Documentos de Académico
Documentos de Profesional
Documentos de Cultura
Ntc1232 Metodo de Analisis de Aflatoxinas
Ntc1232 Metodo de Analisis de Aflatoxinas
COLOMBIANA
NTC
1232
1996-10-23
E:
CORRESPONDENCIA:
DESCRIPTORES:
Primera actualizacin
Editada 2001-09-11
PRLOGO
DE
El ICONTEC cuenta con un Centro de Informacin que pone a disposicin de los interesados
normas internacionales, regionales y nacionales.
DIRECCIN DE NORMALIZACIN
1.
OBJETO
PRINCIPIO
Las aflatoxinas (AF) se extraen con una mezcla de acetonitrilo: agua (84 + 16) y se purifican
con una columna multifuncional de limpieza. Luego de evaporar el extracto bajo una corriente
de nitrgeno, las AFB1 y AFG1 se derivatizan a sus correspondientes hemiacetales (AFB2a y
AFBG2a) con cido trifluoroactico. La separacin de las cuatro Aflatoxinas [B1 (B2a), B2, G1
(B2a) y G2] se hace en una columna cromatogrfica de fase reversa (RP - 18). Las Aflatoxinas
se detectan finalmente y se cuantifican mediante un espectrofotmetro de fluorescencia
acoplado a un integrador-graficador, utilizando un mtodo de cuantificacin por estndar
externo.
3.
El mtodo se ha utilizado en los siguientes substratos: maz, sorgo, arroz, torta de algodn,
torta de soya, harina de yuca, subproductos de trigo, alimentos concentrados, gluten de maz,
man, almendras, pistachos y pasta de breva. Si se requiere analizar un substrato diferente a
los anteriores se sugiere hacer una revalidacin del mtodo, con el fin de determinar si se
precisa hacer modificaciones al mtodo.
4.
4.1
APARATOS Y MATERIALES
4.1.1
Columna de limpieza
Cromatgrafo de lquidos
a)
b)
c)
d)
e)
f)
Integrador-graficador.
4.1.3
Agitador de vaivn
4.1.4
4.1.5
4.1.6
4.1.7
Pipetas de 5 ml de capacidad.
4.1.8
4.1.9
4.1.10 Viales para derivatizacin de 2 ml de capacidad con tapa rosca recubierta de tefln.
4.2
REACTIVOS
4.2.1
Solvente de extraccin
Se mezclan 840 ml de acetonitrilo grado reactivo analtico con 160 ml de agua destilada.
2
Solucin de derivatizacin
Fase mvil
Se mezclan 600 ml de agua grado HPLC con 400 ml de metanol grado HPLC. Se filtran a travs
de membrana de 0,45 m de dimetro de poro y se desgasifica antes de usar.
4.1.4
Sigma A-1022, la cual contiene las siguientes cantidades de aflatoxinas en forma de pelcula
desecada: AFB1:25 g; AFG1:25 g; AFB2: 7,5 g de AFB2; AFG2: 7,5 g.
Preparacin de la solucin madre: se disuelve el contenido del vial con 5,0 ml de benceno:
CH3CN (98 + 2) para obtener las siguientes concentraciones de aflatoxinas: 5 g/ml de AFB1;
1,5 g/ml de AFB2; 5 g/ml de AFG1; 1,5 g/ml de AFG2.
Preparacin de la solucin de trabajo: se toman 400 l de la solucin madre y se llevan a un vial
mbar silanizado de 40 ml. Se evaporan a sequedad el solvente en corriente de nitrgeno y
redisolver con 40 ml de acetonitrilo grado HPLC. La concentracin final de aflatoxinas: 50 ng/ml
de AFB1; 50 ng/ml de AFG1; 15 ng/ml de AFG2 y 15 ng/ml de AFB2.
Preparacin del estndar de calibracin (estndar externo de cuantificacin):
a)
b)
c)
4.3
PROCEDIMIENTO GENERAL
4.3.1
Extraccin
1)
Nota. Se recomienda pesar la mitad de la muestra (25 g) cuando se realicen anlisis de harina de
arroz, harina de yuca, torta de algodn, torta de soya y subproductos de trigo.
4.3.2
4.3.3
4.4
3)
4)
5)
Derivatizacin
6)
7)
HPLC
8)
Nota. Las AFB2A y AFBG2a son inestables (especialmente en metanol). Los extractos derivatizados se deben inyectar
rpidamente para evitar la degradacin de las aflatoxinas.
Donde:
5.
5.1
APARATOS Y MATERIALES
5.2
1)
2)
Bomba de vaco
3)
4)
5)
6)
7)
8)
9)
10)
11)
Agitador de vaivn
12)
13)
14)
15)
Pipetas de 5 ml de capacidad
16)
17)
18)
REACTIVOS
5.3
PROCEDIMIENTO
5.3.1
Se colocan las placas de silica gel 60 (con o sin zona de concentracin) en estufa a 105 C
durante 1 h. Se deja secar y enfriar las placas en un desecador.
5.3.2
Extraccin
Desarrollo de la placa
Se satura la cmara con 50 ml de cloroformo acetona (9:1). Se coloca la placa ajustando las
condiciones para que Rf sea (04 - 07).
Semicuantitativos
Se colocan las placas en la cmara de luz UV. Se compara los valores Rf del estndar y la muestra.
Se busca el estndar aplicado de fluorescencia similar a la fluorescencia de muestra. Se reportan
los resultados como mg/kg.
ng / g =
Cuantitativo
Utilizando un densitmetro se realiza la curva de calibracin aplicando cuatro estndares 2 l, 5 l,
10 l, 15 l de la muestra y se reportan los g/kg de la muestra.
Calibracin de los estndares
Clculo de absortividad molar
Se determina la absorbancia (A) a 350 nm utilizando como blanco una solucin de 0,0018 N de
H2SO4 en agua.
Se calcula ?
mediante la ecuacin:
= (A X 1 000)/concentracin en mM
Para determinar el factor de correccin CF, se reemplaza en la ecuacin CF = 3160/
= ( A MW x 1 000 CF )
Donde:
A
MW y
Aflatoxina
MW
B1
B2
G1
G2
312
314
328
330
19,800
20,900
17,100
18,200
Anexo A (Informativo)
Bibliografa
DAZ, G.J. 1995. Anlisis de aflatoxinas por cromatografa lquida de alta eficiencia. Mtodos de
anlisis del Laboratorio de Toxicologa de la Facultad de Medicina Veterinaria y de Zootecnia.
Universidad Nacional de Colombia.
HOLCOLB, M., WILSON, D.M., TRUCKSESS, M.W. 6 THOMPSON, H.C. 1992 Determination of
Aflatoxins in Food Products by Chromatography. Journal of Chromatography, 624:341-352.
PARK, D.L., S. NESHEIM, S., TRUCKSESS, M.W., STACK & R.F. NEWELL. 1990. Liquid
Chromatographic Method for Determination of Aflatoxins B1, B2, G1 and G2 in corn and Peanut
Products: Collaborative Study. J Assoc. Off. Anal. Chem., 73:260-266.
TRUCKSESS, M.W., STACK, M.E., M.E., NESHEIM, S., ALBERT, R.H. & ROMER, T.R. 1994.
Multifunctional Column Coupled with Liquid Chromatography for Determination of Aflatoxins B1,
B2, G1, and G2 in corn Almonds, Brazil nuts, Peanuts, and Pistachic Nuts: Collaborative Study J.
of AOAC Int., 77: 1512-1521
WILSON, T.J. & ROMER, T.R. 1991. Use of Mycosep Multifunctional Cleanup Column for Liquid
Chromatographic Determination of Aflatoxins in Agricultural Produts. J. Assoc. Off. Anal. Chem.
74:951-956.