un modelo geomtrico (Cavalli-Sforza
y Rogers) y las basadas en modelos consideraciones biolgicas (Nei).
Para n poblaciones, hay n(n-1)/2 pares, y
si en cada una de ellas se tiene la informacin sobre los loci para m alelos, y tambin
sus frecuencias correspondientes, stas pueden expresarse de la siguiente manera:
Pob. 1: p1, p2, ... , pm
Pob. 2: q1, q2, ... , qm
Distancia Cuerda de CAVALLI-SFORZA y
EDWARDS (1967)
d12 = 2 1 - pi q i )
i =1
Los puntos P* = ( p1 , p 2 ,..., p m ) y

Q*= ( q1 , q 2 ,..., q m ) estn sobre una esfera de radio 1. La distancia Cuerda es, precisamente, la longitud de la cuerda que une
esos 2 puntos.
Para el caso m = 2, se ve en el grfico la
distancia cuerda entre los puntos P = (0.3,
0.7) y Q = (0.8, 0.2). Los puntos originales son
llevados a la esfera (crculo) de radio 1 y luego se calcula la distancia entre esos 2 puntos: d = 0.5324
201
Los dos ltimos trminos equivalen a un

estado de homocigosis en la poblacin 1 y 2,
respectivamente.
Nei define primero la Identidad normalizada (vara entre 0 y 1) :
P*
0.8
P
0.6
Q*
0.4
I=
i i
i =1
i =1
i =1
pi2 qi2
0.2
p q
0
0
0.2
0.4
0.6
0.8
y luego la Distancia Estndar: D12 = - ln I.

Si se consideran simultneamente varios
loci la distancia Cuerda se calcula as:
r
d12 = 2 1 -
i =1
pijq ij )
mi
j=1
j=1
ij
- q ij ) 2
En el grfico, sta es la distancia habitual

entre los puntos P y Q.
Distancia Estndar de NEI (1972):
Esta distancia tiene una base biolgica.
Expresa la probabilidad de que dos alelos
tomados al azar de dos poblaciones diferentes sean idnticos (con respecto a la probabilidad de que lo sean dos alelos tomados al
azar de la misma poblacin). Sean, como antes, las poblaciones 1 y 2 y las frecuencias
allicas de un solo locus:
pi q i se puede interpretar como la probabilidad que 2 alelos sean iguales si uno ha

sido elegido al azar de la poblacin 1 y el otro
de la poblacin 2.
sera la probabilidad que 2 alelos
elegidos al azar de la poblacin 1 sean iguales;
sera la probabilidad que 2 alelos
elegidos al azar de la poblacin 2 sean iguales.
202
mi
p q
ij ij
i =1 j=1
mi
mi
p q
i =1 j=1
mi
(p
D12 = - ln
Distancia de ROGERS (1972)
1 r
R 12 =
r i =1
Si se usan varios loci se trabaja con el promedio aritmtico de las probabilidades definidas anteriormente resultando:
2
ij
i =1 j=1
2
ij
Ejemplo: Para la informacin de la tabla, en

el caso de las frecuencias de cinco alelos
provenientes de dos loci, se tiene: I =
0.857986 y, por lo tanto, D = 0.15317.
En las poblaciones naturales una de las

formas de realizar el agrupamiento jerrquico de las mismas en razas, es mediante el
empleo de medidas de divergencia gentica.
Aqu, las llamadas distancias genticas tienen
su mayor aplicacin. Las medidas de distancias genticas basadas en modelos biolgicos son las ms empleadas en estudio de
gentica poblacional, debido a que resumen
los conocimientos obtenidos de las fuerzas
evolutivas que conllevan a los cambios
genticos es decir, mediante mutaciones y
deriva gentica.
La medida de distancia gentica estndar
de Nei es ms confiable cuando se utilizan
datos provenientes de muchos alelos. La distancia de Nei est formulada para un modelo donde se asume que las mutaciones ocurren en forma infinita, con la misma probabilidad para todos los alelos a una tasa de
mutacin neutral, y que la variabilidad
gentica inicial en la poblacin est en equilibrio entre la variabilidad producida por mutaciones y por deriva gentica, siendo el tamao efectivo de la poblacin, en cada una,
constante. Basndose en estos supuestos, y
de que todos los loci sean equivalentes entre s, se espera que la Distancia de Nei
incremente linealmente con el tiempo. Si las
frecuencias allicas en cada poblacin han
sido estimadas con pocas muestras se pueden utilizar en cambio algunas modificaciones a la Distancia Estndar de Nei como las
propuestas por Nei, (1978) y Hillis, (1984). La
distancia de Cavalli-Sforza y Edwards, por el
contrario, asume que las diferencias entre las
poblaciones no provienen de mutaciones
sino solamente como consecuencia de la deriva gentica. Adems, no asume que el tamao poblacional ha permanecido constante en todas las poblaciones. Considera que
el tamao de la poblacin cambia en forma
lineal pero no con el tiempo sino con 1/N,
donde N es el tamao efectivo de la poblacin. As en estos casos, los conocimientos
bsicos de gentica poblacional brindarn las
herramientas necesarias en el momento de
la eleccin del mtodo ms apropiado para
el anlisis de nuestros datos.
5 Anlisis de coordenadas principales
Si se tiene una matriz de distancias entre
N muestras ser posible representar cada
muestra mediante un punto de manera tal
que las distancias resultantes reproduzcan las
de la matriz?
Veamos dos ejemplos:
(i) Si se tiene la siguiente matriz D de distancias entre las muestras A, B y C:
1
.447
0
D= 1
0
.707
.447 .707
0
se podran hacer algunos de los siguientes grficos:
1.4
1.2
1.0
B
0.8
0.6
0.4
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
0.5
II
0.3
C
0.1
-0.1
-0.3
-0.5
-1.0
-0.5
0.0
0.5
1.0
0.5
III
0.3
0.1
A
B
-0.1
C
-0.3
-0.5
-1.0
-0.5
0.0
0.5
1.0
Coordenadas de A, B y C:
I:(1.444, 0.881); (0.445, 0.94); (1.111, 1.179)
II:(0.444, -0.119); (-0.555, -0.06); (0.111,0.179)
III: (0.444, 0.119); (-0.555, 0.06); (0.111,-0.179)
Si se calcula la distancia eucldea entre los
puntos en uno cualquiera de estos grficos
se ve que se han reproducido exactamente
los valores de la matriz D. Por ejemplo:
d E (A, B) = (1.444 - 0.445) 2 + (0.881 - 0.94) 2 = 1
en el grfico I.
(ii) Si se tuviera la matriz de distancias
entre las muestras P1, P2 y P3:
Es fcil ver que es
imposible representar
en un plano puntos
separados por estas
distancias porque si
P1 y P2 se ubican como extremos de un segmento de longitud 0.9, no hay manera de
ubicar un punto P3 que est a 0.5 de P1 y a
0.3 de P2.
0 0.9 0.5
#
D = 0.9 0 0.3
0.5 0.3 0
203
P1
P1
P2
P 3? P 3?
P2
Se van a considerar, por ahora, distancias

como las del ejemplo i). Esto es, distancias
para las que se puedan encontrar puntos que
reproduzcan esas distancias.
Otro aspecto a considerar es el nmero
de coordenadas necesarias para esos puntos.
Es intuitivo que si slo hay 2 muestras a una
distancia dada se pueden graficar en una recta (dimensin =1); si hay 3 muestras ya se vi
que se pueden graficar en un plano (dimensin = 2); si se tuvieran 4 muestras ya son
necesarias 3 coordenadas (dimensin = 3);
... y si se tienen N muestras se necesitarn,
en general, N-1 coordenadas. Con lo cual si
se quieren graficar 40 muestras sern necesarias 39 coordenadas!!!
Es evidente que esto no es cmodo si el
objetivo es obtener una representacin grfica de los puntos o muestras. Lo ideal sera
obtener dos coordenadas pues se podran
graficar en un plano, o bien tres para graficar
en 3 dimensiones.
El problema, entonces, es encontrar las 2
mejores coordenadas ( las 3 mejores) para
obtener esta representacin. Ese es el objetivo del Anlisis de Coordenadas Principales
(ACOOP): encontrar las k mejores coordenadas para las muestras de manera tal que si
se calculan las distancias eucldeas entre ellas
reproduzcan lo mejor posible una matriz de
distancias dada. Habitualmente k = 2 3, a
stas, se las llama Coordenadas Principales.
Naturalmente se perder la informacin
de las restantes coordenadas.
Como se vi en el ejemplo (i) hay muchas
representaciones posibles. Ah se han dado
3 pero se podran haber dado muchas ms.
Una manera de reducir las opciones es obtener coordenadas de manera tal que los puntos estn centrados en el origen, como en II
III.
Se explicar el mtodo de obtencin de
las Coordenadas Principales partiendo de una
matriz de Asociacin S. En este caso las distancias que se van a reproducir son las definidas por:
d2(i, j) = Sii+ Sjj- 2 Sij
(1)
204
donde Sij es la asociacin entre la muestra i y

la j. Si la asociacin de una muestra consigo
misma es 1, es decir Sii = 1, como ocurre con
la mayora de los ndices, la ecuacin se reduce a:
d2(i, j) = 2(1- Sij ).
(2)
Se detallarn los pasos que se deberan

realizar para hacer este anlisis al simple efecto
de poder manejar con idoneidad los programas estadsticos de que se dispongan. Los
pasos 1) a 3) son responsabilidad de esos
programas. El usuario deber, fundamentalmente, indicarle qu asociacin o distancia
desea calcular y cuntas coordenadas quiere.
PASO 1) Centrar doblemente la matriz S
S0 .
P A S O 2) Calcular los autovalores y
autovectores de S0.
PASO 3) Calcular las coordenadas de los
puntos representativos de las muestras.
PASO 4) Graficarlos.
El PASO 1 tiene como fin hacer que los puntos resultantes estn centrados. Cada elemento de la matriz de asociacin S se centra
por filas y por columnas:
(3)
donde Si es el promedio de la fila i de S,
S j es el promedio de la columna j y S es el
promedio de todos los elementos de S.
En el PASO 2 se encuentran:
a) una matriz NxN donde cada columna
es un vector de longitud uno. Son los
autovectores.
b) N nmeros ordenados en forma decreciente: los autovalores.
Estos elementos son caractersticos de
cada matriz S0. Por eso tambin se los conoce como vectores y valores caractersticos.
Cada autovector est asociado a un
autovalor.
Si la matriz de distancias es representable (como la del ejemplo (i)) los
autovalores sern positivos o ceros (el ms
chico es siempre cero para estas matrices
representables).
Sij0
En el PASO 3 , si se desean k coordenadas, se toman los k primeros autovectores

y se multiplican por la raiz del autovalor
respectivo. El primer autovector da la primera
coordenada de todas las muestras, el
segundo la segunda coordenada y as
siguiendo hasta la k-sima. Si slo se desean
2 coordenadas para graficar los puntos en
un plano se toman los 2 primeros autovectores (k=2).
Veamos un ejemplo sencillo:
0.5 0.9
1
S = 0.5
1
0.75
0.9 0.75
1
Autovalores de S0 :
a1=
l1 + l2
x 100%
l1 +l2 +...+ln
si slo se usan 2 coordenadas.

Este porcentaje se interpreta teniendo en
d ij2 , sucuenta que: 2N (1 + ...+ N) =
mando sobre todos los pares de muestras.
En cambio, la suma del cuadrado
0.21110.2390.028
de las distancias reconstruidas
Doble centrado S0 = -0.239 0.3111 -0.072

con las dos coordenadas es igual
0.0280.0720.0444
a 2N (1 + 2). Por lo tanto, este

l1 = 0.5167 l2 = 0.05
l3 = 0
porcentaje mide cunto se rev1
v2
v3
construye del cuadrado de todas
0.6173 - 0.5344 0.57735
las distancias.
Autovectores de S0 : Columnas de V = -0.7716
0.1543
Primeras 2 Coordenadas:
Muestra 1
Muestra 2
Muestra 3
sij0
de las distancias. Hay 2 tipos de porcentajes

que se pueden calcular:
Porcentaje de Dispersin:
- 0.2674
0.8019
l11 v
l 22 v
0.4437
-0.5546
0.1109
-0.1195
-0.0598
0.1793
Grfico: Es el Grfico II que se vi ms arriba donde A es la muestra 1, B la 2 y C la

muestra 3.
Las distancias ( 2 ) calculadas a partir de
la matriz de asociacin S dan la matriz de Distancias D. Por esa razn ambas matrices tienen la misma representacin.
2
d12
= 2(1 - S12 ) = 2(1 - 0.5) = 1
d12 = 1
2
d13
= 2(1 - S13 ) = 2(1 - 0.9) = 0.2
d13 = 0.447
d 223 = 2(1 - S23 ) = 2(1 - 0.75) = 0.5 d 23 = 0.707
OBSERVACIN 1: Como en el ejemplo

slo hay 3 muestras los autovectores tienen
3 componentes. Si se trabajara con una matriz de asociacin entre 40 muestras, los
autovectores tendran 40 componentes, una
por cada muestra.
OBSERVACIN 2: Para la matriz S se han
reconstrudo totalmente las distancias porque slo son 3 muestras. Si hubiera ms
(N=40, por ejemplo) slo se reconstruiran
totalmente las distancias si se usan 39 coordenadas. Si se usan slo las dos primeras se
reconstruye, en general, slo un porcentaje
0.57735
0.57735
Si se usan ms de 2 coordenadas se van sumando los

autovalores correspondientes en
el numerador.
En nuestro ejemplo:
1 = 100% .
Porcentaje de Distorsin:
2
l1+l2
a1= 2
x 100%
l 1 +l22 +...+l2n
Este valor mide cunto se acercan los valores de la matriz de asociacin reconstruda
respecto de la matriz de asociacin original
S0. Ms exactamente:
0
0* 2
a2= 1- S - 0S2
S
x 100%= 1-
(S - S
(S )
0
ij
0* 2
ij
0 2
ij
x 100%
En este algoritmo se ve que lo que se est

comparando son las asociaciones originales,
0*
,con las reconstruidas, sij , una a una. Para
el clculo de 2 se usa la primera frmula por
lo que el lector no debe traumatizarse con la
segunda.
OBSERVACIN 3: Si se hubieran obtenido autovalores negativos la primera medida
no es recomendable. Hasta podra darse el
caso que 1 fuera mayor al 100%. La segunda, en cambio, sigue teniendo sentido. Por
205
otro lado, no se podran calcular coordenadas asociadas a ese autovalor porque no se

puede calcular i .
La aparicin de autovalores negativos no
es necesariamente un problema grave para
la representacin siempre que los autovalores
negativos sean pocos y pequeos. Por ejemplo, si se trabaja con 50 muestras, en el PASO
2 se obtendrn 50 autovalores, de los cuales
uno, seguramente, es cero. Para la representacin en el plano se usan slo los 2 primeros. Si los ltimos 10 son negativos no se vern afectados los clculos de las coordenadas.
Hay asociaciones y distancias que nunca
dan autovalores negativos, entre ellos se
encuentran Jaccard, Ochiai, Russell y Rao, Simple Matching, y distancia eucldea.
Si en lugar de tener una matriz de asociaciones se tiene una matriz de distancias el
procedimiento consiste en calcular una matriz S cuyos elementos son:
(4)
2
sij = -
d ij
2
y luego seguir los PASOS 1, 2, 3 y 4 anteriores.

OBSERVACIN 4: Cada autovector de S0
es un vector de longitud 1 en una cierta direccin. Pero por cada direccin podemos
tener 2 vectores: v y -v. Por ejemplo:
-0.5344
v 2 = -0.2674
0.8019
0.5344
- v 2 = 0.2674
-0.8019
No debe causar sorpresa, entonces, que

con un programa se obtenga un grfico y con
otro el mismo grfico pero con una reflexin
sobre uno u otro eje, o sobre los dos.
Por otro lado, tambin es lcito cambiar,
por alguna razn, el signo de una coordenada. Por ejemplo, esto puede ser til cuando
se quieren comparar Anlisis de Coordenadas Principales realizados con distintas asociaciones o distancias sobre el mismo conjunto de muestras.
Ejemplo:
Presentamos la caracterizacin de 8
cultivares comerciales y 35 cultivares en experimentacin mediante anlisis isoenzimtico
de semillas de Amaranthus. Estas accesiones
pertenecen a siete especies: A. caudatus, A.
cruentus, A. hypochondriacus, A.
mantegazzianus, A. dubius, A. tricolor, y A.
hybridus. Del total de 43 cultivares, 31 fueron polimrficas con 7 sistemas isoenzimticos. Se aplic anlisis de coordenadas
principales el cual, estuvo basado en la presencia o ausencia de las 23 bandas polimrficas. En la figura puede observarse el nivel de diversidad gentica dentro de este
germoplasma representado por las coordenadas 1 y 2. Este anlisis agrup la mayora
de los cultivares de acuerdo a su clasificacin
taxonmica as como mostr que existen relaciones entre diferentes accesiones. Se concluye que el anlisis isoenzimtico de semillas
fue efectivo para caracterizar los cultivares
destinados a los programas de mejoramiento de Amaranthus.
A.cruen.
A.hypoch
A.caudat.
A.manteg.
A.dubius
A.tricolor
A.hybrid.
0.6
Cualquiera de estos dos vectores

pueden usarse como segundo
autovector y, ms an, algunos programas pueden dar como resultado el
primero y otros el segundo. Como consecuencia de esta seleccin se obtendr el grfico II el III. Se ve que el
nico efecto de usar uno u otro vector
es una reflexin del grfico respecto
del primer eje. Si se cambia el signo de
v1 se obtendr una reflexin respecto
del segundo eje. Ninguno de estos
cambios modifica la distancia entre los
puntos.
206
38-39
40-43
0.4
6-9-10-11
41
0.2
14
5
42
27
4
28
13
17
36
0.0
35
12
15
7
8
-0.2
18-22
29-30
-0.4
37
34
20
16
25
26
19
21
23
32-33
31
24
-0.6
-0.6
-0.4
-0.2
0.2
0.4
0.6
Matriz de datos
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
1
1
1
1
1
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2
1
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1
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1
1
1
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3
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4
1
1
1
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1
1
1
1
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6
1
1
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7
1
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8
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9
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1
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1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
10
1
1
1
0
1
1
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0
1
1
1
1
1
1
1
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1
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1
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1
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1
1
1
1
1
1
1
1
11
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0
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0
0
0
0
0
0
0
0
1
0
1
1
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1
207
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
V1
-0.12709
-0.10710
-0.12311
-0.00462
-0.22005
-0.23182
-0.12459
-0.12472
-0.23182
-0.23182
...
V2
0.03060
0.13683
0.09085
0.07441
0.07043
0.16179
-0.11226
-0.09717
0.16179
0.16179
...
CP1
-0.27881
-0.23496
-0.27007
-0.01014
-0.48274
-0.50856
-0.27331
-0.27360
-0.50856
-0.50856
...
Al slo efecto de que el lector pueda repasar algunos clculos se dan los primeros 10
elementos de los 2 primeros autovectores y
las 2 primeras coordenadas Principales.
6 Anlisis de agrupamientos (cluster)
Esta tcnica tiene como objetivo formar
grupos de muestras, poblaciones, individuos
u OTUs que sean similares entre s y diferentes a los elementos de los otros grupos.
El primer problema es fijar el criterio para
decidir cundo dos elementos son similares.
Si se tuviera un mazo de cartas, cmo formar grupos? por el valor de la carta?, porque comparten el palo?. Segn el criterio que
se aplique los grupos que se formen sern
distintos.
En la seccin anterior hemos visto distintas maneras de definir la similitud o disimilitud entre OTUs. Cada una de ellas, u otras
que no se han presentado aqu, plantean
distintas formas de medir la similitud entre
los elementos a agrupar.
Existen, adems, muchos mtodos para
formar los grupos. Uno de los ms usados
son los agrupamientos jerrquicos que pueden, a su vez, ser divisivos o aglomerativos.
Los primeros comienzan con todos los elementos en un solo grupo y en sucesivas divisiones se van formando grupos cada vez ms
pequeos. Los aglomerativos, por el contrario, empiezan considerando tantos grupos
como elementos se tienen y se van agrupando segn su grado de parecido. Los sucesivos pasos de uno y otro mtodo se pueden
representar en un grfico denominado
dendrograma.
208
CP2
0.05495
0.24570
0.16313
0.13362
0.12647
0.29052
-0.20157
-0.17448
0.29052
0.29052
...
Autovalores:
4.81258
3.22431
1 = 46.85 2 = 78.2
En esta seccin se tratarn solamente los

mtodos jerrquicos divisivos.
Aqu se plantea un segundo problema:
Qu tipo de ligamiento se va a utilizar? Esto
es, una vez realizado el primer agrupamiento, cmo se define la distancia entre ese grupo y los restantes elementos?
Supongamos que en un primer paso se
han agrupado los elementos A y B porque
son los que presentan la menor distancia
entre s. La distancia entre el nuevo grupo
AB y otro elemento C se puede definir segn
el criterio empleado para incorporar al nuevo elemento:
LIGAMIENTO SIMPLE: d(AB,C) = mn {d(A, C), d(B,
C)},
LIGAMIENTO
d(B, C)},
COMPLETO:
d(AB,C) = mx {d(A, C),
LIGAMIENTO PROMEDIO:
d({A,B},C) =
d(A, C) + d(B, C)
2
En el caso del ligamiento simple, la incorporacin del nuevo elemento est basada en
la extraccin de los menores valores de distancias entre el nuevo elemento y el grupo
preformado, y entre el nuevo elemento y las
restantes OTUs que se consideren. En cambio, el ligamiento completo lo que hace es
extraer los mayores valores de distancia, respectivamente. Si A, B y C son grupos formados en pasos anteriores, se usan los mismos
algoritmos en el caso del ligamiento simple o
completo. Para el ligamiento promedio hay
que promediar todas las distancias entre ele-
mentos de AB y de C:
d(AB, C) =
ij
A
B
C
D
E
F
A
0
1
1.41
1.15
0
1.1
B
1
0
1.29
1.10
1
0.93
C
1.41
1.29
0
1.26
1.41
1.07
D
1.15
1.10
1.26
0
1.15
1.22
E
0
1
1.41
1.15
0
1
AE
B
C
D
F
AE
0
1
1.41
1.15
1.1
B
1
0
1.29
1.10
0.93
C
1.41
1.29
0
1.26
1.07
D
1.15
1.10
1.26
0
1.22
F
1.1
0.93
1.07
1.22
0
i, j
n AB n C
F
1.1
0.93
1.07
1.22
1
0
donde dij es la distancia entre

el elemento i del grupo AB y el j de
C; nAB y nC son los nmeros de elementos en el grupo AB y C, respectivamente.
Este ligamiento promedio se
conoce tambin por las siglas
UPGMA (Unweighted Pair Groups
Method
with
Arithmetic
AE
BF
C
D
Averages).
AE
0
1.1
1.41
1.15
0
1.29
1.22
Consideremos la matriz de dis- BF 1.1
1.29
0
1.26
tancias de la tabla. Se realizar un CD 1.41
1.15
1.22
1.26
0
agrupamiento
aplicando
ligamiento simple.
AEBF C
D
En primer lugar se agrupan los AEBF 0 1.41 1.22
C
1.41
0
1.26
elementos A y E porque estn a
D
1.22 1.26
0
menor distancia (son iguales). ForAEBFD
C
mado ese primer grupo habra que
AEBFD
0
1.41
calcular las nuevas distancias del
C
1.41
0
grupo AE a los restantes elementos pero como d(A, U) = d(E, U) para
todos los restantes elementos U se
AE
BF
C
D
mantienen esas distancias.
AE
0
1.05
1.41
1.15
En el segundo paso se observa BF 1.05
0
1.18
1.16
1.18
0
1.26
que la menor distancia es la de B a CD 1.41
1.15
1.16
1.26
0
F; se forma ese grupo y se
recalculan las distancias del nuevo
AEBF
C
D
grupo a los restantes. Y as hasta AEBF 0 1.295 1.155
C
1.295
0
1.26
que se han agrupado todos. TamD
1.155
1.26
0
bin se puede detener el proceso
AEBFD
C
fijando algn otro criterio para ello.
AEBFD
0
1.277
Por ejemplo, cuando se ha alcanC
1.277
0
zado una distancia mxima fijada
previamente.
A continuacin se aplica el ligamiento mados inicialmente se van acoplando los rescompleto. Los 2 primeros agrupamientos co- tantes elementos. En cambio, el ligamiento
inciden en este ejemplo, por lo que slo se completo tiende a generar muchos grupos
muestran los tres ltimos pasos.
chicos que se reunirn en los ltimos pasos.
El ligamiento promedio conduce a las siEl anlisis de Agrupamientos slo debe
guientes agrupaciones:
tomarse como un mtodo exploratorio. Si
Los mismos mtodos se pueden aplicar originalmente los datos forman grupos bien
sobre matrices de asociacin cambiando los separados cualquier mtodo de agrupamienconceptos de menor distancia por el de to dar, aproximadamente, los mismos remenor asociacin.
sultados. Pero si las muestras forman un
En general, el ligamiento simple produce contnuo, cada mtodo y cada medida de
agrupamientos en cadena: a los grupos for- distancia pueden conducir a resultados muy
AE
BF
C
D
AEBF
C
D
AE
0
1
1.41
1.15
AEBF
0
1.07
1.10
BF
1
0
1.07
1.10
C
1.07
0
1.26
C
1.41
1.07
0
1.26
D
1.15
1.10
1.26
0
AEBFC
D
AEBFC
0
1.10
D
1.10
0
D
1.10
1.26
0
209
dispares. En este caso las conclusiones deben

realizarse con cautela.
A veces es conveniente realizar un Anlisis de Coordenadas Principales para determinar si existen grupos claramente definidos o
no.
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210
PARTE VII
Genmica
211
212
ECHENIQUE, Viviana; SCHRAUF, Gustavo; SELVA, Juan P.
VII.-Captulo 1
Genmica
Echenique,Viviana; Schrauf, Gustavo;
Selva, Juan P.
1 Introduccin
La genmica se desarroll en los ltimos 10 aos como consecuencia de los avances realizados en biologa molecular e Informtica, dos reas de la ciencia que han tenido un desarrollo tecnlogico enorme, generando una revolucin en el conocimiento y
en la comprensin de los procesos biolgicos. El trmino fue acuado en 1986 por
Thomas Roderick para referirse a la
subdisciplina de la gentica que se ocupa
del mapeo, secuenciacin y anlisis de las
funciones de genomas completos y sirvi de
nombre para una revista especializada en la
publicacin de los mencionados temas,
Genomics. Consiste en la caracterizacin
molecular de genomas enteros y aporta informacin acerca de la secuencia y de la funcin de cada sector del genoma en diferentes situaciones de desarrollo y bajo diferentes condiciones ambientales, as como
de los mecanismos implicados en la regulacin de la expresin e interaccin gnica.
Para ello, las herramientas que se utilizan para
el anlisis individual de genes o pequeas
regiones cromosmicas, se aplican al anlisis
global de genomas completos, estudiando
en conjunto los miles de genes, protenas y
metabolitos que constituyen un organismo,
as como las complicadas redes de
interacciones que operan entre ellos. La informacin generada es enorme y es clave para
la identificacin y el aislamiento de genes de
inters y permitir interpretar, en trminos
moleculares, los procesos biolgicos. Para
ayudar en este proceso han surgido poderosas herramientas bioinformticas que permiten almacenar e interpretar esta informacin.
Las aplicaciones de la genmica alcanzan
a todos los mbitos de la actividad humana
relacionados con la biologa, como la salud,
la alimentacin y el medio ambiente. En pocos aos estarn disponibles las secuencias
de nucletidos y aminocidos de todos los

genes y productos gnicos codificados por los
genomas de varios organismos complejos.
Estas servirn para el estudio de enfermedades humanas complejas y para comprender
fenmenos tales como la fisiologa celular, el
desarrollo, la conducta, la evolucin, etc. Tambin aportarn informacin acerca de todos
los aspectos del crecimiento y desarrollo vegetal, diferenciacin y respuesta a estreses
biticos y abiticos. Gracias al potencial de
relacionar fenotipos biolgica y econmicamente importantes con los genes responsables de los mismos ser posible identificar
genes de inters que puedan ser transferidos a otros organismos por medio de tecnologa gnica. Por otro lado, el conocimiento
de la secuencia de los genes posibilitar el
desarrollo de marcadores perfectos, basados en la secuencia del mismo gen, lo cual
facilitar la seleccin y la transferencia de los
mismos a variedades de inters. La conjuncin entre tecnologa gnica, marcadores
moleculares, genmica y bioinformtica revolucionar el mejoramiento gentico vegetal,
dando origen a lo que se denomina mejoramiento molecular y conducir al desarrollo
de nuevos y promisorios cultivares (Fig. 1).
La genmica se divide en dos grandes
reas:
- Genmica estructural, que se ocupa de
la caracterizacin fsica de genomas enteros.
- Genmica funcional, que caracteriza el
transcriptoma, que est constitudo por el
conjunto completo de transcriptos, producidos por un organismo, el proteoma o conjunto de protenas codificadas por un
genoma, y el metaboloma o conjunto total
de metabolitos de una clula, consecuencia
de la funcin de los RNA y protenas.
El objetivo de la genmica es la dilucidacin completa y exacta de la secuencia de
ADN de un genoma haploide representativo de una especie. Cuando esta secuencia
se conoce, abre la puerta a numerosas posibilidades. Por anlisis computacional de la
misma y utilizando principios conocidos de
gentica y el anlisis molecular de los
transcriptos y protenas es posible:
- Comparar secuencias similares presentes en diferentes entidades biolgicas y comprender el papel de dichas secuencias.
213
Esto ha dado origen a la genmica

comparativa y ha demostrado que
existe considerable sintenia es decir
una localizacin conservada de genes
en posiciones equivalentes en especies
relacionadas (Fig. 2). Tambin ha sido
una excelente herramienta para identificar motivos de secuencia altamente conservados y, por lo tanto,
funcionalmente importantes en regiones codificantes y no codificantes del
genoma. Catalogar las variaciones
genticas entre individuos ayudar a
identificar aquellos cambios que conducen a enfermedades genticas, investigar nuevas terapias y establecer la resistencia o susceptibilidad a diferentes factores.
En Febrero de 2001, coincidiendo
con el cincuenta aniversario de la puFigura 1: La conjuncin entre tecnologa gnica, marcadores
moleculares, genmica y bioinformtica revolucionarn el
blicacin del modelo estructural del
mejoramiento vegetal, conduciendo al desarrollo de nuevos
DNA por Watson y Crick, la revista
cultivares. Los nuevos genes hallados sern introducidos en
Nature public el primer borrador del
plantas por tecnologa gnica. Esto a su vez permitir establecer
genoma humano, que ha sido
la funcionalidad de los mismos. El conocimiento de la secuencia
permitir la obtencin de mapas, marcadores perfectos y realizar
secuenciado completamente. Tamseleccin asistida por marcadores moleculares (MAS), as como
bin
se
han
secuenciado
el fenotipeado molecular. Gentileza de G. Spangenberg.
exitosamente en los ltimos aos los
genomas completos de ms de 30 bacterias
- Realizar predicciones acerca de todas y de varios eucariotas, entre los que se enlas protenas codificadas por una especie.
cuentran la levadura, Saccharomyces
- Establecer las variaciones genticas cerevisiae, el nematodo Caenorhabitis
entre distintas poblaciones de
una misma especie.
- Comparar secuencias de
diferentes especies y entender
procesos evolutivos.
Figura 2: Sintenia entre los genomas
de varias gramneas. El genoma de arroz
contiene grupos de marcadores que se
hallan altamente conservados en
muchos cereales, por lo cual dichos
genomas pueden sintetizarse
bsicamente como compuestos por
bloques de ligamiento de arroz. En la
figura se muestra el alineamiento de los
cromosomas y segmentos de
cromosomas (identificados con letras
maysculas) de varias gramneas con los
del arroz (centro). El genoma del maz
tiene dos copias semejantes de cada
bloque de genes por lo que est
representado por dos anillos del crculo.
Las lneas externas punteadas conectan
sectores adyacentes de los cromosomas
de trigo. Modificado de Gale y Devos
(1998) y de Snustad et al. (2003)
214
elegans, la mosca del vinagre Drosophila

melanogaster y una planta, Arabidopsis
thaliana. Actualmente se encuentran en marcha proyectos de secuenciacin de los
genomas de diferentes modelos animales
como rata, ratn, perro, gato, cerdo, etc. y
vegetales como arroz, maz, colza, soja, trbol, raigrs, etc.
A continuacin se brinda un panorama
global acerca de la forma en que se articulan
los proyectos de genmica, algunos resultados relevantes, las aplicaciones en agricultura y el estado de la investigacin en
Sudamrica.
2 Genmica estructural
Como su nombre lo indica, el objetivo de

la misma es caracterizar la estructura del
genoma. Conocer la estructura de un
genoma individual puede ser de utilidad para
manipular genes y segmentos de ADN en
una especie particular. El anlisis comparativo de diferentes genomas posibilitar deducir reglas generales que gobiernan la estructura de todos los genomas.
La genmica estructural procede a travs
de niveles incrementales de resolucin analtica, comenzando con la asignacin de genes
y marcadores a cromosomas individuales,
mapeando estos genes y marcadores dentro de los cromosomas, finalizando con la
preparacin de un mapa fsico a travs de la
secuenciacin. Es decir, que se procede desde un mapeo gentico
de baja resolucin, basado en el anlisis de
recombinacin
meitica, hacia uno de
alta resolucin, basado
en
marcadores
moleculares, llegando a
la realizacin de un
mapa fsico, basado en
la secuencia de fragmentos clonados parcialmente solapantes
(Fig. 3).
Figura 3: Niveles de complejidad de la genmica estructural. La genmica

estructural procede desde un mapeo gentico de baja resolucin, basado en el
anlisis de recombinacin meitica, a uno de alta resolucin, basado en
marcadores moleculares hasta la realizacin de un mapa fsico, basado en la
secuencia de fragmentos clonados solapantes. Modificada de Griffths et al.
(2000).
Los pasos seran:

Mapeo
cromosmico de baja
resolucin (ubicacin de
genes que producen
fenotipos mutantes conocidos y algunos marcadores). Las distancias
genticas se basan en
frecuencias
de
entrecruzamientos
(crossing overs) y son
medidas como porcentaje de recombinacin
en centiMorgans (cM).
- Mapeo gentico de
alta resolucin de cada
cromosoma (con marcadores moleculares ubicados muy prximos entre
s).
215
- Mapeo fsico, basado en distancias

moleculares, resultantes de mapas de fragmentos de restriccin parcialmente superpuestos. La distancia entre dos marcadores
puede ser medida determinando el tamao
de los fragmentos de restriccin que los contienen, siendo el fragmento ms pequeo
que lleva ambos marcadores una estimacin
de la distancia entre ellos. Utilizando combinaciones de sondas y enzimas de restriccin
puede construirse un mapa fsico determinando qu fragmentos poseen marcadores en
comn. Las distancias fsicas se miden en
kilobases (Kb) o megabases (Mb).
- Anclado del mapa gentico en el mapa
fsico.
- Secuenciacin de ADN a gran escala,
que brinda un mapa completo de cada
cromosoma.
- Anclado del mapa gentico y del mapa
fsico en el de secuencia.
Las distancias fsicas generalmente no se
correlacionan directamente con las distancias
genticas porque las frecuencias de recombinacin no son siempre proporcionales a las
distancias moleculares. Sin embargo, a menudo las dos correlacionan razonablemente bien
en las regiones eucromticas de los cromosomas (aquellas menos condensadas, que
se colorean de manera ms difusa ). En humanos, un cM es equivalente, en promedio,
a aproximadamente 1 Mb de ADN.
2.1 Asignacin de loci a cromosomas
especficos
Se utilizan los siguientes mtodos:
- Ligamiento a loci conocidos: anlisis
tradicional basado en cruzamientos, en especies en las que es factible hacerlo.
- Electroforesis de campo pulstil: se usa
en el caso de especies que poseen
cromosomas pequeos, separables por esta
tcnica, como sucede con los de levaduras.
Las bandas en el gel corresponderan a
cromosomas individuales y pueden utilizarse
para localizar nuevos genes por hibridacin. Primero, utilizando sondas de localizacin conocida se establece que banda corresponde a cada cromosoma. Luego, un nuevo
gen clonado de ubicacin desconocida se
utiliza como sonda para asignarle una posi-
216
cin en un cromosoma determinado.

- Hbridos celulares interespecficos, por
ejemplo humano-ratn. Se utiliza exclusivamente en mapeo del genoma humano o de
especies animales. Se establecen bancos de
lneas celulares que contengan todos los
cromosomas del roedor y un cromosoma
humano particular. Siempre incluye un
cromosoma humano que lleva un alelo salvaje defectivo para una funcin bioqumica
determinada en el genoma del ratn. Si sobreviven en un cultivo deficiente para el factor que no sintetizan es porque llevan el alelo
humano equivalente, que complementa la
funcin faltante .
2.2 Ubicacin de los genes a lo largo del
cromosoma
El prximo nivel de resolucin consiste en
determinar la posicin de un gen o marcador molecular sobre el cromosoma. Este paso
es importante porque los mapas genticos
pueden alinearse con los mapas fsicos y utilizarse para validar los mismos.
- Mapeo por recombinacin: en los casos en que ha sido factible hacerlo -organismos experimentales como levaduras, la mosca
de la fruta, ratn, Arabidopsis, etc- ha posibilitado la construccin de mapas que a lo
largo de los aos aparecen repletos de genes
con efectos fenotpicos determinados. Sin
embargo, los intervalos recombinacionales
entre genes conocidos contienen cantidades
muy grandes de ADN. Estos intervalos o
gaps no pueden ser completados utilizando anlisis de ligamiento debido a la ausencia de marcadores en esas regiones. Para llenarlos y construir mapas de alta resolucin
surgieron los marcadores moleculares, entre
los que se encuentran los RFLP y los SSLP (mini
y microsatlites) (ver II.-4 y IV.-2). Estos marcadores permiten la construccin de mapas
genticos con una densidad de un marcador
/centimorgan (cM). Aunque tal resolucin es
un logro muy importante, un centimorgan
representa, en humanos, una megabase, lo
que equivale a un milln de pares de bases
o 1000 kb. Para lograr mayor resolucin actualmente existen los SNP, que son marcadores basados en el polimorfismo de un solo
nucletido.
- Hibridacin in situ: cuando se dispone
de un gen clonado ste puede ser utilizado

como sonda para hibridar con los cromosomas in situ, para lo cual se lo marca
radiactivamente o por fluorescencia. Puede,
de ese modo, identificarse a los cromosomas
portadores de la secuencia, determinar si son
secuencias especficas de un cromosoma y
determinar la posicin del gen en el mismo.
En el caso de fluorescencia, la tcnica se denomina FISH (fluorescence in situ
hybridization). La localizacin del fragmento en el cromosoma se visualiza como un
punto brillante (ver II.-5).
- Mapeo fsico de los cromosomas: aporta un nivel de resolucin mayor. Se trata de
identificar un conjunto de fragmentos de
ADN clonados superpuestos que juntos representen un cromosoma o un genoma completo. Los mapas as obtenidos se llaman
mapas fsicos, porque el ADN es el material
fsico del genoma.
El mapa fsico es til en tres aspectos:
1- Los marcadores genticos ubicados en
los clones pueden ordenarse y contribuir al
proceso general de mapeo.
2- Cuando se han obtenido los clones
contiguos, ellos representan una genoteca
ordenada de secuencias de DNA que puede utilizarse para futuros anlisis genticos,
como, por ejemplo, correlacionar fenotipos
mutantes con disrupciones en regiones
moleculares especficas.
3- Estos clones constituyen la materia prima para secuenciar en proyectos genmicos
a gran escala.
2.3 Secuenciacin a gran escala del
genoma
- Generacin de bancos de EST (etiquetas de secuencias expresadas)
La complejidad de los genomas eucariotas hace aconsejable, como primera
aproximacin, no abordar el estudio del
genoma completo. Es preferible estudiar slo
una fraccin del mismo, es decir, aquellos
genes que se estn expresando en un momento determinado de la vida del organismo. Para ello se obtienen poblaciones de
ADNc (que reflejan slo secuencias expresadas) que se secuencian de forma masiva para
generar miles de secuencias parciales conocidas como ESTs (ver VII.- 2). Estas secuencias
de entre 300-500 pb suelen ser suficientes
para la identificacin de los genes mediante
comparacin con las secuencias existentes en
las bases de datos pblicas (ej. Genbank,
EMBL), utilizando para ello programas de
anlisis informtico. Si la informacin contenida en la secuencia parcial no es suficiente,
habra que determinar la estructura del ADNc
completo para estudiar su funcin por otros
mtodos.
- Secuenciacin genmica
La aproximacin anterior no permite
identificar genes que se expresan a bajo nivel o en situaciones fisiolgicas no consideradas o regiones no representadas en el ARNm.
Para obtener esta informacin debe
secuenciarse el genoma completo. Para ello,
el ADN genmico total se digiere con enzimas
de restriccin apropiadas o se fragmenta
mecnicamente para generar fragmentos de
gran tamao (100-300 kb), que se clonan en
vectores apropiados, para construir
genotecas que contienen, al menos, una representacin completa del genoma, que
puede estudiarse en detalle y secuenciarse
(ver II.-3). A fin de distinguir las regiones
codificantes para genes, que en muchos organismos representan un porcentaje bastante pequeo del genoma, de las no
codificantes, las secuencias se comparan con
las secuencias de ESTs y ADNc previamente
estudiadas.
a) Secuenciacin de los clones y ensamblado de los fragmentos
El clonado comienza obteniendo un nmero elevado de fragmentos al azar que
se clonan en un vector apropiado. En la preparacin de mapas fsicos de genomas se
utilizan vectores como los csmidos, los YAC,
los BAC y los PAC, que aceptan insertos de
gran tamao (ver II.-3). El contenido de estos clones se caracteriza y se ordenan, buscando los puntos de solapamiento o superposicin. Un conjunto de clones solapantes
se llama contiguo (contig). Para establecer
el solapamiento de clones al azar se
secuencian regiones cortas del inserto
proximales al sitio de clonado utilizando
primers posicionados en el vector. Los vacos
(gaps) se completan utilizando el final de un
217
Se utilizan varias tcnicas para

ordenar los clones
en contiguos. Entre
ellas:
- FISH: para localizar las posiciones aproximadas
de insertos grandes.
- Fenotipificacin
(fingerprinting): se corta
el clon con enzimas
de restriccin que
generan un grupo
de bandas que representan
un
fingerprint o
huella digital del
clon. Las bandas
generadas por vaFigura 4: Estrategia de secuenciado jerrquico (hierarchical shotgun rios clones pueden
sequencing strategy). El primer paso consiste en construir una alinearse visualgenoteca por fragmentacin del ADN e introduccin del mismo en mente o por un
vectores que aceptan grandes insertos, en este caso de BACs. Los programa de comfragmentos de ADN representados en la misma son organizados en putacin para deun mapa fsico y los clones individuales son seleccionados y secuenciados terminar si se superpara lo cual se hace una nueva genoteca de trozos ms pequeos ponen o solapan.
(shotgun library). La secuencia de los clones se ensambla finalmente
- STS (sequenpara reconstruir la secuencia del genoma. Modificada de la publicacin ce tag sites o sidel International Human Genome Sequencing Consortium, 2001.
tios de secuencia
marcada): son sefragmento clonado para llegar al siguien- cuencias cortas de insertos grandes clonados.
te (primer walking). A medida que se van Se rene un conjunto de clones al azar y se
caracterizando los clones, los contiguos se cortan en fragmentos ms pequeos que se
alargan y van convergiendo unos con otros. clonan en y se secuencian pequeas regioEl proyecto termina cuando se tiene un con- nes de cada uno. Para ello se disean primers
junto de contiguos que equivale al nme- que amplifican una secuencia corta de ADN
ro de cromosomas de la especie en estu- (STS).
dio. En la Fig. 4 se resume una estrategia de
secuenciacin jerrquica (hierarchical 3 Utilizacin de mapas genmicos para el
shotgun sequencing). Esta se usa para anlisis gentico
genomas grandes. Para genomas ms pequeLos mapas genticos y los mapas fsicos
os se utiliza otra, llamada secuenciacin de son un importante punto de partida para vagenomas completos (whole genome rios tipos de anlisis gentico, incluyendo el
shotgun sequencing).
aislamiento de genes y genmica funcional.
Todos los estados del anlisis genmico Por ejemplo:
como la preparacin de clones, el aislamien- Aislamiento de genes por clonado
to de ADN, la electroforesis y la secuenciacin posicional: para ubicar un gen cuya secuenhan sido bien adaptados a diferentes m- cia se desconoce se puede partir de un marquinas o robots, automatizando el trabajo. cador conocido que est estrechamente lib) Ordenamiento de los clones
gado al mismo. Este marcador acta como
218
punto de partida para el procedimiento de

caminado cromosmico (chromosome
walking), por el cual los fragmentos finales
del marcador ligado son utilizados como
sondas para seleccionar otros clones de la
genoteca. Del segundo grupo de clones (los
que solapan con el inicial) se hacen mapas
de restriccin y los fragmentos obtenidos son
utilizados para hacer una nueva ronda de
seleccin de clones superpuestos. As el proceso de caminado se mueve hacia ambos
lados a partir del sitio inicial, que culmina
cuando se llega al gen de inters. Existe otra
tcnica relacionada llamada salto
cromosmico, que permite saltar a travs de
reas distantes y potencialmente no
clonables del ADN y genera marcas, ampliamente espaciadas a lo largo de la secuencia, que pueden utilizarse como puntos de
inicio para mltiples caminatas cromosmicas
bidireccionales. Esta tcnica consiste en crear
fragmentos grandes (entre 80-150 kb) por
restriccin del ADN en la regin que se cree
contiene al gen de inters. Cada fragmento
de ADN es luego circularizado, poniendo en
contacto los extremos libres. Este procedimiento acerca puntos relativamente distantes de la regin de genoma en estudio. Se
trata de generar en esa unin un sitio que
no sea cortado en una posterior restriccin,
de manera que esas dos regiones que estaban distantes en el genoma ahora esten
unidas en un fragmento. El crculo se corta
con una nueva enzima de restriccin y los fragmentos obtenidos, entre los que se encuentran los sitios de unin, se clonan en fagos.
Esto es lo que se llama una genoteca de
saltos. Una sonda del sector de comienzo
de la regin que contiene al gen de inters
puede utilizarse como punta de partida para
comenzar a saltar por el genoma. Un salto puede, por ejemplo, avanzar unos 50 kb
hacia el locus de inters. Una vez all, el otro
extremo de la unin del fragmento inicial se
corta y se usa para buscar el siguiente punto
de salto en la genoteca. O sea que a travs
de las uniones se va avanzando hacia el punto donde se encuentra el locus. Cada posicin de salto es un punto de partida para
una caminata cromosmica. Estas regiones
se van secuenciando. All comienza la bsqueda de genes utilizando programas de prediccin y se seleccionan las secuencias
candidatas. Esta estrategia de saltos se utiliz para clonar el gen de la fibrosis qustica,
que es una enfermedad humana que resulta
fatal y es causada por mutaciones en gen de
gran tamao localizado en el cromosoma 7.
- Estrategia del gen candidato: la caracterizacin de una regin cromosmica hace
que aparezcan varios genes de funcin desconocida. Si un gen de inters es mapeado
en esa regin, estas secuencias pasan a ser
candidatas. Para cada una de ellas, o para
la ms probable de acuerdo al anlisis de secuencia, se disean experimentos tendientes
a determinar en cuales tejidos se expresa, en
qu condiciones, etc., utilizando Northern
blot o RT-PCR. Si el patrn de expresin encontrado coincide con el patrn esperado es
altamente probable que hayamos encontrado el gen de inters. El experimento ideal
para confirmar esto, sera la transformacin
de un individuo mutante para esta funcin
con el gen normal. Si se produce la reversin
del fenotipo mutante (complementacin),
tendremos la prueba irrefutable de que estamos frente al gen buscado.
- Genes con patrones complejos de
herencia: no todos los genes muestran patrones simples de herencia. Puede suceder
que:
- La variacin fenotpica sea cuantitativa, como peso o altura. Este tipo de variacin se debe a la interaccin acumulativa
entre alelos + y de varios genes y el ambiente. La disponibilidad de miles de marcadores moleculares como los SSLP, dispuestos
a lo largo del cromosoma, ha posibilitado el
mapeo de algunos de estos genes que contribuyen a la variacin cuantitativa cuyos loci
son llamados QTL (quantitative trait loci).
Para abordar este problema, se buscan
dos tipos de lneas que muestren fenotipos
contrastantes para un carcter cuantitativo
y se cruzan para generar descendencia
homocigota que contenga solo un segmento o un pequeo nmero de segmentos de
una de las lneas. Se realizan cruzas y
retrocuzas y se obtienen lneas endocriadas
recombinantes (RIL). Estos individuos pueden caracterizarse por su fenotipo y puede
estimarse la contribucin de los segmentos
especficos a la variacin observada. (ver IV.2)
En el futuro, el anlisis de SNP (polimorfismos de un nucletido simple) promete ace-
219
lerar el mapeo de caracteres complejos. Nuevos enfoques de mapeo de QTL y QTN

(quantitative trait nucleotide) estn disponibles. El concepto emergente es la posibilidad de explorar directamente la variacin
dentro de genes y no a travs de marcadores annimos.
4 Anlisis funcional de los genes
Una vez secuenciado el genoma completo pueden identificarse la mayora de los
genes de una especie. Restara entonces determinar cul es la funcin de cada uno de
ellos y cmo interaccionan para definir un
fenotipo determinado. La genmica funcional intenta resolver esta cuestin a travs del
estudio de:
- El transcriptoma: se refiere al estudio
de los perfiles de expresin de todos los
genes presentes en el genoma. El mtodo
ms utilizado es el de micromatrices de ADN,
que permite analizar simultneamente la
expresin de miles de genes, pudindose disponer 5000-6000 genes (ESTs, ADNc,
oligonucletidos) sobre un portaobjetos utilizando un sistema robotizado. Sobre este
chip de ADN se realizan experimentos de hibridacin con muestras marcadas radioactivamente o con fluorforos apropiados, y los
resultados se cuantifican mediante anlisis
con phosphorimager o microscopa confocal
(ver VII.-2). De esta manera se pueden identificar, de forma simultnea, los patrones
de expresin de miles de genes en un momento del desarrollo o en respuesta a diferentes estmulos ambientales. El anlisis
bioinformtico de estos datos permite asociar grupos de genes que se expresan de forma coordinada y proporciona informacin
importante sobre la funcin de los mismos,
ver (VII.3).
- El proteoma: comprende el conjunto
total de protenas expresadas por un
genoma completo, incluyendo las modificadas despus de la traduccin. El estudio del
transcriptoma debe ser complementado con
el anlisis de expresin de las protenas codificadas por los transcriptos, puesto que estas macromolculas estn al final de la ruta
de expresin gnica. El mtodo ms utilizado para estudiar la abundancia relativa de
cientos de protenas es la electroforesis
220
bidimensional en geles de poliacrilamida (2DPAGE), que permite separar con gran resolucin, la mayora de los polipptidos celulares
combinando de forma secuencial diferencias
en carga y en masa molecular. Utilizando sistemas computarizados de anlisis de imagen
se seleccionan las protenas cuya abundancia relativa cambia durante el desarrollo o en
respuesta a diferentes estmulos ambientales. Los polipptidos se purifican y digieren
con proteasas para generar una coleccin
de pptidos que se analizan por
espectrometra de masas o se secuencian a
partir del extremo amino. Para identificar la
protena, los perfiles de masa molecular o
secuencias de aminocidos obtenidos se comparan con las bases de datos de protenas
existentes.
- El metaboloma: comprende el conjunto total de metabolitos de una clula. En
plantas, el metabolismo secundario (conjunto de reacciones que no son vitales para
el individuo y que conducen a la producin
de compuestos que no tienen una funcin
reconocida en el manteniento de los procesos fisiolgicos fundamentales de los organismos que los sintetizan pero que a veces
ayudan a la supervivencia, como por ejemplo antraquinonas, alcaloides, digoxina,
taumatina, vainillina, menta, etc.) produce
una enorme variedad de compuestos diferentes de los que se han identificado 40.000
y se estima que an quedan por descubrir
alrededor de 100.000. Los investigadores que
trabajan en este nuevo campo de la qumica
aplicada a la biologa (metabolmica) consideran que slo de esta forma se podra definir, en trminos moleculares, un fenotipo
concreto. En metabolmica se emplean herramientas analticas muy sensibles (tales
como espectrometra de masa, cromatrografa lquida o gaseosa y resonancia magntica
nuclear) para analizar los cambios
metablicos provocados por mutaciones
gnicas o por la expresin de transgenes.
La metabolmica puede ser aplicada al
monitoreo de estreses inducidos, para identificar pasos metablicos limitantes, para el
anlisis de mutantes y hasta para realizar la
evaluacin de manejos agronmicos, tales
como el efecto de fertilizantes sobre el metabolismo, etc.
- La bioinformtica intenta dar sentido
a la informacin derivada de las tcnicas anteriormente descritas. La importancia de esta

ciencia resulta obvia cuando se considera que
los genomas poseen miles de millones de
pares de bases (ver VII.-3).
5 Modelos
El mapeo comparativo ha demostrado
que la organizacin de los genes dentro de
los genomas ha permanecido muy conservada a travs de la evolucin, existiendo estrechas relaciones de colinearidad entre los
genomas de casi todas las gramneas cultivadas, entre las solanceas, entre las
brasicaceas cultivadas y Arabidopsis, entre
los pinos, rosceas y varias leguminosas. Por
ello, teniendo en cuenta la envergadura de
un proyecto de secuenciado de un organismo, los emprendimientos genmicos tomaron especies modelo, representativas de un
genoma vegetal. El primer modelo vegetal
fue una dicotilednea, Arabidopsis thaliana.
Le sigui una monocotilednea, el arroz, cuyo
genoma es seis veces menor que el del maz
y 37 veces menor que el del trigo. El estudio
de estas dos especies permitir arribar a conocimientos clave para el mejoramiento vegetal.
Arabidopsis thaliana es una dicotilednea que posee uno de los genomas vegetales ms pequeos. Carece de importancia econmica pero resulta ser un excelente
organismo para la investigacin puesto que
es fcil de transformar y su ciclo de vida tarda slo 7 semanas, de semilla a semilla. Alrededor de 12.000 cientficos trabajan coordinadamente en Arabidopsis, conformando el
ms avanzado sistema de experimentos en
biologa de plantas del mundo. Su secuencia
gentica es de libre acceso en el sitio Web
www.arabidopsis.org, as como tambin las
experiencias biotecnolgicas que se estn o
se han realizado con esta planta. En un artculo publicado en Nature (2000) se analiza el
genoma de esta planta a partir de las
115.4 megabases secuenciadas (de un total
de 125). Pudo establecerse que la evolucin
de Arabidopsis involucr una duplicacin
completa del genoma, seguida por una subsecuente prdida y duplicacin de genes,
lo cual dio origen a un genoma dinmico,

enriquecido por una transferencia lateral de
genes de cianobacterias. El genoma contiene 25.498 genes que codifican para 11.000
familias de protenas, con una diversidad funcional similar a la encontrada en Drosophila
y Caenorhabditis elegans. Arabidopsis posee varias familias de protenas nuevas pero
carece de otras comunes, indicando que los
conjuntos de protenas en comn han experimentado una expansin y contraccin en
estos tres grupos eucariotas.
6 Algunas generalizaciones acerca de los
genomas
Los estudios en especies modelo han permitido arribar a varias generalizaciones. Una
de ellas es que el nmero de genes no es la
base de la complejidad. La mosca de la fruta tiene unos 13000 genes, Caenorhabitis
elegans 18000, Arabidopsis 26000 y los humanos 31000. Si el nmero de genes nos es
muy diferente entre estas especies, cul es
la base de la mayor complejidad en los humanos?
La explicacin estara en el proteoma, ms
que en el genoma. Las protenas codificadas
por los genes pueden agruparse en familias
en base a su similitud y muchas de estas familias proteicas son compartidas por todos
los grupos mencionados, aunque el nmero
de miembros por familia es mayor en humanos. Esto es particularmente evidente en
aquellos genes involucrados en el desarrollo. Los humanos tenemos 30 genes para
factores de crecimiento del fribroblasto, mientras que Drosophila y Caenorhabitis elegans
tienen 2. Las nuevas protenas surgen a travs de cortes y empalmes alternativos de
un mismo ARN (alternative splicing), lo que
permite aumentar considerablemente la diversidad proteica a partir de los mismos mensajes. Las predicciones indican que el 60 %
de los genes humanos tiene dos o ms alternativas de splicing. En Caenorhabitis el 22%.
Un elevado nmero de factores de transcripcin y modificaciones postraduccionales tambin conducen a una mayor complejidad.
En el caso de Arabidopsis, cerca del 9 %
de los genes son factores de transcripcin
221
(FT). Si se compara la proporcin con los

genomas de otras especies, se observa que
Arabidopsis no slo tiene ms genes que algunos animales pequeos, sino que la proporcin de FT es ms alta que en cualquier
clase de organismo estudiado. Esto parece
reflejar el hecho de que las plantas deben
adaptarse a una amplia variedad de condiciones medioambientales, a diferencia de los
animales, que pueden movilizarse y cambiar
de lugar si este no les resulta propicio.
En humanos, los genes ocupan una
cuarta parte del genoma, y slo el 1,5%
codifica para protenas. Las secuencias correspondientes a los exones (secuencias del
mensajero que se encuentran representadas en la protena, las secuencias correspondientes a los intrones no lo estn) comprenden un porcentaje bajo del genoma,
mientras que los intrones comprenden el
24%. Los genes no estn distribudos en
forma pareja. Algunos se encuentran agrupados en ciertas regiones del genoma mientras que otros se encuentran aislados. En la
mosca, el nematodo y Arabidopsis la disposicin de los genes es mucho ms regular.
Aproximadamente la mitad del genoma
humano consiste de secuencias repetitivas,
siendo la mayora de ellas secuencias parsitas de elementos transponibles que se
propagan replicndose e insertando una copia de s mismos en otras regiones del
genoma. En la actualidad solo dos tipos de
elementos son activos, Alu y LINE1. La mayora de los mismos se encuentran en regiones ricas en A y T, mientras que los genes se
encuentran en reas con elevado contenido
de G y C. Fragmentos de estos elementos
tambin se encontraron en las secuencias
regulatorias que controlan la expresin de
varios genes, por lo que se ha sugerido que,
de alguna manera, podran afectar positivamente su expresin y evolucin.
Los genomas vegetales tambin estn
plagados de estas secuencias repetitivas.
Haciendo uso de la posibilidad que nos brindan las bases de datos de llevar a cabo
Northerns electrnicos fue posible encontrar elementos repetitivos en las bases de EST
de trigo, cebada y centeno, siendo 0.15 %
de las EST similares a retrotransposones (elementos genticos transponibles, es decir que
pueden movilizarse de un sector del genoma
222
a otro y cuyo movimiento depende de la

transcripcin reversa . Son secuencias sin funcin aparente que han contribudo a lo largo
de la evolucin a la expansin de los
genomas de plantas y animales superiores).
Ejemplo aplicado al mapeo y caracterizacin de los genes de vernalizacin de los
cereales
Un ejemplo interesante para aplicar varios de estos conceptos ha sido la investigacin que llev al mapeo y caracterizacin de
los genes de vernalizacin de trigo (Yang y
col., 2004).
El descubrimiento de estos genes es un
buen ejemplo de cmo se encaran algunos
proyectos de genmica. Se utiliz trigo
diploide (2n=2x=14 AA) debido a la menor
complejidad de su genoma que los del trigo
pan y candeal y se confeccionaron detallados mapas genticos y fsicos para la regin
cromosmica que los contena en trigo, arroz
y sorgo. Haciendo uso de las herramientas
de la genmica comparativa se determin
que uno de estos genes, VRN1, est
involucrado en la transicin de los pices desde un estado de crecimiento vegetativo a
uno reproductivo. Este gen es similar a uno
hallado en Arabidopsis llamado APETALA1,
que no est involucrado en la respuesta a la
vernalizacin.
El otro gen involucrado en el proceso,
VRN2 es un represor dominante de la floracin en cereales de invierno. Por mapeo
gentico de alta densidad, utilizando una
poblacin de trigo diploide obtenida de
cruzar progenitores con hbitos
contrastantes de crecimiento, uno primaveral y el otro invernal, se determin que este
gen se encuentra ubicado en el brazo largo del cromosoma 5A. A partir de aqu se
realiz el clonado posicional del mismo. Esto
significa que a partir de marcadores conocidos ubicados en el genoma se comenz una
caminata cromosmica. De esta manera se
construy un mapa fsico o de secuencia de
la regin que contena el gen. Para ello se
utilizaron marcadores moleculares distruibudos en la regin, genotecas de BAC y
genotecas de ADNc. La comparacin de la
secuencia de esta regin con regiones equivalentes de cebada y de arroz permiti establecer que esta regin contena ocho genes,
Figura 5: La inhibicin de la expresindel gen VRN2 por

transgnesis acelera la floracin en aproximadamente
un mes en comparacin con la misma variedad de trigo
no modificada. De Yan et al. (2004), gentileza Dr. Jorge
Dubcovsky.
cinco de los cuales se encontraron en el mismo orden y orientacin que en la cebada y

tres como en el arroz. La funcin de algunos
de estos genes es an desconocida. La regin tambin contena elementos repetitivos
o retrotransposones.
Dos de los genes all ubicados, denominados ZCCT1 y ZCCT2, codificaban para protenas muy similares, lo cual permiti inferir
que los mismos provienen de un evento de
duplicacin que ocurri millones de aos
atrs. Estas protenas resultaron ser similares a una protena de Arabidopsis y de arroz
que est involucrada en la regulacin del tiempo de floracin. Por ello, este gen era un
candidato atractivo para ser el represor de
floracin, es decir VRN2.
Los transcriptos de este gen son muy
poco abundantes en las hojas y desapare-
cen durante el proceso de vernalizacin, no

obstante ello, el anlisis de su expresin
permiti determinar que junto con la desaparicin de los transcriptos de VRN2 se produce un incremento de los transcriptos de
VRN1, lo cual resultaba coherente con la
interaccin episttica entre los dos genes y
con el hecho de que VRN2 acte como un
represor de la floracin, que directa o indirectamente reprime la transcripcin de VRN1.
Todas las pruebas de localizacin de los
transcriptos y niveles de expresin condujeron a concluir que ZCCT1 era VRN2.
Tambin se estableci que las diferencias
entre variedades invernales y primaverales de
trigo estaran dadas por diferencias en la
regin codificante de este gen (es decir en
aquella regin que est representada en el
ARN mensajero). En una accesin de hbito
primaveral se encontr una mutacin de punto que redundaba en un cambio de un
aminocido arginina por un triptofano en
una regin crtica del gen, lo cual afectara su
funcin. La arginina se encuentra en todas
las protenas del tipo ZCCT de Arabidopsis,
arroz y cebada. Esta mutacin de punto sera la causante del hbito primaveral.
El anlisis de este sitio en variedades cultivadas de trigo diploide permiti verificar que
la mutacin est ausente en todas las variedades de trigo invernal. Lo mismo ocurri en
cebada. Todo esto llev a sugerir que la gran
adaptabilidad de los cereales de clima templado fue favorecida por un sistema muy flexible de regulacin de la iniciacin de la floracin. El hbito ancestral de crecimiento invernal, esencial para la adaptacin a clima
fro, poseera el potencial para generar formas primaverales por mutaciones de prdida de funcin en los dos principales loci de
vernalizacin.
Para validar la hiptesis de que ZCCT1
era VRN2 se transform trigo pan invernal
con una construccin que inactivaba los mensajeros del mismo, tcnica denominada de
ARN de interferencia (ver III.3). Estas plantas transformadas, donde estaba inhibida la
expresin del gen (efecto que semejaba la
inhibicin del mismo por fro) mostraron una
aceleracin en el tiempo de floracin (23 das)
en relacin a los controles no transformados
(Fig.5). Esto confirm que la disminucin en
los niveles de los transcriptos de VRN2
223
(ZCCT1) est directamente relacionada con

la aceleracin del tiempo de floracin. Este
experimento demostr, adems, que esta
tecnologa puede ser utilizada para manipular el tiempo de floracin del trigo y confirm que VRN2, un factor de transcripcin,
juega un rol central en la regulacin de la floracin. Este sera entonces un nuevo tipo de
gen involucrado en la regulacin de otros
economa y la calidad de vida que en el mbito de la salud humana. Gracias al aporte

de grupos de investigacin de todo el mundo se dispone de bases de datos pblicas con
informacin genmica de utilidad para los
mejoradores. El conocimiento de cmo actan los genes en una especie puede ayudar
a los mejoradores a perfeccionar su funcin
en otra especie. La secuencia de los genomas
de Arabidopsis y de arroz proporcionarn informacin relevante acerca de otros cultivos, como
el maz y el trigo. Dado que estos tres cereales representan ms
de la mitad de la produccin
alimentaria mundial y que el arroz
es el alimento bsico de ms de
la mitad de la poblacin del planeta, la trascendencia de la
genmica en la agricultura es indiscutible. La similitud entre las
especies de cereales tambin implica que cuando se trasladan
genes de una especie de cereales a otra, tendern a funcionar
Figura 6: Categorizacin funcional de ESTs de Deschampsia
bien y en la misma forma con una
antarctica. El objetivo de este proyecto es encontrar genes
mnima manipulacin gentica.
involucrados en la resistencia a bajas temperaturas para ser transferidos,
A travs de esfuerzos pblipor tecnologa gnica, a especies de cultivo. Gentileza de G.
cos y privados podrn identificarSpangenberg.
se conjuntos de genes asociados
genes de floracin. En variedades invernales
con caracteres como rendimiento, resistende trigo, VRN2 evita la floracin. Cuando la
cia a la sequa, calidad de los alimentos, resisplanta se expone a un perodo de fro dutencia a insectos y tolerancia a herbicidas. De
rante la vernalizacin, la actividad del mismo
esta manera se acelerar significativamente
disminuye y permite que la planta florezca.
A diferencia del gen VRN1, VRN2 es dife- el aporte de nuevas variedades al mercado,
rente de un gen de Arabidopsis que tiene ya sea por modificacin gentica o por seuna funcin similar. Esto permiti sugerir que leccin con marcadores moleculares o utien su evolucin, Arabidopsis y los cereales y lizando criterios de seleccin a partir de la
pastos de clima templado desarrollaron di- informacin molecular.
La genmica comparativa, basada en el
ferentes mecanismos de vernalizacin, que
anlisis
de ESTs de diferentes plantas toleincluyen genes similares y genes muy diferenrantes
a
estreses abiticos, permitir la identes.
tificacin
de redes de genes comunes asoDe ello tambin se concluye que si bien
ciados
con
estreses ambientales, tales como
los modelos son importantes, no siempre se
adaptan a todos los casos y hay que analizar salinidad, sequa, bajas y altas temperaturas.
todos los detalles antes de extrapolar infor- El anlisis de especies tolerantes a situamacin para aplicarla a la comprensin de los ciones extremas permitir localizar genes
involucrados en los mecanismos que las hafenmenos biolgicos.
cen tolerantes. Dichos genes podrn entonces ser transferidos a especies de cultivo.
7 Genmica y Agricultura
Como ejemplos pueden citarse Agrostis
Especialistas en varias disciplinas han lle- adamsonii y Agrostis robusta, tolerantes a
gado a la conclusin de que el alcance de la salinidad, Microlaena stipoides, tolerante a
genmica ser mayor en lo que se refiere a la aluminio y Deschampsia antarctica, toleran-
224
te a bajas temperaturas (la nica gramnea

que crece en la Antrtida) (Fig. 6).
Tambin se ha mencionado que los factores de transcripcin seran las llaves para
desbloquear funciones gnicas que aprovechen la diversidad de la naturaleza para producir mejores cultivos. Estos son genes que
virtualmente controlan todo carcter importante, desde el punto de vista agrcola,
en las plantas, incluyendo rendimiento, resistencia a las enfermedades, proteccin
contra las heladas y sequa, produccin de
qumicos, protenas usadas en farmacutica, etc. La mayora de los caracteres vegetales a los que interesa aplicar la ingeniera
gentica son multignicos (ej. tolerancia al
estrs hdrico) y los genes involucrados se
expresan en cascadas de forma tal que genes
primarios activan a genes secundarios que a
su vez activan a genes terciarios. Los factores
de transcripcin seran los responsables de
hacer funcionar a los genes primarios,
obtenindose largas cascadas de expresin
de genes por la manipulacin de un solo gen.
Durante los ltimos aos se ha obtenido una
gran coleccin de FT de plantas,
funcionalmente caracterizados, no slo en
Arabidopsis, sino tambin en especies como
tomate, maz y soja. En total hay cerca de
1900 FT en Arabidopsis pero en el contexto
de la genmica funcional el inters recae en
unas 60 familias que tienen funciones reconocidas. La herramienta primaria que se utiliza para conocer la funcin de los FT consiste
en sobre-expresarlos y/o detener la expresin de algunos de ellos por disrupcin
gnica o knock out. Se puede, por ejemplo,
medir el efecto de cada FT en la composicin
de los lpidos en las semillas aceiteras y la composicin de lpidos en las hojas, la composicin de azcares, de esteroides, etc., estudiar
procesos bsicos, a travs de la dilucidacin
de sus efectos en el desarrollo vegetal y la
resistencia a las enfermedades, o tratar de
identificar el FT que regula el consumo de nitrgeno (N). El N es uno de los insumos ms
costosos para la agricultura, por lo que identificar los genes que controlan y modifican la
respuesta al N sera de gran valor.
En este sentido tambin existen proyectos genmicos sobre leguminosas y sus
simbiontes fijadores de nitrgeno. Recientemente se han secuenciado los genomas de
las especies de Mesorhizobium y

Sinorhizobium y se han producido cientos
de miles de EST de Medicago truncatula,
Lotus corniculatus y soja. En el caso de M.
truncatula no slo se han disectado los pasos que controlan las seales entre la bacteria fijadora y la planta sino tambin entre la
planta y otro simbionte, las micorrizas (asociacin de un hongo con la raz de una planta superior. Esta asociacin no es especfica de especie como el caso de Rhizobium y
las leguminosas. El hongo puede ser de
varios gneros y aportan fsforo a la planta,). Recientemente se logr la identificacin,
en alfalfa, de un receptor requerido para el
reconocimiento de seales bacterianas de
nodulacin, los llamados factores NOD.
Las plantas medicinales aportan el 25%
de los compuestos activos utilizados actualmente por la industria farmacutica. Entre
estos compuestos se encuentran los
citocromos P450, que participan en la
biosntesis de muchos compuestos
anticancergenos, alcaloides, fitoesteroides,
antioxidantes y antimicrobianos. Tambin
tienen un rol muy importante en la
detoxificacin de xenobiticos (herbicidas y
pesticidas). Se han identificado 1052
citocromos P450 y el objetivo actual es, utilizando herramientas de metabolmica, determinar su funcin bioqumica precisa.
Otro de los objetivos de la metabolmica
es el estudio de la sntesis de las esencias
que confieren perfume a las flores y el mejoramiento del sabor de algunas plantas utilizadas en alimentacin humana, como por
ejemplo Cassava, donde el objetivo sera la
eliminacin de los glicsidos cianognicos
que le confieren sabor amargo.
La devastacin de los bosques es motivo
suficiente para invertir en proyectos de
genmica tendientes a la identificacin de
genes involucrados en perennidad, desarrollo, interaccin con herbvoros, respuesta a
estrs y sntesis de metabolitos secundarios
como lignina y celulosa. Se han comenzado
a colectar EST de lamo, abedul, abeto, pino
y eucaliptus. El lamo se utiliza como sistema
modelo para el anlisis de los genes
involucrados en la formacin de madera. Otro
objetivo en este campo es la bsqueda de
estrategias para inducir floracin temprana,
225
que es un factor crtico en el mejoramiento

de forestales.
La secuenciacin de los genes y la dilucidacin de las vas que controlan la floracin en los cereales, que difiere en varios aspectos con los corresponientes en
Arabidospsis, ha sido otro de los logros de
la genmica. Como se mencionara anteriormente en este captulo, recientemente se
localizaron y caracterizaron, en trigo y cebada, los genes VRN1 y VRN2, que son los genes
centrales en la va de vernalizacin en trigo,
cebada y otros cereales invernales. Este conocimiento es clave en agricultura, ya que
permitira, potencialmente, controlar la floracin en cultivos de gran importancia econmica, como los cereales y los forrajes.
8 Aportes de la genmica al
mejoramiento de trigo
El trigo pan (Triticum aestivum L 2n= 6x=
42; AABBDD) es uno de los principales cultivos alimenticios ya que provee cerca del 55%
de los carbohidratos consumidos por el hombre. La gentica de este cultivo resulta compleja, es de naturaleza hexaploide, con tres
genomas homelogos denominados A, B y
D, que aportan 7 pares de cromosomas cada
uno. Los genes redundantes son una norma, con sets homoallicos triplicados en la
mayora de ellos. Dentro de los cereales, el
genoma de trigo pan es el de mayor tamao (17000 Mb trigo, 2800 Mb maz, 800 Mb
sorgo, 450 Mb arroz). Ms del 80% del
genoma de trigo lo constituyen secuencias
de ADN altamente repetitivo. El restante 20%
est compuesto por ADN de bajo nmero
de copias o copia nica, donde se encuentran la mayora de los genes. Si bien las secuencias del ADN altamente repetitivo varan
de especie en especie, las secuencias de los
genes en general son conservadas. Esta caracterstica permite el uso de sondas
heterlogas (de otros genomas) en experimentos de hibridacin de tipo RFLP (ver II.4)
para identificar secuencias conservadas en
especies diferentes dentro de una misma familia taxonmica (Devos y Gale, 2000).
En 1989 se public el primer mapa
gentico molecular de trigo correspondiente a los cromosomas homelogos del grupo
226
7, observndose que en gran parte de los

tres genomas de trigo hexaploide se conservaba el orden de los genes y marcadores. Esta
fue la primera prueba de colinearidad en
gramneas y posibilita el desarrollo de la
gentica comparativa en cereales.
En trabajos posteriores pudo comprobarse que largos segmentos de los cromosomas
de maz, sorgo, arroz, trigo y cebada conservan la presencia y el orden de marcadores y
genes, aunque en algunos casos la correspondencia cromosmica ha sido modificada por
duplicaciones, inversiones o translocaciones. En la actualidad se ha logrado
consensuar un mapa unificado de
gramneas en el que se detallan secuencias y
genes conservados en diferentes genomas
(Fig. 2). A partir de esta herramienta es posible transferir informacin proveniente de
plantas de genomas pequeos (arroz, sorgo) a plantas de genomas ms complejos
como el trigo. Esto facilita la ubicacin ms
precisa de genes para tolerancia a estrs
bitico y abitico, prebrotado, dormicin,
vernalizacin, etc. y el desarrollo de marcadores tiles para el mejoramiento.
La informacin generada a partir de los
proyectos genmicos de Arabidopsis, arroz
y maz con el descubrimiento de nuevos genes
y QTLs permitir el desarrollo de marcadores
perfectos, generados a partir de la informacin de la secuencia del gen a seleccionar, en
lugar de marcadores genticamente ligados.
Actualmente el acceso a los principales genes
que afectan la calidad ha abierto nuevas vas
para el desarrollo comercial de diferentes productos derivados del trigo. Es posible obtener variedades con diferente calidad de almidn, diferente textura de grano, diferente composicin de gluteninas y gliadinas en
funcin del uso industrial. Por otro lado, el
descubrimiento de nuevos genes valiosos de
otros genomas y la posibilidad de incorporarlos al trigo a travs de la transformacin
permitir resolver problemas del cultivo, como
pueden ser limitantes debido a estreses
biticos y abitico o desarrollar nuevas generaciones de transgnicos en funcin de las
necesidades del consumidor con mayor contenido de aminocidos esenciales como la
lisina, vitaminas, etc.
La complejidad del genoma del trigo ha
hecho aconsejable abordar los estudios
genmicos a travs del transcriptoma. Para
ello, se han establecido consorcios interna-
cionales. Las bases de datos de EST han crecido exponencialmente en la ltima dcada,
de manera que en el National Center for
Biotechnology Information dbEST database
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/dbEST) en
Marzo de 2004 haba 20 millones de ESTs.
Esto incluye cerca de 1 millon de ESTs de trigo hexaploide y sus parientes ms cercanos
de la tribu Triticeae, que son Hordeum
vulgare L., especies diploides y tetraploides
de Triticum, Secale cereale L. y Aegilops
speltoides Tausch.
Toda esta informacin permite inferir que
la biotecnologa puede cambiar el escenario
del trigo en dos reas principales: (1) protegiendo al cultivo de estreses biticos y
abiticos y (2) modificando el concepto de
produccin de commodities por el de
produccin de specialities derivadas de
trigo, de mayor valor agregado, como
noodles (tipo de fideo muy utilizado por los
asiticos), galletitas dulces, crackers (un tipo
de galletita que se rompe fcilmente), masa
congelada, pan de molde, pasta, almidones,
plsticos biodegradables, etc.
9 Genomas trabajadores
La genmica aplicada a dilucidar los mecanismos por los cuales funcionan los
microorganismos puede conducir al aislamiento de sus componentes para desarrollar
nanoestructuras que lleven a cabo complejas funciones. Como ejemplos pueden citarse:
Methanococcus jannaschii: es una bacteria que produce metano, una importante
fuente de energa. Contiene enzimas que
soportan temperaturas y presiones elevadas
por lo que son potencialmente tiles para fines industriales
.Deinococcus radiodurans: soporta niveles de radiacin extremadamente elevados
por lo cual tiene un alto potencial para limpiar desechos radiactivos.
Thalassiosira pseudonana: se trata de
una diatomea marina que es la principal participante en el bombeado biolgico de carbono hacia las profundidades de los ocanos, por lo que posee un elevado potencial
para mitigar los cambios climticos del planeta
10 Proyectos de Genmica en Sudamrica

En Sudamrica se han desarrollado y se
encuentran en ejecucin algunos proyectos
genmicos. Frente al estado del desarrollo
de estas reas en el mundo, existen en la
regin serias carencias, tanto de recursos
humanos entrenados como de infraestructura y equipamiento. En Brasil se estableci
una red de cooperacin que secuenci completamente el genoma de Xylella fastidiosa, bacteria que ataca a los ctricos causando
importantes prdidas econmicas. Tambin
incursion en el estudio de genmica funcional de clulas cancerosas y de
secuenciacin del genoma de caa de azcar, Saccharum oficinalis. En Argentina se
ha trabajado en la secuenciacin de Brucella
abortus, agente causal de la brucelosis bovina. Investigadores argentinos participan
tambin en proyectos de genmica en cooperaciones internacionales, como el consorcio involucrado en la secuenciacin del
genoma de Trypanosoma cruzzi, el proyecto que llev a la clonacin y caracterizacin
de los genes de vernalizacin en trigo o el
proyecto de bsqueda de genes de tolerancia a fro en Deschampsia antarctica. En
Chile se ha completado recientemente la
secuenciacin de Piscirickettsia salmonis,
patgeno intracelular de salmones que causa importantes prdidas en esta industria.
Otros ejemplos son el desarrollo de marcadores de microsatlites (ver II.4) de diversas especies, como girasol (colaboracin de
INTA-Argentina con empresas semilleras locales), vides (INIA-Chile como parte de un
consorcio internacional), alpacas y otros
camlidos sudamericanos (INIA-Chile), entre
otros. Actualmente se est desarrollando en
Chile un programa de genmica funcional
coordinado por diversos ministerios, destinado a enfrentar problemas de postcosecha y
enfermedades en plantas de inters agrcola. En varios pases se han secuenciado fragmentos de genomas de virus, y viroides (Argentina, Chile, Uruguay).
Los objetivos para programas de
genmica sudamericanos deberan enfocarse hacia el aumento de la productividad y la
mejora de la calidad de los productos, desarrollando capacidades para identificar genes
227
propios del germoplasma regional, de manera de disminuir la dependencia de variedades y genes desarrollados y aislados por pases del primer mundo y buscar soluciones
para problemas propios de la regin, que difcilmente pueden ser enfrentados por programas de mejoramiento gentico ajenos a
la misma.
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VII.-Captulo 2
Mtodos para el estudio de la
expresin de genes
Pessino, Silvina C.; Martelotto, Luciano G.
1 Introduccin
La capacidad de secuenciar genomas completos desarrollada en la ltima dcada ha
impulsado a la investigacin cientfica en la
direccin de definir la funcin de cada uno
de los genes identificados. Para contribuir
con ese objetivo se han diseado tcnicas
que permiten estudiar la expresin gnica
global en un determinado tejido y en un
momento particular del desarrollo, posibilitando la identificacin inicial y el agrupamiento en clases funcionales de secuencias nuevas con una actividad asociada.
Los procedimientos para esta evaluacin
han progresado desde los mtodos desarrollados para el anlisis de genes nicos especficos (como el Northern slot y dot blotting,
la RT-PCR semicuantitativa y cuantitativa y los
ensayos de proteccin de nucleasas) hacia
otros enfocados en la identificacin de mltiples transcriptos que difieren en su representacin entre las diversas muestras experimentales (como la hibridacin substractiva,
el display diferencial, el ADNc-AFLP , la
secuenciacin de etiquetas expresadas o EST,
el anlisis serial de la expresin de genes o
SAGE y la hibridacin de microarreglos). La
organizacin de las secuencias dentro de grupos funcionales basada en los datos de expresin y de homologa proporciona un marco bsico para conducir nuevos estudios dirigidos a definir la actividad precisa de cada
producto gnico.
2 Hibridacin substractiva
Los mtodos de hibridacin substractiva
fueron creados a principios de la dcada que
comenz en 1980 con el propsito de construir bibliotecas de ADNc para obtener sondas de genes expresados diferencialmente.
Fueron los primeros que se utilizaron de manera amplia con el propsito de identificar
genes regulados positiva o negativamente en
una escala global. Sus ventajas incluyen la

habilidad de aislar genes de funcin relacionada sin tener conocimientos previos de su
secuencia o identidad y el uso de tcnicas
comunes de biologa molecular que no requieren equipos especializados de deteccin y
anlisis.
El procedimiento general consiste en la
hibridacin de ADNc provenientes de una
muestra prueba (tester) con un exceso de
ARNm proveniente de una muestra control
(driver). Los transcriptos expresados en ambas muestras (tester y driver) forman molculas de ARNm/ADNc hbridas, mientras que
las secuencias de ADNc que estn presentes
nicamente en la muestra tester permanecen como hebras simples. Las molculas de
hebras simples y dobles se separan usando
cromatografa en hidroxilapatita. Los ADNc
expresados diferencialmente pueden entonces ser recuperados y clonados o usados directamente como sondas para analizar una
biblioteca.
Dos limitaciones importantes del protocolo original son: i) el requerimiento de grandes cantidades de ARNm y ii) la tendencia a
una menor eficiencia en la identificacin de
transcriptos poco abundantes.
La hibridacin substractiva es aplicable
slo a comparaciones de pares de muestras
y debe ser realizada por duplicado con el
tester y el driver invertidos para detectar tanto aumentos como disminuciones en los niveles de expresin. Adems no genera una
medida cuantitativa y aunque es eficiente en
la identificacin de genes que estn completamente ausentes en el driver no revela fcilmente a aquellos que estn presentes en
ambas muestras en distinta proporcin.
A fin de mejorar el protocolo original se
realizaron modificaciones que incluyen la produccin de ADNc con marcas de biotina u
oligo(dT)30-ltex de manera de refinar la separacin de las molculas de cadena simple
y doble. Tambin se incorpor la amplificacin de ADNc selectos por PCR para disminuir la cantidad inicial de mARN requerido y
aumentar la eficiencia de clonado de los
transcriptos seleccionados. En la actualidad
se utiliza ms comnmente un protocolo ingenioso conocido como hibridacin
substractiva de supresin (SSH) que fue diseado para favorecer la deteccin de
229
transcriptos raros expresados diferencialmente. Este incluye una normalizacin en la

representacin de los transcriptos diferenciales basada en la inhibicin de la amplificacin
de aquellos que son ms abundantes, eliminando tambin la necesidad de separar molculas de cadena doble y simple (Fig.1).
3 Display diferencial y RAP-PCR

Las tcnicas conocidas en general como
huellas digitales genticas de ARN (ARN
fingerprinting) incluyen al display diferencial
(DD) y al fingerprinting de ARN con una PCR
cebada arbitrariamente (RAP-PCR). Ambos
mtodos estn basados en una
amplificacin por PCR de
subgrupos al azar de transcriptos
a partir de dos o ms muestras.
La primera etapa de ambos
procedimientos es comn y consiste en generar ADNc haciendo
una transcripcin reversa de una
fraccin de las molculas de
ARNm de una muestra. En el display diferencial esto se logra utilizando como cebador de la
transcripcin reversa a un poliT
anclado con una o ms bases adicionales al extremo 3 del ARN
mensajero (por ejemplo (T)12AC).
Estos oligonucletidos se fijan al
ARN mensajero a travs de la
unin de las bases adicionales,
impidiendo que el poliT resbale sobre distintas zonas del poli
A. El nico grupo de ARNm que
es transcripto en forma reversa
es el integrado por las molculas
que llevan las bases complementarias a las bases adicionales del
poliT en el extremo del mensajero adyacente al poliA. En contraste, la RAP-PCR utiliza
oligonucletidos de secuencia arbitraria para la transcripcin
reversa. Estos cebadores tienen
normalmente 10 bases de largo
y se unen a sus secuencias com-
Figura 1: Esquema general que describe el procedimiento de hibridizacin substractiva de supresin (SSH). El
ADNc prueba (tester) se divide en dos porciones iguales que se ligan a dos adaptadores diferentes y son hibridizadas
por separado con un exceso de ADNc de la muestra control (driver), lo que conduce a la formacin de los productos
de tipo a, b, c y d que se indican en la figura. Luego ambas muestras se mezclan y se rehibridizan en presencia de
un exceso adicional del driver desnaturalizado, lo que origina los productos a, b, c, d y e. Los extremos de las
hebras dobles se rellenan y los fragmentos se amplifican por PCR utilizando cebadores complementarios a los
adaptadores. El enriquecimiento en las molculas e se logra durante la amplificacin por PCR ya que: i) a y c pueden
unir un solo cebador por lo que se amplifican linealmente; ii) la amplificacin de b est suprimida debido a la
complementariedad de unas terminaciones largas repetidas invertidas presentes en la secuencia del adaptador
que promueven la formacin de estructuras secundarias internas en las hebras simples; iii) d no contiene sitios de
unin a los adaptadores. Los productos de PCR resultantes provendrn de transcriptos presentes esencialmente en
el tester y ausentes en el driver y adems su representacin estar normalizada ya que los fragmentos diferenciales
abundantes tendrn mayores posibilidades de formar molculas de tipo b. Este esquema fue adaptado de Diatchenko
et al. 1996.
230
PESSINO, Silvina C.; MARTELOTTO, Luciano G.
plementarias permitiendo formar una hebra en los distintos tratamientos experimentade ADNc desde este sitio. En este caso el les representan potenciales transcriptos de
subgrupo de ARNms que sufre transcripcin ARNm de expresin diferencial. Tpicamenreversa estar integrado por aquellas mol- te, las bandas son evaluadas slo si amplificulas que presenten la secuencia complemen- can en forma consistente en reacciones de
taria a la del cebador orientada en el senti- PCR duplicadas para cada muestra (Fig. 2).
do adecuado.
La fase final del display diferencial consisLuego de haberse realizado la sntesis de te en la identificacin de la secuencia del
la primer hebra del ADNc, se amplifican seg- transcripto representado por el producto de
mentos de los transcriptos usando pares ml- PCR y la confirmacin de que este realmente
tiples de cebadores de PCR. Tanto para el se expresa en forma contrastante. Estas etadisplay diferencial como para la RAP-PCR, el pas se logran localizando fsicamente y
cebador superior es un oligonucletido arbi- escindiendo la seccin del gel de
trario de 10 pares de bases. El cebador infe- poliacrilamida que contiene al producto de
rior es el mismo oligonucletido poliT
anclado (para el caso del display diferencial) o el decmero arbitrario (para
el caso de RAP-PCR) que se usaron alternativamente para hacer la transcripcin reversa.
Se ha estimado que los productos
de PCR de 240 combinaciones particulares de pares de cebadores de display diferencial (por ejemplo todas las
combinaciones de 20 oligonucletidos arbitrarios y 12 oligonucletidos anclados) representan
estadsticamente a todos los ARNm
originalmente presentes en la muestra.
Los productos de PCR pueden ser
marcados por incorporacin de un
nucletido radiactivo o de una molcula que pueda ser detectada a travs de su interaccin con un anticuerpo conjugado a un sistema de deteccin (por ejemplo digoxigenina). Tambin puede usarse un cebador unido
a un fluorforo u optarse por no marcar los fragmentos amplificados y usar
luego una tincin con nitrato de plata para revelar los geles. La visualizacin de los productos de PCR se logra Figura 2: Representacin grfica del mtodo de display diferencial.
luego de la electroforesis en geles de Las muestras de ARN son transcriptas en forma reversa usando
poliacrilamida seguida de la apropia- como cebador un oligonucletido poliT de secuencia 5T(T)nTXY
da generacin y deteccin de imge- 3 (donde 10 n 12) que se fija en forma estable al extremo 3de
transcriptos a travs de la unin de las bases adicionales de
nes, que son evaluadas comparando los
secuencia arbitraria X e Y. Una vez sintetizada la primer hebra del
la intensidad relativa de las bandas ADNc, sta se usa como molde para una reaccin de PCR que
producidas a partir de diferentes utiliza como cebadores el mismo poliT anclado y un decmero de
secuencia arbitraria. Distintas combinaciones de poliTs y decmeros
muestras experimentales.
Los fragmentos que estn presen- generan numerosos perfiles de amplificacin a partir de diversas
subpoblaciones de ARN mensajeros. El patrn de bandas de las
tes en una muestra y ausentes en la muestras experimentales se compara en busca de diferencias de
otra o aquellos que estn presentes tipo presencia-ausencia o alteraciones en la intensidad de las
con diferentes intensidades relativas bandas.
231
inters. En la mayora de los casos debe realizarse un alineamiento de las imgenes de

los fragmentos de amplificacin con el gel de
poliacrilamida seco. En los casos en que se
utiliza tincin con nitrato de plata no es necesario realizar este paso, por lo cual la recuperacin de la banda es mucho ms eficiente. Los productos de PCR son purificados del
gel y reamplificados.
Se han utilizado varias estrategias para
confirmar la expresin diferencial de los
transcriptos, que incluyen el uso de los fragmentos como sondas de Northern, la siembra de los fragmentos en membranas para
someterlos a anlisis de Northern inverso y
el clonado y secuenciacin de los productos
para disear cebadores especficos que permitan realizar PCR semicuantitativas. Independientemente de cul sea la tctica usada
para confirmar la expresin diferencial, las
secuencias de los fragmentos de los genes
expresados diferencialmente se requieren
siempre para comenzar a entender la funcin del gen. El aislamiento de la secuencia
completa de los genes involucrados puede
lograrse usando los clones diferenciales en
estudios de bibliotecas de ADNc o realizando experimentos de 5RACE.
Dos ventajas importantes de los mtodos de fingerprinting de ARN con respecto a
los de hibridizacin substractiva son la capacidad de comparar muestras experimentales
mltiples en forma simultnea y la de identificar genes que estn regulados tanto positiva como negativamente en una muestra respecto de las otras. Sin embargo, los mtodos de fingerprinting de ARN comparten con
el SSH la limitacin de que no son cuantitativos. Adems suelen aparecer numerosos falsos positivos, es decir, fragmentos de genes
que parecen estar diferencialmente expresados pero son artefactos de PCR. Otro problema es que estas tcnicas deben aplicarse
en general a muestras provenientes del mismo individuo sometido a distintas condiciones o sobre individuos genticamente idnticos (por ejemplo, isolneas). Cuando se comparan los perfiles de ARNm de individuos diferentes genticamente, pueden aparecer falsos positivos que son resultado de una amplificacin diferencial debida a una variacin
en la secuencia de los transcriptos ms que a
232
diferencias en su representacin. Ese problema puede ser evitado utilizando estrategias

de anlisis de segregantes en grupo (BSA)
aplicadas al estudio de perfiles de ARN.
Finalmente, la investigacin de todos los
genes que potencialmente se expresan en
forma diferencial requiere el uso de
equipamiento de ltima generacin y una
inversin extensiva de tiempo y trabajo para
detectar y confirmar la expresin diferencial
de cada uno de los genes individuales.
4 Polimorfismos en la longitud de los
fragmentos de ADNc amplificados
(ADNc-AFLP)
La tecnologa de AFLP , generalmente
utilizada para producir huellas genticas de
ADN genmico, puede ser aplicada tambin
a preparaciones de ADNc de doble hebra para
obtener un perfil del transcriptoma. Los patrones obtenidos por esta tcnica son una
herramienta confiable y eficiente para la identificacin de los ARNm expresados diferencialmente.
La tcnica de ADNc-AFLP detecta fragmentos de restriccin de ADN por medio de
amplificacin por PCR. Comprende las siguientes etapas: i) generacin de ADNc, ii) restriccin del ADNc con dos endonucleasas especficas, preferiblemente una que reconoce sitios de 6 bases y otra que reconoce sitios de
4 bases, iii) ligacin de adaptadores de cadena doble a los extremos de los fragmentos
de restriccin, iv) amplificacin de un
subgrupo de los fragmentos de restriccin
usando dos cebadores complementarios al
adaptador que llevan bases selectivas adicionales en el extremo 3 v) electroforesis de
los fragmentos de restriccin amplificados en
geles de poliacrilamida, vi) visualizacin de las
huellas digitales genticas mediante el uso de
autorradiografas, fosfoimgenes y otros
mtodos (Fig. 3, ver pg.7).
Las mayores ventaja del uso de la tecnologa de ADNc-AFLP son: i) no se requiere
informacin previa de secuencia; ii) se puede
estudiar una fraccin muy grande de todos
los genes expresados, iii) es una tcnica muy
sensible que permite la deteccin de
transcriptos de baja abundancia, iv) los fragmentos son extrados fcilmente de los geles
y las secuencias correspondientes pueden determinarse sin necesidad de clonados previos.
alterar la actividad de los diferentes dominios

de la protena que codifica.
5 Etiquetas de secuencia expresadas

(Expressed sequence tags, EST)
6 Anlisis serial de la expresin de genes
Los avances tecnolgicos que facilitan la

secuenciacin masiva condujeron a principios
de los aos 90 a idear el concepto de las bibliotecas de etiquetas de secuencia expresadas (bibliotecas de ESTs). Las secuencias EST
son generadas tomando clones al azar de una
biblioteca de ADNc y realizando una sola reaccin de secuenciacin que abarca 300-500
pb del clon. Las diferencias en la expresin
de genes pueden ser identificadas considerando el nmero de veces en que aparece
representada una secuencia en particular. Sin
embargo, las secuencias EST a menudo se generan a partir de bibliotecas de ADNc que
han sido normalizadas para ecualizar la abundancia de clones que corresponden a los diferentes transcriptos. Los EST secuenciados
a partir de estas ltimas pueden ser comparados para identificar transcriptos que se expresan en una biblioteca y estn completamente ausentes en otra, pero si se pretende
obtener datos cuantitativos exactos que describan abundancia relativa se debe recurrir
indefectiblemente a bibliotecas de ADNc no
normalizadas. La posibilidad de detectar diferencias en la expresin de genes a travs
de la comparacin de la abundancia de secuencias en las bases de datos de EST se
incrementa con el crecimiento de estas bases.
La combinacin de la informacin generada por los EST (nivel y localizacin espacio/
temporal de la expresin gnica) y la de los
proyectos de secuenciacin de genomas (secuencias completas de los genes y sus promotores) permite realizar asociaciones de
expresin y homologa estructural que en
muchos casos facilitan la inferencia de la posible funcin de los genes identificados. Por
supuesto, esto constituye una instancia inicial en la identificacin de la funcin de cada
gen. Para determinar su actividad precisa
deben hacerse estudios particulares en general dirigidos a bloquear o aumentar su expresin por ingeniera gentica y a modificar
estructuralmente la molcula de manera de
El anlisis serial de la expresin de genes

(SAGE) consiste esencialmente en una versin acelerada de la secuenciacin de EST.
Est basada en el concepto de que una etiqueta corta de unas pocas bases es suficiente para identificar inequvocamente a un
transcripto, siempre y cuando est ubicada
en una posicin definida dentro de la secuencia del mensajero. Una etiqueta SAGE consiste tpicamente en 9 bases de secuencia
ubicadas por debajo del ltimo sitio de reconocimiento de una endonucleasa especfica
en el transcripto blanco. Mltiples etiquetas
SAGE se ligan juntas en un vector de clonado
de manera que una reaccin de secuencia de
300 a 500 pb genera las secuencias de 20 a
30 etiquetas al mismo tiempo (Fig. 4, ver
pg.7). Como cada etiqueta SAGE representa un nico transcripto de ARNm, es posible
obtener una visin general de todos los
genes expresados en la muestra original. Las
diferencias en la expresin de genes entre
muestras experimentales pueden entonces
ser identificadas comparando la abundancia
relativa de etiquetas SAGE especficas en diferentes bibliotecas. Los genes o las secuencias EST representados por las etiquetas SAGE
son localizados en las bases de datos detectando aquellos transcriptos que tengan la etiqueta SAGE en la posicin adecuada.
Una limitacin del SAGE es la identificacin de los genes representados por las secuencias de etiquetas. Este proceso est en
primer lugar restringido a secuencias que estn accesibles en las bases de datos. Sin embargo, esta limitacin se tornar menos problemtica a medida que se generen ms secuencias EST y que a las secuencias existentes se les asignen asociaciones y funcin. Otra
limitacin potencial es la identificacin errnea de las etiquetas. Esto puede resultar de
errores de secuenciacin y de la identificacin
fallida de la regin que corresponde al SAGE
en la base de datos de secuencia. Adems,
ciertos transcriptos pueden estar ausentes en
la muestra, dependiendo de cul sea la enzima especfica usada para generar la biblioteca de SAGE. Otros ARNm por el contrario
233
pueden estar representados por mltiples

etiquetas SAGE a causa de la existencia de
polimorfismos en un slo nucletido o el procesamiento alternativo de los transcriptos. Se
espera que muchos de esos problemas afecten a una porcin relativamente pequea de
los genes representados, pero no deberan
ser dejados de lado en la interpretacin de
los resultados.
Por otra parte, dos ventajas importantes
del SAGE sobre la hibridacin substractiva y
el display diferencial es que los datos obtenidos son cuantitativos y acumulativos. Si se
genera la suficiente cantidad de informacin
de secuencia se obtienen perfiles exactos de
la expresin de los transcriptos, que describen la abundancia de todos los genes expresados en una clula o tejido. Existe una base
de datos pblica de expresin gnica que ha
sido creada para el almacenamiento y anlisis de secuencias de SAGE cuyo poder continuar creciendo a medida que se contribuya
con ms informacin. Otra caracterstica de
los datos de SAGE es que pueden complementar datos de ESTs generados a partir de
bibliotecas de ADNc normalizadas o
substradas. Los EST brindan informacin de
secuencia mientras que el SAGE provee datos cuantitativos describiendo la abundancia
de los transcriptos.
Finalmente, a pesar de que el SAGE requiere capacidad de secuenciacin de ltima
generacin, la cantidad de datos que aporta
puede ser 20 veces mayor que el que posibilita la misma cantidad de secuenciacin EST.
7 Hibridacin de microarreglos o
micromatrices
La evaluacin de la expresin de genes
usando la tecnologa de micromatrices ha
demostrado ser un procedimiento muy efectivo para una variedad de aplicaciones. Los
tres tipos generales de micromatrices incluyen: i) chips de oligonucletidos,
construdos realizando la reaccin de sntesis
de cebadores cortos directamente sobre una
matriz de vidrio, ii) arreglos de oligonucletidos, construdos depositando oligonucletidos sobre placas de vidrio o membranas de nylon, iii) arreglos de ADNc, obtenidos depositando insertos amplificados por
PCR a partir de una biblioteca sobre placas
234
de vidrio o membranas de nylon.

Uno de los aspectos ms importantes de
la experimentacin con micromatrices es la
seleccin de los fragmentos de ADN que
contendr. An cuando el nmero de genes
representado suele ser grande (3000 a
10000), pueden faltar algunos que sean importantes para una cuestin experimental
particular. La seleccin de la biblioteca ms
adecuada para una aplicacin en particular y
la eleccin de los clones son factores crticos
que determinan el xito de estos experimentos.
En algunas situaciones, puede ser ms
efectivo enfocar los experimentos en un grupo pequeo de genes seleccionados por criterios ms especficos como, por ejemplo,
perfiles de distribucin de tejidos, clasificacin
funcional o cambio de expresin conocidos.
Se pueden adquirir clones de fuentes comerciales u otras fuentes y/o clonar secuencias
especficas usando tcnicas estndar de biologa molecular.
Despus de que los clones han sido seleccionados deben ser ensamblados y organizados para generar el arreglo de ADNc junto
con los controles apropiados. Tpicamente,
el largo de los insertos ser mayor a 500 bases, pero esto depende de los clones seleccionados.
Los productos de PCR son purificados y
luego depositados (o impresos) en lugares precisos sobre una placa de vidrio o una
membrana de nylon. Los instrumentos usados para la produccin de micromatrices han
mejorado en los ltimos aos. Las opciones
varan desde la construccin de un arreglo por
raspado hasta la compra del sistema completo.
Independientemente de cul sea el origen de los clones, es esencial saber con seguridad la secuencia de cada sonda que est
siendo ubicada sobre la matriz para asegurar
una interpretacin exacta de los datos resultantes. Por la tanto, puede ser necesario
secuenciar por duplicado todos o una porcin de los fragmentos organizados (Fig. 5,
ver pg.8).
El ARNm que representa las muestras
experimentales se prepara para la hibridacin
con las micromatrices de ADNc por transcripcin reversa y marcado con nucletidos
fluorescentes (Cye3 y Cye5 dUTP) o
radiactivos ([ 33 P] dCTP). Las molculas
Figura 3: Generacin de una huella digital de ARN por

la tcnica de ADNc-AFLP. El RNA mensajero se
transcribe en forma reversa utilizando un poliT como
cebador. Las hebras de ADNc se digieren con dos
enzimas de restriccin, una de corte raro y otra de corte
frecuente. Se ligan adaptadores complementarios a
ambos extremos y se preamplifican por PCR los
fragmentos utilizando cebadores que reconocen la
secuencia de los adaptadores. Los fragmentos que
contienen adaptadores diferentes en los extremos son
amplificados preferentemente a causa de que en
general tienen un tamao intermedio. Luego se realiza
una segunda amplificacin utilizando cebadores
anclados con una o dos bases adicionales en el extremo
3que amplifican una subpoblacin de fragmentos. El
cebador correspondiente al adaptador para la enzima
de corte raro est marcado radiactivamente. La
combinacin de diferentes cebadores anclados genera
perfiles provenientes de distintos subgrupos de
ARNms.
Figura 4: Procedimiento general para la obtencin de etiquetas de secuencia SAGE. El ARN mensajero es
transcripto en forma reversa utilizando un poliT biotinilado como cebador. Luego es digerido con una enzima de
restriccin ancla que reconoce sitios de 4 bases frecuentes en la secuencia de los mensajeros. Es probable que la
mayora de los mensajeros sean digeridos por esta enzima en algn sector de su secuencia. Los extremos 3de las
molculas son recuperados por unin a esferas de estreptavidina. La muestra se divide en dos partes iguales que
se ligan alternativamente a dos adaptadores diferentes (A y B). A continuacin son digeridas con una segunda
enzima de restriccin (enzima de etiquetado) que reconoce un sitio dentro de la secuencia del adaptador pero
corta al transcripto unos 20 pares de base ms abajo generando un extremo romo. Ambas muestras se mezclan,
se ligan y amplifican con dos oligonucletidos A y B complementarios a los respectivos adaptadores. Los
amplicones se digieren nuevamente con la enzima ancla y los fragmentos se ligan como concatmeros y se
clonan. Este diagrama fue adaptado a partir del presentado por Velculescu et al. 1995.
235
Figura 5: Expresin de genes controlada a travs del uso de microarreglos de ADNc. Los clones amplificados por
PCR se imprimen sobre un soporte slido. Las muestras a analizar se marcan con diferentes fluorforos y se
hibridizan con la matriz. Un detector permite medir por separado la emisin de cada fluorforo. La intensidad de
la seal de hibridizacin ser proporcional al contenido de cada molcula particular de ARN en la muestra. Los
patrones de emisin de ambas muestras son comparados para detectar expresin diferencial.
236
fluorescentes generalmente se usan para

marcar sondas con las que se hibridarn placas de vidrio, mientras que las radiactivas se
incorporan a sondas que se usarn sobre
membranas de nylon. Los fluorforos Cye3 y
Cye5 presentan diferentes espectros de emisin, por lo tanto dos muestras experimentales pueden ser marcadas alternativamente con cada uno de ellos, hibridadas juntas
en una reaccin nica competitiva y luego
evaluadas en forma separada con un detector de fluorescencia. Por el contrario, las muestras radiactivas deben ser hibridadas individualmente en reacciones seriales y pueden
ser detectadas usando un sistema de
fosfoimgenes.
Independientemente del diseo experimental, el anlisis de micromatrices se basa
en la premisa de que la intensidad de la seal de hibridacin resultante para una secuencia es proporcional a la cantidad de ARNm
que corresponde a esa secuencia en la muestra original. La expresin relativa de cada secuencia representada en el microarreglo es
evaluada comparando las seales de intensidad de hibridacin generadas por las diferentes muestras experimentales.
Cada experimento de micromatrices genera una gran cantidad de datos y es crtico
realizar un procesamiento apropiado de los
mismos. El anlisis de la informacin obtenida puede ser dividido en tres componentes:
i) identificacin y cuantificacin de las intensidades de hibridacin; ii) visualizacin de los
datos; iii) tcnicas de agrupamiento.
El primer componente incluye la identificacin exacta de los puntos de la imagen, la
normalizacin segn el fondo, la cuantificacin de las intensidades de hibridacin y la
salida de los datos en una forma utilizable.
La visualizacin de los datos incluye su clasificacin y presentacin en una forma lgica y
su organizacin en diferentes formatos para
apuntar a la resolucin de cuestiones mltiples. Finalmente, los algoritmos de agrupamiento permiten identificar conjuntos de
genes con patrones de expresin similar a
travs de distintas muestras experimentales.
En base a la presuncin de que la expresin
de los genes con funciones relacionadas estn regulada en forma coordinada, el agrupamiento de datos de microarreglos se convierte en un mtodo poderoso para asignar
posibles clasificaciones funcionales a genes

nuevos.
8 Conclusin
Los mtodos descriptos en este captulo
son tecnologas eficaces que expanden los
estudios de expresin desde los genes nicos hasta el nivel genmico. Ninguno de estos procedimientos per se es ptimo para
todas las aplicaciones y la mejor estrategia
para situaciones especficas puede ser crear
combinaciones de varios de ellos. El continuo
refinamiento de las tcnicas genmicas y de
la bioinformtica relacionada proporcionar
a los investigadores nuevas herramientas
para estudiar la expresin de la informacin
hereditaria y lograr un mejor entendimiento
sobre el control gentico de los procesos fisiolgicos.
9 Lecuras Recomendadas
ADAMS, M. D.; J. M. KELLEY, J. D. GOCAYNE, M.
DUBNICK, M. H. POLY-MEROPOULOS, H. XIAO, C. R.
MERRIL, A. WU, B. OLDE, R. F. MORENO. 1991.
Complementary DNA sequencing: expressed se-quence
tags and human genome project. Science (Wash DC)
252:16511666.
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STEINMETZ, W. E. PAUL, L. HOOD. 1984. Cell-typespecific ADNc probes and the murine 1 region: the
localization and orientation of Ad. Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 81:21942198.
DIATCHENKO, L.; Y.-F. C. LAU, A. P. CAMPBELL, A.
CHENCHIK, F. MOQA-DAM, B. HUANG, S.
LUKYANOV, K. PUKYANOV, N. GURSKAYA, E. D.
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hybridization: A method for generating differentially
regulated or tissue-specific ADNc probes and libraries.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:60256030.
GURSKAYA, N. G.; L. DIATCHENKO, A. CHENCHIK, P.
D. SIEBERT, G. L. KHASPEKOV, K. A. LUKYANOV, L. L.
VAGNER, O. D. ERMOLAEVA, S. A. LUKYANOV, E. D.
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OKUBO, K.; N. HORI, R. MATOBA, T. NIYAMA, A.

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1995. Quantitative monitoring of gene expression
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RALPH, M. McCLELLAND. 1992. Arbitrarily primed PCR
fingerprinting of ARN. Nucl. Acids Res. 20:49654970.
238
VII.- Captulo 3
Anlisis informtico de secuencias
moleculares
Paniego, Norma; Heinz, Ruth;
Fernndez, Paula; Lew, Sergio;
Hopp, Esteban
de datos especficas de plantas remitiendo

en cada caso al estudiante a visitar las paginas principales de los sitios mencionados para
ampliar el conocimiento de los mismos. Posteriormente, con la misma orientacin abordaremos aspectos relacionados a la bsqueda, el anlisis y la interpretacin de secuencias biolgicas.
2 Bases de datos moleculares
1 Introduccin
La Bioinformtica es el rea de las ciencias de la computacin que aborda la bsqueda de soluciones a los problemas biolgicos con herramientas computacionales. Tanto el anlisis genmico como sus disciplinas
relacionadas pueden ser abordados desde
una perspectiva diferente a partir de la enorme disponibilidad de secuencias moleculares
acumuladas en las bases de datos internacionales como GenBank [1], EMBL [2], DDBJ
[3] y SwissProt [4]. El impacto de los proyectos genmicos durante los ltimos 10 aos,
ha sido por un lado la creciente disponibilidad de secuencias, y por el otro la gran diversidad de datos biolgicos acumulados. Esto,
junto con el desarrollo de las tecnologas
informticas y el arribo de Internet transformando la estructura de almacenamiento y
acceso de los datos, ha permitido el desarrollo de aspectos fundamentales para el avance de los conocimientos sobre los sistemas
biolgicos, como lo son la bsqueda de similitud en secuencias moleculares, el anlisis comparativo (filogentico, taxonmico
y sintnico) de las especies, el anlisis de
macromolculas, la ingeniera y diseo de
estructuras proteicas, entre otros [5].
El propsito de este captulo es introducir los conceptos y las herramientas bsicas
de la Bioinformtica a los estudiantes de un
curso de biotecnologa vegetal o de biologa
molecular de plantas. De ninguna manera
este material pretende cubrir la totalidad de
los recursos existentes para la materia, por el
contrario el objetivo es guiar el inters de los
estudiantes en la exploracin y el uso de
mtodos computacionales decisivos para el
desarrollo de su actividad cientfica o profesional futura. Por lo cual, en primer lugar describiremos las bases de datos generales para
secuencias de ADN y protenas y las bases
Un proyecto tpico de anlisis genmico

genera secuencias nucleotdicas las cuales se
hacen pblicas envindolas a las bases de
datos internacionales. No slo lo hacen los
proyectos dedicados a la secuenciacin a gran
escala. Tambin lo hacen los investigadores
involucrados en proyectos ms especficos de
biologa molecular, dado que el depsito de
la secuencia es una condicin frecuentemente exigida por las revistas internacionales que
publican estos trabajos. As, las bases de datos moleculares se alimentan constantemente y contienen una enorme y heterognea
cantidad de datos que incluyen secuencias de
cidos nucleicos, protenas, estructuras
macromoleculares, etc., asociados a recursos
informticos que asisten el acceso, el envo,
la actualizacin, y la extraccin de datos. Existen varios cientos de bases de datos accesibles desde la Web, pero la dinmica enunciada no asegura tener el mximo provecho
sustentable de las mismas, empezando por
mantener una actualizacin constante. Con
este fin, se pueden revisar catlogos como
DBCAT [6], o el componente DATABANK de
la plataforma SRS (Sequence Retrieval System
[7]) de integracin de datos del European
Molecular Biology Laboratory (EMBL). Otra
fuente de actualizacin exhaustiva la constituye el primer nmero de cada ao de la
revista Nucleic Acid Research [8] de acceso
libre a travs de Internet, que presenta una
coleccin actualizada de artculos de los sitios
ms importantes como son las bases de datos generales National Center for
Biotechnology Information (NCBI, USA),
European Bioinformatics Institute (EBI, EU)
y DNA Data Bank of Japan (DDBJ, Japn) y
bases de datos ms especficas.
Otro punto de inters es que la calidad
de las secuencias vara notablemente: desde secuencias obtenidas a partir de un pasa-
239
je por amplificacin por PCR por secuenciacin nica (es decir, con posibles artefactos tcnicos y sin rechequeos) hasta secuencias obtenidas de clones independientes y
que han sido secuenciadas en ambas hebras. Lo mismo pasa con la funcin hipottica de los genes representados.
Tpicamente los proyectos de biologa
molecular bsica generan datos muy bien
caracterizados en cuando a la funcin de los
genes estudiados, mientras que los proyectos genmicos generan secuencias annimas
cuya funcionalidad es primero hipottica, es
decir, deducida a partir de su similitud con
otros genes de funcin conocida (ver prediccin de genes, ms abajo) y debe ser corroborada funcionalmente, por ejemplo, mediante experimentos de complementacin
gentica.
Incluso los perfiles de usuarios que atienden estas bases de datos pueden ser bastante heterogneos: desde el tpico bilogo
molecular que clon y secuenci un gen
involucrado en su tema de estudio (por ejemplo, genes que se activan a partir de una aplicacin hormonal) hasta evolucionistas interesados en redefinir la taxonoma tradicionalmente basada en caractersticas fenotpicas.
A pesar de esta heterogeneidad de intereses y de recursos disponibles, lo ms comn
es que los usuarios frecuenten las tres bases
de datos generales de acceso pblico. Estos
sitios colaboran desde 1982 manteniendo las
bases de datos de nucletidos de Genbank
(NCBI), EMBL Nucleotide Sequence Database
(EMBL-Bank, EBI), y DDBJ [8]. Estos grupos
coleccionan una porcin del total de las secuencias producidas y reportadas en el mundo, e intercambian diariamente todas las secuencias nuevas o actualizadas. Las bases de
datos de protenas incluyen aquellas que
derivan de las bases de datos de nucletidos
como Swissprot, TrEMBL [4] y PIR [9], y las
bases de datos estructurales como PDB
(Protein Data Bank [10]) que contiene mas
de 21.000 estructuras resueltas por
cristalografa o resonancia magntica nuclear
y Macromolecular Structure Database (MSD)
[11] que es una base de datos de EBI derivada en parte de PDB.
El NCBI, el EBI y el DDBJ disponen de
otros recursos como bases de datos de
transcriptos (dbEST), polimorfismos de un
240
solo nucletido (dbSNP), sitios de secuencia especfica (dbSTS), genomas completos,

taxonoma, literatura, vectores, etc. por lo
cual recomendamos explorar estos recursos
visitando la pgina About NCBI [12] y
2CAN [13] del EBI.
En general, las bases de datos archivan la
informacin a partir de una organizacin o
estructura lgica, cada entrada en la base
de datos se identifica con un cdigo nico
que es una cadena de nmeros y letras. Este
identificador o nmero de acceso de la secuencia nunca cambia y es la forma en que
se cita la secuencia en las publicaciones. A
este identificador se le suma otro cdigo que
da cuenta de la versin de la secuencia depositada (seq.versin, geninfo identifier, GI).
A medida que la secuencia se va actualizando, el nmero de acceso incorpora un punto
seguido de un valor incremental que corresponde a la versin actualizada, mientras que
el GI toma un valor diferente en cada actualizacin. Las protenas tambin poseen
identificadores o nmeros de acceso
(protein_ids) (Fig. 1).
2.1 Sistemas de bsqueda de las bases de
datos: ENTREZ, SRS y DBGET
Las bases de datos no solo proveen la
informacin molecular, sino tambin los medios adecuados para acceder fcilmente a esa
informacin. Las interfases de bsqueda
principales son ENTREZ [14], SRS [7] y DBGET
[15]. La ms usada probablemente sea el sistema ENTREZ del NCBI, una de las caractersticas nicas del mismo es que fue el primero
en incorporar relaciones lgicas o nexos entre las entradas individuales de datos en distintas bases de datos pblicas (Fig. 2).
La interfase SRS rene unas 400 bases
de datos (Fig. 3), en el ltimo ao se desarroll como un sistema integrado de bsqueda y recuperacin de datos asociados y aplicaciones para anlisis de secuencias [16].
DBGET es un sistema simple de acceso de
datos a un grupo diverso de bases de datos
moleculares (Fig. 4).
2.1.1 Uso avanzado de ENTREZ y SRS
NCBI desarroll Entrez como una herramienta para permitir a los usuarios interac-
PANIEGO, N.; HEINZ, R.; FERNNDEZ, P.; LEW, S.; HOPP, E.
Figura 1: La Figura muestra los cdigos asignados por las bases de datos a cada secuencia ingresada. A) Nmero de
acceso y gi de una secuencia nucleotdica. B) Nmero de acceso y gi de la secuencia de aminocidos correspondiente.
cionar o consultar estas bases de datos. Desde el punto de vista informtico, Entrez es
una interfase de usuario. Es decir, constituye

el nexo entre el usuario y las bases de datos
subyacentes. Esto le permite al
usuario realizar consultas simples y
obtener resultados, an desconociendo la arquitectura de las bases
de datos. Sin embargo, para realizar consultas ms poderosas (en
selectividad y eficiencia), es necesario conocer dicha arquitectura u ordenamiento de la estructura de la
base de datos, al menos en parte,
y saber como restringir las bsquedas a ciertas reas de la base de
datos. Para profundizar en los alcances y la operabilidad de Entrez
se recomienda visitar el documento de ayuda en la pgina del NCBI
[17].
Sin embargo, desde el punto de
vista de la facilidad de uso, tal vez
SRS sea una mejor opcin, dado
que los formularios de bsquedas
avanzados son un tanto ms exFigura 2: Representacin grfica de las relaciones del sistema Entrez plcitos que en el caso de Entrez.
para la bsqueda y la recuperacin de datos depositados en el sitio
NCBI. Entrez es una plataforma dinmica, en la cual se agregan SRS es un paquete de manejo de
constantemente nuevos componentes o cambian de manera dinmica bases de datos desarrollado por
las vnculos establecidas entre los elementos.
EBI y accesible desde distintos si-
241
Figura 3: Algunas de las Bases de Datos accesibles desde el servidor SRS.
tios, que a diferencia de Entrez, puede ser operado de manera local.

2.1.2 Uso de PubMed (ENTREZ)
Otra forma muy popular de acceso es a
travs del PubMed, usualmente utilizado
para el relevamiento bibliogrfico por la mayora de los cientficos. Se basa en el mapeo
automtico de trminos (automatic term
mapping): cuando se ingresa un trmino
para realizar una bsqueda en PubMed, el
servidor que recibe el requerimiento intenta
identificar el tipo de bsqueda que se est
intentando hacer: est el usuario intentando buscar un autor, o una revista, o un rea
de conocimiento? Entonces el servidor filtra
los trminos de bsqueda a travs de listas
sucesivas para intentar responder dicha pregunta y usar los trminos en forma eficiente.
Este proceso utiliza las siguientes listas
242
MeSH (Medical Subject Headings):

vocabulario controlado utilizado para indexar
artculos en PubMed.
Journals: nombre completo de la revista, abreviaturas usadas en MedLine y nmeros ISSN.
Lista de frases: cientos de miles de frases generadas a partir de MeSH y otros vocabularios controlados similares.
ndice de autores: apellido e iniciales.
Si el trmino ingresado est presente en
alguna de estas listas, la bsqueda se limitar a ese campo de la base de datos. En caso
contrario, el trmino ser utilizado para buscar sobre todos los campos de la base de
datos. Es evidente que si uno slo est interesado en buscar publicaciones en determinada revista (por ejemplo Cell), es ineficiente utilizar el trmino Cell como palabra clave, ya que muy probablemente exista
algn autor llamado as, y la palabra Cell
se encuentre presente en varios ttulos o
resmenes.
Figura 4: Representacin grfica de las relaciones del sistema DBGET para la bsqueda y la recuperacin de datos
El mapeo automtico de trminos puede evitarse en primer lugar encerrando el trmino o frase entre comillas. Esto evitar el
filtrado a travs de listas, realizando una bsqueda sobre todos los campos de la base de
datos en forma directa. Adems, en caso de
una bsqueda con una frase (ms de una palabra), esto fuerza la bsqueda usando la frase tal como fue ingresada (con las palabras
en ese orden), lo cual puede resultar til en
algunos casos.
Los trminos de una bsqueda pueden
proporcionarse truncados (truncation), utilizando un asterisco (*). Por ejemplo, una
bsqueda con el trmino enzym* retornar
citas conteniendo la palabra enzyme, pero
tambin enzymes, enzymology, enzymatic,
etc. La bsqueda con trminos truncados
desactiva el mapeo automtico, por lo cual
las bsquedas utilizando este mtodo van a

diferir de las que no lo usan.
PubMed ignora ciertas palabras en las
bsquedas, estas son llamadas stopwords y
corresponden a palabras muy comunes, presentes en la gran mayora de las citas de la
base de datos: artculos, proposiciones, adverbios, etc. La lista de stopwords se encuentra en la documentacin de PubMed.
Entrez permite combinar trminos utilizando operadores lgicos (AND, OR,
NOT). Los operadores lgicos, tambin llamados operadores volanos (boolean
operators), deben ser ingresados en maysculas para ser reconocidos como tales por
Entrez (por ejemplo: vitamin C OR zinc, DNA
AND Crick AND 1993). Entrez lee los operadores lgicos de izquierda a derecha. Es posible cambiar el orden de evaluacin de los ope-
243
radores usando parntesis.

Para focalizar las bsquedas es recomendable utilizar cdigos de calificacin de trminos (search field qualification). Esto es,
describir qu tipo de trmino se est usando: si se busca por nombre de un autor, de
una revista, o por fecha, etc. La calificacin
de trminos se realiza agregando una etiqueta entre corchetes al lado del trmino
a calificar. Es muy poco intuitivo el criterio
de uso de estos calificadores, por lo que se
recomienda leer el manual como fue sugerido al inicio del captulo.
Entrez realiza las bsquedas sobre cierto
tipo de campos de la base de datos. Estos
campos se encuentran indexados, y es posible acceder a los ndices para evaluar la eficacia de nuestra estrategia de bsqueda. Cuando se realiza una bsqueda, se selecciona en
Preview/Index, esto permite acceder a un
formulario para ver los ndices y eventualmente agregar un trmino a la bsqueda.
ciones de dichas palabras. Combine searches

with permite relacionar los trminos de la
bsqueda mediante los conectores & AND,
OR y BUTNOT. Number of entries to display per page permite definir el nmero
mximo de registros listados en cada pgina.
Pueden hacerse bsquedas extendidas
para lo cual hay que ingresar al sitio seleccionando sobre el botn Extended, habiendo
seleccionado primero una base de datos. En
este formulario se pueden definir los mismos
parmetros que en el formulario estndar
(wildcards, nmero de registros por pgina,
etc.), pero a su vez contiene una lista de reas
de datos (que varan de acuerdo con el tipo
de base de datos utilizada) sobre la cual pueden realizarse bsquedas. Una vez elegido el
campo sobre el cual se quiere buscar, simplemente hay que ingresar la(s) palabra(s) clave
en el cuadro de texto de la derecha.
3 Otras bases de datos moleculares
2.1.3 Uso de SRS

El SRS ofrece a los usuarios la posibilidad
de buscar datos y analizarlos a travs de
distintos paquetes de software en el mismo sitio. La pgina de inicio de este servidor
presenta distintas opciones:
Comenzar un proyecto temporario o permanente.
Correr una aplicacin.
Acceder a informacin disponible sobre
las bases de datos.
Acceder a la documentacin en lnea.
Para realizar una bsqueda hay que seleccionar sobre Start a Temporary Project,
con lo que se abre una pgina que muestra
las bases de datos disponibles en el sitio. Una
vez all deber seleccionarse la(s) base(s) de
datos sobre la cual(es) buscar. Es posible seleccionar todas las bases de datos seleccionando sobre el botn all.
Luego se accede a la solapa de bsqueda
estndar (denominada QUERY) donde se
definen las opciones de bsqueda y se ingresan las palabras clave. Dentro de las opciones de bsqueda, si seleccionamos Append
wildcards to words la bsqueda se realizar
sobre las palabras claves ingresadas y tambin sobre todas aquellas posibles termina-
244
Aparte de las bases de datos generales

existe un gran nmero de bases de datos
especializadas de gran importancia para
focalizar proyectos y obtener informacin
adicional generalmente no accesible desde
las bases generales como son fenotipos,
datos experimentales, datos de mapeo,
etc.; bases de datos derivadas del anlisis de
las bases de datos generales (bases de datos de motivos funcionales y estructurales) y bases de datos de interacciones.
Un rea de estas bases especializadas por
especies la constituye el rea de proyectos
genmicos de plantas. Aqu las iniciativas
centrales la constituyen la secuenciacin
completa de especies modelo como
Arabidopsis thaliana [18] y el arroz, Oryza
sativa var. indica [19] y Oryza sativa var.
japonica [20]. Sin embargo, estn en marcha
muchos proyectos de secuenciacin parcial de
genomas en gramneas, crucferas,
solanceas, compuestas, etc., que aportan informacin para sustentar el anlisis comparativo de regiones de inters entre genomas
ampliando los conocimientos sobre la
estructuracin de genes y genomas de las
plantas.
La identificacin de regiones sintnicas
(conservacin de las posiciones cromosmi-
cas relativas de secuencias marcadoras

homlogas en especies relacionadas, es decir, conservacin de mapas genticos a escala evolutiva) har posible el aislamiento de
genes en especies con genoma complejo,
usando la informacin de genes homlogos
en especies con genomas ms pequeos y
ms profusamente estudiados (los as llamados clonados posicionales en base a mapas)
[21].
Desde lo acadmico, el anlisis comparativo de los genomas usando una estrategia bioinformtica persigue entender cuales
son los mecanismos esenciales para el funcionamiento mnimo de una planta, su crecimiento normal, su desarrollo y metabolismo,
entender las bases de la especiacin y la
diversidad, los mecanismos bsicos de la
adaptacin y la enorme diversidad qumica [22].
3.1 Bases de datos de motivos
Existe otro conjunto de bases de datos
denominadas secundarias porque derivan
Base de
Datos
Blocks
CDD
CluSTr
DOMO
InterPro
IproClass
MetaFam
Pfam
PIR
PIR-ALN
PRINTS-S
ProClass
ProDom
PROSITE
ProtoMap
SBASE
SMART
de las bases de datos generales, son las llamadas de motivos estructurales y funcionales. Estas bases de datos introducen el
concepto de patrones y perfiles de secuencias. Los patrones definen secuencias cortas
de aminocidos conservados que corresponden a sitios activos, sitios de unin, etc. Al
ser regiones acotadas, no dan cuenta del resto de la secuencia adyacente y son muy poco
sensibles al momento de encontrar secuencias relacionadas que presenten una divergencia mnima en la regin definida por el
patrn [23, 24, 25]. Los perfiles compensan
esta debilidad dado que cubren reas ms
largas de la secuencia a travs de la representacin numrica de las posiciones conservadas en un alineamiento mltiple. En
otras palabras, los perfiles representan las
posiciones comunes y caractersticas de
aminocidos de una coleccin particular de
secuencias, frecuentemente de una familia
de protenas. Usando perfiles es posible encontrar miembros muy divergentes de familias de protenas que presenten muy baja
identidad de secuencia [23, 24, 25].
Descripcin
Database of protein alignment blocks
Conserved domain database
Clusters of SWISS-PROT and TrEMBL proteins
Protein-domain database based on sequence alignments
Integrated documentation resource for protein families,
domains and functional sites
Integrated protein classification database
Database of protein family information
Collection of multiple sequence alignments and hidden Markov
models
Protein Information Resource
Curated database of protein sequence alignments
Compendium of protein fingerprints
Non-redundant protein database organized by family relationships
Automatic compilation of homologous domains
Database of patterns and profiles describing protein families and
domains
Automatic hierarchical classification of SWISS-PROT proteins
Curated protein domain library based on sequence clustering
Simple Modular Architecture Research Tool
- a collection of protein families and domains
SWISSPROT
Protein sequence databases
and TrEMBL
Systematic re-searching method for sequence searching and
SYSTERS
clustering
TIGRFAMs Protein families based on hidden Markov models
URL
http://blocks.fhcrc.org/
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/cdd.shtml
http://www.ebi.ac.uk/clustr/
http://www.infobiogen.fr/services/domo/
http://www.ebi.ac.uk/interpro/
http://pir.georgetown.edu/iproclass/
http://metafam.ahc.umn.edu/
http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/
http://pir.georgetown.edu/
http://pir.georgetown.edu/pirwww/dbinfo/piraln.html
http://www.bioinf.man.ac.uk/dbbrowser/PRINTS/
http://pir.georgetown.edu/gfserver/proclass.html
http://prodes.toulouse.inra.fr/prodom/doc/prodom.html
http://www.expasy.ch/prosite/
http://www.protomap.cs.huji.ac.il/
http://www3.icgeb.trieste.it/~sbasesrv/
http://smart.embl-heidelberg.de/
http://www.ebi.ac.uk/swissprot/ or
http://www.expasy.org/sprot/
http://systers.molgen.mpg.de/
http://www.tigr.org/TIGRFAMs/
Tabla 1: Bases de datos y recursos para el anlisis de datos de familias de protenas, dominios y motivos [25].
245
Dentro de este grupo de bases de datos

que proveen informacin para la bsqueda
de secuencias homlogas remotas y para la
prediccin de funcin se incluyen Prosite,
PRINT-S, Pfam, SMART, TIGRfam y Blocks
entre otras listadas en la Tabla 1.
4 Alineamiento de Secuencias:
Fundamentos
4.1 Alineamiento de pares de secuencias
Una de las maneras mas frecuentes de
obtener informacin sobre una o un grupo
de secuencias incgnitas, es mediante la bsqueda comparativa utilizando la informacin
depositada en distintas bases de datos. Uno
de los mtodos comparativos ms comunes
es el alineamiento de pares de secuencias,
la descripcin del resultado del mismo trae
aparejado el uso (o mal uso) de los trminos: identidad, similitud y homologa. La
identidad significa que existe exactamente
el mismo nucletido o aminocido en la misma posicin de las secuencias alineadas. Similitud expresa una medida observable que
considera por un lado las identidades y por
otro lado, le da valor a las sustituciones favoreciendo aquellas que sean conservativas
respecto de las que no lo son. Finalmente,
homologa significa que las secuencias no slo
se parecen mucho entre s, sino que tambin
comparten una historia evolutiva [26, 27].
Los algoritmos de comparacin de secuencias ms comunes tales como BLAST [28],
FASTA [29] y SSEARCH [30, 31] miden similitud o identidad entre secuencias pero no
miden homologa.
La forma que estos algoritmos emplean
para darle significado a cada uno de los
alineamientos posibles es asignndole un
valor (score) a cada uno de ellos, el score ms
alto corresponde al mejor alineamiento. La
manera ms comn de asignar este valor es,
a travs de una suma simple de scores especificados para cada alineamiento de pares de
letras (que representan igualdades o sustituciones), y de letras con caracteres nulos (que
representan deleciones o inserciones). El conjunto de estos scores mencionados representa una matriz de scores, las ms populares
son las matrices de bloques de sustitucin
BLOSUM [32] y las matrices de mutaciones
246
puntuales aceptables PAM [33, 34]. La construccin de estas matrices se basa en el modelo de Dayhoff [33], que establece que relaciones lejanas entre secuencias pueden
modelarse con suficiente precisin usando la
informacin de secuencias estrechamente
relacionadas. Ambas matrices se basan en
grupos de alineamientos altamente
confiables de protenas homlogas, a partir
del cual miden la frecuencia de todas las sustituciones a travs de mtodos diferentes
[26].
Las matrices PAM fueron calculadas sobre
la base de un modelo de distancia evolutiva
sobre alineamientos de secuencias muy relacionadas, as PAM1 define una unidad de
cambio evolutivo y representa la probabilidad de que 1 aminocido en 100 haya experimentado una sustitucin. Multiplicando
PAM1 por s mismo se obtiene una familia
de matrices de sustitucin arbitrarias que representan distintos grados de parentesco. La
matriz PAM120 es considerada una buena
matriz de sustitucin para analizar secuencias
evolutivamente ms cercanas, mientras que
PAM250 es ms apropiada para comparar secuencias ms distantes [26, 27].
Las matrices BLOSUM son calculadas de
manera similar pero usando una estrategia
diferente para estimar las frecuencias de sustitucin [27, 32]. Los bloques representan
alineamientos mltiples de secuencias relacionadas (a diferencia de PAM, que usa secuencias estrechamente relacionadas). Los nmeros asociados a estas matrices indican el valor de corte del porcentaje de identidad que
define el grupo. Por lo tanto, las matrices
con valores de corte ms bajo (ej.
BLOSUM62) admiten una mayor diversidad
de secuencias en los grupos y son ptimas
para comparar secuencias ms distantes.
No obstante, los eventos de mutacin
no slo incluyen sustituciones sino tambin inserciones y deleciones, por lo cual
tambin se asigna un score a los intervalos
vacos o gaps observables en los alineamientos.
Una vez definido el score para un alineamiento arbitrario, surge la necesidad de encontrar el alineamiento ptimo entre los
muchos alineamientos posibles. Dado que lo
ms comn entre secuencias de ADN o protenas es que sean similares en algunos seg-
mentos y no en toda la extensin de las secuencias involucradas, lo ms frecuente es

usar en esta instancia programas basados en
el algoritmo de Smith-Waterman que busca ptimos en alineamientos locales de pares de secuencias [35]. No obstante, tratn-
dose de mtodos de programacin dinmica, para los cuales el tiempo de clculo es proporcional al cuadrado del tamao de las secuencias que se comparan [23], son extremadamente lentos para realizar bsquedas exhaustivas en las bases de datos de mayor
Figura 5: Resultado de una bsqueda en BLAST. A) el encabezado muestra el nombre de la secuencia incgnita y el
nombre de la base de datos analizada. Como el programa usado fue BLASYx, la secuencia fue traducida en las seis
marcos de lectura correspondientes y comparada con la base de datos nr (non redundant}de protenas mantenida
por NCBI. B) muestra una representacin grfica de los alineamientos. C) muestra un resumen de los alineamientos
mas significativos junto con el score normalizado y el valor E. D) muestra los lineamientos detallando las propiedades
247
referencia (GenBank, Swissprot, etc.). En cambio, tanto FASTA como BLAST emplean otro
tipo de desarrollo llamado heurstico, que
favorecen la velocidad a cambio de la sensibilidad y la selectividad [26]. Ambos programas operan de manera similar pero usando distintas estrategias para localizar las posiciones donde es ms probable que ocurra
el mejor alineamiento. FASTA busca cadenas
de letras exactamente iguales de un tamao
fijo establecido (words). BLAST, en cambio,
usa matrices de sustitucin (tomando de
base BLOSUM62 para secuencias de
aminocidos) para encontrar words que sin
ser exactamente iguales muestren el score
ms alto, en este nivel de bsqueda ambos
algoritmos no admiten gaps. BLAST realiza
algunas otras operaciones como filtrar las
regiones de baja complejidad (regiones
repetitivas), y elimina words con baja probabilidad de producir un score alto. Una vez que
se identifican estas regiones de alto score,
se aplican algoritmos ms sofisticados de programacin dinmica, ahora s permitiendo la
existencia de gaps. En esta segunda etapa
BLAST busca segmentos similares a la lista de
words establecidos en toda la base de datos y cuando encuentra un alineamiento
posible trata de extenderlo hacia ambas direcciones, hasta tanto el score contine
incrementndose. Luego BLAST evala si el
valor E de los alineamientos obtenidos satisface el umbral seleccionado por el usuario
(normalmente entre 0,1-0,001) para finalmente informar la lista de los seleccionados.
La Figura 5 muestra un resultado obtenido a partir de BLAST. El encabezado cita la
versin del algoritmo empleado y su referencia, el nombre y la longitud de la secuencia
analizada y la base de datos que se us como
blanco. La segunda parte del informe presenta un resumen de todas las secuencias que
produjeron alineamientos significativos
junto con un valor de score normalizado y el
valor E. La tercera parte muestra los
alineamientos detallando los valores de los
scores, identidad y valor E obtenidos y la ltima parte del informe muestra los
parmetros utilizados en la bsqueda.
Para interpretar los resultados obtenidos
de la bsqueda de similitud en bases de datos moleculares usando cualquiera de los
algoritmos (FASTA, BLAST o SSEARCH), el
valor ms representativo es el valor E [26, 35].
248
Este depende del valor de score, del largo

de la secuencia incgnita y del tamao de la
base de datos analizada y mide las chances
de que el alineamiento obtenido sea solamente causa del azar. As un valor E de 0.001
(que es el valor de corte ms usado par las
bsquedas con BLAST) significa que hasta 1
de cada 1000 alineamientos puede haberse dado por azar. Un valor cercano o menor
a 1 e-50 es menos frecuente de encontrar, y
resulta muy confiable en cuanto a que las
secuencias alineadas estn evolutivamente
relacionadas, no obstante esta apreciacin
exige una confirmacin mediada por un anlisis filogentico.
4.2 Alineamiento mltiple de secuencias
Como se mencion ms arriba, el advenimiento de proyectos genmicos a gran escala ha llevado a la acumulacin de un enorme
y heterogneo nmero de secuencias depositadas en bases de datos pblicas. El alineamiento mltiple de secuencias juega un papel importante en la biologa molecular actual. Tanto la anotacin (edicin por correccin e interpretacin de hipotticas funciones por homologa) de dichas secuencias
como las herramientas de anlisis dependen
de alineamientos mltiples adecuados. El
objetivo de la aplicacin ha pasado de una
simple transferencia de anotacin funcional
de una secuencia a otra, a un enfoque
genmico ms amplio. El anlisis de familias proteicas, la prediccin de su estructura secundaria, la estimacin de los diferentes tipos de plegamientos as como la deteccin de homlogos entre especies distantes como pasos intermedios en la construccin de rboles filogenticos, se han constituido en los principales objetivos de este
tipo de alineamiento [37, 23].
El alineamiento mltiple de secuencias
puede ser visto como una generalizacin del
alineamiento de pares de secuencias, donde
la complejidad de esta aproximacin crece
exponencialmente con el nmero de secuencias que intervienen. La posibilidad de resolver el problema por mtodos manuales [38]
debe quedar descartada por la enorme complejidad del problema, limitndose su uso a
casos con pequeos grupos. Por analoga con
la comparacin de pares de secuencias, es
posible aplicar la misma tcnica de programacin dinmica al caso exhaustivo

multidimensional, pero el crecimiento
exponencial de la complejidad de mtodo limit su aplicacin prctica [39, 40, 41]. Introdujeron un esquema de acotamiento que
utiliza alineamientos de parejas de secuencias para limitar el volumen del espacio N dimensional que se necesita para el alineamiento exhaustivo, resultando en importantes
mejoras en la velocidad, que posibilitaron su
implementacin en el programa MSA [42] y
la aplicacin del mtodo a pequeos grupos
de secuencias. Por lo general tampoco es
posible alinear ms de 10 secuencias usando
el riguroso modelo del programa MSA. De
esta forma es fcilmente entendible la proliferacin de mtodos aproximados para conjuntos ms grandes de secuencias. Los programas desarrollados abarcan una amplia
gama, desde aquellos que utilizan mtodos
progresivos tradicionales [43, 44, 45] a aquellos iterativos y con mayores requerimientos
computacionales [40, 46, 47, 48]. Los mtodos iterativos tienden a una optimizacin
de la funcin de puntajes. El objetivo buscado es que la funcin de puntaje refleje
una funcin biolgica tal que su
optimizacin lleve a un alineamiento
biolgicamente correcto. El alineamiento
mltiple puede dividirse en dos categoras
principales: aquellos mtodos de alineamiento de secuencias en toda su extensin
(globales) y aquellos mtodos que alinean
regiones con alta similitud. Tradicionalmente se ha focalizado en los mtodos globales
tales como el mtodo CLUSTAL W, que son
aplicables a casos en los que las secuencias
comparadas tienen extensiones similares.
Sin embargo ms recientemente se ha puesto mayor inters en los mtodos de alineamiento mltiple local para el alineamiento
de secuencias derivadas de proyectos
genmicos que slo alinean parcialmente
[37].
En los mtodos de alineamiento global,
la solucin clsica se basa en la formacin de
agrupamientos (clusters) de secuencias, los
cuales se resuelven progresivamente [48].
Para ello, dada una medida del parecido o
semejanza entre dos secuencias, se elige
aquel par correspondiente al valor ms alto
y se alinean y agrupan entre s para formar
un nico grupo o cluster de secuencias. A

partir de este momento este cluster ser tratado como una sola secuencia, y el proceso
se repetir hasta tener un solo cluster con
todas las secuencias que intervenan en el
alineamiento mltiple. Posiblemente, los
programas ms difundidos de este tipo sean
CLUSTAL V [45] o CLUSTAL W en su ltima
versin [49], y PILEUP, el cual utiliza el mtodo heurstico para el clculo de los niveles de
semejanza entre las secuencias [50]. La aplicacin de esta estrategia no garantiza resultados ptimos (en una primera etapa evala por coincidencias de residuos, por lo que
s utilizar esquemas de puntuacin, aunque
podran existir otras soluciones posibles con
puntuacin mayor). Sin embargo, la calidad
de los alineamientos es bastante aceptable,
y permiten alinear algunos pocos cientos de
secuencias [51, 52]. Otro algoritmo de comparacin mltiple global progresivo es el
POA que no generaliza perfiles sino que emplea grficos parcialmente ordenados partiendo de las secuencias ms similares y va
adicionando otras secuencias progresivamente. Este programa permite comparar no slo
secuencias relacionadas originadas por mecanismos de delecin, insercin o mutacin
sino secuencias ms distantes [53]. Los
algoritmos de comparacin mltiple local,
como el DIALIGN, alinean segmentos completos en vez de residuos simples. Inicialmente realiza alineamientos de pares, seleccionando luego las regiones sin intervalos no
apareados que aparecen como diagonales de
una matriz, para progresar en una comparacin iterativa [46]. Otros programas como el
T-Coffee combinan alineamientos mltiples
globales y locales, realizando primero una
comparacin de a pares global utilizando el
algoritmo CLUSTAL W y luego una comparacin local utilizando FASTA [47]. Tanto el
DIALIGN como el T-Coffee arrojan mejores
resultados con grupos de secuencias ms diversas pero tienen altos requerimientos
computacionales.
Con la idea de mejorar la sensibilidad de
estos resultados, tambin se han propuesto
numerosas posibilidades hbridas, tales como
la representada por el programa MACAW
[54] basado tanto en informacin estadstica sobre alineamientos de segmentos de las
secuencias como en la posibilidad de
interaccin con el usuario. As mismo, se ha
249
propuesto la utilizacin de matrices de consenso [55] para describir la preferencia de

cada aminocido, o de cada delecin, para
situarse en el alineamiento. Tambin se ha
recurrido a informacin sobre las estructuras
secundarias [56, 57], o a la localizacin de
motivos y/o dominios conservados en las
secuencias [58], o a la utilizacin de las caractersticas fsico-qumicas de los aminocidos
en cada posicin [59].
5 Bsqueda por perfiles para localizar
homlogos remotos
Existe una tercera generacin de mtodos ms elaborados para realizar bsquedas
de similitud con mayor sensibilidad [60]. Los
ms exitosos son PSI-BLAST y los mtodos
basados en los modelos ocultos de Markov
(HMM, [61]). El primero es un mtodo extremadamente sensible para detectar similitudes dbiles basndose en un proceso
iterativo mediante el cual el algoritmo de
BLAST puede ser generalizado para utilizar
un perfil en vez de una secuencia [5], se recomienda usar este algoritmo cuando no se
encuentran resultados significativos a partir
de una bsqueda estndar a travs de
BLASTP. El proceso de PSI-BLAST comienza
con una secuencia provista por el usuario, la
cual es alineada mediante el algoritmo
BLASTP contra una base de datos seleccionada. A partir de los alineamientos ms significativos, el programa usa de base aquellos
alineamientos que presentan un valor E menor que 0.005, construye una matriz de
scores especficos de posicin o perfil
(position-specific scoring matrix, PSSM o
profile). En la segunda ronda, la versin
adaptada del algoritmo BLAST usa la matriz
como entrada para realizar una bsqueda
ms refinada.
De una manera similar, HMMs genera
perfiles a partir de alineamientos mltiples
de secuencias, tales como los obtenidos usando Clustal W o X [49, 62] y calcula scores especficos de posicin que guarda en un archivo de formato compatible que luego se usa
para analizar una base de datos.
Tanto PSI-BLAST como HMMs facilitan el
desarrollo de bases de datos secundarias
como las bases de datos de dominios de protenas [63, 64] que permiten el anlisis de la
250
arquitectura modular de las protenas y sus

unidades funcionales. Hoy en da se prefiere usar estas bases de datos para predecir o
confirmar la funcin de genes o protenas,
dado que resultan ms confiables que las
bases de datos primarias que reciben grandes cantidades de informacin regularmente lo cual hace difcil controlar que las anotaciones de los datos sean correctas.
6 Prediccin de Genes
La expansin de los proyectos genmicos
en los ltimos aos ha sido tal que al da de
hoy existen 717 iniciativas de este tipo en el
mundo, 140 de los cuales corresponden a
genomas completos, entre ellos el genoma
humano, el genoma de Arabidopsis thaliana
[18], Oryza sativa variedad indica [19] y
Oryza sativa variedad japonica [20], 235 corresponden a organismos eucariotas, 38 de
los cuales son genomas vegetales y 342 corresponden a organismos procariotas (GOLD
[65]). La gran cantidad de datos generados
por estos, y otros proyectos de anlisis
genmico parcial fuerzan las necesidades de
disponer de las herramientas adecuadas para
darle interpretacin biolgica a estos datos.
Una de las etapas ms crticas de este proceso es la de identificar todos lo genes y sus
protenas asociadas. La manera ms directa de abordar esta tarea es mediante mtodos comparativos como los descriptos anteriormente basados en encontrar una secuencia altamente similar a la secuencia incgnita
en otro organismo usando generalmente
bases de datos de protenas. Sin embargo,
slo un 50-70% de los genes nuevos suelen encontrar homologa con genes o protenas conocidas [66]. La caracterizacin del
resto de las secuencias requiere la aplicacin
de mtodos predictivos, los mismos tratan
de identificar secuencias codificantes a partir
de patrones caractersticos, usualmente secuencias cortas sobre el ADN genmico que
representan sitios claves para procesos
como la transcripcin (sitios de unin a factores de transcripcin, cajas TATA), el procesamiento postranscripcional del ARN (sitios
de splicing) y la traduccin (codones de iniciacin y terminacin) [67]. Existen muchos
programas para predecir genes, la mayora
de los cuales son accesibles desde la Web, el
sitio Computational Gene Recognition mantenido por W Li [68] ofrece una lista completa y actualizada de publicaciones y software
dedicado a este tema. Sin embargo, aunque
los recursos son vastos y los algoritmos de
prediccin han ido avanzando junto con los
desarrollos en informtica y el avance de los
conocimientos, cimentados en una mayor
disponibilidad de informacin biolgica caracterizada, actualmente no existen mtodos
precisos para identificar estas seales en las
secuencias moleculares. Este problema se
acenta cuando se trata de predecir genes
eucariticos que tienen una organizacin y
una estructura ms compleja que la de los
genes de organismos procariticos. En
genomas complejos los genes no estn dispuestos en forma continua, estn separados
por distancias intergnicas enormes y a su
vez estn estructurados en fragmentos
codificantes (exones) separados por regiones no codificantes (intrones), los cuales
adems varan en tamao y nmero dentro
y, ms an, entre especies.
Algunos programas, adems de reconocer y modelar las seales de patrones especficos, tratan de incorporar un modelo estadstico de las propiedades que definen de
manera ms global exones, intrones y regiones intergnicas, aprovechando los sesgos
de composicin de bases (en regiones
codificantes es ms alto el porcentaje de
G+C) [69], el uso de codones, la frecuencia
de hexmeros o dicodones [70, 71, 72, 73],
la periodicidad de aparicin de bases [74],
etc. Sin embargo, todas estas consideraciones no son suficientes para reconocer con
exactitud exones e intrones cuando stos son
cortos.
En la mayora de los casos, los programas
ms promisorios para reconocer genes en la
especie bajo estudio deben ser analizados
particularmente, a partir de lo cual muchos
son redefinidos o diseados especficamente
[67]. Dado que los algoritmos usan distintas
medidas y scores para predecir regiones
codificantes, lo recomendable es combinar el
resultado de algunos o varios de ellos para
construir el mejor modelo, en este sentido
existen distintas herramientas de acceso libre como RiceGAAS [75, 76], y GenMachine
[77, 78], GenMark [79], entre muchos otros.
7 Conclusiones
La biologa moderna ha generado una
explosin de informacin en el rea de
secuenciacin de genomas completos, la
protemica, la transcriptmica, la
genmica funcional, la interactmica, la
metabolmica, etc. Todo esto genera la necesidad constante de actualizar esta informacin y aplicarla en beneficio de los proyectos
particulares. Para ello, es necesario entender
cmo se genera esa informacin, cun
confiable es, cmo se maneja y cmo se analiza. En este proceso juega un papel clave el
desarrollo de la bioinformtica, que se define como un rea de fusin entre la biologa, la matemtica avanzada y la computacin cuyo objetivo discurre en observar la biologa en trminos de macromolculas, con el
fin de ordenar y entender la informacin contenida en las mismas a partir de recursos de
la informtica. En este sentido, la
bioinformtica enfoca tres reas bsicas, la
primera tiene que ver con el desarrollo de un
sistema simple de organizacin de los datos biolgicos de manera de favorecer el
acceso y el ingreso de nuevas entradas a las
bases de datos compartidas. La segunda rea
tiene que ver con el desarrollo de recursos y
herramientas para analizar la informacin
coleccionada en las bases de datos, lo cual
implica conocimientos slidos en las teoras
computacionales y biolgicas.El tercer rea,
implica el uso de estas herramientas para
analizar los datos e interpretar los resultados de manera biolgicamente significativa.
En este captulo hemos intentado dar
una visin amplia de la bioinformtica
focalizando dos elementos fundamentales
como son las secuencias y los alineamientos, familiarizando a los lectores con los
recursos bsicos disponibles para el acceso a
la informacin y su anlisis, e instalando el
concepto de que existen diferentes caminos
para resolver un problema. Sin dejar de tener en cuenta que la mayora de los mtodos computacionales se basan en conocimientos limitados sobre genes, protenas y
caminos biosintticos por lo cual todos los
resultados obtenidos a travs de estos medios exigen una verificacin experimental.
En su defecto, es recomendable explorar dis-
251
tintos programas que aborden el problema

desde perspectivas diferentes. En este sentido, tambin es aconsejable no confiar en
los parmetros de base (defaults) de los
programas sino experimentar valores diferentes (tales como valor E, enmascarado de regiones de baja complejidad, matriz de score,
etc.) para lo cual es crucial leer la documentacin asociada a los programas o bases de
datos usadas.
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254
PARTE VIII
Aplicaciones
255
256
ESCANDN, Alejandro S.
VIII.-Captulo 1
2 El cultivo de tejidos en ornamentales
Biotecnologa en el Cultivo de Especies

Ornamentales
Escandn, Alejandro S.
1 Introduccin
Una de las tcnicas biotecnolgicas que

se emplean en ornamentales es el cultivo de
tejidos. Esta tcnica no slo permite la produccin masal de plantas, sino que tambin
posibilita el estudio y caracterizacin de la
biologa del desarrollo de las mismas.
Dependiendo del objetivo planteado es
posible clonar individuos utilizando cultivo de
pices o meristemas, o bien buscar aumentar la variabilidad gentica por medio del cultivo de callos, suspensiones celulares o
protoplastos.
La tcnica de micropropagacin (Fig.1) es
una excelente herramienta que ha sido am-
La industria florcola es de una importancia ms que relevante a escala mundial, ya

que representa un negocio
de alrededor de 30.000
millones de dlares.
Tradicionalmente se ha
empleado el mejoramiento clsico para obtener variedades exitosas que satisfagan las demandas de un
mercado vido de novedades, que busca nuevas caractersticas en cuanto a colores, formas, aromas, etc.
Sin embargo, las tendencias actuales hacia la mejora ecolgica de los cultivos
y la necesidad de incorporar caracteres tales como
resistencia a herbicidas, insectos, enfermedades,
mayor vida en postcosecha, modificar la arquitectura de las flores, etc., ha
conducido a la industria de
la floricultura a adoptar las
nuevas biotcnicas.
El presente captulo tiene como objetivo brindar
un panorama sobre la situacin actual de la Biotecnologa en relacin al
cultivo de plantas ornamentales. No se profundi- Figura 1. Cultivo de tejidos de Santa Rita. A: Desarrollo de la yema principal y de
zar en los detalles de las brotes subsidiarios en la base de la misma que sern cultivados in vitro. B: Brotes
subsidiarios aislados. C: La flecha seala la yema principal, los restantes son
tcnicas involucradas, que brotes subsidiarios cultivados en forma aislada. D: Estado previo a la transferencia
ya han sido tratadas en de los brotes al medio de enraizamiento. E: Plantas ex vitro enraizando en
otros captulos de este vo- sustrado artificial. F: Plantas ex vitro floreciendo en condiciones de invernculo.
Modificado de Escandn et al. RIA 32 (1):11-122. Abril 2003.
lumen.
257
pliamente utilizada para la propagacin a

gran escala de especies ornamentales, ya que
no slo permite la obtencin de miles de individuos a partir de un genotipo elite seleccionado, sino que tambin permite la
multiplicacin de plantas raras o en peligro
de extincin, resguardando la estabilidad
gentica de las mismas.
Algunos gneros y especies de plantas
que se pueden cultivar in vitro a partir de
diferentes explantos son:
- Cultivo de meristemas: Ghypsophyla,
Chrysantemum, Maranata sp., Gladiolus, Iris
sp., Pelargonium, Saintpaulia spp.
- Apices: Diphaenbachia, Daphne L.,
Dracaena sp., Gerbera sp., Mammillaria sp.,
Rosa L. , Iris sp.
- Yemas o segmentos nodales: Dianthus,
Bignoniaceae, Nierembergia, Jacaranda
mimosifolia, Bougainvillea, Blandfordia sp.,
Anthurium sp. Bromeliaceas, Maranta sp.,
Campanula sp., Daphne L., Dracaena sp.,
Gerbera sp., Mammillaria sp., Mediocactus
coccineus, Zinnia elegans, Rosa L., Gardenia, Chrysantemum, Gladiolus, Impatiens,
Iris sp. , Saintpaulia spp.
- Segmentos de mdula: Chrysantemum,
Orchidea, Saintpaulia spp.
- Pecolos: Rhododendron sp., Anthurium sp., Gerbera sp., Chrysantemum.
- Discos de hojas: Rhododendron sp.,
Bromeliaceas. Begonia sp., Gardenia.
Chrysantemum, Saintpaulia spp.
- Lmina: Saintpaulia spp.
- Escamas: Lilium
- Bulbos o Segmentos de bulbos: Sego lily,
Narcissus
- Rizomas: Cymbidium
- Cotiledones: Zinnia elegans.
- Semillas: Cattleya sp., Mammillaria sp.,
Orchidea, Saintpaulia spp.
- Embriones maduros: Alstroemeria sp.,
Zinnia elegans, Impatiens , Iris sp.
- Embriones inmaduros: Alstroemeria sp.,
Orchidea spp.
- Secciones de flores: Iris sp.
- Anteras: Saintpaulia spp.
- Segmentos de ptalos: Chrysantemum.
- Segmentos de inflorescencia: Chrysantemum, Saintpaulia spp..
- Captulos: Gerbera sp.
- Ovulos: Impatiens
258
- Callos: Chrysantemum, Iris sp.

- Protoplastos: Chrysantemum.
- A partir de plntulas in vitro:
Bromeliaceae, Gerbera sp., Cyclamen
persicum, Gardenia, Scoparia sp.
La lista precedente es apenas una muestra de la gran diversidad de explantos que se
utilizan para la multiplicacin in vitro de plantas y, como tal, est muy lejos de abarcar el
total de las especies ornamentales que se
multiplican por este mtodo.
Adems de la micropropagacin, la posibilidad de obtener plantas libres de virus por
medio del cultivo de meristemas tambin ha
sido explotada en ornamentales. Hace ms
de 50 aos Morel y Martn informaron la regeneracin de plantas de dalia libres de virus
por escisin y cultivo del domo meristemtico
de pices de plantas infectadas. Este descubrimiento dio un gran impulso al cultivo de
tipo intensivo en general. El cultivo de
meristemas es uno de los mtodos ms eficaces para la eliminacin de virus, ms an si
se lo combina con termoterapia y/o mtodos qumicos; es de gran aplicacin en el campo de los cultivos intensivos tanto ornamentales como hortcolas. Como la mayora de
los cultivos ornamentales se multiplican
asexualmente, estas enfermedades virales
suelen ser un problema importante. La eleccin errnea de un material, por error o desconocimiento, provocara la diseminacin de
estas enfermedades, con las consecuentes
prdidas econmicas
Gerbera representa un claro ejemplo de
la necesidad de la aplicacin de estas tcnicas en la industria florcola. En Europa la demanda anual del mercado de plantas de este
gnero oscila entre 15 y 20 millones de unidades. Con el mtodo convencional (semillas o divisin de la corona sobre sustrato artificial e inerte) se logra una tasa de multiplicacin de 30 plantas por ao. Por otro lado,
se hace necesario eliminar de los cultivos de
esta especie los virus que los afectan normalmente, entre ellos el del mosaico del coliflor
(CMV). Si bien existe una dependencia del
genotipo, por medio de la multiplicacin de
yemas apicales in vitro es posible obtener
una tasa de multiplicacin de hasta 300 yemas por pice cultivado en 90 das, libres de
virus. En general, con todos los genotipos,
estas tcnicas de produccin superaron largamente los rendimientos del mtodo convencional, por lo que fueron adoptadas como
mtodo de rutina para la multiplicacin comercial de este gnero.
El cultivo in vitro tambin puede ser fuente de variabilidad gentica. La produccin de
plntulas por regeneracin a partir de callos,
suspensiones celulares o protoplastos, puede dar origen a individuos que presentan algn rasgo diferente respecto de la planta
madre. Esto tambin puede lograrse utilizando mutgenos durante el cultivo in vitro asociados con una presin de seleccin conferida por factores tales como pH, salinidad, toxinas y baja temperatura. Las plantas regeneradas luego de estos tratamientos pueden
mostrar caractersticas que difcilmente se
puedan obtener por otra va. La induccin
de variantes somaclonales tiene especial significado en la floricultura debido a la constante bsqueda de nuevas variedades,
seleccionndose las variantes prometedoras
y estables e incorporndolas a los programas
de mejoramiento. En la actualidad se conoce un importante nmero de variantes en
ornamentales. Se han obtenido individuos
con diferencias en la forma, el color y el tamao de la flor (en Chrysantemum, Zinnia,
Geranium y Saintpaulia).
En Chrysantemum, se han obtenido individuos con resistencia al estrs salino y con
cambios interesantes en la forma de las hojas. Otro ejemplo de variacin somaclonal es
el caso de Zinnia. Los somaclones en este
gnero se obtuvieron a travs del desarrollo
de yemas adventicias a partir de cotiledones
cultivados con diferentes concentraciones de
tidiazuron (TDZ). Este fue un avance importante para la especie Z. marylindica, que es
un hbrido estril. A partir de este tratamiento se recuper una gran cantidad de variantes, plantas con diferentes tamaos, hbitos de floracin, color de ptalos y, lo que es
ms interesante, en algunos casos se restaur la fertilidad. Aquellas variantes cuyos nuevos caracteres mostraron ser heredables se
seleccionaron para incorporar en el programa de mejoramiento.
Asimismo, la variacin somaclonal tambin se ha utilizado a fin de seleccionar
genotipos resistentes a enfermedades
fngicas en el gnero Rosa, lo mismo que la
fusin de protoplastos. En este caso se obtuvieron yemas a partir de callos originados

de protoplastos interespecficos fusionados
que haban sido pretratados con antimetabolitos como iodoacetato o rodamina-6G o,
alternativamente, con rayos X. La obtencin
de plantas completas y frtiles a partir de
estos materiales hace a esta estrategia muy
promisoria para incorporar nuevos caracteres.
Una tcnica tradicional para la obtencin
de mutantes in vitro que tambin se utiliza
en especies ornamentales es la aplicacin de
inductores de poliploida, como la colchicina
y los herbicidas orizalina y trifluralina, que ha
sido aplicada en Rhododendron y Lilium.
Esta tcnica se est utilizando en el Centro Tecnolgico en Flori, Fruti y Horticultura
(CETEFFHO) con el objetivo de obtener cruzamientos interespecficos viables en especies
de los gneros Calibrachoa y Scoparia. Para
ello, una vez efectuado el cruzamiento, se duplican los cromosomas del hbrido a fin de
que sea frtil. Las plantas de Calibrachoa que
sobrevivieron al tratamiento demostraron ser
quimeras diploides/tetraploides. Se multiplicaron las tetraploides y se espera la floracin
a fin de establecer la posibilidad de cruzarlos
con otras especies del gnero.
3 Marcadores moleculares para el
mejoramiento y la seleccin de
ornamentales
Los marcadores moleculares como herramienta para la caracterizacin y diferenciacin entre genotipos fueron rpidamente utilizados por genetistas y mejoradores de plantas. Su neutralidad en relacin al proceso de
seleccin, su poder de resolucin y la celeridad con que se obtiene la informacin, son
algunas de las ventajas que ofrece esta herramienta.
A pesar de que diferentes clases de marcadores moleculares fueron probados en ornamentales, los AFLPs y los microsatlites son
los ms frecuentemente utilizados por su alta
reproducibilidad y la gran cantidad de informacin que brindan. Estos marcadores
moleculares aplicados a la diferenciacin de
genotipos son un arma muy poderosa para
la proteccin de los derechos de los
mejoradores y productores. Para detectar la
259
propagacin fraudulenta de un cultivar el

mtodo tradicional se basa en el anlisis y la
comparacin de los caracteres fenotpicos de
plantas crecidas y en perodo de floracin.
Esta estrategia tiene la desventaja de que
requiere mucho tiempo y depende de factores ambientales. Esto se soluciona utilizando
marcadores moleculares de manera ms rpida y precisa.
La genmica tambin est realizando
aportes en el rea de las plantas ornamentales. La rosa, que como flor de corte es uno
de los cultivos ornamentales ms importantes del mundo, es un ejemplo interesante. A
mediados de la dcada de 1990, se inici un
proyecto conjunto entre las Universidades de
Clemson y Texas a fin de obtener el mapa
gentico de esta especie. El mismo tiene
como objetivos, a largo plazo, ubicar los
genes involucrados en la produccin de la fragancia y los de la resistencia a la enfermedad
de la mancha negra, causada por el hongo
Diplocarpon rosae. Esta enfermedad es la
de mayor incidencia en el produccin de rosas. Se caracteriza por la presencia en las hojas de manchas negras de contorno irregular, defoliacin, prdida del vigor de la planta, y disminucin en la produccin de flores.
La enfermedad se controla con aplicaciones
de fungicidas. Un hecho de importancia es
que se han detectado variedades de rosas
que manifiestan resistencia a la enfermedad
y se estn buscando los genes que la confieren. Con este fin los investigadores texanos
estn analizando la F2 de un cruzamiento seleccionado entre una variedad susceptible y
una resistente, donde la progenie segreg
adems para varios caracteres de inters para
la industria florcola, como color de la flor
(rosa vs blanco), nmero de ptalos (5 vs. 10
o ms), presencia o ausencia de espinas en
el tallo, floracin una vez al ao o siempre
florecida.
A partir del anlisis de esta F2 se est
construyendo un mapa de alta densidad con
distintos marcadores moleculares, entre los
que se encuentran los AFLPs. Una vez
construdo este mapa, se proceder al anlisis de los perfiles detectados a fin de establecer la asociacin entre los marcadores utilizados y los caracteres de inters. Esto permitira llevar a cabo en el gnero Rosa un programa de mejoramiento asistido por marca-
260
dores moleculares.
Como el resto de las tcnicas biotecnolgicas, la de marcadores moleculares est
siendo intensamente aplicada en especies
ornamentales, sobre todo por la relevancia
Tabla 1: Aplicacin de marcadores moleculares para
determinar la distancia gentica (DG), identificacin
varietal (I.V) y anlisis gentico (A.G), en algunos gneros
ornamentales.
Gnero
I. V.
D. G.
A. G.
Alstroemeria
Calladium
Cephalotaxus
Cymbidium
Dahlia
Dedrathema
Dianthus
Euphorbia
Geranium
X
X
X
X
Gerbera
Heliconia
Jacaranda
Junipers
Lilium
Osteospermum
Ozothamnus
Pelargonium
Petunia
Rhododendron
Rosa
Scaevola
Syringa
Viola
que estos estn adquiriendo en la verificacin de los criterios de distinguibilidad, estabilidad y uniformidad de las nuevas variedades que ao a ao ingresan al mercado.
En la Tabla 1 se mencionan los cultivos
ornamentales en los cuales se han aplicado
marcadores moleculares.
4 Mejorando la ecologa de los cultivos y
modificando las formas y los colores de
las flores
La tecnologa gnica es otra de las estra-
tegias que se ha aplicado exitosamente en

el mejoramiento y se ha difundido en forma
sostenida entre los principales cultivos ornamentales. Varios factores han contribudo a
este importante desarrollo, entre los que se
puede considerar un profundo conocimiento de la bioqumica de las plantas (sobre todo
en lo que hace a la sntesis de pigmentos),
un notable manejo del cultivo de tejidos en
las especies de inters, el alto valor agregado que implica la aplicacin de la tcnica,
adems de las ventajas adicionales que se
pueden lograr en la incorporacin de un
caracter determinado (por ejemplo: ahorro
de insumos, incremento en el rendimiento,
etc.). Asimismo, y desde un punto de vista
totalmente ligado el mercado, los organismos
genticamente modificados (OGMs) ornamentales, no generan el mismo tenor de
controversias que provocan los OGMs ligados
al consumo alimentario humano como los
cereales y las oleaginosas.
Para el mejoramiento de ornamentales
por transgnesis existe un considerable inters en la incorporacin de caractersticas tales como: resistencia a insectos, a enfermedades fngicas y virales, tolerancia a herbicidas, androesterilidad, etc., que son los de
aplicacin en la mayora de los cultivos. A estas se suman los caracteres especficos para
la floricultura, como son la modificacin del
color y la forma de las flores, el incremento
de la vida post cosecha, la modificacin de la
fragancia, el control de la floracin y el mejoramiento de la eficiencia de enraizamiento.
En el tema donde ms se ha avanzado
es en la modificacin de los pigmentos de
los ptalos. El color de las flores se debe a
tres tipos de pigmentos. De los colores amarillo y naranja son responsables los
carotenoides. Del rojo y del rosa son responsables los flavonoides (cianidina y
pelargonidina, flavonoides, se encuentran en
las flores rosas y rojas respectivamente). El
color azul se debe a un pigmento denominado delfinidina.
La modificacin del color de las flores se
plante como objetivo por los grupos de
mejoradores de ornamentales. El primer informe acerca de la modificacin de los colores de flores por ingeniera gentica lo efectu en 1987 el Instituto Max Planck de Colonia, Alemania. Desde mediados de la dcada que comenz en 1990 se sucedieron una
serie de publicaciones acerca de la alteracin

de la pigmentacin de flores de crisantemo
por aplicacin de la tecnologa antisentido
para el gen de la chalcona sintetasa (chs). En
clavel se utiliz la secuencia antisentido de la
flavonona 3-hidroxilasa (Fht), para bloquear
la va metablica de las antocianinas. De esta
manera se logr la modificacin del color original y se obtuvieron nuevos genotipos de la
variedad utilizada en el ensayo. Asimismo, se
encontr que los genotipos transgnicos que
tenan reprimida la expresin de Fht resultaron tener mucho ms fragancia que los controles. Estudios de cromatografa gaseosa
mostraron incrementos de 10 a 100 veces en
los niveles de los derivados del cido benzoico,
por lo que a partir de la alteracin de la expresin de un transgen, se logr la modificacin de dos caracteres.
La introduccin de la secuencia en sentido del gen de la chalcona sintetasa en
petunia permiti redireccionar la va
metablica de los flavonoides hacia la produccin de chalconas, lo que deriv en la
obtencin de flores amarillas en el gnero
por acumulacin de pigmentos como
chalconas, auronas y algunos flavonoles en
los ptalos.
El color azul no es muy frecuente en las
flores. Slo en petunia el azul tiene la intensidad que los mejoradores pretenden. Este
color depende de tres factores: la sntesis de
un pigmento denominado delfinidina (3,5hidroxiantocianina), la presencia de copigmentos como flavonas y un pH alcalino
en las vacuolas de las clulas de los ptalos.
La obtencin de flores dentro de la gama
del azul se constituy un desafo para las semilleros. Una idea de la relevancia de este
tema lo indica el hecho que en el ao 1986
se fund en Melbourne, Australia, la compaa Florigene cuyo principal objetivo era el
desarrollo de claveles, crisantemos y rosas de
color azul (las tres especies abarcan el 50%
del mercado mundial de flores de corte). Esta
empresa aisl el gen que codifica para la enzima clave para la biosntesis de delfidina, la
flavonoide 3',5'-hidroxilasa, el Blue Gene. A
mediados de la dcada que comenz en 1990
se obtuvieron claveles azules. Otro gen
involucrado en la produccin de delfinidina
fue identificado en 1999. Este gen codifica
para un citocromo del tipo b5. La expresin
261
del mismo incrementa la produccin de la

antocianina 3,5 sustituda. El silenciamiento
de este gen en plantas de petunia redunda
en un 60% menos de acumulacin de
delfinidina en relacin a plantas no tratadas.
En la actualidad existen en el mercado siete variedades de claveles cuya pigmentacin
fue modificada por ingeniera gentica por
incorporacin del Blue Gene.
En cuanto a la obtencin de rosas azules,
un inconveniente a resolver es que la va
metablica de produccin de pigmentos en
estas plantas es muy diferentes a la petunia,
ya que la rosa es deficiente en la enzima
flavonoide 3',5' hidroxilasa. En consecuencia
no puede sintetizar los pigmentos adecuados. Otro inconveniente es el pH vacuolar,
que en las rosas es cido y bajo estas condiciones la delfidina se torna de color rosa. Los
datos indican que el microambiente de las
clulas del ptalo de la rosa no sera el ms
propicio para la produccin de pigmentos
azules va flavonoides, por lo que esta estrategia no sera la ms adecuada para la produccin de una rosa de color azul.
En la actualidad Florigene est probando
el citocromo P450 (responsable de la
detoxificacin heptica en mamferos), como
alternativa para la obtencin de rosas de
color azul. Experimentos efectuados en la
Universidad de Queensland demostraron
que bacterias transformadas con el gen que
codifica para el P450 son capaces de generar
un color azul intenso usando como sustrato
compuestos con grupos indlicos, que se
encuentran normalmente presentes en los
vegetales. Si bien presenta la ventaja de que
se trata de una va metablica directa (de un
solo paso), habra que determinar si los productos de la conversin de grupos indol no
presentan fitotoxicidad. Todava no se han

obtenido resultados concluyentes con la aplicacin de esta estrategia para la obtencin
de rosas azules.
Otro importante avance tecnolgico, desarrollado y patentado por la misma empresa, es la produccin de claveles larga vida
(long vessel life, LVL) por bloqueo de la sntesis de etileno. La va metablica de produccin de esta hormona es bien conocida, la
enzima ACC (cido 1 amino ciclo propano-1carboxlico) sintetasa, convierte a la Sadenosilmetionina en ACC que, por accin
de la ACC oxidasa se transforma en etileno.
Aplicando tecnologa antisentido se logr
suprimir la expresin de ambas enzimas, por
lo que se bloque la produccin de etileno
en los claveles transgnicos. La falta de produccin de etileno impide el deterioro prematuro de las flores una vez cortadas (principalmente, el enrollamiento de los ptalos),
retrasando su envejecimiento. La tecnologa
ofrece una importante ventaja tanto en lo
comercial como en lo ecolgico, ya que los
productores podrn abandonar el uso de las
sales de plata, muy contaminantes, para
prevenir la produccin de etileno en el perodo post-cosecha.
En otros laboratorios se ha modificado la
forma de las flores de crisantemo por la introduccin del gen rol C de Agrobacterium
rhizogenes, obtenindose plantas de menor
tamao, flores de menor dimetro y ptalos
y hojas modificados. En clavel la incorporacin de este transgn produjo una serie de
modificaciones morfolgicas muy ventajosas
como ser disminucin de la dominancia apical,
mayor capacidad de enraizamiento, mejor
incorporacin de metabolitos y mayor produccin de varas (se increment tres veces
Tabla 2: Algunos
avances logrados en el
mejoramiento de
ornamentales por
ingeniera gentica
262
en relacin al producto no transgnico). En

trminos prcticos estas modificaciones implican una sensible mejora en el rendimiento del cultivo.
La Tabla 2 resume algunos avances logrados en el mejoramiento de ornamentales por
ingeniera gentica.
5 La situacin en la Argentina
En la Ctedra de Produccin Vegetal de

la Facultad de Agronoma de la UBA se han
realizado experiencias en la micropropagacin de Pelargonium, Lupinus,
Jasminum mensyi y Gerbera.
En el CETEFFHO, futuro Instituto de
Floricultura de INTA-Castelar, se trabaja desde hace algunos aos en micropropagacin
de especies ornamentales como, entre otras,
alstroemeria, clavel, rosa, orqudeas,
Poinsetia, Ghypsophylla, Gerbera, etc. Dentro del mismo Instituto y en el marco del proyecto INTA-JICA: Desarrollo de la Floricultura
La revisin de los libros de resmenes del

Primer Congreso Argentino de Floricultura y
del V Simposio de Redbio Argentina 2002
muestra que en nuestro
pas son muy pocos los laboratorios que trabajan en
biotecnologa de ornamentales. La lista alcanza a 5 instituciones trabajando en el
rea.
En el Dpto. de Agronoma de la Universidad Nacional del Sur y en el Centro de Recursos Naturales
Renovables de la Zona
A
B
Semirida (CERZOS) se trabaja en multiplicacin in
vitro de Lilium.
En el laboratorio de Cultivo de Tejidos del Instituto de Botnica del Noreste
(IBONE) y Universidad Nacional del Noreste (UNNE)
se multiplican orqudeas in
vitro. Este Instituto en colaboracin con el Dpto. de
Agronoma de la UniversiC
D
dad Nacional del Sur estudia la variabilidad gentica
Figura 2. A) Individuos tetraploides del gnero Scoparia (izq.) obtenidos a
en la micropropagacin de
partir de un diploide (der.) tratado con colchicina en condiciones in vitro,
comparados con el correspondiente control. B). Comparacin entre las flores
paraso (Melia azaderach).
de ambas plantas, tetraploide (izq.) y control (der.). C) Hojas de la planta
Sobre esta misma especie
tetraploide (arr.) y de la planta control (ab.). D) Planta tetraploide florecida.
en el IBONE se efectan estudios de crioconservacin.
En el Laboratorio de Propagacin y Pro- en la Argentina se est trabajando en flora
duccin Vegetal del Centro Austral de Inves- nativa de importancia ornamental, entre
tigaciones Cientficas de Usuahia se trabaja otros con los gneros: Tabebuia, Jacaranda,
Tecoma, Nierembergia, Lilium, Calibrachoa,
en Berberis sp.
En el Centro de Produccin Vegetal Bougainvillea y Scoparia (Fig.2).
Adems de importantes avances en el
(CEPRoVe) de la Facultad de Ciencias Agrarias de la Universidad Nacional de La Plata se establecimiento in vitro de Tabebuia y
est trabajando en la micropropagacin de Tecoma, se han logrado interesantes resultados en la micropropagacin de J.
Pelargonium.
263
mimosifolia, Bougainvillea sp, Lilium sp,

Calibrachoa sp y Scoparia spp. En algunos
casos con el objetivo de micropropagacin
en s misma, y en otros, para aplicar
mutagnesis in vitro. Otra de las reas en
las que se trabaja en el CETEFFHO es la puesta a punto de tcnicas de marcadores
moleculares para la identificacin, va
fingerprinting (fenotipeado), de los individuos que se obtienen por mejoramiento. Se
han obtenido resultados promisorios en la
aplicacin de microsatlites anclados en la
caracterizacin molecular de clones de
Jacarand, siendo la primera vez que se informa un resultado de esta ndole para el
gnero.
De esta revisin se desprende que en
nuestro pas la herramienta biotecnolgica
de aplicacin en cultivos de inters ornamental es la multiplicacin in vitro.
Si bien a partir del desarrollo del proyecto INTA-JICA Desarrollo de la Floricultura en
la Argentina se dieron pasos sustanciales en
la formacin de recursos humanos, nuestro
pas debera potenciar el desarrollo y aplicacin de las nuevas tecnologas en el rea del
mejoramiento de cultivos ornamentales. Estos dos aspectos son fundamentales para
que el pas pueda intervenir en el mercado
mundial de ornamentales, aprovechando los
inmensos e interesante recursos naturales de
los cuales dispone. Se espera que la incorporacin de nuevas variedades al mercado incidir en forma positiva sobre el desarrollo de
la industria local y permitir el ingreso de la
Argentina en el mercado florcola mundial
como generador de germoplasma mejorado.
6 Perspectivas
El advenimiento de la genmica y
protemica y el desarrollo de la bioinformtica han aportado herramientas de utilidad
que podran aplicarse en el mejoramiento de
especies ornamentales.
Los estudios sobre el genoma de
Arabidopsis facilitarn la comprensin de la
estructura y funcin del genoma de los cultivos ornamentales, en especial a travs de la
identificacin de genes involucrados en estrs
abitico, sntesis de hormonas, resistencia a
patgenos, etc. Tambin ser sustancial el
aporte que se haga acerca de los mecanis-
264
mos que intervienen en el establecimiento

de la arquitectura de la planta, en el funcionamiento de los meristemas (en especial de
las flores), o en los componentes de la resistencia a enfermedades. La identificacin y el
aislamiento de estos genes posibilitar su incorporacin, va transgnesis, a los cultivos
ornamentales a fin de lograr un mejoramiento sustancial que involucre todos los aspectos del cultivo.
Los avances efectuados en fotobiologa
y en el conocimiento de los ritmos circadianos
vegetales permitirn ajustar finamente el
control de procesos tan importantes como
la floracin.
Tambin se abren nuevas y muy interesantes perspectivas para la creacin, seleccin
y uso de la variabilidad gentica.
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http://www.cx.yn.cninfo.net/edu/science/flecture-1.htm
VIII.-Captulo 10
Estrategias para el control de insectos
plaga
Ferrero, Adriana A.; Descamps, Lilian;
Reviriego, Mara
1. Introduccin
toneladas por ao. Esto representa un recurso potencialmente disponible para ser
explotado por los insectos fitfagos.
El impacto de los insectos sobre las cosechas es conocido desde los tiempos bblicos,
cuando las plagas de langostas se extendieron por el territorio egipcio. Sin embargo, el
estudio global de la interaccin y del impacto de los insectos sobre la vegetacin natural se ha desarrollado en los ltimos cien
aos. En la actualidad, los insectos plaga y
los organismos patgenos (hongos, bacterias y virus) son responsables del 14 % de las
prdidas en cosechas en el mundo (Fig. 1).
Las actividades agrcolas incrementan las
oportunidades para el surgimiento de las plagas a travs del desarrollo de monocultivos,
del cultivo en reas donde no existen enemigos naturales de la plaga, del uso de fertilizantes y herbicidas, del desarrollo del cultivo
en un rea nueva permitiendo as que las
especies nativas de insectos se alimenten de
ste y se conviertan en plagas, de la eliminacin de los enemigos naturales de la plaga
por cambios en el manejo del cultivo y del
uso continuo del mismo producto qumico,
generando adaptacin a ste y posibilitando la aparicin de resistencia.
En los agroecosistemas modernos la evidencia experimental sugiere que la
biodiversidad puede ser utilizada para mejo-
La categorizacin de un organismo como

peste o plaga est determinada por el hombre, es decir, tiene carcter antropocntrico,
considerndose ste como el factor principal
en el sistema. As, insectos que se alimentan
de plantas y granos, que actan como
vectores de agentes patgenos en los vegetales o que alteran la salud humana son considerados plagas.
La poblacin humana est sumergida en
un mar de insectos. Si se considera su nmero solamente, la tasa estimada de insectos
en relacin con los humanos en nuestro planeta es de 200 millones a 1, existiendo alrededor de 160 millones de insectos por hectrea. Basados en su biomasa y abundancia,
los insectos son los organismos ms exitosos
en la tierra, siendo el 1% de ellos los que caen
en la categora de plagas.
Se supone que las formas ms primitivas
de insectos conocidas eran
consumidores de detritus. El
hbito de alimentarse de
plantas parece, en algunos
casos, haber evolucionado
independientemente. Los insectos han atravesado un largo y variado perodo de
coevolucin y coadaptacin
con sus plantas huspedes
estableciendo modelos de
asociacin con distintas estrategias en el ciclo biolgico y
en
los
mecanismos
alimentarios necesarios para
la explotacin de stas.
La produccin primaria
neta de las 300.000 especies
de plantas vasculares, que
Figura 1: Principales destinos de la agricultura mundial. El hombre debe
competir por las cosechas con insectos plaga, malezas y enfermedades
habitan las zonas secas de la
que reducen el rendimiento de los cultivos. Gentileza del Prof. Germn
superficie de la tierra, ha sido
Spangenberg.
9
estimada en unas 115 x10
335
rar el manejo de las plagas. Varios estudios

muestran que es posible estabilizar las comunidades de insectos en un agroecosistema
constituyendo arquitecturas vegetales que
soporten a las poblaciones de enemigos naturales y/o inhiban el ataque de las plagas.
Es difcil imaginar una tecnologa que produzca la cantidad necesaria de alimento para
la humanidad y el mantenimiento adecuado
de la salud pblica sin recurrir al uso de
plaguicidas, adquiriendo particular relevancia
dentro de este grupo los insecticidas destinados a combatir y/o reducir una poblacin
de insectos plaga.
orgnicos. Estos contienen cloro, hidrgeno

y carbono en su molcula y, ocasionalmente,
oxgeno y azufre. Aunque son muy efectivos,
estables y persistentes, se acumulan en grasas y dan origen al conocido fenmeno de
biomagnificacin. Sus efectos sobre la vida
silvestre, el medio ambiente y la salud humana estn muy bien documentados en el libro
La primavera silenciosa, escrito en el ao
1962 por la biloga Raquel Carlson. A partir
de 1950/1960 los organoclorados fueron reemplazados por los organofosforados y los
carbamatos.
Los organofosforados se desarrollaron en
Alemania durante la Segunda Guerra Mun2 Insecticidas
dial; qumicamente derivan del cido fosfrico, son menos estables en presencia de la
El uso de insecticidas en el mundo es muy luz y se descomponen rpidamente en comgeneralizado. Su aplicacin para mantener a puestos no txicos. La ruptura de estos comlos cultivos libres de insectos representa cuan- puestos se produce en horas o das en comtiosas inversiones econmicas (Fig.2). Las paracin con los organoclorados, que demoprdidas en cosechas debidas a los insectos ran meses o aos. Los carbamatos son insecsumado al costo de los herbicidas represen- ticidas de amplio espectro muy utilizados en
tan una inversin mundial de unos 3 billones la agricultura, desarrollados por la corporade dlares anuales.
cin Geigy. Son derivados del cido carbmico
El mtodo ms preciso de clasificacin de y similares en la persistencia en el ambiente
los insecticidas es de acuerdo con su compo- a los organofosforados. Entre 1970 y 1980
sicin qumica. Los grupos ms importantes siguieron los insecticidas piretroides, derivason los organoclorados, organofosforados, dos
del
cido
crisantmico.
Su
carbamatos y piretroides.
fotodegradacin es rpida y en la actualidad
Los organoclorados constituyen el grupo son los ms utilizados por ser ms seguros
ms antiguo y ms utilizado de insecticidas para la vida silvestre y el ambiente.
Como grupo, los compuestos sintticos mencionados son los ms potentes
para el control de las plagas.
Debido a su amplio espectro
de accin en la naturaleza,
pueden resultar perjudiciales
al hombre tanto en los
agroecosistemas como en los
ecosistemas naturales, no
slo destruyendo a la plaga
sino tambin a otros insectos
que actan como enemigos
naturales o favoreciendo el
resurgimiento de plagas secundarias. A menudo, algunas de las causas de estos
efectos indeseables estn relacionadas con la eleccin del
Figura 2: Uso de insecticidas en los principales cultivos agrcolas y el monto
producto, la dosis y el modo
de las inversiones realizadas.
en que stos se aplican.
336
FERRERO, Adriana A.; DESCAMPS, Lilian; REVIRIEGO, Mara
Continuamente se buscan compuestos

ms selectivos, ms especficos y con blancos
para accionar especficos de los insectos.
Muchos insecticidas convencionales afectan
el sistema nervioso del insecto, que tiene funciones similares a las del hombre o al de otros
animales. Esto hace que el inters en ellos se
reduzca por los potenciales riesgos para la
salud humana y animal.
En las ltimas tres dcadas se han logrado avances tecnolgicos significativos que
han permitido descubrir, identificar y sintetizar qumicos especficos que regulan o median el crecimiento, comportamiento y desarrollo del insecto. En este grupo se encuentran los llamados reguladores del crecimiento, que se caracterizan por causar muerte
prematura y metamorfosis anormales. Dado
su modo de accin su uso es seguro.
Otro grupo de insecticidas son los naturales, que pueden ser aceites minerales obtenidos del refinamiento del petrleo o botnicos. Los aceites refinados de petrleo
presentan ventajas como bajo costo, buena
cobertura de las superficies a tratar y facilidad en su formulacin. Se los ha utilizado
como coadyuvantes de otros insecticidas y
son seguros para el ambiente. Sin embargo,
son inestables en almacenaje, inefectivos
contra ciertas plagas y algunos insectos presentan resistencia a los mismos.
Los insecticidas botnicos son derivados
de las plantas o de parte de ellas y han sido
utilizados durante mucho tiempo antes que
cualquier otro insecticida. Las plantas producen una diversidad de compuestos, sin un rol
aparente en los procesos fisiolgicos bsicos
de las mismas, y a los que se conoce con el
nombre de metabolitos secundarios. Un considerable nmero de ellos son txicos para
los insectos ocasionndoles lesiones o la
muerte, dependiendo de las circunstancias y
de la cantidad ingerida. Los ms conocidos
son los alcaloides. Adems de stos, existen
anlogos qumicos de las hormonas de los
insectos, que pueden actuar interrumpiendo
su ciclo biolgico. Tambin existen protenas,
dentro de las cuales estn incluidas enzimas
tales como quitinasas, lectinas e inhibidores
de enzimas digestivas, con la misma funcin.
Actualmente es posible introducir en plantas genes que confieren resistencia a insectos para reducir su susceptibilidad a los mis-
mos. Estos genes pueden tener diversos orgenes y constituyen una herramienta importante en el desarrollo de variedades resistentes. Su importancia radica en su efectividad,
selectividad contra la plaga, baja estabilidad
relativa y compatibilidad con otras tcticas.
Adems, las variedades resistentes pueden
ser introducidas fcilmente y en forma econmica resultando en ganancias en corto
tiempo. Sin embargo, el tiempo requerido
para su desarrollo, los problemas de biotipos
y que, a veces, las caractersticas agronmicas
de un cultivar puedan ser beneficiosas para
otra plaga son algunas de sus desventajas.
Las barreras qumicas de las plantas pueden ser interpretadas como un mecanismo
de defensa contra los insectos que se alimentan de ellas y que la planta ha adquirido por
seleccin natural. Sin embargo, es difcil demostrar esta afirmacin. Los metabolitos
secundarios tienen funciones alternativas,
muchos son considerados como agentes
antimicrobianos que protegen las plantas de
posibles enfermedades. De todas maneras
existen ejemplos que demuestran que durante la alimentacin de los insectos con una
planta puede inducirse en la misma un incremento en la concentracin de algunos
metabolitos secundarios, que sern efectivos
contra sucesivos ataques.
La relacin entre el estmulo qumico de
la planta y la respuesta del insecto es una
forma de comunicacin qumica entre estos
organismos. Esta comunicacin se realiza
mediante compuestos conocidos como
semioqumicos, que suelen llamarse agentes
antiinsectos y que pertenecen al grupo de
los biorracionales. Los semioqumicos incluyen a las feromonas, sustancias producidas
por insectos que permiten la comunicacin
entre individuos de la misma especie y a los
aleloqumicos, que permiten la comunicacin
entre individuos de diferentes especies. Es
necesario destacar que en la ltima dcada
se han investigado intensamente las posibilidades de aplicar comercialmente las
feromonas con fines de control. En la prctica slo el 5% de las mismas se ha logrado
sintetizar. Hasta el momento no se encuentran en la bibliografa casos instalados de resistencia a feromonas, pero poco uso se ha
hecho de ellas.
Los aleloqumicos pueden subdividirse en
337
allomonas y kairomonas. Las allomonas

cumplen funcin defensiva, produciendo respuestas negativas en los insectos y reduciendo el contacto y la utilizacin de la planta.
Entre ellas se encuentran los repelentes y los
compuestos que alteran la oviposicin y la
alimentacin. Las kairomonas provocan respuestas positivas en el insecto favoreciendo
la localizacin del huesped, la oviposicin y la
alimentacin. Estas incluyen atractantes,
excitantes y estimulantes.
El estudio de la interaccin entre la plaga
y los compuestos presentes en las plantas
ofrecen un potencial importante para mejorar, en el futuro, el control de las plagas en
muchos cultivos.
Dentro del grupo de los biorracionales
tambin resultan de inters los productos de
fermentacin bacteriana y las protenas
cristalinas. Entre los primeros se encuentran
las avermectinas, que son una mezcla de
productos naturales producidos por un
actinomicete del suelo, Streptomyces
avermectilis. Este moderno insecticida y tambin acaricida debe su mecanismo de accin
a la actividad como agonista del cido gama
amino butrico (GABA), que es una
neurohormona del sistema nervioso de los
invertebrados. Las avermectinas actuaran en
los mismos receptores especficos para GABA
provocando la parlisis y muerte del insecto.
Entre los segundos se encuentran las
endotoxinas de Bacillus thuringiensis, tambin conocidas como Bt. Los productos basados en Bacillus thuringiensis (Bt) son los
ms difundidos entre los llamados insecticidas biolgicos porque poseen bajo riesgo ambiental y humano. No obstante, su
aplicacin ha sido muy restringida. En la actualidad, debido a los avances logrados en
su formulacin y a la biotecnologa se han
descubierto cepas de Bt. con mayor potencia y espectro de accin. Las Bt son bacterias
Gram positivas que producen, durante la
esporulacin, una inclusin cristalina
parasporal proteica. Esta inclusin es disuelta por ingestin en el intestino medio de los
insectos, donde se libera la llamada delta
endotoxina. Los cristales de las diferentes
cepas de Bt contienen ms de un tipo de
protena con poder insecticida. Son
bioactivas frente a lepidpteros, dpteros
o colepteros. La estructura de las delta
338
endotoxinas vara segn el gen que las codifica. Se identificaron y clasificaron numerosos
genes que las codifican, que son de dos tipos, denominados cry (por cristal), y cyt (toxinas citolticas). Ya hay ms de 100 genes identificados pertenecientes a estas familias. El
modelo actualmente vigente para el mecanismo de accin sugiere que por unin de la
toxina a su receptor especfico se induce la
formacin de poros en la membrana celular
que generan un desbalance inico que conduce finalmente a la muerte del insecto. Una
nueva clase de insecticidas que surgieron a
partir de las bacterias mencionadas es la que
corresponde a la llamada clase VIP (vegetative
insecticidal protein). Estas molculas se sintetizan durante el ciclo vegetativo de las bacterias y actan como exotoxina que al ser
ingerida por la plaga, cesa la alimentacin y
muere rpidamente.
Gracias a los avances de la tecnologa del
ADN recombinante se pudieron aislar los
genes de las deltas endotoxinas de Bacillus
thuringiensis y expresarlos en plantas y bacterias del suelo. Esta biotecnologa condujo
a nuevas formas de liberacin de las toxinas
para controlar insectos plaga. Los genes Bt
que ms comnmente se utilizan, en la actualidad en algodn tienen dos orgenes, uno
es el CryAc utilizado por Monsanto en sus
variedades Bollgard y el otro es un gen hbrido que fue desarrollado por el sector pblico
(Academia de Ciencias Agrarias de China,
CAAS). Se trata de un gen Cry1Ab/Cry1Ac.
Existe otro gen CpTi (cowpea trypsyn
gene) que se emplea unido a Bt en alguna
variedades chinas. Otro gen dual es el CryAc/
Cry1F. La utilizacin de dos genes simultneamente es una importante herramienta
para demorar el comienzo de la resistencia.
Las dos toxinas juntas resultan en un control
redundante que conferira una resistencia
ms duradera e incrementa el espectro de
insectos que permite controlar. En la actualidad se han informado 1.326 especies de insectos que atacan al algodn, de los cules
10 producen prdidas importantes desde el
punto de vista econmico, la mayora de los
cuales son lepidpteros.
Cabe mencionar que las toxinas expresadas en la plantas Bt son idnticas o similares
a las encontradas en la naturaleza y a las que
se encuentran en el microorganismo que se
utiliza en las aplicaciones convencionales de

Bt. Esta toxina es inocua para insectos que
naturalmente no son sensibles al Bt, para
aves, peces y mamferos, entre los que se incluye el hombre. En cuanto a la evaluacin
del impacto ambiental ver IX.2 y 3.
El cultivo a gran escala de variedades Bt,
comenz en 1996 y se increment rpidamente, alcanzando los 14 millones de has.
en el 2002. En el 2001 variedades comerciales de maz, algodn y papa fueron plantadas en 5 millones de hectreas en EE.UU.,
Argentina, Canad, China, Australia,
Sudfrica, Mxico, Espaa, Francia, Portugal,
Rumania y Ucrania
En el 2003 el maz Bt ocup el segundo
lugar en importancia en el mundo, con una
superficie de 12,3 millones de has, lo que
equivale al 13 % del rea total de cultivos
transgnicos (67,7 millones de has). Los pases que lo han adoptado son Estados Unidos, Canad, Argentina, Sudafrica, Espaa,
Filipinas, Honduras, Uruguay y Alemania. En
un ao la superficie sembrada aument de
9,9 millones de has a 12,3 millones. El maz
tolerante a herbicidas e insectos (eventos
combinados por cruzamiento convencional)
con 3,2 millones de has representa el 5 % de
la superficie y el algodon Bt tiene una superficie equivalente. El algodn tolerante a herbicidas e insectos ocupa 2,6 millones de has
(4%)
Este tipo de biotecnologa tiene mucha
importancia en los pases en vas de desarrollo. Los beneficios que otorgan estos productos son la reduccin en el uso de insecticidas
convencionales, en algunos casos de ms del
50 %, el incremento del valor del cultivo, mejor
control natural de la plaga, proteccin de los
enemigos naturales, reduccin en la contaminacin ambiental y posibilidad de combinar esta tecnologa con otras tcticas para el
control de la plaga. Tambin se han registrado incrementos en el rendimiento y menores costos de produccin, ya que el gen se
expresa en todos los estadios de crecimiento y en todos los rganos de la planta, evitando tener que aplicar insecticida en tiempos determinados; no existe riesgo de lavado por la lluvia ni prdida de actividad debida a la luz del sol, como sucede cuando se
aplican las formulaciones derivadas del microorganismo directamente. (Fig.3 y 4).
Figura 3: Caas de maz convencional (arriba) y

protegido de insectos (abajo) con el gen cry1Ab
especfico para el barrenador del tallo, Diatraea
saccharalis. (Gentileza Monsanto Argentina).
Figura 4: Ensayo experimental de soja tolerante a

insectos lepidpteros. En primer plano, variedad
convencional (Gentileza Monsanto Argentina).
Como un efecto indirecto de la proteccin contra insectos del maiz Bt, se ha podido determinar una reduccin en la presencia
de fumonisinas (micotoxinas producidas por
diferentes especies de Fusarium sp). Estas
micotoxinas son toxicas y cancerigenas para
un nmero de especies animales y se han
relacionado con los altos indices de cancer
esofgico observados en agricultores de Africa y China. Los niveles de reduccin de
fumonisinas en maices protegidos del dao
de los insectos (que constituyen vas de entrada del hongo), varan entre 3 y 8 veces en
diferentes pases y aos.
Otra ventaja es el ahorro en consumo de
agua que implica la menor utilizacin de insecticidas, que, como se sabe es uno de los
recursos ms limitantes del planeta (ver
VIII.12). El volumen de agua utilizada en una
339
simple aplicacin de insecticida es de 40 a 80

litros por ha. El ahorro en consumo de agua
debido a la utilizacin de tecnologas como
Bt puede estimarse de la siguiente manera:
durante 2001, 81 millones de kg de insecticidas fueron aplicados en el cultivo de algodn
en el mundo, a un promedio de 0,45 kg/ha/
aplicacin en el 2001. Esto representa 180
millones de has. fumigadas, lo que es consistente con un promedio global de 5,5 aplicaciones sobre 33,5 millones de has. La cantidad de agua utilizada para aplicar 81 millones de kg de insecticida es de 12,6 billones
de litros. El ahorro en consumo de agua con
esta tecnologa podra ser del 50%, es decir
6.3 billones de litros anuales. Tambin significa una reduccin de 5,6 millones de litros
de combustible y de un milln de kg de deshechos industriales generados en la fabricacin de insecticidas convencionales.
Dados los recientes avances en
biotecnologa, se podra esperar que las plantas transgnicas resistentes jueguen a futuro un importante rol en el control de insectos plaga. Hasta donde se conoce, no ha
evolucionado una plaga que exprese a campo resistencia a los cultivos Bt. No obstante,
el Bt aplicado como spray ha generado
moderados a elevados niveles de resistencia
en poblaciones de polilla de las coles y en
algunos ensayos se observ resistencia a plantas Bt en experimentacin, como por ejemplo a plantas transgnicas de brccoli. Existen al menos 7 cepas resistentes de 3 insectos plaga que sobreviven sobre cultivos Bt.
A fin de contrarrestar la aparicin de resistencia se desarroll la estrategia de refugio, basada en la teora desarrollada en docenas de publicaciones durante los ltimos
25 aos y en la limitada experiencia de trabajos experimentales a pequea escala. Se
trata de plantar refugios de plantas no Bt
en reas prximas a los cultivos Bt para permitir la supervivencia de los insectos susceptibles. De manera ideal, la resistencia es conferida por alelos raros, recesivos y los adultos
ms resistentes de los cultivos Bt se
aparearn con los adultos susceptibles de los
refugios. Si esto es as, la teora predice que
la aparicin de resistencia se ver demorada
sustancialmente. Aunque no existen informes
detallados acerca de las evaluaciones a gran
escala de esta estrategia de refugio, los ex-
340
perimentos muestran que pueden ocurrir algunas violaciones a algunas de las asunciones clave (baja frecuencia de alelos de resistencia y herencia recesiva de la resistencia a
Bt) en algunos sistemas. De esta manera,
dado el difundido uso de los cultivos Bt contra varios insectos plaga, la resistencia podra
evolucionar rpidamente en algunas situaciones a pesar de la presencia de refugios. Contrariamente a esto, no se han documentado hasta la fecha incrementos en la frecuencia de resistencia a las toxinas Bt en poblaciones de insectos a campo a causa de la exposicin a cultivos comerciales que expresan
Bt.
Los factores clave para la demora en la
aparicin de resistencia son probablemente:
los refugios, las bajas frecuencias iniciales de
los genes de resistencia, la herencia recesiva
de la misma, los costos asociados con el desarrollo de la resistencia, que reducen la aptitud de los individuos resistentes en relacin
a los individuos susceptibles sobre los cultivos Bt y las desventajas sufridas por las cepas resistentes sobre los huspedes Bt en
relacin a su desempeo sobre cultivos no
Bt. La importancia relativa de estos factores
vara entre los sistemas de las plagas y los
cultivos Bt.
Una leccin que nos brindan estos pocos
aos de cultivos Bt es que debemos ser cautelosos y reconocer que la habilidad para predecir tasas de evolucin de la resistencia en
el campo es limitada. El xito de los cultivos
Bt hasta la fecha excede las expectativas de
muchos, pero no previene los problemas de
resistencia en el futuro. El monitoreo constante y las estrategias biotecnolgicas en
continuo desarrollo sern fundamentales
para conservar este recurso de control biolgico.
2.1. Insecticidas naturales vs insecticidas
sintticos
La pregunta que nos deberamos hacer
es: son los insecticidas naturales ms seguros que los sintticos? Los cientficos responden que puede ser que sean, dependiendo
del insecticida natural o sinttico que se est
comparando. Cuando se evala el riesgo o la
seguridad de cualquier plaguicida se debe recordar que 1) la toxicidad es una funcin de
la estructura qumica y no de su origen, 2) la

seguridad de un plaguicida depende del tiempo y frecuencia con que el individuo estuvo
expuesto y de la dosis de exposicin y que 3)
la percepcin del riesgo a veces no es coincidente con el riesgo real o actual de un
plaguicida.
En algunas plagas, no se puede detener
la aparicin de resistencia a insecticidas convencionales, biopesticidas o nuevos cultivos
transgnicos.
La resistencia en insectos es un caso de
toxicidad selectiva intraespecie. Segn una
definicin, el fenmeno de resistencia consiste en la habilidad desarrollada en una cepa
de insectos para tolerar dosis de txicos que
seran letales para la mayora de los individuos de una poblacin normal de la misma
especie, siendo esta habilidad de carcter
gentico y heredable. Los insecticidas crean
una presin de seleccin que elimina progresivamente los individuos sensibles dejando
un nicho vaco que pasan a ocupar los individuos resistentes. La resistencia es un caso de
evolucin preadaptativa. Los insecticidas
naturales y/o sintticos no inducen sino que
seleccionan cepas resistentes. El mecanismo
ms comn por el cual una cepa resulta resistente a un insecticida es por la modificacin
de la toxicocintica o toxicodinmica. La
toxicocintica de los insecticidas naturales o
sintticos tienen que ver con las etapas de
penetracin, distribucin, acumulacin,
biotransformacin y excrecin en el insecto.
La llegada al sitio de accin se denomina
toxicodinmica y tiene que ver con la reaccin fundamental del insecticida o su
metabolito activado con una enzima o receptor vital. Estas etapas dependen crticamente
de las propiedades fisicoqumicas de los compuestos antiinsectos.
3. Consideraciones finales
Sin duda, varias tcticas pueden ser
implementadas para evitar la prdida de las
cosechas por accin de los insectos plaga. As
programas de Manejo Integrado de la Plaga
(MIP) deben ser desarrollados para cada cultivo y en cada regin, manteniendo la poblacin de la plaga debajo del nivel de dao
econmico. Se debe entender al MIP como
una filosofa y una metodologa que enfatizan
la necesidad de utilizar estrategias de manejo de la plaga para minimizar el resurgimiento de la misma. A pesar de todo, los insecticidas han sido y probablemente continuarn
siendo los mtodos ms efectivos para controlar el desarrollo de las plagas. Deca el Dr.
Edgardo Wood, en una conferencia relacionada con la resistencia a insecticidas: El hombre contemporneo debera comprender
que las tcticas qumicas eficaces para controlar las plagas como asimismo los blancos
sensibles y viables deben protegerse como
patrimonio de la humanidad, porque de la
irracionalidad en el uso de la qumica contra
la naturaleza podr sobrevenir una crisis debida a resistencia generalizada en la que no
contaremos con molculas naturales o sintticas efectivas ni con blancos viables. Entretanto la esperanza radica en el conocimiento cada vez mayor del problema y su potencialidad para ser cuidadosos en el aporte y
utilizacin de las soluciones. El primer gran
paso ya est dado: el no desconocer el fenmeno.
4. Lecturas Recomendadas
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London, Norwood (Australia). 185 pp.
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342
VIII.-Captulo 11
Estrategias para el manejo integrado
de malezas: problemtica, resistencia a
herbicidas y aportes de la
biotecnologa.
Sabbatini, M.R.; Irigoyen, J.H.; Vernav, M.N.
1 Definiciones, caractersticas y daos
ocasionados por las malezas
Se define a las malezas como plantas que
crecen en sitios no deseados por el hombre,
por lo que puede ser considerada maleza
toda planta que disminuye el rendimiento de
un cultivo, resulta txica para el ganado, invade el csped de un jardn o la que crece en
el techo de una casa dificultando el desage
de sus tuberas. Este concepto de maleza o
de planta indeseable causa por lo general un
rechazo especialmente por parte de botnicos que no admiten que se catalogue de esta
manera a una especie vegetal. Contrariamente, para un productor agropecuario, las malezas constituyen plantas nocivas que deben
ser eliminadas de los campos en produccin,
debido a que en la mayora de los cultivos y
pasturas su presencia ocasiona perjuicios econmicos de mayor o menor grado de severidad. La referencia negativa a estas plantas
se traslada a otros pases; as, por ejemplo,
en Espaa se las denomina malas hierbas
y en Brasil plantas dainas. El concepto de
maleza tiene por ello un origen
antropocntrico, ya que en realidad no existe ninguna caracterstica morfolgica o fisiolgica que permita caracterizar a una especie
vegetal como maleza. As, existen algunas
especies que de acuerdo con el lugar donde
crecen pueden ser consideradas cultivos o
malezas. Un buen ejemplo de ello lo constituye el raigrs (Lolium multiflorum), en la
provincia de Buenos Aires, que es una maleza importante del cultivo de trigo pero paralelamente es una forrajera ganadera muy
deseable.
Las malezas conforman una pequea proporcin del mundo vegetal: de las 200.000
especies de angiospermas, slo cerca de
30.000 se comportan como malezas y no ms
de 250 representan serios problemas para las

actividades humanas. En agroecosistemas, la
mayora de las malezas tienen algunas caractersticas claves que aseguran su xito y les
otorgan la habilidad de invadir, dominar y
persistir. Entre ellas se encontraran una alta
dispersin por semillas u otros disemnulos,
que les asegura una asociacin cercana a
hbitat manejados por el hombre; un alto
potencial de colonizacin que les permite
incrementar la poblacin rpidamente e integrarse a la comunidad vegetal, y una alta
capacidad de persistencia en el sitio, fundamentalmente a travs de comportarse
como hbiles competidoras frente a los cultivos y presentar un banco de semillas o
propgulos abundante y longevo. El banco
de semillas del suelo es la reserva de simientes que se encuentra enterrada en los suelos
agrcolas y constituye la nica fuente de reposicin de las especies anuales, que son
aquellas que se reproducen nicamente por
semillas. Las especies perennes presentan en
el banco, adems de semillas, propgulos
vegetativos (tubrculos, rizomas, estolones,
bulbos) que originan plantas genticamente
idnticas a las plantas madres. La eficiencia
reproductiva a travs de la va sexual (semillas) permite la formacin de nuevos
genotipos capaces de colonizar y dominar
nuevos ambientes. Por otro lado, la va
asexual (propgulos vegetativos) les permite
perpetuarse en los ambientes ya colonizados.
Los principales inconvenientes ocasionados por las malezas a los agricultores, que se
traducen generalmente en un perjuicio econmico, son los siguientes:
- Compiten con los cultivos por nutrientes,
agua y luz, disminuyendo el rendimiento de
los productos cosechados (granos, tubrculos, frutos, etc.).
- Interfieren en las labores de cosecha y
disminuyen la calidad de los productos cosechados.
- Causan toxicidad directa al ganado y disminuyen la calidad de las pasturas.
- Interfieren con el manejo del agua en
sistemas de agricultura bajo riego.
- Actan como huspedes de insectos,
enfermedades y otras plagas de la agricultura.
343
- Liberan sustancias alelopticas, que afectan el normal desarrollo de los cultivos.

El problema no es menor. Debemos por
ejemplo considerar que algunas malezas disminuyen el valor de la tierra, ya que limitan
la posibilidad de producir determinados cultivos. Por ejemplo, la abundancia de malezas invasoras perennes como el gramn
(Cynodon dactylon) o el sorgo de alepo
(Sorghum halepense) reducen el valor de los
campos en la provincia de Buenos Aires, ya
que es necesario implementar un intenso y
costoso programa de control si se deseara
implantar la mayora de los cultivos
primavero-estivales, producidos normalmente en esa zona. Otro ejemplo lo constituye
la zona bajo riego del valle inferior del Ro
Negro, en la cual algunas chacras no son cultivadas cuando existe la presencia en abundancia de Centaurea repens, una maleza
perenne de muy difcil erradicacin y que impide la produccin rentable de cultivos
hortcolas. El problema lo podramos cuantificar indicando que es mayor la inversin que
realizan los agricultores para controlar dichas
malezas (labores mecnicas, aplicaciones de
herbicidas) que la que realizan para controlar otras plagas como insectos, hongos,
nematodos, etc. As, por ejemplo, se ha calculado que cerca del 50% del mercado mundial de plaguicidas corresponde a herbicidas.
2 Estrategias en el manejo de las malezas
Desde que el hombre comenz a cultivar
vegetales necesit extirpar las plantas no
deseadas que crecan junto a ellos, de forma
tal que el manejo y control de malezas es
tan antiguo como el desarrollo mismo de la
agricultura. Por miles de aos el control manual y el uso de cultivadores arrastrados por
animales constituyeron la principal prctica
disponible para solucionar el problema de las
malezas. Posteriormente, el control mecnico sustituy dichas prcticas hasta que a
mediados del siglo XX, comenz a generalizarse el uso de compuestos qumicos (herbicidas) para el control de malezas.
El manejo de las especies consideradas
maleza puede ser enfocado a travs de diferentes estrategias. Todo programa de control deber inexorablemente responder con
344
tcticas de manejo en concordancia con los

ciclos de vida, tasa de crecimiento y otros
atributos de las malezas. El enfoque tctico
es diferente si se trata de malezas de ciclo
anual o perenne. Como regla general, se
puede aseverar que las especies anuales son
vulnerables a los mtodos de control en los
estadios de plntula y vegetativo, aunque
cierto grado de xito tambin pueda
alcanzarse en el estadio de floracin. Las
malezas perennes, que cuentan con sistemas
de propagacin vegetativa, requieren de un
programa a largo plazo que combine diferentes medidas de control previo y durante el
desarrollo del cultivo.
Existen cuatro estrategias bsicas de control relacionadas con la problemtica de las
malezas:
a) El control cultural involucra todas las
medidas tendientes a generar condiciones
favorables o ventajas competitivas que beneficien al cultivo frente a las malezas. As, la
siembra de un cultivo con semillas de adecuada sanidad, valor cultural y vigor, puede
generar condiciones para el rpido establecimiento y desarrollo del cultivo en relacin con
las malezas.
b) Los controles manual y mecnico implican la remocin de las malezas emergidas
directamente por el hombre o mediante la
utilizacin de diferentes implementos como
cultivadores, escarificadores, rastras, arados,
etc. La topografa y el tipo de suelo, la profundidad de la napa fretica, el tipo de maleza y el estadio fenolgico del cultivo son
factores determinantes de su factibilidad de
implementacin. Es una de las prcticas de
control ms utilizada debido fundamentalmente a su practicidad.
c) El control biolgico de malezas consiste en la utilizacin de organismos, agentes biolgicos o enemigos naturales que se
encuentran en el ambiente y que a travs de
su interaccin (parasitismo, predacin o
herbivora, accin patognica, alelopata)
afectan negativamente el desarrollo de una
poblacin de malezas. Esta tctica de control representa la mxima aspiracin en el
manejo de malezas, fundamentalmente en
trminos ecolgicos y de preservacin del
ambiente. Una condicin necesaria en el control biolgico es la especificidad que debe
SABBATINI, M.R.; IRIGOYEN, J.H. y M.N. VERNAV
tener el agente controlador, para evitar que

afecte a los cultivos o la flora natural. De esta
forma, su operatividad potencial se ve restringida debido a la diversidad de la flora de
malezas generalmente presente. Adems, el
aislamiento y comercializacin de organismos
de control biolgico especficos frente a un
amplio espectro de malezas determina que
esta tctica se adapte, en mayor medida, a
situaciones donde una especie de maleza
constituye el problema dominante. Un ejemplo en desarrollo en nuestro pas es el del
control de yuyo esqueleto (Chondrilla
juncea) en la zona del sudoeste de la provincia de Buenos Aires, mediante la liberacin
del caro extico (Eriophyes chondrillae) que
forma agallas en los tallos de la maleza reduciendo su produccin de flores y semillas.
d) El control qumico constituye en la
actualidad la estrategia ms difundida en el
manejo de malezas. Las principales ventajas
son su rpida accin, su versatilidad y adaptacin a diferentes equipos de aplicacin y
sistemas de cultivo y su potencialidad de aplicacin en grandes extensiones. Como contrapartida, pueden contaminar suelos,
acuferos y alimentos, afectar organismos
benficos, disminuir la biodiversidad, causar
cambios en las comunidades de malezas, conduciendo al reemplazo de malezas susceptibles por tolerantes y, adems, desencadenar
problemas de resistencia, como se ver ms
adelante.
3 Caractersticas de los herbicidas y su
modo de accin
Los herbicidas son sustancias qumicas
que ocasionan la muerte de plantas o que
inhiben su normal crecimiento. As, existen
herbicidas selectivos o especficos, que permiten controlar malezas sin afectar a los cultivos y herbicidas no selectivos o de accin
total, que se utilizan generalmente en los
barbechos, previo a la implantacin del cultivo. Reemplazan las tareas de labranza tradicional y constituyen la herramienta fundamental de manejo en los cultivos resistentes
a herbicidas.
La selectividad es la propiedad que presentan algunos herbicidas de ejercer su accin fitotxica sobre algunas especies vegetales (malezas) pero sin afectar a otras plan-
tas (cultivos). As, por ejemplo, el 2,4-D (cido 2,4-dicloro-fenoxi-actico) es un herbicida

selectivo para cultivos de cereales o gramneas
en general (trigo, avena, maz, etc.), ya que
controla malezas de hoja ancha o latifoliadas.
Sin embargo, el carcter de selectividad generalmente se restringe a determinados estadios fenolgicos dentro del ciclo de desarrollo del cultivo y a una dosis determinada
del herbicida. Efectivamente, el 2,4-D pierde
su selectividad en el cultivo de trigo cuando
se lo aplica fuera del estadio de macollaje del
cultivo (perodo en que emite tallos secundarios) y tambin cuando se aplica en dosis
superiores a las recomendadas.
El herbicida puede ser pulverizado en cobertura total o en forma parcial (sobre las
bandas del cultivo) por lo que se adapta a
diferentes tecnologas de aplicacin. A su vez,
los mismos pueden ser aplicados sobre la
canopia de malezas emergidas denominndose herbicidas postemergentes, o pueden
ejercer su accin desde el suelo, denominndose entonces preemergentes. Una de las
propiedades ms relevantes de algunos herbicidas llamados sistmicos lo constituye su
capacidad de transportarse dentro de los sistemas de conduccin de las plantas hasta
alcanzar el sitio o blanco de accin biolgica.
Existen algunos herbicidas postemergentes
cuya movilidad es reducida o nula, ejerciendo su accin solamente en las reas que alcanza cuando es pulverizado. Estos herbicidas se denominan de contacto. Un ejemplo
lo constituye el paraquat, herbicida
desecante de contacto que ejerce su accin
slo sobre el sistema areo de la planta, sin
afectar el sistema subterrneo del vegetal.
Para que un herbicida sea efectivo debe
tomar contacto con la maleza, ser absorbido, transportarse hacia el sitio de accin sin
ser desactivado y alcanzar niveles txicos en
el sitio de accin biolgica. Se puede definir
como modo de accin de un herbicida a la
secuencia de eventos que ocurren en la planta desde que la sustancia herbicida es absorbida hasta la ocurrencia de la muerte del vegetal. Asimismo, se define como mecanismo
de accin a la interferencia bioqumica o
biofsica primaria impuesta por la presencia
de molculas del herbicida que conduce al
efecto letal en el vegetal. Algunas plantas son
capaces de desactivar o degradar rpidamen-
345
te a un determinado herbicida, logrando sobrevivir a su efecto txico. El maz, por ejemplo, es tolerante a los herbicidas de la familia
de las triazinas debido a que puede conjugar
o enlazar dichas sustancias txicas con compuestos qumicos naturales dentro de la planta de maz.
Existe un gran nmero de herbicidas en
el mercado. En la Argentina, actualmente se
comercializan aproximadamente 100 ingredientes activos, agrupados en familias de
herbicidas, que a su vez pueden asociarse de
acuerdo con su mecanismo de accin (Tabla
1).
Una de las vas de desarrollo del control
qumico es el continuo mejoramiento de
tcnicas de aplicacin de los herbicidas. As,
para que una sustancia alcance su mxima
potencialidad biolgica debe garantizarse su
traslado desde el equipo aplicador hasta el
sitio de accin en el vegetal, donde ejercer
su efecto letal. Para ello se han diseado
equipos de aplicacin muy precisos y la industria qumica ha perfeccionado la formulacin
de los principios activos con el agregado de
distintos vehculos, coadyuvantes, diluyentes,
etc., que los acondicionan para su mejor desempeo biolgico.
En los ltimos aos, debe destacarse el
importante avance en el uso de protectores
de herbicidas, mal denominados antdotos.
Un protector de herbicidas es un compuesto que protege a las plantas de un cultivo de
los daos de una sustancia herbicida dirigida
al control de malezas. Estos compuestos protectores actan nicamente sobre el cultivo,
reduciendo la habilidad de las sustancias herbicidas para alcanzar o interferir el sitio de
accin donde actan. En la actualidad existe
ms de una decena de protectores disponibles para uso comercial en cultivos de maz,
trigo, arroz, sorgo y otros cereales. El alcance
de estos protectores ha permitido que herbicidas de accin especfica sobre malezas de
la familia de las gramneas puedan ser utilizados selectivamente en cultivos de gramneas,
como por ejemplo el trigo o el maz. El desarrollo de esta tecnologa se inici con la aparicin del NA (1,8-naftalen-anhdrico),
patentado en 1971, para uso en tratamientos de semillas de maz con el objeto de protegerlo de los daos ocasionados por los
herbicidas tiocarbamatos y actualmente se
346
encuentran registrados protectores para un

gran nmero de herbicidas disponibles en el
mercado.
4 Resistencia de las malezas a los
herbicidas
El desarrollo de resistencia a herbicidas en
malezas es un proceso evolutivo. Se define
como resistencia a herbicidas a la habilidad
hereditaria de una poblacin de malezas de
sobrevivir y reproducirse luego de ser expuesta a una dosis de herbicida a la cual era originalmente susceptible. La resistencia de malezas a herbicidas es un proceso por el cual, a
travs de una alta intensidad de seleccin,
escasos biotipos resistentes -presentes en
una poblacin susceptible- se vuelven mayoritarios, convirtindose la poblacin en resistente. Se asume que la existencia o no de
resistencia en una maleza se limita a la dosis agronmica, o sea la dosis normalmente
utilizada a campo para el control de malezas. Algunas plantas (ya sean cultivadas o
malezas) son naturalmente resistentes a
algunos herbicidas aplicados en la dosis
agronmica, caracterstica denominada tolerancia a herbicidas. Lo anterior implica que
no hubo seleccin o manipulacin gentica
para hacer tolerante a la especie.
El reiterado uso de herbicidas en un mismo predio hace que la presin de seleccin
acte como un filtro que elimina a las plantas susceptibles, dejando que sobrevivan slo
las resistentes. Se dice que existe resistencia
cruzada cuando un biotipo ha desarrollado
uno o varios mecanismos de resistencia a un
herbicida que le permite ser tambin resistente a otros herbicidas. Este fenmeno se
observa frecuentemente con herbicidas que
pertenecen a una misma familia y que pueden tener o no el mismo sitio de accin. Para
ejemplificar lo anterior, se dara resistencia
cruzada cuando luego de un intenso empleo
del herbicida A en un lote se encuentra que
los biotipos resistentes a este herbicida lo son
tambin a un herbicida B, que nunca haba
sido aplicado antes. La resistencia mltiple
se refiere a biotipos que evolutivamente han
desarrollado resistencia a varios herbicidas
por procesos diferentes de seleccin. Por
ejemplo, un biotipo que desarroll resistencia a un herbicida A es tratado con un her-
Tabla 1. Mecanismo y sitio de accin de las principales familias de herbicidas, frecuentemente utilizadas en el
control de malezas en la Repblica Argentina y su riesgo potencial de ocasionar resistencia en las especies de
malezas controladas.
bicida B, hacia el cual es inicialmente susceptible; luego de un tiempo de intenso uso del
herbicida B la poblacin se torna resistente
a ste, por lo cual ahora es resistente a ambos herbicidas.
Los mecanismos ms comunes de resistencia son:
(i) Modificaciones en los sitios de accin,
o sea en los sitios bioqumicos dentro de la

planta con los cuales el herbicida interacta
directamente. Cuando el herbicida acta sobre un solo sitio de accin, este tipo de mecanismo normalmente deriva en una resistencia completa, es decir que el biotipo resistente no manifestar ningn sntoma como consecuencia de la aplicacin del herbicida.
347
(ii) Cambios en el metabolismo de los

herbicidas, referido al proceso bioqumico
dentro de la planta que generalmente modifica los herbicidas hacia compuestos menos
txicos. Diferencias en la tasa de
metabolizacin de herbicidas entre malezas
y cultivos es la causa principal de selectividad
de los cultivos. En este caso, generalmente
la resistencia es parcial (no completa), conduciendo a un control poco efectivo del
biotipo resistente.
La resistencia de insectos a insecticidas es
un hecho ampliamente documentado desde mediados del siglo XX, pero la de malezas a herbicidas fue considerada hasta principios de los 90 ms como una curiosidad que
un problema que afecte la produccin agrcola. Sin embargo, la aparicin en el mercado agropecuario, entre 1980 y 1990, de herbicidas que actan en un nico sitio de accin, condujo a que la resistencia de malezas
a herbicidas sea actualmente el tema de
mayor inters en el manejo de malezas en
todo el mundo. Se han identificado aproximadamente 260 biotipos de malezas resistentes a herbicidas, que incluyen 160 especies diferentes. El pas con mayores casos registrados es Estados Unidos, seguido por
Australia y Canad. En la Argentina no se ha
informado acerca de regiones severamente
afectadas con poblaciones de malezas resistentes, aunque en el centro y norte del pas
se han aislado biotipos de la maleza
Amaranthus quitensis (yuyo colorado), resistentes a herbicidas de la familia de las
imidazolinonas.
La Tabla 1 indica con cules familias de
herbicidas existe un riesgo alto, mediano o
bajo de desarrollar poblaciones de malezas
resistentes. Las familias que en la actualidad
ocasionan mayores perjuicios en la agricultura son aquellas cuyo modo de accin se basa
en la inhibicin de la enzima ALS
(acetolactato sintetasa) y ACCasa (acetil
coenzima A carboxilasa), que afectan en las
plantas la biosntesis de aminocidos y de
lpidos, respectivamente. Varios herbicidas
incluidos en dichas familias son intensamente utilizados en la actualidad en la Argentina, por lo que la resistencia representa una
amenaza para los agricultores en el corto plazo, especialmente en cultivos extensivos
como trigo, soja, girasol y maz.
348
El grupo de los herbicidas que presentan

un riesgo mediano a adquirir resistencia incluye algunos productos muy utilizados en
nuestro pas, como por ejemplo atrazina,
trifluralina y paraquat. Entre los que tienen
bajo riesgo a adquirir resistencia se incluye el
glifosato, herbicida intensamente utilizado en
los planos tanto nacional como internacional. El desarrollo de cultivos resistentes a herbicidas (CRH) se ha basado principalmente
en el uso de este herbicida, ya que permite
controlar un amplio espectro de malezas, es
de bajo costo y reducido impacto ambiental.
Entre los factores que conducen a acelerar el proceso de resistencia se encuentran:
a) Frecuencia inicial de mutaciones en
el pool gnico: las mutaciones siempre ocurren, se usen o no herbicidas, siendo letales
la mayora de los genes mutantes. Los que
no son letales se encuentran en bajas frecuencias porque son competidores dbiles
frente a los tipos salvajes, dominantes. La
frecuencia de los genes que confieren a la
planta resistencia a varios herbicidas es variable en la naturaleza. Por ejemplo, los alelos
que confieren resistencia a los herbicidas con
sitio de accin en la enzima ALS (caso de las
sulfonilureas, por ejemplo) aparecen con una
frecuencia de uno en un milln, se heredan a
travs del ncleo y se comportan
fenotpicamente como dominantes en la
mayora de las dosis de aplicacin del herbicida. Contrariamente, las mutaciones que confieren resistencia al afectar la protena D1
quinona del fotosistema II (por ejemplo las
triazinas) se heredan recesivamente y ocurren
en el genoma de los cloroplastos. Debido a
que las mutaciones en los cloroplastos ocurren a frecuencias muy inferiores a las nucleares, la resistencia a ALS evoluciona ms rpidamente que la resistencia a la protena D1
quinona. As, mientras que las malezas resistentes a sulfonilureas se hacen evidentes a
campo en un perodo medio de tres a cinco
aos, las resistentes a triazinas lo hacen entre 7 a 10 aos, y como consecuencia de un
uso continuo y a gran escala de herbicidas
de dicha familia.
b) Presin de seleccin: cuanto mayor
sea el efecto letal del herbicida sobre el
biotipo susceptible y mayor la supervivencia

de los biotipos resistentes, ms rpido ser
el proceso. Adems, la presin de seleccin
ser mxima con herbicidas persistentes, con
larga accin residual en el suelo. Cuanto mayor sea el xito reproductivo del biotipo resistente, mayor ser su potencial para dominar en la poblacin. Asimismo, el tamao del
banco de semillas ser crucial para retardar
la aparicin de resistencia al diluir las semillas resistentes entre las semillas producidas
por las plantas susceptibles.
c) Adaptacin del biotipo resistente: si
bien en ausencia del herbicida los individuos
resistentes poseen en general una capacidad
adaptativa menor que los individuos susceptibles, existe una notable variacin de acuerdo con el herbicida. Retomando el ejemplo
anterior, los biotipos resistentes a las triazinas
se adaptan bastante menos al ambiente que
los biotipos susceptibles, lo que implica una
rpida vuelta a la situacin previa (es decir,
mayora de biotipos susceptibles en la poblacin) una vez que el herbicida deja de aplicarse. Contrariamente, las diferencias de
adaptacin entre biotipos resistentes y susceptibles a las sulfonilureas son mnimas, lo
que implica un problema mucho ms prolongado en los cultivos enmalezados.
Si bien en estos ltimos aos se ha acrecentado la importancia de la resistencia
monognica, derivada de herbicidas que actan en un solo sitio de accin, existen casos
recientes de malezas que han desarrollado
resistencia multignica. En este ltimo caso
la resistencia se desarrolla como consecuencia de muchas y diferentes mutaciones en los
alelos, cuya acumulacin en la poblacin por
repetida seleccin confiere cada vez mayores niveles de resistencia, especialmente cuando la dosis es gradualmente incrementada.
Este tipo de resistencia se ha encontrado
recientemente en Lolium rigidum en Australia al aplicarse en forma reiterada el herbicida diclofop-metil y se produce como consecuencia del mal uso del herbicida (bajas dosis, herbicidas adulterados, baja calidad en
las aplicaciones, etc.).
De lo expuesto se desprende que el tema
de la resistencia de las malezas a los herbicidas es realmente complejo y si bien la resis-
tencia puede ser demorada, su desarrollo es

prcticamente inevitable.
Como estrategia general para demorar la
aparicin de resistencia podra recomendarse el empleo de los herbicidas en las situaciones en las que sea estrictamente necesario,
la combinacin en lo posible del control qumico con mtodos mecnicos y/o biolgicos
de control de malezas, la rotacin y mezcla
de herbicidas con diferentes sitios de accin
y la rotacin de cultivos de verano e invierno, que permitirn ampliar el espectro de
malezas controladas y las medidas de control utilizadas.
5 La biotecnologa y su insercin en el
manejo de malezas
Las malezas han ido adaptndose a los
cambios impuestos por el hombre desde los
inicios de la agricultura, constituyndose en
un claro ejemplo de la teora Darwiniana de
la seleccin natural. La reciente introduccin
del sistema de siembra directa en la pampa
hmeda de la Argentina es un buen ejemplo
de cmo modificaciones introducidas en el
ambiente se traducen en cambios en la comunidad de malezas.
La siembra directa es un tipo de labranza conservacionista que acumula residuos de
cosecha en superficie e implica una menor
remocin del suelo que el sistema de labranza convencional. Como consecuencia, en
pocos aos se han producido cambios importantes en predios cultivados con soja, como
por ejemplo un aumento en las poblaciones
de malezas gramneas anuales en detrimento de las latifoliadas y una notable disminucin de la riqueza florstica natural.
La evolucin de las malezas dentro de
los hbitat creados por el hombre fue lograda por diferentes vas: a partir de formas silvestres colonizadoras que se adaptaron al
disturbio continuo del ambiente debido a las
actividades del hombre; como consecuencia
de la hibridacin natural entre formas silvestres y cultivadas; y, aunque menos frecuente, a partir de cultivos que se convirtieron en
malezas. De esta forma, actualmente muchas
especies de malezas presentan morfologa
muy similar a la de los cultivos, mimetizndose
con ellos de tal manera que en muchas ocasiones plantas cultivadas y malezas presen-
349
tan los mismos requerimientos fisiolgicos y

nutricionales. Un ejemplo lo constituye la
colza cultivada (Brassica napus), que crece
junto a malezas del mismo gnero, como por
ejemplo Brassica campestris. Esto implica un
riesgo potencial por la posible hibridacin
entre ambas. Sin embargo, muchas malezas
consideradas como altamente nocivas no
son necesariamente las ms exitosas desde
el punto de vista evolutivo. Su carcter nocivo est asociado a una dificultad para su
manejo o control y a una fuerte tendencia a
deprimir el crecimiento y la produccin de los
cultivos.
El flujo gnico, en sus variadas formas,
ha sido clave en la evolucin de las malezas.
El accionar del hombre ha acelerado este proceso de transferencia gentica, principalmente como consecuencia de la aproximacin de
especies distantes geogrficamente y de las
modificaciones producidas en el hbitat, que
determinaron la creacin de nuevos nichos
para la sobrevivencia, persistencia y diseminacin de nuevos genotipos, productos de
hibridacin.
El desarrollo de cultivos resistentes a
herbicidas (CRH) es otra de las vas que contribuy en el avance del control qumico de
las malezas, debido a que ha generado una
nueva estrategia de manejo. Un CRH es una
variedad o biotipo de un cultivo que es resistente a la accin de un herbicida que normalmente resulta letal para las variedades
tradicionales del mismo cultivo.
La obtencin de CRH ha sido lograda a
travs de procesos de seleccin o a travs
de la insercin de genes en el genoma del
vegetal que le confieren la propiedad de alterar o bloquear el sitio de accin donde acta el herbicida. Cultivos resistentes obtenidos por las dos vas mencionadas se emplean
comercialmente en la Argentina.
Un ejemplo del primer proceso es la obtencin de CRH de la familia de las
imidazolinonas como el girasol Clearfield,
resistente al herbicida imazapir (Clearsol).
La seleccin de esta variedad se produjo en
Kansas, Estados Unidos, donde los girasoles
con tolerancia al herbicida fueron descubiertos bajo condiciones naturales del cultivo.
El segundo proceso implica la obtencin
de organismos genticamente modificados, en este caso particular, cultivos trans-
350
Figura 1: Soja RR(surcos a derecha e izquierda) y

convencional (surco central) en ensayos de eficacia de
aplicacin de herbicida a base de glifosato.
gnicos. Un ejemplo lo constituye la obtencin de resistencia al glifosato por la transferencia de un gen, que codifica para un producto que inhibe la actividad de la enzima
EPSP sintetasa (Tabla 1), desde una especie
de Agrobacterium al genoma de la soja.
Este proceso de transferencia gnica dio
como resultado la obtencin de la denominada soja RR (soja Roundup Ready) resistente a la accin herbicida del glifosato (Fig.
1). Posteriormente, dicho gen tambin fue
introducido en el maz, generando el hbrido
de maz RR (maz Roundup Ready), tambin resistente a glifosato. En este cultivo se
ha obtenido tambin la variedad Liberty
Link, resistente a glufosinato de amonio,
herbicida no selectivo conocido comercialmente como Liberty. En este ltimo ejemplo, el gen incorporado codifica una enzima
(fosfinotricin-N-acetil transferasa) que es la
responsable de convertir al glufosinato en un
metabolito inocuo para maz.
El desarrollo de CRH ha generado un impacto econmico y biolgico de magnitud
sobre la produccin agrcola, pudindose
destacar los siguientes beneficios:

- Amplan el espectro de malezas controladas, ya que se utilizan herbicidas no selectivos, como glifosato y glufosinato de amonio,
que permiten el control de un extenso espectro de malezas, tanto anuales como perennes.
- Reducen los daos al cultivo, dada su
alta tolerancia a estos herbicidas y al no uso
de otros herbicidas normalmente utilizados
en cultivos no resistentes, que pueden ocasionar fitotoxicidad.
- Un menor costo, debido al bajo precio
de los herbicidas empleados y a la reduccin
en el nmero de labores culturales y mecnicas, previas o durante el ciclo de crecimiento
del cultivo.
- Los herbicidas utilizados tienen baja
residualidad en suelos y aguas, por lo que
presentan escasas restricciones para la rotacin de cultivos, y adems baja toxicidad para
el hombre y animales.
- Las malezas controladas tienen bajo riesgo de adquirir resistencia, ya que tanto el
glifosato como el glufosinato de amonio evitan el empleo de otros herbicidas de alto riesgo, como por ejemplo los inhibidores de ALS
(Tabla 1).
- Simplifican y flexibilizan el manejo del
cultivo. La tecnologa asociada a los CRH no
requiere de un entrenamiento especial por
parte del productor y asimismo facilitan algunas de las prcticas relacionadas con el cultivo. Un ejemplo de ello es la prolongacin
del perodo crtico para la aplicacin del herbicida en comparacin al de los herbicidas
selectivos frecuentemente empleados en cultivos no resistentes, en el que dicho perodo
suele ser muy limitado.
Una prueba de las ventajas de esta tcnica la constituye el hecho de que el 92% de la
totalidad de soja cultivada en la Argentina
corresponde a soja RR. El uso de este cultivo
resistente permite realizar tres o cuatro aplicaciones por ao del herbicida, lo cual elimina casi por completo la competencia de las
malezas.
No obstante, existen riesgos o amenazas
potenciales que es importante considerar en
el momento de decidir acerca del uso de los
CRH, ellos son:
- La aparicin de especies de malezas resistentes como consecuencia del uso conti-
nuo y repetido de un mismo herbicida, as

como cambios en las poblaciones de malezas por el incremento de especies naturalmente tolerantes al herbicida. Si bien tanto
el glifosato como el glufosinato de amonio
tienen bajo riesgo de seleccionar biotipos de
malezas resistentes (Tabla 1), existen casos
probados en el mundo de la aparicin de
resistencia. Asimismo, las especies naturalmente tolerantes encuentran nuevos nichos
para su crecimiento y desarrollo y por lo tanto incrementan su frecuencia y abundancia.
Un ejemplo de esto ltimo lo constituye la
maleza iresine (Iresine difusa) informada
por el INTA Oliveros como tolerante a
glifosato y que surge como un nuevo problema en esta zona.
- El uso de CRH y de los herbicidas asociados a ellos implica un impacto significativo
sobre la composicin florstica de las malezas, ya que disminuyen la diversidad gentica
de la comunidad (erosin gentica).
- La aparicin de las denominadas
supermalezas por la transferencia de los
genes de resistencia desde los CRH a sus especies salvajes emparentadas a travs del
polen. El fenmeno de hibridacin, por polinizacin cruzada, no es raro en la naturaleza
y la probabilidad resulta mayor para las especies emparentadas. Ejemplos de cultivos
considerados con riesgo de hibridarse con
malezas cercanas son: el sorgo cultivado
(Sorghum saccharatum) con la maleza sorgo de alepo (Sorghum halepense) y el girasol (Helianthus annus) con el girasol silvestre (Helianthus petiolaris). Aqu es importante destacar que la transferencia horizontal de genes entre organismos taxonmicamente muy distantes es poco frecuente en
la naturaleza pero muy relevante en trminos evolutivos. La produccin de plantas
transgnicas acelera en ciertos aspectos la
evolucin de las malezas, ya que la hibridacin representa un riesgo potencial de transferencia de la resistencia a herbicidas desde
el cultivo hacia la maleza.
La aparicin de CRH voluntarios en un
predio donde no fueron sembrados y que,
por lo tanto, se comportan como una maleza. El problema grave radica en su resistencia
al herbicida empleado para el control.
- Reduccin en el rendimiento (5 - 10 %)
de algunas variedades o hbridos de CRH
351
como consecuencia fundamentalmente de la

adicin de genes extraos. Esto ha sido informado en algunos casos puntuales.
- La contaminacin de cultivos por flujo
gnico, especialmente los orgnicos, que se
encuentran en predios aledaos mediante
la polinizacin cruzada desde los cultivos
transgnicos a los no transgnicos.
- Riesgos ambientales por la persistencia
de algunos de los herbicidas utilizados, como
por ejemplo los pertenecientes a la familia
de las imidazolinonas, que pueden acumularse en el ambiente y afectar la productividad y sustentabilidad del sistema agrcola.
- Riesgo de reduccin en la exportacin
de productos de origen transgnico como
consecuencia del sentimiento antibiotecnologa que existe en los consumidores de varios pases de Europa. Hasta el momento, Argentina no ha tenido ninguna dificultad de acceso a los mercados de destino
para sus exportaciones de soja transgnica y
a pesar de las percepciones negativas de algunos consumidores, los diferenciales de precios entre la soja convencional y transgnica
en el mercado mundial no penalizan a esta
ltima, por lo que no es sorprendente que
prcticamente toda la soja cultivada en el pas
sea transgnica.
Si consideramos los principales cultivos
transgnicos en el mundo encontramos que
en la actualidad la soja transgnica resistente a herbicidas es el mayoritario en 7 pases
(Estados Unidos, Argentina, Canad, Mxico, Rumania, Uruguay y Sudfrica), ocupando una superficie de 41,4 millones de has en
el mundo, lo que representa el 61 % del rea
total ocupada por cultivos transgnicos que
comprende 67,7 millones de has. Le sigue el
maz Bt con 12,3 millones de has (13 % del
rea total). El tercer cultivo de mayor importancia es la canola tolerante a herbicidas, con
3,6 millones de has (5 % del rea total) y se
siembra en dos pases, Canad y Estados
Unidos. Otros tres cultivos ocupan, cada uno,
un 5 % de la superficie total y son maz tolerante a herbicidas e insectos (3,2 millones de
has), maz tolerante a herbicidas (3,2 millones de has) y algodn Bt (3,1 millones de has).
El algodn, tolerante a herbicidas e insectos,
ocupa 2,6 millones de has (4%) y el algodn
tolerante a herbicidas 1,5 milln (2%).
352
6 Manejo Integrado de Malezas: nica

solucin sustentable
Debido a que las malezas continuarn
adaptndose a las diferentes metodologas
de control, los agricultores siempre necesitarn de nuevas tcticas y estrategias. La
biotecnologa ha realizado un valioso aporte
al suministrar nuevas herramientas para el
control de malezas, siendo los CRH la ms
importante. Sin embargo, sera un grave error
suponer que esta tcnica permitir anular el
problema de las malezas en el futuro, ya que
debemos enfatizar que todas estas tcnicas
son slo herramientas de las que puede valerse el hombre en su afn y esfuerzo para
controlar las malezas y que no existe una
nica y fcil solucin.
Un programa de Manejo Integrado de
Malezas es un sistema de manejo que enfoca el problema de las malezas de una manera compatible con la preservacin de la calidad del ambiente, utilizando todas las tcticas y estrategias de control (tcnicas adecuadas y conocimientos existentes) con el objeto de reducir una poblacin de plantas indeseables a niveles tales que los perjuicios econmicos producidos se hallen por debajo de
un umbral econmico aceptable para el sistema general de produccin.
Este programa puede involucrar, en muchos casos, mtodos de control fsicos, qumicos, mecnicos, genticos y biolgicos juntamente con medidas preventivas y estudios
bsicos sobre la biologa y ecologa de malezas. Es un sistema interdisciplinario, ya que
no consiste simplemente en la aplicacin de
una o dos medidas de control sino que abarca estrategias de control provenientes de
varias disciplinas as como tambin involucra
el entrenamiento de tcnicos y la extensin
a los productores.
Tanto la teora ecolgica como la experiencia prctica acumulada durante ms de
50 aos de intentar disminuir los daos ocasionados por las plagas indican que una nica herramienta de control (por ejemplo los
CRH) es una solucin slo temporal para el
problema de las malezas. Un manejo integrado de malezas, en el que mltiples estrategias son implementadas de una manera
racional, es la nica solucin en el marco de
un manejo sustentable del sistema productivo.
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353
VIII.-Captulo 12
Outlook to 2005: an impending crisis predice que si la crisis del agua contina, cabra
esperar para el 2025 una reduccin de 350
Tolerancia a factores abiticos
millones de toneladas mtricas en la produccin de granos, lo cual representa un poco
Puebla, Andrea F.; Del Viso, Florencia
ms de la produccin actual de Estados Unidos. Como resultado, el precio del arroz
incrementara en un 40%, el del trigo en un
1 Introduccin
80% y el del maz en un 120 % si se considera
la demanda actual. Dado que la agricultura
La radiacin, la temperatura, el agua y los consume el 70 % de toda el agua utilizada
nutrientes son factores del medio ambiente por el hombre, resulta obvio que la mejor
que afectan el crecimiento y el desarrollo de forma de ahorrar agua es a travs de la
las especies vegetales. La distribucin de las implementacin de prcticas agrcolas que
plantas sobre la tierra depende, por lo tan- tiendan a reducir el consumo. Una forma es
to, de la existencia e intensidad de estos fac- la reduccin del riego mediante la creacin
tores. Para alimentar a una poblacin futura de plantas resistentes a sequa, otra es la disde 8 billones de habitantes con las prcticas minucin en el uso de insecticidas mediante
agrcolas actuales se requerira de un incre- la utilizacin de estrategias de control biolmento del 12 % en la cantidad de tierras cul- gico contra insectos (ver VIII.10) y plantas
tivables (Fig. 1), lo cual ser imposible dada tolerantes a herbicidas (ver VIII.11). Estas dos
ltimas estrategias tambin reducen el riesla densidad demogrfica esperada.
go de contaminacin de las fuentes
de agua potable disponibles
Levitt (1980) define a los estreses
ambientales como cambios en las
condiciones del medio que reducen
o cambian desfavorablemente el crecimiento o desarrollo de las plantas.
Los estreses ambientales provocan en las plantas respuestas complejas y constituyen un problema fundamental para la agricultura, ya que influyen sobre la supervivencia y la productividad de los cultivos. Estas respuestas se manifiestan a nivel celular, fisiolgico y del desarrollo (Levitt,
1980) y son caracteres de variacin
continua (cuantitativos), controlados por un importante nmero de
Fig. 1: La cantidad de tierra destinada a la agricultura, calculada en genes aditivos y probablemente
acres/persona ha ido disminuyendo paulativamente. Se estima que sinrgicos (Bohnert y col., 1995). Se
para alimentar a una poblacin futura de 8 billones de habitantes, ha visto, por ejemplo, en estudios
con las tecnologas actualmente en uso, se requerira de un citogenticos, que al menos diez de
incremento de un 12 % en la cantidad de tierra cultivables. Gentileza
los veintin pares cromosmicos en
Prof. Germn Spangenberg.
el trigo estn comprometidos en la
respuesta
a las bajas temperaturas (Sutka y
Por otro lado la agricultura es la principal
Vesz,
1988).
consumidora de agua en el mundo, uno de
Los genes inducidos bajo condiciones de
los recursos ms limitantes para el futuro. Las
estreses
abiticos, tales como las bajas temreservas de agua del planeta han ido dismiperaturas, la salinidad y la sequa, codifican
nuyendo a medida que los consumos han ido
protenas que tienen funciones de sealizaaumentado con el crecimiento de la humanicin, transduccin de seales y proteccin
dad y las prcticas agrcolas (Fig. 2). Un inforcelular, como por ejemplo, protenas constime reciente de IIPRI (2002) Global Water
tuyentes de canales de agua que alteran el
355
indica que los receptores con caractersticas de proten-kinasas y

las histidin-kinasas de dos componentes seran buenos candidatos
para cumplir la funcin de
sensores potenciales de estas seales de estrs (Xiong y Zhu,
2001).
Receptores tipo protenkinasas (RTK): se encuentran tanto en animales como en plantas
y estn estructuralmente compuestos por un dominio
extracelular, que funciona por
unin a un ligando o por
interaccin protena-protena, por
un dominio transmembrana y
por un dominio kinasa intraceFig. 2: Las reservas de agua del planeta son limitadas, siendo la
agricultura la principal consumidora de agua en el mundo. Los consumos lular. Las RTK de plantas son tamhan ido aumentado con el crecimiento de la humanidad y las prcticas bin responsables de respuestas
agrcolas. Gentileza Prof. Germn Spangengenberg.
a patgenos estando adems
involucradas en el desarrollo. Espotencial agua celular, enzimas requeridas tas kinasas deberan ser constitutivas, consipara la sntesis de sustancias protectoras derando las rpidas respuestas celulares
(azcares, prolina y betana), desaturasas (como las respuestas a inositol-P y Ca 2+) cuanlipdicas para modificar la composicin de las do las plantas son expuestas a un estrs
membranas celulares, protenas protectoras (Hong y col., 1997).
como las de tipo LEA (Late Embryogenesis
Sistema de dos componentes tipo
Abundant o protenas abundantes en la histidin-kinasas: en estos sistemas cuando el
embriognesis tarda), protenas anticonge- sensor extracelular percibe la seal, una
lantes, chaperonas, proteasas y enzimas histidina del dominio citoplasmtico se
detoxificantes como la catalasa y la ascorbato autofosforila y el residuo fosfato es pasado
peroxidasa.
a un aspartato aceptor, en una respuesta
regulatoria que se acopla a una cascada de2 Seales para la respuesta a estreses
pendiente de MAP kinasas (Mitogen
abiticos
activated), o por fosforilacin directa de blancos especficos que inician la respuesta celuLa hiptesis de sealizacin actual postular. Se ha demostrado que, en cianobacterias,
la que las seales ambientales son percibidas la fluidez de la membrana podra actuar como
primero por receptores especficos, que con el primer sensor para las bajas temperaturas
su activacin inician o suprimen una cascada y es el disparador de histidin-kinasas que mode transduccin de seales intracelulares dulan la expresin de genes de desaturasas
y, en muchos casos, activan factores de trans- (Murata y Los, 1997; Suzuki y col., 2000).
cripcin nucleares, que inducen la expresin
de grupos especficos de genes.
2.1 Segundos mensajeros
Una forma comn de seal de iniciacin
es la fosforilacin de protenas acoplada a
Numerosos estudios sugieren que el Ca2+
receptores. Aunque todava no se han de- forma parte de varios procesos de sealizaterminado con certeza en plantas ninguno cin intracelular (revisin de Sanders y col.,
de los receptores de respuesta al fro, sequa 1999; rvar y col., 200; Sangwan y col., 2001).
o de ABA (cido abscsico, la hormona rela- La concentracin intracelular de Ca2+ se encionada al estrs), el conocimiento reciente cuentra firmemente controlada: el Ca 2+
de una va de sealizacin de estrs salino citoslico se encuentra en bajas concentra-
356
PUEBLA, Andrea F.; DEL VISO, Florencia
ciones, aunque luego de la estimulacin se

libera de las reservas intracelulares o entra
en la clula a travs de varios canales. El Ca2+
extracelular puede entrar en la clula por
cambios de voltaje, operado por receptores,
o a travs de canales especficos. El Ca 2+
intracelular puede liberarse a travs de canales sensibles a mensajeros ligandos o a segundos mensajeros, entre los que se incluyen a los inositol polifosfatos y la ADP-ribosa
cclica (cADPR) (Fig. 3).
3 Induccin de genes en respuesta al
estrs
genes de respuesta temprana y genes de

respuesta tarda. Los primeros son inducidos
en pocos minutos y a menudo transitoriamente. Su induccin no requiere de sntesis
de nuevas protenas, ya que estos componentes de sealizacin seran constitutivos.
En contraste, los genes de respuestas tardas
son activados ms lentamente (en horas) y
su expresin es generalmente sostenida durante el tiempo en que el estrs se encuentra actuando. Los genes tempranos codifican
factores de transcripcin que activan a los
genes de respuesta tarda, que constituyen
la vasta mayora de los genes inducidos por
estrs (Figura 3).
Los genes inducidos por estrs incluyen
Figura 3: Vas principales de sealizacin en plantas en respuesta a estreses abiticos (Fro, Sequa y Salinidad).
La va I de sealizacin involucra la produccin de antioxidantes y osmolitos involucrando la transduccin de
seales a travs de MAP kinasas. La va II involucra la produccin de diferentes tipos de protenas (tipo LEA y otras)
y est mediada por CDPK. La va III involucra a la va SOS, especfica del estrs inico. No se detallan las molculas de
sealizacin o segundos mensajeros.
357
4 Genmica de la tolerancia a estreses

ambientales
Los recientes avances en el estudio
molecular y gentico de las respuestas a
estreses abiticos llevaron a la identificacin
de un gran nmero de loci cualitativos nicos, QTL, y genes relacionados con la tolerancia a estreses abiticos. Estos nuevos conocimientos posibilitarn modificar la forma
de seleccionar en el mejoramiento de cultivos importantes, desde una seleccin
fenotpica a una genotpica (a travs de seleccin asistida por marcadores), aumentando as las posibilidades de mejoras genticas
en los cultivos.
Como se mencion anteriormente, la
tolerancia a estreses ambientales no depende de un nico gen sino que es un carcter
polignico, de variacin continua. Recientemente se construyeron mapas que contienen
los determinantes que afectan la tolerancia
a estreses abiticos en las Triticeae (Cattivelli
y col., 2002). Se demostr que el grupo de
cromosomas 5 en trigo contiene la concentracin ms alta de loci que controlan la
adaptacin de la planta al ambiente, particularmente los relacionados con la tolerancia a las heladas y a la salinidad, mientras que
una regin del cromosoma 7 es crucial en la
tolerancia a la sequa (Cattivelli y col., 2002).
Se identific un locus en el cromosoma 5A
de trigo, Vrn-Fr1, que tiene un importante
efecto en la tolerancia a las heladas (Galiba y
col., 1995). Las variedades de invierno poseen
el alelo vrn1, y son ms tolerantes a las bajas
temperaturas que las variedades de primavera que poseen el alelo Vrn1. Tambin se
demostr que las diferencias en la tolerancia
a las bajas temperaturas encontradas entre
distintas variedades de invierno pueden ser
explicadas, en algunos casos, por las diferencias en este locus (Storlie y col., 1998). Actualmente se conocen dos genes, VRN1 y
VRN2 presentes en este intervalo, los cuales
estn directamente involucrados en la respuesta a la vernalizacin en el trigo diploide
(Triticum monoccocum) (Law y col., 1975;
Dubcovsky y col., 1998: Tranquilli y col., 2000).
En sorgo se construyeron varios mapas
de ligamiento utilizando RFLP y otros marcadores moleculares (Xu y col., 1994; Taramino
y col., 1997; Kong y col., 2000) y se identifica-
358
ron tambin varios QTLs con efectos significativos en la tolerancia a la sequa (Tunistra y
col., 1997).
Las nuevas tecnologas para el anlisis
genmico (microarreglos de ADN, gentica
directa y reversa) produjeron una revolucin
en el anlisis gentico de las especies y permitieron cambiar el enfoque en el anlisis,
yendo desde estudios de un solo gen a estudios que abarcan todo el genoma. Utilizando tanto macro como microarreglos de ADN
(Lin y col., 2003; Seki y col., 2001, 2002a,
2002b; Kawasaki y col., 2001; Oono y col.,
2003) se estudiaron genes inducidos o suprimidos en condiciones de estrs abitico (fro,
sequa, salinidad). La mayor parte de estos
estudios se realizaron en Arabidopsis debido al hecho, entre otros factores, de que su
genoma ha sido completamente secuenciado, facilitando as la construccin de los
microarreglos y el anlisis de las secuencias
obtenidas.
Los resultados de estos trabajos indicaran la existencia de una mayor interseccin
entre las vas de sealizacin de ABA, sequa
y salinidad, comparada con las vas en comn
entre ABA y fro (Seki y col., 2002b). A partir
de estos estudios tambin se identificaron
numerosos genes que son inducidos por uno
solo de los tratamientos, los cuales se clasificaron como especficos de cada respuesta.
Los resultados obtenidos hasta el momento permiten sugerir que la tecnologa de
microarreglos ser de mucha utilidad para el
aislamiento de nuevos genes, para el estudio de perfiles generales de expresin tejido-especfico ante distintas condiciones de
estrs abitico y tambin para la identificacin de genes y potenciales elementos en cis
de factores de transcripcin.
4.1 Tolerancia a las bajas temperaturas
Las especies vegetales adaptadas a regiones templadas del planeta varan durante
transcurso del ao en su habilidad para sobrevivir a las bajas temperaturas. Las plantas
capaces de aclimatarse al fro perciben las
bajas temperaturas sobre cero durante el
avance del invierno y disparan procesos
bioqumicos especficos que resultan en la
tolerancia, an, de temperaturas de
congelamiento (Thomashow, 1999).
La aclimatacin al fro est asociada a

la expresin de novo de genes, sntesis de
protenas y varios cambios fisiolgicos
(Guy, 1990). Los mecanismos que contribuyen a la tolerancia incluyen la prevencin de
la desnaturalizacin de protenas inducida
por bajas temperaturas, la prevencin de la
precipitacin de molculas y la atenuacin de
las consecuencias de la formacin de hielo
intercelular.
Muchos estudios indican que en las plantas los sistemas de membranas de la clula
son los primeros sitios daados por el
congelamiento (Levitt, 1980; Steponkus,
1984). Entre estos daos se incluyen la lisis
celular inducida por expansin, las transiciones de los lpidos de membrana (de laminares
a fase hexagonal II) y las lesiones por fracturas.
Los mecanismos involucrados en la estabilizacin de las membranas celulares en respuesta al fro son mltiples. Los ms importantes seran los cambios en la composicin
de lpidos, aunque tambin se ha observado
la acumulacin de solutos compatibles (molculas que pueden acumularse en la clula
sin modificar el metabolismo central) en clulas de plantas sometidas tanto a estrs por
fro como por sequa. La acumulacin de sacarosa y otros azcares, que tpicamente ocurre en plantas tolerantes durante la aclimatacin, parece contribuir a la estabilizacin de
las membranas. Estas molculas demostraron proteger in vitro a las membranas durante el congelamiento (Strauss y Hauser,
1986; Anchordoguy y col., 1987).
En muchas especies de gramneas de clima templado se ha observado la acumulacin de fructanos, polmeros de fructosa,
cuando las plantas son expuestas a bajas
temperaturas sobre cero. El incremento en
el contenido de estos polmeros parece estar relacionado al proceso de aclimatacin a
las bajas temperaturas (Pontis, 1989;
Tognetti y col., 1989; Santoiani y col., 1993;
Puebla y col., 1997,1999a).
El metabolismo de los fructanos en
gramneas ha sido estudiado en su mayor
parte en cereales de importancia agronmica
y se lo ha sealado como uno de los mecanismos de tolerancia a bajas temperaturas.
En la Argentina existen especies nativas que
estn adaptadas a ambientes de climas rigu-
rosos y son tolerantes a condiciones severas

de estrs abiticos. Bromus pictus, por ejemplo, es una especie distribuida en las estepas
ridas de la meseta patagnica, donde las
bajas temperaturas imperan en la mayora
de los das del ao (la temperatura media en
julio es de 1,9C) y las precipitaciones promedio slo llegan a los 168 mm anuales. Esta
especie contiene elevados niveles de
fructanos en sus tejidos y una creciente actividad de fructosil-transferasas, enzimas responsables de la sntesis de estos azcares,
cuando las plantas son tratadas con bajas
temperaturas. Los genes que codifican estas
enzimas fueron aislados recientemente y, a
travs de la transformacin de tejidos
heterlogos con los mismos, fue posible estudiar la funcin de estos azcares en la tolerancia a fro (Puebla y col., 1999b).
4.1.1 Identificacin y caracterizacin de
genes de tolerancia a fro
Numerosos genes inducibles por bajas
temperaturas y sus promotores han sido aislados y caracterizados en varias especies vegetales, incluyendo alfalfa, Arabidopsis, cebada y trigo. Una gran parte de estos genes
codifican protenas de funcin conocida, que
contribuyen a la tolerancia a las bajas temperaturas. Por ejemplo, el gen de Arabidopsis
FAD8 codifica una desaturasa de cidos grasos
que alterara la composicin lipdica de las
membranas. Tambin se conocen genes de
chaperonas en espinaca y Brassica napus que
responden a las bajas temperaturas y genes
regulados por fro que intervienen en la
transduccin de seales (Fig. 3).
Sin embargo, muchos genes inducidos
durante la aclimatacin a bajas temperaturas codifican protenas de funcin desconocida. Muchas de stas presentan homologa
con las protenas LEA, ya mencionadas. Los
polipptidos LEA son sintetizados en la semilla durante la embriognesis tarda antes
de la desecacin y tambin en plntulas, en
respuesta a la deshidratacin. Estas protenas son altamente hidroflicas, tienen una
composicin simple de aminocidos y en
muchas se predicen regiones capaces de formar -hlices anfipticas.
Otras protenas, de funcin desconocida,
que no se encuentran agrupadas con las LEA,
359
son las codificadas por genes COR (cold

resistant o resistente a fro), tambin designados LT1, KIN, RD y ERD, de Arabidopsis.
Estas protenas tambin presentan regiones
con capacidad para formar -hlices
anfipticas que podran tener roles en la estabilizacin de las membranas durante las
bajas temperaturas.
Algunos de estos genes, bajo promotores constitutivos (35S CaMV), han sido utilizados para transformar plantas susceptibles
a fro y se han realizado estudios de adquisicin de tolerancia a estrs con las plantas
transgnicas obtenidas. Los resultados sugieren que la tolerancia a bajas temperaturas depende de varios genes de tolerancia y no de un gen particular.
4.2 Regulacin de la respuesta a la
aclimatacin: el reguln CBF
Los estudios iniciales de la expresin de
genes regulados por fro establecieron que
algunos promotores de estos genes eran activados en respuesta a bajas temperaturas y
sequa. Los anlisis posteriores determinaron
que en Arabidopsis existen elementos
regulatorios en los promotores de estos
genes: las repeticiones C (CRT) en el elemento DRE (elemento que responde a sequa)
que estimulan la expresin de genes en respuesta a las bajas temperaturas, a la sequa
y a la salinidad. Se identificaron poco despus
activadores transcripcionales que se unen a
estos elementos CRT/DRE. Las protenas que
codifican contienen un dominio de unin al
ADN tipo AP2/EREBP y estn codificadas por
genes que se encuentran en tandem sobre
el cromosoma 4 de esta especie. La expresin constitutiva de estos activadores
transcripcionales bajo el promotor 35S del
CaMV en plantas transgnicas de
Arabidopsis induce la expresin de mltiples
genes regulados por bajas temperaturas que
poseen los elementos CRT/DRE, sin mediar
ningn estmulo de fro.
5 Tolerancia al estrs hdrico
La disponibilidad de agua es el factor abitico
ms importante que modela la evolucin de
las plantas. El estrs hdrico, en su sentido
ms amplio, incluye tanto a la sequa como a
360
la salinidad. Estos estreses, junto al fro,

constituyen problemas cruciales para la
agricultura, ya que impiden a los cultivos
desarrollar su mximo potencial gentico.
El estrs hdrico generalmente inhibe el
crecimiento celular y las evidencias indirectas
sugieren que existen seales de divisin celular y expansin relacionadas con las kinasas
dependientes de ciclinas (CDPK) (Zhu, 2002).
Las plantas sufren deshidratacin o estrs
hdrico, no slo durante la sequa o las altas
concentraciones de sales sino tambin durante condiciones de bajas temperaturas. Durante la exposicin de las plantas a temperaturas de congelamiento la formacin de hielo
extracelular impone una fuerza deshidratadora a la solucin no congelada intracelular.
La formacin de hielo lleva a una rpida concentracin de los solutos extracelulares y el
cambio de potencial qumico y osmtico provoca que el agua lquida se mueva hacia fuera de la clula.
Tanto la sequa como la salinidad afectan
virtualmente cada aspecto de la fisiologa de
una planta y su metabolismo. Considerando
la complejidad de las respuestas encontradas bajo estos estreses, no es sorprendente
que una gran proporcin del genoma est
sujeto a regulacin, como lo demuestran algunos trabajos de microarreglos de ADN. Por
ejemplo, en la levadura unicelular
Saccharomyces cerevisiae, la tolerancia a
estrs salino afecta aproximadamente al 8%
de los genes de todo el genoma (Posas y col.,
2000; Rep y col., 2000).
Las respuestas adaptativas al estrs pueden clasificarse de la siguiente manera:
a) El control de la homeostasis, que incluye homeostasis inica y la osmtica.
b)El control del dao y la reparacin o
detoxificacin.
c) El control del crecimiento.
La seal de homeostasis regula negativamente la respuesta de detoxificacin y estas
dos inducen la tolerancia al estrs, que regula negativamente la inhibicin del crecimiento provocada por la aparicin de las condiciones ambientales adversas.
La respuesta de las plantas a la alta
salinidad se dispara cuando se produce un
aumento intracelular de Na+. La seal de
estrs hdrico incluira posiblemente un cambio de turgencia que provoca el cierre de los
estomas, la expresin y/o activacin de
enzimas de sntesis de osmolitos y la de sistemas transportadores de stos y de agua.
Los genes involucrados en la homeostasis
hdrica incluyen los genes de acuaporinas, los
genes de enzimas de biosntesis de osmolitos,
de cotransportadores de sentido contrario
(antiporters) de Na+/H+ asociados a membrana plasmtica para la extrusin de Na+,
de antiporters de Na+/H+ para la compartimentalizacin de Na+ en la vacuola y de transportadores de K+ con alta afinidad para la
adquisicin de K+.
La seal de detoxificacin se disparara
ante la desnaturalizacin proteica y la presencia de especies reactivas de oxgeno. La
respuesta incluye la hidrlisis de fosfolpidos,
cambios en la expresin de protenas tipo
LEA/dehidrinas, de chaperonas moleculares
y proteasas que remueven las protenas desnaturalizadas, as como la activacin de
enzimas responsables de la remocin de especies reactivas de oxgeno, de protenas relacionadas con la ubiquitinacin y de otras
protenas detoxificantes.
6 La va SOS (Salt Overly Sensitive o
sensible al exceso de salinidad) de
tolerancia a la salinidad
El estrs salino quiebra la homeostasis
inica de las plantas provocando un exceso
txico de Na+ en el citoplasma y una deficiencia de iones esenciales como el K+.
El clonado y la caracterizacin bioqumica
de varios genes y productos de genes SOS
(Salt Overly Sensitive) ha permitido establecer recientemente una va de sealizacin
para la regulacin de la homeostasis inica y
la tolerancia a la salinidad en Arabidopsis.
Esta va se dispara por un aumento intra o
extracelular de Na + y provoca una seal
citoplasmtica de calcio que induce la expresin y cambios de actividad de transportadores de iones como el Na+, K+ y H+. La va
contiene tres genes principales llamados
SOS1, 2 y 3 (Zhu, 2000) (Fig. 3).
El estrs salino provoca una seal
citoslica de Ca 2+. Una protena que se une
a Ca 2+ , codificada por SOS3 percibe
presumiblemente esta seal y desencadena
la respuesta. SOS3 interacta y activa a SOS2,

una serin-treonin kinasa y estas dos a su vez
regulan la expresin y la actividad de SOS1,
un efector de la tolerancia a la salinidad, que
codifica un cotransportador de sentido contrario (antiporter) Na+/H+ de la membrana plasmtica. SOS3 es una protena
miristoilada, lo que facilita que sta y sus protenas asociadas (tipo SOS2) interacten con
la membrana, donde se encuentran ubicados sus transportadores blanco. SOS3 tambin parece interactuar con protenas que
median la induccin de la biosntesis de ABA.
SOS2 representa una nueva familia de
proten-kinasas slo encontradas en plantas
que contienen un dominio cataltico y otro
regulatorio que interacta con SOS3. SOS1 es
un cotransportador de sentido contrario
(antiporter) Na+/H+ de la membrana
plasmtica con una larga cola que estara
inmersa en el lado citoplasmtico y que podra funcionar como sensor de los solutos que
transporta.
7 El cido abscsico (ABA) y la tolerancia a
estrs
El ABA posee muchas funciones durante
el crecimiento y desarrollo de las plantas, pero
la principal funcin es la de regular el balance de agua y la tolerancia a estrs
osmtico.
Los patrones de expresin de los genes
inducibles por estreses abiticos son complejos y muchos de ellos son inducidos tambin
por la aplicacin exgena de ABA. Existen,
sin embargo, algunos genes inducibles por
estreses abiticos que no responden a esta
hormona. Esto sugiere que entre la seal inicial de sequa, salinidad o estrs por fro y la
expresin de genes especficos existen cascadas de seales de transduccin dependientes e independientes de ABA.
La acumulacin de ABA inducida por
estrs osmtico es una combinacin de la
activacin de su sntesis y de la inhibicin en
su degradacin. Aunque nada se sabe de la
sealizacin entre la percepcin del estrs y
la induccin de los genes de biosntesis, el
conocimiento actual sugiere que estn
involucradas seales de Ca 2+ y cascadas de
fosforilacin de protenas (Zhu, 2003).
En girasol fue descripta una familia de factores de transcripcin caractersticos de plan-
361
tas que contienen un homeodominio

leucine-zipper (cremallera de leucina) (Chan
y Gonzlez, 1994; Chan y col., 1998). Estas
protenas pueden unirse al ADN debido a la
presencia de una secuencia altamente conservada, conocida como homeodominio, que
se encuentra en muchos genes de eucariotas
que se expresan durante el desarrollo (Valle
y col., 1997). La familia de factores de transcripcin descripta en girasol incluye protenas
raturas revelaron la presencia de un elemento ABRE. Estos genes se expresan en respuesta a ABA, demostrando que las vas
regulatorias de fro y las dependientes de
ABA se cruzan en algn punto de la seal de
transduccin (Shinozaki y YamaguchiShinozaki, 1997).
8 Plantas transgnicas tolerantes a
estreses abiticos
Tabla 1: Plantas transgnicas conteniendo genes de tolerancia a estreses

abiticos (fro, sequa, salinidad) en etapa de experimentacin o de pruebas
experimentales a campo en pases en vas de desarrollo. (fuente:http://
www.fao.org/biotech/inventory_admin/dep/default.asp)
Tolerancia a estreses abiticos Especie
Pases
Bajas temperaturas
Bolivia
China
India
Bangladesh, Brasil, China,
India, Pakistn, Tailandia
China
China
Argentina
Egipto
China, Indonesia, Sudfrica,
Tailandia
Indonesia
Croacia
Salinidad
Papa
Tomate
Trigo
Arroz
Sequa
Maz
Sorgo
Tabaco
Trigo
Arroz
Caa de azcar
Trigo
involucradas en el desarrollo temprano de las

plntulas y otras que participan en la respuesta a sequa. Hahb-4 es un gen de esta familia
que mostr estar fuerte y reversiblemente
inducido por estrs hdrico y por ABA. La regin promotora de Hahb-4 contiene secuencias consenso presentes en elementos de
respuesta a ABA (ABRE), sugiriendo que este
gen funciona en la cascada de sealizacin
que controla en girasol la respuesta al estrs
hdrico mediada por ABA (Gago, 2002). Plantas de Arabidopsis transformadas con este
gen mostraron un aumento importante en
la tolerancia a estrs hdrico (Chan, comunicacin personal).
Estudios de la expresin de genes inducidos por fro en mutantes de Arabidopsis deficientes en ABA (aba) e insensibles a ABA
(abi) demostraron que la expresin de genes
de fro se encuentra mediada por vas dependientes e independientes de ABA (Ingam y
Bartels, 1996; Shinozaki y YamaguchiShinozaki, 1997). Los genes que contienen
los elementos CRT/DRE estan relacionados
con la va independiente de ABA. Algunos
de los genes que responden a bajas tempe-
362
En muchos pases se investiga activamente la adquisicin de tolerancia a factores ambientales adversos

en especies agronmicamente importantes transformadas con genes que codifican para protenas de tolerancia a estreses abiticos,
muchas de las cuales ya se encuentran en etapa de experimentacin a campo (Tabla
1).
9 Conclusiones finales
Las investigaciones en el campo de la tolerancia a factores ambientales adversos tuvieron un desarrollo importante en la ltima
dcada. Se identificaron genes y protenas
con roles en la tolerancia a fro, sequa y
salinidad, se determinaron muchos de sus
mecanismos de accin y se avanz en el conocimiento de cmo se desencadenan y activan las respuestas de las clulas vegetales
ante estos estreses y sus interrelaciones.
Las nuevas tecnologas (micro y
macroarreglos de ADN, transformacin
gentica de plantas) prometen brindar nuevos descubrimientos, fundamentales para
entender cmo las especies vegetales son
capaces de adaptarse a un ambiente siempre cambiante.
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365
VIII.- Captulo 13
Aproximacin biotecnolgica
integrada para un manejo sustentable
del estrs bitico en frutilla
Castagnaro, Atilio Pedro;
Salazar, Sergio Miguel; Zembo, Juan Carlos
Daz Ricci, Juan Carlos
Introduccin
La frutilla cultivada (Fragaria x ananassa:
2n=8x=56) es un poliploide con 56
cromosomas resultante de la hibridacin
interespecfica entre dos especies de frutillas
silvestres, tambin octoploides. Una de estas frutillas es originaria del sur (F. chiloensis:
2n=8x=56) y la otra del norte de Amrica (F.
virginiana: 2n=8x=56). La x en el nombre
cientfico hace referencia a su condicin de
hbrido. Se trata de un importante fruto que
se consume en fresco o industrializado y que
es muy apreciado en prcticamente todo el
mundo. Su cultivo involucra dos actividades
agronmicas bien diferenciadas: la produccin de frutas y la viverstica, las cuales generan una gran demanda de mano de obra
(alrededor de 500 jornales /Ha /ao), por lo
cual en muchos pases es considerado tambin como un cultivo social.
Si bien se realiza mejoramiento gentico
en distintos lugares de Asia, Europa y Norte
Amrica, el mercado de variedades est dominado por empresas estadounidenses. En
Argentina, a partir de 1996 comenz a funcionar, en forma organizada, el Programa
Nacional de Mejoramiento Gentico de la
Frutilla (Pro\Frutilla) a travs de una iniciativa
interinstitucional (sectores pblico y privado)
e interdisciplinaria (combina el mejoramiento gentico convencional con los mtodos
surgidos de la biotecnologa molecular), que
en 1999 represent a nuestro pas en la exposicin Flanders Technology InternationalTechnoland, en Gante, Blgica.
El objetivo general del Pro\Frutilla es obtener cultivares argentinos adaptados a por
lo menos dos agroecosistemas o ambientes
de seleccin (el subtropical de Lules en
Tucumn y el templado del cinturn hortcola
del Gran La Plata, en Buenos Aires), con resistencia incrementada a estrs de origen
bitico que permita evolucionar hacia una

agronoma menos reida con la salud humana y ambiental (principalmente sin bromuro
de metilo) y para que empresas viveristas locales puedan aprovechar las ventajas comparativas de exportacin de plantines de
gentica nacional en contraestacin con los
pases del hemisferio norte.
Reconocimientos
En este captulo se describen en forma
resumida los trabajos realizados y los logros
obtenidos con este programa donde, adems de los autores, participaron los siguientes investigadores (en orden alfabtico):
Marta Arias, Elsa Camadro, Nadia Chalfoun,
Paula Filippone, Gabriela Garca, Hugo Lzaro,
Cecilia Lemme, Alicia Ins Maman, Gustavo
Martnez Zamora, Luis Mroginski, Marta
Ontivero, Graciela Terada, Ursula Tonello y
Gabriel Vellicce.
1 Mejoramiento gentico
El Pro\Frutilla se basa en un esquema de
seleccin recurrente (Fig. 1) delimitado por
tres niveles de domesticacin:
1) Poblaciones Comerciales, representadas en la Figura 1;
2) Poblaciones Intermedias o Tampones,
donde se intenta llevar a cabo hibridaciones
interespecficas;
3) Poblaciones Silvestres, en las cuales se
realizan cruzamientos dentro de cada especie y/o nivel de ploida.
En una primera etapa, se realizaron recolecciones y se estableci un Banco de
Germoplasma activo, constituido por
genotipos de especies silvestres (Fragaria
vesca: 2n=2x=14; F. chiloensis: 2n=8x=56;
Duchesnea indica: serie poliploide 2n=8x y
10x=56 y 70, respectivamente) y de la cultivada F. x ananassa. Estudiando caracteres
citogenticos, morfolgicos y anatmicos
pudo identificarse una nueva especie silvestre, Potentilla tucumanensis (2n=2x=14), que
es endmica del Noroeste Argentino y se
encuentra en peligro de extincin. Esta especie fue clasificada de manera errnea a
principios del siglo XX como Potentilla
367
norvegica, especie decaploide tpica de los

pases nrdicos.
Paralelamente a la caracterizacin bot-
En la actualidad, se dispone de dos

genotipos promisorios en etapas avanzadas
de evaluacin y seleccin clonal, llamados 96/
Figura1. Esquema de seleccin recurrente seguido en las poblaciones comerciales (mayor nivel de domesticacin)
nica, en el marco de las mencionadas Poblaciones Intermedias (2) y siguiendo un esquema diallico incompleto, se realizaron 500 cruzamientos interespecficos entre accesiones
silvestres de Fragaria vesca, Duchesnea indica, Potentilla tucumanensis y 9 genotipos
de la cultivada F. x ananassa. Este estudio
permiti detectar barreras pre y poscigticas
de aislamiento reproductivo entre estas especies. A fin de conocer la naturaleza de las
barreras, se investig el crecimiento del tubo
polnico en el pistilo utilizando microscopia
de fluorescencia (Fig. 2) y se realizaron estudios histolgicos de aquenios. Este conocimiento permitir disear estrategias que
posibiliten la transferencia de genes de inters agronmico desde los genotipos silvestres a los domesticados.
Figura 2. Compatibilidad del cruzamiento. Incompatible:

el grano permanece sin germinar en el estigma (izda.).
Compatible: varios granos de polen crecen a travs del
estilo (centro). Medianamente compatible: Slo unos
pocos granos de polen atraviesan el estilo (dcha.).
368
6-5 y 96/6-6, donde el nmero anterior a la

barra, indica el ao de cruzamiento (en este
caso 1996), el que le sigue indica la familia o
cruza, en este caso cv. Chandler x cv. Oso
Grande) y el ltimo nmero es arbitrario y
responde a un ordenamiento interno del
programa.
2 Cultivo in vitro de meristemas,
micropropagacin y evaluacin de la
variacin somaclonal
Debido a que el cultivo de meristemas posibilitara sanear la mayor parte de las virosis,
no se ha profundizado demasiado en el estudio y caracterizacin de los virus que afectan a la frutilla y desde un punto de vista agronmico estas enfermedades no estn dentro de los principales problemas del cultivo. Este
mismo razonamiento
podra aplicarse para la
enfermedad sistmica
(bacteriosis) provocada
por
Xanthomonas
fragariae.
Se estudiaron las condiciones de cultivo
in vitro para sanear y multiplicar diferentes
genotipos de frutilla, entre ellos el cultivar
Camarosa, que es la variedad ms cultivada
en el mundo. A su vez y mediante caracteri-
CASTAGNARO, A.P.; SALAZAR, S.M.;ZEMBO J.C.;DAZ RICCI, J.C.
zacin fenotpica y marcadores genotpicos

del tipo RAPD (del ingls Randomly Amplified
Polymorphic DNA), se investig la eventual
induccin de variacin somaclonal en ciclos
sucesivos de multiplicacin de este cultivar.
La tasa de multiplicacin de las plantas in
vitro fue evaluada utilizando dos formulaciones salinas en el medio de cultivo (N30K
y MS) y diferentes concentraciones de
cinetina (0,25, 0,5 y 0,75 mg/L). La mejor tasa
de multiplicacin se obtuvo en el medio N30K
suplementado con 0,25 mg/L de cinetina, sin
que se detectara variacin somaclonal despus de tres ciclos sucesivos multiplicacin.
Este resultado nos permiti proponer por
primera vez el uso de un procedimiento para
el saneamiento y la micropropagacin comercial de la variedad Camarosa.
3 Interaccin planta-patgeno
A diferencia de otros productos agroalimentarios, las hortalizas se consumen
mayoritariamente en fresco, lo que implica
que no pueden llevar residuos de pesticidas.
Por otro lado, la prctica agronmica deber
evolucionar, indefectiblemente, hacia nuevos
sistemas productivos que minimicen la utilizacin de agroqumicos sintticos. El problema principal del cultivo de la frutilla son
las enfermedades fngicas. El manejo de
estas enfermedades, donde una de las ms
importantes
es
la
antracnosis
(Colletotrichum sp.), involucra el uso masivo
de pesticidas contaminantes como el
bromuro de metilo, que adems de ser txico destruye la capa de ozono, y cuya eliminacin ya fue pautada desde Naciones Unidas.
En este contexto el Pro\Frutilla est llevando a cabo una investigacin bsica que
permita desarrollar estrategias de biocontrol.
Para ello:
1) En primer lugar, se aislaron los agentes
etiolgicos locales de las enfermedades ms
importantes (especies pertenecientes a los
gneros: Colletotrichum, Botrytis,
Micophaerella, Xanthomonas, etc.) y se
optimizaron metodologas de infeccin controlada que posibilitaron la evaluacin
fenotpica certera de la resistencia/ susceptibilidad de los materiales fitotcnicos del Banco de Germoplasma del Pro\Frutilla.
Figura 3. La previa inoculacin con un patgeno

avirulento desencadena una respuesta defensiva
de proteccin cruzada contra el patgeno virulento
(izda.). Planta control infectada con un patgeno
virulento (dcha.).
2) Se caracterizaron los hongos

patgenos del gnero Colletotrichum relacionados con la enfermedad de la
antracnosis. Esto permiti detectar una respuesta sistmica de proteccin cruzada desencadenada por un patgeno avirulento,
que adems puede ser inducida por el microorganismo (patgeno) inactivado y/o por
extractos del mismo, lo que puede tener tanto implicancias conceptuales como biotecnolgicas (Fig. 3). Los estudios histopatolgicos
Tabla1:
ESPECIE
EC50 (uM)
Bacterias
Gram positivas
Clavibacter michiganensis
Staphylus aureus
Enterococcum faescium CRL 35
Bacillus subtilis
Listeria monocytogenes
Gram negativas
Xanthomonas fragariae
Xanthomonas axonopodis pv citri
Pseudomona auruginosa
Pseudomona siringae pv. gladiolii
Erwinia carotovora
Salmonella newport
E.coli D21
Hongos
Colletotrichum fragariae
Colletotricum acutatum
Colletotrichum gloeosporioides
0.07
0.14
0.20
0.25
0.28
0.06
0.07
0.12
0.27
0.95
3.25
4.00
8.92
7.91
9.37
EC50 = concentracin efectiva para el 50 % de inhibicin
en plantas que manifiestan la respuesta de

defensa revelaron la presencia de cristales no
caractersticos de la especie F. x ananassa, un
incremento en la sntesis de almidn (activi-
369
dad metablica), un mayor nmero de

cloroplastos y un engrosamiento de las paredes celulares, lo que contribuye a aumentar el espesor de la semilmina.
Por otra parte, se purificaron y caracterizaron compuestos antimicrobianos preformados (fitoanticipinas, para diferenciarlos
de las fitoalexinas, cuya formacin en la
planta es inducida por un microorganismo)
que fueron llamados Fragarinas. Uno de stos, llamado Fragarina 1, cuando es aplicado
en forma exgena, desencadena adems
una respuesta defensiva en la planta. Esto
implicara que ms all de su efecto como antibitico (Tabla 1), que permeabiliza la membrana plasmtica, estara de alguna manera
participando en la sealizacin de la respuesta de defensa. Actualmente, se analiza la potencialidad de extractos o compuestos de
este tipo como principios activos en la formulacin de agroqumicos naturales de bajo
impacto ambiental.
4 Marcadores moleculares
Aprovechando la versatilidad de la tcnica de RAPD lo primero que se plante fue
investigar la similitud gentica entre las especies silvestres relacionadas con la frutilla
cultivada y se desarrollaron los primeros marcadores moleculares especficos de especie,
que permitieran la deteccin de hbridos
interespecficos putativos. Del mismo modo,
pero usando electroforesis en geles de
poliacrilamida de alta resolucin, se generaron 37 marcadores genotpicos actualmente
disponibles para la identificacin inequvoca

de las 8 principales variedades de frutilla cultivadas en la Argentina. Utilizando esta
aproximacin pudieron diferenciarse tres accesiones distintas del cultivar Pjaro, que haban sido multiplicadas en forma independiente, confirmando la importancia del anlisis del ADN para evitar errores en la identificacin de cultivares (Fig. 4a).
Sobre la base de la informacin obtenida
en los experimentos donde se evalu la resistencia/ susceptibilidad de los genotipos del
Banco de Germoplasma frente a diversos
patgenos fngicos, se disearon cruzamientos para obtener poblaciones segregantes
que posibilitaran investigar el control gentico
de la resistencia. As, para la principal enfermedad del cultivo, la antracnosis, se propuso un modelo basado en una interaccin gen
a gen en un fondo gentico octoploide, que
asume que la resistencia est determinada
por diferentes variantes allicas de un gen R,
donde la susceptibilidad es parcialmente dominante sobre la resistencia y la respuesta
defensiva sera modulada por la dosis allica
y por otros genes que interactuaran
epistticamente con el gen R. Mediante BSA
(del ingls Bulked Segregant Analysis) se detectaron marcadores AFLP (del ingls
Amplification Fragment Length Polymorphisms) ligados a la resistencia que pueden
contribuir a hacer ms eficiente la seleccin
en el Pro\Frutilla (Fig. 4b).
5 Transgnesis
Figura 4. Marcadores moleculares. A. Perfiles diferenciales de RAPD

indican diversidad gentica entre distintas accesiones de un mismo
cultivar de frutilla. B. Marcador AFLP asociado a la resistencia a C.
acutatum, presente en Progenitor (PR) e hbridos resistentes (HR) y
ausente en progenitor (PS) e hbridos susceptibles (HS).
370
En virtud de las ventajas

que ofrece la transformacin
gentica
mediada
por
Agrobacterium tumefaciens,
preliminarmente se desarroll
un protocolo de regeneracin
de brotes a partir de discos de
hojas, con el que se consegua
que el 70% de los explantos
cultivados regeneraran plantas
de frutilla. Este sistema de regeneracin fue utilizado para
optimizar una metodologa de
transformacin con la cepa de
Agrobac-terium tumefaciens
LBA 4404, portadora del
plsmido binario pBI121,
Figura 5. Transgnesis: A, Construcciones gnicas portadoras de genes que

codifican protenas antifngicas (quitinasa, glucanasa y Ap24). B, Hojas
desprendidas de frutilla no transgnica (izda.) y transgnica resistente a Botrytis
(dcha.).
logrndose una eficiencia del 6,6 plantas

transgnicas por cada 100 discos de hojas
infectados con la bacteria.
Basados en este procedimiento, se obtuvieron 16 lneas transgnicas de frutilla cv
Pjaro, que expresaban uno o una combinacin de dos de los siguientes genes
heterlogos (Fig. 5a) que codifican protenas
antifngicas del grupo de las PR (protenas
relacionadas con la patognesis vegetal):
ch5B (codifica para una quitinasa de
Phaseolus vulgaris), gln2 (codifica para una
glucanasa de Nicotiana tabacum) y ap24 (codifica para una protena del tipo de las
taumatinas de Nicotiana tabacum). Solamente dos de estas lneas transgnicas, ambas portadoras de una copia simple del gen
ch5B, mostraron resistencia incrementada a
la enfermedad del moho gris (causada por
Botrytis cinerea, de gran incidencia en
agrosistemas subtropicales), aunque ninguna de las 16 evidenci cambios en su comportamiento frente a Colletotrichum
acutatum, una de las especies ms agresivas
causante de la antracnosis.
De este modo, queda demostrada la utilidad del gen ch5B para introducir resistencia
a Botrytis en frutilla (Fig. 5b), un patgeno
para el cual todava no se han encontrado
fuentes de resistencia gentica en la especie
F. x ananassa.
6 Caracterizacin molecular de genes de
inters
Actualmente se est aprovechando el
conocimiento que se tiene, tanto de los materiales fitotcnicos como de los sistemas de
compatibilidad, incompatibilidad y de proteccin cruzada caracterizados, para aislar genes
implicados en los mecanismos defensivos, si-
guiendo al menos dos aproximaciones distintas:

i) Mediante la tcnica de visualizacin de
la expresin diferencial de ARNms y la construccin (y posterior anlisis) de genotecas
de ADNc por hibridacin sustractiva.
ii) El clonado y caracterizacin de anlogos de genes de resistencia (RGA).
En el primer caso (i), se clonaron numerosos fragmentos de ADNc que codifican protenas relacionadas con la defensa vegetal
como quitinasas de tipo III o PR 8, protenas
quinasas con un dominio de unin a calcio,
reguladores transcripcionales con dominios
hometicos, miembros de la familia de las
enoil-CoA-hidratasa /isomerasa, etc. De estos genes que estn siendo analizados al
momento de escribir este captulo, se destaca uno que presenta una alta homologa con
una glutation S tranferasa (GST) de zapallo
(Cucurbita maxima). Esta familia gnica que
acta en la detoxificacin de compuestos altamente oxidantes (especies reactivas de oxgeno) generados durante estrs tanto bitico
como abitico, en Arabidopsis presenta
miembros que slo se expresan en interacciones planta /patgeno de tipo incompatibles (cuando no se produce enfermedad).
Respecto de la segunda aproximacin (ii),
se utilizaron oligonucletidos cebadores degenerados diseados a partir de secuencias
conservadas de la regin NBS (del ingls
Nucleotide Binding Site) de genes de resistencia (R) clonados de otras plantas, para
amplificar por PCR, anlogos de genes de resistencia en genotipos silvestres y cultivados
de frutilla. Se identificaron al menos siete familias distintas de RGAs, de las cuales la mayora perteneca a genes R de tipo TIR (del
ingls Toll Interleukin Receptor), similares
a los ya caracterizados en Arabidopsis, tabaco y lino.
371
7 Conclusiones
En general, se podra decir que el caso del
Pro\Frutilla es un claro ejemplo de
complementacin, interaccin, integracin y
coordinacin, entre el mejoramiento
gentico convencional y la biotecnologa
molecular, para buscar soluciones a problemas de estrs bitico asociados a un cultivo
de inters comercial, en un marco de
sustentabilidad y competitividad agronmica.
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372
VIII.-Captulo 2
Mejoramiento de Plantas Forrajeras en
la Era Genmica
Spangenberg, Germn
1 Introduccin
La agricultura de pastizales depende en
gran medida de la disponibilidad de fuentes
adecuadas de forraje como base primaria
para la alimentacin del ganado. En la mayora de las regiones agrcolas del planeta la
produccin de forraje es un sistema de baja
inversin donde el mejoramiento gentico
de plantas es la forma ms econmica de
aportar tecnologa de avanzada a los productores. El mejoramiento convencional se basa
en el uso de la variacin gentica natural existente entre ecotipos o aquella creada a travs de recombinacin sexual. La biotecnologa
permite generar nueva variabilidad y utilizar
de manera ms eficiente la variabilidad
gentica existente. Esto incrementa la fuente de genes tiles para el desarrollo de nuevos cultivares, acelerando los programas de
mejoramiento gentico.
En los ltimos aos se han desarrollado
numerosas tcnicas biotecnolgicas y
moleculares para el mejoramiento de
gramneas y leguminosas forrajeras
(Spangenberg 1999; Forster et al. 2000). Entre estas tcnicas cabe mencionar el establecimiento de sistemas eficientes de regeneracin de plantas a partir de clulas competentes para la transformacin gentica, la combinacin total o parcial de genomas por hibridacin somtica y cibridacin a travs de
la fusin de protoplastos, la produccin de
plantas forrajeras transgnicas utilizando
Agrobacterium y biolstica, y el establecimiento de sistemas altamente informativos de
marcadores moleculares codominantes
para ser utilizados en el proceso de seleccin
y en el desarrollo de mapas genticos.
En este captulo se describen las aplicaciones actuales y futuras y el impacto de la
biotecnologa en el mejoramiento de especies forrajeras.
2 Transgnesis
La tecnologa gnica y la obtencin de
plantas transgnicas brindan la posibilidad de
generar variacin gentica cuando esta es

inexistente o tiene una heredabilidad muy
baja. En la actualidad se dispone de
metodologas eficientes para la transformacin de forrajeras, ya sean gramneas o leguminosas (Fig. 1, ver pg.9), estando en la etapa de evaluacin a campo las primeras plantas forrajeras transgnicas con caracteres simples modificados. Si bien algunos aspectos de
la gentica, fisiologa y bioqumica de muchos
procesos vegetales complejos no han sido an
completamente dilucidados -lo cual podra
demorar algunas de las aplicaciones de la
transgnesis en el mejoramiento vegetal- la
tecnologa gnica es una poderosa herramienta para ampliar los conocimientos en
gentica molecular.
En consecuencia, las aplicaciones de la
transgnesis en el mejoramiento de especies
forrajeras estn orientadas hacia el desarrollo de eventos de transformacin con variacin gentica nica y a la diseccin
gentica de vas metablicas y procesos de
desarrollo relevantes para la produccin de
forrajes.
Los mejores candidatos en cuanto a caracteres para la aplicacin de transgnesis en
plantas forrajeras son: calidad del forraje,
resistencia a plagas y enfermedades, tolerancia a estreses abiticos y la manipulacin del
crecimiento y desarrollo.
2.1 Calidad del forraje
El mejoramiento molecular basado en
transgnesis para sortear limitaciones en la
calidad del forraje est dirigido al tratamiento de los subcaracteres involucrados, a saber: digestibilidad de la materia seca, contenido de carbohidratos solubles, contenido de
protenas, metabolitos secundarios, alcaloides, etc. El enfoque molecular puede incluir la modificacin del perfil de ligninas
para mejorar la digestibilidad de la materia
seca, la manipulacin gentica del contenido de fructanos para incrementar el contenido de carbohidratos no estructurales, de la
sntesis de taninos condensados para desarrollar forrajeras libres de meteorismo y la
expresin de protenas resistentes al rumen
(rumen by-pass) para mejorar el aporte de
protenas y aminocidos esenciales. La mayora de los parmetros de calidad estn aso-
267
ciados con vas metablicas o con la produccin de protenas especficas. La tecnologa

gnica permite identificar las protenas
involucradas y las enzimas clave a ser manipuladas, el aislamiento de los genes correspondientes y la manipulacin de su expresin en plantas transgnicas.
2.1.1 Manipulacin de la biosntesis de
lignina
El principal objetivo tendiente mejorar el
valor nutritivo de las gramneas forrajeras
para la industria lechera es el incremento de
la digestibilidad de la materia seca, la cual
declina marcadamente (> 10%) a medida que
estas crecen y maduran, reduciendo el valor
nutritivo del forraje. Dado que la heredabilidad de este caracter es baja y el mismo
est controlado por un gran nmero de
genes, el potencial para un mejoramiento
rpido por mtodos tradicionales es reducido.
Se calcula que pequeos incrementos en
la digestibilidad tendrn un efecto significativo en la calidad del forraje y concomitantemente, en la produccin animal. Incrementos del 1% en la digestibilidad de la materia
seca in vitro conducen a incrementos promedio del 3,2% en ganancia media de peso
vivo.
El principal factor involucrado en la disminucin de la digestibilidad de los tejidos a
medida que maduran es la lignificacin de
las paredes celulares. Los efectos negativos
de la lignina sobre la digestibilidad dependen
de su contenido, composicin de
monmeros y grupos funcionales y del grado de entrecruzamiento con los polisacridos
de la pared celular. La lignificacin es un proceso altamente coordinado y regulado por
un conjunto de eventos metablicos que resultan en la biosntesis de precursores de la
lignina (monolignoles). Una de las estrategias
exploradas para mejorar la digestibilidad de
la lignina es la regulacin negativa, en sentido o anti-sentido, de las enzimas
involucradas en la biosntesis de monolignoles
en plantas transgnicas. Las principales
enzimas blanco para la aplicacin de esta tecnologa son la O-metiltransferasa del cido
cafeico (COMT), la 4-cumarato: CoA ligasa
(4CL), cinamoil CoA reductasa (CCR) y cinamil
268
alcohol deshidrogenasa (CAD)(Fig. 2 A).

Las investigaciones realizadas utilizando
plantas modelo como tabaco y lamo demostraron que la regulacin negativa de la
expresin de COMT, CAD y 4CL conduce a
una alteracin en la composicin de la lignina
o a una disminucin de su contenido con incrementos significativos en la digestibilidad
de la materia seca. En algunos de estos casos la lignina result ms fcil de extraer qumicamente, en otros esta tecnologa trajo
aparejadas alteraciones en el desarrollo de
la planta, como reducido tamao y colapso
de las clulas del xilema. No obstante ello,
estos resultados indican que la introduccin
de genes de esta va metablica en sentido
o antisentido permite mejorar la digestibilidad de la materia seca sin alterar el desarrollo normal de la planta.
Los efectos observados en plantas con
regulacin negativa de alguna de estas
enzimas son similares a aquellos encontrados
en la naturaleza en un tipo particular de mutantes de maz llamados brown midrib
(bmr), cuyos genes codifican para enzimas
menos activas. El enfoque transgnico brinda la posibilidad de obtener plantas con
ligninas diferentes, logrando una mayor variedad de fenotipos que la existente en la
naturaleza, a travs de la regulacin negativa de varias enzimas y a la utilizacin de promotores especficos.
Estudios tendientes a mejorar la calidad
del forraje por esta tecnologa estn siendo
explorados en leguminosas como
Stylosanthes humilis y Medicago sativa y
gramneas como Lolium perenne y Festuca
arundinacea. Se cuenta con los genes (ADNc
y clones genmicos) que codifican para COMT,
4CL, CCR y CAD de L. perenne. Estos han sido
aislados, secuenciados, caracterizados y utilizados para la diseccin gentica de esta va
biosinttica en gramneas (Fig.2 A). Los genes
correspondientes han sido mapeados en
raigrs perenne (Fig. 2 B).
A fin de producir cultivares con mayor
digestibilidad, aptos para el mercado, es necesario contar con varios eventos de transformacin con regulacin negativa para
enzimas individuales o mltiples enzimas
involucradas en el metabolismo de los
monolignoles, realizar ensayos a campo de
estas plantas, evaluando particularmente el
SPANGENBERG, Germn
Los fructanos son molculas de

polifructosa producidas por varias especies
de gramneas para las cuales constituyen la
principal forma de almacenamiento de
carbohidratos solubles. Observaciones reali2.1.2 Manipulacin del metabolismo de
zadas en lneas de raigrs que almacenan confructanos
centraciones elevadas
de carbohidratos soL-fenil- PAL cido cinmico
lubles indicaron que
alanine
estas no sufren dismiC4H
nuciones
en
la
TAL
C3H cido
OMT cido F5H 5-hidroxi- OMT cido
cido
digestibilidad
durante
L-tirosina
p-cumrico
cafeico
ferlico
sinpico
el verano, debido a
cido ferlico
PAL
4CL
4CL
4CL
4CL
4CL
que estos carbohiCCoA-3H
CCoA-OMT
CCoA-OMT
dratos parecen con?
p-cumaroilcafeoilferuloil5-hydroxysinapoiltrarrestar las disminuCoA
CoA
CoA
feruloyl-CoA
CoA
ciones en digestiCCR
CCR
CCR
CCR
bilidad debidas a
lignificacin, favorep-cumaraldehdo
coniferaldehyde 5-hidroxisinapaldehdo
coniferaldehdo
ciendo adems la asiCAD
CAD
CAD
milacin del forraje y
de protenas en el
alcohol p-cumarlico
alcohol coniferlico
Alcohol sinaplicol
rumen y, concomi(H)
(G)
(S)
tantemen-te, conduPER
LAC
ciendo a incrementos
LIGNINA
A en el peso vivo.
La sntesis de
fructosa en gramLG2
LG7
neas involucra la accin concertada de al
menos tres enzimas:
sacarosa:sacarosa 1Xc30.1,
fructosil-transferasa
Xbcd147
e41t50240,
Xcdo1417
LpCAD2.2
e41t50144
Xbcd1823
(1-SST), fructano:
e33t50120
LpCAD2.1
e33t62340
Xpsr154, Xpsr690
Xbcd135, Xc600.1
fructano 1-fructosilLpOMT1
e33t62760
e38t50244
transferasa (1-FFT) y
LpCCR1
e33t62620
e41t47520
sacarosa: fructano 6Xpsr540.1
fructosiltransferasa
(6-SFT) que sintetizan
e40t50334
10 cM
la mezcla ms comLpCAD1
e40t49173, Xcdo36
pleja de fructa-nos liXpsr546
Xpsr1316
gados que se encuenXc472
Xr738
tra en pastos y cereaXc556, Xc498, Xpsr10 (Gli-2)
Xc847
les. Varios de los
B genes involucrados
en
esta
va
metablica han sido
Figura 2: A) Diseccin de la va metablica de la biosntesis de monolignoles. Las
aislados y caracterizaenzimas son: PAL = fenilalanina amonio liasa, C4H = 4-cumarato-3-hidroxilasa, COMT =
O-metil transferasa del cido cafeico, F5H = ferulato-5-hidroxilasa, 4CL = dos, como el 6-SFT de
hidroxicinamato:CoA ligasa, CC3H = cumaroil CoA hidroxilasa, CCOMT = Cafeoil CoA 3- cebada, el 6G-FFT de
O-metil transferasa, CCR = cinamoil CoA reductasa, CAD = cinamil alcohol deshidrogenasa. cebolla y el 1-SST de
Las flechas punteadas indican reacciones que no han sido experimentalmente alcaucil. Su introducverificadas. B) Mapeo de los genes correspondientes a la va en los grupos de ligamento cin en plantas desLG2 y LG7 de raigrs perenne.
provistas de frucvigor, la tolerancia a estreses y por ltimo llevar a cabo la hibridacin y seleccin para obtener germoplasma elite.
269
tanos nativos conduce a la acumulacin de

oligofructanos, y en plantas que los producen, a la acumulacin de nuevas variedades
de los mismos.
La introduccin de un gen microbiano
para la fructosiltransferasa (gen SacB) de
Bacilus subtilis en plantas de tabaco y papa
que carecen de fructanos y acumulan almidn condujo a la acumulacin de cantidades
considerables de fructanos de elevado peso
molecular, del tipo de los levanos, que les
confierieron un mejor rendimiento en situaciones de estrs. Esto demuestra que la sacarosa, el sustrato para la fructosiltransferasa,
puede ser redireccionada en especies que no
acumulan fructanos.
La manipulacin de la biosntesis de
fructanos en plantas transgnicas para mejorar la calidad del forraje y la tolerancia a
estreses abiticos est siendo explorada en
leguminosas como Trifolium repens y
Medicago sativa y gramneas como Lolium
perenne y Festuca arundinacea.
En trabajos previos se obtuvieron plantas de L. multiflorum con alteraciones en el
metabolismo de fructanos por la introduccin
de genes quimricos de levansucrasa
bacteriana. Actualmente se dispone de ADNc
de genes de homlogos de la fructosiltransferasa de raigrs perenne. Estos han sido aislados, caracterizados y utilizados para la diseccin gentica de la biosntesis de
fructanos en gramneas transgnicas. Tambin se han aislado y caracterizado otros
genes de la va que han sido introducidos y
expresados en leguminosas y gramneas.
La diseccin molecular de la biosntesis de
fructanos en forrajeras clave incrementar
nuestro conocimiento del metabolismo de
los fructanos y de la distribucin de los
carbohidratos en gramneas, aportando informacin acerca de su rol funcional en la
tolerancia al fro y la sequa. Este conocimiento
es clave para el diseo de experimentos tendientes a la obtencin de plantas
transgnicas con mejor calidad de forraje y
tolerancia a estreses abiticos.
2.1.3 Expresin transgnica de protenas
rumen by-pass
Los aminocidos azufrados metionina y
cistena son los ms limitantes en la nutricin animal. Estos influyen en el crecimiento
de la lana de las ovejas y su aporte es reducido en condiciones naturales de pastoreo. A
270
esto se suma el problema de la fermentacin

en el rumen, ya que la microflora degrada las
protenas y en algunas circunstancias
resintetiza protenas de menor valor nutritivo. Los suplementos postruminales de
metionina y cistena resultan en incrementos
del 16 al 130% en la tasa de crecimiento de
la lana. Estos efectos positivos tambin se
han observado en bovinos, donde han redundado en una mayor produccin de leche
y una mayor tasa de crecimiento en animales para carne. Por lo tanto la ingestin de
forrajeras que contengan protenas ricas en
aminocidos azufrados, relativamente estables en el rumen, incrementar el aporte de
aminocidos esenciales para la nutricin de
los rumiantes, conduciendo a una mayor produccin animal, particularmente en lo que a
lana se refiere.
Se ha informado la obtencin de plantas
forrajeras transgnicas que expresan genes
que codifican para diferentes protenas ricas
en aminocidos azufrados, resistentes a la
accin del rumen, como la ovoalbmina de
gallina y la albmina de arveja y de semilla
de girasol. Como ejemplo puede citarse el
caso de plantas transgnicas de Festuca
arundinacea (Festuca alta) que expresan
genes quimricos constitudos por secuencias
de ADNc de la albmina de girasol (SFA8) con
la seal KDEL del retculo endoplsmico bajo
el control de diferentes promotores. Estas
plantas expresan el transcripto esperado y
acumulan la protena SFA8 a niveles superiores al 0,2% del total de protena soluble. Desde el punto de vista nutricional los valores
obtenidos an estn lejos del ptimo, que
deber ser del 2 al 5 % del total de protena
soluble. Es crucial, por lo tanto, desarrollar
estrategias que permitan alcanzar estos niveles a fin de explotar el mximo potencial
de la tcnica.
2.1.4 Manipulacin de la biosntesis de
taninos condensados
Los taninos condensados (proantocianas)
son compuestos polimricos derivados del
metabolismo fenilpropanoide, sintetizados
por la va metablica de los flavonoides.
Desde el punto de vista agronmico son importantes en las leguminosas forrajeras donde pueden considerarse beneficiosos o per-
SPANGENBERG, Germn
judiciales de acuerdo a los niveles encontrados en la planta. Niveles de taninos condensados superiores al 4-5% del peso seco son
perjudiciales, actuando como factores
antinutritivos y generando rechazo por parte del animal. En cantidades moderadas (13%) mejoran la calidad del forraje, ya que
reducen el meteorismo (empaste) por
disrupcin de la espuma causada por las protenas en el rumen, disminuyen la prdida de
protenas debidas a desaminacin microbiana y reduciendo la carga de parsitos en
el animal.
Las estrategias moleculares utilizadas para
la manipulacin de la biosntesis de taninos
se han orientado hacia la introduccin de
taninos condensados en alfalfa y trbol blanco y a su reduccin en leguminosas que tienen altos contenidos (ver Morris y Robbins
1997 y Gruber et al., 2000). Estas se basan
en la disponibilidad de genes involucrados en
la biosntesis de antocianas, que afectan las
etapas comunes en la biosntesis de
flavonoides y la suposicin de que estos funcionarn en la biosntesis de taninos.
El estudio de mutantes de la va
metablica de los flavonoides en Arabidopsis
ha proporcionado abundante informacin
acerca de la identidad de las enzimas
involucradas en la sntesis de taninos en esta
especie. Esto permiti el clonado, entre otros,
de los genes CHS, CHI, F3H y DFR. Se identific y clon tambin el gen BAN (BANYULS),
que parece ser especfico de la va de
biosntesis de los taninos.
Se ha intentado la regulacin negativa o
positiva de enzimas clave en la biosntesis,
como es el caso de chalcona sintetasa (CHS)
y leucoantocianina-4 reductasa (LAR) respectivamente, o la activacin de la ruta
biosinttica mediante la expresin de genes
reguladores apropiados que gobiernen la va
a travs de un accionar pleiotrpico (con
efectos a varios niveles fenotpicos). El anlisis de los promotores de algunos genes estructurales de esta va demostr la presencia
de motivos de secuencia especficos para
la interaccin con factores de transcripcin
de tipo MYB, bZIP y bHLH. Un ejemplo de
esto lo constituye la transformacin de plantas de Lotus corniculatus con el gen
regulatorio Sn de maz, que result en una
disminucin del contenido de taninos en
hojas, conjuntamente con un aumento del
nivel de los mismos en raz.

El pastoreo directo de alfalfa presenta el
riego de causar meteorismo en los rumiantes que la consumen debido a la ausencia de
taninos condensados en hojas y tallos. Sin
embargo, la presencia de estos flavonoides
en las semillas demuestra que esta especie
contiene todos los genes necesarios para la
sntesis de taninos condensados. La identificacin y aislamiento de los genes involucrados
en la biosntesis de taninos en semillas de
alfalfa permitiran manipular su expresin en
hojas. Candidatos adecuados podran ser los
genes de leucoantocianina-4 reductasa (LAR)
y de CHS.
2.2 Resistencia a plagas y enfermedades
Los patgenos y las plagas pueden disminuir considerablemente la produccin, la
persistencia, el valor nutritivo y la
palatabilidad de las plantas forrajeras. En los
ltimos diez aos se han desarrollado varias
estrategias para manipular la resistencia a los
mismos. Estas incluyen la expresin de
quitinasas,
glucanasas,
defensinas,
fitoalexinas, protenas inactivadoras del
ribosoma, protenas de la cpside viral,
replicasa viral, protena del movimiento viral,
toxinas Bt, inhibidores de proteasas e
inhibidores de -amilasa.
2.2.1 Transgnesis para incrementar la
resistencia a enfermedades fngicas
El ataque de hongos a las hojas y sistemas radicales de las plantas provocan daos
que resultan en un pobre establecimiento,
disminucin en el rendimiento y calidad y una
limitada persistencia. La expresin constitutiva en plantas transgnicas -especfica de
rgano o inducida por el patgeno- de genes
que codifican para protenas antifngicas
(AFPs), puede conferir nuevas formas de resistencia a enfermedades fngicas. Estas estrategias, utilizando genes que actan individual o concertadamente, se han intentado
principalmente en leguminosas, como alfalfa y trbol blanco. Como ejemplo puede citarse la obtencin de plantas de alfalfa que
expresan una quitinasa I de arroz, que podra hacerlas resistentes al ataque de
Rhizoctonia solani y Sclerotium rolfsii.
271
Hongos como Phytophthora clandestina, Kabatiella caulivora, Rhizoctonia solani

y Fusarium spp., que atacan a varias especies de trboles, donde no existen fuentes
de resistencia natural, provocan cuantiosas
prdidas econmicas en Australia. Se han
identificado cuatro protenas antifngicas diferentes que en ensayos in vitro demostraron ser efectivas contra estos patgenos y
se han utilizado los correspondientes genes
quimricos que las expresan para producir
plantas fenotpicamente normales de trbol
subterrneo. Mientras se trata de determinar la resistencia lograda utilizando estos
genes AFPs de manera individual tambin se
intenta piramidizar diferentes transgenes
a fin de brindar una mayor proteccin contra un amplio espectro de hongos patgenos.
pecies vegetales. En este sentido se han utilizado resistencias derivadas de distintos

patgenos para la obtencin de leguminosas transgnicas con resistencia a AMV,
WCMV y CYVV. La estrategia utilizada fue la
de expresin de protenas de la cpside viral
u otras propias del patgeno como versiones mutadas de distintas protenas. (ver
VIII.4).
En las gramneas forrajeras dos virus que
se encuentran con frecuencia son el del
enanismo y amarillamiento de la cebada
(BIDV) y el del mosaico del raigrs (RMV).
Estos provocan disminuciones en el rendimiento del raigrs de hasta un 24% (BIDV) y
de un 5 al 50% (RMV). La infeccin con RMV
tambin reduce la competitividad del raigrs
perenne como resultado de un mal establecimiento y una reducida persistencia.

resistencia a enfermedades virales

resistencia a plagas
Virus tales como el del mosaico de la alfalfa (alfamovirus,AMV), el del mosaico del
trbol blanco (potexvirus,WCMV) y el del
amarillamiento de las nervaduras
(potyvirus,CYVV) afectan negativamente el
crecimiento y desarrollo de las leguminosas.
Cada uno de ellos infecta individualmente a
un gran nmero de especies distribuidas por
todo el mundo, causando prdidas significativas en leguminosas utilizadas para distintos
fines. El control de estos tres virus podra incrementar la rentabilidad de las industrias
rurales australianas en ms de 860 millones
de dlares. La mayora de los mtodos clsicos utilizados para prevenir las infecciones
virales son laboriosos y econmicamente
inviables. Se han identificado fuentes potenciales de tolerancia o resistencia en alfalfa y
en unas pocas especies de Trifolium, pero
no existe una resistencia natural a estos virus
que sea transferible, efectiva y durable que
pueda ser incorporada a cultivares de leguminosas forrajeras. La tecnologa gnica es
una opcin atractiva para lograr este objetivo, ya que permite sortear barreras
interespecficas, desarrollar resistencias
multignicas y manipular niveles y sitios de
expresin. La transgnesis se ha usado
exitosamente para desarrollar resistencia
efectiva y durable en un amplio rango de es-
Las plagas pueden daar a las plantas

directamente, por consumo del follaje y races o indirectamente, por transmisin de
patgenos a estas durante su accionar sobre la planta. En pasturas infectadas por densas poblaciones de insectos plaga se producen disminuciones en la produccin de materia seca que van del 20 al 40%.
Varios insectos como Wiseana spp,
Costelytra zealandica, Teleogryllus
commodus, Sminthurus viridis, Sitona spp,
Coleophora spp, Inopus rubriceps y
Acyrthosiphon spp pueden causar daos significativos a leguminosas y gramneas. A fin
de incrementar la resistencia a los mismos se
han utilizado distintos enfoques transgnicos.
Uno de ellos es la utilizacin de la protena
cristalina e inhibidores de proteasas de
Bacillus thuringiensis (Bt). Para una revisin
del tema pueden consultarse a Voisey et al.
(1994), Strizhov et al. (1996) y Voisey et al.
(2000).
Como ejemplo cabe citar la obtencin de
plantas de trbol blanco que expresan un
gen quimrico Bt cry1Ba modificado y acumulan en las hojas la delta-endotoxina
Cry1Ba a niveles del 0,1% de protena soluble. La alimentacin de larvas de Wiseana con
hojas de estas plantas promueve una inhibicin en la ingesta, reduccin en el crecimien-
272
SPANGENBERG, Germn
to de la larva y una mayor mortalidad de estas cuando se la compara en la misma situacin utilizando plantas control .
Otro ejemplo lo constituye la utilizacin
de inhibidores de proteasas, tales como el
inhibidor de tripsina pancretica bovina o
aprotinina en trbol blanco, donde la expresin en hoja de aprotinina a niveles de 0,07%
de protena soluble reduce el ataque por las
larvas de Wiseana.
Otra estrategia para proteger contra insectos plaga sera la transformacin indirecta en gramneas, utilizando un endfito (microorganismo que vive y se desarrolla dentro
de los tejidos de la planta) transformado,
como Neotyphodium. Esto permitira obtener cepas del endfito seguras para los rumiantes que las consuman, que expresen y
secreten protenas insecticidas tales como
toxinas Bt e inhibidores de proteasas que
protejan a las gramneas forrajeras de las plagas.
2.3 Crecimiento y desarrollo
2.3.1 Manipulacin de alrgenos del
polen
La fiebre del heno y el asma alrgico
estacional debido al polen de las gramneas
son enfermedades ambientales que afectan
hasta el 25% de la poblacin en climas templado-fros. El polen de raigrs es uno de los
ms abundantes en estas regiones, siendo
el principal alrgeno para el 49-67% de los
pacientes alrgicos. Este polen contiene por
lo menos 4 clases principales de protenas
alergnicas, cada una de las cuales est
constituda por mltiples isoformas
inmunolgicamente indistinguibles que
involucran 17 alrgenos que tienen un tamao que va de 12 a 89 kDa. Al menos una protena de cada una de estas clases ha sido aislada y caracterizada en detalle. Se han aislado clones de ADNc para el principal alrgeno
del raigras Lolp1, Lolp2 y Lolp5. En 1997 se
obtuvieron las primeras plantas transgnicas
de raigrs perenne (Lolium perenne) y de
raigrs Italiano (Lolium multiflorum) que llevan genes para Lolp1 y Lolp2 en antisentido,
bajo el control de un promotor especfico del
polen a fin de regular negativamente los
alrgenos del mismo. Estas plantas permitirn estudiar el rol funcional in planta de es-
tos alrgenos y permitirn explorar el potencial para la obtencin de cultivares de raigrs

hipoalergnico.
Ms recientemente se obtuvieron plantas de raigrs anual (Lolium rigidum) que
portan en antisentido un gen quimrico
Lolp5.
2.3.2 Manipulacin de cambio de fase y
floracin
La disminucin del valor nutritivo en algunas forrajeras perennes se encuentra asociada con el comienzo del crecimiento de las
caas florales, la floracin y la senescencia.
La calidad del forraje podra mejorarse, por
lo tanto, inhibiendo la produccin de caas
florales, que son poco digeribles, o retardando la senescencia.
Se han informado modificaciones en el
tiempo de floracin en plantas transgnicas
a travs de la regulacin de la expresin de
genes involucrados en la iniciacin del
meristema floral. La expresin constitutiva de
genes de Arabidopsis thaliana como LEAFY
o APETALA1 conducen a un desarrollo precoz, como se ha observado en plantas
transgnicas de lamo. En A. thaliana, mutaciones en uno o ms de los genes
involucrados en la determinacin de identidad del meristema floral conducen a un desarrollo floral incompleto o nulo. Esto ha llevado a pensar en la posibilidad de controlar
o inhibir la floracin en forrajeras transgnicas regulando negativamente la expresin
de este tipo de genes, tales como los
ortlogos (genes que tienen la misma estructura y funcin y un origen comn) de LEAFY
o APETALA1.
Otro blanco para la manipulacin del desarrollo reproductivo en forrajeras es el gen
INDETERMINATE1 (ID1). Este gen desempea un rol importante en el control de la iniciacin floral y en el mantenimiento de un
estado floral determinado en maz. Su mutacin es la nica conocida en monocotiledneas que bloquea especfica y severamente la transicin hacia un crecimiento reproductivo. Recientemente fue aislado y caracterizado un ADNc de plantas de raigrs perenne homlogo de este gen. Se espera que
la inhibicin de la transicin de un estado
vegetativo a la formacin de caas florales e
inflorescencias en gramneas incremente la
273
calidad del forraje y, en consecuencia tambin disminuya la cantidad de alergenos del

polen.
La inhibicin o el control de la floracin
en forrajeras transgnicas a travs de la supresin antisentido de ortlogos de ID1 o
LEAFY y APETALA1 podra conducir a incrementos en la calidad y a una mejora en los
patrones de crecimiento estacional. Por otro
lado, representara una va para la contencin de transgenes. Para la produccin de
semilla este bloqueo de la floracin debera
ser revertido. Una posibilidad para lograr este
fin sera la utilizacin de un promotor
inducible por cobre, por ejemplo, que controlara la supresin de ortlogos de estos
genes.
Se han utilizado diferentes enfoques para
la manipulacin del desarrollo reproductivo
que podran conducir a un bloqueo de la floracin, al desarrollo de la apomixis (tipo de
reproduccin agmica comn en ciertas especies de gramneas, ver VIII.3) y a la
androesterilidad (esterilidad de la parte
masculina de la planta), que adems posibilitaran el mantenimiento de los transgenes.
Esto es de particular importancia para
forrajeras transgnicas de polinizacin abierta, mediada por el viento, ya que la dispersin del polen es un factor importante en la
evaluacin de riesgo de las gramneas
genticamente modificadas.
2.3.3 Manipulacin de la senescencia
Se ha observado en plantas transgnicas
que la produccin autorregulada de
citocininas conduce a la inhibicin de la
senescencia foliar (envejecimiento de la hoja
que culmina en la muerte de la misma). Este
sistema se basa en la utilizacin de un promotor especfico de senescencia de A.
thaliana, el SAG12, que controla la expresin
transgnica de un gen para la isopentenil
transferasa (ipt) de Agrobacterium
tumefaciens, que cataliza un paso en la
biosntesis de citocininas. Las plantas que
expresan este gen presentan un retraso en
la senescencia foliar y no presentan anomalas de ningn tipo. En trbol blanco genes
anlogos de ipt quimricos, bajo el control
de promotores regulados por desarrollo, asociados a senescencia, provocan un retardo
274
significativos en la senescencia y su aspecto

es completamente normal.
2.4 Agricultura molecular
Las plantas transgnicas pueden ser utilizadas para expresar protenas recombinantes heterlogas, siendo esta una alternativa atractiva para la produccin de biomolculas en reemplazo de los sistemas
microbianos. La perennidad, la produccin
potencial de biomasa, la capacidad de fijar el
nitrgeno biolgico y la habilidad para crecer en reas marginales que poseen las
forrajeras, en particular las leguminosas, las
hace atractivas para este fin. La disponibilidad de tecnologas que permitan elevados
niveles de expresin y contencin de los
transgenes permitiran utilizar a las forrajeras
como biorreactores para la obtencin de
enzimas industriales, productos farmacuticos, vacunas, anticuerpos y plsticos
biodegradables. La alfalfa tiene ciertas caractersticas que la convierten en un interesante biorreactor. Entre ellas se destacan la perennidad y la capacidad de producir dos
tres cosechas en el ao, existiendo adems
la tecnologa adecuada para extraer las protenas de inters dejando un residuo utilizable para la alimentacin del ganado. Se han
desarrollado y evaluado plantas de alfalfa
transgnicas productoras de enzimas
microbianas involucradas en la degradacin
industrial de lignina y celulosa, entre otros.
Este cultivo tambin ha sido utilizado para la
produccin de polmeros biodegradables
como el polihidroxibutirato (PHB) mediante
la introduccin de tres genes de Ralstonia
eutropha.
2.5 Evaluacin a campo de plantas
forrajeras transgnicas
A fin de determinar la estabilidad en la
expresin de los transgenes, evaluar los nuevos fenotipos e identificar los eventos de
transformacin adecuados para el desarrollo de germoplasma y cultivares transgnicos
es necesario realizar ensayos de campo planificados, en principio en pequea escala.
Solo despus de haber realizado estas evaluaciones se pueden integrar estos materiales en programas de mejoramiento
molecular para el desarrollo de cultivares
SPANGENBERG, Germn
transgnicos. Un ejemplo ilustrativo de un

diseo para ensayos de campo en escala reducida es el de plantas transgnicas de trbol blanco inmunes al virus del mosaico de la
alfalfa. En este ensayo se tuvieron en cuenta
importantes caractersticas de bioseguridad,
como por ejemplo la presencia de una zona
de dos hectreas sembradas con leguminosas forrajeras que se sabe que no se cruzan
con el trbol blanco. El uso de leguminosas
forrajeras como el trbol rojo, trbol de Persia
y alfalfa en esta zona buffer, sembradas
en bandas alternadas, asegura que haya un
elevado nmero de leguminosas no
transgnicas floreciendo en el ensayo en el
perodo crtico en que estn floreciendo las
plantas transgnicas motivo del experimento. Las dimensiones de esta zona buffer
Figura 1: Transformacin de trbol blanco para

resistencia virus. A-H) Sistema prolfico de
regeneracin de plantas resistentes al virus del
mosaico de la alfalfa (AMV) y al virus del mosaico del
trbol blanco (WCMV) a partir de explantos
cotiledonales. La transformacin se llev a cabo
utilizando Agrobacterium tumefaciens, utilizando
npt2 como marcador de seleccin. I) T-ADN del vector
binario conteniendo el gen quimrico npt2 y el gen de
la protena de la cpside del wcmv4 (wcmv4) J)
Anlisis por PCR para la identificacin preliminar de las
plantas transformadas utilizando cebadores (primers)
para el gen npt2. K) Idem anterior pero utilizando
cebadores para el gen wcmv. L) Anlisis por el mtodo
de Southern utilizando el gen wcmv4 como sonda. M)
Anlisis por el mtodo de Northern de plantas
transgnicas de trbol blanco expresando el gen
quimrico wcmv4.
275
Figura 3: A) Esquema de la liberacin a campo, a pequea escala, de plantas transgnicas de trbol blanco inmunes
a AMV. B) Estrategia para el desarrollo de germoplasma elite transgnico de trbol blanco inmune a AMV, basada
en la utilizacin de PCR cuantitativa para detectar las plantas homocigotas para los transgenes (npt2 y AMV4).
fueron diseadas teniendo en cuenta consideraciones tales como la conducta de las

abejas como polinizadoras del trbol blanco, la dispersin del polen, y determinaciones de flujo gnico utilizando un gen marcador de fcil trazabilidad, denominado
Feathermark. A fin de determinar el flujo
gnico, dos hileras de trbol blanco no
transgnico se incluyeron en el diseo rodeando el permetro del ensayo y las parcelas centrales con las plantas transgnicas. Las semi-
276
llas cosechadas de las plantas de trbol blanco no transgnico de estas dos hileras se
analizaron utilizando una combinacin de
resistencia a antibitico (resistencia a G418
mediada por un gen npt2 ubicado en el ADNT integrado en el genoma de las plantas
transgnicas) y PCR para detectar la presencia del gen marcador de seleccin. Los resultados de este anlisis confirmaron que este
diseo de campo es adecuado para la evaluacin de plantas transgnicas (Fig. 3 A).
SPANGENBERG, Germn
2.6 Integracin de plantas forrajeras

transgnicas en programas de
mejoramiento y desarrollo de cultivares
transgnicos
Los ejemplos citados ms arriba acerca del
desarrollo de una serie de eventos de transformacin en leguminosas y gramneas
forrajeras constituyen una prueba fehaciente de la funcionalidad de esta tecnologa. El
desafo actual es utilizar esta tecnologa y las
herramientas moleculares actuales para transferir genes valiosos de manera mltiple o individual a fin de obtener nueva variabilidad
gentica y nuevo germoplasma transgnico
lite e incorporar eficientemente estos factores en programas de mejoramiento para
la obtencin de cultivares. Se han desarrollado estrategias eficientes para la introgresin
de transgenes en parentales lite para la
obtencin subsecuente de cultivares sintticos (polihbridos), asegurando la expresin
estable y uniforme del transgn en todas las
plantas de la poblacin (Fig. 3B).
En la Fig. 3B se muestra la estrategia utilizada para la obtencin de plantas de trbol
blanco elite inmunes a AMV, homocigotas
para los transgenes. Involucra cruzas iniciales
de los eventos de transformacin elegidos
luego de su evaluacin a campo con plantas
elite no transgnicas (Estado 1); seleccin por
resistencia a antibitico de la progenie que
lleva el transgen y est ligado al gen marcador npt2, o anlisis por PCR, seguido por cruzas diallicas entre la progenie T1 (Estado
2). Identificacin por PCR cuantitativa o cruza de prueba de las plantas T 2 que son
homocigotas para los transgenes (Estado 3).
Las plantas lite de trbol blanco homocigticas para los transgenes son entonces
sembradas para su seleccin en un criadero
junto con lneas parentales lite no transgnicas. De esta manera se identificarn los
nuevos parentales de los cultivares sintticos
transgnicos experimentales, que posteriormente sern evaluados en distintos ambientes.
3 Genmica
El mejoramiento de la plantas forrajeras
ha entrado en la era genmica, lo cual significa que se cuenta con gran cantidad de nuevas herramientas y tecnologas para el descubrimiento de genes y para el anlisis glo-
bal de los genomas. Todo esto aportar informacin acerca de todos los aspectos del
crecimiento vegetal, desarrollo, diferenciacin
y respuestas a estreses biticos y abiticos,
revolucionando el mejoramiento vegetal y la
produccin. Cientos de miles de etiquetas de
secuencias expresadas (ESTs) han sido el
punto de partida para dilucidar la funcin de
miles de genes vegetales y se han creado
bases de datos de las mismas provenientes
de los principales cultivos. Esto posibilitar la
identificacin, caracterizacin funcional y uso
de genes valiosos para los sistemas de produccin de forraje.
3.1 Descubrimiento de genes y
micromatrices (microarrays) para el
anlisis de la expresin de genes en
plantas forrajeras
Las especies modelo para las cuales se han
encarado proyectos de genmica basados
fundamentalmente en el descubrimiento de
ESTs son Lotus japonicus y Medicago
truncatula. Aproximadamente 80.000 ESTs
de la ltima han sido generados por consorcios internacionales financiados por el French
Centre National de Sequencage, la
International Human Frontier Science
Program Organization, la Samuel Roberts
Noble Foundation, Stanford University, el US
National Science Foundation Plant Genome
Program y el US Deparment of Energy
Biosciences Program.
Un programa asociado entre Agriculture
Victoria-DNRE (Australia) y AgResearch
Limited (Nueva Zelanda) gener aproximadamente 100.000 ESTs de cultivos forrajeros
clave para la agricultura de clima templado,
como son el raigrs perenne (L. perenne) y
el trbol blanco (T. repens). Para ello se
secuenciaron a gran escala clones seleccionados al azar de genotecas de ADNc que representaban un amplio rango de rganos,
estados de desarrollo y tratamientos experimentales. Fueron generadas, 49503 secuencias de ADN de raigrs perenne, analizadas
por bsqueda de BLAST (Ver VII-3) y
categorizadas funcionalmente .
Dentro de este programa se realizaron
micromatrices de ADNc de alta densidad (con
4000-5000 gotas/arreglo) para su utilizacin
en la identificacin de secuencias de trboles
y raigrases (Fig. 4, ver pg. 13).
277
Dentro de las aplicaciones de estos

micromatrices basados en ESTs de plantas
forrajeras se encuentra la fenotipificacin
molecular. Esto comprende el anlisis de patrones de expresin global o patrones de
expresin especficos utilizando hibridacin
con sondas complejas de genotipos
contrastantes o poblaciones y ambientes
contrastantes. Todo esto puede utilizarse
para integrar los datos de micromatrices con
aquellos de seleccin fenotpica convencional.
El anlisis comparativo de secuencias y
datos de micromatrices de raigrs y trboles
con aquellos de Arabidopsis y arroz, conjuntamente con los programas de descubrimiento de ESTs en M. truncatula, aportarn informacin acerca de los aspectos conservados y divergentes en la organizacin y funcin del genoma gramneas y leguminosas.
3.2 Simbio y patogenmica
Las leguminosas y gramneas ofrecen la
posibilidad de estudiar a nivel genmico
interacciones de distinto tipo, como por
ejemplo planta-patgeno, simbiosis leguminosa/bacteria fijadora de nitrgeno, asociaciones leguminosa/microrriza y endosimbiosis gramnea/endfito. La informacin obtenida en estos estudios ser de gran
valor para desarrollar resistencia a patgenos
y mejorar las asociaciones beneficiosas en las
forrajeras.
El trabajo de descubrimiento de genes en
M. truncatula est orientado a estudiar la
respuesta de la planta ante los patgenos y
a caracterizar diferentes sistemas patognicos que incluyen patgenos fngicos tales
como Colletotrichum trifolii y Phytophthora
medicaginis y patgenos bacterianos como
Xylella fastidiosa y Xanthomonas alfalfae.
Para mediados del 2000 el US M. truncatula
Functional Genomics Project gener 27.000
secuencias de DNA que incluan 2.828 ESTs
de hojas infectadas con Colletotrichum,
2.462 ESTs de hojas infectadas con
Phytophthora, 3.259 ESTs de micorrizas de
raz y aproximadamente 9.500 secuencias de
raz en diferentes tiempos despus de la inoculacin con Sinorhizobium meliloti y de
ndulos maduros y senescentes.
Existe un proyecto de genmica funcional integrado tendiente a dilucidar los even-
278
tos conducentes a la nodulacin en las leguminosas utilizando L. japonicus como modelo. Este proceso de nodulacin involucra la
interaccin compleja entre genes bacterianos
y sus productos con procesos de desarrollo
en la planta que involucran percepcin y
transmisin de seales y morfognesis. El
objetivo es comprender mecanismos
genticos de la planta involucrados en esta
simbiosis a fin de mejorar las asociaciones naturales beneficiosas para la agricultura y el ambiente. Este y otros recursos genticos de M.
truncatula y L. japonicus contribuirn
significativamente a conocer y comprender
las respuestas a patgenos y estrs y las
interacciones de la rizsfera con las leguminosas forrajeras.
Agriculture Victioria-DNRE tambin ha
encarado un programa de genmica de
endfitos de gramneas focalizado en el descubrimiento de genes gramnea-endfito en
la asociacin Festuca arundinacea/
Neotyphodium coenophialum. A travs de
este programa se han generado aproximadamente 8.000 secuencias del hongo que se
analizaron por bsqueda de BLAST y se caracterizaron funcionalmente. El principal inters est dirigido al descubrimiento de
genes involucrados en la colonizacin del
husped, en el aporte de nutrientes para el
hongo endoftico y en la biosntesis de
metabolitos secundarios activos de
pirrolopirazina y pirrolizidina (los repelentes
de insectos peramina y N-formilolina respectivamente) y su regulacin. Este proyecto
tambin aportar informacin acerca de la
interaccin endfito-husped as como de los
mecanismos fisiolgicos conducentes a un
incremento en el vigor de la planta y a una
mayor tolerancia a estreses. Estas herramientas genmicas y el conocimiento generado
posibilitarn el desarrollo de tecnologas para
manipular las asociaciones gramnea-endfito
a fin de incrementar el rendimiento de la planta, mejorar la tolerancia a estreses biticos y
abiticos y alterar la especificidad endfitohusped a fin de beneficiar a las industrias
semilleras de pasto para csped y forrajes.
En otro proyecto similar se ha tratado de
aislar y caracterizar genes involucrados en la
biosntesis de indol-diterpenos y ergopeptinas responsables de la toxicosis animal en
la asociacin Lolium perenne-N. Lolii. La pro-
SPANGENBERG, Germn
Figura 4: A) Perfiles de expresin a travs de micromatrices de ADN utilizando dos colorantes fluorescentes (Cy5 y
Cy3) para marcar dos muestras de RNA total provenientes de distintas situaciones de crecimiento o desarrollo, por
ejemplo plantas creciendo en luz (Cy3) y plantas creciendo en oscuridad (Cy5). Luego de la hibridacin, los puntos
marcados en verde indican los genes que se encuentran regulados positivamente cuando las plantas se encuentran
en condiciones de luz, aquellos marcados en rojo corresponden a los regulados positivamente cuando se hallan en
oscuridad y los que estn en amarillo corresponderan a aquellos genes que estn regulados positivamente en
ambas situaciones. C) Micromatrices de ADNc de trbol blanco utilizando RNA de hojas y raz. Confirmacin por
Northern de la expresin de los genes para la dihidroflavonol reductasa y una protena embrinica.
teccin de los meristemas de Lolium de un

exceso de herbivora es vital para el xito
reproductivo y la distribucin de esta y otras
especies de gramneas. El desarrollo de asociaciones simbiticas entre gramneas y
endfitos del grupo Epichlo/Neotyphodium
representa una forma nica de proteccin
donde los genomas del husped y el

simbionte han co-evolucionado para beneficio mutuo. El hongo le aporta proteccin al
husped a travs de la produccin de
metabolitos bioprotectores en retribucin
por los nutrientes para su crecimiento. Estos
compuestos son txicos para los mamferos.
279
a estreses abiticos permitir la

identificacin de redes de genes
asociados con estreses ambientales tales como alta salinidad, sequa y bajas temperaturas, as
como la determinacin de vas
bioqumicas conserva-das.B) Anlisis de la imgen de micromatrices
de etiquetas expresadas de ADN
(ESTs) (ImaGene Software).
involucradas en las respuestas a
estreses.
La investigacin genmica utilizando especies vegetales exticas, conocida como xenogenmica, incluye el descubrimiento de
genes a travs del secuenciado de
ESTs a gran escala y el anlisis de
la expresin global de genes con
micromatrices basados en las mismas. Esto posibilitar la obtencin
de genes clave y variantes de
genes de plantas tolerantes a
estreses abiticos extremos, muchos de ellos nuevos, y la determinacin de sus patrones de expresin en respuesta a estreses
abiticos especficos.
Un programa de xenogenmica llevado a cabo por
Agriculture Victioria-DNRE se encuentra abocado a seleccionar
.B) Anlisis de la imgen de micromatrices de etiquetas expresadas
gramneas y leguminosas austrade ADN (ESTs) (ImaGene Software).D) Perfiles de expresin de genes
lianas nativas y exticas, adaptade raigrs, comparando genes que se expresan en tallo y raz.
das a estreses ambientales extreEl clonado de los genes de estas vas mos. En este marco se estn aislando y cametablicas es un objetivo importante ya racterizando aquellos genes que permiten a
que se conoce poco acerca de la enzimologa, estas especies tolerar estreses abiticos como
de la biosntesis de toxinas y de las condicio- sequa, salinidad y suelos de baja fertilidad.
nes para la sntesis endoftica de estos Entre las especies estudiadas se incluyen
metabolitos ex planta. En este sentido se gramneas australianas nativas, tales como
han logrado avances al clonar un conjunto las halotolerantes Agrostis adamsonii y A.
de genes responsables de la sntesis de robusta y la especie tolerante a aluminio
ergopeptina y ergotamina de Claviceps Microlaena stipoides. Tambin incluye espepurpurea y de paxilina, un indol-diterpeno cies exticas como Deschampsia antarctica,
estrechamente relacionado al lolitremo B de una de las dos nicas plantas vasculares nativas de la Antrtida.
Penicillum paxilli.
Estos descubrimientos facilitarn el desarrollo
de estrategias efectivas de mejoramien3.3 Xeno-genmica
to molecular que permitirn incrementar la
La genmica comparativa basada en el tolerancia a estreses abiticos en forrajeras
anlisis de ESTs de varias plantas tolerantes y otros cultivos.
280
SPANGENBERG, Germn
4 Resumen y conclusiones
En los ltimos aos se ha realizado un
considerable progreso en el establecimiento
de las metodologas requeridas para el mejoramiento molecular de plantas forrajeras.
Numerosas estrategias biotecnolgicas estn
siendo consideradas en relacin al mejoramiento de la calidad nutritiva a travs de la
alteracin de la biosntesis de lignina,
carbohidratos solubles y protoantocianas y
de la expresin regulada de protenas ricas
en aminocidos esenciales, resistentes al
rumen. Tambin se pretende incrementar la
resistencia a patgenos y plagas, manipular
el crecimiento y desarrollo a fin de incrementar la persistencia y demorar la senescencia,
impedir la floracin y regular negativamente
los alrgenos del polen. Las primeras plantas
forrajeras transgnicas han sido evaluadas a
campo y eventos de transformacin seleccionados se han utilizado para el desarrollo de
cultivares.
Las herramientas genmicas permitirn
comprender mejor la gentica, fisiologa y
bioqumica de varios procesos vegetales complejos y acelerar la aplicacin de estrategias
de tecnologa gnica para el mejoramiento
de plantas forrajeras.
La aplicacin de herramientas y
metodologas moleculares para el mejoramiento de estas especies reemplazar en
gran medida la seleccin emprica basada en
el fenotipo por otra ms directa y predecible,
basada en el genotipo. Sin embargo, estas
estrategias son promisorias solamente cuando se las considera dentro de un programa
de mejoramiento. Los programas ms
exitosos sern aquellos que incluyan un equipo multidisciplinario conformado por
mejoradores, bilogos moleculares y celulares, bioqumicos, patlogos, agrnomos, expertos en nutricin animal y que adopten las
nuevas tecnologas gnicas, de genmica funcional, bioinformtica y de fenotipificacin y
que las apliquen de manera apropiada para
resolver problemas especficos. El esfuerzo de
tales equipos integrados ser crtico para el
desarrollo de cultivares destinados al mercado y para el desarrollo de plantas forrajeras
destinadas a otros usos.
La genmica vegetal tendr un rol vital al
acelerar la aplicacin de la biotecnologa para
la agricultura de forrajes y pastizales. La in-
vestigacin genmica en las plantas forrajeras

permitir el desarrollo de tecnologas que van
ms all de los sistemas de produccin de
forrajes, incrementando significativamente el
valor de las semillas y de los productos agrcolas. Infinidad de genes vegetales sern un
recurso invalorable para ser insertados en
muchas plantas de cultivo utilizando tecnologa gnica y para ser utilizados como marcadores en seleccin asistida. Esto incrementar la eficiencia y la eficacia de los programas de mejoramiento vegetal.
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Chapter 14 (in press).
VIII.-Captulo 3
Manipulacin de la Apomixis y su
Aplicacin en la Agricultura
Ortiz, Juan Pablo A.; Pessino, Silvina C.;
Quarin, Camilo L.
1 Qu es la apomixis?
Algunas plantas con flores presentan un
modo asexual de reproduccin llamado
apomixis. ste consiste en la formacin de
semillas que contienen embriones
genticamente idnticos a la planta madre,
generados sin que intervengan los procesos
de meiosis y fecundacin. La apomixis fue
descripta por primera vez en 1841 en la planta
australiana Alchornea ilicifolia por J. Smith.
Cuando un ejemplar femenino de esta especie dioica fue llevado a los Kew Gardens de
Londres desde Asia, la planta aislada floreci
y produjo semillas en abundancia, poniendo
al carcter en evidencia. Paradjicamente, los
primeros experimentos con plantas
apomcticas fueron realizados en forma
involuntaria por Gregor Mendel, quien utiliz cruzas entre especies del gnero
Hieracium para intentar confirmar los resultados obtenidos en sus famosos estudios
sobre la herencia de las arvejas de jardn.
Mendel atribuy errneamente a una supuesta frecuente autopolinizacin la falta
de segregacin observada. Hoy sabemos que
muchas especies de este gnero son
apomcticas.
Se considera que la apomixis ha evolucionado como un sistema de reproduccin alternativo a la sexualidad a travs de la
reformulacin de sus programas de desarrollo. Por lo tanto, para comprender su funcionamiento es necesario compararlo con el de
la reproduccin sexual. La sexualidad en las
angiospermas comprende la alternancia cclica entre los estados de esporfto (la planta
misma, 2n) y gametfito (el grano de polen
y el saco embrionario, n). La meiosis que ocurre en las flores posibilita la recombinacin y
reduccin del contenido gentico y da lugar
a la formacin de las esporas femeninas
(megsporas) en el ovario y masculinas
(micrsporas) en las anteras. La megaspo-
rognesis genera cuatro clulas haploides,

tres de las cuales degeneran. La restante
constituye la megspora funcional, que por
el proceso de megagametognesis desarrolla un megagametfito conocido como saco
embrionario. El tipo de saco embrionario
ms comn entre las angiospermas (conocido como Polygonum) est formado por 8
ncleos haploides (n) contenidos en siete
clulas, a saber: la ovoclula, dos sinrgidas,
una clula central binucleada, y tres antpodas. Por otra parte, las micrsporas desarrollan los granos de polen mediante un proceso de microgametognesis. El polen maduro
est tpicamente integrado por tres clulas
haploides (n), dos de las cuales constituyen
los gametos masculinos. La otra tiene una
funcin relacionada con el crecimiento del
tubo polnico.
La formacin de la semilla requiere previamente de un proceso de doble fecundacin: un gameto masculino (n) se fusiona con
la ovoclula (n) para originar al cigoto (2n). A
partir de este cigoto se desarrolla el embrin.
La clula central del saco embrionario con sus
dos ncleos (n + n) se fusiona con el otro
gameto masculino para originar el
endospermo. As, la fusin de dos gametos
haploides nicos derivados de la distribucin
al azar del material gentico durante las
meiosis masculina y femenina resulta en la
generacin de progenies genticamente diversas. En resumen, en la reproduccin sexual
la meiosis produce la recombinacin gnica
de los caracteres de ambos progenitores y
genera gametos haploides. La fecundacin
fusiona de manera aleatoria un gameto masculino con uno femenino para originar un
nuevo individuo con una constitucin
gentica nica.
La apomixis elude la ruta sexual evitando
la reduccin meitica y la fecundacin. El vulo desarrolla una semilla cuyo embrin contiene exactamente el mismo genotipo que
la planta que lo origina. Por lo tanto este
carcter (tambin llamado agamospermia)
ha sido definido como reproduccin asexual
a travs de semillas. Fue descripto en ms
de 400 especies de plantas pertenecientes a
35 familias diferentes, entre las que se destacan las Gramneas, las Compuestas, las
Rosceas y las Rutceas. Presenta formas diferentes y parece haber surgido varias veces
283
en forma independiente durante la evolucin. Brevemente, los embriones apomcticos

pueden formarse a travs de una ruta
esporoftica o gametoftica. En la primera,
tambin llamada embriona adventicia, los
embriones surgen directamente de una clula somtica de la nucela o de los tegumentos
del vulo. Comnmente se forman embriones mltiples a partir de clulas nucelares
(esporofticas) que comparten el vulo junto
con el embrin de origen sexual y utilizan su
endospermo para desarrollarse. Esta forma
de apomixis aparece comnmente en los ctricos, los cuales se convirtieron en un sistema modelo para estudiar el proceso. En la
apomixis gametoftica se forman siempre
sacos embrionarios que difieren en algunos
aspectos del gametfito femenino haploide
(n) generado a partir de la megspora funcional. Su principal diferencia es precisamente el hecho de ser diploides (2n) ya que los
ncleos que los conforman no han pasado
por el proceso meitico y por lo tanto no han
reducido su contenido de ADN. Por eso se
dice que estos sacos embrionarios o
megagametfitos surgen por un proceso de

apomeiosis (apo: prefijo griego de significacin negativa). De acuerdo con el origen de
la clula que genera al saco embrionario y al
embrin, la apomixis gametoftica puede ser
clasificada como: diplospora, cuando el saco
embrionario se origina a partir de la clula
madre de la megspora misma ya sea por
mitosis o luego de una falla en la meiosis o
apospora, cuando el saco embrionario se
origina directamente por mitosis a partir de
una clula somtica, usualmente una clula
de la nucela. Los sacos embrionarios, sean
stos apospricos o diplospricos, contienen
un gameto femenino 2n, la ovoclula, a partir de la cual se desarrolla directamente el
embrin por partenognesis sin que exista
fecundacin. As, mientras en el proceso
sexual la reduccin meitica se complementa con la fecundacin que restaura el nivel
de ploida 2n, en la apomixis gametoftica la
ausencia de reduccin se complementa con
la partenognesis. La apomixis gametoftica
fue estudiada ms profundamente que la
apomixis esporoftica, principalmente por
Meiosis
Clula madre de la megspora
o meiosis
Mitosis
modi
Mitosis
Mitosis
Clulas somticas
ficad
Megasporas
haploides (n)
Megagametofito
no reducido (2n)
ac
i
somtica
d
un
fec
o
a
om
ci
t n
n au
da
Esporofito (2n)
Divisi
Endosperma
in
ss
osi
Mit
Embrin
tosi
s
Megagametofito reducido (n)
Grano
de polen
is
tos
Mi
Mi
n
cu
fe
Doble fecundacin
Figura 1: La rutas biolgicas de la reproduccin sexual y apomctica. Durante la sexualidad una clula de la
nucela del vulo se diferencia como clula madre de la megspora y luego de sufrir un proceso de meiosis da origen
a cuatro megsporas haploides. Tres de estas megsporas degeneran y la cuarta da origen a la formacin de un saco
embrionario luego de una serie de mitosis, donde todos los ncleos celulares estn reducidos (n). La ovoclula y los
ncleos polares del saco son fecundados por los ncleos generativos del polen para generar el cigoto y el ncleo
primario del endosperma, respectivamente. El cigoto da origen al embrin a travs de sucesivas mitosis. La apomixis
consiste en la formacin de un embrin a partir de una clula no reducida (que no ha sufrido mitosis). En algunos
casos hay formacin de un megagametofito con clulas no reducidas, cuya ovoclula (2n) genera un embrin por
partenognesis (apomixis gametoftica). En otros casos el embrin es generado directamente a partir de una clula
de la nucela en un proceso similar a la embriognesis somtica (embriona adventicia).
284
ORTIZ, J.P.A.; PESSINO, S.C.; QUARIN, C.L.
ser el tipo presente en las gramneas, donde

muchas especies con valor agronmico presentan este modo de reproduccin. Un esquema de las diferentes rutas posibles que
puede tomar la apomixis se muestra en la
Figura 1.
Recordemos que en las angiospermas
existe una doble fecundacin. En la apomixis
gametoftica la partenognesis excluye uno
de los procesos de la doble fecundacin: la
unin de los gametos masculinos con los femeninos. Sin embargo no necesariamente se
anula la fecundacin de los ncleos polares.
Aunque en algunos casos el endospermo
puede desarrollarse en forma autnoma (sin
la unin de un gameto masculino con los
ncleos polares del saco embrionario
aposprico o diplosprico) en muchas especies apomcticas, como en la mayora de las
gramneas tropicales, es necesario que un
gameto masculino se fusione con el o los
ncleos polares de la clula central del saco
embrionario para formar el endospermo. A
este proceso se lo llama pseudogamia.
Los sacos embrionarios diplospricos conservan la tpica estructura de los sacos
embrionarios de origen meitico, generalEsporognesis
mente con siete clulas y ocho ncleos. Sin

embargo, en la aposporia por lo general tienen una constitucin distinta y muy variable,
tanto en taxones diferentes como dentro de
un mismo taxn. Por ejemplo, en gramneas
tropicales o subtropicales, el saco aposprico
se forma por dos mitosis consecutivas, con
permanencia de los cuatro ncleos en un solo
polo celular. As se organiza un megagametfito con una ovoclula flanqueada por dos
sinrgidas y una clula central uninucleada y
extensamente vacuolizada. Esta estructura
de saco aposprico fue descripta por primera vez para Panicum maximum y por esa razn a los megagametfitos con esta morfologa se los conoce como sacos apospricos
de tipo Panicum. Sin embargo, en las especies apospricas de Paspalum, un gnero
tambin perteneciente a la tribu Panceas
igual que Panicum, existe una caracterstica
en la constitucin de los sacos apospricos
que los diferencia netamente del tipo
Panicum: en Paspalum los sacos generalmente tienen una clula central con dos ncleos
polares y a veces tres. Esta caracterstica es
importante porque debido a la pseudogamia, a veces la relacin genmica materna/paterna del endospermo es distinta en
Gametognesis
n
Mitosis
Meiosis
2n
Me
io
Clula madre
de la megspora
sis
Mitosis
mo
d
ific
ad
a
(tipo A
ntenna
ria)
2n
Mitosis (tipo Taraxacum)
2n
2n
Mitosis (tipo Paspalum)
2n
Clulas
nucelares
Sexualidad
Esporfito
Diplospora
Apospora
Gametfito
Figura 2: Distintos tipos de sacos embrionarios formados durante los procesos de sexualidad y de apomixis
gametoftica. En la sexualidad, la clula madre de la megspora realiza un proceso de meiosis y genera cuatro
megsporas haploides, tres de las cuales degeneran. La cuarta megspora lleva a cabo una serie de tres divisiones
mitticas para formar un saco embrionario reducido y octanucleado. En el proceso de apomixis diplosprica la
clula madre de la megspora realiza una serie de mitosis para generar un saco embrionario no reducido y octanucleado
(tipo Antennaria) o inicia un proceso de meiosis que falla para generar un saco embrionario no reducido y
octanucleado (tipo Taraxacum). En la apomixis aposprica clulas de la nucela cercanas a la clula madre de la
megspora realizan varias mitosis consecutivas para generar un saco embrionario no reducido que puede ser
pentanucleado (tipo Paspalum) y cuya caracterstica ms notable es la ausencia de antpodas.
285
las plantas sexuales y en las apospricas. En

las sexuales, hay una relacin 2/1 materno/
paterno (madre n + n; padre n), mientras que
en las apospricas esa relacin es generalmente 4/1 (madre 2n + 2n; padre n). En
Panicum la relacin es 2/1 tanto en las sexuales como en las apospricas (n + n/n en las
sexuales y 2n/n en las apospricas) (Fig. 2).
2 Otros aspectos substanciales del
carcter apomixis
Hay varias caractersticas particulares de
este modo de reproduccin que merecen ser
remarcadas. Por una parte la apomixis usualmente no altera la formacin del microgametfito y la meiosis ocurre normalmente en
las anteras generando polen perfectamente
viable y reducido. Adems, apomixis y sexualidad no son procesos mutuamente
excluyentes ya que pueden aparecer simultneamente sacos reducidos (meiticos) y no
reducidos (provenientes de apomixis) en una
misma planta, en una misma inflorescencia y
an en un mismo vulo (Fig. 3). Una planta
apomctica capaz de generar al menos una
parte de su progenie por medios sexuales se
conoce como facultativa. Por lo tanto, en los
genotipos apomcticos facultativos las proge-
nies segregan como clases maternas (2n + 0)

y no-maternas o aberrantes. Hay tres tipos
diferentes de individuos aberrantes que pueden encontrarse en la progenie de una planta apomctica: 1) hbridos BIII (2n + n) que
resultan de la fecundacin de una ovoclula
no reducida, 2) hbridos BII (n + n) que resultan de la fecundacin de una ovoclula reducida y 3) haploides (n + 0) generados por partenognesis a partir de una clula huevo reducida.
Por otra parte, la apomixis gametoftica
se relaciona siempre con la poliploida. En
general aparece en especies que presentan
razas de bajos niveles de ploida (usualmente diploides) que se reproducen por sexualidad y otras de mayor nivel de ploida (por
ejemplo tri, tetra o pentaploides) que se reproducen por apomixis. Estos complejos integrados por individuos sexuales y
apomcticos de distinto nivel de ploida se
conocen como complejos agmicos y se
consideran estructuras reproductivas complejas y evolucionadas donde la sexualidad permite la generacin de nuevos genotipos y la
apomixis la propagacin clonal muy eficiente
de las combinaciones genticas superiores.
Existen evidencias que sugieren que la diversidad generada a niveles menores de
ploida puede ser impulsada hacia los niveles
Figura 3:
Microfotografas de
secciones de vulos
de razas
tetraploides de
Paspalum notatum.
A: vulo
conteniendo un
saco embrionario
meitico (las dos
sinrgidas y
algunas de las
antpodas no se
observan porque
estn en una
seccin adyacente
del corte del
vulo). B: vulo
conteniendo dos
sacos embrionarios
apospricos.
Referencias: a,
antpodas; e, clula
huevo, p, ncleos
polares; barra = 30
micras
286
poliploides por medio de eventos sucesivos

de hibridizacin 2n + n.
3 Mejoramiento gentico de especies
naturalmente apomcticas
Algunas especies apomcticas tienen un
valor agronmico muy importante, como es
el caso de varias gramneas forrajeras, los
citrus, el mango y las fresas. Hasta el presente, slo se dispone de programas de mejoramiento avanzados en algunas gramneas
forrajeras entre las que se encuentran especies de los gneros Brachiaria, Cenchrus,
Eragrostis, Panicum, Paspalum, Pennisetum
y Poa. En principio, las plantas apomcticas
facultativas pueden ser mejoradas por
metodologas de cruzamiento convencionales, ya que producen al menos algunos sacos
embrionarios meiticos que posibilitan la hibridacin y seleccin. En cambio en los
apomcticos obligados, que se reproducen
completamente o casi completamente en
forma clonal, la hibridacin y el anlisis de
segregacin son impracticables. Las progenies
de tales plantas exhiben siempre el fenotipo
materno o pueden ocasionalmente aparecer
variantes que probablemente surjan de mutaciones ms que de segregacin sexual. Por
ello, la disponibilidad de individuos sexuales
o con algn grado de sexualidad (apomcticos
facultativos) es un requisito fundamental para
el mejoramiento de estas especies. Estos individuos presentan un cierto grado de variabilidad como para aumentar las posibilidades
de supervivencia de la especie frente a cambios ambientales y aportan asimismo
germoplasma til para el mejoramiento.
Uno de los principales requisitos para llevar adelante un programa de mejoramiento
de una especie apomctica es la coleccin de
germoplasma diverso desde las fuentes de
origen para ampliar la base gentica disponible e identificar introducciones sexuales o altamente sexuales (apomcticas facultativas
con alta expresin de sexualidad). La evaluacin de especies relacionadas es tambin una
alternativa importante cuando no se dispone de plantas sexuales de la especie de inters. Ejemplos de cruzamientos interespecficos e incluso intergenricos empleados
como punto de partida en programas de
mejoramiento se encuentran en Brachiaria,
Zea x Tripsacum y Pennisetum, entre otros.

El adecuado conocimiento de la biologa,
citologa y modo de reproduccin de los materiales disponibles es asimismo un requisito
fundamental para cualquier estrategia de
mejoramiento. Como se ver mas adelante,
los estudios realizados para determinar la
base gentica de la apomixis en varias especies de gramneas indican que el carcter presenta un tipo de herencia simple, haciendo
posible entonces su manipulacin en programas de mejoramiento una vez que son detectados individuos sexuales o apomcticos
facultativos. En estos casos los genotipos
apomcticos obligados con caractersticas deseables pueden ser usados como dadores de
polen. Debido a que los gametos masculinos
son completamente normales (reducidos) y
que la mayora de las especies apomcticas
son altamente heterocigotas, los cruzamientos entre individuos sexuales (utilizados como
progenitores femeninos) y apomcticos (empleados como dadores de polen) pueden
conducir a la generacin de progenies F1 variables donde es posible seleccionar. Hay que
tener en cuenta que si bien son necesarios
individuos sexuales o con adecuada expresin
de sexualidad para realizar las cruzas, en el
momento de la seleccin habr que usar el
criterio contrario, es decir, seleccionar por un
alto grado de expresin de la apomixis. Esto
conducir a la obtencin de variedades estables. El objetivo final de un programa de
mejoramiento de una especie apomctica en
el cual ha sido posible obtener recombinacin
gentica es la identificacin en la poblacin
segregante de los genotipos superiores, con
reproduccin completamente (o casi completamente) apomctica que puedan ser transformados en cultivares mediante su multiplicacin por semillas. El camino no es sencillo
porque en cada generacin es necesario distinguir en la progenie, cules son los individuos generados por sexualidad y cuales por
apomixis. Dentro de los generados por sexualidad, habr que seleccionar los que al mismo tiempo posean las mejores caractersticas agronmicas y presenten un alto grado
de expresin de la apomixis. Otro aspecto a
tener en cuenta es el nivel de ploida de los
progenitores que sern empleados en los cruzamientos. Los primeros estudios de hibridacin indicaron la necesidad de realizar cruzas
287
entre especies sexuales y apomcticas con el

mismo nivel de ploida ya que varios intentos realizados entre diploides sexuales y
poliploides (en general tetraploides)
apomcticos condujeron a la generacin de
progenies estriles.
En las gramneas tropicales y subtropicales
se ha hecho un buen uso del carcter en el
mejoramiento, especialmente en la domesticacin de algunas especies. Dos grandes lneas de trabajo han sido llevadas adelante
en estos programas: 1) la seleccin de los
mejores genotipos naturales partiendo de
una amplia coleccin de germoplasma y estudiando caractersticas como la productividad de materia seca, calidad, adaptabilidad
al cultivo y a distintas condiciones ambientales, capacidad de produccin de semilla y
persistencia al pastoreo. Esta seleccin puede llevarse a cabo entre diferentes especies
o dentro de la misma especie, considerando
cules son los mejores genotipos entre distintas poblaciones apomcticas disponibles.
Hay numerosos ejemplos de cultivares de
pastos forrajeros apomcticos que se mejoraron usando este tipo de seleccin. As se
obtuvieron todas las variedades apomcticas
cultivadas de Paspalum, Brachiaria, Panicum,
Themeda y Melinis. Tomando como ejemplo a Paspalum, en primer lugar se seleccionaron algunas especies como P. notatum
(apomctico, 4X), P. dilatatum (apomctico,
5X), P. plicatulum, P. atratum, y luego se eligieron algunos ecotipos por sus cualidades
agronmicas y su adaptabilidad al cultivo. En
el sur de los Estados Unidos se han popularizado algunas variedades tetraploides
apomcticas de P. notatum (Argentine, Paraguay, Wilmington, Tifton 7 y otras). Tambin
se cultivan algunas variedades apomcticas de
Dallisgrass (P. dilatatum) seleccionadas de la
misma manera. En nuestro pas se cultivaron
durante mucho tiempo dos variedades
apomcticas de P. guenoarum: el Pasto Rojas y el Pasto Ramrez, seleccionadas por este
mismo mtodo en Paraguay. Recientemente se han inscripto otras dos variedades que
han sido seleccionadas en la Facultad de Ciencias Agrarias de la Universidad Nacional del
Nordeste: el Pasto Camb (P. atratum) y el
Pasto Chan (P. guenoarum); 2) la segunda
posibilidad de mejoramiento (en la que an
se ha avanzado poco) consiste en realizar
288
cruzamiento con genotipos sexuales

poliploides naturales, que son muy raros. Un
buen ejemplo de esto es son las variedades
Nueces y Llano de Buffelgrass (Pennisetum
ciliaris) desarrolladas en USA en la dcada
del 70 a partir de cruzamientos entre una rara
planta tetraploide sexual (natural) con plantas apomcticas tetraploides (que son las comunes en esta especie). Tambin se han conseguido obtener plantas tetraploides sexuales por duplicacin cromosmica de una planta sexual diploide. Mediante este tipo de tratamientos se han generado tetraploides
sexuales en B. ruziziensis y P simplex, P.
notatum y P. hexastachium. La disponibilidad de estas plantas, adems de facilitar los
planes de cruzamientos, permiti la realizacin de estudios detallados de la herencia del
carcter apomixis en ambos gneros. Actualmente se estn llevando a cabo programas
de mejoramiento que utilizan esta estrategia para Paspalum y Brachiaria, aunque an
no se ha inscripto ninguna variedad nueva.
4 Usos potenciales de la apomixis en el
mejoramiento de plantas naturalmente
sexuales
La ausencia de recombinacin durante la
megagametognesis y de fecundacin de la
ovoclula por un gameto masculino posibilita la generacin de embriones que presentan una constitucin gentica idntica a la
de la planta madre. La apomixis es un carcter utilizable en el mejoramiento de plantas
y la produccin de alimentos, ya que puede
ser percibida como una herramienta ventajosa para la estabilizacin de genotipos superiores y la fijacin combinaciones hbridas.
En teora cualquier combinacin gentica que
lleve los factores determinantes de la
apomixis podra ser mantenida y multiplicada como una rplica exacta por innumerables generaciones va semillas. La perspectiva de clonar genotipos superiores hbridos
podra representar una ayuda importante
para los productores agropecuarios de los
pases en desarrollo, permitindoles sostener
altos rendimientos ao tras ao usando parte de las semillas cosechadas sin prdidas en
la produccin debidas a la segregacin. Entre otras ventajas, la expresin de la apomixis
reducira al mnimo el aislamiento fsico reque-
rido para preservar lneas genticas

homocigotas. Podran ser obtenidos y propagados fcilmente nuevos hbridos interespecficos e intergenricos, permitiendo el
desarrollo de genotipos mejor adaptados a
los distintos ambientes. Asimismo podra
facilitarse el uso de transformantes considerando que una planta transgnica apomctica
fijara inmediatamente el nuevo carcter y se
convertira en un cultivar luego de su multiplicacin.
5 El control gentico de la apomixis
recen estar controladas por un nico locus

en donde un gen mayor dominante o un grupo de genes ligados y coadaptados, que funcionan como una sola unidad gentica a causa de una fuerte supresin de la
recombinacin, son los responsables de la
expresin del carcter. El modelo gentico
ms simple propuesto para especies
tetraploides de Panicum y Brachiaria, supone que la constitucin gentica de las plantas sexuales sera del tipo nuliplexo (aaaa)
mientras que los individuos apomcticos seran uniplexos (Aaaa), siendo A el alelo dominante responsable de la apomixis. Los cruzamientos de individuos de este tipo generan progenies F1 que segregan en una relacin 1:1 (sexuales vs. apomcticos). Sin embargo, en este modelo existen ciertas cuestiones que no han sido resueltas. Por ejemplo en el caso de Panicum maximum (que es
una especie apomctica facultativa) si bien se
postula que las plantas apomcticas son
uniplexas (Aaaa) hasta ahora no se han encontrado en la naturaleza plantas completamente sexuales (aaaa). Esta situacin se repite en otras especies apomcticas. Tampoco
se puede explicar el hecho de que siempre
que se utiliz como polinizador a una planta
apomctica sta result ser un genotipo Aaaa.
Cmo es posible que el genotipo uniplexo
La apomixis es un carcter heredable,

pero su control gentico no fue an completamente esclarecido. Tradicionalmente se
consider que sus determinantes bsicos
podran haberse originado por mutacin y
que la mayora de los otros genes involucrados son similares a los de la sexualidad.
A pesar de su amplia distribucin en las
angiospermas, el carcter no es muy comn
en los cultivos mayores o en sistemas modelos. Esta condicin forz a que los estudios
en este campo deban ser realizados en especies silvestres que son poliploides, altamente heterocigotas y con una pobre caracterizacin gentica. La diseccin de las bases
genticas del carcter es por lo tanto dificultosa y compleja. Los estudios de
herencia slo son posibles si pueden cruzarse progenitores completamente sexuales y apomc-ticos y
la progenie F 1 segregante puede
ser examinada por mtodos
citoembriolgicos. Alternativamente, el anlisis de progenies usando
marcadores moleculares, puede ser
empleado como un indicador de la
tasa de plantas con genotipo materno formadas por cada uno de
los hbridos F1. En las cruzas de este
tipo (que pueden ser intra o
interes-pecficas) se utiliza un
poliploide sexual natural o generado artificialmente como planta ma- Figura 4: Los estudios con marcadores moleculares permiten la
dre, mientras que un genotipo localizacin del locus que controla la apomixis. A la izquierda se
apomctico contribuye como dador muestra un gel de AFLP obtenido durante la construccin del mapa
de polen. Los diferentes estudios gentico de Paspalum notatum. A la derecha vemos la regin
genmica que contiene al locus responsable de la apomixis (apodesarrollados en las gramneas co- locus) definida por marcadores moleculares, varios de los cuales
inciden en sealar que tanto la segregan completamente ligados al apo-locus y evidencian una fuerte
apospora como la diplospora pa- restriccin de la recombinacin (tomado de Martnez et al 2003).
289
sea el nico existente en las poblaciones

apomc-ticas, cuando la especie no es completamente apomctica?. El modelo tampoco es aplicable a otras especies como las incluidas en el gnero Paspalum, en donde la
regin genmica involucrada parece estar
asociada con algn factor letal que afecta
parte de los gametos masculinos (Fig. 4).
6 Transferencia del carcter apomixis a
especies de inters agronmico
Aunque desde el punto de vista del mejoramiento gentico la apomixis puede considerarse como un sistema que restringe la
recombinacin gentica, esta forma de reproduccin constituye una herramienta nica
para desarrollar cultivares superiores y preservar combinaciones hbridas indefinidamente.
Por ello la transferencia del carcter a las especies cultivadas ha sido perseguida desde
hace tiempo. Bsicamente se consideran tres
grupos generales de procedimientos para la
transferencia potencial de la apomixis a especies sexuales: i) hibridizacin clsica entre
una planta sexual y un pariente apomctico
natural; ii) iniciacin de la expresin de la
apomixis por experimentos de bloqueo de
genes (mutantes T, etiquetado transposicional, mutagnesis); iii) transformacin de
cultivares sexuales con genes que controlan
la expresin del carcter. Las dos primeras
aproximaciones ya fueron intentadas, aunque los proyectos no han sido exitosos hasta el momento, mientras que la tercera opcin todava contina siendo hipottica. Los
primeros experimentos dirigidos a introducir
la apomixis a travs de cruzamientos fueron
realizadas cerca de 40 aos atrs por D. F.
Petrov, quien realiz hibridaciones entre maz
y razas tetraploides de Tripsacum
dactiloydes (una especie diplosprica tambin perteneciente a la tribu de la
Andropogneas igual que el maz). Posteriormente otros grupos de investigacin produjeron hbridos interespecficos de mazTripsacum que se reproducen por apomixis.
Sin embargo, como los genotipos obtenidos
luego de una serie de retrocruzas con maz
son completamente macho-estriles, el progreso en la recuperacin del genoma de esta
especie est fuertemente asociado con la
posibilidad de generar hbridos con algn gra-
290
do de reproduccin sexual (apomcticos facultativos). La imposibilidad de generar este

tipo de individuos es la principal dificultad que
enfrenta este sistema. Una dificultad adicional es el fuerte requerimiento de una relacin 2:1 en el nmero de genomas haploides
maternos y paternos que contribuyen a la
formacin del endospermo en maz. Estos
problemas han demorado el progreso de la
introduccin de la apomixis en maz en los
ltimos aos. La transferencia de la apomixis
al mijo perla (Pennisetum glaucum) desde
P. squamulatum por un programa de mejoramiento iniciado al final de los 70 es considerado el ms avanzado de su clase. En este
esquema las retrocruzas con Pennisetum
glaucum han avanzado hasta la generacin
BC7, mediante la seleccin de grandes progenies para identificar individuos apomcticos
parcialmente macho frtiles. Estas plantas
son morfolgicamente muy parecidas al mijo
perla, aunque producen un bajo nmero de
semillas viables. Este hecho estara vinculado
a la formacin del endospermo y es un inconveniente que an resta resolver.
En resumen, la factibilidad de la transferencia est an por demostrarse. Los principales obstculos son: equilibrar el balance
endosprmico y lograr la expresin de la
apomixis a nivel diploide. Aqu se debera lograr, seguramente a travs de un esfuerzo
multidiciplinario internacional, un conocimiento profundo de la relacin entre la expresin de la apomixis y la poliploida, especialmente de la autopoliploida. En gramneas
de la subfamilia Panicoideas (Paspalum,
Panicum, Tripsacum, Brachiaria, Melinis y
otras) es posible que el sistema apomctico
difiera del que existe en Pooideas (Poa,
Elymus y otras). Son necesarios conocimientos bsicos ms profundos de la embriologa
de especies silvestres con sistemas
apomcticos, para determinar qu gnero o
qu especie son los ms adecuados como
fuente para obtener los genes que podran
utilizarse hipotticas transformaciones
genticas que permitan usar la apomixis en
los cereales.
Los intentos para generar mutantes
apomcticas inactivando genes de la sexualidad por etiquetado transposicional o
mutagnesis no han tenido xito an en re-
crear el carcter pero permitieron la identificacin de varios genes involucrados en el control de etapas particulares de su desarrollo,
como la proliferacin del endospermo en
ausencia de fertilizacin. La transformacin
gentica de cultivares sexuales con genes que
controlan el inicio del carcter es an hipottica, ya que la identificacin de esos genes
no se ha logrado.
7 Caracterizacin molecular de la
apomixis
En los ltimos aos la tecnologa de marcadores moleculares y los procedimientos de
biologa molecular han generado una cantidad considerable de conocimientos nuevos
sobre las bases moleculares de la apomixis
que pueden ser tiles para el futuro aislamiento del/los genes que controlan el carcter.
Han sido identificados varios marcadores que
cosegregan con la apomixis en distintos gneros de gramneas como Tripsacum,
Pennisetum, Brachiaria y Paspalum. Estos
marcadores ligados al carcter pueden emplearse en el estudio de la transmisin del
mismo en los programas de mejoramiento
de especies apomcticas y eventualmente intentar cualquiera de las estrategias de
clonado basadas en el mapeo gentico para
aislar el/los disparadores del fenmeno. El
anlisis molecular posibilit la identificacin
de una regin genmica especfica de la
apospora (ASGR) en Pennisetum
squamulantum que est ausente en individuos sexuales y donde la recombinacin est
severamente restringida. En Tripsacum
dactyloides, Paspalum simplex y Paspalum
notatum se detectaron regiones similares en
donde numerosos marcadores aparecen
completamente ligados al carcter (ver figura 4). La ausencia de recombinacin bien podra estar asociada a una estrategia para evitar la dispersin de los factores que necesitan cosegregar estrictamente para determinar la apomixis. La existencia de una regin
ASGR de baja recombinacin puede enmascarar la presencia de varios genes que gobiernan al carcter, hacindolos aparecer y funcionar como una sola unidad gentica. Una
caracterizacin molecular detallada de este
segmento cromosmico revelar en el futuro la variedad y el nmero de genes
involucrados. Dado que varios elementos diferencian a la apomixis de la sexualidad

(apomeiosis, partenognesis, pseudogamia
y a veces desarrollo autnomo del
endospermo) la cuestin de si la apomixis es
consecuencia de la expresin de un solo gen
mayor o de un grupo de factores ligados y
coadaptados es uno de los problemas a resolver en el futuro cercano.
Varios trabajos recientes enfocados en
estudios de expresin han informado el aislamiento de transcriptos de mRNA especficos del desarrollo apomctico en varias
gramneas La mayora de los transcriptos aislados hasta el momento no muestran similitudes con genes de funcin conocida. En
Paspalum notatum se identific una familia
gnica de expresin aumentada en flores de
plantas apospricas cuyo producto proteico
presenta sitios de control por el complejo de
cdc2 ciclinas tpicos de protenas del
citoesqueleto. Asimismo, por comparaciones
de los perfiles proteicos en geles de dos dimensiones se identific una a tubulina caracterstica de lneas partenogenticas. Anlisis
de expresin de este tipo pueden conducir
en el futuro a la identificacin y el clonado
de genes involucrados en las primeras etapas del desarrollo apomctico y al eventualmente al aislamiento del disparador mismo
de la apomixis.
8 Perspectivas
A pesar de que an necesitan ser respondidas numerosas cuestiones sobre la accin
de genes, la funcin y la regulacin de la
apomixis, se vislumbra para el futuro un escenario promisorio. Nuestro entendimiento
de las bases moleculares de la apomixis se ha
incrementado a causa del desarrollo de tcnicas poderosas de biologa molecular y al
creciente inters en el tema despertado en
las instituciones cientficas e investigadores.
Por otra parte, con el advenimiento del anlisis genmico a gran escala se dispone de
nuevas herramientas para el descubrimiento
de genes y los anlisis de expresin. Los resultados obtenidos hasta ahora han contribuido al mejoramiento de las especies
apomcticas, muchas de las cuales son recursos naturales importantes y al uso de las ventajas intrnsecas de este modo de reproduc-
291
cin en la generacin de variedades

mejoradas, como es el caso de las gramneas
forrajeras tropicales y subtropicales. Es de
esperar que en los prximos aos el conocimiento de las bases genticas y moleculares
del carcter se incremente considerablemente. Esto har posible la comprensin del
mecanismo biolgico responsable de la
apomixis, as como su transferencia a las especies de gran cultivo. Para esto se requerir
un fuerte apoyo financiero a los estudios
bsicos sobre el tema. Por otra parte, dado
que la problemtica del carcter es muy compleja ser indispensable fortalecer la cooperacin internacional ya existente para mantener un espacio de discusin y de intercambio de materiales e informacin.
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292
VIII.-Captulo 4
Tcnicas de ingeniera gentica para
conferir resistencia a virus en plantas
del Vas, M.; Distfano, A.J.; Vazquez Rovere,
C.; Hopp, H.E.
1 Introduccin
Las enfermedades de las plantas causan
la prdida de aproximadamente el 15% de
la produccin agrcola mundial. En particular,
las infecciones virales producen perjuicios
econmicos significativos de manera directa,
a travs de una disminucin del rendimiento
por efecto de la enfermedad e indirecta, a
travs de un incremento en los costos debido a la utilizacin de semilla libre de virus
(por ejemplo, en plantas de propagacin
clonal como papa, ajo y batata). Por otro
lado, la exportacin de ciertos productos se
ve restringida debido a las limitaciones internacionales impuestas a la exportacin de
materiales fuera de la calidad y tolerancia
fitosanitaria permitidas.
Clsicamente, las enfermedades virales en
plantas se controlan mediante distintas estrategias como el mejoramiento gentico,
el uso de semillas libres de virus, la rotacin de cultivos y la tcnica de proteccin
cruzada (que se describe brevemente ms
adelante).
A partir de 1983, cuando Fraley y col. obtuvieron plantas de tabaco y petunia
transgnicas, se public un gran nmero de
trabajos detallando la transferencia de genes
forneos a una cantidad creciente de especies de plantas. La ingeniera gentica permite incorporar en las plantas nuevos caracteres de inters agrcola en forma horizontal,
evitando as el traspaso de caracteres indeseables. De esta forma, la variedad
transgnica adquiere un carcter nuevo al
tiempo que mantiene intactos el fondo
gentico y el potencial productivo original, lo
que permite encarar el mejoramiento rpido de cultivares ya utilizados por el agricultor. Los transgenes introducidos pueden provenir de otras variedades de la misma especie vegetal, de plantas de otras especies
sexualmente incompatibles e incluso de organismos pertenecientes a otros reinos incluyendo animales y microorganismos.
En sentido amplio existen dos formas de
modificar plantas por ingeniera gentica de
manera de conferirles resistencia al virus: desencadenar resistencia mediante la expresin
de secuencias genmicas derivadas del propio virus al que se desea combatir (llamada
resistencia derivada del patgeno o PDR)
o desencadenar resistencia mediante la expresin de genes no-virales que poseen
actividad antiviral.
2 Resistencia a virus conferida por genes
virales
La prevencin del desarrollo de enfermedades virales utilizando genes derivados del
patgeno fue propuesta por primera vez a
comienzos del siglo XX, cuando se demostr
que las plantas de tabaco podan ser protegidas frente a la infeccin con una cepa severa del virus del mosaico del tabaco (Tobacco
mosaic virus o TMV) si, previamente, se las
haba inoculado con una cepa menos virulenta del mismo virus (McKinney, 1929). Este
tipo de estrategia, comnmente denominada proteccin cruzada, ha sido empleada para varios cultivos de importancia econmica, incluyendo tomate, papaya, ctricos,
etc. (Gadani y col., 1990). En 1985, Sanford y
Johnston propusieron que la expresin de
ciertos genes del patgeno en un hospedante alterara el balance normal de los componentes virales y predijeron que esto conducira al impedimento de la replicacin o del
movimiento del virus dentro de la planta ms
all de la primera clula infectada (Sanford &
Johnston, 1985).
Las primeras plantas transgnicas con
resistencia a virus se obtuvieron en 1986
mediante la expresin del gen que codifica
para la cpside del TMV (Abel y col., 1986).
Utilizando esta estrategia se logr obtener
plantas resistentes a virus pertenecientes a
casi todos los gneros de virus de plantas,
principalmente en tobamo-, potex- y
alfamovirus (Tabla 1).
En general, las plantas protegidas muestran un retardo temporal del desarrollo de
sntomas, una atenuacin en la sintomatologa caracterstica de cada virus en parti-
293
Tabla 1: Ejemplos de resistencia a virus mediante la expresin de la protena de cpside

(CP) o nucleocpside (Gen N) viral en plantas transgnicas.
tas estrategias no se
detallarn debido a
que actualmente hay
Gneros de
transgn
Virus
Especies vegetales
virus
evidencias de que en
varios casos su efectiTobamovirus
CP
TMV; ToMV; AIMV
tabaco; tomate
vidad se debe a la induccin del mecanisPotexvirus
CP
PVX; CyMV; WCIMV
tabaco
mo de resistencia
Potyvirus
CP
PVY; TEV; PRV; PPV PPV; tabaco; papa; papaya; mediada por ARN
maz
MDMV; SMV; WMV II;
que se describe a conZYMV
tinuacin.
Carlavirus
CP
tabaco; papa
PVS
En 1992 se demostr,
por primera
Luteovirus
CP
PLRV
papa
vez, que se poda
Comovirus
CP
SLRSV
tabaco
obtener resistencia a
virus mediante la exNepovirus
CP
ArMV
tabaco
presin de un ARNm
Tobravirus
CP
TRV
tabaco
de cpside viral no
Ilavirus
CP
TSV
tabaco
traducible, es decir,
no era necesaria la
Geminivirus
CP
TYLCV
tomate
expresin de la proTospovirus
Gen N
TSWV; INSV; TCSV; GRSV
tabaco
tena codificada por
el transgn (Lindbo
Los acrnimos utilizados (en orden alfabtico) son: AIMV: Alfalfa mosaic virus; ArMV: & Dougherty, 1992).
Arabis mosaic virus; CMV: Cucumber mosaic virus; CyMV: Cymbidium mosaic virus; A partir de entonces
GRSV: Groundnut ringspot virus; INSV: Impatiens necrotic spot virus; MDMV: Maize se publicaron numedwarf mosaic virus; PLRV: Potato leaf roll virus; PPV: Plum pox virus; PRV: Papaya rosos trabajos proringspot virus; PVS: Potato virus; PVX: Potato virus X; PVY: Potato virus Y; SMV:
Soybean mosaic virus; SSLRSV: Strawberry latent ringspot virus; TCSV: Tomato fundizando la caracchlorotic spot virus; TEV: Tobacco etch virus; TMV: Tobacco mosaic virus; ToMV: terizacin de este
Tomato mosaic virus; TRV: Tobacco rattle virus; TSV: Tobacco streak virus; TSWV: tipo de resistencia a
Tomato spotted wilt virus; TYLCV: Tomato yellow leaf curl virus; WClMV: White virus, llamada en senclover mosaic virus; WMV II: Watermelon mosaic virus II; ZYMV: Zucchini yellow tido amplio resismosaic virus.
tencia mediada por
ARN.
Las
plantas
que
muestran este tipo
cular, una menor cantidad de sitios de infecde
resistencia
presentan
un fenotipo de incin y un menor ttulo viral. Se demostr que
munidad que se caracteriza porque no hay
hay una correlacin entre la resistencia y el
replicacin viral detectable, no hay diseminanivel de expresin de la protena de la cin viral dentro de la planta y no hay sntocpside, que la proteccin acta en el pla- mas debido a la enfermedad, o un fenotipo
no celular y es superada por altas dosis de de recuperacin que se caracteriza por una
inculo (viriones). En algunos casos es su- infeccin inicial (con produccin de sntomas)
perada por inoculacin con ARN viral.
que es seguida por un crecimiento posterior
La proteccin es ms efectiva para el vi- resistente a la infeccin y asin-tomtico. En
rus homlogo al que dio origen al transgn. cualquiera de los dos casos, las plantas son
Sin embargo, abarca tambin a virus y cepas solamente resistentes a la infeccin producirelacionadas aunque la eficiencia se va redu- da por virus mucho ms estrechamente relaciendo a medida que la relacin filogentica cionados con el virus que dio origen al
transgn que en el caso de proteccin mese hace ms lejana.
Adems, se logr obtener resistencia a diada por cpside. El anlisis de estas planvirus mediante la expresin de otras prote- tas en el plano molecular demostr que en
nas virales tales como las protenas respon- general contienen copias mltiples del
sables de la multiplicacin viral (por ejem- transgn y que si bien presentan un alto niplo ARN polimerasas dependientes de ARN) vel de transcripcin en el ncleo, los niveles
y las protenas responsables del movimien- estables del ARNm del transgn en el citoto viral de clula a clula disfuncionales. Es- plasma son muy bajos. Usualmente se ob-
294
serva adems metilacin de la regin

codificante del transgn.
2.1 Mecanismo de proteccin debida a la
expresin de la protena de cpside viral
(CP)
Como se mencion, las primeras plantas
transgnicas con resistencia a virus se obtuvieron mediante la expresin del gen que
codifica para la cpside del TMV. Estas plantas resultaron resistentes a la inoculacin con
partculas virales de TMV pero la resistencia
era sobrepasada si se las inoculaba con ARN
viral infectivo. Se postul entonces que la
proteccin se deba a la inhibicin del
desnudamiento viral en las clulas infectadas
inicialmente. Varias lneas de evidencia apoyan esta hiptesis. Por ejemplo si se inoculan protoplastos derivados de plantas
transgnicas que expresan la CP de TMV o
plantas no transformadas con pseudoviriones (partculas formadas por la CP viral
que contienen en su interior un ARNm no
viral) de TMV que contienen ARNm que codifica para la enzima indicadora glucuronidasa (GUS), se observa que hay una marcada disminucin de la actividad GUS en los
protoplastos derivados de las plantas
transgnicas. Esto se debe probablemente
a la falla en el desnudamiento de los viriones
(Osbourn y col., 1989). Ms adelante se demostr que las protenas de cpside
mutagenizadas para anular la habilidad de
autoagregarse no son capaces de conferir
proteccin frente a TMV, y que las protenas
mutantes capaces de interactuar entre ellas
con afinidad ms alta conferan mayor proteccin que la protena de cpside salvaje. Es
decir que se estableci una relacin directa
entre el nivel de agregacin de la protena
de cpside y el nivel de proteccin frente a
TMV (Bendahmane y col., 1997). Si bien estos trabajos apoyan la hiptesis de que en
las plantas transgnicas para CP hay una inhibicin en una etapa temprana de la infeccin, no se puede descartar que, adems, la
expresin de protena de cpside impida o
modifique etapas ms tardas de la infeccin.
Si se injerta una porcin de planta
transgnica que muestra proteccin mediada por cpside entre una base y un pice no
transgnicos y se inocula la planta injertada
en la base no transgnica, se observa que el

virus no puede moverse hacia el pice, es decir
que no puede atravesar la zona transgnica
protegida (Wisniewski y col., 1990). Sin embargo, la supresin del movimiento vascular
involucra tambin el empaquetamiento y
desnudamiento viral, y cabe la posibilidad de
que la supresin del movimiento vascular sea
una consecuencia secundaria de la inhibicin
del desnudamiento viral en las plantas expresando protena de cpside.
Otro caso muy estudiado es el del virus
PVX de la papa. Las plantas transgnicas para
la cpside de PVX resultan protegidas ante
la inoculacin con virus o con ARN viral
(Hemenway y col., 1988). Se postula que la
protena de cpside se une al origen de ensamblado localizado en el extremo 5 del
ARN viral, suprimiendo de esta manera la traduccin de la replicasa viral (cuyo gen est
localizado en el mismo extremo). Tambin
es posible que inhiba el movimiento de PVX
de clula a clula, ya que la protena de
cpside es un cofactor esencial de la
traslocacin sistmica (Chapman y col., 1992).
Como se desprende de los dos ejemplos
descriptos, el mecanismo de proteccin mediado por la protena de cpside no es nico, y es particular para cada sistema virus-planta.
2.2 Mecanismo de proteccin debida al
desencadenamiento de resistencia
mediada por ARN
Es conocido que distintos eventos de
transformacin obtenidos con la misma
construccin gentica pueden dar lugar a una
variada gama de expresin del gen de inters (efecto de posicin). Hay muchos ejemplos en los que la caracterstica que uno desea expresar no se expresa o su expresin
desaparece a lo largo de las distintas generaciones. Esta prdida de la caracterstica deseada (pero no del transgn correspondiente) se denomina silenciamiento gnico y el
primer ejemplo se describi en petunias para
el gen de la chalcona sintetasa (Napoli y col.,
1990). Dependiendo del nivel de accin en el
cual ocurre el silenciamiento gnico, se pueden distinguir el silenciamiento transcripcional (TGS) y el silenciamiento postranscripcional de genes (PTGS). El TGS se
295
manifiesta por una falta de expresin del

gen en cuestin debido a la metilacin de la
regin promotora, lo cual impide la normal
transcripcin del gen. Este tipo de silenciamiento se hereda meiticamente y se desencadena por interaccin entre varias copias de un transgn que tienen homologa
en sus regiones promotoras. El PTGS se
manifiesta por una supresin del efecto del
gen en cuestin ocasionado por una degradacin inducible y especfica del ARNm
transcripto. Para desencadenar este tipo de
mecanismo se requiere de homologa en la
regin transcripcional entre los genes que
interactan y puede estar acompaado de
metilacin de la secuencia de ADN codificante.
Este mecanismo de degradacin de ARN especfico de secuencia evolucion como un
mecanismo de defensa antiviral en plantas.
Si bien se describi por primera vez en plantas, se lo ha encontrado tambin en hon-
gos (donde se denomina quelling) y animales como nematodos, moscas o mamferos (donde se lo denomina interferencia
mediada por ARN). El PTGS puede ser desencadenado eficientemente por transgenes
nucleares que dan lugar a transcriptos con
estructura de ARN de doble cadena (ARNdc)
o que expresan altos niveles o niveles
aberrantes de transcriptos. En plantas tambin puede ser desencadenado por la
replicacin de virus que generalmente produce intermediarios replicativos de ARNdc.
Una vez desencadenado el proceso, los intermediarios que contienen ARNdc son reconocidos por una nucleasa especfica de
ARNdc que los procesa en fragmentos de
ARNs pequeos (llamados pequeos
interferentes -small interfering- ARNs o
ARNsi) de ambas polaridades y de 21 a 25
nucletidos de longitud (Hamilton &
Baulcombe, 1999). A su vez, se postula que
Figura 1: Mecanismo propuesto para la iniciacin, diseminacin de la seal mvil y degradacin del ARNm blanco
durante el proceso de silenciamiento gnico postranscipcional (PTGS) dentro de una planta. RdRP: ARN polimerasa
dependiente de ARN.
296
los ARNsi actan como guas para dirigir la

maquinaria de degradacin de ARN contra
todo aquel ARN con homologa a la secuencia desencadenante. Un aspecto a destacar
es que el silenciamiento mediado por ARN
es desencadenado localmente y luego transmitido a toda la planta va una seal de silencia-miento mvil (Palauqui y col., 1997,
Voinnet & Baulcombe, 1997). Si bien se desconoce por el momento la naturaleza de la
seal, se postula que sta contiene un componente de cido nucleico que explicara la
especificidad de secuencia del mecanismo de
degradacin y un componente proteico. Asimismo, por prospeccin gentica de
mutantes de Arabidopsis se han identificado numerosos genes que codifican para una
serie de factores que intervienen en el proceso de PTGS, como por ejemplo ARN
polimerasas dependientes de ARN que sintetizan ARNdc, protenas que forman parte
de los complejos de degradacin del ARN
blanco, etc. Las plantas mutantes para estos
genes no son capaces de desencadenar PTGS.
Recientemente se han publicado numerosas
recopilaciones del tema (Vzquez Rovere y
col., 2002, Voinnet, 2001, Waterhouse y col.,
2001). En la Figura 1 se esquematiza el mecanismo subyacente al PTGS.
Dado que el PTGS es un mecanismo de
defensa antiviral en plantas, resulta
esperable que se haya seleccionado en los
virus de plantas la capacidad de contrarrestar a este mecanismo. Congruentemente con
esta especulacin, se encontr que varios virus de plantas codifican para protenas
supresoras del PTGS (Anandalakshmi y col.,
1998, Beclin y col., 1998, Brigneti y col., 1998).
Luego de una bsqueda exhaustiva de supresores de silenciamiento en una gran cantidad de virus de plantas, Voinnet y col., concluyeron que prcticamente todos los virus
llevan supresores de silenciamiento, que los
genes que los codifican tienen secuencias y
origen evolutivo diversos, y que los distintos
supresores actan inhibiendo el silenciamiento a distintos niveles (Voinnet y col., 1999).
Algunos, como la protena HC-Pro codificada
por los potyvirus previenen la acumulacin de
los ARNsi, pero no eliminan la seal mvil que
propaga el silenciamiento (Llave y col., 2000).
Otros supresores, como la protena p25 del
virus PVX interfieren con la seal de propa-
gacin sistmica (Voinnet y col., 2000), y finalmente otros, como el codificado por el
virus del achaparramiento del tomate
(Tomato bushy stunt virus o TBSV), suprimen el silenciamiento slo en las nervaduras
(Voinnet y col., 1999). Incluso se han encontrado en virus animales supresores de
silenciamiento que son funcionales en plantas (Li y col., 2002). Es interesante destacar
que varios de los supresores de silenciamiento
virales descriptos haban sido previamente
caracterizados como protenas responsables
de la sintomatologa, del movimiento viral y/
o del fenmeno de sinergismo en la virulencia combinada de dos o ms virus.
La posibilidad de la supresin del
silenciamiento por parte de un virus que coexista con las plantas transgnicas protegidas por el mecanismo de silenciamiento
gnico debe ser tomada en cuenta ya que la
infeccin de una planta silenciada con un virus heterlogo que lleva un supresor de
silenciamiento puede dar lugar a la reversin
del silenciamiento tornndola susceptible a
la infeccin viral (Beclin y col., 1998). Resulta
importante entonces estudiar qu virus
coinfectan un mismo hospedador en condiciones naturales y en lo posible utilizar plantas transgnicas con resistencia a ambos virus.
Un aspecto interesante a recalcar es que,
debido a que el mecanismo de PTGS implica
una muy baja acumulacin del ARN derivado
del transgn y una nula acumulacin de protenas, la estrategia de obtener resistencia a
virus mediante el desencadenamiento de
este fenmeno en plantas transgnicas es
ms atractiva desde el punto de vista de la
evaluacin de riesgos en cuanto a la
bioseguridad de estos organismos genticamente modificados u OGMs, que la sobreexpresin de genes que interfieran con el
ciclo de multiplicacin viral, como es el caso
de la cpside u otras protenas virales. Esto
se debe a que la baja acumulacin de ARN
transgnico minimiza las posibilidades de una
potencial recombinacin homloga con ARN
de origen viral infectante. Por otro lado, la
ausencia de la protena codificada por el
transgn minimiza drsticamente el anlisis
de riesgo alimentario del OGM y evita el riesgo de transcapsidacin (la encapsidacin del
material gentico de otros virus) en el caso
297
en que el transgn codifique para la protena de cpside viral funcional.

3 Resistencia a virus conferida por genes
no virales
Adems de la resistencia derivada del
patgeno (PDR), en los ltimos aos se han
explorado estrategias alternativas para la
obtencin de plantas transgnicas con resistencia a enfermedades virales. Entre ellas se
destaca el uso de inhibidores naturales y especficos de la replicacin viral como la protena antiviral pokeweed (PAP), la expresin de anticuerpos en plantas o plantibodies, la expresin antisentido de genes
de plantas esenciales para el ciclo de vida viral
y la expresin de la enzima 2-5oligoadenilato sintetasa de mamferos en
plantas (Truve y col., 1993). A continuacin
se describirn brevemente las dos primeras
estrategias debido a que son las consideradas ms promisorias.
3.1 Expresin de protenas antivirales de
origen vegetal
heterlogas de infecciones virales. Se demostr que la expresin de esta protena en plantas de papa y tabaco transgnicas las protega frente a una variedad de viruses, sea que
stos fueran inoculados mecnicamente o
por fidos vectores (Lodge y col., 1993). El
estudio de esta resistencia demostr que la
protena PAP inhiba un paso temprano de
la infeccin. Estas protenas son potencialmente txicas para la planta husped (Wang
& Tumer, 2000).
En los ltimos aos se encontraron o
redisearon variantes menos txicas o no
txicas de estas protenas las que, expresadas en plantas transgnicas, confieren resistencia a virus sin producir el efecto de la
inactivacin de los ribosomas (Wang y col.,
1998, Zoubenko y col., 2000).
Por otro lado, se estudi la actividad
antiviral de la protena IRIP (protena RIP obtenida de bulbos de iris) en plantas
transgnicas de tabaco. Esta protena es una
ARN-N-glicosidasa y su expresin en plantas
transgnicas no produjo cambios fenotpicos
observndose una reduccin significativa de
las lesiones producidas por el virus TMV con
respecto a las plantas control (Desmyter y
col., 2003).
Las protenas antivirales de la planta

Phytolacca
Tabla 2: Plantas transgnicas con resistencia a virus autorizadas para su comercializacin.
americana (lla- (fuente AGBios: http://www.agbios.com/dbase.php)
mada pokeweed en ingls) (PAP) conforman uno de
los grupos ms
importantes
de protenas
usadas como
inhibidores naturales de la
replicacin
viral. Las protenas PAP
inactivan los
ribosomas
(pertenecen a
la familia de las
RIP o protenas
inactivadoras
de ribosomas)
y su aplicacin
exgena protege a plantas
298
Tabla 3: Plantas transgnicas con resistencia a virus en etapas avanzadas de experimentacin en laboratorio (e) o de
pruebas piloto a campo (c) en pases en vas de desarrollo (fuente: FAO.Bio.Dec www.fao.org/biotech/
inventory_admin/dep/default.asp).
Cultivo
Virus
Pas
moscada
Los acrnimos utilizados fueron: BGMV: Bean golden yellow mosaic virus; BYDV: Barley yellow dwarf virus;
CLCV: Cotton leaf curl virus; CMV: Cucumber mosaic cucumovirus; CPsV: Citrus psorosis virus; CVBMV: Chilli
vein-banding mottle virus; MSV: Maize streak virus; PAMV: Potato aucuba mosaic virus; PLRV: Potato leafroll
luteovirus; PMV: Papaya mosaic virus; PRSV: Papaya ringspot virus; PStV: Peanut stripe virus; PVX: Potato virus
X; PVY: Potato virus Y; RDV: Rice dwarf virus; RRSV: Rice ragged stunt virus; SCMV: Sugarcane mosaic virus;
SMV2: Soybean mosaic virus; SPMFV: Sweet potato feathery mottle virus; TMV: Tabaco mosaic virus; TSWV:
Tomato spotted wilt virus; TuMV: Turnip mosaic virus; TYLCV: Tomato yellow leaf curl virus; ZAMV: Zantedeschia
mosaic potyvirus. ZYMV: Zuchini yellow mosaic potyvirus.
299
La ventaja de expresar protenas de tipo

PAP en plantas transgnicas es que se logra
resistencia a un amplio espectro de virus
mediante la expresin de un nico gen a diferencia de los mtodos descriptos previamente que son especficos para un tipo de
virus o virus cercanamente relacionados.
3.2 Expresin de anticuerpos en plantas
transgnicas
Una estrategia alternativa que se comenz a utilizar en los ltimos aos es la expresin de anticuerpos completos o fragmentos
de los mismos en plantas transg-nicas para
obtener resistencia a virus.
En 1993 se demostr que la expresin
constitutiva de un anticuerpo de cadena
nica (scFv) dirigido contra la protena de
cpside del virus del moteado crujiente de la
achicoria (Artichoke mottled crinkle virus)
causaba una reduccin en la susceptibilidad
al virus, que se pona de manifiesto por una
baja en la incidencia de la infeccin y un retraso en la aparicin de los sntomas
(Tavladoraki y col., 1993). En 1996 se expres un anticuerpo monoclonal de cadena
nica (scFv) contra la protena de cpside del
virus de la vena necrtica amarillenta de la
remolacha (Beet necrotic yellow vein virus)
en Nicotiana benthamiana (Fecker y col.,
1996) y en el 2000, Schillberg y col. mostraron que la expresin de la cadena Fv contra
la protena de cpside del virus TMV en la
membrana plasmtica de plantas de tabaco
transgnicas confera resistencia al virus
(Schillberg y col., 2000). Hasta el momento
se desconoce el mecanismo por el cual la expresin de anticuerpos o fragmentos de los
mismos confiere resistencia a virus, pero se
demostr que para que la estrategia sea
efectiva es indispensable lograr altos niveles
de expresin y que los anticuerpos se expresen en el compartimento celular donde ocurre la replicacin viral para que sta sea
inhibida en forma efectiva. Por ltimo, los
anticuerpos deben seleccionarse correctamente para que bloqueen los pasos cruciales
en la replicacin o transmisin del virus. En
los ltimos aos se han desarrollado protocolos sencillos para mejorar los anticuerpos a
utilizar, que incluyen la seleccin de
anticuerpos monoclonales usando las tec-
300
nologas de hibridoma y construccin de

genotecas utilizando la tcnica de exhibicin
de epitopes en bacterifagos o phage display (Schillberg y col., 2001). Es importante
destacar que los anticuerpos monoclonales
que reconocen a la polimerasa viral o alguna
otra protena viral con actividad cataltica, son
ms promisorios que los que reconocen protenas estructurales como es el caso de la
cpside viral. Por lo tanto, la expresin de
anticuerpos dirigidos contra protenas virales
esenciales podra proveer una alternativa interesante para obtener resistencia a virus.
4 Plantas transgnicas con resistencia a
virus cultivadas comercialmente o en
etapas avanzadas de experimentacin
En los ltimos aos se ha autorizado el
cultivo comercial y consumo de una variedad
de plantas transgnicas con resistencia a virus basada en alguno de los mecanismos
descriptos (Tabla 2).
Existe otro grupo muy importante de
plantas transgnicas con resistencia a virus
que se encuentran en etapas avanzadas de
experimentacin o de pruebas piloto a campo. Es interesante constatar que los pases
en vas de desarrollo han adoptado esta tecnologa y trabajan activamente en la obtencin de plantas de cultivos de inters local
con resistencia a virus (Tabla 3).
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VIII-Captulo 5
Obtencin de plantas libres de virus
Conci, Vilma C.
1 Eliminacin de virus
Los virus de plantas son responsables de
importantes prdidas en los rendimientos,
llegando en algunos casos a ser limitantes
para el cultivo.
La mayora de los virus no se transmiten
por semilla, por lo tanto, las especies que se
multiplican por esta va tienen la posibilidad
de liberarse de ellos en forma natural.
Por otra parte, cuando las especies que
se propagan exclusivamente en forma
agmica son infectadas sistmicamente por
virus ellos son transmitidos, con alta eficiencia, desde la planta madre a la descendencia. Esta situacin. que es normal en especies
que se multiplican por bulbos, tubrculos,
esquejes o estacas permite que la infeccin
contine de generacin en generacin y se
disemine a diferentes regiones a travs del
comercio de estos propgulos. Ejemplo de
ello son ajo, frutilla, frutales de carozo o pepita, yuca, papa, batata y numerosas especies ornamentales. En estos casos, la obtencin y multiplicacin de plantas libres de virus por medios artificiales juega un papel importante para mejorar la produccin y calidad de estas especies. Existen numerosos
ejemplos respecto a los beneficios obtenidos
como consecuencia del empleo de plantas libres de virus, no slo por los incrementos en
la produccin sino que adems ha permitido
la recuperacin de reas de cultivo que haban sido prcticamente abandonadas.
Una larga lista de especies han sido liberadas de virus a travs de la regeneracin de
plantas in vitro. El sistema ms frecuentemente utilizado y con mayores xitos es el
cultivo de meristema, suplementado en muchos casos por tratamientos de termoterapia
o quimioterapia.
1.2 Cultivo de meristemas
Esta tcnica consiste en aislar el
meristema y sembrarlo en un medio de cultivo adecuado que posibilite el desarrollo de
una planta completa.

El trmino cultivo de meristema, por lo
general, no es correctamente empleado, ya
que en la mayora de los casos se siembra el
domo meristemtico acompaado por uno
o dos primordios foliares. El domo es una
estructura de menos de 0,1 mm de dimetro muy difcil de extraer con xito en forma
aislada, y de la cual resulta con frecuencia complicado obtener plantas completas. Para ello
es necesario un medio de cultivo con una
concentracin de nutrientes muy equilibrada y condiciones ambientales muy estrictas.
Por consiguiente los resultados en ese sentido han sido muy pobres. Por esta razn, en
la mayora de los casos, se utiliza el domo
acompaado de uno ms primordios
foliares. Tal vez lo ms aconsejable sera utilizar el trmino cultivo de yema, o brote,
o tallo. A pesar de ello, en este captulo
utilizaremos la denominacin cultivo de
meristema por ser esta la terminologa ms
difundida, aunque no sea estrictamente correcta.
En general se considera que las plantas
provenientes del cultivo de meristema son
idnticas u homlogas a la planta madre de
donde se extrajo el explanto. Por el contrario, las plantas derivadas de otros tejidos
como callos, nucela, primordios florales o
protoplastos, usualmente presentan distintos grados de variabilidad. Esto ltimo no es
deseable para la produccin de plantas libres
de virus, donde el objetivo que se persigue
es mejorar la sanidad de la planta pero conservar el resto de sus caractersticas
agronmicas.
Sin embargo, es importante aclarar que
han sido sealadas ciertas mutaciones en
plantas provenientes de cultivo de
meristema, pero con mucha menos frecuencia y menos importantes que las detectadas
con otros sistemas de obtencin de plantas
in vitro.
El cultivo de meristema ha sido utilizado
con xito para distintos objetivos, entre ellos
los ms frecuentes son la rpida clonacin de
material deseable (micropropagacin), conservacin de germoplasma a baja temperatura o criopreservacin y para la obtencin
de plantas libres de patgenos sistmicos,
entre ellos los virus, que son el objetivo de
este captulo.
303
2 Distribucin de los virus en la planta

Los virus en la planta no estn uniformemente distribudos. En las infecciones
sistmicas algunos estn limitados al floema
o a pocas clulas parenquimticas adyacentes; otros involucran a todas, o casi todas,
las clulas de la planta. Existen otros virus que
dejan sectores de tejidos sin infectar y slo
unos pocos invaden los nuevos tejidos
meristemticos.
Los meristemas suelen tener pocos o ningn virus. Las razones para que ello ocurra
no estn esclarecidas completamente pero
se mencionan como posibles las siguientes:
1.- Sistema vascular poco diferenciado. Los
virus son rpidamente transportados a lo largo de toda la planta por el floema y as se
distribuyen sistmicamente. Los meristemas
no tienen tejido vascular formado, por lo
tanto, el avance es solamente a travs del
movimiento clula a clula. Se comprob que
el Tobacco mosaic virus (TMV) y el Potato
virus X (PVX) avanzan 1 a 8 cm/h por el tejido vascular y 5 a 15 /h de clula a clula. Por
esta razn se supone que las clulas
meristemticas no estn completamente invadidas por virus cuando estn en activo crecimiento.
2.- Elevada actividad metablica.
Presumiblemente es ms difcil para un virus
invadir clulas con elevada actividad
metablica, como es el caso de las clulas
meristemticas, donde tiene lugar una activa mitosis.
3.- Elevadas concentraciones de auxinas.
Se ha observado que elevadas concentraciones de 2,4-D en el medio de cultivo inhiben
la multiplicacin de los virus. Por lo tanto se
puede suponer que las altas concentraciones
de auxinas endgenas existentes en los pices meristemticos pueden producir un efecto similar.
Primordios
foliares
Nudos
Figura 1: Esquema ilustrativo de la iniciacin de la hoja

en el pice del brote de dicotilednea de hojas opuestas
(Esau, 1959).
4 Factores que pueden afectar la

produccin de plantas libres de virus
3 Meristema apical
El meristema apical incluye las clulas
meristemticas iniciales y sus derivadas inmediatas del pice de la raz o del brote. El nmero de clulas iniciales es variable y pueden
presentarse en una o ms filas.
304
Dentro del meristema apical se distinguen

dos zonas de tejido: la tnica, que consta de
una o ms capas perifricas de clulas, y el
cuerpo, masa celular rodeada por la tnica.
La demarcacin entre ambas zonas se deduce de las diferencias en la divisin de las clulas. Las capas de la tnica presentan predominantemente divisiones anticlinales, es decir, experimentan un crecimiento en superficie. Las clulas del cuerpo se dividen segn
varios planos y la masa crece en volumen. El
concepto de tnica-cuerpo fue desarrollado
refirindose a las angiospermas pero resulta
poco apropiado para la caracterizacin del
meristema apical de las gimnospermas. En
este grupo se presentan comnmente varias
zonas de crecimiento derivadas de un grupo
de clulas iniciales superficiales.
El dimetro de los pices oscila entre 90
en algunas angiospermas a 3,5mm en el caso
de Cyca revoluta. La forma y el tamao del
pice cambian notoriamente durante el desarrollo de la planta.
Las hojas se inician mediante divisiones
periclinales de un pequeo grupo de clulas
situadas al lado del meristema y su situacin
en relacin al meristema apical vara en las
diferentes especies (Fig. 1).
Varios factores pueden afectar el buen

desarrollo in vitro de una planta a partir de
un meristema: el medio de cultivo empleado, el estado fisiolgico del explanto, la concentracin de hormonas endgenas del
CONCI, Vilma C.
explanto, las contaminaciones internas o

externas producidas durante el desarrollo del
cultivo, el tamao y localizacin del explanto,
etc. Mencionaremos aqu algunas consideraciones haciendo especial referencia a aquellas que afectan la obtencin de plantas libres de virus.
- Localizacin del explanto: frecuentemente se utilizan meristemas apicales y
axilares con buenos resultados. Sin embargo
es aconsejable el uso de yemas terminales
ya que tienen un mayor crecimiento potencial que las yemas laterales. En general, los
meristemas ms jvenes se desarrollan mejor que los viejos y producen mayores cantidades de plantas libres de virus que las yemas laterales, probablemente porque tienen
un crecimiento ms activo que las axilares. No
obstante, tambin es posible la obtencin
de plantas sanas a partir de yemas axilares.
- Estacin o momento de la extraccin:
los meristemas en activo crecimiento son los
ms recomendados por su alto potencial de
desarrollo, situacin que favorece las posibilidades de obtener plantas libres de virus. Para
especies vegetales con perodos de
dormancia definidos los mejores resultados
se obtienen cuando los meristemas estn
despiertos y comienzan a brotar. En el caso
de ser necesario se recomienda despertar el
material. Los tratamientos ms usados consisten en someterlo a perodos de fro (variable segn la especie) y/o el uso de cido
giberlico.
- Tamao del explanto utilizado: el
meristema tiene una serie de requerimientos
nutricionales para cumplir sus funciones de
autoperpetuacin y de generar clulas para
formar tejidos definidos. Por lo tanto, al ser
retirado de la planta debe ser sembrado en
un medio de cultivo apropiado, as rpidamente desarrolla en una planta completa.
Cuanto ms pequeo sea el meristema
(explanto) ms difcil ser encontrar el medio de cultivo adecuado que permita un buen
desarrollo. Se ha observado que sembrar slo
el domo meristemtico, en general no da
buenos resultados. En la mayora de los casos no se desarrolla una planta, slo produce callo que luego puede, o no, regenerar
plantas. Como se mencion anteriormente,

la diferenciacin a partir de callo implica un
incremento en la posibilidad de aparicin de
mutaciones y de variabilidad no deseada
cuando se intenta obtener plantas
genticamente iguales a las donantes de
explantos. Por esta razn generalmente se
cultiva el domo, con uno o dos primordios
foliares, a partir del cual se obtiene con frecuencia una planta completa.
El tamao del explanto, as como el nmero de primordios que deba poseer, depender, en cada caso, del objetivo que se
persiga, la especie vegetal que se trate y el o
los virus involucrados. En trminos generales,
cuanto ms grande sea el explanto, mayor
ser la posibilidad de regenerar plantas, pero
menor la posibilidad de obtener plantas libres de virus. Si por el contrario se parte de
plantas ya saneadas, o lo que se desea es
slo la multiplicacin del material in vitro, se
podrn usar yemas o brotes de mayor tamao y asegurar as el desarrollo de una planta
sin mayores requerimientos nutricionales.
Existe un gradiente de incremento en la
concentracin de virus desde el domo
meristemtico hacia los sucesivos primordios
foliares coincidiendo con el grado de diferenciacin. Esto significa que la probabilidad de
obtener plantas libres de virus es inversamente proporcional al tamao del
explanto utilizado. Explantos de entre 0,2 y
0,5 mm son los que ms frecuentemente producen plantas libres de virus. Tambin se han
informado, sin embargo, buenos resultados
con el empleo de meristemas ms grandes.
El tamao recomendado es variable y depende del hospedante, de tratamientos previos
(termoterapia, quimioterapia, etc.) y del (o
los) virus involucrados. En algunos casos no
slo es importante considerar la especie
hospedante sino tambin el cultivar, ya que
se han detectado notables diferencias entre
ellos.
Por otra parte, es probable que el tamao del meristema por si solo no sea el factor
que determina el xito en la obtencin de
plantas libres de virus. Se han detectado numerosos virus en meristemas apicales de 0,10,5mm en diferentes especies (clavel, poroto, tabaco, tomate, petunia, papa, etc.). Sin
embargo se ha logrado la obtencin de plantas sanas con explantos de esos tamaos o
305
mayores, por lo que se podra suponer que

la eliminacin de virus ocurre tambin durante el proceso de cultivo in vitro o por alguna
otra razn no aclarada todava.
5 Desarrollo del cultivo
El primer paso es la extraccin del
meristema o explanto. Para ello se corta una
porcin de tejido de aproximadamente 1cm
que incluye el meristema y se desinfecta. Esto
frecuentemente se realiza mediante la inmersin en alcohol seguida de inmersin en
hipoclorito de sodio o calcio. Luego en la cmara de flujo laminar y con la ayuda de instrumental estril y bajo microscopio
estereoscpico se procede a la escisin del
explanto. Una vez extrado se coloca en un
medio de cultivo adecuado en el cual es mantenido, para su desarrollo, bajo condiciones
apropiadas de luz, temperatura y humedad.
- Fase I: Etapa de iniciacin: el objetivo
de esta primera etapa es iniciar el desarrollo
del explanto cultivado en forma asptica. En
general ocurre primero un aumento del tamao y luego el tejido puede ir adquiriendo
lentamente pigmentacin verde. Posteriormente irn desarrollndose brotes o plantas
completas a partir de las cuales pueden
obtenerse yemas axilares.
- Fase II: Etapa de multiplicacin: en esta
etapa el objetivo es la multiplicacin activa
del explanto para la produccin de numerosas plantas a partir de una, constituyendo
as un clon proveniente de un solo meristema,
denominado en este caso mericlon. La
multiplicacin o micropropagacin puede
efectuarse por proliferacin de brotes axilares,
brotes adventicios, formacin de embriones
somticos, etc., tratando siempre de evitar
la formacin de callo como paso previo a la
diferenciacin. La etapa de multiplicacin
puede involucrar varios repiques del material
a medio de cultivo fresco. Se ha visto con frecuencia que la tasa de multiplicacin vara con
el tiempo de permanencia del explanto en
el medio de cultivo. Es frecuente que despus
de 2 o ms subcultivos aumente el nmero
de yemas que se producen a partir de un
explanto. Sin embargo no es aconsejable
mantener el material indefinidamente en
306
esta etapa, ya que se ha observado un aumento de la variabilidad cuando las plantas

son mantenidas por largos perodos en estas condiciones. En general, se considera que
10-12 subcultivos es lo mximo que debera
mantenerse el material en esta etapa.
- Fase III: Etapa de acondicionamiento
para el transplante a tierra: frecuentemente las plantas desarrolladas in vitro no poseen races o, si las tienen, muchas veces no
son funcionales. En general tienen malas conexiones vasculares entre la raz y el tallo. A
nivel foliar puede estar alterada la produccin de clorofila. Los estomas no funcionan
o lo hacen muy lentamente y la capa de cera
epicuticular es muy reducida.
La formacin de races adventicias es relativamente fcil de conseguir en plantas
herbceas, y dificultosa en leosas. Existe una
etapa de induccin de races, de iniciacin del
crecimiento y de elongacin de las mismas.
En esta fase del crecimiento se suele incrementar la intensidad de luz para favorecer la rusticacin de las plantas pero hay que
tratar de que la misma no afecte a las races.
Esto puede mejorarse cubriendo la base de
los tubos con papel de aluminio o usando
0,3% de carbn activado en el medio de cultivo para proporcionar sombra a las races.
Las plantas que se propagan por bulbos,
tubrculos, rizomas, etc., pueden ser inducidas a formarlos in vitro para mejorar la eficiencia en el transplante, ya que stos pueden ser cosechados del tubo de ensayo y
sembrados directamente en tierra sin mayores dificultades.
-Transplante: en el momento del transplante es importante no daar las races. Es
necesario lavarlas cuidadosamente para retirar los restos de agar, debido a que los medios de cultivo ofrecen un buen sustrato para
el desarrollo de hongos y bacterias que pueden afectar el desarrollo de la planta en el
suelo.
El mayor problema en esta etapa es la
deshidratacin debida a algunas caractersticas anatmicas que presentan las plantas
creciendo in vitro (reducida cera epicuticular,
lentitud de movimiento estomtico, abun-
CONCI, Vilma C.
dantes espacios intercelulares, dificultades en

la conexiones entre el tallo y la raz). Conviene transferir las plantas a macetas y mantenerlas con alta humedad relativa durante los
primeros 15 das. Se han observado buenos
resultados con el uso de roco artificial o neblina. Otra prctica frecuente es cubrir las
plantas con polietileno o recipientes de vidrio transparente, a modo de cmara hmeda, y descubrirlas progresivamente hasta
destaparlas completamente al cabo de 3 4
semanas.
ladas de focos de contaminacin. Esta etapa se extiende todo el tiempo necesario hasta la obtencin del nmero requerido de individuos para realizar la produccin a nivel
comercial. Si el rea protegida est lo suficientemente alejada de plantas infectadas y se
evita el acceso de los vectores, es posible
mantener las plantas libres de virus por muchos ciclos de cultivo. Son fundamentales los
anlisis peridicos que permitan llevar un registro del estado sanitario del material.
6 Multiplicacin del material libre de

virus ex vitro
7 Algunas alternativas para mejorar la

eficiencia en la produccin de plantas
libres de virus
Las plantas libres de virus deben ser multiplicadas bajo condiciones controladas para
evitar su recontaminacin. Una vez rusticadas
y adaptadas nuevamente a las condiciones
ex vitro ellas pueden ser multiplicadas bajo
jaulas antivectores todo el tiempo que se
considere necesario. En esta etapa es importante evitar que las plantas se reinfecten. Es
recomendable la esterilizacin del suelo para
evitar la contaminacin con nematodes y
hongos, que en algunos casos son transmisores de virus. Las jaulas deben estar revestidas de una malla muy fina para evitar la entrada de los vectores. Es recomendable, para
evitar la entrada de los vectores, utilizar una
doble puerta que permita abrir una de las
hojas y recin cuando est cerrada, abrir la
otra. Peridicamente la malla debe ser controlada para detectar inmediatamente la
presencia de roturas que dejen expuestas a
las plantas. A pesar de estos cuidados, es recomendable aplicar insecticidas y mantener
libre de malezas dentro y fuera de la jaula,
ya que las mismas pueden actuar como
reservorios de vectores. Si bien la sanidad del
material introducido a las jaulas debe ser previamente controlada, es conveniente, en esta
etapa, repetir los anlisis para detectar rpidamente la presencia de una infeccin a fin
de eliminarla antes de que se propague. En
estas condiciones es posible mantener como
plantas madres, por mucho tiempo, un
stock de material libre de virus a partir del
cual se pueden hacer las sucesivas multiplicaciones.
La etapa de multiplicacin masiva, o a
gran escala, se realiza a campo en reas ais-
- Termoterapia: es la tcnica ms antigua

utilizada para la liberacin de patgenos en
plantas. No obstante, es difcil la obtencin
de plantas libres de virus con el empleo de
altas temperaturas solamente. Mantener las
plantas enfermas por perodos prolongados
en termoterapia disminuye la concentracin
de virus, pero al llevar las plantas nuevamente a condiciones normales, en poco tiempo
recuperan la concentracin original.
Una prctica muy usada es la combinacin de la termoterapia y el cultivo de
meristemas. Esto implica mantener las plantas en termoterapia por un perodo variable
de tiempo y temperatura (generalmente
entre 34 y 38C desde una a varias semanas), luego se realiza la extraccin del
meristema, se siembra en el medio de cultivo y se contina con los pasos convencionales para su desarrollo.
Esta prctica no es efectiva para todos
los virus por igual, depende del virus y del
hospedante. Se ha observado que un mismo virus en distintas especies se inactiva en
forma diferente. Generalmente, esta prctica ha resultado ms efectiva en virus de partculas alargadas, y menos eficiente para virus polidricos.
Podra suponerse que cuanto ms largo
es el tratamiento de calor, resulta ms efectivo; sin embargo, no siempre es as. En crisantemo y en ajo se ha mencionado, por
ejemplo, que tratamientos de 10-30 das
pueden ser efectivos para la liberacin de algunos virus; en cambio, tratamientos ms
prolongados no siempre producen mayor
porcentaje de plantas sanas. Estos tratamien-
307
tos prolongados, por otra parte, dificultan

la implantacin in vitro del tejido, lo cual se
traduce en un nmero ms reducido de plantas obtenidas.
En algunos casos las bajas temperaturas
(5C) seguidas del cultivo de meristemas fueron utilizadas con xito para la eliminacin
de virus. Esta prctica fue aplicada principalmente en el caso de viroides, los cuales se
desarrollan bien con altas temperaturas.
- Quimioterapia: el uso de antivirales sera la solucin definitiva para estas enfermedades; sin embargo, hasta ahora no se ha
encontrado un producto que por s solo cumpla esta funcin. Algunas sustancias qumicas
ocasionan una disminucin en la concentracin de virus existentes en la planta y atenan, o suprimen, los sntomas tpicos de los
virus, pero, una vez suspendido el tratamiento se recupera la concentracin original. Han
sido evaluadas diferentes sustancias pero la
ms utilizada es el Ribavirin o Virazole (1--Dribofuranosyl-1, 2, 4 triazole 3- carboxamide).
Un modo adecuado de emplear los antivirales es combinndolos con el cultivo de
meristemas. Tambin han sido aplicados directamente a los meristemas in vitro. En este
caso, el antiviral es colocado en medio del
cultivo en concentraciones variables, que van
desde 10 a 50 mg/l, y en algunos casos hasta
100 mg/l. Las plantas son mantenidas bajo
la accin del antiviral por largos perodos que
incluyen varios subcultivos.
Un problema importante con el Virasole
es su fitotoxicidad, que a su vez depende de
la dosis empleada y de la especie de planta
utilizada. El xito del proceso en muchos casos requiere de varios meses de tratamiento
y la fitotoxicidad del antiviral constituye una
dificultad.
Tambin se han obtenido plantas libres
de virus a partir de callos a los que previamente se les aplic Virasole, aunque esta
prctica no ha sido eficiente en todos los casos.
- Electroterapia: el mtodo consiste en
aplicar corriente elctrica a yemas por un
perodo variable de tiempo para obtener
plantas libres de patgenos. Se menciona
que la aplicacin de electricidad produce de-
308
gradacin de las partculas y prdida de

infectividad. Esta tcnica ha sido citada para
liberar del mosaico al almendro cv
Caetanuccia. Para ello los brotes fueron sometidos a 500V por tiempos variables y luego injertados sobre pies sanos (obtenidos
por semilla). Se seal que con 5 minutos de
tratamiento los resultados fueron buenos y
con 20 minutos se obtuvo completa
inactivacin. El mtodo tambin ha sido
empleado para eliminar bacterias de caa de
azcar, Potato leaf roll virus de papa,
Dasheen mosaic virus de araceas y Banana
streak virus de banana, entre otras, aplicando 5-30V a las yemas por un perodo de 5
minutos. En este caso se obtuvo una eficiencia del 3 al 60%, dependiendo del cultivar y el
patgeno.
- Cultivo de domos proveniente del disco basal (stem-disc dome culture): el procedimiento consiste en la obtencin de plantas libres de virus a partir del cultivo de estructuras con forma de domo, diferenciadas
a partir del cultivo del disco basal de dientes
de ajo.
Se ha informado la diferenciacin de 2030 brotes a partir del cultivo del disco basal
de dientes de ajo en 1 mes de cultivo. Este
mtodo fue designado por los autores
(Ayabe y Sumi, 1998) como cultivo del disco
basal (stem-disc culture). Una modificacin
posterior de esta tcnica consiste en la extraccin de las estructuras con forma de
domo y su posterior cultivo en un medio adecuado para la obtencin de plantas.
- Microinjerto de pices caulinares in
vitro para obtencin de plantas de naranjo libres de virus: consiste en extraer el pice caulinar de la variedad a injertar,
constitudo por el domo apical y primordios
foliares, y luego sembrarlo sobre la superficie
decapitada del epictilo de una plntula de
2 semanas de edad (patrn) proveniente de
semilla crecida in vitro. Ver VIII-7 (plantas ctricas libres de enfermedades)
8 Anlisis de las plantas obtenidas o
indexing
De lo expuesto previamente surge que
existen varias alternativas para obtener plantas libres de virus a partir del cultivo de
meristemas. Si bien existen algunos
CONCI, Vilma C.
lineamientos, o consideraciones generales

para tener ms probabilidades de xito, no
hay proceso que ofrezca total seguridad. La
etapa decisiva en este sistema es el anlisis
que permite comprobar si realmente se ha
producido la total erradicacin de los virus.
En la bibliografa se sealan distintos porcentajes de xito en el proceso. Esto significa que
empleando el mismo protocolo, en el mismo momento, con el mismo material, se consiguen plantas sanas y plantas que an permanecen infectadas. Por lo tanto, la nica
forma de separar las plantas sanas de las
enfermas es un anlisis que permita distinguirlas para luego multiplicar solo aquellas que
fueron liberadas de los virus. El xito de un
programa de produccin de plantas libres de
virus no depende de la obtencin de un alto
porcentaje de plantas sanas en al primera
etapa, sino en la obtencin de al menos unas
pocas plantas madres realmente libres de
patgenos. Si el nmero es escaso pueden
ser multiplicadas por diferentes sistemas,
pero si alguna de ellas est contaminada,
todo el trabajo ser intil, porque al final,
despus de las multiplicaciones a campo, lo
ms probable es que tengamos todas las
plantas enfermas.
Las plantas deben ser analizadas una por
una para hacer una buena seleccin de plantas madres a partir de las cuales se iniciarn
los procesos de multiplicacin del material.
Es recomendable hacerle ms de un anlisis
para asegurar su sanidad, es preferible que
sea en etapas diferentes a lo largo del proceso, y en lo posible por tcnicas distintas.
Para realizar un anlisis confiable hay que
tener en cuenta varios factores que son especficos para cada combinacin planta-patgeno. Es importante el empleo de sistemas de alta sensibilidad que nos permitan
detectar los virus aun en bajas concentraciones; sin embargo, no existe un sistema que
sea infalible, siempre hay un lmite de concentracin por debajo del cual el virus no
puede ser detectado. Para evitar errores en
este sentido es recomendable tener en cuenta algunos factores. Como ya se ha mencionado, la concentracin de virus no es igual
en todas las partes de una planta; por lo tanto, si queremos hacer un anlisis confiable hay
que establecer qu tejidos y rganos son los
que concentran ms el patgeno y realizar
la prueba a partir de ellos. Del mismo modo

tambin se ha comprobado que existen fluctuaciones a lo largo del ciclo de cultivo; por lo
tanto, es conveniente realizar el anlisis cuando la concentracin de virus es mayor. Esto
es importante cuando se prueba el material
a campo.
La eleccin de la tcnica de anlisis depender del patgeno que se desea eliminar y de las posibilidades para realizarla.
Cuanto ms temprano se descarten las
plantas contaminadas ms seguro ser el sistema. Una planta infectada siempre es un
foco de contaminacin. Por ms cuidados
que se tengan siempre se corren riesgos.
Cuando las plantas estn in vitro, en general, la concentracin de virus es muy baja,
probablemente debido a las condiciones de
cultivo, la concentracin de hormonas en el
medio, u otros factores no bien establecidos.
Sin embargo, es recomendable hacer un anlisis riguroso antes de empezar con la
micropropagacin para hacer el primer descarte de individuos enfermos.
Frecuentemente se menciona en esta
etapa el empleo de la tcnica inmunoenzimtica de doble sndwich de anticuerpos
(DAS-ELISA). Esta prueba se realiza en una
placa de poliestireno con 96 celdillas en la cual
se lleva a cabo una prueba por celdilla. En el
primer paso cada celda es tapizada por el
anticuerpo especfico para el patgeno que
se est analizando. Luego se coloca el extracto de la planta a probar. Si los virus estn en
el mismo sern atrapados por el anticuerpo
previamente colocado. En el tercer paso se
aplica un anticuerpo combinado con una
enzima y en el ltimo paso se coloca el
sustrato especfico para la enzima. Si el virus
est presente en la muestra se produce el
sndwich anticuerpo-virus-anticuerpo conjugado con la enzima, el sustrato es desdoblado y la reaccin vira al color amarillo (respuesta positiva, planta enferma). (Fig. 2).
Esta tcnica tiene varias ventajas, ya que
permite el anlisis simultneo de muchas
muestras (96 celdillas por placa y se pueden
hacer varias placas simultneamente). Es relativamente fcil de usar y de bajo costo. Sin
embargo, nuestra experiencia nos indica que
esta prueba no es lo suficientemente sensible para detectar los virus en algunos casos.
Muchas de las plantas in vitro que dan resul-
309
tados negativos mediante DAS-ELISA resultan positivas cuando se prueban por otra
tcnica. Algunas variantes, como ELISA en
membrana de nitrocelulosa o Dot Blot, han
sido empleadas con resultados ms satisfactorios; sin embargo, estas tcnicas por s solas permiten el escape de muchas plantas
infectadas.
Figura 3: Extracto vegetal

conteniendo una mezcla
de virus probado por
ISEM-D con antisuero para
Garlic virus A. Izq.,
partcula viral decorada
con el antisuero utilizado.
Der., partcula viral no
decorada de una especie
viral diferente.
Mejores resultados se han obtenido con

el empleo de tcnicas que combinan la
Figura 2: Placa de DAS-ELISA mostrando resultados

positivos (celdillas oscuras) y negativos (celdillas claras).
serologa con la microscopia electrnica como

son la inmunoelectromicroscopa con o sin
decoracin (ISEM o ISEM-D). En esta tcnica
se tapiza una grilla porta especimen con anticuerpo y luego se coloca sobre ella el extracto de la planta a probar. Si las partculas virales
estn presentes quedarn atrapadas al anticuerpo. Luego se contrasta y se observa por
el microscopio electrnico (ME), donde se
pueden ver las partculas de virus que han sido
selectivamente atrapadas. Esto es lo que se
llama ISEM. Si antes de contrastar se aplica
otra vez el antisuero y ste es atrapado por
las partculas virales las mismas se vern ms
oscuras al ME, decoradas (ISEM-D) y sern
ms fciles de detectar (Fig. 3). Estas tcnicas son altamente sensibles, permiten la observacin directa del virus por lo cual no hay
falsos positivos y no se requiere un antisuero
de alta calidad para su desarrollo. El grave
inconveniente con ellas es que no son de uso
masivo, porque es engorroso analizar gran
cantidad de muestras, y por otra parte, se
requiere de un ME, que es un equipo altamente costoso.
310
Las tcnicas basadas en la deteccin de

los cidos nucleicos han mostrado un gran
desarrollo y evolucin en la ltima dcada, y
son utilizadas con frecuencia debido a su alta
sensibilidad y especificidad. El uso de sondas
moleculares ha dado buenos resultados. Consiste en dar condiciones para que el cido
nucleico del patgeno, fijado sobre un soporte slido (membrana de nylon), se una con
un fragmento de cido nucleico complementario, marcado con molculas radioactivas, o
con un antgeno que luego ser reconocido
por un anticuerpo especfico que ser detectado por colorimetra o fluorescencia. La reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) y
sus variantes son las tcnicas de mayor sensibilidad con que se cuenta actualmente. Entre ellas se mencionan: PCR anidado, transcripcin reversa (RT), inmuno captura (IC) PCR
post. transcripcin reversa (RT-PCR), entre
otras. La PCR consiste en amplificar un fragmento del genoma del virus mediante la utilizacin de dos iniciadores que hibridan
especficamente en el genoma del patgeno. La tcnica permite producir, en corto
tiempo, muchas copias del segmento del
genoma comprendido entre los 2 iniciadores, de tal forma que luego es posible observarlo con facilidad en un gel (Fig. 4). Esto
posibilita la deteccin de los virus, aun en
bajsimas concentraciones. Esta tcnica adems puede ser combinada con la serologa y
ser realizada en placas como las de ELISA, lo
que permite el anlisis simultneo de muchas
plantas. Estas pruebas, si bien son altamente sensibles, no son an de uso masivo porque tienen un costo muy elevado.
Para obtener resultados en forma prctica y confiable es posible tambin la combi-
CONCI, Vilma C.
Figura 4: Fragmentos
amplificados por IC-RTPCR. Lneas 1-4,
segmentos de 489pb
correspondientes a
Onion yellow dwarf
virus; lneas 4-5,
segmentos de 566pb
correspondientes a
Leek yellow stripe
virus; lnea 6, marcador
de peso molecular.
nacin de varias pruebas, pudiendo, por

ejemplo, aprovechar la practicidad del ELISA
y la sensibilidad de las tcnicas moleculares,
o de ISEM u otras. En este caso, las plantas
que resultan negativas para el test de ELISA
pueden ser luego analizadas por una tcnica
ms sensible y disminuir as el nmero de pruebas complicadas o costosas. Esto depende
de la cantidad de plantas que ELISA sea capaz de detectar, porque si no es lo suficientemente sensible tendremos que repetir la
prueba con todas, o casi todas las muestras.
Como se mencion anteriormente, la
concentracin de virus en las plantas in vitro
en general es baja, por lo tanto, se corre el
grave riesgo de considerar como sanas plantas que, en realidad, estn infectadas. Por
esta razn se hace casi obligatorio repetir los
anlisis cuando las plantas son transferidas
al suelo. Es necesario dejar pasar cierto tiempo antes de hacer el anlisis, para que si el
virus est presente, tenga la posibilidad de
incrementar su concentracin y ser entonces
fcilmente detectado. En esta etapa se utiliza con frecuencia el test de ELISA en cualquiera de sus variantes, que generalmente conduce a resultados confiables.
En algunos casos el sistema que resulta
ms eficiente para hacer el indexing es el
empleo de plantas indicadoras. El injerto es
la forma ms segura de transmitir un virus y
esto es lo que se emplea como sistema de
diagnstico. Se realiza un injerto desde la
planta que se desea probar a plantas que
son susceptibles al virus (planta indicadora) y
que desarrollan sntomas claros y evidentes
de la presencia del patgeno. El inconveniente, en este tipo de anlisis, es que hay que
esperar que la planta obtenida in vitro sea

transferida al suelo, luego que se desarrolle
lo suficiente como para extraer una porcin
de tejido (hoja, yema, brote, etc., segn el
tipo de injerto). Se requiere adems de un
operador con habilidad para realizar el injerto con xito y luego mantener las plantas
injertadas en condiciones adecuadas hasta
la aparicin de los sntomas. En algunos casos, este tiempo puede ser muy prolongado. A pesar de los inconvenientes que se mencionan, para algunas especies este sigue siendo el mtodo ms seguro. Por ejemplo la
frutilla, que es afectada por ms de 20 enfermedades diferentes y que en muchos casos
ni siquiera ha sido todava caracterizado el
agente causal, la transmisin del virus a plantas indicadoras resulta la prueba ms efectiva. En este caso se injerta el fololo medio de
una hoja perteneciente a la planta que se
desea probar en plantas indicadoras en las
cuales los patgenos van a dar sntomas claros. Algunos virus se van a manifestar despus de 2 3 semanas de realizado el injerto; en otros casos, la bibliografa menciona
que los sntomas aparecen entre los 6 y 12
meses. Con frecuencia, no es posible identificar que virus es el que est presente, pero es
posible determinar si la planta est infectada.
En vid, parte de los virus son analizados
mediante ELISA. Pero otros son probados por
injerto a plantas indicadoras. Algunos de los
virus pueden ser detectados en pocas semanas, pero para el stem pitting/grooving
sindrome, por ejemplo, es necesario esperar
entre 8 y 12 meses.
9 Algunas consideraciones respecto a los
anlisis de virus
En general, cuando se habla de las plantas liberadas de virus se emplean trminos
como plantas libres de virus planta sana
o saneada sin que se defina qu virus fueron eliminados ni qu pruebas se emplearon
para comprobar su eliminacin. El concepto
de plantas libres de virus debera estar acotado al, o a los virus, analizados. En el caso
de plantas que son afectadas por un conjunto de virus diferentes sera necesario realizar
un anlisis independiente para cada uno de
311
ellos y sealar el o los virus de los cuales ha

sido liberada o probada. Por otra parte debe
definirse la tcnica de anlisis empleada.
Como se mencion previamente pueden
emplearse diferentes mtodos de diagnstico con distintos grados de sensibilidad. As,
por ejemplo, si se cuenta con un DAS-ELISA
calibrado para detectar hasta 10 ng/ml y un
RT-PCR que puede detectar 10 pg/ml y se
analiza una planta con 50 pg/ml; la tcnica
de DAS-ELISA no va a detectar el patgeno y
el resultado ser negativo, mientras que el
RT-PCR arrojar un resultado positivo. Todas
las tcnicas tienen un lmite de sensibilidad
por debajo del cual no son capaces de detectar la presencia del patgeno. Por consiguiente, dependiendo de la sensibilidad de
la tcnica que se use, el porcentaje de plantas supuestamente libres de virus puede
variar. Lo correcto sera entonces hablar de
plantas negativas a un virus probado mediante una tcnica determinada. Por ejemplo, plantas negativas a Onion yellow
dwarf virus mediante DAS-ELISA, lo que no
significa que realmente est libre de virus sino
que la tcnica no lo detect. Por esa razn
se aconseja evaluar las plantas en ms de una
oportunidad y repetir los anlisis cuando las
plantas estn a campo, para darle al patgeno, si est presente, la posibilidad de multiplicarse.
10 Agradecimientos
QUACQUARELLI, A., GALLITELLI, D., SAVINO, V., and

PIAZZOLLA, P. 1980. The use of electric current for
obtaining mosaic-free almonds. Acta Phytopathologica
Academiae Scientiarum Hungaricae, Vol, 15 (1-4):251-255.
A los Ing. Agr. MSc Delia Docampo, Sergio

Nome y al Dr. Luis Conci por la revisin del
presente manuscrito; y a la Ing. Agr. Eva
Cafrune por su colaboracin en la bsqueda
de informacin.
312
AYABE, M. and SUMI, S. 1998. Establishment of a novel

tissue culture method, sem-disc culture, and is practical
application to micropropagation of garlic (Allium
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CONCI, Vilma C.
VIII.-Captulo 6
Produccin de plantas de ajo libres de
virus
Conci, Vilma C.; Cafrune, Eva E.;
Lunello, Pablo; Nome; Sergio; Perotto, Cecilia
1 Introduccin
De los cultivos de Alliaceae, el ajo (Allium
sativum L.) es considerado como una especie valiosa por muchas culturas diferentes.
Adems de su conocida utilizacin en el arte
culinario, hoy es un producto apreciado por
sus beneficios medicinales, especialmente en
Europa y Asia. Algunos de sus productos derivados, poseen actividades biolgicas tales
como antibiticas, antiparasitario, reductores
de riesgo de enfermedades cardiovasculares
y como potenciales agentes anticancergenos.
El ajo es la principal hortaliza exportable
de Argentina desde el punto de vista de la
entrada de divisas, siendo este pas el segundo exportador mundial despus de China.
Las exigencias cada vez mayores del mercado y la aparicin permanente de nuevos competidores obligan a replantear las estrategias
de produccin nacional.
Entre las enfermedades que afectan a
este cultivo, los virus son los responsables de
las mayores prdidas (entre un 20 y 80% de
disminucin en el peso de los bulbos). Las
infecciones son causadas por un complejo
viral que incluye Potyvirus (Onion yellow
dwarf virus, OYDV, y Leek yellow stripe virus, LYSV); Carlavirus (Garlic common latent
virus, GCLV y Shallot lantent virus, SLV), y
Allexivirus (Garlic virus-A, -B, -C, -D, -E, -X,
GarV-A B C- D- E -X; Garlic mite-borne
filamentous virus, GarMbFV). Este conjunto causa un mosaico que si bien no mata la
planta produce una infeccin crnica. Debido a la exclusiva propagacin agmica de
esta especie, la totalidad de las plantas estn infectadas por virus, por lo tanto es evidente la importancia que tiene la obtencin
de propgulo libre de virus como salida de
control. En Argentina se ha detectado la presencia de OYDV y LYSV, GCLV, GarMbFV,
GarV-C y otros Allexivirus todava no caracterizados completamente.
A modo de ejemplo se detalla a continuacin un protocolo de produccin de ajo

libre de virus.
2 Procedimiento para la obtencin de ajo
libre de virus
A) Termoterapia: en trabajos realizados
en la Argentina se ensayaron tratamientos
de termoterapia con agua y con aire caliente, antes de la extraccin del meristema. Los
mejores resultados se obtuvieron con aire caliente. Para ello dientes de ajo fueron sembrados en terrinas con una mezcla de tierra/
mantillo/arena (1/1/1) y mantenidos en una
cmara a 36C. Cuando plantas de ajo Blanco fueron sometidas 60 das a 36C y luego
se hizo el cultivo de meristema, se regeneraron pocas plantas, pero las que se obtuvieron resultaron libres de virus. Cuando se
probaron 5 cultivares de ajo durante 40 das
a 36C se pudo observar valores de supervivencia del cultivo de meristema que variaron
entre 40 y 82%, resultando libres de virus
entre 30 y 100% de las plantas obtenidas,
dependiendo del cultivar. Los controles en
los cuales se obtuvieron plantas slo por cultivo de meristema, sin termoterapia, el porcentaje de plantas desarrolladas vari entre
70 y 100%, y de ellas, en algunos cultivares,
no se obtuvieron plantas libres de virus y
en otros lleg hasta el 21%.
Trabajos realizados posteriormente pusieron en evidencia que la posibilidad de liberar
de virus por termoterapia es muy variable.
En algunos monoclones de ajo Blanco y Colorado se observ que a pesar de ser sometidos a perodos prolongados (ms de 60 das)
a 36C, no fue posible eliminar todos los virus integrantes del complejo; paralelamente,
otros genotipos fueron liberados de virus
slo con el empleo del cultivo de meristema.
B) Cultivo de meristema, primer anlisis
y micropropagacin: para la extraccin del
meristema se corta un trozo de tejido en
forma cbica, incluyendo el disco basal donde est el meristema. Este se desinfecta mediante una inmersin en alcohol 70% y luego
con hipoclorito de Na al 5 % durante 10-15
min. Posteriormente, el trozo de tejido es colocado sobre papel estril bajo una lupa
estereoscpica dentro de una cmara de flu-
313
jo laminar y con la
ayuda de instrumental estril se procede
a la extraccin del
explanto constituido por el domo ms
1 primordio foliar
(0,3 mm aproximadamente). Luego de
la escisin es rpidamente sembrado
en medio de iniciacin donde se desarrollar una planta
completa (Fig. 1, A).
Las plantas obtenidas son analizadas mediante ISEMD con un antisuero
producido a partir
de plantas de ajo
enfermas con la
mezcla de virus que
naturalmente infectan al cultivo. Aquellas plantas que resultan negativas a
esta prueba son
evaluadas
con
antisueros especficos para OYDV,
LYSV, GCLV, SLV,
GarMbFV y con un
antisuero que detecta fundamentalmente una mezcla
de
diferentes
Allexivirus.
Las
plantas negativas a
todos ellos son
transferidas a un
medio de micropropagacin. En este Figura 1: Produccin de ajo libres de virus. A: planta en medio de iniciacin. B:
medio es posible micropropagacin. C: bulbillos obtenidos in vitro (microbulbillos). D: planta transferida
a tierra y mantenida en cmara hmeda. E: planta adaptada a las condiciones ex vitro.
una tasa de multipli- F: plantas en suelo bajo jaula antifidos. G: multiplicacin a gran escala bajo jaula
cacin de 1:2-1:8 de- antifidos. H: bulbos de ajo libre de virus (arriba) e infectados (abajo).
pendiendo del cultivar (Fig. 1, B).. Esta
tasa vara con el nmero de repiques en el
C) Rusticacin y transplante a tierra bajo
medio de cultivo, siendo baja en los prime- condiciones controladas: despus de varios
ros y aumenta a partir del segundo o tercer ciclos in vitro, muchas plantas bulbifican esrepique, adems se detectaron diferencias pontneamente y otras deben ser inducidas
entre los distintos meristemas.
(Fig. 1, C). Repicando los plantines a un me-
314
CONCI, Vilma C.; CAFRUNE, Eva E.; LUNELLO, Pablo; NOME, Sergio; PEROTTO, Cecilia
Lneas selectas
Termoterapia
Cultivo de meristema (medio de iniciacin)
ANALISIS por ISEM-D
Plantas in vitro
(OYDV, LYSV, GCLV, SLV,

GarV A, y otros
- Allexivirus
Multiplicacin in vitro (en medio de multiplicacin)
Bulbificacin in vitro
(medio de bulbificacin)
Planta in vitro
1 generacin en suelo
(bajo jaula)
2 mas generaciones en suelo
(bajo jaula)
Multiplicacin en reas aisladas
(productores, semilleros)
ANALISIS por DAS-ELISA

(Potyvirus, Carlavirus y Allexivirus)

Transferencia a productores
(produccin comercial)
zando las plantas,

una por una, mediante pruebas de DASELISA (Fig. 1, F y G).
Los bulbos producidos son entregados
a semilleros que realizan la multiplicacin
en reas aisladas de
otros cultivos de
Alliaceae, hasta obtener el nmero de
bulbo-semilla suficiente como para iniciar
una produccin comercial. Cuando se
comparan los bulbos
producidos por las
plantas libres de virus
con respecto a los producidos por plantas
infectadas las diferencias en peso y tamao son notables
Fig.1, M. Esquema de
produccin Fig.2.
3 Certificacin
La implementacin de programas
tendientes a la produccin de plantas de ajo libre de virus y el
control de la enfermedad adquiere fundamental importancia ya que han comenzado
a regir en Argentina normativas para la fiscalizacin de semilla de ajo. Estas normas establecen las categoras de Bsica (subcategora
Preinicial, Inicial y Fundacin) Registrada
(subcategora A y B) y Certificada. Cada una
de estas categoras contempla diferentes porcentajes de OYDV. Por ahora slo se controla este virus; sin embargo, con el avance de
los conocimientos respecto del dao que producen el resto de los integrantes del complejo, seguramente algunos otros sern considerados en el futuro.
Figura 2: Esquema de produccin de plantas de ajo libres de virus, IFFIVE-INTA,

Argentina.
dio sin hormonas, con alto contenido de sacarosa y luz continua se consigue mejorar el
porcentaje de bulbificacin en algunos clones,
o bien, se obtienen plantas ms robustas que
soportan mejor el transplante a suelo.
Los minibulbillos obtenidos in vitro son
cosechados y sembrados en suelo estril compuesto por una mezcla de tierra/mantillo/
arena (1/1/1). Las plantas que no forman
bulbos son transferidas a suelo y mantenidas en cmara hmeda por un tiempo variable entre 15 y 20 das luego son paulatinamente adaptadas a las condiciones naturales de humedad y temperatura (Fig. 1, D y E).
Las plantas ex vitro son probadas mediante DAS-ELISA para constatar su estado
sanitario y mantenidas bajo jaulas
antivectores. Los bulbos cosechados son conservados en lugar fresco y seco hasta la poca de siembra. Las sucesivas multiplicaciones
se realizan en jaulas donde se contina anali-
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316
CONCI, Vilma C.; CAFRUNE, Eva E.; LUNELLO, Pablo; NOME, Sergio; PEROTTO, Cecilia
VIII.-Captulo 7
Plantas ctricas libres de enfermedades
Costa, Norma; Plata, Mara Ins;
Anderson, Catalina
1 Introduccin
Para competir en un mercado citrcola
globalizado se necesita de la mxima eficiencia en todas las fases de la produccin. Para
lograrlo es primordial partir con material de
excelencia desde el vivero. La planta es el primer escaln para iniciar una citricultura
exitosa.
Las exigencias de calidad en los ctricos
producidos en los viveros comerciales de todo
el pas aumentan da a da. El material de
multiplicacin para la produccin de plantas
de vivero debe provenir de un origen cierto y
certificado. El citricultor espera que la planta
que pondr en sus explotaciones tenga un
porte adecuado, un sistema radicular desarrollado y la garanta sanitaria y varietal correspondiente para obtener una produccin
rentable y duradera.
Las enfermedades producidas por virus,
viroides y otros organismos similares producen importantes prdidas econmicas en los
ctricos de todo el mundo. Algunas enfermedades provocan la muerte de las plantas y
otras disminuyen la produccin y la calidad
de la fruta, causando prdida de vigor y de
longevidad de la planta.
Algunas de las principales enfermedades
causadas por este tipo de microorganismos
son la psorosis, tristeza, exocortis y
cachexia. Estas enfermedades se han extendido debido a la propagacin vegetativa de
material infectado. Es normal encontrar varias virosis en una misma planta y en muchos
pases como la Argentina casi la totalidad de
las plantas adultas estn afectadas por alguna virosis.
La psorosis y otras enfermedades se
transmiten mediante el injerto de yemas.
Una vez hecho el injerto, la planta puede
permanecer con la enfermedad latente durante muchos aos. Las yemas que se extraigan de una planta con enfermedad latente
originarn plantas enfermas.
Los pases con citricultura de avanzada

han basado su xito en el empleo de Programas de Certificacin utilizando plantas libres
de enfermedades, especialmente las causadas por virus u organismos similares.
Estas plantas libres de virus se obtienen
a partir de plantas de variedades ctricas
agronmicamente ideales pero afectadas por
una o ms enfermedades causadas por virus
u organismos similares. Para esto se recurre a
tcnicas que permitan la obtencin de plantas libres de virus a partir de individuos enfermos. La termoterapia y la obtencin de
plantas nucleares han sido tcnicas usadas
para conseguir aquel objetivo. Otra tcnica
que cumple este objetivo es la tcnica de
microinjerto de pices caulinares in vitro.
Dicha tcnica es la que actualmente se utiliza
en gran parte de los pases citrcolas que tienen programas de eliminacin de virus y
viroides.
Con la combinacin de las tcnicas de
termoterapia y de microinjerto de pices
caulinares in vitro es posible obtener un elevado porcentaje de plantas ctricas libres de
virus, cosa que una tcnica sola no permite
lograr.
La tcnica de microinjerto se basa en la
hiptesis de que los virus vegetales no llegan
a infectar el meristema. Una vez obtenida la
planta por esta tcnica debe ser sometida a
las pruebas de comprobacin sanitaria (pruebas biolgicas, qumicas, inmunoqumicas,
serolgicas, moleculares, etc.) que determinen con certeza que esa planta esta libre
de lo que se est analizando.
El PROCITRUS es un proyecto que el INTA
desarroll para la obtencin, produccin,
mantenimiento y distribucin de material de
portainjertos y cultivares de especies ctricas
con identidad varietal y estado sanitario controlados y en su esquema bsico (Tabla 1)
emplea estas tcnicas para cumplir dichos
objetivos.
2 Tcnica de microinjerto de pices
caulinares in vitro
La planta a microinjertar es seleccionada
de las introducciones de variedades ctricas
de copa y portainjerto que se realizan a los
Bancos de Germoplasma, de selecciones locales y de variedades obtenidas en los Pro-
317
Tabla 1: Esquema operativo del proyecto PROCITRUS:

para la obtencin de una planta libre de enfermedades
- Introducciones.
- Selecciones locales.
- Programas de Mejoramiento.
Planta candidata
Termoterapia
32C
Cultivo de
Tejidos
Diagnstico
Sanitario
Planta Madre Original
Protegida
gramas de Mejoramiento. Una vez obtenida esta planta candidata a planta madre,
es sometida a termoterapia y cultivo de tejidos empleando la tcnica de microinjerto
de pices caulinares in vitro.
Esta tcnica comprende las siguientes etapas: preparacin del portainjerto, preparacin del pice, injerto, cultivo de plantas injertadas e injerto sobre un plantn vigoroso.
Las plantas obtenidas por microinjerto no
presentan caracteres juveniles y en las mismas no se han observado anormalidades con
respecto a la planta madre.
El xito de la tcnica depende del tamao del tejido extrado (0.1-0.2 mm) y del patgeno que se quiera eliminar. En el caso de
exocortis, tristeza y cachexia, el porcentaje
de plantas libres es superior al 90%. El ms
Tabla 2: Pruebas de Diagnstico para Plantas Madres
Enfermedad
Metodologa
Duracin
difcil de eliminar es el virus de la psorosis de

los ctricos (CPsV).
Una vez obtenida la planta de microinjerto y cuando tiene tamao suficiente, se
realizan las pruebas de diagnstico para comprobar que estn libres de patgenos (Tabla 2).
Las tcnicas de diagnstico para cada
enfermedad pueden ser varias pero deben
emplearse aquellas reconocidas internacionalmente por organismos de referencia.
Para el PROCITRUS y para el Programa Nacional de Certificacin de Ctricos las tcnicas
empleadas son las recomendadas por las
Normas para la Produccin, Comercializacin
e Introduccin de Plantas Ctricas de Vivero
(RES N 149/98) y las Normas de Funcionamiento de Laboratorios de Diagnstico para
Enfermedades de Plantas Ctricas de Vivero
y sus partes, aprobadas por el INASE y el
SENASA dependientes de la SAGPyA (Secretara de Agricultura, Ganadera, Pesca y Alimentacin).
3 Lecturas recomendadas:
1- Enfermedades de los Ctricos. 2000 Monografa de la
SEF (Sociedad Espaola de Fitopatologa). Editores
Cientficos: Nria Duran-Vila y Pedro Moreno 165 pp
2-Proceedings of the IOCV (International Organization
of Citrus Virologists): 1957-2002 (15 Conferencias)
3-Improvements in serodiagnosis of Citrus Psorosis Virus
(CPsV). 2000. Aliotto, D.,M. Gangemi,P. Sposato, S.
Deaglio, E. Luisoni and R.G. Milne.14th Proceedings of
the IOCV 353-356pp
4- Indexing of Citrus viroids by imprint hybridisation.
1999.Palacio-Bielsa, A.,X. Foissac and N.
Duran-Vila. European Journal of Plant
Pathology 105:897-903
Repeticin
Tristeza
Inmunoimpresin ELISA
Plantas indicadoras
ELISA DAS
4h
12 meses
48 h
Psorosis
Plantas indicadoras
ELISA TAS
12 meses
48 h
Exocortis
Plantas indicadoras
Hibridacin Molecular
Electroforesis
12-24
meses
3 meses
3 meses
6 aos
Cachexia-xiloporosis
Plantas indicadoras
Hibridacin Molecular
Electroforesis
12 meses
3 meses
3 meses
6 aos
CVC
ELISA DAS
48 hs
6 aos
Cancrosis
Infiltracin de tejido susceptible

Medio Selectivo
Inmunofluorescencia indirecta
ELISA DAS
10 das
7 das
7 das
48 hs
1 ao
318
1 ao
3 aos
5- Cancrosis de los Citrus en el Litoral

Argentino.2001. Canteros, Blanca I. IDIA XXI
Ao I- Nro.1 23-27pp
6- Citrus Canker in Argentina- Control,
Eradication, and Current Managment. 2000
International Citrus Canker Research
Workshop. Ft. Pierce, Florida USA. 12-13pp
7- Manual para Productores de Naranja y
Mandarina de la Region del Ro Uruguay.
1996. INTA Manual Serie A Nro. 2 Diversificacin Productiva. Eds. A. Fabiani, R.
Mika, L. Larocca y C. Anderson. 238 pp
8- Graft-Transmissible Diseases of Citrus.
Handbook for detection and diagnosis. 1991.
Roistacher, C.N. FAO and IOCV 286 pp.
COSTA, Norma; PLATA, Mara Ins; ANDERSON, Catalina
VIII.-Captulo 8
Certificacin sanitaria de especies
frutales de Prunus
Docampo, Delia M.
1 Introduccin
Monitoreos realizados en especies frutales del gnero Prunus (durazneros, ciruelos,
cerezos, guindos) del rea frutcola templada (provincias de Mendoza, Crdoba y Buenos Aires) evidenciaron el deterioro de la condicin sanitaria de las plantaciones en produccin y de propagacin. Los anlisis pusieron de manifiesto que una de cada cuatro
plantas analizadas se encontraba infectada
por uno o ms virus.
Varios factores han sido decisivos para la
distribucin de estos patgenos. La carencia
de controles sanitarios, la ineficacia de los
mtodos usados en los anlisis, su dispersin
por vectores y la diseminacin de materiales
infectados a larga distancia, por el hombre a
travs de la comercializacin.
Un Sistema de Certificacin Sanitaria de
Plantas Perennes se fundamenta en producir el nmero de plantas requeridas por el
mercado a partir de una Planta Inicial. El Sistema contempla cuatro etapas bsicas: 1)
Eleccin de la Planta Inicial (selecta de variedades y de portainjertos) seleccionada sobre
la base de sus caracteres agronmicos deseables, por su pureza varietal (deben coincidir
con los Descriptores del Registro Nacional de
Cultivares) y su estado sanitario, (analizado
por las tcnicas ms rigurosas establecidas en
el Sistema de Certificacin). Constituye el
material fundacional de un Sistema de Certificacin del cual derivar todo el material certificado; 2) Establecimiento de un Monte Fundacin. Constituido generalmente por tres
plantas de cada cultivar (de variedad y de
cada portainjerto) obtenidas por propagacin agmica de la Planta Inicial. Constituye
un monte de reserva y es donante de materiales de propagacin; 3) Organizacin de un
monte de Plantas de Base que deber mantener al menos diez plantas por cultivar y/o
portainjerto como plantas madres de la
propagacin, sometidas a rigurosos contro-
les sanitarios y varietales anuales; 4) Produccin de Plantas Certificadas. Est destinada

a producir las plantas que demanda el mercado (viveros expendedores). Cada etapa
puede tener subetapas. Todas estn reglamentadas y sometidas a estrictos controles
sanitarios y varietales.
El Material Certificado producido por los
Sistemas de Certificacin referidos al saneamiento de virus puede considerar dos calificaciones segn su programacin: Material
Libre de Virus (virus free - VF) cuando los
materiales estn exentos de todos los virus
conocidos en esa especie y Material Testado (virus test - VT) cuando los materiales se
encuentran exentos de los principales virus.
Por lo comn ninguna planta seleccionada como candidata a Planta Inicial resulta
libre de patgenos sistmicos. El cultivo in
vitro de meristemas precedido por la aplicacin de termoterapia ofrece la posibilidad de
recuperar materiales contaminados para obtener una Planta Inicial. El cultivo in vitro es,
adems, una prctica de rutina para la rpida multiplicacin de portainjertos en los cuales injertar yemas para propagar cultivares.
Una planta de un cultivar (variedad) puede
donar numerosas yemas que requieren igual
nmero de portainjertos (Fig. 1). Esta
clonacin permite obviar el empleo de carozos como generadores de portainjertos y de
esta manera uniformar su respuesta a estrs
bitico o abitico.
2 Micropropagacin de portainjertos
para Prunus de Sanidad Certificada,
mediante cultivo in vitro
Los Sistemas de Propagacin de
Portainjertos Certificados establecen procedimientos para su micropropagacin mediante el cultivo in vitro que en general contemplan el siguiente desarrollo: 1.- Tomar
explantos de Plantas Iniciales o de Plantas
de Propagacin (Monte Fundacin, Plantas
de Base) que hayan superado todos los controles sanitarios y de pureza varietal anuales.
2.- El nmero de multiplicaciones in vitro no
deber superar los diez ciclos una vez superada la fase de adaptacin. 3.- Iniciar la
micropropagacin empleando meristemas
de 0,3-0,5 mm (meristema con uno o dos
primordios foliares), e identificar el material
319
MICROPROPAGACIN
Seccionado de yemas
CONTROL SANITARIO
Estaca de planta
seleccionada enraizada
Yemario generado por

pice caulinar a
a a1a2a3a4a5a6
a: explanto inicial
a1, a2, ... a6: clon
CONTROL SANITARIO
Toma de muestras
abcdefghij
Termoterapia
Iniciacin del cultivo in vitro.

Cada pice caulinar originar un clon
MICROPROPAGACIN
Clones libres
Yema tratada
Seccionado de brotes
Cultivo de pices caulinares

Micropropacin
(hasta
10 ciclos)
RIZOGNESIS
Desinfeccin superficial
pice caulinar
TRANSPLANTE A SUELO BAJO

CONDICIONES CONTROLADAS
EN INVERNADERO
Remocin de hojas
Figura 1: Esquema de micropropagacin de Prunus
sembrado. 4.- Los meristemas generarn yemas (un yemario), en general, entre las 6 y
12 semanas de implantado. 5.- Repicar las
yemas del yemario. La propagacin de cada
meristema se deber identificar con una sigla, de manera que cada pice caulinar d
origen a un clon (una lnea de descendencia). 6.- Control sanitario. Antes de la tercera multiplicacin debern tomarse al menos
3 plantas de cada clon para realizar el anlisis de los patgenos que se estableci eliminar. Las plntulas seleccionadas debern permanecer destapadas por al menos una semana, fuera de la cmara de cultivo, bajo luz,
temperatura y humedad relativa controladas
a fin de dar oportunidad a el o los patgenos,
si los hubiera, de incrementar su poblacin
lo cual facilitar su deteccin. El control sanitario deber realizarse en plantas leosas y
320
herbceas por indexacin, testado mediante tcnicas inmunoenzimticas (DAS-ELISA o

sus variantes), microscopa electrnica (dips,
secciones ultrafinas, ISEM + D) y tcnicas
moleculares (dsRNA viral, PCR, PCR anidado).
La lnea de descendencia que no supere este
control ser eliminada. 7.- Los medios de cultivo no deben contener sustancias nocivas
ni antibiticos que puedan enmascarar la
presencia de microorganismos. 8.- Es motivo
de rechazo el material cultivado en medios
contaminados. 9.- Consignar en un Libro de
Registro las acciones realizadas durante la
micropropagacin (ciclos de micropropagacin, medios de cultivo, nmero de individuos logrados, toma de muestras para
anlisis, tipo de anlisis, resultados, depuraciones, etc.) por cada lnea de descendencia.
10.- Trasplantar a suelo (mezcla de turba,
DOCAMPO, Delia M.
perlita, mantillo 1:1:1:) estril las plantas regeneradas in vitro.

2.1 Aclimatacin
1.- Descalzar del medio las plantas regeneradas lavando cuidadosamente sus races
bajo chorro de agua hasta retirar la totalidad del agar. 2.- Plantar en terrinas plsticas
desinfectadas con NaOCl al 15% (Cl activo 80
g/dm3), en una mezcla de turba, mantillo y
perlita 1:1:1 esterilizada en autoclave durante 1 h sin presin. 3.- Colocar las terrinas en
cmaras con HR del 90-100%, con luz continua de 4000 luxes provista por tubos
fluorescentes de luz blanca fra, temperatura
mnima 15C, mxima 35C. 4.- A los 30 das
transplantar a cestillos plsticos (6 cm de dimetro) y mantenerlos bajo tneles de
polietileno en invernadero con HR 70-90% y
16 h de luz. 5.- Levantar el plstico por los
costados lentamente cada 2-3 das hasta su
retiro definitivo. 6.- Control varietal: tomar
al menos tres plantas por lnea de descendencia clonal para el control varietal. Dentro
de un Sistema de Certificacin, el productor
cultivar las plantas en sus instalaciones de
aclimatacin e informar al organismo oficial
responsable para que efecte las correspondientes inspecciones. Toda planta fuera de
tipo y las afectadas por plagas sern eliminadas. Esta depuracin debe ser anotada en el
Libro de Registro. 7.- Control sanitario: realizar un segundo control sanitario (indexing y
testado serolgico, microscopia electrnica,
tcnicas moleculares) al ao de desarrolladas
las plantas en todos los clones. 8.- Identificar
con una clave, que debe figurar en el Libro
de Registro, cada lnea de descendencia. En
los recipientes de multiplicacin figurar la clave y el nmero de multiplicacin que corresponda. 9.- En la etiqueta debe figurar Producido in vitro.
3 Obtencin de una Planta Inicial (cultivar
y/o portainjerto) libre de patgenos
mediante cultivo in vitro asociado con
termoterapia
1.- Seleccionar plantas (cultivares y/o
protainjertos) por su pureza varietal y condiciones agronmicas deseables (candidata a
Planta Inicial). 2.- Investigar su condicin sa-
nitaria por indexacin en plantas leosas y

herbceas, testeado mediante tcnicas
inmunoenzimticas (DAS-ELISA y/o sus variantes), microscopia electrnica (dips, secciones ultrafinas, ISEM-D) y tcnicas moleculares
(dsRNA viral, PCR, PCR anidado). 3.- Si ninguna de las plantas resultase libre de patgenos
sistmicos, aplicar termoterapia seguida de
cultivo de meristemas de las yemas tratadas.
Los controles sanitarios de las plantas regeneradas permitirn seleccionar las plantas libres de patgenos.
3.1 Termoterapia
Se aplica sobre materiales activos (barbados con brotes, plantas jvenes). 1.- Enraizar individualmente en suelo estril estacas
de la planta seleccionada para el tratamiento o estacas de portainjertos de Sanidad
Certificadas para injertar yemas de las variedades seleccionadas. 2.- Colocar las plantas
enraizadas y con brotes (en actividad) en
cmaras donde reciban una corriente de aire
caliente. 3.- Temperatura: vara con la relacin cultivar-patgeno. Algunos patgenos
son eliminados con facilidad por el calor mientras otros disminuyen su concentracin pero
permanecen en los tejidos. Los Prunus tienen intolerancia a los tratamientos prolongados con calor, pero pueden soportarlos si
se utiliza calor moderado (34-38C). 4.Fotoperodo: 16 h de luz suministrada por
tubos fluorescentes de luz blanca. Intensidad
lumnica: 48.000M S-1m-2 (3,54,0 klux). Riego: diario. Humedad relativa: entre 60 y 80%.
5.- Tiempo: vara con la relacin planta patgeno. Oscila entre 3 y 7 semanas, aunque,
por lo comn, vara entre 3-4 semanas. 6.Retirar las plantas de la termoterapia y a continuacin aislar y cultivar los meristemas de
las yemas desarrolladas durante el tratamiento. Evitar la recontaminacin de los meristemas prolongando el tiempo entre la finalizacin de la termoterapia y el cultivo de los
materiales. 7.- Continuar la micropropagacin como se desarrolla desde el tem 2
en Micropropagacin de portainjertos para
Prunus de Sanidad Certificada, mediante cultivo in vitro.
4 Obtencin de variedades (cultivares)
libres de patgenos mediante el
microinjerto de pices caulinares in vitro
321
La tcnica es adecuada para injertar

meristemas de frutales de carozo infectados
sometidos a termoterapia. 1.- Cultivar in
vitro explantos de un portainjerto libres de
infeccin. 2.- Colectar brotes de la variedad
sometida a termoterapia y desinfectarlos. 3.Extraer bajo lupa el meristema (0,2-0,4 mm).
4.- Decapitar los portainjertos cultivados in
vitro. 5.- Colocar el meristema de la variedad
sobre el extremo decapitado de la plntula
portainjerto cuidando que las zonas
vasculares entren en contacto. 6.- Colocar los
microinjertos en ambiente controlado (16 h
de luz aportada por tubos fluorescentes de
luz blanca. Intensidad lumnica: 3,54,0 klux,
HR: 60 y 80%). 7.- Dejar desarrollar la planta
injertada en un medio adecuado durante 5
a 15 semanas bajo luz. 8.- Transplantar a suelo estril. Se inicia su aclimatacin en invernadero bajo condiciones de luz, temperatura y
humedad controlada por varias semanas. 9.Continuar con la aclimatacin de las plantas
generadas como se sealara previamente.
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322
DOCAMPO, Delia M.
VIII.-Captulo 9
Biotecnologa aplicada al control de
enfermedades fngicas y bacterianas
Zappacosta, Diego
1 Introduccin
Desde la domesticacin de las plantas por
el hombre las enfermedades han causado
enormes prdidas en la produccin. El uso
intensivo de monocultivos con baja diversidad gentica en la agricultura moderna ha
redundado en una elevada susceptibilidad a
algunas enfermedades y en un incremento
de la agresividad de algunos patgenos. Con
excepcin de las enfermedades epidmicas,
que llegan a destruir cultivos completos, se
estima que las prdidas ocasionadas por
patgenos en el plano mundial representan
un 12% del potencial de produccin, teniendo mayor incidencia en hortalizas, frutales y
arroz. Adems de causar prdidas en la produccin, algunos patgenos tambin reducen la calidad de los alimentos, como es el
caso de algunas especies de Fusarium y
Aspergillus, que dejan en los tejidos infectados toxinas que afectan la salud humana
y animal.
Existen varias formas de controlar las
enfermedades, entre los que podemos mencionar: a) las prcticas culturales, como la rotacin, la sanidad del material inicial, el control de restos vegetales, etc., b) la aplicacin
de agroqumicos y c) la resistencia gentica.
Aunque las tres alternativas son utilizadas,
la ltima, por su mejor implementacin y
menor impacto ambiental, es una de las
mejores opciones. Es frecuente, sin embargo, encontrar inconvenientes para su aplicacin, tales como la falta de genes de resistencia, la rpida evolucin de nuevas razas
virulentas del patgeno, etctera.
La incorporacin de genes de resistencia es uno de los mayores desafos para los
mejoradores durante el desarrollo de nuevos cultivares. Tradicionalmente se ha llevado a cabo a travs de mtodos convencionales de mejoramiento, que involucran seleccin y evaluacin de grandes poblaciones
derivadas de cruzamientos entre materiales
susceptibles y resistentes y la posterior seleccin bajo condiciones propicias para la enfermedad.

Si bien estos mtodos convencionales
han resultado exitosos en muchos casos, son
lentos y laboriosos, ya que involucran cruzas,
retrocruzas y seleccin, siendo adems difcil
seguir la evolucin de nuevas razas virulentas
de los patgenos. Esto ha llevado a un uso
masivo de agroqumicos a pesar de su alto
costo y su alto impacto ambiental.
La biotecnologa y la biologa molecular
ofrecen nuevas herramientas a los
mejoradores, aumentando las posibilidades
y la eficiencia en la obtencin de variabilidad
gentica y en la seleccin de caracteres deseables, brindando adems alternativas viables para identificar, seleccionar y transferir
genes de resistencia.
El cultivo in vitro fue una de las primeras
herramientas de la biotecnologa utilizadas
en la bsqueda de resistencia a enfermedades. Desde sus distintas alternativas brinda
soluciones para sortear barreras en los cruzamientos, colaborando adems en la seleccin
de genotipos resistentes. En lo que respecta
a la ingeniera gentica, la resistencia a enfermedades fngicas y bacterianas no ha alcanzado el mismo nivel de desarrollo que la
resistencia a insectos o virus. Sin embargo
existen numerosos proyectos de investigacin en curso y se prev un gran desarrollo
comercial en los prximos aos.
En este captulo se intentar ofrecer un
panorama actualizado de las herramientas
que la biotecnologa vegetal brinda al
mejorador para el estudio y control de las
enfermedades fngicas y bacterianas.
2 Cultivo in vitro
Es posible encontrar genes de resistencia
en muchas de las especies cultivadas o en
especies muy cercanas filogenticamente y
transferirlos por cruzamientos convencionales a especies susceptibles. Sin embargo, a
veces, es necesario recurrir a especies no tan
cercanas filogenticamente, pudiendo existir barreras de incompatibilidad. En estos casos es posible obtener hbridos viables con la
utilizacin de tcnicas tales como el rescate
de embriones, la hibridizacin somtica, la
323
fusin de protoplastos, la polinizacin in

vitro, etc. Estas tcnicas ya fueron descriptas
en captulos precedentes y son utilizadas
para la incorporacin de diversas caractersticas entre las que encontramos la resistencia
a enfermedades.
Una tcnica promisoria es la seleccin in
vitro de materiales resistentes utilizando al
patgeno vivo o algn metabolito purificado o no del mismo u otras sustancias qumicas como agente de seleccin. Esta tcnica ser tratada con ms detalle a continuacin.
2.1 Seleccin in vitro de genotipos
resistentes
Los ensayos para la seleccin de resistencia a patgenos (screening) y el estudio
de la interaccin hospedador-patgeno bajo
condiciones de campo se encuentran sujetos
a una gran variacin entre experimentos.
Esto se debe principalmente a la distribucin
no uniforme de los patgenos y a la falta de
control sobre las variables ambientales. Por
ejemplo, en el caso de enfermedades del
suelo, los perodos relativamente largos de
crecimiento favorecen el desarrollo de otras
enfermedades que pueden interferir y afectar la validez de los resultados. Por esta razn, queda claro que los ensayos de seleccin por resistencia a enfermedades deben
realizarse, en lo posible, bajo condiciones
controladas. Estas condiciones raramente
pueden encontrarse a campo. Se han planteado alternativas utilizando invernculos o
ambientes controlados, lo cual soluciona algunos de los problemas mencionados anteriormente. En estas situaciones, la seleccin
de genotipos resistentes se basa en la observacin de la respuesta de genotipos individuales en la poblacin de plantas ante la
presencia del patgeno. Otras metodologas
plantean el uso de metabolitos producidos
por el patgeno, que en algunos casos han
demostrado tener el mismo efecto que el
microorganismo mismo. Esto ltimo se observa principalmente cuando las toxinas producidas por el hongo son factores de virulencia importantes.
La seleccin in vitro se basa en exponer
plantas, rganos, tejidos o clulas vegetales
324
a patgenos o sus metabolitos simulando la

interaccin hospedador-patgeno que tiene
lugar en la naturaleza. Esta tcnica permite
estandarizar la evaluacin, hacindola repetible y confiable, con la ventaja adicional de
que en un espacio reducido y en un corto
perodo se puede chequear la resistencia o
tolerancia de gran cantidad de individuos.
Esto brinda adems la posibilidad de poder
ensayar callos y plntulas, sin necesidad de
trabajar con plantas adultas. Presenta, sin
embargo, algunos inconvenientes, tales como
la falta de correlacin in vitro-in vivo y la posible aparicin de modificaciones genticas no
deseables originadas por el pasaje por cultivo in vitro. No obstante, en algunos casos,
la respuesta obtenida in vitro ha demostrado tener una estrecha correlacin con la resistencia-tolerancia obtenida in vivo (Yoder,
1980).
Diferentes tcnicas in vitro pueden ser
explotadas para seleccionar o inducir variantes con mayor resistencia a enfermedades o
para establecer modelos de estudio de
interacciones planta-patgeno. Sin embargo,
la eleccin de la estrategia experimental depende del sistema hospedador-patgeno
considerado. Las principales variables a tener
en cuenta son (Daub, 1986):
La naturaleza y complejidad de las tcnicas de cultivo in vitro requeridas (cultivo de

embriones, regeneracin de plantas desde
suspensiones celulares, callos, etc.).
El nivel en que se realiza la seleccin o
screening (in vitro o en plantas regeneradas luego de realizar manipulaciones in vitro)
Los agentes utilizados para la seleccin
de resistencia (el patgeno mismo, filtrados,
toxinas especficas o toxinas de otro patgeno muy relacionado, agentes qumicos, etc.).
El origen de la nueva resistencia buscada (recuperacin de variacin existente, cambios espontneos, mutagnesis, etc.).
Muchos microorganismos patgenos de
plantas producen fitotoxinas, que son
metabolitos txicos, no enzimticos, que, no
obstante hallarse a bajas concentraciones,
daan a las plantas (Tabla 1). Una toxina
especfica es un metabolito producido por el
patgeno que posee la misma especificidad
por el material vegetal que el patgeno mis-
ZAPPACOSTA, Diego
tos metabolitos txicos

y la resistencia a alguno
de ellos puede mejorar
la resistencia a la enfermedad en forma cuali y
cuantitativa. Ejemplos
de seleccin usando
toxinas no especficas
se encuentran en las
interacciones: arroz-C.
miyabeanus, tomateFusarium oxysporum,
apio-Septoria apiicola,
caf-Colletotrichum
kahawae, esprrago-F.
o x y s p o r u m ,
Arabidopsis-F.
moniliforme, cebolla-Phoma terrestris, entre otras.
Una de las principales limitaciones de este
sistema de seleccin es precisamente el desconocimiento del tipo de toxina(s) o la importancia de ellas en muchas enfermedades.
Tambin es de destacar que en algunas
interacciones donde se conocen toxinas especficas, las mismas no son activas en todos
los tejidos y clulas. Descifrar el fundamento
bioqumico de la resistencia a una toxina facilitara el proceso de seleccin.
Aunque los comentarios anteriores se
aplican fundamentalmente a patgenos
fngicos, las bacterias tambin producen
fitotoxinas. En general, estas toxinas son no
especficas y causan sntomas en muchas plantas que no son hospedadores del patgeno
que las produce. Aunque las fitotoxinas
bacterianas son generalmente no requeridas
para la patognesis, ellas tpicamente funcionan como factores de agresividad y su produccin resulta en un incremento de la severidad de la enfermedad (Bender, 1998).
Otra alternativa para la seleccin de materiales resistentes es usar como presin de
seleccin enzimas pectolticas, cuando stas
cumplen un rol importante en la patognesis,
como es el caso de los patgenos que producen la maceracin de los tejidos que atacan. Un ejemplo de ello lo constituye la
interaccin entre Rhizoctonia fragariae y
Botrytis cinerea con la frutilla, donde se logr seleccionar plantas con mayor resistencia a los patgenos mencionados utilizando
Tabla 1: Principales toxinas de microorganismos patgenos de plantas
mo. En cambio, las toxinas no especficas son

metabolitos producidos por el patgeno que
pueden tener alguna relevancia en el desarrollo de la enfermedad, pero no son responsables de todos los daos causados por el
mismo. Sin embargo, en algunas
interacciones compatibles estas toxinas no
especficas pueden ser necesarias para una
infeccin exitosa y en otros casos son slo
determinantes secundarios de la enfermedad. El mecanismo responsable de su toxicidad vara con el patosistema y, en muchos
de ellos, el(los) rol(es) de las toxinas en la
patogenicidad no est(n) claramente
establecido(s), especialmente en los casos de
toxinas no especficas, como por ejemplo el
cido fusrico. En general se considera que
actan como factores de virulencia, debilitando al hospedador o inhibiendo o retardando las respuestas de defensa (Johal, 1995).
Buscando resistencia a toxinas se puede hallar resistencia a patgenos, ya que la toxina
puede tener un rol decisivo en la patognesis
(McCormick y col., 1998).
En algunas especies de plantas se ha tenido xito en la seleccin de materiales resistentes a patgenos utilizando toxinas especficas como presin de seleccin in vitro.
Entre las interacciones ms estudiadas podemos mencionar el caso de avenaCochliobolus victoriae, caa de azcarDrechslera
sacchari
y
pltanoMycosphaerella fijiensis.
Tambin se pueden usar toxinas no especficas para la seleccin de materiales resistentes. Muchos patgenos producen es-
325
enzimas pectolticas purificadas a partir de 3 Obtencin de resistencia utilizando

herramientas de ingeniera gentica
cultivos lquidos de los mismos.
La falta de toxinas relevantes en la patoUna de las alternativas biotecnolgicas
gnesis de muchas enfermedades y/o activas a nivel celular, ha llevado a establecer y ms promisorias para obtener resistencia a
estudiar sistemas in vitro con el patgeno enfermedades es la incorporacin de genes
mismo. Uno de los mayores problemas en de resistencia mediante tecnologa gnica.
estos sistemas es controlar el crecimiento Estas tcnicas han sido descriptas previamenexcesivo del patgeno, sea bacteria u hon- te (ver III.-3), por lo que en esta seccin slo
go, sobre el material vegetal y sobre el mese tratarn las situaciones especficas de redio de cultivo y la dificultad para interpretar sistencia a bacterias y hongos patgenos.
Como resultado de los estudios tendienlos resultados. Otro inconveniente es la correlacin entre las interacciones hospedador- tes a la identificacin, clonacin y caracteripatgeno in vitro e in vivo (la resistencia in zacin de genes involucrados en la resistenvitro puede no ser expresada in vivo o la si- cia a enfermedades han sido identificados
tuacin recproca). Un prerrequisito para una muchos mecanismos que las plantas utilizan
eficiente seleccin in vitro utilizando al pa- para responder a la infeccin de patgenos,
tgeno es que el sistema in
vitro sea consistente con los
eventos que suceden a nivel
de planta (hay que tener en
cuenta cules son los tejidos
susceptibles, el estado fisiolgico de la planta, etc.). En
el caso de hongos bitrofos
obligados y en muchos
necrtrofos las tcnicas de
cocultivo han resultado ser
una solucin para cultivarlos
en condiciones controladas.
El cultivo dual de hongos
necrtrofos y tejidos vegetales puede resultar ptimo
para estudios bsicos y aplicados, constituyendo un sistema simplificado en el cual
factores nutricionales y ambientales pueden ser cuidadosamente controlados. Se
ha establecido exitosamente este sistema de cultivo
para las interacciones alfalfaP h y t o p h t h o r a
megasperma, tabaco-P.
parasitica var. nicotianae,
tabaco-Peronospora
tabacina, caa de azcarSclerospora sacchari, abeto-Ceratocystis polonica y
Lamium
purpureumConiothyrium palmarum,
Figura 1: Principales mecanismos de defensa que presentan las plantas
frente al ataque de microorganismos (modificado de Kombrink y Somssich,
entre otras (Miller, 1985).
1995).
326
ZAPPACOSTA, Diego
logrndose avances en el conocimiento de

los genes que participan en estas respuestas
(Fig. 1). La identificacin de estos genes permiti la evaluacin de su rol especfico y su
forma de activacin mediante el empleo de
plantas transgnicas. Numerosos trabajos
detallan los distintos mecanismos de defensa que las plantas poseen para contrarrestar
ducto del metabolismo secundario) o fortalecen las defensas estructurales (por ejemplo
fortificacin de la pared celular). Algunas respuestas normales de resistencia son relativamente lentas, detectndose, en algunos casos la expresin 48 hs luego de la infeccin
(Fig. 2).
En el caso de plantas transgnicas la idea
sera lograr expresin temprana o
sobreexpresin del producto, generalmente a travs de promotores constitutivos. Otros genes interesantes
son aquellos que participan en las vas
de induccin de los mecanismos naturales de resistencia. Recientemente, la clonacin de numerosos genes
R (de resistencia) ha precipitado el
inters en el uso de estos genes para
obtener resistencias de amplio espectro.
Las principales estrategias de control de enfermedades fngicas mediante el uso de plantas transgnicas
pueden ser agrupadas en cinco categoras (Punja, 2001):
Expresin de productos
gnicos que son directamente txicos para los patgenos o que reducen su crecimiento. Incluyen protenas relacionadas a la patognesis (proFigura 2: Tiempo relativo de induccin de las principales defensas
contra patgenos fngicos (modificado de Kombrink y Somssich, tenas PR), como enzimas hidrolticas
(quitinasas, 1,3--glucanasas), prote1995).
nas antifngicas (osmotinas y tauel ataque de microorganismos y son reco- matinas), pptidos antimicrobianos (tioninas,
mendados como una lectura accesoria al defensinas, lectinas), protenas de transfematerial que sigue a continuacin (Kombrink rencia de lpidos (LPT), protenas inactivay Somssich, 1995; Durand-Tardif y Pelletier, doras de riboso-mas 28S rRNA fngicos (RIP)
2003).
y fitoalexinas.
Expresin de productos gnicos que
3.1 Resistencia a hongos fitopatgenos
destruyen o neutralizan componentes de
La seleccin de genes de resistencia para ataque del patgeno. Por ejemplo:
ser introducidos en plantas por tecnologa inhibidores de poligalacturonasas (enzimas
gnica se basa, en parte, en la evaluacin de que degradan algunos componentes de la
la toxicidad de productos gnicos sobre el pared celular vegetal), cido oxlico o lipasas.
crecimiento y desarrollo de los patgenos in
vitro y del rol del gen en las respuestas de mejoran las defensas estructurales de la
resistencia. Muchos productos gnicos per- planta. Consiste en la elevacin de los nivetenecen al grupo de las protenas relaciona- les de ligninas y peroxidasas asociadas a la
das a la patognesis (van Loon, 1999), mien- pared celular.
tras que otras pertenecen a las vas
biosintticas de las fitoalexinas (compuestos participan en las vas de seales que reguantimicrobianos de bajo peso molecular pro- lan las defensas. Incluyen la produccin de
327
elicitores especficos, perxido de hidrgeno

(H2O2), cido saliclico o etileno.
Expresin de productos de genes de
resistencia (genes R). Participan en la reaccin de hipersensibilidad y en la interaccin
con factores de avirulencia.
3.2 Enzimas hidrolticas
La estrategia ms ampliamente utilizada
es la sobreexpresin de enzimas
hidrolticas tales como 1,3--glucanasas o
quitinasas, que degradan la pared celular de
hongos y han demostrado tener actividad
antifngica in vitro.
Con la expresin de diferentes tipos de
quitinasas en varias especies vegetales se ha
logrado reducir el tamao, el nmero y el
desarrollo de lesiones causadas por varios
hongos patgenos, algunos de amplio rango de hospedadores, como por ejemplo
Botrytis cinerea y Rhizoctonia solani. La expresin de quitinasas ha sido inefectiva, sin
embargo, para el control de Cercospora
nicotianae, Colletotrichum lagenarium y
Pythium spp., indicando que en los hongos
existen diferencias en la sensibilidad a este
tipo de enzimas. Las diferentes quitinasas
presentan variacin en caractersticas tales
como especificidad de sustrato, pH ptimo y
localizacin celular, lo cual trae aparejadas
diferencias en su actividad antifngica. Aunque los resultados de estos estudios no han
sido espectaculares en trminos de niveles de
control de la enfermedad, la tasa de progresin y la severidad de la misma pudieron ser
significativamente reducidas, como se ha
demostrado en cultivos transgnicos evaluados a campo (Melchers y Stuiver, 2000).
Los resultados obtenidos utilizando 1,3 -glucanasas son similares a los de
quitinasas. La expresin combinada de ambas enzimas en varias especies ha revelado
un comportamiento mucho ms efectivo en
la prevencin del desarrollo de varias enfermedades que la expresin de una sola de
ellas, corroborando los resultados obtenidos
en los ensayos in vitro. Lo mismo sucede con
otras protenas PR con actividad antifngica
in vitro, tales como osmotina y taumatina
(TLP), que en plantas transgnicas muestran
una disminucin de los daos causados por
enfermedad, pero los resultados ms alen-
328
tadores aparecen cuando se expresan en

combinacin con quitinasas y 1,3-bglucanasas.
Como regla general, el uso de estrategias
de ingeniera gentica que involucren la expresin de dos o ms productos de genes
antifngicos en un determinado cultivo debera proveer un control de la enfermedad
ms efectivo y de ms amplio espectro que
el uso de estrategias con un solo gen (Shah,
1997).
3.3 Pptidos antimicrobianos
Las defensinas y tioninas son pptidos de
bajo peso molecular, ricos en cistena, que
poseen actividad antimicrobiana. La
sobreexpresin de estas protenas en plantas transgnicas reduce el desarrollo de varios patgenos como Fusarium y Alternaria
y confiere resistencia a Verticillium en papa
en condiciones a campo.
Tambin se han desarrollado plantas
transgnicas que expresan pequeos
pptidos antimicrobianos sintticos (10-20
aminocidos) que pueden afectar a las hifas,
a la pared celular o aumentar la permeabilidad de las membranas celulares fngicas. La
habilidad para crear recombinantes sintticos o variantes combinadas de pptidos ofrece nuevas oportunidades para lograr resistencia a un amplio rango de patgenos de manera simultnea, siendo alternativas
promisorias para mejorar la eficacia de las
plantas transgnicas en el futuro (Lassner y
Bedbrook, 2001).
3.4 Fitoalexinas
Son otro grupo de compuestos
antimicrobianos, productos del metabolismo
secundario, presentes en un amplio rango de
especies vegetales cuya expresin es inducida por la infeccin de patgenos y elicitores.
Son sintetizados a travs de complejas vas
bioqumicas, como la del shikimato. La manipulacin gentica para suprimir o mejorar la
produccin de fitoalexinas no es sencilla, ya
que se hallan involucradas varias enzimas.
Como en el caso de las enzimas
hidrolticas, no se ha demostrado concluyentemente su rol en mejorar la resistencia
a enfermedades en muchas interacciones
ZAPPACOSTA, Diego
hospedador-patgeno. En plantas transgnicas se ha demostrado que la sobreexpresin de genes que participan en la sntesis
de ciertas fitoalexinas como el resveratrol y
la medicarpina resulta en una demora en el
desarrollo de la enfermedad y en la aparicin
de los sntomas producidos por varios
patgenos en distintas especies vegetales.
Sin embargo, hay que tener en cuenta que
las fitoalexinas son potencialmente txicas
para los animales y tienden a no ser especficas en su accin, por lo tanto es necesario
realizar ms evaluaciones de los riesgos potenciales de su utilizacin, adems de las relacionadas con sus caractersticas de conferir
resistencia a enfermedades (Essenberg,
2001).
3.5 Compuestos que mejoran las
defensas estructurales de la planta
La pared celular vegetal es una barrera
que los patgenos tienen que superar en su
ataque y lo logran a travs de enzimas que
la degradan (como las poligalacturonasas) o
mediante la accin de toxinas. Se han diseado plantas transgnicas que expresan
inhibidores de poligalacturonasas, pero los
resultados por el momento no son concluyentes. Otra estrategia considerada ha sido
la sobreexpresin de peroxidasas, enzimas
que participan en la lignificacin de la pared
celular. La lignificacin alrededor de los sitios
de infeccin es un mecanismo natural que
presentan las plantas para restringir el ataque de patgenos. Mediante esta estrategia se logr un aumento en los niveles de
lignina de la planta, que no brind, sin embargo, una mejora en la resistencia a enfermedades en varios sistemas hospedadorpatgeno estudiados.
Una opcin ms reciente es la expresin
de enzimas que degradan toxinas fngicas,
como la expresin en tabaco de una enzima
degradadora de tricotecenos de Fusarium
sporotrichloide, que reduce el dao a los tejidos y mejora la emergencia de plntulas en
presencia de la toxina. La inactivacin de factores de virulencia especficos por productos
gnicos expresados en plantas transgnicas
es una estrategia promisoria para reducir el
desarrollo de patgenos especficos.
3.6 Elicitores
Las vas de seales que coordinan las respuestas de defensa en las plantas, que incluyen la reaccin de hipersensibilidad (RH), la
produccin de protenas PR y de fitoalexinas,
pueden ser activadas por molculas llamadas
elicitores. La induccin de RH y necrosis, que
resulta en la activacin de respuestas de defensa, podra resultar en una induccin de
resistencia a un amplio espectro de enfermedades. El uso de estas estrategias requerira,
sin embargo, de la cuidadosa manipulacin
de vas metablicas complejas, cuya alteracin podra tener efectos secundarios no
deseables sobre otros caracteres del cultivo,
ya que intervienen en varios procesos vegetales. Mediante el uso de plantas
transgnicas se han disectado genticamente muchas de estas vas, identificndose muchos de los compuestos intervinientes en las
respuestas de defensa a patgenos.
El perxido de hidrgeno (H2O2) inhibe el
crecimiento de patgenos y activa ciertas vas
de trasmisin de seales que inducen respuestas de defensa. La expresin de niveles
elevados de H2O2 en plantas transgnicas a
travs de la expresin de la glucosa oxidasa
reduce los efectos causados por patgenos
como
Rhizoctonia,
Verticillium,
Phytophthora y Alternaria en varias especies cultivadas. Hay que tener en cuenta, sin
embargo, que niveles elevados de H2O2 son
fitotxicos.
Otros activadores de defensas son el cido saliclico, el etileno y el cido jasmnico.
La manipulacin de los niveles de cido
saliclico en plantas transgnicas tiene un gran
potencial para mejorar la resistencia a enfermedades, ya que no slo inducen la expresin de protenas PR, sino tambin la de
otros productos de defensa, los cuales, en
conjunto, han demostrado tener una
interaccin sinrgica y conferir elevados niveles de resistencia (Lawton, 1997).
3.7 Genes R
Estos genes son los ms utilizados en
mejoramiento convencional ya que son determinantes simples de una resistencia efectiva y especfica. En su mayora, los productos de estos genes actan reconociendo in-
329
afectan al mismo tiempo varios tipos de rganos como hojas, tallos

y frutos. Sin embargo, cuando la accin de los patgenos es especfica
de rganos o tejidos es recomendable el uso de promotores especficos.
En ciertos casos la actividad
antifngica de determinados compuestos mejora cuando actan en
el espacio apoplstico o son volcados en la vacuola. En este aspecto
es necesario orientar los esfuerzos
hacia la bsqueda de promotores
especficos inducibles por patgenos
y a la evaluacin de los sitios ms
adecuados de expresin de los
transgenes a fin de desarrollar planFigura 3: Modelos de interaccin entre productos de avirulencia
tas transgnicas con elevados nivedel patgeno (Avr), sitio target de este producto en la clula vegetal
les de resistencia a un amplio espec(T) y productos de genes de resistencia R (R1 y R2). (modificado de
tro de enfermedades.
Hammond-Kosack y Parker, 2003).
Las expectativas puestas en el
directamente factores de avirulencia de desarrollo de plantas transgnicas son granpatgenos a travs de correceptores, pero des, ya que podran brindar soluciones para
tambin hay casos de interaccin directa (Fig. el control de distintas enfermedades, como
3). Existen varios ejemplos de plantas las provocadas por patgenos de amplio rantransgnicas que expresan genes R; sin em- go de hospedadotes, entre los que se enbargo, debido a la complejidad de las vas de cuentran Rhizoctonia solani y Botrytis
seales involucradas en las respuestas de cinerea, para los cuales existen muy pocas
defensa, es improbable que la expresin de fuentes convencionales de resistencia.
un solo gen mejore la tolerancia a enfermeLas plantas transgnicas expresando redades. Se dispone de una gran cantidad de sistencia a enfermedades podran ser cuesgenes R clonados cuyo anlisis permitir la tionadas porque:
obtencin de genes R sintticos con dominios funcionales adecuados que confieran
Los productos gnicos antimicrobianos
resistencias de amplio espectro (Rommens y podran tener efectos adversos sobre la
Kishore, 2000).
microflora no patognica que habita sobre
o en las inmediaciones de las plantas.
4 Perspectivas
Los productos antifngicos expresados
podran tener efectos indeseables en la saEl desarrollo de plantas transgnicas con lud de los organismos que consumen dichas
resistencia a enfermedades fngicas no ha plantas, en particular el hombre.
alcanzado el xito logrado en el desarrollo
Una fuerte presin sobre los patgenos
de otras resistencias, como por ejemplo a podra llevar a la aparicin de nuevas cepas
herbicidas, insectos o virus. La mayora de los resistentes y la ruptura de genes de resistenestudios se han realizado sobre sistemas cia nuevos o existentes.
modelo como tabaco, habiendo pocos estu Algunos productos de genes de resisdios a campo, estimndose la aparicin en el tencia, como las protenas PR, los compuesmercado de materiales transgnicos con re- tos antifngicos y los inhibidores de
sistencia a hongos en los prximos aos.
poligalacturonasas (PGIP), reducen el desarroEn la mayora de los casos mencionados llo de la enfermedad, pero no la previenen
anteriormente, la expresin de los totalmente.
transgenes ha sido constitutiva, lo cual es
La induccin de muerte celular y de RH
positivo para el control de patgenos que pueden ser peligrosas, ya que si no son co-
330
ZAPPACOSTA, Diego
rrectamente controladas pueden provocar

importantes alteraciones metablicas.
La existencia de un escudo general de
resistencia, que es lo que se busca con niveles elevados de resistencia de amplio espectro, puede llevar a la prdida de genes menores de resistencia en el cultivo y, si un patgeno logra eludir esta barrera, no existiran
otras para detener su avance.
5 Resistencia a bacterias
Slo una pequea proporcin de las bacterias son fitopatognicas y han desarrollado mecanismos para invadir y colonizar plantas hospedadoras y causar enfermedades. Por
ello los esfuerzos invertidos en lograr resistencia a bacterias por tecnologa gnica han
sido escasos. La mayora de los mismos se han
centrado en una bacteriosis importante en
el mbito mundial para la cual no se han hallado genes de resistencia potencialmente
transferibles por cruzamientos convencionales, como es el caso de la podredumbre blanda y pie negro de la papa, causados por
Erwinia carotovora (During, 1996).
Las principales estrategias para lograr resistencia a bacterias fitopatgenas son las
siguientes:
Expresin de pptidos bactericidas

(cecropinas) provenientes de insectos y ranas, que actan a nivel de la membrana
bacteriana.
Expresin de tioninas, que son
polipptidos ricos en cistena presentes en
endosperma y hojas de los cereales, cuya accin, no especfica, se basa en la permeabilizacin de las membranas celulares.
Expresin de la lisozima del
bacterifago T4 y de huevo de gallina.
Cambio de la enzima blanco de toxinas bacterianas o expresin de enzimas
detoxificantes provenientes del mismo patgeno u otro organismo.
Sntesis de fitoalexinas, que generalmente involucra la modificacin de vas
biosintticas complejas, las cuales no siempre son accesibles a la ingeniera gentica.
Los resultados, en algunos casos, han sido
promisorios, aunque la estrategia ms inten-
samente investigada, la expresin de

cecropinas, no ha producido resultados concluyentes, especialmente en los ensayos a
campo. Este pptido es degradado por
enzimas vegetales, por lo cual sera necesario el desarrollo de anlogos resistentes a
proteasas.
La expresin de tioninas de cereales en
tabaco mejora la resistencia a Pseudomonas
syringae. Estas protenas poseen actividad
antimicrobiana in vitro y su expresin constitutiva trae aparejada una disminucin significativa del crecimiento de la bacteria y una
reduccin en el porcentaje de lesiones
necrticas.
Las lisozimas son enzimas que catalizan
la hidrlisis de la murena, constituyente de
la pared celular bacteriana. Se localizan en las
vacuolas de varias especies vegetales y comnmente poseen fuerte actividad
quitinasa. Antes del inicio de una enfermedad las bacterias patgenas se acumulan en
grandes cantidades en los espacios
intercelulares de la planta. Las lisozimas slo
entran en contacto con las mismas luego de
la ruptura de la clula, cuando las bacterias
son demasiado numerosas como para ser
efectivamente controladas. Por ello, las estrategias se han centrado en dirigir las
lisozimas hacia el espacio intercelular. Pocas
lisozimas vegetales han sido caracterizadas y
clonadas, por lo que se han buscado lisozimas
de otros orgenes para ser expresadas en
plantas transgnicas, como la del bacterifago T4 y la de huevo de gallina. Esta estrategia ha dado buenos resultados en varios casos y es una de las ms prometedoras.
Algunas bacterias producen toxinas que
son clave en el desarrollo de la enfermedad,
como por ejemplo la tabtoxina de
Pseudomonas syringae pv. tabaci, que acta sobre la sntesis de glutamina, provocando clorosis. La expresin del gen trr que codifica para una enzima bacteriana que protege de la accin de la tabtoxina ha logrado
disminuir los sntomas de la enfermedad, mejorando la resistencia. Otra ejemplo es la expresin en plantas de tabaco de ornitil
transcarbamilasas insensibles a la toxina de
P. syringae pv. phaseolicola, que inhibe la
actividad de la misma en poroto.
Los hospedadores resistentes y algunos
no hospedadores son capaces de reconocer
331
y combatir las bacterias fitopatgenas. Estas

plantas resistentes reaccionan con una muerte celular localizada en el sitio de infeccin
(RH), que es inducida por compuestos
bacterianos llamados elicitores, tales como
protenas de avirulencia (protenas Avr), que
son reconocidos por protenas receptoras del
hospedador (Fig. 1). La dilucidacin de los
mecanismos de resistencia en hospedadores
resistentes posibilita la obtencin de plantas
transgnicas que expresen diferentes receptores que reconozcan una variada gama de
elicitores bacterianos (harpinas, protenas
Avr, etc.) y que activen las respuestas de defensa.
Varias de las estrategias mencionadas
previamente son potencialmente aplicables
en el control de bacterias fitopatgenas. Las
que implican la expresin de protenas
antibacterianas, tales como cecropinas y
lisozimas, tienen la ventaja de implicar a un
solo gen y conferir resistencia amplia. La
inactivacin de toxinas bacterianas o la modificacin del sitio blanco de dichas toxinas
puede brindar una estrategia mucho ms
especfica y eficiente.
6 Genmica y enfermedades causadas
por bacterias
En este rea tambin est incursionando
la genmica. Xylella fastidiosa es una bacteria que vive en el xilema de las plantas, causando enfermedades que producen grandes
prdidas econmicas, incluyendo clorosis
variegada en ctricos. Un grupo de
biotecnlogos brasileos seleccion este patgeno para secuen-ciacin genmica debido a la gran importancia de los ctricos para
la economa de Brasil. Los frutos de las plantas afectadas son ms pequeos y no tienen
valor comercial. Utilizando programas de prediccin de secuencias se han encontrado en
el genoma de esta bacteria, que consta de
ms de 2.5 millones de pares de bases, unos
2.904 genes. A la mitad de los mismos se les
ha asignado funciones sobre la base de comparaciones realizadas con otros genomas. Entre estos genes se encuentran algunos que
estn involucrados en la patogenicidad, generando compuestos que actan en diferentes procesos, como:
- Protenas involucradas en la sntesis y
secrecin de toxinas.
332
- Enzimas involucradas en la ruptura de

las paredes celulares.
- Enzimas para detoxificar de compuestos de defensa de la planta.
- Transportadores eficientes de azcares,
que permiten la existencia en el xilema, pobre en nutrientes.
- Protenas regulatorias, que ayudan a
regular la expresin gnica para mantener el
crecimiento en distintos ambientes.
- Sntesis y excrecin de polisacridos
extracelulares.
- Genes involucrados en la eliminacin de
antibiticos, que podran se producidos por
la planta para matar a la bacteria.
- Captacin y secuestro de hierro y otros
metales.
7 Situacin en la Argentina
La Comisin Nacional Asesora de
Biotecnologa Agropecuaria (CONABIA) ha
venido autorizando la realizacin de pruebas
de laboratorio-invernculo o a campo de
plantas transgnicas que expresan resistencia a enfermedades. Del total de autorizaciones realizadas en el periodo 1998-2002, 39
(aproximadamente el 10%) corresponden a
solicitudes presentadas por distintas empresas o instituciones para la evaluacin de distintos materiales con resistencia a enfermedades. En la tabla 2 se presenta una lista de
algunas de las liberaciones autorizadas.
8 Resumen
Los hongos y bacterias fitopatgenos son
responsables de gran parte de las prdidas
que se producen sobre los cultivos. Una de
las formas de control ms eficiente es a travs de la resistencia gentica. Sin embargo,
no siempre es posible incorporar genes de
resistencia en plantas de cultivo por mejoramiento convencional. La biotecnologa brinda al mejorador nuevas herramientas para
la bsqueda e incorporacin de resistencias
a travs del cultivo in vitro y la ingeniera
gentica. Mediante el cultivo in vitro es posible sortear barreras a la hibridizacin y seleccionar rpida y eficientemente materiales
resistentes a enfermedades. La seleccin in
vitro se basa en exponer plantas, rganos,
tejidos o clulas vegetales a patgenos o sus
metabolitos simulando la interaccin
ZAPPACOSTA, Diego
Tabla 2: Lista de algunas de las liberaciones de plantas transgnicas con resistencia a

enfermedades autorizadas por la CONABIA (recopilacin de la pgina web de la
CONABIA, http://www.sagpya.mecon.gov.ar)
hospedador-patgeno que tiene lugar en la

naturaleza. Mediante tecnologa gnica es
posible transferir genes que confieren resistencia a enfermedades. Las estrategias ms
utilizadas son la expresin de compuestos
antimicrobianos (enzimas hidrolticas, protenas antimicrobianas), la expresin de enzimas
o compuestos que neutralizan componentes
de ataque del patgeno (inhibidores de
poligalacturonasas, inactivadores de toxinas),
fortalecimiento de las defensas estructurales
(aumento en los niveles de ligninas o
peroxidasas) o la modificacin de las vas de
seales que regulan las defensas por la produccin de elicitores especficos (perxido de
hidrgeno, cido saliclico o etileno). La
genmica brinda nuevas herramientas para
la deteccin de genes involucrados en la
patognesis y, aunque actualmente no existen en el mercado plantas transgnicas que
expresen resistencia a enfermedades fngicas
o bacterianas, el nivel de desarrollo alcanzado indica que en un futuro muy prximo aparecern plantas resistentes a enfermedades
logradas por ingeniera gentica.
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ZAPPACOSTA, Diego
PARTE IX
Bioseguridad y regulacin de
organismos vegetales
genticamente modificados
(OVGM)
373
374
RUBINSTEIN, Clara
IX.-Captulo I
Criterios cientficos para la evaluacin
de la bioseguridad de organismos
genticamente modificados.
Rubinstein, Clara
que han generado en diferentes mbitos y

posteriormente, tambin debido a su impacto en la percepcin pblica, en especial en la
Unin Europea.
El National Research Council de los EE.UU.,
public en 1989 un informe en el cual analiza
las diferencias entre el mejoramiento tradicional y las nuevas biotecnologas para la
modificacin gentica de plantas y microorganismos. En este informe, se incluye a las
tecnologas de ADN recombinante como
parte integrante de la secuencia de los avances del conocimiento y de la tecnologa cientfica, a lo largo de 10.000 aos de desarrollo
humano (NRC, 1989, ver Fig 1). Tambin concluyen en que las mismas leyes fsicas y biolgicas gobiernan la respuesta de los organismos modificados por los modernos mtodos moleculares y celulares y aqullos
producidos por mtodos clsicos.
Si bien las tecnologas de mejoramiento

de variedades tradicionalmente utilizadas
introducen modificaciones genticas y producen efectos no intencionales, las tecnologas
de ADN recombinante presentan caractersticas propias que se han considerado lo suficientemente novedosas a nivel de las organizaciones internacionales que han recomendado su regulacin. Las caractersticas de un
organismo vegetal genticamente modificado (OVGM) son estudiadas y evaluadas desde las etapas ms tempranas de
su desarrollo desde el punto de
vista de su bioseguridad. Para
ello, se utiliza un enfoque comparativo que ha sido desarrollado con anterioridad a la aparicin de cultivos transgnicos o
sus derivados alimentarios en el
mercado. Fue descripto por primera vez en este contexto, en
un documento de la OECD (Organizacin para la Cooperacin
y el Desarrollo Econmico) de
1993, que fue el resultado de dos
aos de discusiones que reunieron a ms de 60 expertos de 19
pases. Este enfoque, as como Figura 1: Aumento en la capacidad de modificacin gentica a travs del
tiempo Fuente: Informe de Expertos del IFT (2000), adaptado de NRC,
los criterios cientficos utilizados 1989
para su implementacin, son presentados en este captulo, con nfasis en la
Al mismo tiempo, organismos internacioinocuidad para el consumo.
nales como FAO y OMS (la Organizacin para
A lo largo de la historia, los mejoradores la Alimentacin y la Agricultura y la Organizahan apelado a todo tipo de tecnologas para cin Mundial de la Salud, respectivamente)
generar diversidad gentica, de la cual poder se han ocupado de la bioseguridad de las
seleccionar aquellas caractersticas deseadas. nuevas tecnologas aplicadas a la produccin
En los captulos y secciones anteriores se han de alimentos. Un informe conjunto de 1991
descripto las ms recientes, que se suman a afirma que la biotecnologa tiene una larotras, utilizadas durante siglos con el mismo ga historia de uso en produccin y procefin.
samiento de alimentos. Representa un conLa aplicacin de las tcnicas de ADN tinuo abrazo entre las tcnicas de reprorecombinante al mejoramiento vegetal en duccin tradicionales y las ltimas tcnicas
la dcada de 1980, sin embargo, marcan un basadas en la biologa molecular. El uso
punto de inflexin, dada las preocupaciones de estas tcnicas no resulta en alimentos
375
inherentementes menos seguros que los

producidos por tcnicas convencionales.
Se desprende de esto, as como de lo expuesto en captulos anteriores, que todas las
especies mejoradas por el hombre son, de
un modo u otro, genticamente modificadas. A pesar de esto, la aplicacin de las
tcnicas de ingeniera gentica a la produccin de alimentos ha sido considerada lo
suficientemente nueva y diferente, como
para justificar el control de su desarrollo e
implementacin.
Esto tiene sus antecedentes en las primeras etapas del desarrollo de la ingeniera
gentica, en los aos 70. En 1974 y 1975, los
Institutos Nacionales de Salud de los EE.UU.
(NIH) convocan a las Conferencias de
Asilomar (California), ste fue el primer paso
para la creacin de polticas para el control
de la seguridad de organismos recombinantes. Desde all, y en todo el mundo, han
evolucionado estas polticas y las regulaciones que controlan el desarrollo de nuevos
organismos y sus productos mediante tcnicas de ADN recombinante.
Estas regulaciones se basan en criterios
cientficos y tambin empricos, en particular,
en lo que hace a la seguridad de los alimentos. En efecto, muchos de nuestros conocimientos sobre la inocuidad de lo que comemos, proviene de cientos o miles de aos
de experiencia, ensayos y errores. Aunque
los alimentos tradicionalmente disponibles en
las diferentes culturas se aceptan como seguros, se sabe que algunos pueden ser txicos, segn la parte de la planta que se consuma por ejemplo el tallo se puede consumir, pero no as las hojas o las races o el
estado de su desarrollo. Tambin hay alimentos de origen vegetal que deben ser cocinados para ser seguros (por ej. porotos), as
como sabemos que hay grupos de alimentos que pueden provocar alergias en individuos sensibles (man, leche, nueces, huevo,
soja).
En 1986 la OECD (Organizacin para el
Desarrollo y la Cooperacin Econmica)
convoca a reuniones de expertos que renen
sus recomendaciones en el llamado Blue
Book. Ms adelante, en 1993, OECD resumi estos conceptos: La seguridad de los
alimentos para consumo humano se basa
en que debe existir una certeza razonable
376
de que no resultar dao alguno del uso

debido bajo las condiciones de consumo
anticipadas. Histricamente, los alimentos
preparados y utilizados bajo las condiciones tradicionales han sido considerados seguros, por su historia de uso y experiencia,
aun cuando pudieran contener txicos naturales o antinutrientes. En principio, los
alimentos se han considerado seguros, a
menos que un peligro significativo se haya
podido identificar.
En este captulo se intentar dar un panorama de los criterios cientficos que se utilizan internacionalmente para evaluar la seguridad de los cultivos transgnicos, tambin
llamados genricamente OGM (Organismos
Genticamente Modificados).
1. El anlisis de riesgos y la identificacin
del peligro
Se ha establecido que el anlisis de riesgos consta de tres etapas fundamentales:
La identificacin del peligro: es la identificacin y cuantificacin de un efecto adverso, en general, a partir de ensayos experimentales; por ejemplo, de tipo toxicolgico
en modelos animales.
Valoracin de la exposicin: estima y si
es posible cuantifica la frecuencia y el tiempo
de exposicin a dicho peligro.
Caracterizacin del riesgo: es la estimacin que surge de evaluar el peligro en funcin de la exposicin y evaluar diferentes escenarios de exposicin mxima, para establecer qu grado de exposicin es aceptable en
cuanto a la seguridad.
Este proceso se aplica a casos muy diferentes, y existe amplia experiencia en su aplicacin a la evaluacin de riesgos para aditivos alimentarios, agroqumicos y compuestos
especficos en general. En esos casos, es relativamente simple someter cantidades exactas y conocidas de un compuesto a ensayos
toxicolgicos clsicos en modelos animales,
o evaluaciones de residuos en alimentos,
aguas, suelos, etc. De esta forma, se establecen parmetros como el NOAEL (por No
Adverse Effect Level), que es el nivel de
exposicin en el que no se observan efectos adversos. Este da una medida de la peligrosidad del compuesto: cuanto mayor el
RUBINSTEIN, Clara
NOAEL, menor el potencial txico del compuesto. Basndose en el NOAEL, es posible

estimar un nivel de exposicin seguro, que
define el ADI (dosis diaria aceptable, expresada por kg de peso corporal) y que dependiendo del tipo de sustancia y otras variables,
suele estar unas 100 veces por encima del
NOAEL. Este factor de multiplicacin se conoce como margen de seguridad para la
exposicin.
Sin embargo, estos principios no son tan
directamente aplicables al anlisis de riesgos
para OVGM o sus derivados de uso
alimentario, ya que constituyen mezclas complejas, que contienen miles de compuestos,
macro y micro nutrientes, txicos naturales
(compuestos txicos que estn naturalmente presentes en la especie), antinutrientes
(compuestos que inhiben la absorcin o
biodisponibilidad de algunos nutrientes),
metabolitos secundarios, etctera.
Por lo tanto, la evaluacin de estos cultivos es ms una evaluacin de seguridad o
inocuidad ms que un anlisis de riesgos clsico, ya que hasta ahora no se han determinado peligros cuantificables en los OGM
estudiados. De hecho, en la prctica, en caso
de identificarse efectos adversos, estos
cultivos no se autorizaran para su salida
al mercado.
Por todo lo anterior, se ha desarrollado
para los OGM un enfoque que ha sido utilizado para otros casos de alimentos y que se
basa en la comparacin del nuevo alimento o cultivo con el tradicionalmente utilizado y considerado seguro. Este enfoque
se ha desarrollado consensuadamente con
la colaboracin de diferentes organismos internacionales
(OECD,
FAO
,OMS,
International Life Sciences Institute o ILSI) que
peridicamente convocan a paneles de expertos que revisan y actualizan las recomendaciones de acuerdo con los avances tecnolgicos y el estado del conocimiento.
Es en este contexto dinmico y cambiante, que se ha desarrollado el sistema de evaluacin de la seguridad alimentaria de OGM,
como resume el documento de OECD, 1993:
Nuestra comprensin de la naturaleza y
composicin de los alimentos aumenta cada
da y estamos investigando y conociendo ms
acerca de la importante relacin entre dieta
y efectos sobre la salud. En el futuro, segura-
mente descubriremos nueva informacin

importante acerca de beneficios especiales y
riesgos ocultos en los alimentos que comemos, que nos podrn ayudar a conducirnos
hacia dietas ms saludables.
2. El enfoque comparativo y la
equivalencia sustancial
En 1993 la OECD formul el concepto de
Equivalencia Sustancial. Este concepto no
constituye en s la evaluacin de inocuidad
sino que es un marco de referencia que
orienta la evaluacin, que s se basa en un
Enfoque Comparativo.
Este enfoque no hace otra cosa que tomar como referencia los cultivos o alimentos
conocidos y aceptados como seguros y compararlos con sus versiones mejoradas mediante ingeniera gentica. Es oportuno aclarar
que estas tcnicas no en todos los casos van
a tener como resultado la introduccin de un
transgn, sino que hay otras estrategias experimentales - antisentido, silenciamiento
por regulacin epigentica o anulacin de
la actividad de un gen por knock out, que
si bien involucran manipulacin in vitro y
transformacin, no resultan en la adicin de
un gen y/o una protena nuevos.
El Enfoque Comparativo fue evolucionando desde las primeras propuestas de recomendaciones que formularon OECD; FAO/
OMS e ILSI desde 1988. La base de esta estrategia para establecer inocuidad de nuevos alimentos, es la historia de uso seguro
del cultivo parental (es decir aquel que es
la base de la modificacin) .
- Qu se compara y por qu
Es claro que toda modificacin tiene un
objetivo, sea obtener una mejora de tipo
agronmica (a esta categora pertenecen los
OVGM conocidos como de primera generacin) como resistencia a plagas o enfermedades, una mejora nutricional o de calidad (segunda generacin) o bien la sntesis de un producto en particular (tercera
generacin) desde un frmaco, hasta
biocombustibles, pasando por vacunas comestibles. Es decir que la modificacin tiene
efectos intencionales medibles, que se traducen en una caracterstica fenotpica dada.
Por otro lado, es posible que se produzcan efectos no intencionales de la modifica-
377
cin, que pueden o no tener un impacto

negativo en la seguridad de la planta modificada, pero que es pertinente estimar. Y es
aqu donde la comparacin tiene un papel
relevante.
Los impactos no deseados de la introduccin de un gen o secuencia en el genoma de
una planta, comprenden diferentes aspectos
que son examinados durante el proceso de
evaluacin:
Toxicidad o alergenicidad de la(s) protenas expresadas
Influencia de los productos de expresin sobre el metabolismo de la planta, que
lleve a cambios en el valor nutricional o la concentracin de txicos o alrgenos naturales.
Insercin no intencional en otros genes
(knock out no intencional) que sean esenciales o activacin de otros, que no se expresen normalmente.
Efectos pleiotrpicos de los genes insertados (efectos sobre la actividad de otros
genes o vas metablicas, que se manifiesten a diferentes niveles en el fenotipo de la
planta).
Es importante tener en cuenta que estos
efectos tambin pueden producirse durante
el mejoramiento convencional (definido
como el que no utiliza ingeniera gentica), si
bien los cultivos mejorados mediante tecnologas no recombinantes no se someten por
el momento, a este tipo de evaluacin, con
la excepcin de Canad, que s regula algunos casos especiales. La normativa canadiense, evala aquellas variedades con rasgos suficientemente novedosos, independientemente del proceso utilizado para su obtencin, si bien menciona particularmente ciertas metodologas de mejoramiento, como la
mutagnesis acelerada (inducida por agentes qumicos o irradiacin) o la fusin celular.
Como veremos en detalle a continuacin,
el proceso evaluativo recorre una serie de
pasos que se basan en evidencia experimental, y que van llevando a conclusiones
que permiten tomar decisiones respecto de
la inocuidad del OGM en cuestin (ver Figura 3).
Las evaluaciones de seguridad, entonces,
se concentran: a) en la caracterstica introducida: para ello, se caracteriza completamente el gen insertado en el cultivo GM y se
378
evala la seguridad de la/s protena/s resultantes. Si bien esta evaluacin la deben realizar los obtentores previamente a la transformacin , ya que no ser aprobado un cultivo que pueda presentar algn problema
toxicolgico o de alergenicidad, las agencias
regulatorias encargadas del control de estos
productos efectan un exhaustivo anlisis de
seguridad de los genes insertados y sus productos de expresin.
b) en el cultivo o alimento como un
todo: sobre el cultivo GM, se analizan los rasgos fenotpicos / agronmicos y la composicin y se los compara con los de sus contrapartes no-GM o convencionales. Las diferencias encontradas, sean intencionales o no, se
convierten en el centro de ulteriores evaluaciones de seguridad. El objetivo de estas
evaluaciones es demostrar que el cultivo o
alimento GM es tan seguro como el alimento tradicional conocido, independientemente de su grado de equivalencia (Figura 2).
a. El rasgo introducido:
Para caracterizar el gen introducido se
requiere conocer la secuencia completa del
inserto o insertos, el nmero de copias y su
estabilidad a lo largo de varias generaciones.
La seguridad (o inocuidad) de la/s protena/s producidas por el inserto se evala
basndose en informacin relativa a su fuente de origen (el organismo donante, historial de uso seguro, etc.), su estructura (secuencia de aminocidos, cambios postraduccionales, incluso su estructura
tridimensional), su funcin / especificidad /
modo de accin, su expresin en diferentes
tejidos de la planta, su toxicidad aguda, su
potencial de alergenicidad, su digestibilidad
in vitro y su estabilidad al procesamiento,
que son indicadores de esta potencialidad.
Se utiliza la toxicidad aguda determinada en ensayos estndares en ratones por va
oral, ya que la gran mayora de las protenas ejercen sus efectos txicos por esta va,
fundamentalmente debido a su naturaleza
(que hace que se degraden rpidamente en
el tracto intestinal). Para detectar otros efectos que podran dejar fuera a algunos casos
especiales, se realizan estudios de alimentacin en animales y toxicolgicos
subcrnicos (en general, estudios de 90 das
en rata, cuando se considera justificado por
RUBINSTEIN, Clara
comparar los patrones de

protenas del suero de pacientes sensibles, que se
unen a inmuglobulinaE (la
responsable de las reacciones
alrgicas severas) en anlisis
de Western sobre geles
bidimensionales, para determinar si hay nuevas protenas o si el patrn endgeno
se ha visto alterado por la
modificacin.
Como ya se dijo, an no
se cuenta con modelos animales que se encuentren lo
suficientemente desarrollados para ser validados a nivel internacional en cuanto
a su capacidad predictiva de
alergenicidad, pero numerosos organismos e instituciones internacionales se encuentran trabajando en ello.
Figura 2. Enfoque comparativo
las dems evidencias experimentales).

En cuanto a la estimacin del potencial
alergnico, la aproximacin que se utiliza, es
la del peso de la evidencia. Este concepto
se basa en el hecho de que no existe un solo
parmetro que defina a un alrgeno, y que
no es posible hoy contar con modelos que
predigan adecuadamente la alergenicidad en
humanos. Dado que existe una serie de
parmetros fisicoqumicos que son compartidos por los alrgenos proteicos conocidos (que son un grupo reducido de protenas de origen animal y vegetal), stos pueden ser utilizados para estimar la posible
alergenicidad de la protena introducida. Por
ejemplo, la resistencia a la digestin, la prevalencia en el alimento (normalmente, los
alrgenos proteicos son mayoritarios en la
composicin final) y la similitud con otras
protenas alergnicas, son algunos de estos parmetros. En efecto, se realizan anlisis bioinformticos que comparan la secuencia de los productos de expresin presentes
en los OGM, contra bases de datos de todos
los alrgenos conocidos.
En el caso de cultivos con actividad
alergnica conocida, como la soja, es posible
b) El cultivo o alimento
GM:
Sobre la base de los 50 aos de experiencia ganada en mejoramiento tradicional
(breeding), y evaluacin de seguridad de
otros productos como medicamentos, alimentos, y qumicos, las agencias internacionales recomiendan comparar los siguientes
parmetros de los OGM respecto de contrapartes convencionales, para poder contar
con suficiente informacin que permita arribar a una certeza razonable de inocuidad:
- Parmetros fenotpicos: La caracterizacin fenotpica/agronmica del cultivo GM se
hace tempranamente durante el proceso de
seleccin. Los puntos evaluados ( por ej. morfologa, rendimiento) son muy sensibles a los
cambios genticos y a las perturbaciones desfavorables en el metabolismo, por lo tanto
son buenos indicadores de equivalencias entre el cultivo modificado y su contraparte tradicional.
Se observan y miden cuidadosamente las
caractersticas morfolgicas, fisiolgicas, y
reproductivas, la resistencia o susceptibilidad
a plagas y enfermedades, e incluso caractersticas como perfume o sabor de los frutos.
Este proceso, que dirige la seleccin de aque-
379
llas plantas transformadas (o

eventos) que tengan las caractersticas deseadas, es crtico para eliminar efectos no
intencionales.
-Composicin qumica:
sta es la evaluacin en la que
se fundamenta gran parte del
anlisis comparativo. Se realiza la determinacin analtica
de la composicin en diferentes tejidos de la planta,
sobre muestras de ensayos a
campo controlados, realizados en ambientes representativos de aquellos donde
ese cultivo va a ser sembrado, a lo largo de varias campaas de produccin (aos).
Se determina la composicin
1: Ensayos de alimentacin con OGM en modelos animales (adaptado
de macro y micronutrientes Tabla
de Kuiper y col., 2001, Faust and Glenn, 2002)
(protenas, grasas, hidratos de
carbono, aminocidos y cidos grasos, vitaMientras que la evaluacin de seguriminas, etc.), minerales, txicos naturales y dad de las protenas introducidas se lleva
compuestos bioactivos y/o metabolitos a cabo con la protena (s) purificadas y gesecundarios, dependiendo del cultivo. Por neralmente sintetizadas en modelos bacteejemplo, se miden niveles de fitoestrgenos rianos (por la cantidad que se necesita para
y antinutrientes (inhibidores de tripsina, los ensayos toxicolgicos), los estudios de
lectinas) en soja, glucosinolatos en colza, alimentacin se realizan con el alimento
cumarinas en apio y solaninas en papa. Tam- completo, por ejemplo, grano o forraje en
bin se pueden medir alrgenos en soja el caso de maz, harinas de soja tostadas , o
(glicinina), beta carotenos en zapallo, y semilla de algodn como suplementacin de
gosipol en algodn. La OECD ha publicado la dieta . (Ver Tabla 1).
recientemente recomendaciones que especifican qu componentes son ms apropiaSegn los resultados de todos los pundos analizar para cada cultivo en particular.
tos analizados, es posible clasificar al cultivo
A parte de la comparacin en compo- o alimento GM en una de estas tres categonentes especficos, se realizan, general- ras posibles (FAO/OMS/OECD):
mente, ensayos de aptitud nutricional en
* El producto GM es sustancialmente
modelos animales. Estos apuntan a detec- equivalente a la contraparte tradicional, no
tar cualquier efecto no intencional de la mo- existiendo diferencias significativas. Esta situadificacin que pudiera haber afectado el va- cin se da principalmente en productos altalor nutricional del alimento o su inocuidad. mente refinados. El aceite o la fructosa deriEs comn que se utilicen ensayos de alimen- vados de maz GM, son totalmente equivatacin de duracin variable (entre 42 y 120 lentes a los derivados de maz convencional.
das) dependiendo del modelo elegido. Uno
* El cultivo o alimento GM es sustancialde los ms utilizados y sensibles es el de po- mente equivalente a su contraparte tradillos parrilleros, ya que pasan de pesar 35 gra- cional con la excepcin de diferencias clamos a ms de 2 kg en 42 das. Este crecimien- ramente definidas (presencia de la/s proteto rpido hace que se puedan detectar pe- nas introducidas y/o diferencias bien caracqueas deficiencias nutricionales del alimen- terizadas en otros elementos individuales).
Dentro de esta categora caen la mayora
to.
380
RUBINSTEIN, Clara
de los cultivos de primera generacin, que

expresan un rasgo nico, tal como la resistencia a herbicidas o la proteccin contra
insectos, y algunos de segunda generacin,
con mejoras nutricionales o de calidad. Para
demostrar que los cultivos o alimentos GM
son tan seguros como su contraparte tradicional, se debe mostrar que cada diferencia encontrada no tiene consecuencias
toxicolgicas ni nutricionales. Esta evaluacin
se lleva a cabo caso por caso, y segn se considere necesario, pueden conducirse ensayos
de toxicidad o estudios de alimentacin en
animales grandes con el cultivo entero.
* El cultivo o alimento GM no es
sustancialmente equivalente a su contraparte tradicional o no existe un cultivo equivalente con el cual compararlo. Ejemplo de esto
seran cultivos con ciertos rasgos combinados o cultivos con valor nutritivo aumentado que contienen nuevas vas
metablicas o modifican las endgenas. La
evaluacin de seguridad se va a enfocar en
las caractersticas de los nuevos productos
expresados. En cada caso en particular se
determinar el programa de estudios que

corresponda.
Actualmente, todos los cultivos modificados y sus productos alimentarios derivados
presentes en el mercado han sido analizados en profundidad para evaluar su seguridad, demostrndose que son sustancialmente equivalentes, con la excepcin de la/s protenas introducidas y son tan seguros como
su contraparte tradicional. En un futuro se
introducir una segunda generacin de cultivos con rasgos de calidad y valor nutritivo
mejorado. Por definicin, es menos probable que sean sustancialmente equivalentes a
las variedades tradicionales.
La evaluacin de la seguridad en estos
casos requerir enfocarse en los cambios
composicionales intencionales que se hayan
introducido en cada caso, y en la evaluacin
de los efectos no intencionales (esperados
o no) que pudieran haberse producido por
modificacin de las vas metablicas
involucradas.
Como ejemplo de este tipo de casos, se
puede mencionar el arroz conocido como
arroz dorado, debido a la modificacin introducida para expreTabla 2: componentes analizados en semillas enteras de soja y
en varias fracciones de soja procesada (Tomado del Cuadernillo
sar altas concentraciones de betaTcnico No1, Seguridad de la Soja RR tolerante a Glifosato (Monsanto
caroteno, precursor de vitamina A
Agricultura Espaa, 2001)
(que le da esta coloracin particular). Como efecto no esperado de
esta modificacin, se encontr que
tambin se expresaban mayores
niveles de xantofilos, un cambio
que fue detectado aplicando tcnicas de croma-tografa de alta
presin (HPLC) para carotenoides,
y que no hubiera sido aparente en
un anlisis general de composicin. Este tipo de anlisis, por lo
tanto, puede ser apropiado en
casos de modificaciones nutricionales (de segunda generacin)
dirigidas a cambiar algn paso en
vas metablicas especficas, pero
que pueden tener efectos en el
mbito de otros componentes.
Es en estos casos, en los que
las nuevas tecnologas analticas
que se estn desarrollando pueden aportar soluciones al anlisis
de riesgo (ver prxima seccin).
Asimismo, este tipo de modifica-
381
ciones puede implicar un cambio significativo

en la ingesta de ciertos nutrientes (por ejemplo, vitamina A), y requerir un seguimiento
luego de su comercializacin para verificar el
posible impacto nutricional (positivo o negativo) que esto pueda tener en una determinada poblacin.
En la Tabla 2 se resume como ejemplo el
tipo de componentes analizados en diferentes fracciones, para la evaluacin de seguridad alimentaria para el evento de soja GM
40-3-2, tolerante a glifosato (ver Parte VIII,
captulo 6). En la Tabla 1 se listan los diferentes modelos animales utilizados para la evaluacin de aptitud nutricional de OGM y los
parmetros que se analizan en cada caso.
3. Evaluacin de impacto ambiental
Toda tecnologa tiene un cierto riesgo que
debe ser evaluado 1) en funcin del beneficio o beneficios que aporta y 2) en el contexto de las tecnologas que se utilizan con el
mismo fin y de tecnologas alternativas, en
caso de existir.
La evaluacin del impacto ambiental de
nuevos cultivos GM es una parte fundamental de su proceso de aprobacin y control y debe enfocarse dentro de los
parmetros enunciados. En los captulos 2 y
3 se desarrolla este aspecto en mayor detalle, por lo que en este punto se enunciarn
los posibles impactos sobre el ambiente, que
son evaluados antes de la introduccin de
un OGM en los agroecosistemas, y que se resumen en los siguientes puntos:
Capacidad de convertirse en maleza: en
caso de que la planta GM tuviera caractersticas que la hicieran ms resistente a las condiciones ambientales, o tuviera mayor poder
reproductivo que su contraparte convencional.
Posible impacto en especies benficas
o sobre la flora o fauna circundante: es evaluado el impacto que el cultivo podra tener
en especies propias del agroecosistema. Por
ejemplo, efectos sobre especies que no son
el blanco de su actividad en el caso de cultivos GM protegidos de insectos.
Mayor capacidad de cruzarse con plantas de su entorno que la contraparte convencional. Incluso en caso de ser idntica, se
evala cules seran las consecuencias de di-
382
chos cruzamientos (debido al llamado flujo

gnico mediado por polen).
El flujo gentico entre poblaciones es un
fenmeno natural, responsable de una gran
diversidad gentica. Para estimar qu peso
puede tener un rasgo nuevo introducido
por ingeniera gentica en el flujo gnico
general, es importante tener en cuenta qu
efecto en particular producir ese gen si
se establece en otra poblacin. Todo esto
se examina en funcin de la existencia de
parientes silvestres de ese cultivo en la zona
donde se lo quiere introducir. Por ejemplo,
en el caso de la soja o el maz, no existen
parientes silvestres en la Argentina, pero s
en Mxico (en el caso de maz) y en China
(en el caso de la soja).
En el caso de cultivos resistentes a insectos, la aparicin de insectos resistentes.
Es conocida la plasticidad gentica de los insectos para desarrollar estrategias adaptativas que les permiten sobrevivir a insecticidas qumicos. De igual modo, es posible pensar que lo mismo ocurrir con las protenas
de control biolgico utilizadas en los cultivos
transgnicos tolerantes a plagas. Por este
motivo, se han desarrollado procedimientos
y estrategias para minimizar o prevenir el
desarrollo de estas resistencias en las plagas
blanco.
Si bien no se han reportado casos de aparicin de insectos resistentes por el uso de la
tecnologa de proteccin de insectos en plantas desde 1996, es importante desarrollar
estrategias que apunten a conservar el recurso biolgico. Estos programas se conocen
como de Manejo de Resistencia de Insectos o MRI (IRM en ingls: Insect Resistance
Management) y se disean a medida de cada
cultivo y plaga que se va a controlar,
basandse en el conocimiento del modo de
accin de esta protenas y la dinmica de las
poblaciones de los insectos plaga.
Es requisito presentar un plan de MRI,
para que las agencias regulatorias evalen
el impacto ambiental antes de la introduccin comercial de un cultivo GM protegido
de insectos. Todos estos puntos son analizados, del mismo modo que la inocuidad
alimentaria, caso por caso. Tambin se estima el cambio que podra provocar en el manejo agronmico, la introduccin de un dado
cultivo GM .
RUBINSTEIN, Clara
mtica han potenciado la identificacin y

caracterizacin de genes (genmica) y el
estudio de su funcin (genmica funcional).
Otras tecnologas derivadas de las primeras y en constante evolucin, se ocupan del
estudio del transcriptoma, el proteoma, el
metaboloma, que abarcan todos los transcriptos, proteinas o metabolitos de una especie , respectivamente. Hoy se habla de las
tecnologas micas en referencia global a
este tipo de aproximacin.
Paralelamente, estas tecnologas permi4. Nuevas tecnologas potencialmente
ten el desarrollo de nuevos campos de la cienaplicables a la evaluacin de la
cia, como la farmacogenmica, la toxicogebioseguridad
nmica y la nutrigenmica, que son versiones micas de las especialidades tradicioLos avances en la tecnologa cientfica de nales que abordan el mismo problema.
los ltimos aos han transformado profunEstas tecnologas hoy se encuentran en
damente la forma en la que se hace ciencia y una etapa inicial de generacin de enormes
se obtiene informacin de los sistemas bio- cantidades de datos; sin embargo, el potenlgicos. La enorme capacidad de secuencial que presentan a corto y mediano plazo
ciacin en combinacin con la bioinfor- para el descubrimiento y la comprensin de
procesos biolgicos, no
tiene precedentes.
En el campo del anlisis de riesgos, especialmente en los aspectos
toxicolgico y nutricional, ser valioso contar
con tecnologas que permitan determinar los
perfiles bioqumicos de
OGM y sus contrapartes convencionales
(profiling), ya que ser
posible de un vistazo,
detectar cambios en los
patrones de expresin
gentica y en los proteicos o metablicos
por efecto de la modificacin.
El problema es que
seguramente, al penetrar en niveles de resolucin tan altos, se encontrarn una serie de
cambios que incluso son
evidentes entre individuos del mismo grupo
Figura 3: Diagrama para la estimacin de seguridad de OGM. Adaptado de
(por ejemplo, individuos
Cockburn , 2002
de la misma variedad no
El objetivo de las evaluaciones de riesgo
ambiental, es identificar impactos en el
ambiente, cuantificarlos y proporcionar
elementos para aquellos que deben manejar y minimizar estos riesgos, siempre en
el contexto del balance riesgo-beneficio y
de las tecnologas alternativas disponibles
(por ejemplo, cultivos Bt evaluados en relacin con las aplicaciones tradicionales de insecticidas qumicos, y en el contexto del Manejo Integrado de Plagas, como una herramienta ms de control biolgico).
383
GM), debido a la variabilidad natural. Esta variabilidad, hace muy difcil en estos momentos poder interpretar de manera clara muchos de los resultados que se obtienen, y su
significacin biolgica real, para poder sacar
conclusiones en cuanto a su relevancia en la
bioseguridad.
Sin embargo, en un futuro cercano, y a
medida que se avanza en el conocimiento
de los sistemas biolgicos, ser posible aplicar nuevas tecnologas a la evaluacin de la
seguridad alimentaria, no slo de OGMs sino
de cualquier alimento.
Conclusin
El objetivo del anlisis de riesgos para organismos y/o alimentos derivados del uso de
la ingeniera gentica (GM) es estimar el impacto que los efectos intencionales y los no
intencionales de la modificacin, pudieran
tener sobre la inocuidad del alimento o del
organismo GM, o sobre su impacto ambiental.
El enfoque utilizado para aplicar este proceso (el enfoque comparativo) ha sido
consensuado a partir de consultas y discusiones en el plano internacional, y se basa en la
comparacin de parmetros como composicin, txicos naturales o aptitud nutricional,
con la contraparte convencional que tiene
historia de uso seguro y es aceptado como
alimento inocuo (OECD, 2000).
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385
IX.- Capitulo 2
Bioseguridad de Organismos
Genticamente Modificados - Marcos
Regulatorios
Dr Burachik, Moiss
1. Panorama Internacional
Desde 1986, algunos pases como Japn,
por ejemplo, se han ocupado de elaborar y
desarrollar regulaciones para controlar la
entrada en el mercado de productos derivados del uso de tcnicas de ADN recombinante. En ese momento el foco estaba
puesto en los ingredientes o aditivos
alimentarios producidos por microorganismos recombinantes, pero a medida
que la tecnologa avanzaba y se aplicaba a
otros organismos, estas reglamentaciones se
vieron extendidas a plantas y animales modificados.
Numerosos pases en los cinco continentes, tienen en este momento un marco
regulatorio disponible para la evaluacin y
aprobacin de OGMs antes de su entrada
en el mercado.
Entre los primeros pases que han desarrollado estos procesos, se encuentran los
pases europeos, siendo la Comisin Europea,
el rgano de evaluacin y control de la Unin
Europea. En los Estados Unidos, diferentes
agencias estn involucradas en estas evaluaciones: la Agencia de Alimentos y Drogas
(FDA), la Agencia para la Proteccin del Medio Ambiente (EPA) y el Departamento de
Agricultura (USDA). Canad y Australia-Nueva Zelanda, han establecido sus sistemas
regulatorios ms recientemente (a partir de
1993).
En cuanto a Amrica Latina, Argentina
fue el pas pionero en esta materia, con la
creacin de CONABIA en 1991, en el mbito
de la Secretara de Agricultura, Ganadera,
Pesca y Alimentacin (ver ms adelante). Es
importante notar que despus de los EEUU,
Argentina es el pas con mayor grado de
adopcin de cultivos agrobiotecnolgicos,
seguido por Canad.
Otros pases de la regin han comenzado desde entonces a establecer sistemas

para la evaluacin de la bioseguridad de
OGMs. Colombia, Chile, Brasil, Uruguay, Paraguay, Bolivia, poseen comisiones tcnicas
evaluadoras, y en algunos de estos pases ya
se han aprobado la comercializacin y el cultivo de variedades GM. Estos sistemas estn
siendo establecidos en muchos otros pases,
especialmente apuntando a la implementacin del Protocolo de Bioseguridad, tambin conocido como Protocolo de
Cartagena, vigente desde Septiembre de
2003. Este protocolo, firmado en el ao 2000
por ms de 130 estados, regular los movimientos transfronterizos de OGMs vivos
o OVGMs , con el objeto de asegurar un nivel adecuado de bioseguridad en el comercio internacional y la conservacin de la
biodiversidad . Para una actualizacin sobre
marcos regulatorios en America Latina, ver
el listado de sitios recomendados.
2. Cules son los riesgos?
Uno de los problemas inherentes a la concepcin de un marco regulatorio para los
ensayos de campo de plantas GM es el de la
identificacin de los riesgos que deben considerarse. Esta identificacin depende de las
opciones que se acepten de un conjunto de
posibilidades y de los valores de los que optan, sean ellos cientficos, funcionarios, polticos, empresarios o pblico en general. Esto
es, deben compatibilizarse criterios sobre
lo que se consideran riesgos aceptables, en
un marco de intereses muy variados.
Por otra parte, si bien la identificacin de
los riesgos se basar en conocimiento cientfico disponible ahora, existir siempre un
componente de extrapolacin (si bien plausible) cuando se estimen efectos adversos
potenciales, que es la materia misma y el
objetivo del anlisis de riesgos.
No obstante estas limitaciones, la evaluacin de efectos potenciales de una entidad y sus implicaciones, para verificar y estimar la posiblidad de ocurrencia de un efecto
adverso y caracterizar la naturaleza de tal
efecto es (definible como) una actividad cientfica (Natl. Acad. Sci., 1983).
Con estas limitaciones en mente, lo que
sigue es una lista acotada de caractersticas
387
comnmente asociadas con los riesgos de los

ensayos de campo de plantas GM, que son
los que se han tenido en cuenta al fundamentar los requerimientos necesarios para
evaluar su impacto en cada caso .
I Prdida de Diversidad Biolgica:
Aqu nos referimos a la prdida debida a
la presin del mercado y de los costos sobre
los productores, induciendo cambios en las
prcticas agronmicas (menor uso de herbicidas e insecticidas) por la utilizacin (ventajosa) de OGMs, en desmedro de razas locales adaptadas (landraces) empleadas en la
actualidad.
Tambin podra producirse si se cultivan
OGMs en la vecindad de centros de origen o
de diversidad de sus parientes silvestres o de
especies sexualmente compatibles, por fenmenos de introgresin gnica (este riesgo
es relativamente ms importante en el hemisferio Sur).
II Transferencia gentica a especies silvestres o malezas sexualmente compatibles,
con el resultado de la formacin de hbridos
viables con fenotipos no deseados (p.ej.,
tolerancia a herbicidas, resistencia a insectos
u otras plagas). (Ver Captulo 3, de esta parte).
III Incremento de la presin de seleccin,
tal que favorezca un aumento de la tolerancia de plagas a insumos defensivos actualmente empleados. En el caso de insumos que por
razones ambientales, econmicas o de manejo agrcola, son apreciados por el productor y/o por la sociedad (p.ej., herbicidas postemergentes, productos biodegradables, insecticidas biolgicos, productos de menor
costo, o sin restricciones relacionadas con la
propiedad intelectual, etc.), el aumento de
la tolerancia de la plaga al producto es un
efecto desfavorable, ya que puede convertir
a dicho insumo en intil en el futuro.
IV Modificacin de las relaciones
predador-plaga entre insectos, en detrimento de los insectos benficos. Aqu se incluyen
los efectos sobre organismos no-blanco
(caso de cultivos con incorporacin de genes
de resistencia a insectos). El conocimiento
388
insuficiente sobre especies amenazadas de

extincin (p.ej., insectos benficos, sus plantas-refugios, etc.), tambin es un factor a tener en cuenta.
V Persistencia en estado funcional
(transferible, integrable y expresable) del
DNA residual en suelos u otros hbitats (p.ej.,
el intestino de mamferos), y de los posibles
mecanismos de su eventual transferencia
(p.ej. genes de resistencia a antibiticos hacia microorganismos patgenos humanos).
Este riesgo se incluye en esta lista limitada, pero su ocurrencia se considera en general muy poco probable.
VI Modificaciones en la relaciones
ecolgicas con otros organismos en el largo
plazo.
VII Fenmenos no esperados de
recombinacin (relacionados con promotores, enhancers, cpsides virales, etc) que cambien caractersticas epidemiolgicas,
ecolgicas o rango de husped de
patgenos. Este es tambin un fenmeno
de ocurrencia muy poco probable. La existencia de una zona potencialmente
recombinognica en el promotor 35S del virus del mosaico del coliflor, ampliamente utilizada en las construcciones insertadas en
OGMs, no parece tener consecuencias biolgicas significativas. En cuanto a la resistencia
a virus por sobre-expresin de la cpside viral
(un mecanismo que ms probablemente se
trate de silenciamiento gnico que de reencapsidacin del cido nucleico viral. Ver VIII4) es tambin muy poco probable que genere fenmenos de trans-capsidacin con cambios hipotticos en el rango de husped
(cpside A tomada por un virus B, de modo
que el rango de husped de B pasa a ser el
de A).
VIII Efectos del ingreso de protenas de
inactivacin de antibiticos en la cadena
alimentaria. Posible necesidad de cambiar los
marcadores de seleccin utilizados en la obtencin de las plantas transgnicas. Este riesgo no ha sido probado, y por el contrario
existen muchas pruebas (y barreras biolgicas) de que tiene una muy baja probabilidad de ocurrencia. Sin embargo se inclu-
BURACHIK, Moiss
ye en esta lista por el impacto que tiene en

la legislacin europea en este sentido.
IX Posibles cambios en los flujos comerciales.
En el rea del manejo de riesgos, es importante el manejo de las modificaciones
esperables en la resistencia de las plagas, por
parte de los productores, mediante un control post-liberacin. Este no es un riesgo,
sino una condicin necesaria para el mantenimiento de la utilidad del OGM con determinadas caractersticas. Por ejemplo, la liberacin de plantas conteniendo genes de resistencia a insectos (genes Bt), debe estar
acompaada con programas de manejo (establecimiento de refugios, control de plantas y cultivos vecinos) para prevenir que la
presin selectiva del evento seleccione poblaciones de insectos resistentes que harn
inefectiva la proteccin inicialmente lograda
con la modificacin gentica. En realidad este
fenmeno slo se puede retrasar, ya que
toda presin de seleccin generar individuos
tolerantes, en tiempos ms o menos cortos.
3. Fundamentos de las normativas Definiciones
La elaboracin y evolucin de un marco
regulatorio para la bioseguridad de una tecnologa novedosa como la biotecnologa aplicada al mejoramiento vegetal, no est exenta de dificultades.
Por una parte est la responsabilidad de
asegurar la aplicacin sustentable de la
nueva tecnologa, y de preservar al hombre,
la flora, la fauna y el ambiente de los potenciales efectos perjudiciales de las innovaciones, tanto en el presente como en el futuro.
Por otra parte, hay razones para no obstaculizar el desarrollo de las innovaciones
biotecnolgicas, que ya han demostrado
poseer un gran potencial para brindar beneficios a la sociedad. Toda actividad humana
(especialmente la innovacin tecnolgica)
implica peligros (riesgos) y por lo tanto requiere la atencin (gestin) de su seguridad.
La seguridad se obtiene definiendo, evaluando y gestionando los riesgos asociados
con la innovacin.
Aplicando estos conceptos a la

biotecnologa, que implica el uso de organismos vivos, podemos enfocar el anlisis de
los riesgos de los ensayos hacia los siguientes aspectos generales:
Identificacin de los todos organismos involucrados (donantes, receptores,

etc),
Caractersticas de los organismos
involucrados en la obtencin del OGM (familiaridad, patogenicidad, etc),
Manera en que sern utilizados los
OGMs (escala, contencin)
Caractersticas de las zonas y de los
otros organismos (lugares, medio receptor
potencial, incluyendo seres humanos)
La normativa argentina ha tomado en
consideracin estos aspectos, entre otros,
para elaborar un marco regulatorio detallado para los Ensayos a Campo de Plantas
Transgnicas, que se describe a continuacin
en sus rasgos principales.
Consideramos una definicin aceptable
de bioseguridad, como la proteccin de la
salud humana y del ambiente con respecto a los riesgos conocidos y/o percibidos
de la tcnica o proyecto en cuestin, de
acuerdo al estado actual de nuestros conocimientos. Est implcita en esta definicin
que una regulacin para la bioseguridad, que
significa una regulacin de los riesgos aceptables para la sociedad, conlleva una condicin de flexibilidad y de adaptacin permanentes.
Para la normativa argentina, un OGM es:
un organismo (vegetal, animal, microorganismo o virus)

en el cual se ha introducido informacin gentica precisa y definida
en forma deliberada y dirigida a obtener un determinado fenotipo
siendo aquella introduccin realizada
de tal manera que dicha informacin gentica
no podra haber sido adquirida por ese organismo por la va de mutaciones, recombinaciones u otras formas de transferencia
gentica reconocidas como mecanismos que
operan en la Naturaleza sin intervencin humana.
389
Esta definicin hace referencia al mtodo de obtencin del OGM, con el propsito
de establecer el campo de aplicacin de la
norma, excluyendo, por ejemplo, los cruzamientos tradicionales. Sin embargo, en el
anlisis del riesgo de la liberacin de un
OGM, la caracterstica dominante, esto es,
aquella que constituye el foco del anlisis de
la Comisin, es el inserto, esto es, la porcin
de DNA efectivamente presente en el
genoma transformado, cuya naturaleza y
consecuencias (geno- y fenotpicas) caracterizan al OGM como tal.
Al OGM o conjunto de OGMs con un
dado inserto se los denomina colectivamente evento. Varios OGMs pueden contener el mismo evento, y por lo tanto sus anlisis de riesgo sern equivalentes. Ocasionalmente, en etapas tempranas del desarrollo
de un OGM, se admite que el evento puede
no estar inequvocamente caracterizado, en
el sentido de que no se ha definido el inserto con la debida precisin (por ejemplo, el
inserto puede estar en diferentes posiciones
en el genoma del vegetal). En estos casos, el
anlisis se enfoca en la construccin gentica
utilizada en la transformacin.
Definimos como transformacin, el mtodo utilizado para introducir la nueva informacin gentica, vehiculizada por el
vector.
Si bien la normativa argentina atiende
aspectos del proceso de obtencin de un
OGM en el anlisis de riesgo, esa atencin
slo se enfoca en aquellas caractersticas
que interesan en la evaluacin del producto (y no del proceso de su obtencin), en el
sentido de que esas caractersticas se encontrarn finalmente en el OGM obtenido.
Otra caracterstica del marco regulatorio
administrado por la CONABIA es que considera cada producto o liberacin caso por
caso. Si bien los antecedentes (si los hubiera) se tienen en cuenta, y los casos similares
son identificados y considerados como objetos de informacin vlida para la evaluacin,
los datos no son transferibles, y cada caso
y/o solicitante deben ser coherentes y
autosuficientes en cuanto a la informacin
que provee a la Comisin. La definicin de
caso es entonces relevante. Un caso est
definido por:
390
La empresa o ente solicitante.

El evento de transformacin (es decir:
un inserto definido introducido en el
genoma de la planta, admitindose un conjunto de eventos con un nico vector en las
etapas muy preliminares del desarrollo del
OGM).
La escala de la liberacin.
Cualquiera de estas condiciones que no
se conserve (p.ej., el mismo evento presentado por dos empresas o entes diferentes)
representar un caso diferente.
La normativa puesta en prctica es
proactiva, en el sentido de que requiere un
anlisis previo de todas las previsibles consecuencias de una liberacin antes de que tal
liberacin sea autorizada.
4. Marco Regulatorio en Argentina
Argentina dispone desde 1991 de un
marco regulatorio para el Anlisis y la Gestin de los Riesgos asociados con los Ensayos a Campo de Organismos Genticamente
Modificados (OGMs). Esta normativa es administrada por la Comisin Nacional Asesora de Biotecnologa Agropecuaria
(CONABIA), que opera en el mbito de la
Secretara de Estado de Agricultura, Ganadera, Pesca y Alimentos (SAGPyA). Esta Comisin es multisectorial (la forman representantes de los sectores pblico y privado),
multidisciplinaria, y es la encargada de emitir las recomendaciones con respecto a la
autorizacin para los ensayos solicitados (experimentacin y/o liberaciones a campo).
Estas recomendaciones son remitidas a la
autoridad decisoria, que es el Secretario de
la SAGPyA. En el presente trabajo se analiza
esta normativa y se exponen algunas consideraciones sobre los factores que deben ser
atendidos.
La consideracin bsica que gua el funcionamiento y los dictmenes de la CONABIA
es la Bioseguridad, y su caracterstica esencial es que funda sus procedimientos
operativos en consideraciones exclusivamente tcnicas, fundadas en los conocimientos cientficos disponibles.
Los principales criterios aplicados en la
normativa argentina para decidir si una libe-
BURACHIK, Moiss
racin puede autorizarse, pueden resumirse

as:
a) el criterio de bioseguridad: la definicin, evaluacin y gestin de los riesgos, es la
consideracin primaria y su aplicacin es
proactiva, esto es, debe realizarse antes de
autorizarse la liberacin; los ensayos son
evaluados caso por caso; el foco del inters
est en el producto, pero aquellas caractersticas del procedimiento de su obtencin
que terminan afectando o manifestndose
en el producto final, son tambin analizadas
b)el enfoque precautorio: el marco
regulatorio acompaa el desarrollo del producto, y no se requiere la fundamentacin
cientfica completa para detener dicho desarrollo; basta que se presente alguna de las
siguientes situaciones: i) no existe suficiente
informacin sobre el sistema, ii) los riesgos
no son aceptables en base a presunciones
razonables, iii) la evaluacin no sea concluyente, o iv) el sistema es demasiado complejo
CONABIA dictamina sobre la historia de

bioseguridad de la planta transgnica, para
informacin de las agencias especficas del
Estado encargadas de aquellos pasos.
Si bien el marco regulatorio inicial ha experimentado algunas modificaciones a lo largo de los aos (como respuesta a las necesidades de su adaptacin en un campo tecnolgico de rpido crecimiento), sus principios
bsicos se han mantenido y han demostrado su eficacia, desde varios puntos de vista
que se describen ms abajo. La versin que
se presenta aqu resume las principales caractersticas de la normativa vigente en la actualidad.
5. El Ente Regulatorio Argentino:
CONABIA
La CONABIA es una Comisin multisectorial, formada por miembros de los sectores pblico y privado. Su Coordinacin Tcnica est a cargo de tres profesionales que
pertenecen al sector pblico (vase la Tabla).
Dada las caractersticas de esta composicin,
la operatoria de la Comisin hace especial
La CONABIA no interviene en las etapas
nfasis en mantener una elevada tica de
ulteriores (aprobacin alimentaria, dictamen transparencia, evitando rigurosamente la
sobre el impacto en las exportaciones y re- posible interferencia de conflictos de interegistro, para la comercializacin) del camino ses. Para ello, los miembros deben declarar
de una planta GM hacia el mercado (Ver Fi- la existencia y naturaleza de sus intereses,
gura 1). Sin embargo, emite un dictamen sean ellos comerciales o cientficos, y excluirparticular fundado sobre la bioseguridad de se totalmente de la discusin de solicitudes
la produccin masiva a escala comercial del de liberacin de OGMs que provengan de las
cultivo en cuestin. De este modo, la empresas o institutos a los que estn vinculados.
Fase I
La Comisin es profesioliberacin
nalmente
multidisciplinaria,
experimental
los
criterios
para la toma de
CONABIA
Informacin
Solicitantes
decisiones
son
exclusivamenrequerida
te tcnicos y el principio bFase II
sico que rige esas decisiones,
SENASA
liberacin
(seguridad
alimentaria)
Aprobacin
que se toman por consenso,
extensiva
o Rechazo
/comercial
es la bioseguridad.
En los documentos que
presentan
a la CONABIA, los
Secretario de
Direccin de Mercados
Dictmenes
solicitantes de autorizaciones
Agricultura
Internacionales
fundamentados
de ensayos tienen la opcin
de hacer reserva de informacin que consideren confidenEvaluacin del OGM a tres niveles
cial. La informacin as considerada, ser examinada por
FIGURA 1: el sistema de regulacin y aprobacin de OGMs en Argentina
solamente uno de los miem-
391
bros de la Comisin, quien deber emitir un

juicio fundado sobre la bioseguridad de la propuesta y exponer esta opinin (aunque no
la informacin reservada) ante la Comisin.
A continuacin se resumen los ms
importates logros luego de once aos de trabajo de CONABIA :
El anlisis de riesgo y autorizacin de

unas 550 liberaciones de OGMs. El nmero
de presentaciones muestra un pronunciado
crecimiento hasta 1999, en que la gestin a
cargo de la Secretara de Agricultura Ganadera Pesca y Alimentos desde esa fecha, y hasta 2001, demor la aprobacin de muchos
ensayos.
Procedimientos operativos giles, que
mantienen la alta calidad de los anlisis de
riesgos sin obstruir ni producir demoras innecesarias en el normal desarrollo y aplicacin
de la tecnologa.
Juicios positivos manifestados sobre su
actuacin por varias autoridades representativas de los entes regulatorios de pases como
el Reino Unido de Gran Bretaa, Estados
Unidos de Norteamrica y Canad, entre
otros.
Organizacin y Co-organizacin de Reuniones Internacionales sobre Bioseguridad
y Manejo de Riesgo, con la participacin de
representantes de pases con amplia experiencia regulatoria.
Misiones de asesoramiento institucional a pases limtrofes en la elaboracin
de sus marcos regulatorios.
Desarrollo de varias iniciativas de armonizacin regulatoria regional.
Asesoramiento a los negociadores de
la Cancillera y participacin institucional en
las discusiones sobre la poltica nacional con
relacin a la implementacin de la Convencin de Diversidad Biolgica sobre
Bioseguridad para la Biotecnologa.
Esta operatoria de CONABIA permite asegurar, tanto para la sociedad como para los
sectores empresariales, un balance correcto
entre la proteccin de la salud, la preservacin de la calidad ambiental y la
sustentabilidad de los proyectos aprobados,
con la implementacin regulada, en tiempo
y forma, de las innovaciones tecnolgicas
392
propuestas por los solicitantes.

La CONABIA realiza las evaluaciones de
todas las Solicitudes de liberaciones de OVGM
al ambiente, y recomienda al Secretario de
Agricultura, Ganadera, Pesca y Alimentos
sobre la conveniencia o no de autorizar dichas liberaciones. Estas evaluaciones comprenden dos fases:
1) las evaluaciones de las liberaciones
experimentales cuyo propsito es determinar que la probabilidad de efectos sobre el
ambiente es no significativa primera fase
de evaluacin-, y
2) las evaluaciones de las liberaciones
extensivas cuyo propsito es determinar que
dichas liberaciones del OVGM no generarn
un impacto sobre el ambiente que difiera
significativamente del que producira el
organismo homlogo no GM segunda
fase de evaluacin-. (Ver Figura 1)
6. Primera Fase de Evaluacin: Ensayos
experimentales
Los solicitantes deben presentar un legajo de informacin especfica, que consta de
una Informacin General sobre la liberacin
y sobre el OGM en cuestin y de un apartado sobre las Condiciones de Bioseguridad
que se pondrn en prctica.
El campo del anlisis de los riesgos abarcado por estas informaciones, que debe proveer el solicitante, es amplio, e incluye tanto
las caractersticas de la liberacin como las
del OGM. Con respecto a las caractersticas
de la liberacin, la Informacin General sometida al anlisis incluir:
Si el material es importado: status

regulatorio en el pas de origen.
Propsito de la liberacin (objetivo,
cronograma, protocolos, antecedentes). Si es
a escala de invernadero o a campo
Operaciones de transporte de OGM (ingreso al pas, transportes internos).
Cantidad y tipo de material a liberar,
antecedentes en otros pases.
Lugar de la liberacin.
Detalles operativos para auditar la liberacin (fechas, instituciones, personas).
Con respecto a las caractersticas del
OVGM, se analizar el genotipo del evento
BURACHIK, Moiss
(es decir, las nuevas caractersticas

genticas introducidas), para lo cual el solicitante debe proveer informacin con respecto a:
Descripcin de la biologa molecular del

sistema donante-vector-receptor
Mtodo de transformacin utilizado
Genes principales (y sus organismos donantes). Genes auxiliares (marcadores de
seleccin).
Secuencias regulatorias (promotores,
terminadores, enhancers, etc.). Otros elementos genticos introducidos.
Productos de expresin, tejidos de la
planta en los que se expresan, niveles de expresin. Homologas de secuencia con protenas txicas o alergnicas.
Descripcin fenotpica del organismo
receptor, centros de origen o diversidad
gentica.
Estabilidad fenotpica y nmero de generaciones en los que se verific.
En cuanto a la seccin sobre las Condiciones de Bioseguridad, la informacin solicitada depende de la escala de la liberacin:
desde laboratorio/invernadero hasta pruebas a campo. En el caso de eventos que an
no han obtenido la autorizacin de
comercializacin en el pas, es decir, eventos
regulados, que se siembran a gran escala
para producciones de semilla en contraestacin para el hemisferio Norte, o con
otros fines, existe un protocolo especfico que
es necesario presentar para obtener la autorizacin.
En todos los casos el solicitante debe proveer informacin relativa a varios aspectos
bsicos de los Procedimientos de Bioseguridad, a saber:
a) Durante la liberacin: Descripcin y
ubicacin del lugar o instalacin donde se
realizar la liberacin. Localizacin precisa
(mapas detallados): distancia a caminos, lugares transitados, lmites del predio bajo control del solicitante. Caractersticas constructivas de bioseguridad (laboratorio o invernadero) y normas de acceso. Tamao y nmero de parcelas, su diseo, plano de siembra y
superficie a sembrar. Medidas de aislamiento
En ensayos a campo: distancias, tiempos de floracin, jaulas, cobertura para evitar la diseminacin del polen, por viento o
insectos, control de vectores potenciales de
polen u otro material con capacidad de propagacin, etc.
En ensayos en laboratorio o invernadero: mtodos o estructuras de contencin
contra el ingreso de vectores potenciales de
material gentico.
b) En los movimientos de materiales:
semillas, material vegetal acompaante, as
como los lugares, normas e identificacin del
material que sea almacenado.
c) En lo relacionado con el destino del
material cosechado: el solicitante deber
informar sobre su utilizacin, aclarando si ser
local o si ser exportado o destrudo, e identificando los lugares de su almacenaje final o
transitorio.
d) En lo relacionado con la disposicin
final (OGM y materiales remanentes): se requiere informacin sobre el tratamiento del
suelo post-cosecha, el uso futuro del terreno, los controles posteriores (deteccin de
plantas voluntarias) y su duracin.
e) En el caso de un eventual escape del
OGM y/o de cualquier material asociado:
El solicitante debe exponer con claridad los
procedimientos que seguir en el caso de un
eventual escape del OGM y/o de cualquier
material asociado. Normalmente, esto incluye mtodos de identificacin del OGM, procedimientos para limitar y controlar el escape, as como la obligacin de notificar
perentoriamente a la autoridad regulatoria.
f) Tcnicas que se usarn para detectar
la transferencia de genes desde el OGM al
ambiente bitico.
g) Usos previstos del terreno con posterioridad a la liberacin solicitada. Control
posterior de la parcela, duracin de los controles post-cosecha.
Una vez completados los ensayos, es requisito indispensable para poder acceder a
nuevas autorizaciones, la entrega de un Informe de Cierre de la Liberacin, que incluye observaciones relativas al comportamiento agronmico del OVGM en cuanto a
germinacin, crecimiento vegetativo, floracin, susceptibilidad a enfermedades y plagas, as como efectos sobre organismos no
393
blanco y caractersticas de la cosecha, los tratamientos realizados y la disposicin final .

Es importante notar que estas liberaciones son peridicamente inspeccionadas por
agentes habilitados por la SAGPyA.
La normativa completa, as como los
requerimientos de informacin detallados en
los formularios que deben completarse para
obtener una autorizacin de liberacin, se
encuentran a disposicin para la consulta a
travs del sitio de CONABIA (ver en la lista
de lecturas y sitios recomendados).
7. Segunda Fase de Evaluacin : el camino
hacia el mercado
Como ya se ha enfatizado antes, la incumbencia bsica de la CONABIA est limita-
La informacin suministrada por la

CONABIA sobre el comportamiento del OGM
en cuestin a lo largo de los ensayos autorizados que se han realizado.
Esta ltima informacin constituye una
parte crucial del camino de la planta GM hacia el mercado, y es solicitada y analizada por
la CONABIA. En la normativa argentina actual se la denomina Segunda Fase de Evaluacin. La condicin necesaria para dar una
respuesta positiva a estas solicitudes en la
prctica, es que la CONABIA considere que:
No existen riesgos para la salud humana, para el agroeco-sistema, y para la flora
y la fauna asociados, derivados del cultivo
no confinado del OGM en consideracin.
Tabla I: COMPOSICION DE LA CONABIA

Representantes del Sector Pblico
REPRESENTANTES DEL SECTOR PRIVADO
Coordinacin Tcnica de la Comisin:

Direccin de Agricultura (Secretara de
Estado de Agricultura, Ganadera,
Pesca y Alimentos)
Asociacin de Semilleros de Argentina
INASE: Instituto Nacional de Semillas
Foro Argentino de Biotecnologa
SENASA: Servicio Nacional de Sanidad

y Calidad Agroalimentaria
Cmara de Productos de
Sanidad Agropecuaria y Fertilizantes
Secretara de Recursos Naturales y

Desarrollo Sustentable
Cmara Argentina de Productos

Veterinarios
Esta categorizacin requiere del

solicitante la presentacin de un
breve Resumen (caractersticas del
OGM; el evento, breve descripcin
molecular del inserto; usos del
OGM, destacando los que difieran
del organismo no transformado;
condiciones especiales, si las hubiera, para el cultivo extendido en gran
escala) y de una Solicitud que se
compone de:
Institutos Nacionales de Investigacin:

De Investigaciones Agropecuarias
De investigaciones Cientficas y
Tcnicas
Universidad de Buenos Aires
Sociedad Argentina de Ecologa
da a la gestin de los riesgos y la bioseguridad

de los ensayos a campo de plantas GM a diferentes escalas.
Los pasos siguientes hacia el mercado, es
decir la aprobacin de su uso como materia
prima alimentaria, la verificacin de que su
liberacin comercial no afectar negativamente nuestro comercio internacional, el registro
de la nueva variedad, y la autorizacin para
la produccin comercial, son resorte de otras
agencias del Estado (Ver Figura 1). Esas dependencias basan su decisin en dos clases
de informacin:
La informacin requerida a los solicitantes que es especfica a sus necesidades (la
aptitud alimentaria, la estructura de nuestro
mercado de exportacin).
394
A) Informacin General, que se

refiere a la informacin anterior,
pero de manera ms detallada. Deber incluir, entro otras informaciones,
Caracterizacin
del
OVGM, incluyendo protenas y/o RNAs que
expresa el OGM originados en el inserto y el
fenotipo que resulta de esa expresin; las
ventajas aportadas por la modificacin
gentica; resultados de los ensayos de campo realizados, en el pas y en el extranjero,
en lo que respecta a la bioseguridad .
Una declaracin de equivalencia, diferencia o no equivalencia del OVGM. El
solicitante declarar aqu si el OVGM es equivalente al organismo no GM de la misma especie, excepto por el fenotipo aportado por
la modificacin gentica introducida. La declaracin se referir a todas aquellas caractersticas del OVGM que no fue intencin modificar en el evento. Se deben citar los trabajos que sostienen esta declaracin. La equi-
BURACHIK, Moiss
valencia se referir al menos a: a) composicin centesimal, procesamiento, productos y

subproductos y b) caractersticas y prcticas
agronmicas, reas geogrficas, tipos de
ambientes, precauciones especficas para el
cultivo extensivo, si las hubiera, con relacin
a efectos ambientales. Asimismo, se declararn aqu las observaciones sobre cualquier
diferencia no intencional o no esperada, observada en cualquier aspecto de la expresin
fenotpica del OVGM en comparacin con el
organismo no GM de la misma especie. Se
deber incluir toda observacin que haya
surgido en el monitoreo post- comercializacin de este evento (si ste ha sido liberado comercialmente en otros pases), como
as tambin las que resultaran de investigaciones realizadas con posterioridad a dichas
liberaciones comerciales.
En caso que corresponda, el solicitante
declarar aqu si el tipo de modificacin
gentica tiene el propsito de introducir diferencias que determinan que el OVGM no
pueda considerarse sustancialmente equivalente al no OVGM, explicando sucintamente
aquellas diferencias. (Ver tambin Captulo1).
Una historia de experimentaciones y
ensayos previos, instrucciones sobre manejo
(agronmico y del producto) y almacenaje
(producto, subproductos y remanentes) si
difieren del organismo no transgnico.
Propuestas para el envasado, rotulado
y procesamiento, si difieren del organismo no
transgnico y medidas que deben tomarse
en caso de liberacin accidental o mal empleo.
B. Caracterizacin general del OVGM :
esta informacin se concentra en la metodologa y la construccin utilizada en la obtencin del OGM y en la caracterizacin exhaustiva del mismo a nivel molecular y
fenotpico. Se debe proporcionar informacin
sobre:
La especie receptora (caractersticas

fenotpicas, centros de origen y diversidad,
distribucin geogrfica en Argentina, estabilidad gentica, potencial de transferencia y/
o intercambio de genes con otros organismos, reproduccin, supervivencia, diseminacin, interacciones con otros organismos,
caractersticas patognicas, txicas,
antinutricionales, alergnicas u otras, e his-
toria de modificaciones genticas previas).

La modificacin gentica : mtodo de
transformacin empleado, descripcin detallada del vector (cada elemento gentico
componente, su origen, tamao y funcin;
mapa del vector; secuencias nucleotdicas o
regiones de la construccin cuyos productos
o funciones no sean conocidas; capacidad
para transferir genes, o para ser movilizados
por conjugacin, recombinacin o integracin; regiones del vector que se incorporan
al OGM, es decir que constituyen el inserto).
Caracterizacin del inserto: anlisis
molecular de la insercin en el genoma del
OVGM (nmero de sitios de integracin, nmero de copias de cada gen, incorporacin
de porciones de genes), origen y funcin de
cada elemento insertado en el OVGM, informacin sobre si el inserto (esto es, alguno de
sus elementos) confiere alguna funcin no
requerida para la expresin del fenotipo esperado en el OVGM, transposiciones y/o rearreglos dentro del inserto presente en la
planta (con respecto a las posiciones que los
elementos genticos tenan en el vector) y/
o de/con porciones del genoma de la planta
dentro del inserto y en sus regiones
flanqueantes; informacin detallada de las
secuencias del genoma vegetal que flanquean
del inserto y sobre la presencia/ausencia de
fragmentos del inserto en regiones del
genoma vegetal fuera del inserto funcional.
Los organismos donantes: caractersticas patognicas (con relacin a las resultantes de la expresin de los elementos presentes en la construccin utilizada en la transformacin). Caractersticas perjudiciales para
la salud humana o animal (con la observacin del punto anterior), potencial y/o antecedentes de transferencia natural (esto es,
en hbitats y condiciones naturales) de los
elementos que constituyen la construccin,
desde los organismos donantes a otros organismos, su probabilidad o frecuencia, y
fenotipos posibles u observados de los organismos receptores.
Caracterizacin del OVGM propiamente dicho: caractersticas fenotpicas incorporadas, si alguna caracterstica fenotpica del
organismo receptor no GM no se expresa en
el OVGM. Estabilidad gentica, segregacin
y transferencia a la progenie. Anlisis
molecular (Southern blot, PCR). Caractersticas de la expresin del nuevo material
395
gentico. Productos expresados (debe incluir

todos los elementos genticos que se incorporan al OVGM, total o parcialmente), caractersticas de la expresin (p.ej., constitutiva,
tejido-especfica), tejidos del OVGM en que
se expresan los genes introducidos y niveles
de expresin y su evolucin temporal, en relacin con el ciclo de la planta. Actividad biolgica de las secuencias expresadas, ARNs
transcriptos no traducidos, sus niveles, funcin y caracterizacin. Anlisis detallado de
las posibilidades de transcripcin, por ejemplo, que comience dentro del inserto y se extienda hacia el genoma de la planta ignorando seales de terminacin, as como de transcripcin y traduccin de protenas de fusin
o de marcos de lectura nuevos, generados
como consecuencia de la insercin. Tambin,
se deben detallar las tcnicas de deteccin
del OVGM en el ambiente: Mtodos
moleculares y Mtodos biolgicos:
Efectos sobre la salud humana: posibles efectos txicos o alergnicos del OVGM,
sus materiales derivados, sus productos
metablicos, los productos resultantes del
procesamiento industrial habitual (incluyendo pero no limitado a alimentos), o los resultantes de interacciones de estos productos
con otros componentes normales de la dieta humana. Efecto de la modificacin
gentica sobre aquellas caractersticas del
organismo no GM que constituyan un peligro o riesgo para la salud (incluyendo, pero
no limitados a, los niveles de antinutrientes).
Interacciones del OVGM con el ambiente: supervivencia en el ambiente, tasa de
germinacin y dormicin, vigor vegetativo
(calidad agronmica, susceptibilidad a
patgenos, a insectos, a factores de estrs
ambiental), ventajas adaptativas presentes
o potenciales del OVGM frente al organismo
no GM, en hbitats y condiciones naturales,
y en condiciones de agroecosistemas para la
misma especie y para otros cultivos
geogrficamente compatibles. Los modos y
tasas de multiplicacin y las formas naturales
de propagacin. Informacin cuantitativa
sobre interacciones: susceptibilidad a
patgenos, plagas e insectos y rendimiento.
Impacto ambiental del OVGM en el
agroecosistema: efectos del OVGM sobre la
flora, fauna y poblacin microbiana, con nfasis en las especies benficas. Efectos deri-
396
vados de cambios en las prcticas

agronmicas (si los hubiera). Conceptos para
el manejo de los efectos mencionados en los
puntos anteriores y condiciones especficas
para el manejo de efectos ambientales debidos al OVGM. Estudios realizados sobre el
escape de genes va polen.
C. Comportamiento esperado en la produccin del OVGM a escala comercial: esta
informacin se refiere especficamente al impacto ambiental, a informacin general sobre la inocuidad del OVGM o sus derivados
alimentarios y a su perfil composicional.
Impacto Ambiental: efectos sobre la

flora y fauna, manejo de efectos no deseados potenciales (p.ej., desarrollo de resistencia a Bt en insectos previamente sensibles),
programa de investigaciones de seguimiento propuesto, para monitorear posibles efectos sobre el ambiente en el largo plazo.
Efectos sobre la salud humana: conceptos y programa de investigaciones que se
realizaron para la evaluacin de la inocuidad
de las nuevas protenas expresadas en el
OVGM; evaluacin de la toxicidad, digestin
en jugo gstrico simulado, a diferentes pH:
velocidad, caracterizacin de los fragmentos
originados y su actividad biolgica. Toxicidad
aguda de las nuevas protenas en animales
de laboratorio; determinacin del nivel de
efecto adverso no observable (sigla del ingls
NOAEL), si es posible. Clculo de la ingesta
diaria aceptable (IDA), y su comparacin con
la ingesta habitual para humanos en dietas
normales. Evaluacin del potencial alergnico,
homologas de las secuencias de aminocidos
de las nuevas protenas con otras protenas
relevantes (toxinas, alrgenos, etc.). Composicin centesimal del OVGM, y comparacin
con el correspondiente organismo no GM,
en todos los tejidos de la planta; protenas y
composicin en aminocidos, lpidos y composicin de cidos grasos, carbohidratos y
otros componentes (cenizas, fibra, materia
seca, vitaminas, etc.).
Como se presenta en el esquema correspondiente, la evaluacin completa y detallada de la inocuidad y aptitud alimentaria de
los OVGMs es llevada a cabo por otra Comisin Evaluadora, que funciona en la rbita
del SENASA (Servicio Nacional de Calidad y
BURACHIK, Moiss
Sanidad Agroalimentaria). Las caractersticas

de esta etapa de evaluacin son similares a
las que lleva adelante CONABIA, y basa sus
conclusiones en toda la informacin presentada a CONABIA, ms otra serie de datos,
evidencias experimentales y estudios que
deben ser presentados especficamente en
relacin con los aspectos nutricionales y/o
toxicolgicos del OVGM en cuestin, de
acuerdo a los requisitos de la resolucin oficial.
En ambas instancias de evaluacin de
bioseguridad se aplica el enfoque comparativo desarrollado en el Captulo 1 y la conclusin a la que como mnimo, debe arribarse
para poder recomendar la autorizacin comercial, es:

El OGM es tan seguro como su contraparte no modificada, para el medio ambiente y la salud humana o animal.
8. Eventos con aprobacin para su
produccin o consumo en pases
Latinoamericanos
De acuerdo con el ultimo informe de
ISAAA (International Service for the
Acquisition of Agri-Biotech Applications,
2003), hay seis pases en la regin que han
aprobado cultivos transgnicos para su pro-
Tabla 2. Pases de Amrica Latina que han aprobado cultivos GM
Pas
Maz
Argentina
-Maz resistente a
-Soja tolerante al
lepidpteros (evento Bt herbicida glifosato
176)
-Maz tolerante al
herbicida glufosinato de
amonio
-Maz resistente a
lepidpteros (evento
MON 810)
-Maz resistente a
lepidpteros (evento Bt
11)
-Maz tolerante a glifosato (evento Nk603)
Soja
Algodn
Otros
-Algodn resistente
a lepidpteros
-Algodn tolerante
al herbicida glifosato
-Soja tolerante al
herbicida glifosato
Brasil*
-Algodn resistente
a lepidpteros
Colombia
Clavel azul
-Algodn tolerante al
herbicida glifosato
Honduras
-Maz resistente a
lepidpteros
Mxico**
-Maz resistente a
lepidpteros
-Soja tolerante al
herbicida glifosato
-Maz resistente a
coleptero
-Maz tolerante a
herbicidas
Uruguay
Papa resistente a
escarabajo de la
papa y virus Y
-Algodn tolerante (New leaf Y)
al herbicida glifosato Tomate de maduracin retrasada.
(TH)
Canola tolerante
-Algodn RLxTH
(evento combinado) a herbicidas
-Algodn resistente
a lepidpteros (RL)
-Maz resistente a
-Soja tolerante al
lepidpteros (MON 810) herbicida glifosato
*Siembra permitida durante la campaa 2003-2004

** maces aprobados para importacin en alimentos. Soja y algodn, siembras pre-comerciales.
397
duccin o para su importacin como alimentos.
www.oecd.org: Organizacin para el Desarrollo y la

Cooperacin Econmica
Lecturas /sitios recomendados
www.fda.gov: Agencia de Drogas y Alimentos de los

EEUU
BURACHIK, M. y TRAYNOR, P. 2002. Anlisis of a Nacional

Biosafety System: Regulatory Policies and Procedures in
Argentina. ISNAR Country report 63. www.isnar.cgiar.org
McLEAN, M.A.; MACKENZIE, D.J. and COLE, BA, 2001.
Policy Choices in the Development of National
Frameworks for Biosafety Regulation. Report for the
International Service for National Agricultural Research
(ISNAR), The Hague.
www.sagpya.gov.ar (ir a Biotecnologa , Conabia y
SENASA): resolucin 39/2003.
www.fao.org: Agencia para la Agricultura y la

Alimentacin de la Naciones Unidas
www.redbio.org: ir a Marco Regulatorio, para
informacin sobre bioseguridad en America Latina y el
Caribe
http://www.unep.ch/biosafety/: Programa ambiental de
las Naciones Unidas . Informacin sobre el Protocolo de
Bioseguridad y marcos regulatorios internacionales
www.senasa.gov.ar : resolucin 412/2002
www.cibiogem.gob.mx: sitio de la Comisin evaluadora

de bioseguridad de OGMs del gobierno de Mxico.
www.agbios.com: sitio canadiense con informacin

detallada sobre cultivos GM y seguridad
www.ica.gov.co: sitio del Instituto Colombiano

Agropecuario
www.ctnbio.gov.br: sitio de la Comisin de Bioseguridad

de Brasil
www.anbio.org.br: Asociacin Brasilera de Bioseguridad

www.usbiotechreg.nbii.gov: sitio con informacin
regultoria unificada de los EEUU
398
BURACHIK, Moiss
IX.-Captulo 3
Flujo gnico mediado por polen y su
posible impacto ambiental
Poverene, Mnica; Ureta, Soledad
El flujo de genes es un proceso biolgico
natural. Puede ocurrir flujo mediado por polen entre plantas de la misma especie o de
especies relacionadas y depende del modo
de polinizacin y la compatibilidad gentica
entre la planta receptora y la dadora de polen. Tambin puede ocurrir flujo gnico por
movimiento de semillas o de otras partes
vegetales hacia poblaciones sexualmente
compatibles. Los agricultores pueden adoptar prcticas de manejo para minimizar y controlar este flujo.
1. Flujo gnico y riesgo de escape de
transgenes al ambiente
El flujo gnico es el proceso de incorporacin de genes de una poblacin dentro de
otra. En plantas, donde el concepto de especie es frecuentemente puesto a prueba, el
intercambio de material gentico ocurre entre individuos formalmente considerados
una especie o entre especies relacionadas.
El flujo gnico tiene lugar a travs de la migracin de polen o semillas, dispersados por
viento, agua o la accin de animales y el hombre. En el contexto de la agricultura, el intercambio de genes entre plantas y poblaciones es un proceso bien conocido en todos
los cultivos mejorados por tcnicas tradicionales o mediante ADN recombinante y en
las plantas silvestres relacionadas con ellos.
El flujo gnico es un poderoso mecanismo
para prevenir la diversificacin de las poblaciones, pero tambin para permitir la difusin de mutaciones favorables (Rieseberg y
Burke, 2001).
La utilizacin de cultivos transgnicos
plantea la posibilidad de que el flujo de
transgenes hacia otras poblaciones (escape
al ambiente) represente un riesgo para los
ecosistemas, dependiendo de las caractersticas que aporten y sus efectos sobre la poblacin receptora. Se denomina escape a la
diseminacin no intencional de la construccin gentica de un OGM (plantas,

microorganismos o animales) hacia otras
poblaciones, mediante mecanismos biolgicos naturales como la reproduccin sexual o
la transferencia horizontal. La reproduccin
sexual implica la unin de gametos femeninos y masculinos, uno de los cuales debera
ser portador del transgen. La transferencia
gnica horizontal o lateral consiste en el intercambio de material gentico entre especies no relacionadas e involucra fenmenos
diferentes. Estos procesos son bien conocidos en microorganismos, mediados por diferentes sistemas moleculares de insercin
(Kurland y col., 2003). En el caso de las plantas, el escape gnico a travs del polen es el
mecanismo ms probable y de all que la atencin se enfocar sobre este aspecto.
El flujo de genes desde cultivos GM hacia
cultivos no transgnicos, la aparicin de nuevas malezas difciles de erradicar y la reduccin de la biodiversidad son las inquietudes
ms frecuentemente invocadas del escape de
transgenes. Excepto el primero, no se han
informado casos concretos donde las otras
dos situaciones se hayan observado.
La literatura sobre los riesgos del escape
es especulativa y los estudios cientficamente documentados hasta el momento confirman la imposibilidad de extraer conclusiones
generales y la necesidad de efectuar pruebas
para cada caso particular (Carpenter y col.,
2002; Conner y col, 2003), tal como lo recomiendan las principales agencias regulatorias
del mundo. Estas exigen ensayos experimentales con todos los eventos en desarrollo y
generalmente, la informacin obtenida a
partir de los mismos as como las conclusiones de los comits evaluadores se pueden
consultar en Internet (ver lista de sitios recomendados).
Las construcciones genticas en las variedades GM son caracterizadas a nivel
molecular y en cuanto a sus efectos
fenotpicos antes de su liberacin (ver captulos 1 y 2 de esta Seccin). El nmero de
insertos y de copias es conocido y la transmisin de los caracteres introducidos se estudia para evaluar su comportamiento y estabilidad. En algunos casos de transgnesis
la transmisin puede ser variable. El cultivar de zapallo Freedom II posee tres insertos
399
de un transgen que confiere resistencia a virus y su descendencia puede heredar una, dos
o las tres copias del gen (Spencer y Snow,
2001). Normalmente, el carcter conferido se
expresa como dominante y aun cuando no
se conozca exactamente el nmero de copias de un transgen en un genoma, la probabilidad de transmisin a travs del polen
mediante el proceso normal de meiosis, es
de al menos 50%. En especies algamas o
parcialmente algamas, la difusin del
transgen hacia variedades no transgnicas
de la misma especie depender exclusivamente de los mecanismos de polinizacin,
generalmente por el viento (anemfila) o
los insectos (entomfila).
En la mayor parte de los cultivos se conocen las distancias mnimas de aislamiento necesarias para prevenir la polinizacin
cruzada entre variedades. Estas constituyen
la base para determinar las medidas de
bioseguridad que se exigirn en cada caso
durante la fase de liberacin experimental.
Una vez aprobado el cultivo para su siembra
a escala comercial, esas distancias no son
necesariamente aplicadas en la prctica
agronmica. La cuestin queda en manos de
los agricultores y depende de los intereses
econmicos que para ellos represente la
comercializacin de un cultivo transgnico,
tradicional u orgnico. Un ejemplo de conflicto se dio en 1998 en Canad, donde se
registraron denuncias de contaminacin de
lotes de colza tradicional con polen de colza
GM, posiblemente provenientes de lotes cercanos o de plantas subespontneas, escapadas de los cultivos (http://news.bbc.co.uk/
go/pr/fr/-/2/hi/science/nature/
3116713.stm).
En lugares donde se ha autorizado la
siembra de cultivos transgnicos, stos
pueden coexistir con cultivos tradicionales
u orgnicos, lo que requiere medidas adecuadas durante el cultivo, cosecha, transporte y almacenamiento, a fin de evitar la
mezcla accidental de materiales GM y no
GM, que puede tener consecuencias econmicas para productores que comercialicen productos no transgnicos. Las recomendaciones tendientes a evitarla consisten
en: 1. Medidas a tomar dentro del establecimiento, como respetar las distancias de aislamiento, colocar barreras a la dispersin del
polen, o intercalar lotes con cultivo de una
400
especie distinta. 2. Cooperacin entre establecimientos vecinos sobre planes de siembra, o uso de variedades con tiempo de floracin diferente. 3. Utilizar los servicios de
extensin para informar a los productores,
monitoreo, intercambio de informacin tcnica y servicios de alarma.
La modificacin gentica en plantas ha
sido exitosa en ms de 20 familias botnicas
diferentes, comprendiendo cereales,
oleaginosas, forrajeras, especies hortcolas,
frutales, forestales y ornamentales
(www.agbios.com). La mayor parte de las
especies domesticadas como cultivos posee parientes silvestres, los que frecuentemente se utilizan como donantes de caracteres tiles para el mejoramiento
gentico, tales como resistencia a estreses
biticos y abiticos. Esto implica que entre la
especie domesticada y la silvestre existe suficiente relacin gentica como para transferir
esos caracteres mediante cruzamientos y seleccin. Los cruzamientos ocurren naturalmente en regiones donde las especies conviven y muchas malezas han evolucionado a
travs de la adquisicin de genes de los cultivos (Keeler, 1989; Ellstrand y col., 1999). Es
posible que un transgen sea transferido de
un cultivo GM hacia poblaciones silvestres
o malezas relacionadas. Los transgenes que
confieren tolerancia a herbicidas, resistencia
a insectos o a patgenos podran conferir las
mismas caractersticas a plantas silvestres relacionadas en la vecindad, determinando una
mayor supervivencia bajo la presin de seleccin natural (insectos herbvoros o
patgenos) o de prcticas agronmicas usuales para el control de malezas, plagas o enfermedades (uso de pesticidas, agentes de
control biolgico). En consecuencia, aumentara el nmero o tamao de las poblaciones
silvestres. El concepto de supermaleza ha
surgido como consecuencia de reconocer la
dificultad que implicara el control de esas
poblaciones. El potencial impacto ambiental depende tanto de la probabilidad de
transferencia del transgen a la poblacin
silvestre como de la consecuencia de esa
transferencia (Ahl Goy y Duesing, 1996).
Segn la probabilidad de transferencia, los
cultivos pueden clasificarse en tres grupos:
I. Mnima probabilidad de transferencia a
especies silvestres, sea porque stas no exis-
POVERENE, Mnica; URETA, Soledad
ten en el rea o no hay compatibilidad sexual

entre el cultivo y su pariente silvestre. II. Cultivos con baja probabilidad de transferencia, cuando la compatibilidad sexual es limitada. III. Cultivos con alta probabilidad de
transferencia, cuando especies silvestres
sexualmente compatibles crecen en la vecindad del rea sembrada.
Las consecuencias de la transferencia
dependen de la capacidad potencial del
transgen para aumentar la aptitud biolgica y conferir ventajas selectivas a la especie silvestre receptora. De acuerdo con
este criterio, tambin se pueden agrupar los
genes en diferentes clases. En la clase I se
sitan los transgenes que confieren pequea o ninguna ventaja adaptativa, como los
marcadores de seleccin, genes de
androesterilidad o de madurez retrasada. La
clase II, de escasa ventaja adaptativa, comprende genes que pueden conferir alguna
ventaja bajo la adecuada presin de seleccin, como los de tolerancia a herbicidas o
de resistencia a insectos y enfermedades. En
la clase III se sitan genes para mejorar el
crecimiento y la supervivencia, que conferiran ventajas adaptativas en cualquier
ambiente. La Tabla I presenta una clasificacin de los cultivos GM autorizados o bajo
ensayo en la Argentina, segn esos criterios.
La reduccin de la biodiversidad por causa del uso de cultivos GM es probablemente
la consecuencia ms difcil de visualizar. La
erosin o prdida de variabilidad gentica
atribuida al monocultivo o al uso de unas
pocas variedades que dominen el mercado
de semillas, no es privativa de los cultivos
GM y puede prevenirse mediante una adecuada planificacin de la agricultura regional. Por otra parte, algunas especies crecen
en
ambientes
especializados
o
geogrficamente limitados como raras especies silvestres o razas locales domesticadas
(landraces) constituyendo reservorios de diversidad gentica de potencial uso en el mejoramiento gentico. Cuando crecen en la
vecindad de cultivos a gran escala, existe la
posibilidad de cruzamientos naturales y flujo
gnico a travs del polen del cultivo hacia la
especie local. Esto puede resultar en una prdida de vigor y fertilidad en los descendientes depresin por alogamia o de identidad gentica por sucesivos ciclos de cruza-
miento con el cultivo, de manera que paulatinamente la especie local se va perdiendo

hasta la completa extincin. El proceso es
dependiente de la frecuencia de cruzamiento, la cual a su vez depende de la cantidad
relativa de individuos de cada especie. Nuevamente, el proceso puede evitarse mediante adecuadas medidas de conservacin
y manejo del cultivo.
Se puede concluir que la posibilidad de
escape de transgenes es de orden diferente segn la poblacin recipiente. Una variedad no GM de la misma especie ciertamente
adquirir el transgen si es expuesta al flujo
de polen del cultivo GM. Una rara variedad
local domesticada perder asimismo identidad por contacto gentico con el cultivo. En
Mxico se ha informado la deteccin de razas nativas de maz portadoras de transgenes
provenientes de variedades GM, cuyo cultivo est vedado (Quist y Chapela, 2001), lo
que ha generado controversias y estudios
cientficos adicionales. Algunos autores hacen
notar que las prcticas de cultivo de los pequeos productores de maces criollos en
Mxico tambin contribuyen al flujo gnico
entre hbridos, variedades mejoradas, GM y
los maces criollos, como parte de sus hbitos de seleccin y ensayo (Christou, 2002;
MartnezSoriano y col., 2002; CIMMYT
2003).
Cuando no existen barreras biolgicas
al flujo gnico, el escape depende exclusivamente de factores antrpicos y puede
ser prevenido mediante un manejo cuidadoso. La situacin no es tan simple si se
trata de una poblacin silvestre
emparentada, ya que depender de las relaciones genticas con el cultivo, que determinan la probabilidad de hibridacin. Se
requerir de una evaluacin de la probabilidad de escape y del impacto que el transgen
podra ocasionar en la poblacin silvestre.
2. Factores que determinan el escape de
transgenes y su impacto ambiental
La mayor parte de los cultivos actuales
est emparentada con una o ms especies
silvestres o malezas, con las que puede
hibridar y producir descendientes total o parcialmente frtiles. Trigo, arroz, avena, sorgo,
cebada, maz, soja, girasol, colza, man, po-
401
roto, caa de azcar, remolacha azucarera,

algodn, papa, zapallo, frutilla, rbano, zanahoria, vid, trboles y otras especies cultivadas son objeto de experimentacin
biotecnolgica. El flujo gnico a travs del
polen permite la transmisin de caracteres
heredables a parientes silvestres. Si esos
caracteres son beneficiosos para la supervivencia o la fertilidad, aumentarn la aptitud biolgica de las poblaciones recipientes. El intercambio gentico de los cultivos
con sus parientes silvestres es uno de los
mecanismos de origen de las malezas (Keeler,
1989; Ellstrand y col., 1999). Aproximadamente la mitad de los caracteres que determinan
invasividad estn controlados por genes nicos, de modo que existe la posibilidad de que
transgenes relacionados con la aptitud biolgica persistan y modifiquen poblaciones silvestres. Podra resultar que stas se vuelvan
ms abundantes en su hbitat o invadan
nuevos hbitat. Tambin podran tener efectos adicionales sobre poblaciones de insectos o patgenos.
La evaluacin del riesgo de escape de
transgenes comprende tres etapas:
1. Investigacin de barreras genticas o
geogrficas para el escape del transgen desde el cultivo hacia las poblaciones silvestres.
2. Investigacin del efecto del transgen
sobre la aptitud biolgica de las plantas silvestres.
3. Investigacin de las consecuencias
ecolgicas de la difusin del transgen en la
poblacin silvestre.
Hasta el momento existe escasa informacin sobre situaciones reales y no sera posible generalizar las conclusiones, ya que stas dependen del evento de transformacin,
la poblacin recipiente y las condiciones ambientales donde tiene lugar el escape. A continuacin se expondrn algunos factores a
tener en cuenta en ese esquema.
3. Barreras geogrficas y genticas entre
el cultivo y especies silvestres
Las especies silvestres suelen difundirse desde su centro natural de origen, pero
no siempre estn presentes en la misma
rea geogrfica del cultivo. Por ejemplo, la
soja (Glycine max) y su pariente silvestre G.
soja conviven naturalmente en China y
402
Corea, donde producen un hbrido interfrtil,

G. gracile, pero no en el resto del mundo. El
maz (Zea mays) hibrida con el teosinte (Z.
m. ssp. mexicana, Z. diploperennis, Z.
luxurians) presente en Mxico, aunque existe evidencia que muestra que el flujo gnico
entre hbridos de maz y teosinte va en la
direccin teosinte-hbrido y no en la direccin
opuesta (Evans y Kermicle, 2001).
En la Argentina, estas especies no conviven con parientes silvestres, mientras que
colza, arroz y girasol s lo hacen y pueden cruzarse con ellos. El primer paso consiste en
el estudio sistemtico de la flora local. An
cuando se encontraran especies silvestres
emparentadas, la hibridacin con la especie
cultivada depender de la afinidad gentica
que tengan entre ellas, la cual determina
desde completa fertilidad de los hbridos
hasta grados variables de esterilidad y an la
imposibilidad de cruzamiento. Para que la
cruza tenga lugar, ambos taxa deben florecer al mismo tiempo y el polen debe ser
capaz de germinar y efectuar la fecundacin. La descendencia suele tener una fertilidad menor que las especies parentales, pero
raramente es por completo estril. La fertilidad parcial de los hbridos permite la
introgresin, la incorporacin estable de
genes de una especie en otra mediante
sucesivas retrocruzas de sus descendientes con una o ambas especies parentales.
Caracteres morfolgicos y fenolgicos intermedios entre la especie cultivada y la silvestre constituyen un buen diagnstico de hibridacin e introgresin, pero el estudio de
marcadores
moleculares
resulta
invalorable. Este ha demostrado que la mayor parte de los cultivos hibrida con sus parientes silvestres y que los alelos de las especies domesticadas persisten durante generaciones en las poblaciones silvestres, an cuando no se adviertan cambios morfolgicos.
Este es el caso del girasol con sus parientes
silvestres Helianthus annuus ssp. annuus y
H. petiolaris en Norteamrica (Whitton y
col., 1997, Riesberg y col., 1999, Snow y col.,
2000). En la Argentina, donde ambas especies silvestres se han naturalizado, hemos
encontrado numerosas evidencias de hibridacin e introgresin con el cultivo en la
regin central del pas, tanto por caracteres morfolgicos y fenolgicos como por mar-
cadores moleculares, constatando adems la

fertilidad parcial de los hbridos mediante
estudios del polen y de la produccin de semillas (datos propios no publicados). En girasol se ha estudiado la transmisin a plantas
silvestres de un transgen Bt (ver Parte VIII)
para resistencia a lepidpteros (Show y col.,
2003) y uno de oxalato oxidasa, OxOx que
confiere resistencia al hongo Sclerotinia
(Burke y Rieseberg, 2003). En zapallo GM
(Cucurbita pepo) se estudi la transferencia
de la resistencia a dos virus, ZYMV y WMV2
(Spencer y Snow, 2001). El flujo gnico a travs del polen es una poderosa fuerza evolutiva y el impacto sobre las poblaciones
silvestres depende de su magnitud, as
como del efecto de los alelos transmitidos
sobre la poblacin recipiente.
La magnitud del flujo mediado por polen puede medirse a travs de la frecuencia de marcadores moleculares caractersticos del cultivo presentes en una poblacin silvestre o sus descendientes. Estos
han demostrado que la ubicacin de un gen
en el genoma tiene una importancia crucial
para su difusin mediante hibridacin. En
colza, un aloploide (AACC), la introgresin
de tolerancia a herbicidas y androesterilidad
hacia la especie diploide Brassica rapa (AA)
sera menos probable si los transgenes que
codifican esos rasgos estuvieran en el genoma
C, porque implicara una recombinacin
intergenmica. (Jorgensen et al. 1996). En
girasol (Helianthus annuus) donde ha ocurrido
una
extensa
remodelacin
cromosmica mediante inversiones y
translocaciones, la transferencia de un
transgen hacia la especie silvestre H.
petiolaris es improbable si este no est situado en las porciones colineares entre ambos genomas (Rieseberg y col., 1999).
La cuantificacin de la tasa de hibridacin e introgresin entre el cultivo y la especie silvestre mediante experimentos adecuados es previa a la investigacin de las
consecuencias gnicas y ecolgicas del escape del transgen, ya que si la tasa de hibridacin fuera despreciable, no cabra preocuparse por las consecuencias.
4. Efecto del transgen sobre la aptitud
biolgica de las plantas silvestres
Una vez comprobada la posibilidad de
hibridacin y la presencia de un transgen en
plantas silvestres, surge la pregunta: se es-
pera que el transgen incremente su frecuencia en las poblaciones silvestres? El destino

de un alelo en una poblacin depender de
su efecto sobre la aptitud biolgica de los
individuos que lo adquieren. Si no tiene efecto alguno en ese ambiente ecolgico, se trata de un alelo neutro y su destino depender del azar, o sea que su frecuencia en la poblacin estar sujeta a la deriva gnica y
persistir o eventualmente se perder. Si su
efecto es deletreo conducir a una depresin alogmica, con disminucin de la viabilidad y fertilidad de los hbridos. El efecto nuevamente depender de la magnitud del flujo gnico y cuanto mayor sea, mayor ser el
riesgo de extincin de la poblacin silvestre.
Si el alelo es beneficioso, el flujo gnico
acelerar su diseminacin en la poblacin
silvestre y la frecuencia allica aumentar
rpidamente, en forma proporcional al movimiento de polen desde el cultivo a la poblacin silvestre (Ellstrand y col., 1999).
La diseminacin de un transgen en la
poblacin silvestre requiere que los
hbridos cultivo/silvestre se reproduzcan
en condiciones naturales. Estudios previos
de hibridacin entre cultivos no transgnicos
de colza, sorgo, girasol, rbano, poroto y trigo y sus parientes silvestres han demostrado que no slo lo hacen sino que su aptitud
biolgica puede ser incluso mayor que la de
sus progenitores silvestres. En uno de los primeros estudios de transmisin de un
transgen a poblaciones silvestres, Scott y
Wilkinson (1998) encontraron una baja frecuencia de plantas hbridas de Brassica rapa
portadoras de un transgen de colza, considerado neutral y concluyeron que el riesgo
de transmisin era bajo. En tanto, Spencer y
Snow (2001) demostraron que los hbridos
entre calabaza GM y zapallo silvestre eran
suficientemente vigorosos como para permitir la rpida introgresin de transgenes neutrales y beneficiosos en las poblaciones silvestres. En girasol, un transgen beneficioso que
confiere resistencia a lepidpteros mediante
la produccin de la protena Bt Cry1Ac, aument considerablemente la fecundidad de
las plantas silvestres recipientes, aunque este
efecto vari entre localidades y aos (Show
y col., 2003). De acuerdo con estas observaciones, podra esperarse que el gen Bt aumente la aptitud biolgica de girasoles silvestres
403
e incremente rpidamente su frecuencia en

las poblaciones naturales, debido a que reduce el dao producido por varias especies
de insectos herbvoros. Sin embargo, el
transgen OxOx, que confiere resistencia al
hongo Sclerotinia, no aument significativamente la fecundidad de plantas de girasol
silvestre, sugiriendo que su diseminacin sera prcticamente neutral luego de un escape hacia poblaciones naturales (Burke y
Rieseberg, 2003). En Brassica rapa un
transgen Bt adquirido por cruzamiento con
colza transgnica disminuy su agresividad
como maleza en un 20% comparado con
B.rapa no GM (Adam, 2003). Estos son ejemplos contrastantes de los efectos de
transgenes sobre la aptitud y comportamiento ecolgico de poblaciones silvestres.
Cmo estimar los costos y beneficios de
un transgen para la aptitud biolgica de una
especie silvestre? La aptitud o valor
adaptativo es una medida relativa de la
eficacia reproductiva de un genotipo, cuando se lo compara con otro genotipo. En este
caso, los genotipos a comparar son el que
ha adquirido el transgen por hibridacin con
el cultivo y el que no lo ha adquirido, o sea el
genotipo silvestre de la poblacin en ausencia de flujo gnico del cultivo. Los componentes de la aptitud son la supervivencia y la fecundidad, que pueden resultar afectadas en
distintos momentos del ciclo vital. La medicin de la aptitud puede hacerse a travs
del porcentaje de germinacin, supervivencia de plntula, nmero de flores, produccin de semilla, peso de la semilla, etc. y en
cada caso de estudio ser necesario determinar cules parmetros reflejan mejor la supervivencia y la fertilidad de los individuos.
Los resultados obtenidos deberan indicar
la velocidad de diseminacin del transgen
y la probabilidad de que las poblaciones
que lo incorporen, adquieran ventajas
adaptativas.
En general, las poblaciones silvestres son
menos susceptibles a patgenos y plagas que
sus parientes cultivados. Mayor diversidad
genotpica, menor densidad de plantas y
ausencia de laboreo son algunas de las causas de esa diferencia. Por ello, un transgen
que confiera resistencia a una plaga o patgeno puede no representar para la especie
silvestre una ventaja tan grande como para
404
el cultivo. Por el contrario, puede representar un costo para la planta que lo adquiera
debido a efectos pleiotrpicos sobre otros
caracteres fenotpicos que a su vez afecten
la aptitud. El beneficio de un transgen asociado a la resistencia a determinada plaga
debe ser evaluado comparando la aptitud
biolgica de plantas con el transgen y sin l
que hayan sido expuestas a esa plaga. Por el
contrario, el costo de adquirir el transgen
debe ser medido comparando la aptitud biolgica de plantas que lo llevan o no, en ausencia de la plaga. Adems, los caracteres
que determinan supervivencia y fecundidad
pueden ser afectados por las condiciones
ambientales, por lo que es necesario
estimarlos en distintos ambientes y a lo largo de varias estaciones de crecimiento. Las
diferencias significativas entre plantas silvestres GM y no GM en cada sitio, entre sitios y
entre aos pueden ser probadas para cada
carcter relacionado con la aptitud mediante un anlisis de la varianza.
5. Consecuencias ecolgicas de la
difusin del transgen en la poblacin
silvestre
La teora de la seleccin natural predice
que un fenotipo cuya aptitud biolgica sea
superior a la de otros fenotipos de la poblacin, dejar mayor cantidad de descendientes y que si estos a su vez heredan el genotipo
favorecido, su frecuencia aumentar en detrimento de los dems genotipos. Sin embargo, el impacto ambiental depender no slo
de la frecuencia sino del cambio en las
interacciones biticas y abiticas de ese
genotipo silvestre en su ambiente. La prediccin de las consecuencias de un escape de
transgenes requiere del estudio de la alteracin de las interacciones ecolgicas existentes entre las especies. Un gen de resistencia
a insectos o a enfermedades modificar la
herbivora o la relacin husped-patgeno
entre la especie silvestre y otras especies de
su hbitat, as como un transgen que favorezca el crecimiento modificar las relaciones
de competencia intra e interespecficas.
Cuanto ms se conozca acerca de la dinmica poblacional de una especie, ms fcilmente se podr evaluar el impacto ambiental. En Cucurbita pepo, hbridos entre
un cultivar GM y plantas silvestres mostraron

amplias variaciones en fecundidad entre aos
y localidades, que fueron atribuidas a condiciones de suelo y clima, densidad de herbvoros, competencia con malezas, enfermedades y otros factores ambientales (Spencer y
Snow, 2001). El crecimiento poblacional a
travs de la produccin de semilla es uno
de los parmetros ms informativos y es
ms probable que sea limitante para especies anuales; por ello, caracteres que aumenten la produccin o germinacin de
semilla tienen un gran efecto ecolgico.
Asimismo, est relacionado con la dispersin,
la dinmica del banco de semillas y la longevidad de las poblaciones. Resultados preliminares en poblaciones experimentales de girasol silvestre sometidas a flujo gnico de un
cultivo GM (Bt) indicaron que el aumento de
la produccin de semilla determin mayor
nmero de plntulas, mayor supervivencia
hasta la edad reproductiva, mayor nmero
de inflorescencias con semilla y mayor rea
total de captulo al ao siguiente (Pilson y col.,
2002). El incremento en tamao y nmero
de las poblaciones silvestres de una especie
afectar a otras especies vegetales del
hbitat, cuya frecuencia relativa podra disminuir.
El escape de un transgen Bt de resistencia a insectos a una poblacin silvestre podra tener un impacto negativo en varias especies de herbvoros, algunas de las cuales
pueden ser especialistas, alimentndose con
exclusividad de la especie silvestre receptora.
Como parte de los estudios necesarios para
la evaluacin del impacto ambiental de eventos Bt, se incluyen estudios del impacto de
estos genes sobre especies no blanco (aquellas que no son las controladas
especficamente por esos genes) (Wolt y col.,
2003). Las toxinas Bt son altamente especficas para determinados tipos de herbvoros
(lepidpteros, colepteros, dpteros) y la disminucin de uno de ellos puede alterar las
relaciones de competencia con los dems. Las
relaciones ecolgicas entre herbvoros suelen
implicar un delicado equilibrio demogrfico
cuyo colapso podra contribuir a mayores niveles de infestacin y dao (Groot y Dicke,
2002).
El uso comercial de cultivos Bt ejerce una
presin selectiva que podra favorecer la seleccin de insectos resistentes a las toxinas,
que llevan una mutacin recesiva de resistencia en condicin homocigota. La descendencia podra heredar los genes de resistencia y
en unos pocos aos, la biotecnologa desarrollada para el control de insectos se volvera inefectiva. Para evitar esta situacin se ha
ideado la estrategia del cultivo refugio, que
consiste en sembrar una franja de variedad
no transgnica junto a la variedad Bt. Los
insectos se reproducen libremente en esa
franja, de modo que los raros portadores de
resistencia se mantendrn en una frecuencia
relativamente baja en la poblacin total de
insectos. La prdida de la eficacia Bt es actualmente una de las mayores preocupaciones ambientales en relacin con el uso de
biotecnologa agrcola aplicada al control de
insectos. Hasta el momento no se han detectado insectos resistentes en condiciones
de produccin a campo de cultivos Bt
(Shelton y col., 2002; Tabashnik y col., 2003).
Conclusiones
El estudio del impacto ambiental precede la liberacin de cualquier nuevo evento
de transformacin en plantas para tener resultados confiables en el ambiente de la liberacin. La mayor parte de los efectos no deseados del escape de un transgen pueden
evitarse mediante acciones adecuadas que
pueden planificarse anticipadamente (manejo del cultivo, bancos de germoplasma, cultivos refugio, etc.). Sin embargo, la difusin de
un transgen hacia poblaciones silvestres
emparentadas es difcil de evitar debido a que
el polen de los cultivos puede alcanzar grandes distancias. En las prximas dcadas, los
cultivos GM se utilizarn en gran escala, por
lo que ser necesario evaluar cuidadosamente el riesgo de escape de transgenes para
cada uno de ellos. Esa evaluacin, realizada
por equipos multidisciplinarios, debe considerar los siguientes aspectos: a) Presencia de
especies silvestres sexualmente compatibles
con el cultivo y la probabilidad de que el
transgen difunda en ellas. b) Cambios en las
caractersticas de poblaciones de patgenos,
insectos y malezas relacionadas con el cultivo GM y medidas para evitar o retardar la
aparicin de biotipos resistentes. c) Cambios
405
Tabla I. Clasificacin de las especies GM en Argentina segn la probabilidad de transferencia del transgen (Grupo
1,2,3) y las consecuencias biolgicas de la modificacin gentica( Clase 1,2,3).
406
en la dinmica de poblaciones de otras especies vegetales y animales que comparten

el hbitat (polinizadores, parsitos y
predadores, microflora y fauna del suelo).
Esos estudios tambin tienen en cuenta el
fondo gentico y las condiciones ambientales para cada caso en particular (Burachik y
Traynor 2002, Ver Captulos 1 y 2 de esta seccin).
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www.sagpya.gov.ar: CONABIA en Secretara de
Agricultura, Ganadera, Pesca y Alimentos.
IX-Captulo 4
Deteccin de OGM en la cadena
alimentaria
Tozzini, Alejandro C.
Una gran cantidad de plantas
genticamente modificadas (GM) han sido
aprobadas para su cultivo en el mbito mundial luego de haber pasado por rigurosos controles de seguridad alimentaria y ambiental.
Sin embargo, algunos mercados, en particular la Unin Europea, tienen estrictos requerimientos para su etiquetado. En este caso,
la normativa de etiquetado que rige a partir
de abril de 2004, establece el etiquetado
obligatorio de los alimentos y piensos derivados de un OGM, independientemente de
la detectabilidad de ADN o protenas, y slo
admite la presencia adventicia (accidental) de
hasta un 0.9% de OGM aprobados o de 0,5%
en el caso de eventos, an no aprobados
pero con un dictamen de bioseguridad favorable.
La Argentina es uno de los pases con
mayor adopcin de OGM, segundo despus
de los EE.UU. y antes que Canad. El aprovechamiento a campo de los beneficios de la
biotecnologa vegetal implic inmediatamente la necesidad de implementar procedimientos de campo y laboratorio para poder discriminar mercaderas conteniendo un nivel de
OGM superior a un determinado umbral, de
aquellas que estaban por debajo. A partir del
ao 1997 los exportadores comienzan a demandar el anlisis de partidas de granos destinados a la Comunidad Europea. En ese
momento el contenido aceptable era inferior al 1%, los protocolos de deteccin requeran de la germinacin de los granos (para
extraer ADN de las hojas) y en algunos casos
hasta el uso de sondas radioactivas. Desde
entonces, se ha avanzado sensiblemente en
una serie de aspectos que han hecho evolucionar el panorama, tanto en el pas como
en el mundo:
- Se han desarrollado protocolos de
purificacin de ADN y de PCR para aplicar
a gran escala.
- Los mtodos de PCR han evoluciona-
do hacia tcnicas cuantitativas (PCR en

Tiempo Real)
- Se han desarrollado tcnicas
inmunolgicas y kits especficos de fcil
aplicacin.
- Hay ms informacin molecular sobre
los eventos y los primers especficos correspondientes.
- Los operadores de mercado se han
familiarizado con el concepto de OGM.
- Se han desarrollado y aplicado programas de Trazabilidad e Identidad Preservada para la caracterstica genticamente
modificado.
- Se discuten protocolos y materiales
de referencia a nivel de normas de CODEX
Alimentarius, ISO (International Standards
Organization) e ISTA (International Seed
Testing Asociation) entre otras.
- En el pas se ha desarrollado una logstica de segregacin de granos y semillas capaz de abastecer con distintos productos, los requerimientos especficos de
mercados de exportacin, o del nacional,
en aquellos casos en los que la demanda
est dispuesta a cubrir los costos derivados de la segregacin.
A grandes rasgos, una planta genticamente modificada es aquella a cuyo genoma
se han incorporado uno o ms transgenes
mediante alguna de las tcnicas de ingeniera gentica. Estos transgenes poseen una
secuencia nucleotdica especfica y algunos de
ellos se expresan generando una protena
nueva en el organismo, lo cual le va a conferir un nuevo fenotipo a la planta. En cualquiera de estos tres niveles, ADN, protenas o fenotpico, es posible hacer un anlisis para determinar cualitativa o
cuantitativamente la presencia de una
modificacin gentica. La deteccin a nivel
de ADN se realiza mediante amplificacin
por PCR, a nivel de protenas por tcnicas
inmunolgicas (tiras reactivas o ELISA), mientras que la fenotpica implica la evaluacin
de la nueva caracterstica producida por el
transgen. Desde el punto de vista de los requerimientos tcnicos, el anlisis fenotpico
puede ser el ms sencillo, mientras que el anlisis por PCR es en general, el ms complejo.
Los protocolos analticos son muy sensi-
409
bles ya que detectan un gen en decenas de

miles de genes del genoma, o una nueva protena entre varios miles de protenas. A esto
hay que sumarle la dilucin no OGM /
OGM, que en muchos casos requiere detectar y cuantificar un grano GM entre varios
miles.
Actualmente, los protocolos pueden detectar un evento o grupo de eventos en un
cultivo en particular pero ninguno puede hoy
detectar en un nico ensayo todos los eventos, por eso no se puede asegurar que una
muestra est libre de OGM; slo se puede
asegurar que est libre de los eventos para
los cuales se hayan realizado los anlisis pertinentes.
Figura 1: mezcla de semillas de maz no GM y GM (evento

GA 21, Monsanto) puestas a germinar con agua (superior)
y con solucin de glifosato (inferior). (gentileza de Ing.
Agr. Silvia Passalacqua y Mnica Abal. Lab. del SENASA)
Deteccin fenotpica
En referencia a los mtodos de deteccin
fenotpica, nos concentraremos en el
fenotipo como resultado de algn proceso metablico de la planta (y no restringirnos
a una definicin de fenotipo que implique la
medicin de alguna protena). Las plantas
genticamente modificadas (PGM) que se
encuentran actualmente a campo presentan
la caracterstica de resistencia a herbicida y/o
a insectos. La evaluacin de la resistencia a
insectos de una planta se realiza mediante
ensayos biolgicos complejos y de larga
duracin, por eso sta no es una alternativa
prctica parael anlisis de granos. Sin embargo, la resistencia a herbicidas s puede ser
evaluada mediante ensayos sencillos en laboratorio y a campo. Las semillas o granos
pueden ser puestos a germinar en presencia
del herbicida (para soja, 0.5 ml glifosato 48%
en 1 litro de agua; Monsanto America Latina. 2001), y slo germinarn aquellos individuos portadores del gen de resistencia (Fig.
1).
La cantidad de semillas GM puede ser
estimada en la muestra mediante un clculo sencillo: semillas RR = semillas germinadas con glifosato/semillas germinadas
con agua.
Una vez que un lote ha sido sembrado y
mientras el cultivo se encuentre en una etapa en la que es susceptible al herbicida, se
pueden hacer aplicaciones de herbicida en
pequeas parcelas representativas (Fig. 2)
para luego hacer el recuento de plantas so-
410
brevivientes sobre total de plantas tratadas.

Si los individuos GM y no GM tienen el mismo rendimiento entonces, los granos que
se cosechen en ese lote tendrn una proporcin de GM/ no GM igual al porcentaje
de plantas sobrevivientes.
Estas alternativas de evaluacin son usadas en soja por los propios productores que
abastecen a parte de la industria nacional
productora de jugos y alimentos a base de
soja. La industria, por su parte, controla esta
materia prima mediante el uso de tests
inmunolgicos a la entrada de la planta procesadora. Generalmente de un conjunto de
lotes as controlados se toma una muestra
que se enva a un laboratorio para realizar
un anlisis por PCR para as tener un lmite
de deteccin menor y una cuantificacin del
contenido de GM, lo que adems les permite obtener un certificado de una tercera parte (laboratorio independiente) para el control de procesos de produccin.
Deteccin inmunolgica o por PCR?
La eleccin del mtodo de deteccin depende de varios factores, uno de ellos es el
producto que se va a analizar: la matriz (granos, harina, galletita, sopa, etc). En el caso
de grano y los primeros productos de molienda de stos, tanto la protena como el
ADN conservan sus propiedades fsicoqumicas intactas, por lo tanto ambos mtodos pueden aplicarse. Sin embargo, a medida que la materia prima es elaborada ha-
TOZZINI, Alejandro C.
Procedimientos inmunolgicos
Bsicamente dos son los formatos que
toman los ensayos inmunolgicos para la
deteccin de OGM: las tiras reactivas (o
strips de flujo lateral) o ELISA (ensayo de
inmunodeteccin ligado a enzimas).
Flujo lateral o lateral flow
Figura 2: representacin esquemtica de la aplicacin
de herbicida en parcelas representativas en un lote de
soja para determinar y cuantificar la presencia de
individuos GM con resistencia al herbicida.
cia alimentos terminados, los distintos tratamientos a que son sometidos los componentes, hacen que se vayan degradando el ADN
y las protenas. Especialmente estas ltimas
pierden su estructura disminuyendo rpidamente sus propiedades inmunolgicas, por
lo tanto no es apropiado aplicar mtodos
inmunolgicos a alimentos con alto grado
de procesamiento.
El ADN, por su parte, se corta en fragmentos pequeos, hasta que la mayora
tiene un largo menor al segmento a amplificar y por lo tanto ya no resulta amplificable. A esto hay que sumarle las modificaciones qumicas de las bases del ADN que
hacen que pierdan su capacidad de servir
como templado en el proceso de copia in
vitro que ocurre durante la PCR (Fig. 3), por
eso en determinadas ocasiones la presencia
de OGM en las materias primas usadas deja
de ser detectable en el producto final. Algo
similar ocurre con aquellas materias primas
usadas como sustrato de procesos
fermentativos, como la fabricacin de cerveza, al final del cual la mayora de las molculas han sido digeridas y resintetizadas.
Junto con esto cabe acotar que los costos de extraccin/purificacin del ADN son
mayores a partir de matrices elaboradas y/o
complejas.
Otro de los factores que atenta contra
las posibilidades de deteccin es el grado de
purificacin del producto: en productos
como los aceites, la lecitina o la glucosa no
queda una cantidad suficiente de ADN como
para ser purificado y amplificado.
En este formato se renen todos los

reactivos en un soporte slido y mediante
el flujo por capilaridad de la muestra en solucin se logra determinar la presencia o au-
Figura 3: Representacin esquemtica de la degradacin

de las propiedades fisico-qumicas de las protenas y del
DNA con el grado de procesamiento de la materia prima
hasta el alimento terminado. De alli la eleccin de la
tcnica adeacuada para detectar OGMs segn la matriz a
analizar.
sencia de una determinada protena (anlisis cualitativo). Este formato ha sido

exitosamente aplicado para la deteccin de
un sinnmero de molculas de importancia
en el diagnstico veterinario y humano,
como es el caso de los tests rpidos de embarazo. Para el ensayo debe molerse una
cantidad determinada de granos y una alcuota de esta harina mezclarse con un buffer (provisto con el kit) o agua, para generar una solucin que incluya la protena de
inters. La tira posee en la parte inferior un
fieltro que sirve para absorber la solucin
con las protenas y filtrar las partculas que
se hallan en suspensin (Fig. 4). Al mismo
tiempo, en el otro extremo se encuentra un
material absorbente que recibe el flujo que
asciende por capilaridad. El lquido en su
ascenso, pasa primero por una zona en donde se halla un anticuerpo monoclonal (Atb)
contra la protena a detectar, conjugado con
una molcula coloreada (con oro o ltex). Si
la protena est presente en la muestra, en
esta zona se producir el reconocimiento
411
por el Atb y ambos seguirn migrando juntos. La segunda zona es la de pegado o

lnea de resultado. En sta se halla inmovilizado un segundo anticuerpo monoclonal
contra la protena en cuestin, de forma que
cuando sta llega a esa zona, queda retenida y concentrada en una lnea delgada, y al
traer consigo al conjugado coloreado, la regin comienza a ser visible.
Finalmente, hay una tercera zona llamada de control, en la cual un segundo anticuerpo contra el anticuerpo conjugado est
inmovilizado y retiene al conjugado que no
haya quedado retenido en la lnea de resultado, generando tambin una lnea visible en esa zona. Esto indica que se produjo
el flujo ascendente de lquido y que el anticuerpo conjugado se halla en buenas condiciones. La aparicin de esta lnea avala los
resultados negativos, al indicar que la falta de color en la linea de resultado no se
debe a una falla del kit. Cuando el resultado es positivo (visualizacin de color en la
zona de resultado) no es necesario que aparezca la banda de control. En la prctica, la
banda de control presenta menor intensidad
en las muestras positivas que en las negativas debido a que el conjugado que llega a
esta zona es slo aquel que no se adhiri a
la protena y no qued retenido en la lnea
de resultado (ver foto en Fig. 4). En casos
excepcionales todo el conjugado queda retenido en la lnea de resultado quedando sin
color la banda de control.
Para realizar el ensayo a partir de granos
es necesario moler los mismos y resuspender
en un buffer una muestra representativa de
la harina obtenida. En esta suspensin se
introduce la parte inferior de la tira y se espera de 10 a 20 minutos el desarrollo de color. El resultado es cualitativo (positivo o
negativo) y la sensibilidad (o lmite de deteccin) oscila entre el 0.5 y 2% para los
eventos Bt11 y Mon810 en maz (eventos
protegidos de insectos con el gen cry1Ab de
B.thuringiensis) y de 0.1-0.3% para soja RR
(evento GTS 40-3-2, tolerante a glifosato, con
el gen para la enzima CP4EPSPS). Como se
mencion, el ensayo es cualitativo, pero a
partir de los resultados se pueden hacer clculos estadsticos para determinar la probabilidad de que la muestra tenga un contenido de granos GM inferior a un determinado
412
valor para un dado nivel de confianza. Para

esto, es imprescindible conocer la sensibilidad del strip expresada en granos GM/
granos no GM, y trabajar con submuestras
que no excedan este nmero para evitar resultados falsos negativos. Por ejemplo, la
sensibilidad de deteccin de la protena CP4
EPSPS es de 1 grano GM en 1000 no GM,
por lo tanto el nmero mximo de granos
a incluir en cada submuestra es de 1000.
Entonces, para una submuestra de 1.000 granos de resultado negativo y aceptando un
nivel de confianza de 95% (i.e. la probabilidad de resultado negativo del anlisis es de
5%), la frecuencia de no GM (probabilidad
de no GM) ser la raz unmilsima de 0.05;
esto es 0.997 y por lo tanto el contenido
mximo de GM esperado es de 0.003 (0.3%).
Si de la misma muestra se analizan dos
submuestras de 1.000 granos y ambas resultan negativas, el clculo ahora involucra la raz
dosmilsima de 0.05, lo que determina un
contenido mximo de GM de 0.0015 (0.15%).
Realizando el anlisis de submuestras, la sensibilidad de anlisis de una muestra se puede
mejorar combinando estadsticamente los resultados de cada una de ellas. Los manuales
de los distintos kits incluyen tablas de clculo
que estn basadas en estos conceptos.
En general, los strips reactivos tienen
una versin optimizada para la deteccin
a partir de tejido vegetal para poder realizar el anlisis en los perodos en que el cultivo an no presenta granos. La mayor ventaja de realizar el anlisis en granos es la facilidad para muestrear cientos de individuos y
combinarlos en una misma muestra; esto es
mucho ms difcil de lograr a partir de la recoleccin de hoja. Por otro lado, algunos
eventos (ej, maiz Bt 176, de Syngenta) tienen niveles de expresin de las protenas
transgnicas altos en hojas y prcticamente
nulos en granos, por lo tanto en estos casos
resulta ventajoso el anlsis de hojas y desaconsejado el de granos. Como se observa
en la Figura 5 los eventos Bt11 y MON810
pueden ser detectados hasta en una concentracin de 0.5%, mientras que el evento 176
no se detecta, an en una concentracin de
10%. Resultados similares se obtienen con los
strips provistos por Envirologix o por
Strategic Diagnostic Inc (A. Tozzini, datos no
publicados). Otros datos de perfomance de
Figura 4: Esquema de las partes de un strip reactivo (ver

texto) y foto de dos strips para la deteccin de la protena
CP4 EPSPS (resistencia a glifosato) mostrando un
resultado negativo (izq.) y otro positivo (der). (Gentileza
de Mnica Porcio, Agricheck Argentina, representante
de Strategic Diagnostic Inc. www.sdix.com )
Figura 16: Lectura de un microchip luego de la

hibridacin con DNA marcado. Suponiendo que se tratara
de un micro-array para identificar GMO, los puntos
fluorescentes representaran secuencias pertenecientes
a GM presentes en la muestra. En primer plano se muestra
una ampliacin de uno de los 16 campos que conforman
el micro-array.
reactivos inmunolgicos en formato de strips

o de ELISA para distintos eventos y proveedores puede verse en http://
www.usda.gov/gipsa/techservsup.
Obviamente la gran ventaja de esta metodologa de anlisis radica en su simplicidad y rapidez, por eso se la utiliza a
campo como control inicial
en la conformacin de conjuntos que luego sern analizados por algn mtodo cuantitativo, o como primer control
a la entrada de un proceso o
industria.
ELISA
(enzyme-linked
immunosorbant assay)
Figura 5: Ensayo de lmite de deteccin de granos de maz Bt utilizando
el Quickstick TM de Envirologix (www.envirologix.com). Los porcentajes
expresan granos de un evento/granos no GM. Entre parntesis figura el
tiempo en minutos transcurridos desde el inicio del ensayo y en el cual
se iniciaron las lecturas de los resultados. No hubo cambios en una
lectura posterior a los 20 min. (A. Tozzini, Instituto de Biotecnologa
INTA)
En este caso, el anlisis

inmunolgico se resuelve sobre
el soporte slido de placas de
poliestireno en el formato de
96 pocillos o de tiras de 8 o 12
pocillos. Estos pocillos estn
recubiertos con el anticuerpo de
413
captura, en los cuales se agrega la

solucin con la muestra (preparaPrimers (en exceso)
Separada de las hebras (95C) y
cin similar a la anterior). Si la propegado de los primers (60C)
tena en cuestin (antgeno) est
presente, sta queda capturada
en el pocillo por los anticuerpos.
Primers complementarios a la secuencia genmica
CICLO 1
Finalizado el perodo de incubacin con la muestra sta se vuelExtensin de los primers (72C) por
la Taq polimerasa
ca del pocillo y se realizan lavados
con buffer para retirar las molcuNuevas cadenas de DNA sintetizada a partir de los
las que no hayan sido capturadas.
primers y sobre las hebras genmicas
Luego se coloca un segundo anticuerpo que se unir a la protena
Separado de las hebras, pegado de
los primers y extensin
capturada por el anticuerpo anteCICLO 2
rior, y que est conjugado con una
Nuevas cadenas de DNA sintetizada sobre DNA
enzima que transformar el
sinttico (tamao del fragmento a detectar)
cromgeno (ver ms adelante).
Finalizada la incubacin con el
Separado de las hebras, pegado de
los primers y extensin
conjugado, se lava con buffer para
retirar todo el conjugado libre (no
CICLO 3
DNA doble cadena del tamao esperado (amplicn)
unido al antgeno). El ltimo
reactivo que se agrega es una solucin conteniendo un cromDuplicacin de la cantidad de amplicn
geno, una sustancia incolora que
por cada ciclo de amplificacin
es modificada por la enzima del
CICLO 30
conjugado en un compuesto co1.000.000.000 copias de amplicn
loreado y que revela, por lo tanto, la presencia del antgeno en la
Figura 6: Esquema del proceso de PCR (Polimerase Chain Reaction). muestra. La intensidad de color
Amplificacin de un fragmento especfico de DNA mediante un proceso generada en un pocillo determide sntesis in vitro.
nado en un tiempo dado es medible en un espectrofotmetro
DNA genmico
Figura 14: Desarrollo de la amplificacin en una PCR en Tiempo Real para distintas muestras (incluyendo la curva de
calibracin, el control sin DNA (lnea horizontal marrn) y el control negativo (inicia fase exponencial en ciclo 39.
414
para placa de ELISA y es proporcional a la

cantidad de antgeno inicial.
Por lo tanto, esta lectura puede transformarse (con una curva de calibracin apropiada) en una estimacin cuantitativa del contenido del OGM en la muestra. La sensibilidad de estos anlisis se encuentra entre el
0.3 y 1%, y requiere de un laboratorio de
complejidad baja a media y personal calificado. El resultado se obtiene en 3 a 4 horas
(sin contar la molienda de la muestra). Como
en el caso de las tiras, tambin son varias las
empresas que ofrecen anticuerpos y placas
para realizar este tipo de ensayo (ver http:/
/www.usda.gov/gipsa/tech-servsup). Este
ensayo es adecuado para asistir un proceso de segregacin de granos, para aquellos
eventos que tengan una buena expresin de
la protena transgnica en granos y en casos
que se necesite hacer un anlisis cuantitativo
sencillo.
Para un determinado tipo de protena,
por ejemplo la de Bacillus thuringiensis Bt
Cry1A, la secuencia de aminocidos codificada es la misma (o muy similar) en las distintas construcciones utilizadas para generar los
distintos eventos de transformacin, an
cuando sus secuencias nucleotdicas sean muy
distintas. Por eso, el mismo anticuerpo puede ser usado para detectar distintas construcciones presentes en los distintos eventos (los maces tolerantes a lepidpteros
MON 810, Bt11 y Bt176, tienen Bt Cry1A).
En algunos casos no es posible generar
un anticuerpo para detectar la protena introducida debido a que es muy similar a protenas propias de la planta original y por lo
tanto no es posible generar un anticuerpo
que detecte a la protena introducida sin
detectar tambin la ya presente en la planta
(reaccin cruzada). Este es el caso de la protena que determina la resistencia a glifosato
introducida en el evento GA21, en el cual la
protena modificada (mEPSPS, la enzima tolerante al herbicida) presenta slo dos
aminocidos de diferencia en 450, con respecto a la EPSPS nativa de maz, la cual es
sensible al glifosato.
ADN; sin embargo, los servicios de deteccin

de secuencias transgnicas utilizan casi exclusivamente PCR. El transgen es uno ms entre las decenas de miles de genes originales de la planta. Adems, en la prctica, se
requiere de la capacidad de poder detectar
un grano GM entre 1.000 o 10.000 granos
no GM, y la PCR ha demostrado tener la sensibilidad suficiente como para cumplir este
cometido. Sin embargo, la mayor dificultad
de un anlisis dirigido a detectar niveles mnimos de OGM no radica en las tcnicas analticas sino en la posibilidad de hacer un
muestreo representativo en la prctica, acorde a los niveles a detectar. Las muestras de
granos (de al menos 15.000 granos para
detecciones de 0.1%) deben ser molidas y
reducidas en su granulometra para tomar
una muestra de harina menor a un miligramo
y de all, purificar su ADN.
La reaccin en cadena de la polimerasa
es una sntesis in vitro de ADN, mediada por
una ADN polimerasa ADN-dependiente a
partir de un cebador o primer (segmento de
ADN simple cadena de 18 a 25 nucleotidos).
Un par de primers son utilizados para determinar la especificidad y el tamao del fragmento a amplificar. Una ADN polimerasa
termo-rresistente proveniente de Termophilus aquaticus, Taq polimerasa, es la enzima encargada de la replicacin del ADN
bajo un programa de ciclos repetidos que
alterna normalmente tres temperaturas: una
temperatura de desnaturalizacin (9495C) en la cual el ADN doble cadena se abre
en hebras simples, le sigue una etapa de hibridacin de los primers (de 45 a 68 C) en
la cual stos se unen por complementariedad
de bases con el ADN simple cadena y sirven
de punto de inicio de la sntesis de ADN por
la Taq polimerasa. Finalmente la temperatura se eleva a 72C, en la fase de elongacin,
ya que sta es la temperatura ptima de fun-
Deteccin del ADN

Existen varias tcnicas para determinar la
presencia de una determinada secuencia de
Figura 7: Ubicacin de distintos pares de primers con

respecto a la construccin y al sitio de insercin en el
genoma de la especie.
415
cionamiento de la enzima y de esta forma se

acelera la reaccin. As termina un ciclo de
copia y se inicia el siguiente elevando nuevamente la temperatura hasta 94-95C (Fig. 6,
ver pg.6). Estos ciclos tienen una duracin
de 2 a 4 minutos y se repite de 35 a 50 veces multiplicando una copia del fragmento inicial en ms de 1.000 millones de copias al final del proceso.
El producto de la amplificacin se resuelve por electroforesis en gel de agarosa y se
visualiza con un colorante fluorescente
(bromuro de etidio) bajo radiacin UV. Este
aparece como una banda de un tamao predeterminado de pares de bases, correspondiente al fragmento amplificado.
La tcnica de PCR es muy sensible, y por
lo tanto, niveles nfimos de contaminacin
con ADN en una muestra pueden generar
un resultado positivo falso. La amplificacin
repetida del mismo fragmento de ADN
(amplicn) va generando cientos de miles de
millones de copias dentro del mismo laboratorio y estas copias pueden contaminar las
nuevas muestras y los reactivos si no se tienen cuidados especiales. En primer lugar se
Tabla 1: Nmero de copias por genoma de distintas

secuencias regulatorias en diferentes eventos (P35S =
promotor 35S CaMV. Tnos = terminador de la nopalin
sintetasa. T35S = terminador del 35S de CaMV)
Evento
P 35S
Tnos
T35S
GA21
GTS 40-3-2
MON 810
NK 603
3 T25
TC1507
176
Bt11
MON 809
T14
MON 832
DBt418
CBH 351
plificacin y se resuelve por electroforesis. En

este ltimo cuarto se abre el tubo de reaccin y es donde se liberan los
810
amplicones. Es conveniente que el
primer y ltimo cuarto tengan presin negativa, mientras que en el
de purificacin la presin debe ser
positiva.
Cada cuarto debe ser limpiado
regularmente con hipoclorito de
Bt11
sodio, tener un sistema de luz UV
para la destruccin del ADN y tener
40-3-2
sus propios equipos e instrumentos.
Slo personal capacitado puede inFigura 8: Representacin esquemtica de las partes componentes de gresar en los laboratorios para
las construcciones de los eventos aprobados en la Argentina en soja y minimizar el transporte de
maz (no estn los dos eventos en algodn). P35S: promotor 35S,
T35S: terminador 35S, Tnos: terminador de la nopalin sintetasa, Pmaz: amplicones de un cuarto a otro.
El reactivo clave en una reaccin
promotor no especificado de un gen de maz, Cry 1Ab: protena Bt
que confiere resistencia insectos, CP4 EPSPS: protena que confiere de PCR son los primers que deterresistencia al herbicida glifosato, PAT: fosfinotricin acetil transferasa, minarn el fragmento a amplificar.
determina resistencia a glifosinato.
Para esto, se requiere conocer la
requiere de un laboratorio especialmente di- secuencia de nucletidos de un segmento
seado con cuartos separados para las disde la construccin usada para generar el
tintas tareas del anlisis y con un flujo evento, para as poder disearlos. Esta inunidireccional de la muestra desde las reas formacin no siempre est disponible, pero
limpias hasta la ltima zona sucia. En el una vez que se la conoce, la sntesis de
primer cuarto se muele la muestra, en el se- primers es mucho ms barata y sencilla que
gundo se purifica el ADN y se prepara la reac- la produccin de anticuerpos para reactivos
cin de PCR y en el ltimo se produce la am- inmunolgicos. Segn sea la secuencia so-
416
Figura 9. Evolucin de la acumulacin de DNA en una

reaccin de PCR positiva. La fase exponencial de
crecimiento est marcada entre barras.
Figura 10: Evolucin de la acumulacin de DNA en

funcin de los ciclos para distintas reacciones de PCR
correspondiente a diferentes concentraciones iniciales
del fragmento de DNA a amplificar. La lnea umbral
corresponde a un determinada cantidad de DNA, que es
superado por las distintas reacciones en diferentes ciclos.
bre la cual se ubiquen los primers, los mismos tendrn propiedades de deteccin distintas. Los primers generales o universales estn diseados sobre secuencias presentes en la mayora de las construcciones
vegetales (promotores, terminadores, genes
marcadores, etc.), por lo tanto, permiten detectar varios eventos (Fig. 7). Los primers
especficos permiten detectar uno o pocos
eventos. Si estos estn ubicados sobre la secuencia codificante pueden detectar un mismo tipo de construccin, por ejemplo, los
eventos Bt11 y MON810. Normalmente, con
una construccin se obtienen muchos eventos en una misma especie, pero slo uno alcanza la fase comercial; sin embargo, a veces
una misma construccin se usa para transformar varias especies y por ello, una misma
construccin se repite en el mercado en varios cultivos. En estos casos, los primers que
amplifican esta construccin detectan varios
eventos. Por ejemplo, con los mismos
primers se puede amplificar el evento GTS 403-2 de soja y el NK603 en maz (as como tambin los mismos reactivos inmunolgicos).
Los primers evento-especficos estn

diseados sobre el inserto y sobre la regin
genmica adyacente al sitio de integracin;
por eso, permiten detectar un solo evento
(de todos los que hayan sido obtenidos con
una determinada construccin).
Todos los eventos aprobados en la Argentina hasta la fecha (ver: Biotecnologa
CONABIA en www.sagpya.mecon.gov.ar) tienen en su estructura por lo menos una copia
de la secuencia del promotor 35S, sea para
dirigir la transcripcin del gen principal o del
gen marcador (Fig. 8 y Tabla 1); por eso, una
reaccin de PCR con primers ubicados sobre
el p35S permite detectar la presencia de cualquiera de estos eventos.
Existen dos tipos de PCR desde un punto
de vista tcnico: la primera versin de PCR,
ahora denominada de Punto Final (End
Point PCR), debido a que el resultado de la
amplificacin se obtiene al finalizar la reaccin (electroforesis en gel), y la otra versin,
ms reciente, la PCR en Tiempo Real (Real
Time PCR), ya que el resultado de la amplificacin se lee ciclo a ciclo (sistema de tubo cerrado).
Desde el punto de vista del objetivo de
la reaccin, un ensayo puede hacerse a los
fines de detectar la presencia de OGM o de
un evento en particular (anlisis cualitativo)
o para cuantificar su presencia (anlisis cuantitativo).
La cintica de acumulacin del producto de PCR se puede describir en tres etapas,
la primera de lenta acumulacin del producto, una segunda en la cual en virtud de la
cantidad de copias acumuladas, el crecimiento del producto es exponencial y la tercera
en la cual el sistema se satura y alcanza un
plateau. (Fig. 9).
Los momentos (ciclos del proceso) en los
cuales se alcanzan las distintas etapas dependen del nmero inicial de copias del segmento de ADN a amplificar en la muestra;
una muestra con mayor nmero de copias
iniciales alcanzar la fase exponencial antes
que una con menor nmero. Otra caracterstica del sistema es que la fase estacionaria o
de plateau, determina que las cantidades
de producto totales acumuladas en las distintas muestras tiendan a igualarse aunque
hayan iniciado con un nmero distinto de
copias. (Fig. 10).
417
El resultado de una PCR en Punto Final

(PCR PF) se obtiene una vez que se han cumplido todos los ciclos de amplificacin programados y el producto se resuelve por electroforesis en un gel de agarosa. El bromuro
de etidio agregado al gel o despus de haberlo corrido se intercala en el ADN y permite visualizar los productos de amplificacin
cuando se lo irradia con iluminacin UV. De
esta manera se puede determinar la presencia del producto esperado (amplificacin
Figura 11: Resultado semicuantitativo por PCR de Punto

Final. Scanning de una foto de trabajo, los trazos
verticales a mano alzada separan las distintas calles del
gel. Las primeras 6 calles corresponden a la Curva de
Calibracin con los siguientes puntos, 0.05%, 0.1%, 0.25%.
0.5%. 1% y 5% (genomas GM/genomas totales). Le
siguen dos calles correspondientes al control negativo
(maz no GM, molido en la misma tanda que las muestras
siguientes). Los pares de calles de 1 a 7 corresponden a
7 muestras con dos repeticiones cada una (dos extraccin
de DNA y una PCR de cada extraccin), muestras 1, 2 y 3,
GM no detectado con LOD 0.05%; muestras 6 y 7 GM
detectado, con contenido estimado inferior al 0.1%;
muestras 4 y 5 debe repetirse la PCR y/o extraccin hasta
igualar los resultados entre las repeticiones
(generalmente esto ocurre con muestras con bajo
contenido de GMO por un tema de muestreo de la harina
y del DNA).
especfica), identificado por su peso

molecular (en pares de bases), relativo a un
marcador de peso conocido. Tambin se puede observar la presencia de productos
inespecficos si los hubiera.
Anlisis cualitativo por PCR PF
La PCR en Punto Final es adecuada para
anlisis cualitativos, es decir, donde el resultado se medir como amplificacin positiva (OGM detectado) o como negativa, (OGM
no detectado), considerando la sensibilidad
lograda , lmite de deteccin o LOD.
Optimizando todos los parmetros de la
reaccin: ADN de muy buena calidad, primers
bien diseados, reactivos de mxima calidad
y con un programa y un equipo adecuados,
se puede lograr un lmite de deteccin ubi-
418
cado entre el 0.01 y 0.05% de genomas GM.

Esto equivale a detectar de 5 a 25 copias de
transgen por reaccin segn el tamao del
genoma de la especie y de la cantidad de
ADN usado en cada reaccin. Programando
un alto nmero de ciclos (45 a 50 ciclos) se
permite que an las muestras con un bajo
Figura 12: PCR competitiva. Co-amplificacin de las

diluciones crecientes del estandar y decrecientes del DNA
de la muestra. En el punto de equivalencia se igualan las
masas de los productos de amplificacin
nmero de copias iniciales alcancen la fase

exponencial y acumulen una masa visible de
producto, a costa de saturar las muestras con
contenidos mayores. En estos ensayos, adems de los controles negativos compuestos por una muestra con ADN de material
no GM y el control sin ADN (slo agua), se
debe incluir como controles positivos al
menos dos puntos de concentracin conocida de GM. Una de stas debe tener un contenido de GM igual al lmite de deteccin
deseado de forma tal de verificar que el LOD
se ha alcanzado y otro superior como segundo control en caso de que la eficiencia del
proceso no haya sido ptima. Estos valores
podran ser 0.05% (LOD) y 0.20%. Es muy conveniente que estos controles positivos se inicien en el proceso de anlisis a partir del
momento de la purificacin del ADN. De esta
manera, se est controlando en ellos la calidad del ADN obtenido, adems de la eficiencia del proceso de PCR. El anlisis cualitativo es tambin denominado screening test,
ya que permite hacer un primer anlisis a un
determinado nmero de muestras y luego
derivar a PCR cuantitativa aquellas que resultaron positivas.
Anlisis semicuantitativo por PCR PF
En un anlisis en PF puede obtenerse una
estimacin del contenido de OGM en un
rango dinmico acotado. Un resultado po-
Figura 13: Esquema de la estructura optica del ABI prism 7700 (PE
Biosystem). Este sencillo esquema muestra como a partir de uan
fuente de luz (laser en este caso) se direcciona la luz hasta cada
muestra y la emisin de retorno es dirigido hacia una cmara. Un
detalle de equipos como este es que la tapa caliente que apoya sobre
las muestras debe ser transparente. Fuente PE Biosystems
sitivo se expresa como deteccin de OGM y

un contenido estimado por una curva de
calibracin con valores prximos al LOD del
ensayo. Para esto hay que estandarizar muy
bien las condiciones intralaboratorio, especialmente cantidad y calidad de ADN y cantidad de ciclos de amplificacin (teniendo en
cuenta que alcanzado el plateau de la reaccin, la cantidad de ADN acumulado tiende
a igualarse entre muestras con distintas concentraciones de OGM). El resultado positivo
se expresa como: OGM detectado con un
LOD de ensayo X; la cantidad de producto
generado se ubica entre las seales producidas por los estndares A y B (controles
positivos). Por ej.: amplificacin de promotor 35S positiva con un LOD = 0.05%; la cantidad de producto amplificado se ubica entre
los generados por los estndares de 0.1 y
0.5%. Cuando este ensayo se realiza con una
curva de calibracin puede verse, por ejemplo, una seal dbil en los estndares de 0.05
y 0.1%, una seal media en 0.25 y 0.5% y fuerte en 1 y 5% (Fig. 11).
Anlisis cuantitativos por PCR PF, PCR
competitiva
Una de las estrategias desarrolladas para
cuantificar por PCR de Punto Final fue la PCR
competitiva (Hardegger y col., 1999) y est
basada en la co-amplificacin (en la misma
reaccin y a partir del mismo par de primers)
de un estndar interno de concentracin
conocida. Cuando la seal de amplificacin
generada a partir de la muestra y a partir del
estndar interno son iguales, se asume que
ambos procesos partieron de igual

nmero de copias iniciales del ADN
blanco. El estndar interno se construye clonando en un plsmido el
fragmento a amplificar y producindole una insercin o delecin de manera tal que cuando se resuelvan en
un gel los productos de amplificacin a partir de la muestra y del
estndar, se distingan por sus pesos moleculares. Para lograr una reaccin donde se igualen los productos de amplificacin (muestra: control interno) se arma una serie de
diluciones crecientes del estndar y
se combina con una serie de diluciones decreciente de la muestra
(Fig. 12.).
Esta estrategia, adems de laboriosa
(para obtener una reaccin donde se igualen los productos de amplificacin), requiere
del desarrollo del control interno, pero se
puede realizar en un laboratorio de PCR tradicional.
PCR en Tiempo Real (Real Time PCR)
En un sistema de PCR en Tiempo Real, el
proceso de amplificacin se va siguiendo
ciclo a ciclo, observando el incremento de la
masa de ADN presente en cada reaccin. Esto
se logra gracias a un termociclador que tiene
adosado un sistema ptico que emite un haz
de luz sobre cada muestra y registra la emisin de fluorescencia a partir de las misma y
de uno o ms reactivos fluorescentes agregados a la reaccin y que emiten luz de manera proporcional a la cantidad de ADN presente (Fig. 13). La ventaja de este sistema es
que permite detectar en qu momento cada
reaccin alcanza su fase exponencial de amplificacin (Fig. 14, ver pg.6), y sta
correlaciona con la cantidad de copias del
ADN blanco que haba inicialmente en la
muestra.
Para poder cuantificar se necesita incluir
en el experimento una curva de calibracin
con la cual comparar las muestras incgnitas.
A partir de esta curva, se determinar en qu
ciclo alcanza la fase exponencial cada concentracin de OGM. Una muestra con un 10%
de OGM alcanzar la fase exponencial antes
que una muestra con un 1%; y sta antes que
una con 0.1%. La cuantificacin del contenido de OGM se obtiene comparativamen-
419
Figura 15: Ajuste

matemtico de los
resultados de las
muestras que
integran la curva de
calibracin y a partir
del cual se calcular
la concentracin de
GM en las muestras.
Los puntos incluidos
en esta curva son
0.05, 0.1, 0.25. 0.5,1 y
5% (Genomas/
genomas totales).
te con la curva de calibracin usada y en

sus mismas unidades (nmero de copias,
porcentual, etc) (Fig. 10 y Fig. 15).
Una de estas expresiones relativas se logra cuantificando genomas modificados, respecto de los genomas totales de la especie.
Para determinar el nmero de genomas
modificados se mide el nmero de copias del
segmento de ADN transgnico (una copia
por genoma), mientras que para medir el
nmero de copias de genoma de la especie
se cuantifica el nmero de copias de un gen
endgeno, de copia nica y propia de la
especie, esto siempre dentro de la misma
muestra de ADN. Por lo tanto, en este ensayo se necesita utilizar dos curvas de calibracin, una para el nmero de copias del
transgen y otra para la cuantificacin del gen
endgeno, para lo cual se utilizan plsmidos
conteniendo las secuencias en cuestin.
Cuando la cuantificacin de una muestra se
realiza por evento, la suma de los porcentuales de cada evento determina el contenido
total de la muestra.
Para granos, la curva de calibracin puede prepararse mezclando distintas proporciones de granos modificados con no modificados. De esta manera, la extraccin de
ADN a partir de estas mezclas ya tiene una
proporcin fija y conocida de genomas modificados/no modificados. Si en la reaccin de
PCR se utiliza la misma cantidad y calidad de
ADN en los estndares y en las muestras, se
puede hacer la comparacin directa entre
stos para realizar la cuan-tificacin.
Como en todo anlisis cuantitativo, el
material de referencia es de suma importancia. Para maz y soja existen preparados
(harinas) comerciales con distintas concentraciones de GM (de 0 a 2%). Este material de
420
referencia, es preparado por el IRMM de Europa (Institute for Reference Material and
Measurements, www.irmm.-jrc.be ) y por su
costo se lo usa generalmente para calibrar
los materiales preparados en el laboratorio;
sin embargo, es muy difcil lograr la estabilidad y reproducibilidad de los valores entre
lotes e incluso algunos productos se han
discontinuado.
En materia de plsmidos, una firma japonesa comercializa uno que contiene 8 secuencias que estn presentes en un gran nmero
de eventos comerciales (www.fasmac.co.jp).
Al tema de los materiales de referencia
se le agrega el de las unidades de medicin.
En la mayora de los contratos comerciales
de granos en los cuales se estipula un determinado contenido de OGM, este contenido
se expresa de manera porcentual pero sin
especificar las unidades. Lo mismo ocurre
dentro de la legislacin europea de etiquetado (EC 49/2000) y su reciente modificacin
hacia un lmite de 0.9% para cada especie ingrediente (EC 1829/2003), donde tampoco
se especifica las unidades de esta medicin
relativa. En general se asume que se trata
de una medicin relativa de peso en peso.
Sin embargo, ninguno de los mtodos analticos cuantitativos, ELISA cuantitativo o
PCR cuantitativa, puede medir estas unidades e incluso cuantifican elementos distintos entre ellos. Si en una muestra de granos
se conoce el nmero de granos GM, se puede calcular con precisin el contenido porcentual en peso. Sin embargo, conocer el nmero de granos GM a partir de un contenido
de genomas modificados medidos por la presencia del promotor 35S, implica conocer informacin precisa de la muestra o suponerla. Por ejemplo, en una especie diploide, si
el evento est en estado homocigota, tendremos el doble de copias del p35S que si
est en estado de heterocigosis (lo ms probable es que en una muestra tengamos proporciones distintas de ambos estados). Adems, en los granos heterocigotas, el tejido
triploide del endos-perma genera diferencias en la densidad del transgen por unidad de masa; si el transgen lleg al grano
por la gameta masculina (polen), el
endosperma tendr una relacin modificado:
no modificado de 1:2, mientras que si ingres por la gameta femenina, la relacin ser
2:1, debido a la contribucin gentica desigual de ambos padres en el endosperma 3n.
Tambin hay que conocer los eventos
involucrados, ya que algunos tienen una copia del p35S por genoma, mientras que otros
tienen dos, tres y hasta 5 copias (Tabla 1).
Cuando se est cuantificando la contaminacin accidental con GM de un lote de granos, es poco probable que se tenga la informacin precisa de la misma y su origen.
Cmo detectar OGM en el futuro?
En un futuro cercano sern muchos los
eventos aprobados y liberados en el mundo, y las secuencias hoy presentes en la mayora de los eventos, como son el promotor
35S y el terminador NOS, ya no sern comunes. El desarrollo de nuevos promotores especficos de la especie y la funcin har que
los distintos eventos prcticamente no tengan ninguna secuencia en comn. Con la tecnologa actual, esto implica que deberamos
realizar una reaccin de PCR por cada evento posible para poder finalmente decir que
la muestra no contiene (con un lmite de deteccin dado) una determinada lista de eventos correspondiente a todos los que hayan
sido ensayados. Hoy, un ensayo de PCR dirigido al P35S y cuyo resultado sea negativo permite descartar la presencia de ms
del 90% de los eventos del mercado mundial.
El consumidor, especialmente el europeo,
ha solicitado la eliminacin en las plantas
transgnicas de los genes de resistencia a
antibiticos. Estos son usados como marcadores de seleccin en los procesos de transformacin y regeneracin vegetal. Estas secuencias tambin son comunes a muchos
eventos y por lo tanto tiles a la hora de

detectar la presencia de modificaciones
genticas, pero estos genes ya no estarn
presentes en los nuevos materiales GM.
Por otro lado, los prximos desarrollos
planean agregar o modificar varias caractersticas en el mismo genotipo o la introduccin de pasos metablicos complejos. Esto
implicar la introduccin de varios genes distintos en transformaciones sucesivas. Las tcnicas actuales de integracin al azar en el
genoma tienen una muy baja eficiencia de
produccin. Por eso, para estos desarrollos
se requerir el uso de sistemas de integracin al genoma que sean dirigidos a sitios
especficos del mismo (sistemas de integracin por recombinacin). Unos pocos sistemas se presentan como promisorios para su
uso, entre ellos el sistema Cre/Lox, (Srivastava
V, Ow DW, 2001). Por lo tanto es posible que
las secuencias requeridas para el funcionamiento de estos sistemas sean, en el futuro,
blanco para la detecccin de OGM.
En diversos mbitos se est discutiendo
la posibilidad de introducir secuencias no
codificantes en el genoma de las plantas junto con los genes de inters de una modificacin gentica, para generar blancos de deteccin universales frente a la diversidad de
eventos que habr en el futuro.
Frente a esta perspectiva de diversidad
de modificacin gentica y tan heterognea
mundialmente, la nueva tecnologa de los
microchips, microarrays o micromatrices,
podra permitir detectar y cuantificar en un
solo ensayo la presencia de cientos o miles
de secuencias. A grandes rasgos, un
microchip es un pequeo soporte slido del
tamao de un cubreobjetos para microscopia
ptica, en el cual se han fijado puntos ordenados y microscpicos de secuencias de simple cadena conocidas.
Estas secuencias tienen la capacidad de
hibridar con su ADN complementario, y si
ste est marcado con un fluorforo, el punto de la micromatriz quedar marcado. Luego de la hibridacin con la muestra de ADN
marcado, un aparato de barrido especial realiza la lectura punto por punto, identificando los puntos marcados y por lo tanto las
secuencias que estn presentes en la muestra bajo anlisis (Fig. 16, ver pg.5).
Desde el ao 2001 una comisin europea
421
de investigacin est encargada de desarrollar el GMO chip, un chip de baja densidad (1000 puntos /cm2) que permita detectar la presencia de distintos OGM simultneamente (ver: www.gmochips.org).
Segregacin, trazabilidad e identidad
preservada para GMO
El objetivo de un programa de trazabilidad es generar un producto de identidad
preservada, esto es un producto del cual se
puede conocer su origen y los procesos a que
fue sometido hasta alcanzar el producto final en destino. La identidad preservada se
aplica para obtener un producto identificado por su origen geogrfico, y/o por su contenido y/o por su mtodo de produccin.
Esto implica el trabajo de auditores, ensayos
de laboratorio y documentacin a lo largo
de todo el proceso. La trazabilidad est asociada a la reastreabilidad (identificar el origen de los productos) y a la segregacin,
para evitar las mezclas y para descartar todo
aquello que no cumpla con lo requerido.
Muchas veces se confunden los trminos
trazabilidad y segregacin y no se refieren a
los mismos conceptos. Segregacin implica
mantener separado un producto de otros,
mientras que trazabilidad significa conocer su
origen y no forzosamente separacin. La
trazabilidad de un producto puede mostrar
que en sus composicin hay ingredientes diferentes, por ejemplo derivados de OGMs.
Lo que suele ocurrir es que se utiliza a la
trazabilidad como una herramienta para
asegurar la segregacin e identidad de un
producto.
Para que un programa de trazabilidad se
justifique se necesita de la demanda de un
sector dispuesto a pagar un precio mayor al
normal por una determinada caracterstica de
calidad.
En el caso de los granos, existen programas para asegurar calidad y origen y recientemente se le ha acoplado un nuevo atributo que es el contenido de OGM. Los niveles
requeridos varan de acuerdo al destino del
producto. Actualmente stos, van de menos
del 0.1% al 5% en algunos casos. En funcin
de este requerimiento, se arma un programa de trazabilidad y/o segregacin que requerir de mayores controles cuanto menor
422
sea el nivel admitido de OGM.

Cuanto menor sea el nivel exigido, mayor ser el costo del producto. Esto no slo
es por los mayores controles en todo el proceso sino tambin por la mayor cantidad de
mercadera que quedar fuera de la tolerancia y que se descartar del programa.
El primer paso es identificar los puntos
crticos del proceso productivo en los cuales
la mercadera pueda sufrir una mezcla accidental que pueda incrementar los niveles de
OGM por encima del mximo nivel requerido.
En granos, los programas de trazabilidad
no se disean para una sola caracterstica.
Adems del contenido de OGM, tambin se
analiza la pureza del tipo de grano, el contenido de aflatoxinas, ausencia de materiales
extraos y contaminantes, etctera.
El desarrollo de un programa de
trazabilidad implica la participacin y capacitacin de numerosos agentes; entre
ellos el productor agropecuario, los transportistas, los acopiadores y, por supuesto,
todo el personal que ejecuta y audita el
programa.
El primer paso del programa, y el ms
importante, es el control y seleccin de los
lotes de semillas. El contenido de OGM en
la semilla determinar el mnimo contenido del producto final, ya que por lo general
las mezclas accidentales en el proceso tendern a elevar el contenido de OGM. Por
esto, el contenido de OGM en la semilla debe
ser holgadamente inferior el mximo nivel
admitido al final del proceso. En programas
avanzados, la auditora se inicia dentro del
semillero multiplicador, controlando las lneas
parentales que formarn el hbrido.
Controlada la semilla, se reparte entre los
distintos productores que participan del programa, quedando registrada la identidad de
los lotes y la superficie sembrada de los mismos (algunos programas incluyen los datos
de informacin satelital, GPS, para la ubicacin y el seguimiento de los lotes).
Una segunda instancia de control es la
toma de muestra en precosecha, con el
objetivo de corroborar que se utiliz la semilla indicada en el lote asignado y que no
hubo mezclas con semillas de otras fuentes.
Tambin en este momento se toman muestras de hojas o granos de lotes linderos para
determinar la presencia o no de material

genticamente modificado de la misma especie que pueda mezclarse con el lote del
programa por polinizacin cruzada.
En caso de que el lote lindero resulte
positivo se descartarn del programa las
hileras del lote ms prximas al lote lindero para descartar los granos que pudieran
haber recibido polen del lote GM positivo.
Las cosechadoras y todos los vehculos de
transporte de los granos (carros y camiones)
deben ser limpiados y controlados de restos
de granos de tareas anteriores
En el momento de la cosecha los diferentes camiones que ingresan en el acopio con
los granos del programa son controlados
antes de la descarga mediante ensayos
inmunolgicos rpidos (strips reactivos)
para detectar a tiempo posibles errores de
destino o identificacin.
Una muestra de granos del conjunto de
camiones (cada 20 a 30 camiones) se enva al
laboratorio para su anlisis por PCR para tener un anlisis ms sensible y cuantitativo.
As se van conformando conjuntos con
material identificado de mayor cantidad (silos, celdas) hasta lograr el volumen requerido. Del ltimo continente (celda o bodega) se realiza un nuevo ensayo de PCR que
confirma el cumplimiento con el nivel de OGM
solicitado. Sin embargo, no slo tiene valor
el ltimo resultado obtenido de la mercadera sino todos los procesos para asegurar y
controlar la calidad realizados a lo largo del
proceso de produccin con segregacin y
trazabilidad. Por esto, el producto se entrega con una carpeta que contiene toda la informacin generada por el programa de
trazabilidad y que valida el ltimo resultado
analtico obtenido.
Conclusiones
Combinando estratgicamente las distintas tcnicas para detectar OGM, en programas sencillos o complejos de trazabilidad, es
posible producir granos con distintos contenidos de OGM, segregados del resto de la
produccin de commodities (a granel). As
es posible abastecer al sector exportador, a
los productores de especialidades
(speciailties), para quienes es vital que sus
productos estn diferenciados e identifica-
dos, o a la industria en general que requiera

de un producto diferenciado; mientras al
mismo tiempo se producen commodities de
precio no diferenciado, aprovechando las
ventajas econmicas y tcnicas de la
biotecnologa. La trazabilidad y segregacin
por contenido de OGM es slo una de las
muchas caractersticas que se utilizan para
definir productos, y ms all del caso de los
productos de la biotecnologa moderna en
el contexto actual, uno de los desafios de la
produccin argentina de granos y alimentos
parece ser la de poder segregar e identificar
la mayor cantidad de productos dentro de
sus commodities.
Finalmente hay que mencionar que los
materiales genticamente modificados que
no mantengan una equivalencia sustancial
con los materiales tradicionales, por definicin, van a ser segregados e identificados
de acuerdo a la nueva caracterstica de valor
(nutricional, por ejemplo) y sern producidos
dentro de distintos tipos de programas con
segregacin positiva y de etiquetado de producto para asegurar su pureza, calidad y su
valor de uso diferencial.
Lecturas recomendadas
A. C. TOZZINI, M.C. MARTINEZ, M.F. LUCCA, C. V. ROVERE,
A. J. DISTEFANO, M. DEL VAS and H. E. HOPP. Semiquantitative detection of genetically modified grains
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http://www.usda.gov./
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PARTE I

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los representantes de la sociedad civil) para

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ciencias de la vida y de la biotecnologa, representaran un potencial nada desdeable

nal como internacional, en los pases desarrollados y en los pases en desarrollo. El

y la Agricultura (FAO), hay alrededor de 800

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la obtencin de un producto final de mayor

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Esto generar cada vez ms cambios sustanciales en toda la cadena productiva

y estima el impacto de stas sobre el mundo

tivos que potencien las capacidades. De esta

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cubri el efecto de la leche de coco como estimulante de la formacin de callo sobre el

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Figura 3: Esquema de los diferentes procesos

generacin es un proceso que comprende

cin es de brotes, races o flores se denomina organognesis directa. Si en cambio se

do. Estas clulas son capaces de dividirse o

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pecie, frecuentemente desarrollan de manera anormal o son inmaduros. La anomala

Varios son los compuestos qumicos que

se incorporan por difusin al medio de cultivo.

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Entre las condiciones fsicas podemos

1. La temperatura de incubacin de los

Figura 5: Esquema de las diferentes respuestas

HICKS, G.S. 1980. Patterns of organ development in plant

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Estudios bsicos. En este caso, los

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V.-2) el explante original deber posibilitar la

Establecimiento de suspensiones celulares. En este caso se recomienda iniciar los

MROGINSKI, Luis; SANSBERRO, Pedro; FLASCHLAND, Eduardo

gacin y que generalmente est asociado al

peccionar visualmente con la ayuda de un

Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal

En los casos en que no se utilice etanol, la

nos a microondas. El agua caliente tambin

MROGINSKI, Luis; SANSBERRO, Pedro; FLASCHLAND, Eduardo

utilizacin de guardapolvos, guantes y mscaras protectoras de la boca y de la nariz, as

Fuente de carbono: Prcticamente todos

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tan una distribucin espectral de la energa

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Figura 1: Diseo de una CMARA DE ACLIMATACIN

mente, introducen o extraen aire, generando un movimiento masal.

PREZ PONCE, J.N. 1998.

MROGINSKI, Luis; SANSBERRO, Pedro; FLASCHLAND, Eduardo

una pequea protena que induce la sntesis

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aportado sofisticados procedimientos que

a menudo genera un grupo de clones que

Seleccin de las clulas que contienen molculas de ADN

Figura 1: Pasos bsicos en la clonacin de un

GMEZ, Marisa; ECHENIQUE, Viviana

mente reconocen secuencias de ADN que son

Genera extremos romos

Tabla 1: Secuencias reconocidas y sitios de restriccin de diferentes endonucleasas de restriccin

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de la secuencia de reconocimiento (en el mismo punto, en ambas cadenas) produciendo