Universidad Complutense

DEPARTAMENTO DE
MICROBIOLOGA II
GUIA DE PRCTICAS DE

MICROBIOLOGA e INMUNOLOGA
Segundo Curso
2010/2011
1

INDICE
NORMAS DE SEGURIDAD EN EL LABORATORIO ....................................................... 5
EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGA..................................................................... 6
ELIMINACIN Y LIMPIEZA DEL MATERIAL CONTAMINADO ....................................... 9
PREPARACIN Y ESTERILIZACIN DEL MATERIAL ................................................. 10
OBSERVACIN DE MICROORGANISMOS ................................................................. 14
AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS ................................................................... 22
TIPOS DE SIEMBRAS ................................................................................................ 26
CULTIVO DE ANAEROBIOS....................................................................................... 30
CONTROL MICROBIOLGICO AMBIENTAL............................................................... 32
ANTIBIOGRAMA POR DIFUSION EN AGAR ............................................................... 34
AISLAMIENTO E IDENTIFICACIN DE Candida albicans.......................................... 38
OBSERVACIN MICROSCPICA DE LOS MICROORGANISMOS DE LA MICROBIOTA
ORAL ................................................................................................. 40
ANLISIS E IDENTIFICACIN DE MICROORGANISMOS CULTIVABLES DE LA
MICROBIOTA ORAL ........................................................................... 41
MEDIOS DE CULTIVO, COLORANTES Y REACTIVOS ............................................... 45
BIBLIOGRAFA .......................................................................................................... 48

NORMAS DE SEGURIDAD EN EL LABORATORIO

- El acceso al laboratorio de prcticas slo se permite a los alumnos que estn
realizando las prcticas. No se admiten visitas por razones de seguridad.
- Los laboratorios de investigacin son de acceso restringido al personal del
Departamento.
- Es obligatorio utilizar batas abrochadas siempre que se est trabajando en el
laboratorio. Durante el periodo de prcticas, la bata no debe utilizarse fuera
del laboratorio.
- Debe respetarse la prohibicin de beber, comer, masticar chicle o fumar en el
laboratorio y se debe evitar llevarse a la boca ningn objeto (bolgrafos...) o
tocarse los ojos y nariz..
- En la superficie de trabajo no deben depositarse en ningn momento ropa u
objetos personales.
- Cada alumno es responsable de la limpieza de su lugar de trabajo y del
material asignado, as como de los microscopios que haya usado.
- Se deben usar los mecheros Bunsen con precaucin, no dejando material
inflamable cerca y evitando el posible contacto con pelo y ropas. Se
comprobar que se ha apagado el gas al finalizar el experimento y al
abandonar el laboratorio.
- Est prohibido pipetear con la boca.
- Ante un vertido accidental de material microbiolgico debe informarse
inmediatamente al profesor encargado del grupo.
- No se debe forzar un tubo de vidrio o la apertura de un frasco sin tener
protegidas las manos.
- No se manejarn los autoclaves o el material recin esterilizado si no se
dispone de guantes apropiados.
- La eliminacin de residuos, material desechable y material reciclable se
realizar siguiendo las pautas de la prctica 1, utilizando los contenedores
dispuestos a tal efecto.
- Se deben lavar las manos con jabn antisptico ante cualquier sospecha de
contaminacin y siempre antes de marcharse del laboratorio.

EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGA
Para trabajar en un laboratorio de Microbiologa se requieren unas
tcnicas especficas y diferentes de las que se utilizan en otras disciplinas. Es
imprescindible trabajar en condiciones aspticas: el material e instrumental
que se va a utilizar, as como los medios de cultivo, deben ser sometidos a
algn procedimiento de esterilizacin, eliminndose de ellos cualquier posible
microorganismo. Para mantener las condiciones de esterilidad, debemos
trabajar en campana de flujo laminar o en la proximidad de la llama de un
mechero Bunsen.
En el laboratorio, el trabajo con microorganismos suele realizarse
utilizando cultivos axnicos o puros, es decir, que contienen organismos de
una sola especie microbiana. La posibilidad de contaminacin est siempre
presente porque los microorganismos se encuentran en todos los ambientes:
en el aire, en el agua, en nuestra piel y, en general, en todo lo que tocamos.
Para evitar las contaminaciones hemos de observar las siguientes normas:
El medio de cultivo y el recipiente que lo contiene deben estar estriles.
Los tubos o matraces deben ser tapados con algodn hidrfobo estril o
cubiertos con un capuchn metlico, para impedir la entrada de
microorganismos. Si se usan placas de
Petri
deben
mantenerse
tapadas
mientras no se estn manipulando.

Los instrumentos que van a entrar

contacto con el medio de cultivo, con
distintos
recipientes
o
con
microorganismos en estudio (asa
siembra,
pipetas,
etc)
deben
previamente esterilizados.

uso:

Instrumentos para siembra de

microorganismos
A: Asa de siembra
B: Hilo de siembra
C: Pipeta Pasteur
D: Cayado

en
los
los
de
ser

Materiales empleados y forma de

Asa e hilo de siembra: Antes de su

utilizacin, se esterilizan sometindolos a
la accin de la llama de un mechero
hasta
que
el
filamento
quede
incandescente. Luego se flamear la
parte inferior del filamento. Una vez
utilizados, deben flamearse de nuevo con
el objeto de eliminar los microorganismos
que quedan en ellos.

Pipetas Pasteur: Son generalmente de

vidrio y se utilizan para la transferencia
de cultivos lquidos, diluciones de suero, etc con ayuda de un chupete de
goma u otro sistema de aspiracin mecnica. Pueden utilizarse, con el
extremo inferior cerrado, en sustitucin del hilo de siembra, cuando se
6

realizan siembras en el interior del agar (en profundidad). Para ello se sella
previamente el extremo de la misma con la llama del mechero.
Varillas de vidrio macizo acodadas (cayados): Sirven para distribuir los
microorganismos de la muestra sobre la superficie del medio de cultivo
contenido en una placa de Petri. Se utilizarn previamente esterilizadas,
impregnndolas en alcohol y pasndolas posteriormente por la llama del
mechero. Tambin, pueden hacerse usando una pipeta Pasteur, sellando el
extremo de la misma y acodndola con la llama del mechero.
Pipetas graduadas de vidrio o plstico: Se suministran ya estriles a los
alumnos, dentro de estuches metlicos o bien empaquetadas de forma
individual (envueltas en papel satinado o plstico para mantener su
esterilidad), en cualquier caso deben abrirse cerca de la llama del mechero.
La pipeta, si es de cristal, y por lo tanto reciclada, debe flamearse
ligeramente antes de ser usada. Las pipetas llevan un algodn en la
boquilla, que acta como filtro, para evitar la contaminacin y para impedir
la llegada de lquido al sistema de succin. Dicho algodn debe permanecer
en la boquilla durante el uso. Bajo ningn concepto se debe pipetear con la
boca una muestra microbiolgica. Para pipetear suspensiones de
microorganismos se utilizan chupetes o pipeteadores ms o menos
sofisticados, como son las peras de goma provistas de vlvulas que permiten
controlar la succin y el dispensado de los lquidos o los dispositivos
semejantes a jeringas en los que se coloca la pipeta y que operan por medio
de un mbolo o con ayuda de bombas elctricas.

A
B

Pipetas
A: Pipeta automtica de 0,21 ml
B: Pipeta automtica de 0,020,2 ml
C: Pipeta de vidrio de 10 ml
D: Pipeta de vidrio de 1 ml

D
Tubos de ensayo con cultivos problema y placas Petri: Se destapan cerca de
la llama del mechero utilizando para ello slo los dedos que quedan libres
en la mano que sostiene el asa de siembra. Se flamea la boca del tubo, se
toma una pequea muestra del cultivo con asa de siembra estril,
previamente atemperada, y tras flamear de nuevo la boca del tubo
colocamos el tapn. Todo el proceso se realiza cerca de la llama. Si el medio
es lquido, se debe agitar el tubo antes de tomar la muestra, porque los
microorganismos tienden a sedimentar. En el caso de que el medio sea
slido (tubos de agar inclinado y placas Petri), la muestra se obtendr
rozando ligeramente con el asa la zona en la que se aprecia masa
microbiana. Los tubos y las placas deben permanecer abiertos el menor
tiempo posible con el fin de evitar contaminaciones.
Medios de cultivo: Pueden ser lquidos, slidos y semislidos. Se distribuyen
en matraces, tubos de ensayo y placas de Petri. Estas ltimas slo llevan
medio slido. Su preparacin y esterilizacin se describe mas adelante.
7

La composicin de los medios, colorantes y reactivos utilizados en prcticas

se describe en el anexo del final de la gua.

El asa se coge del

mango como si
fuera un lpiz.

La boca del
tubo se
flamea
despus de
abrir y antes
de cerrar

El tapn se
maneja con el
meique de la
mano derecha.

Manejo del asa de siembra durante una inoculacin.

Toda la
operacin se
realiza cerca
del mechero
Bunsen

ELIMINACIN Y LIMPIEZA DEL MATERIAL

CONTAMINADO
En Microbiologa es importante recordar la necesidad de una pulcra y
esmerada limpieza del material, as mismo, es muy importante la recuperacin
del material reciclable y la eliminacin del material desechable.
Todos los objetos sucios o contaminados deben recogerse en recipientes
adecuados, provistos de tapa. El material de vidrio, tubos, matraces y pipetas,
se separa del resto del material recogindose en un contenedor vertical u
horizontal lleno de una solucin desinfectante, como por ejemplo una solucin
diluida de leja, en la que permanecer antes de su lavado durante 24 horas.
Como los objetos contaminados contienen, con frecuencia, cantidades
importantes de materia orgnica (procedente de los medios de cultivo) que
protegen a los microorganismos de los agentes fsicos o qumicos utilizados en
la descontaminacin de los mismos, no puede asegurarse la total destruccin
de las formas vegetativas y mucho menos de las esporas. Por ello, se
recomienda utilizar mayores concentraciones de desinfectante y tiempos ms
largos de tratamiento que para la desinfeccin o la esterilizacin de material
limpio.
Generalmente se utiliza el autoclave para la descontaminacin de
instrumentos, equipos y material que sean estables al calor, as como de
material desechable. A tal objeto se coloca este material en recipientes
adecuados y se introducen en el autoclave sometindolos a la accin del vapor
de agua a 1 atmsfera de sobrepresin (121 C) en ciclos ms prolongados de
lo habitual (1 hora en lugar de hacerlo durante 30 minutos).
Una vez efectuado este tratamiento, se procede a su lavado para eliminar
toda materia extraa, sumergiendo el material en agua caliente jabonosa o
utilizando detergentes, mezcla crmica o cualquier otro procedimiento
enrgico, tanto mecnico como qumico. Se aclara bien con abundante agua y
se deja escurrir y secar a temperatura ambiente. En el caso de las pipetas, y
antes de ser lavadas, debe extraerse con ayuda de un alambre o pinzas
especiales, el trozo de algodn que tienen en la boquilla.
Algunos de los objetos sucios y contaminados (portas, pipetas, etc),
despus de lavados, se sumergen en una mezcla sulfocrmica donde se dejan
24 horas al cabo de las cuales se lavan con agua y se dejan escurrir. Los
portas se secan con un pao de hilo limpio, procurando que no queden hilazas
sobre la superficie.
El material que contiene colorantes se trata, segn las condiciones del
material, durante un tiempo variable con una solucin que puede ser de cido
clorhdrico, ntrico o mezcla sulfocrmica.
El resto del material (tubos de plstico, jeringas, etc) se trata con distintas
soluciones desinfectantes como hipoclorito sdico, formol, etc, pero debe
recordarse que se utilizan a concentraciones superiores a las utilizadas con
otros fines.

PREPARACIN Y ESTERILIZACIN DEL

MATERIAL

Introduccin:
En Microbiologa se define esterilizacin como la destruccin o
eliminacin total de todos los microorganismos vivos en un objeto o material,
incluidas las endosporas bacterianas. La esterilidad es un estado absoluto, no
hay grados de esterilidad.
El material que se va a esterilizar debe prepararse de tal manera que se
conserve sin contaminar una vez esterilizado:
El material de vidrio, como tubos, matraces, frascos, etc, se cierran con
algodn graso o tapones metlicos para evitar la entrada o salida de los
microorganismos. Adems, cuando se usa algodn, ha de cubrirse ste con
un papel impermeabilizado. En el caso de las pipetas, se les coloca en la
boquilla un trocito de algodn que actuar como filtro, evitando la
contaminacin del operario con los microorganismos de la muestra y que
ste a su vez contamine la muestra. Una vez preparadas, se introducen en
estuches o cajas metlicas, o bien se envuelven individualmente en papel
satinado para ser posteriormente esterilizadas. Todo el material de vidrio se
esteriliza con calor seco, generalmente en un horno Pasteur.
El material de plstico desechable ya se suministra estril y listo para su
uso. Por ejemplo, las placas de Petri se introducen en bolsas de plstico
selladas y se esterilizan con xido de etileno o radiaciones.
Las soluciones y medios de cultivo lquidos se envasan en matraces o tubos
y se esterilizan, generalmente, en autoclave.
Existen varios mtodos para llevar a cabo el proceso de esterilizacin y
la eleccin de uno determinado viene condicionado por el tipo de material que
se quiere esterilizar.
Objetivos:
Conocer de la importancia de la esterilizacin y familiarizarse con el
manejo de los procedimientos ms frecuentemente utilizados para llevarla a
cabo.
Material:
Mechero Bunsen, horno Pasteur o estufa de aire caliente, autoclaves,
equipos de filtracin y materiales a tratar.
Tcnicas:
El mtodo ms comnmente empleado para destruir los microorganismos
es el calor, entre otras razones porque es el ms econmico y el ms fcil de
controlar. El calor utilizado en con este fin puede aplicarse en forma de calor
seco o de calor hmedo. El calor seco destruye los microorganismos por
efectos de oxidacin y se requieren temperaturas muy elevadas. El calor
hmedo elimina los microorganismos a temperaturas menores, ya que la
10

presencia de agua acelera la rotura de los puentes de hidrgeno responsables

de la estructura terciaria de las protenas, haciendo que stas se
desnaturalicen y pierdan por tanto su funcionalidad.
La esterilizacin por calor seco puede hacerse por flameado o mediante
estufas de aire caliente.
I) Flameado: Se emplea para esterilizar asas e hilos de siembra, pinzas,
esptulas, etc. Consiste en someter directamente a la accin de la llama de un
mechero Bunsen los utensilios que se vayan a esterilizar. Este mtodo es
rpido y su eficacia es altsima, sin embargo no se puede aplicar a objetos
termolbiles.
II) Esterilizacin por aire caliente: Se lleva a cabo en estufas de aire
caliente y consiste en colocar los objetos que se van a esterilizar, debidamente
protegidos para que no se contaminen una vez esterilizados, en el interior de
una estufa. Este procedimiento se utiliza para esterilizar material de vidrio:
pipetas, matraces, tubos, etc. u otros materiales termorresistentes. Las
temperaturas a las que se someten estos materiales son muy elevadas (160180C durante cerca de 2 horas).
Estas temperaturas no pueden utilizarse para esterilizar lquidos (como
medios de cultivo), ya que al llegar a los 100C comenzaran a hervir y
continuaran hirviendo sin elevar su temperatura por encima del punto de
ebullicin del agua a presin atmosfrica, y a esta temperatura las endosporas
bacterianas pueden sobrevivir durante horas. Pero incluso en muestras en las
que supisemos que no existen endosporas, esta metodologa puede implicar
cambios en la concentracin de los componentes del medio, a causa de la
fuerte evaporacin sufrida.
El calor hmedo tambin se utiliza para la destruccin de los
microorganismos siendo, como ya se ha comentado, a igual temperatura,
mucho ms eficaz que el calor seco; con este tratamiento las enzimas se
desnaturalizan rpidamente, al igual que las membranas celulares. Adems, el
vapor de agua, especialmente si se genera a sobrepresin, es un eficaz
transmisor de calor al interior de la clula microbiana. Se puede aplicar
utilizando varios mtodos: ebullicin, vapor fluente y vapor saturado a presin:
I) Ebullicin: El agua hirviendo (100C) tiene accin limitada, ya que
aplicada durante 10 minutos va a destruir las formas vegetativas de los
microorganismos, pero las endosporas bacterianas pueden sobrevivir incluso a
tratamientos prolongados. Se podra utilizar el bao Mara o bao de agua
hirviente (slo con fines de desinfeccin en el laboratorio), cuando no se
necesita alcanzar la esterilidad o cuando no se dispone de otros mtodos
mejores, tanto para material (pinzas, tijeras, escalpelos, etc) como para medios
de cultivo que no puedan esterilizarse en autoclave.
II) Vapor fluente: Esta tcnica se emplea con frecuencia para esterilizar
medios de cultivo que no se puedan someter a una temperatura superior a
100C sin que pierdan alguna de sus propiedades, como leche, azcares,
suero, etc. Se utiliza un autoclave a presin atmosfrica, con la espita abierta,
donde nunca se superan los 100C, y se realiza el proceso durante tres das
consecutivos, dejndose a temperatura ambiente en los intervalos entre dos
tratamientos. La muestra se somete a calentamiento (100C) durante 30-45
11

minutos destruyndose en este proceso las formas vegetativas pero no las

endosporas termorresistentes. Si stas se encuentran presentes en la muestra
germinan despus del calentamiento y estas formas vegetativas sern
destruidas en los siguientes ciclos.
Este mtodo de esterilizacin se denomina tambin esterilizacin
fraccionada o tindalizacin.
III) Vapor saturado a presin: La esterilizacin por esta tcnica utiliza
vapor de agua saturado que se somete a una atmsfera extra de presin sobre
la presin atmosfrica normal, elevndose con ello el punto de ebullicin del
agua de 100C a 121C y consiguindose la destruccin de todos los
microorganismos (salvo los termfilos extremos) en un tiempo de 15 a 20
minutos. Esta temperatura es tambin necesaria para la destruccin de las
endosporas bacterianas, que presentan una alta resistencia trmica y que
pueden sobrevivir, como ya se ha indicado, a 100C durante horas. El vapor
de agua difunde por smosis a travs de las membranas de las esporas,
coagulando su protoplasma, fenmeno que se acenta si el vapor es saturado
y a sobrepresin. Esta tcnica de esterilizacin requiere el uso del autoclave.
El autoclave permite elevar la
presin una o dos atmsferas sobre
la presin atmosfrica, elevndose
con
ello
la
temperatura
de
ebullicin
del
agua
que
se
encuentra en su interior.
Consta
de
un
recipiente
metlico, generalmente de acero
inoxidable, similar a una gran olla,
en cuyo interior se introduce el
material a esterilizar que se coloca
sobre
una
rejilla
o
placa
Autoclave de cuba horizontal
agujereada. Despus de cerrar
cuidadosamente la tapa, se conecta la fuente de calor y comienza a elevarse la
temperatura en su interior. La salida continua del chorro de vapor a travs de
la vlvula nos indica que el aire contenido en el interior del autoclave ha sido
eliminado. La eliminacin de este aire es importante ya que la difusin del
calor entre el vapor de agua y el aire es pobre, por lo que no se alcanzar la
temperatura esperada a la presin elegida y no se conseguir la esterilizacin.
La vlvula se cierra cuando slo sale vapor de agua y, a partir de ese
momento, comienza a elevarse la presin hasta una atmsfera sobre la presin
normal, elevndose como consecuencia la temperatura hasta 121C.
Transcurridos 15-20 minutos, en estas condiciones, el material se ha
esterilizado. Es el incremento de temperatura por encima de los 100C y no la
presin la que destruye los microorganismos.
Si se esterilizan volmenes grandes de lquidos, es necesario mantener el
material en el autoclave durante perodos de tiempo ms prolongados, pues se
tarda ms en alcanzar los 121C en el centro de un gran volumen.
Una vez transcurrido el tiempo necesario, se apaga el autoclave y se deja
descender la temperatura hasta que el indicador marque menos de 80C, que
ser cuando la presin haya descendido hasta presin atmosfrica. Se abre
ligeramente la espita para comprobar que no queda vapor a presin en el
interior y ya se puede proceder a retirar todo el material esterilizado, dejndolo
enfriar a temperatura ambiente.
12

El autoclave se utiliza para esterilizar medios de cultivo, instrumentos,

ropas, soluciones, jeringas, etc que puedan soportar altas temperaturas y una
atmsfera de sobrepresin.
Para la esterilizacin de materiales lquidos sensibles al calor, como
algunos medios de cultivo, soluciones de antibiticos, enzimas, vacunas, etc, o
tambin para gases, se utiliza la filtracin. En la esterilizacin por calor se
destruyen los microorganismos del medio, mientras que la filtracin los retira
de una forma mecnica, en lugar de destruirlos.
La filtracin es el paso de un lquido o gas a travs de un material
filtrante, con poros lo suficientemente pequeos como para retener clulas
microbianas. Los filtros que se utilizan en la actualidad son, generalmente, los
denominados filtros de membrana y estn integrados por pequeas piezas de
material sinttico, generalmente acetato de celulosa o policarbonato, que
pueden tener poros con tamaos de 0,22 y 0,45 m, diseados para retener
bacterias. La accin combinada de los poros, la trama del filtro y la naturaleza
qumica del material utilizado retiene los microorganismos, pero no el fluido.
Los fluidos que se van a filtrar pasan a travs de la membrana con la ayuda
del vaco generado, por ejemplo, con una bomba de vaco.
Tanto los filtros de membrana como los equipos de filtracin con los que
stos se usan deben ser esterilizados por otros mtodos, generalmente el
autoclave.
Los virus y algunas bacterias de tamao muy pequeo como, por ejemplo,
los micoplasmas, no son retenidos por los filtros habituales.

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OBSERVACIN DE MICROORGANISMOS
Introduccin:
La morfologa de los microorganismos puede examinarse de dos formas:
observando microorganismos vivos sin colorear (en fresco) y observando
clulas muertas teidas con colorantes.
El examen en fresco de los microorganismos permite conocer algunas de
sus caractersticas (morfologa, tamao, movimiento, etc). Sin embargo, las
microorganismos vivos son casi incoloros y no se pueden visualizar fcilmente
al microscopio ptico normal cuando se encuentran suspendidos en agua, de
ah que se utilicen colorantes para incrementar su contraste con el entorno
que los rodea y de esta forma hacerlos visibles.
Los colorantes son compuestos aromticos solubles en agua
(generalmente en forma de sales), que contienen un in orgnico coloreado y
otro in inorgnico.
Pueden dividirse en dos grupos: cidos y bsicos. El colorante es cido si
la porcin coloreada tiene carga negativa, es decir, si tiene un anin coloreado,
siendo en este caso repelido por estructuras de la clula que presenten la
misma carga, como es el caso de la superficie bacteriana. El colorante se
denomina bsico si la porcin coloreada es el catin, cargado positivamente y
con afinidad por estructuras de la clula con carga negativa, como es la
superficie celular.
Las bacterias toman mejor los colorantes bsicos, como son el cristal
violeta, el azul de metileno y la safranina. La eosina es un colorante de tipo
cido, as como la nigrosina.

EXAMEN EN FRESCO
Objetivo:
Observar microorganismos vivos en el microscopio de campo claro.
Estudiar su morfologa y agrupacin, apreciar las diferencias de tamao entre
organismos procariticos y eucariticos y aprender a diferenciar el movimiento
browniano de la movilidad de los microorganismos.
Material:
Asa de siembra, portaobjetos y cubreobjetos (o portaobjetos excavados),
cultivos de microorganismos (Proteus mirabilis y Saccharomyces spp.) y
microscopio.
Tcnica:
Para la observacin de microorganismos sin teir se pueden utilizar dos
tipos de preparaciones: montaje hmedo y montaje en gota pendiente.
En el primer caso, depositar una gota de la muestra tomada con asa
de siembra previamente flameada, en un portaobjetos y colocar sobre
la misma un cubreobjetos presionando suavemente.
14

En el segundo caso, depositar una gota de la muestra en el centro de

un cubreobjetos limpio y colocarlo invertido sobre el pocillo de un
portaobjetos excavado, de manera que la gota no se mueva ni tome

contacto con los lados o el fondo de la depresin.

Utilizar el microscopio con el objetivo de 40 aumentos, disminuyendo la
cantidad de luz incidente sobre la muestra con ayuda del diafragma o bajando
el condensador. Un exceso de luz dificultar la observacin de los
microorganismos, ya que poseen el mismo ndice de refraccin que el medio
circundante (el vidrio del portaobjetos y el lquido en el que se encuentran
suspendidos).
Si se utiliza el objetivo de inmersin se debe colocar una gota de aceite de
inmersin sobre el cubreobjetos.
Para reducir la evaporacin de la muestra con el calor desprendido por el
foco luminoso y que los microorganismos pierdan su movilidad, debe realizarse
la operacin rpidamente o bien sellar los bordes del cubreobjetos con
parafina.
Observar la forma y el tamao de los microorganismos, comparando las
levaduras (clulas eucariticas) con las bacterias (clulas procariticas).
Describir su movilidad, diferenciando el movimiento browniano, debido a la
colisin de los microorganismos con las molculas del lquido que los rodea, de
la verdadera movilidad. La movilidad se manifiesta por el desplazamiento de
los microorganismos a grandes distancias y en una direccin determinada,
aunque a veces pueden apreciarse rotaciones o giros. Los desplazamientos
cortos y sin sentido se deben al movimiento browniano.

TINCIN DE LOS MICROORGANISMOS

Existen distintos tipos de tincin:
1.-Tincin simple: Aquella en la que slo se utiliza un colorante, que
generalmente tie a los microorganismos. Este tipo de tincin se denomina
directa.
Si el colorante proporciona una coloracin al fondo, sin alterar el aspecto
de las clulas, que permanecen sin teir, la tincin se denomina negativa.
La tincin simple permite observar morfologa celular, tamao y
agrupacin de los microorganismos.
2.-Tincin diferencial: Es aquella que emplea secuencialmente dos
colorantes que permiten distinguir tipos de microorganismos en funcin de
diferencias en su estructura y composicin qumica. La tincin de Gram y la
cido-alcohol-resistente, basadas en las propiedades de la pared celular
bacteriana, son las ms utilizadas.

15

3.-Tincin estructural: Se utiliza para identificar y estudiar

determinadas estructuras que pueden estar presentes en los microorganismos.
En las tinciones estructurales se colorea nicamente una parte de la clula.
Se utilizan este tipo de tinciones para poner en evidencia la presencia
de cpsulas, endosporas, flagelos o inclusiones (almidn, polifosfato, etc.).
Tcnica general:
En la mayora de los casos, los pasos a seguir son los que se indican a
continuacin:
Tcnica de extensin de una muestra sobre portaobjetos.

Realizar una extensin con el asa de siembra esterilizada, para ello se toma
una pequea gota de cada uno de los cultivos y se extiende en un
portaobjetos limpio. Si el cultivo procede de un medio slido, se coloca una
gota de agua en el portaobjetos y se mezcla con una pequea porcin de la
muestra hasta formar una suspensin homognea, extendindola con el fin
de obtener una fina pelcula. Posteriormente, se deja secar al aire o en la
parte alta de la llama del mechero, pero no se debe eliminar el lquido
calentando el portaobjetos a la llama porque pueden distorsionarse las
clulas.
Fijar la muestra. La fijacin tiene como finalidad coagular el protoplasma
de las clulas y hacer que se adhieran al portaobjetos, siendo el calor el
mtodo ms utilizado para la fijacin, aunque pueden utilizarse otros
agentes, como el alcohol (metanol) u otros compuestos qumicos. La fijacin
con calor se recomienda cuando se trabaja con muestras de un cultivo
slido; en muestras obtenidas de un cultivo lquido es mejor hacer la
fijacin con metanol ya que se retienen en el portaobjetos un mayor
nmero de clulas. Es necesario que la extensin se haya secado antes de
proceder a la fijacin, por ello se debe esperar hasta que el lquido de la
misma se evapore. La fijacin por calor se lleva a cabo pasando varias veces
la preparacin seca a travs de la llama de un mechero, con la extensin
hacia arriba. El calor desnaturaliza las protenas y suele matar al
microorganismo. Es importante no excederse en este proceso, para evitar
que las bacterias se deformen o se rompan, siendo suficiente que el
portaobjetos se note caliente sobre el dorso de la mano, pero no demasiado.
Realizar la coloracin. Para ello es necesario cubrir la preparacin con
abundante colorante y dejarlo actuar durante algn tiempo.
Pasado ese tiempo, lavar con agua las preparaciones teidas para eliminar
el exceso de colorante, dejando caer con suavidad el agua sobre un extremo
del portaobjetos, que se mantendr inclinado durante este proceso. No se
16

Procedimiento general para realizar una tincin

debe dirigir el agua con demasiada fuerza sobre la preparacin para no

arrastrar la muestra.
Eliminar el exceso de agua del portaobjetos golpendolo ligeramente por el
canto; este proceso debe realizarse con cuidado. Permitir que se seque la
preparacin, bien utilizando un papel secante, sin frotar o bien dejndola
secar al aire, aunque lleva ms tiempo.
Examinar la preparacin al microscopio, con el objetivo de inmersin
(100x), colocando, previamente, una gota de aceite de inmersin sobre la
preparacin.

TINCIN SIMPLE
Objetivo:
Estudiar las caractersticas de los microorganismos en cultivo, es decir,
tamao, forma y agrupacin de las clulas.
Material:
Asa de siembra, portabojetos, cultivos bacterianos de microorganismos
(Escherichia coli y Staphylococcus aureus), colorantes, microscopio y aceite de
inmersin.
Tcnica:
Preparar extensiones de los distintos microorganismos, dejar secar al aire y
proceder a su fijacin.
Realizar la coloracin cubriendo la preparacin con abundante colorante y
dejarlo actuar durante algn tiempo. Para la fuchsina fenicada bastan de
15 a 30 segundos, para el cristal violeta es suficiente de 30 a 45 segundos y
para el azul de metileno de 3 a 5 minutos.
Lavar con agua las preparaciones teidas y continuar con la tcnica tal y
como se indica previamente.
Examinar la preparacin al microscopio con el objetivo de inmersin.
Observar la forma y disposicin de los microorganismos teidos con el
colorante.

17

TINCIN NEGATIVA
Objetivo:
Conocer la morfologa de los microorganismos, realizando una coloracin
del fondo, sin que se coloreen las bacterias o las estructuras que se tratan de
observar.
Material:
Asa de siembra, portaobjetos, cultivo bacteriano de microorganismos
(Escherichia coli y Staphylococcus aureus), nigrosina al 10%, microscopio y
aceite de inmersin.
Tcnica:
Depositar una gota de la suspensin de microorganismos, con el asa de
siembra previamente esterilizada, sobre un portaobjetos
Aadir una gota de solucin de nigrosina al 10%.
Mezclar totalmente y dejar secar al aire.
Hacer una extensin en otro portaobjetos mezclando una cierta cantidad de
sarro dentario, extrado recientemente con un palillo estril, con una gota
de solucin de nigrosina, hasta conseguir una suspensin homognea. A
continuacin dejar secar al aire.
Examinar las dos preparaciones con el objetivo de inmersin. Los
microorganismos aparecern sin teir, en contraste con el fondo oscuro,
pudindose apreciar su forma y agrupacin caractersticas.
TINCIN DIFERENCIAL
La tincin diferencial colorea selectivamente ciertos tipos de clulas, ya
que los colorantes que se utilizan reaccionan de modo diferente con los
distintos microorganismos, generalmente debido a diferencias en la estructura
y/o composicin qumica de la pared celular de stos.
Estas tcnicas son de gran inters en la identificacin y la clasificacin
de las bacterias, y la ms utilizada es la tincin de Gram.
Tincin de Gram: Es uno de los procedimientos de tincin ms tiles en
la identificacin de microorganismos, ya que divide a stos en dos grandes
grupos: Gram positivos y Gram negativos. En esta tcnica es necesario utilizar
varias soluciones:
1.- Un primer colorante bsico, generalmente cristal violeta, que se aplica
sobre la muestra y que reacciona con las clulas (cargadas negativamente),
colorendolas.
2.- Un mordiente, que incrementa la afinidad entre el primer colorante y
las clulas. Parece ser que el mordiente (solucin diluida de yodo) se combina
con el colorante, para formar un compuesto insoluble coloreado en el interior
de la clula.
18

3.- Un agente decolorante, como el etanol de 95% o la mezcla alcoholacetona (1:1), que son disolventes orgnicos capaces de eliminar el primer
colorante de algunas bacterias, decolorndolas.
4.- Un colorante de contraste, igualmente de carcter bsico pero de
distinto color que el primer colorante. Generalmente se suele utilizar la
safranina, de color rosa, que contrasta con el color violeta del primer
colorante, y que teir slo a las bacterias decoloradas en el paso anterior.
Los organismos que resisten la decoloracin y retienen el complejo cristal
violeta-yodo aparecern de color violeta oscuro al microscopio y se denominan
Gram positivos. Aquellos que pierden el color inicial del cristal violeta tras la
decoloracin, se clasifican como Gram negativos y toman el color rosa debido
al segundo colorante, la safranina.
Las diferencias qumicas en sus paredes celulares, son las que permiten o
no la salida del complejo cristal violeta-yodo. Las bacterias Gram positivas
tienen una pared celular gruesa, compuesta principalmente por
peptidoglucano, mientras que en Gram negativas, aunque la pared est
tambin constituida por pptidoglucano, es ms delgada y presenta adems
una membrana externa con lipopolisacridos. Las paredes de las bacterias
Gram positivas tratadas con alcohol sufren una deshidratacin y sus poros se
contraen, dificultando la salida del complejo cristal violeta-yodo. En las Gram
negativas, el alcohol desorganiza la capa lipdica ms externa y lava el
colorante de la delgada capa de peptidoglucano.
La tincin de Gram es ms reproducible cuando se aplica a cultivos
jvenes de bacterias, ya que las bacterias Gram positivas, en la fase
estacionaria de crecimiento, pueden aparecer como Gram negativas.
Objetivo:
Aprender una tcnica de coloracin diferencial e interpretar los resultados
obtenidos en la misma, distinguiendo bacterias Gram positivas y Gram
negativas.
Material:
Asa de siembra, portaobjetos, cultivos bacterianos de microorganismos
(Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis y Neisseria spp.),
colorantes, solucin de lugol, etanol de 95%, microscopio y aceite de
inmersin.
Tcnica:
Preparar extensiones de los distintos microorganismos, que debern
encontrase en fase exponencial de crecimiento. Dejar secar al aire y proceder
posteriormente a la fijacin, siguiendo la tcnica ya descrita.
Para la coloracin se seguir el siguiente protocolo (modificacin de
Hucker):
Teir durante un minuto con la solucin cristal violeta.
Lavar el exceso de colorante con agua.
19

Cubrir la extensin con una solucin diluida de yodo (lugol), que actuar
como mordiente, durante un minuto.
Lavar con agua el exceso de lugol.
Decolorar con etanol de 95%, cubriendo la preparacin y dejando actuar
durante 30 segundos.
Lavar con agua abundante para eliminar el resto del disolvente.
Colorear con safranina durante un minuto (coloracin de contraste).
Lavar con agua y dejar que la preparacin se seque.
Examinar las preparaciones al microscopio, con aceite y usando el objetivo
de inmersin. Las bacterias Gram positivas aparecern coloreadas de
violeta, mientras que las Gram negativas se observan de color rosa.
A

Ejemplos de morfologa bacteriana al microscopio ptico

A. Staphylococcus en tincin Gram
B. Escherichia en tincin simple.
C. Bacillus en tincin Gram.
D. Bacillus en tincin negativa.

20

21

AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS
Introduccin:
En la naturaleza, la mayora de los microorganismos no se encuentran
aislados, sino integrados en poblaciones mixtas. Para llevar a cabo el estudio
de estos microorganismos y de sus propiedades, es necesario separar unos de
otros y trabajar con especies aisladas, obteniendo cultivos axnicos o puros.
Un cultivo axnico o puro es aquel que contiene un slo tipo de
microorganismo y que procede generalmente de una sola clula; el crecimiento
de sta origina, en medio slido, una masa de clulas fcilmente visible que
recibe el nombre de colonia.
Para obtener cultivos axnicos o puros a partir de una poblacin
microbiana mixta, se utilizan las denominadas tcnicas de aislamiento, que
fueron desarrolladas durante el siglo XIX. En un principio, Lister utiliz
diluciones seriadas en medio lquido con esta finalidad, pero la presencia de
contaminacin, es decir, de microorganismos no deseados, dificult el
aislamiento. La escuela de Robert Koch introdujo los medios slidos,
complementados con agar, y las placas de Petri en Bacteriologa, permitiendo
as la separacin fsica de las colonias sobre la superficie del medio de cultivo
o en el interior del mismo.
El aspecto de las colonias sirve para diferenciar distintas especies
microbianas.
Objetivos:
Familiarizarse con el manejo de microorganismos y con las tcnicas de
aislamiento en placa de Petri.
Obtener colonias separadas, utilizando uno o ms mtodos.
Estudiar la morfologa de cada colonia.
Material:
Asa de siembra, cayado, placas de Petri con medio de cultivo slido y
cultivo de microorganismos.
Tcnicas:
Existen distintas tcnicas que pueden ser usadas:
a) Extensin en superficie con cayado:
Depositar sobre la superficie de una placa con agar nutritivo una gota
0,1 ml de una determinada dilucin del cultivo de microorganismos problema
y extenderlo con ayuda del cayado, previamente esterilizado, en todas las
direcciones hasta que est completamente seco. Incubar la placa, en posicin
invertida, a la temperatura deseada (durante 24, 48 72 horas) segn el tipo
de microorganismo. La posicin invertida evitar que el agua de condensacin
se deposite sobre la superficie del medio, dificultando la obtencin de colonias
aisladas.

22

Es una tcnica usada para el aislamiento de colonias, que permite

igualmente el recuento de bacterias viables en la muestra, si conocemos
exactamente el volumen de muestra sembrado.

Serie de
diluciones
conocidas de
la muestra

Cayado

Siembra por extensin en superficie para recuento.

b) Estra mltiple en superficie:

Con un asa de siembra, previamente esterilizada, se toma una muestra
del cultivo de microorganismos y se extiende sobre un rea pequea de la
superficie de la placa con agar nutritivo, en forma de estras muy juntas, pero
sin hacer presin para no daar el agar.
Se flamea el asa, se enfra y despus de rozar la siembra realizada
previamente, se extiende de nuevo por otra zona de la placa haciendo nuevas
estras. Este proceso se repite sucesivamente, flameando y enfriando el asa al
comienzo de las sucesivas siembras en estra. Se lleva la placa a incubar, a la
temperatura adecuada, siempre en posicin invertida.

Carga (1 estra)

Primera diseminacin

(2 estra)
Tcnica de aislamiento por estra en superficie

Segunda diseminacin

(3 estra)

ltima diseminacin

(4 estra)

Mediante esta tcnica se obtienen colonias aisladas a partir de una

muestra que contenga un elevado nmero de bacterias.
c) Dilucin en masa:
En una placa de Petri vaca se deposita un pequeo volumen conocido de
muestra y a continuacin se aade el medio de cultivo (agar nutritivo) fundido
23

y atemperado aproximadamente a 45C. Se mezclan ambos por rotacin suave

de la placa. De esta forma los microorganismos se distribuirn de forma
homognea en el medio de cultivo, permitiendo el desarrollo de colonias
separadas por todo el agar.
Otra variacin de esta tcnica consiste en inocular el medio de cultivo,
fundido y atemperado, contenido en un tubo, con un determinado volumen de
la muestra. La homogeneizacin de la muestra y el medio de cultivo se realiza
por rotacin del tubo entre las manos, antes de verterlo sobre la placa.
En ambos casos, trs homogeneizacin, se dejan enfriar las placas hasta
que se solidifique el medio y posteriormente se incuban a la temperatura
adecuada (siempre en posicin invertida).
Aunque con esta tcnica se obtienen colonias aisladas, generalmente slo
se utiliza para determinar el nmero de microorganismos viables en una
muestra, cuando stos son anaerobios facultativos o microaerfilos.

Inculo
calibrado

Medio
fundido
atemperado

Homogeneizar
Siembra por dilucin en masa o inclusin en agar

Resultados:
a) Extensin en superficie: Tras el perodo de incubacin se examinarn
las placas. Las colonias aparecen sobre la superficie, distribuidas
uniformemente si la siembra se ha realizado de forma correcta. Podrn
diferenciarse las colonias de acuerdo a su tamao, forma, color, textura, etc.
Esta tcnica de siembra, adems de permitir que se distingan las colonias
por su morfologa, permite el recuento de microorganismos viables. La
expresin de este recuento se hace en unidades formadoras de colonias
(UFC) ya que cada una procede de un slo microorganismo (o de un grupo de
microorganismos, pues en algunos casos stos tienden a formar agregados). A
partir de las colonias aisladas, los microorganismos pueden transferirse a
otros medios de cultivo para su estudio.
b) Por estra mltiple en superficie: Tras la incubacin, se observarn las
colonias aisladas en alguna regin de la placa inoculada. Con esta tcnica se
logra la separacin de los microorganismos que se encuentran en un cultivo
mixto, o bien que proceden de muestras homogneas, pero en las que existe
un elevado nmero.
24

En las zonas donde existen colonias aisladas se puede estudiar la

morfologa colonial.
c) Dilucin en masa: Aparecen las colonias distribuidas por toda la masa
del agar. Aquellas que estn en la superficie tendrn distintas caractersticas,
dependiendo del tipo microbiano, mientras que las colonias que se desarrollan
en el interior, bajo la superficie del agar, tienen forma lenticular, aunque los
microorganismos que formen las distintas colonias sean de distinto tipo. Por
tanto, las colonias que aparecen en la profundidad del agar son siempre
biconvexas y no se diferencian unas de otras por su morfologa.

Aislamiento por estra en superficie

Forma

Borde

Puntiforme

Entero

Elevacin
Plana

Circular
Ondulado
Rizoide
Lobulado
Irregular
Filamentosa

Aislamiento por dilucin en masa

Filamentoso

Superficie
Lisa o rugosa

Elevada

Mate o brillante

Convexa

Seca o cremosa

Crateriforme

Invasiva o superficial

Acuminada

Aspectos ms comunes de las diversas colonias microbianas aisladas sobre medio

slido.

25

TIPOS DE SIEMBRAS
Objetivos:
Aprender a inocular distintos medios de cultivo contenidos en tubo: caldo,
agar inclinado y medio semislido sembrado en profundidad.
Observar el crecimiento bacteriano en los distintos medios de cultivo.
Observar el crecimiento de microorganismos en ausencia de oxgeno.
Comprobar la movilidad de determinados microorganismos.
Material:
Asa de siembra, hilo de siembra, pipetas Pasteur o pipetas graduadas,
suspensin de microorganismos y tubos con medio de cultivo lquido, slido
inclinado y semislido.
Tcnica:
a) En medio lquido con asa: Transferir aspticamente, con el asa de
siembra, una pequea muestra de los microorganismos, desde el tubo que
contiene el material problema al tubo con medio de cultivo estril. Sumergir el
asa en el lquido y agitar para desprender y diluir la muestra. Incubar el tubo
recin sembrado en estufa, durante 24-48 horas a la temperatura ptima de
crecimiento.

Muestra

Inoculacin

Incubacin

Inoculacin de un caldo de cultivo (ver tambin figura III, pg. 5).

b) En medio lquido con pipeta: Introducir aspticamente la pipeta

Pasteur o la pipeta graduada en el medio lquido que contiene los
microorganismos y, aspirando de forma adecuada, sacar una cantidad
establecida de material que se transfiere al tubo con medio de cultivo estril.
Incubar en estufa durante 24-48 horas a la temperatura ms adecuada.
c) En medio slido (agar inclinado): Con el asa de siembra estril tomar
los microorganismos de la muestra e inocular el tubo realizando un
movimiento de zig-zag en la superficie. El proceso se inicia en el fondo y se va
avanzando hacia arriba por el rea inclinada.
Incubar en estufa durante 28-48 horas a la temperatura ms adecuada.
26

Siembra en
zig-zag en la
superficie
Asa de
siembra

Muestra

Medio (agar inclinado)

Siembra en un tubo de
agar inclinado

d) En medio semislido: La siembra en este tipo de medio, que contiene

una proporcin menor de agar que los medios slidos y que se envasa en
tubos, se lleva a cabo con un hilo de siembra esterilizado, con el cual se toma
la muestra. El medio queda inoculado al introducir el hilo en profundidad
hasta el fondo del tubo, retirndolo posteriormente por la misma trayectoria
utilizada al realizar la picadura. Una siembra con asa o con un cierto
movimiento de vaivn podra originar un patrn de crecimiento que se
interpretara errneamente como movilidad bacteriana.
Incubar durante 24-48 horas a la temperatura ptima de crecimiento.

Puncin
limpia

Filamento

Muestra

Medio (agar semislido)

Inoculacin de un
medio semislido
por picadura con
hilo de siembra.
dedededsiembrafil
amento

Resultados:
a y b) En los cultivos lquidos no tiene lugar la formacin de colonias, por
lo tanto se examinar la existencia de enturbiamiento ms o menos intenso, la
formacin de una pelcula o velo sobre la superficie, la aparicin de sedimento
27

en el fondo del tubo, etc. La utilizacin de medios de

cultivo lquidos permite la obtencin de una poblacin
microbiana grande, con un elevado nmero de
microorganismos, para ser utilizados posteriormente.
c) En medio slido (agar inclinado) se observar el
aspecto general del medio y la aparicin de crecimiento
sobre su superficie. Este tipo de siembra permite el
cultivo de microorganismos aerobios o anaerobios
facultativos. Adems, se utiliza para almacenar cultivos
durante cortos perodos de tiempo, a temperaturas de
4C.

Aspecto de
cultivos en
agar inclinado
(A) y
semislido (B)
tras la
incubacin.

d) En medio semislido se podr comprobar si el

microorganismo es o no mvil, ya que en el primer caso
se observar que el crecimiento difunde alrededor de la
zona donde se hizo la picadura, detectndose turbidez.
Por eso es tan importante que, cuando se inocula el
medio de cultivo, no se distorsione el agar y se vuelva a
sacar el hilo por el mismo sitio de inoculacin. Los
microorganismos inmviles crecern nicamente a lo
largo de la picadura.
Este tipo de siembra en picadura sirve, tambin,
como
otro
de
mtodo
de
conservacin
de
microorganismos anaerobios facultativos.

3
Prueba de movilidad en agar
semislido.
1. Microorganismo mvil,
2. Microorganismo inmvil
3. Tubo control sin
inocular

28

29

CULTIVO DE ANAEROBIOS
Objetivo:
Conseguir el crecimiento de microorganismos anaerobios, en ausencia de
oxgeno, utilizando diversas tcnicas.
Material:
Asa de siembra, medios de cultivo (segn la tcnica utilizada), parafina
estril, jarra de anaerobiosis y suspensin de Clostridium. Para comparar el
tipo respiratorio, se emplearn tambin otros microorganismos que no sean
anaerobios estrictos, como Escherichia coli y Micrococcus luteus.
Tcnicas:
a) Siembra en profundidad:
En tubo con medio slido vertical o semislido: Se utilizan los medios V.L.
(Viande et levures, Buttiaux et al.) o medio fluido de tioglicolato, que deben ser
hervidos en un bao Mara durante 15 20 minutos, antes de ser inoculados,
para eliminar el oxgeno disuelto. Sembrar los medios, una vez atemperados a
45-50C. Con el asa de siembra o con una pipeta Pasteur estril, con el
extremo cerrado, se realiza un movimiento en espiral de arriba a abajo y de
abajo a arriba, para distribuir la muestra homogneamente, sin agitar el tubo
durante la siembra para evitar la entrada de aire. Con la misma finalidad,
solidificar rpidamente el medio de cultivo sumergiendo el tubo en agua fra.
Estos medios pueden utilizarse tambin para determinar el tipo
respiratorio, como se describe en los resultados.
Si el medio utilizado es lquido, agregar una capa de parafina estril para
impedir la difusin del O2 al medio.
Incubar en estufa durante 24-48 horas a la temperatura ms adecuada.
En placa: Transferir 1 ml del inculo a una
placa de Petri estril vaca y aadir el medio de
cultivo
fundido
y
atemperado
a
45-50C,
homogeneizando mediante giros repetidos de la
placa, hasta que el inculo se haya distribuido
uniformemente. Una vez solidificado el agar, aadir
una segunda capa de medio de cultivo.
b) Siembra en superficie:
Estra mltiple: La siembra por estra en
superficie
tambin
puede
hacerse
con
microorganismos anaerobios, pero en este caso, las
Jarra de anaerobiosis
placas no se llevan a incubar directamente, sino que
se introducen en una jarra especial en la que exista
un ambiente libre de oxgeno, denominada jarra de anaerobiosis.
Para crear un ambiente de anaerobiosis en el interior de estas jarras, se
utiliza una preparacin comercial que elimina el O2 y desprende CO2. La
30

atmsfera va reducindose y, para verificar que el ambiente es anaerbico, se

coloca dentro de la jarra una tira de papel impregnada en un indicador que
vira de color en presencia de CO2. El indicador suele ser azul de metileno, que
es de color azul cuando se expone al aire y se vuelve incoloro cuando est
totalmente reducido.
Incubar las placas dentro de la jarra de anaerobiosis durante 48 horas a
la temperatura ms adecuada.
Resultados:
a) En medio slido vertical (V.L.)
o
semislido
(tioglicolato)
los
microorganismos pueden crecer en
la parte superior del medio si son
aerobios estrictos, en la zona inferior
del medio si son anaerobios
estrictos, a lo largo de todo el medio,
en
el
caso
de
anaerobios
facultativos.
Si
se
trata
de
microorganismos
microaerfilos,
aparecer
crecimiento
en
una
pequea zona intermedia, prxima a
la superficie.
Observar tambin el aspecto de
las colonias y el desprendimiento de
gas.
En la siembra en placa en
profundidad, se debe anotar si ha
habido crecimiento de colonias en
toda la masa del agar.
b) Estra mltiple en superficie
observar el crecimiento, teniendo en
cuenta que la placa ha sido
incubada
en
ambiente
de
anaerobiosis. En las zonas donde se
hayan obtenido colonias aisladas
estudiar su morfologa.

Comportamiento de los
microorganismos en tubos VL:
1. Aerobios estrictos
2. Anaerobios estrictos
3. Anaerobios facultativos
4. Anaerobios aerotolerantes
5. Microaerfilos

31

CONTROL MICROBIOLGICO AMBIENTAL

La tcnica de sedimentacin por gravedad permite determinar la carga
microbiana de un ambiente problema. Este tipo de control es caracterstico de
la evaluacin de la calidad microbiolgica de zonas estriles en la industria
farmacutica y en estudios de la microbiota en ambientes naturales. Los
microorganismos suspendidos en el polvo o aerosoles sedimementan sobre la
superficie de un medio rico y no selectivo contenido en una placa Petri. Pasado
el tiempo de toma de muestra ambiental, la placa debe mantenerse cerrada y
se incubar en las condiciones que favorezcan el crecimiento del tipo de
microorganismos que deseemos estudiar, normalmente a temperatura
ambiente y en aerobiosis, pues estas son las condiciones que prefieren los
microorganismos ambientales.
Objetivo:
Observar
y
caracterizar
someramente,
mediante
observacin
macroscpica y microscpica, la diversidad microbiana de un ambiente elegido
por el alumno.
Material:
Asa de siembra, una placa de Petri con agar nutritivo, portaobjetos,
colorantes para tincin simple y de Gram, solucin de azul de lactofenol, cinta
adhesiva transparente, microscopio y aceite de inmersin.
Tcnica:
Llevar la placa cerrada, con cuidado de que no se abra durante el
transporte, al ambiente cuya carga microbiolgica se desee evaluar. Retirar la
tapa y dejar la placa abierta, durante 30 minutos, en un lugar representativo
de dicho ambiente. Pasado este tiempo, cerrar la placa e incubarla a
temperatura de 25-30C, teniendo cuidado de nuevo de que no se abra
durante el transporte. La placa se incuba durante varios das.
Resultados:
Se observar la aparicin paulatina de diversos tipos de colonias.
Aparecern en primer lugar colonias bacterianas y al cabo del tercer da de
incubacin las caractersticas colonias algodonosas de los hongos
filamentosos. Se anotarn las caractersticas mas importantes de las colonias
y se realizar un estudio microscpico de cada una de ellas. Tras la tincin de
Gram de las distintas colonias bacterianas que aparezcan en la placa, se
observar todo tipo de microorganismos, con predominio de cocos y bacilos
Gram positivos, frecuentemente dispuestos respectivamente en sarcinas y en
cadenas. La observacin microscpica de hongos filamentosos se realizar
mediante tincin con azul de lactofenol. Para ello, se pone una tira de cinta
adhesiva sobre el micelio, con el fin de que hifas y esporas queden adheridas.
Se aade una gota de azul de lactofenol en el centro y se adhiere al
portaobjectos. El color azul facilita la visualizacin del micelio en fresco.
32

B
Morfologa de hongos al
microscopio ptico.
A. Levaduras
(Saccharomyces) en
tincin con cristal
violeta.
B. Penicillium Observacin
en fresco.
C. Mucor. Observacin en
fresco.
D. Aspergillus Observacin
en fresco.

33

ANTIBIOGRAMA POR DIFUSION EN AGAR

Objetivo:
Se pretende evaluar la sensibilidad o resistencia a diversos antibiticos de
una bacteria de crecimiento rpido aislada en prcticas anteriores. El mtodo
utilizado es el de difusin en agar o de Kirby-Bauer.
Preparacin del inculo:
La tcnica de antibiograma slo es aplicable a especies bacterianas en
cultivo puro. Por ello, previamente se proceder, si es preciso, a hacer un
aislamiento en placa.
Material:
Tubo con 10 ml de solucin salina y cultivo de la bacteria problema.
Tcnica:
Cultivar la bacteria aislada en un tubo de medio lquido apropiado (caldo
nutritivo, infusin cerebro-corazn) o preparar una suspensin directa a partir
del cultivo en placa usando el siguiente mtodo:
Tomar de una colonia aislada con el asa y resuspender en el tubo de
solucin salina frotando en la pared del
tubo (Figura 11.1).
Homogeneizar bien, y ajustar la
densidad ptica con un patrn de turbidez
n 0.5 de McFarland (0,5 ml de cloruro de
bario 0,048 M y 99,5 ml de cido sulfrico
0,36 M). Esto equivale aproximadamente a
una densidad de 108 clulas/ml. Diluir si
es necesario la suspensin o aadir ms
inculo.
Siembra y colocacin de los discos:
Material:
Placas con medio de cultivo MellerHinton, hisopo, pinzas y discos de 6 mm de
dimetro impregnados con antibitico.

Preparacin de una
Tcnica:
suspensin
Impregnar
una
torunda
con la
suspensin del inculo; escurrirla contra la
pared del tubo y sembrar con ella toda la superficie de la placa, mediante
estras cruzadas en varias direcciones. Antes de 15 minutos deben colocarse
los discos de antibiticos.
Con pinzas flameadas y fras (o con un aplicador automtico) se disponen
los discos sobre las placas, de forma que disten unos 15 mm del borde de la
placa y unos 30 mm entre s. En una placa de 9 cm caben 6 discos. Adherir
cada disco al agar presionando ligeramente con las pinzas.
A los 15 minutos se llevan a incubar, invertidas, a 35-37 C
34

Lectura:
Se realiza a las 16-20 horas. Medir el dimetro de los halos con calibrador
o regla graduada, considerando la zona que esta libre de crecimiento. En caso
de bacteriostticos es aceptable un ligero velo dentro del halo. La presencia de
colonias en el interior del halo indica contaminacin, cultivo mixto o aparicin
de resistencia.
Consultar el siguiente cuadro para interpretar el antibiograma. Teniendo
en cuenta la especie bacteriana y el antibitico, decidir si la bacteria es
sensible (S), resistente (R) o su sensibilidad no puede definirse con claridad
(intermedio o indeterminado: I).
ANTIMICROBIANO

PENICILINAS:
Penicilina G
Staphylococcus
Neisseria gonorrhoeae
Listeria monocytogenes
Enterococcus
Streptococcus -hemolitico
Streptococcus pneumoniae
Oxacilina
Staphylococcus
Ampicilina
Staphylococcus
Listeria monocytogenes
Streptococcus -hemoltico
Enterococcus
Haemophilus spp.
Enterobacterias
CEFALOSPORINAS:
Cefazolina,cefalotina y
cefuroxima
Ceftriaxona
Cefoperazona
Cefotaxima, moxalactama
Cefoxitina, cefotetn,
cefepima

Carga
del
disco

Dimetro del halo (mm)

Resistente Intermedio Sensible
()
()

10 U
28
26
19
16
18
10

27-46
19-25
11-12

29
47
20
17
26
13

1 g
10
13
28
19
18
16
18
13

19-21
14-16

13
17
29
20
26
17
22
17

30 g

14

15-17

18

30
75
30
30

13
15
14
14

14-20
16-20
15-22
15-17

21
21
23
18

10 g

g
g
g
g

11-12
14-16

19-25

35

ANTIMICROBIANO

Carga
del
disco

AMINOGLUCSIDOS:
Amicacina
30 g
Estreptomicina
300 g
Enterococcus (alto nivel de
resistencia)
Otras bacterias
10 g
Gentamicina, tobramcina
10 g
Kanamicina
30 g
Netilmicina
30 g
GLUCOPPTIDOS
Vancomicina
30 g
Enterococcus
Otras bacterias Gram(+)
MACRLIDOS Y LINCOSAMIDAS
Eritromicina
15 g
Streptococcus spp.
Otras bacterias Gram(+)
Clindamicina
2 g
TETRACICLINAS:
Doxiciclina
30 g
Tetraciclina
30 g
Haemophilus spp.
Neisseria gonorrhoeae
Streptococcus spp.
Otras bacterias
QUINOLONAS:
Acido nalidxico
30 g
Norfloxacina
10 g
Ciprofloxacina
5 g
Haemophilus spp.
Neisseria gonorrhoeae
Otras bacterias
OTROS ANTIMICROBIANOS:
Cloranfenicol
30 g
Haemophilus spp.
Streptococcus pneumoniae
Streptococcus spp.
Otras bacterias
Nitrofurantona
300 g
Rifampicina
5 g
Trimetoprm/
1,25/
/Sulfametoxazol
23,75
Streptococcus spp.
g
Otras bacterias

36

Dimetro del halo (mm)

Resistente Intermedio Sensible
()
()
14

15-16

17

7-9

10

11
12
13
12

12-14
13-14
14-17
13-14

15
15
18
15

<9
9

10-11
10-11

12
12

15
13
14

15-20
14-22
15-20

21
23
21

12

13-15

16

25
30
18
14

26-28
31-37
19-22
15-18

29
38
23
19

13
12

14-18
13-16

19
17

15

16-20

21
36
21

25
20
17
12
14
16

26-28
18-20
13-17
15-16
17-19

29
21
21
17
17
20

15
10

16-18
11-15

19
16

Antibiograma por
difusin en agar:
Respuesta de
Staphylococcus
aureus frente a
cuatro diferentes
antibiticos. Las
lneas indican el
dimetro del halo
de inhibicin.

37

AISLAMIENTO E IDENTIFICACIN DE Candida

albicans
Objetivo:
En esta prctica se plantea la deteccin de levaduras patgenas y la
identificacin presuntiva de Candida albicans.
La muestra utilizada proviene de un supuesto exudado, por ejemplo vaginal o
farngeo, tomado con el fin de diagnosticar una posible candidosis.
Material:

Torunda con muestra de exudado.

Tubo con agua destilada estril.
Tubo con 0,5 ml de suero de caballo.
Una placa de agar-sangre (ver Prctica 1).
Una placa de agar glucosado de Sabouraud. Es un medio selectivo para
hongos, debido a su pH cido (5,6). El efecto inhibitorio puede completarse
por adicin de antibiticos antibacterianos, como tetraciclina o
cloranfenicol.

Tcnica:
Siembra:

Se realiza con el hisopo segn el mtodo ya descrito (Prctica 1). Cuando se

pretende aislar nicamente hongos se emplear el medio de Sabouraud; en
caso contrario se utilizar agar-sangre. Lo mismo ocurre con la temperatura
de incubacin: 25C para hongos, y 37C para levaduras y bacterias
indistintamente.
Identificacin:

Las colonias de Candida albicans son blancas y cremosas, con olor a levadura.
Pueden observarse en fresco (a 40x) o teidas por el mtodo de Gram (los
hongos salen Gram-positivos, aunque no lo sea su pared) y a 100x.
Prueba de la filamentacin:

Resuspender una colonia aislada en 1 ml de agua destilada; tomar 2 3 gotas

de esa suspensin y aadirlas al tubo con suero de caballo. Incubar a 37C
durante 3 horas.
Examinar una gota entre porta y cubre (a 40x) en busca de filamentos.
Interpretacin:
La morfologa celular permite asegurar que se trata de una levadura. La
produccin de filamentos permite identificar presuntamente a Candida
albicans (tambin los produce Candida stellatoidea). La identificacin puede
38

confirmarse mediante pruebas bioqumicas y de necesidades nutricionales

(auxonograma).

39

OBSERVACIN MICROSCPICA DE LOS

MICROORGANISMOS DE LA MICROBIOTA ORAL
Introduccin:
Muchos de los microorganismos de la biota no son cultivables. Sin
embargo, se puede estudiar su morfologa y ciertas propiedades estructurales
mediante observacin microscpica. Para ello, se puede recurrir a la tcnica de
observacin en fresco o bien realizar tinciones. En el primer caso, se pueden
observar propiedades del microorganismo vivo, como la movilidad, para lo cual
requeriremos aumentar el contraste del microscopio de campo claro mediante
sistemas pticos de contraste de fases, interferencial-diferencial, diafragmas
de campo oscuro, etc. Los consorcios microbianos de la placa dental implican
a comunidades ssiles, por lo que este anlisis no resulta informativo a no ser
que estudiemos microorganismo planctnicos, por ejemplo, a partir de
muestras de saliva. Para ello se puede realizar un montaje hmedo, consistente
en depositar una gota de la muestra (5-10 l) tomada en un portaobjetos y
colocar sobre la misma un cubreobjetos presionando suavemente. Si se utiliza
el objetivo de inmersin se debe colocar una gota de aceite de inmersin sobre
el cubreobjetos. La observacin debe hacerse rpidamente antes de que la
muestra se evapore. De esta manera se puede observar la forma y el tamao
de los microorganismos, comparando las levaduras (clulas eucariticas) con
las bacterias (clulas procariticas), describir su movilidad, diferenciando el
movimiento browniano, debido a la colisin de los microorganismos con las
molculas del lquido que los rodea, de la verdadera movilidad. La movilidad se
manifiesta por el desplazamiento de los microorganismos a grandes distancias
y en una direccin determinada, aunque a veces pueden apreciarse rotaciones
o giros. Los desplazamientos cortos y sin sentido se deben al movimiento
browniano.
Para observar los microorganismos ssiles es aconsejable realizar tinciones
estructurales o morfolgicas por ello. La tincin de un consorcio microbiano
complejo, como los existentes en las distintas zonas de la cavidad oral
proporciona una aproximacin bsica al anlisis de su composicin y su
complejidad.
Toma de muestra:
Se introduce el palillo estril en la cavidad oral y recoge muestra en las
zonas en las zonas de anlisis: regiones expuestas de las piezas dentales,
surco gingival, lengua, mucosas, etc. evitando el contacto con otras zonas de
la boca.
Extensin:
El palillo utilizado se extiende sobre un medio de extensin (agua o
colorante, segn la tcnica) en un portaobjetos con el fin de extender los
microorganismos en un frotis para obtener una fina pelcula.
La tincin puede realizarse segn diferentes mtodos, con el fin de observar
diferentes caractersticas de los microorganismos.
40

ANLISIS E IDENTIFICACIN DE
MICROORGANISMOS CULTIVABLES DE LA
MICROBIOTA ORAL
Introduccin:
El fin de la prctica es observar y estudiar las bacterias cultivables que forman
parte de la microbiota oral. Es importante tener en cuenta que para proceder a
la identificacin debe partirse siempre de un cultivo puro, o por lo menos de
una colonia aislada.
Dada la diversidad que presentan los microorganismos, que hace que una
cepa en concreto no presente exactamente las caractersticas que definen a la
especie, hay que considerar en el proceso de identificacin la totalidad de los
resultados coincidentes y no coincidentes, y valorar la importancia taxonmica
de cada uno. Se ofrecen aqu mtodos sencillos para la identificacin de los
microorganismos que pueden haber sido aislados. La identificacin completa
puede requerir otras pruebas, descritas en los manuales de laboratorio de
Microbiologa Clnica (ver Bibliografa).
Toma de muestras, examen preliminar y cultivo:
Material:

Palillos estriles.
Placas de Agar-sangre.

Tcnica:

Toma de muestra:

Se introduce el palillo en la boca y se frota en las zonas en las que suponemos

mayor acumulacin de microorganismos: surco gingival, etc., evitando el
contacto con la lengua y otras zonas de la boca.

Siembra:
Frotar el palillo sobre un segmento de la superficie de la placa, hacindolo
girar a la vez para descargar toda la muestra (Figura 1.2.-1).
Sembrar para aislamienyto por estra.
Incubar las placas 24-48 h a 37C en aerobiosis y anaerobiosis.

Identificacin de Estreptococos orales:

Examinar las placas de agar sangre incubadas en aerobiosis analizando la
hemlisis. La -hemlisis (total) puede ser ms evidente donde se clav el asa
en el agar. Puede manifestar la presencia de estreptococos del grupo
Anginosus o bien S. pyogenes procedente de contaminacin de la muestra con
mucosa farngea en caso de que exista una infeccin farngea aguda. Las
colonias -hemolticas (hemlisis parcial) pueden corresponder a estreptococos
orales de los grupos Salivarius, Mitis (incluido S. pneumoniae, tambin
transitorio en faringe) y Mutans. Hgase una tincin de Gram a partir de los
microorganismos aislados para averiguar si presentan aspecto de cocos Grampositivos lanceolados en parejas o cadenas quebradas; para proseguir su
identificacin se resiembran algunas colonias en otra placa de agar sangre,
reaislndolas mediante la tcnica de estra en superficie. Se puede colocar un
41

disco de optoquina para descartar una contaminacin de los -hemolticas con

S. pneumoniae, as como un disco de bacitracina para descartar una
contaminacin de -hemolticos con S. pyogenes, siendo ambas especies
caractersticamente sensibles a estos compuestos respectivos, a diferencia de
los estreptococos orales. A partir de estas colonias, se realiza la prueba de la
catalasa, que debe resultar negativa
PRUEBA DE LA CATALASA
La catalasa es una enzima que cataliza la descomposicin del perxido de
hidrgeno en agua y oxgeno. Se encuentra presente en la mayora de los
microorganismos aerbicos y anaerbicos facultativos, excluyendo los
estreptococos.
Tcnica
En un portaobjetos se depositan una o dos gotas de agua oxigenada de 30
volmenes y se pone en contacto con ella una colonia de los microorganismos
a estudiar con ayuda del asa de siembra. Es muy importante no arrastrar
sangre del agar, que dara un falso resultado positivo.
Interpretacin
La prueba se considera positiva cuando se produce una efervescencia rpida
con desprendimiento de burbujas: la enzima catalasa convierte el perxido de
hidrgeno en agua y oxgeno molecular. El gnero Streptococcus es catalasa
negativo, luego un resultado positivo descartara que el microorganismo
ensayado fuera un estreptococo.
Identificacin de actinomyces y otras actinobacterias orales:
Actinomyces spp. Requieren CO2 para su crecimiento, mientras que otros
gneros, como Propionibacterium y Bifidobacterium no requieren CO2. Las
colonias de estas bacterias son irregulares y prominentes, con aspecto de
araa o muela. Se comprobar mediante tincin de Gram que se trata de
bacilos Gram positivos pleomrficos o corineformes. La prueba de la catalasa
es til para distinguir entre gneros: Actinomyces es catalasa negativo,
mientras que Corynebacterium y Propionibacterium son generalmente catalasa
positivos. En el caso del gnero Bifidobacterium, la respuesta a catalasa
depende de la especie. Para identificar el gnero Corynebacterium,
representado en la biota oral en especial por la especie C. matruchotii, se puede
recurrir a la tincin de corpsculos metacromticos, caracterstica de este
gnero, mediante el mtodo de Alberts.
La diferenciacin entre propionibacterias, bifidobacterias y Actinomyces puede
ser difcil si no se dispone de paneles de identificacin con pruebas
bioqumicas diseadas a tal efecto.
La especie Rothia dentocariosa es un bacilo Gram positivo que se tie de
manera no uniforme, sacaroltico pleomrfico, con formas cocoides, bacilares,
corineformes, raramente ramificadas. Es aerobio y, por tanto, aparecer en las
placas cultivadas en presencia de oxgeno. Por lo dems, es difcil de distinguir
de especies relacionadas como Nocardia (microorganismos asacarolticos) y
Actinomyces.
42

Identificacin de cocos gram negativos aerobios:

Nos referiremos los pertenecientes al gnero Neisseria.
Se caracterizan preliminarmente por su morfologa de cocos Gram-negativos
en parejas, semejando granos de caf, y por dar positivas las pruebas de la
catalasa y de la oxidasa.
El aislamiento es comn en medio agar sangre, donde producen colonias no
hemolticas de aspecto diverso segn la especie. Su caracterizacin se
completara mediante pruebas bioqumicas. Los ensayos de oxidacin de
azcares son difciles de realizar, y se recomienda el empleo de alguno de los
mtodos comercialmente disponibles.
Gemella es un coco Gram positivo emparentado con los estreptococos que se
puede confundir con las neisserias puesto que tiene idntica morfologa y se
decolora dando lugar a una falsa lectura del Gram. Se distingue de Neisseria
por ser -hemoltico y por dar negativas las pruebas de la oxidasa y la
catalasa.
Prueba de la Oxidasa: Se trazan rayas con el asa cargada de bacterias sobre
tiras de papel impregnadas en solucin acuosa al 1 por 100 de tetrametil-pfeniln-diamina. En caso positivo el papel cambia de color pasando a azul
oscuro o negro

Identificacin de gram negativos anaerobios:

Estos microorganismos son muy comunes en la cavidad oral, aunque su
cultivo y aislamiento resulta tedioso, puesto que crecen mal in vitro. Su
aislamiento implica comnmente el uso de medios enriquecidos en hemina,
vitamina K, menadiona, piruvato y cistena. La incubacin debe realizarse en
atmsfera anaerbica con 5-10% de CO2. La tincin Gram puede ser equvoca
con algunos gneros.
Dentro de los bacilos, los gneros Prevotella y Porphyromonas son
representativos
del
Phylum
Bacteroidetes,
mostrando
un
aspecto
habitualmente cocobacilar. Gracias a la produccin de porfirinas, sus colonias
manifiestan una fluorescencia roja intensa si se les expone a radiacin
ultravioleta (UV, =365 nm). En tiempos largos de incubacin las colonias se
vuelven negras por la presencia de estos pigmentos. La aparicin de pigmentos
es ms rpida en las especies P. intermedia y P. loeschii que en P.
melaninogenica. Otras especies, como P. oralis, no producen pigmento. La
hemlisis en el gnero Prevotella es muy variable: P. melaninogenica puede
presentar hemlisis o , mientras que otras especies, como P. intermedia y P.
loeschii suelen ser no hemolticas o bien producir una hemlisis . El gnero
Tannerella, relacionado con Porphyromonas no es fcilmente cultivable por su
requerimiento nutricional de cido N-acetil murmico. Las colonias de la
especie Eikenella corrodens corroen el agar de manera caracterstica. Para su
aislamiento se requiere una atmsfera del 10% de CO2.
Es posible detectar colonias de Gram positivos anaerobios como los cocos
Peptostreptococcus y, sobre todo, Veillonella, que son refractarios al Gram,
apareciendo en tincin como Gram negativos. Veillonella aparece
microscpicamente como masas de cocos muy pequeos, oxidasa negativos.
Las especies V. atypica y V. parvula dan negativa la reaccin de la catalasa,
43

mientras que V. dispar es catalasa positivo. Peptostreptococcus suele responder

mejor al Gram, apareciendo como positivo, agrupado en diversas formaciones:
cadena, pares, ttradas o racimos. Son siempre catalasa negativos.
Selenomonas es un Gram positivo refractario al Gram que aparece como falso
Gram negativo. Es fcilmente reconocible al microscopio por su forma curva de
media luna. Es catalasa y oxidasa negativo. Dialister tambin es un Gram
positivo que aparece como negativo en tincin, de forma bacilar. Se conoce
poco sobre su posibilidad de cultico y caracterizacin microbiolgica.
Las Fusobacterias (Fusobacterium spp. y Leptotrichia buccalis) son de muy
difcil cultivo o no cultivables. Todas ellas son, en cualquier caso catalasa y
oxidasa negativos. Las fusobacterias tienen una caracterstica forma alargada
y fina, como filamentos rectos de aspecto fusiforme, pero pueden ser
pleomrficos, sobre todo las especies del gnero Fusobacterium. Leptotrichia, al
contrario que Fusobacterium puede ser aerotolerante en subcultivo.
Identificacin de bacilos gram negativos anaerobios facultativos:
Las Gamma-Proteobacterias, el grupo ms conocido de este tipo de
microorganismos, que incluye a las Enterobacterias, no est representado en
la microbiota oral, salvo en ciertas situaciones patolgicas. Por tanto, no se
investigan bacilos Gram negativos oxidasa negativos de manera rutinaria en el
anlisis de la placa dental.
La especie Actinobacillus actinomycetencomitans, asociada a la cavidad oral,
dar lugar a colonias preferentemente en atmsferas enriquecidas en CO2. La
morfologa colonial es caracterstica, con un abultamiento central en forma de
estrella. Microscpicamente tiene el aspecto de formas cocoides y bacilares
asociadas (aspecto de alfabeto Morse).

44

ANEXO:
MEDIOS DE CULTIVO, COLORANTES Y
REACTIVOS
Agar movilidad:
Extracto de carne
Peptona
Cloruro sdico
Agar
Agua destilada, c.s.p.

3
10
5
4
1000

g
g
g
g
ml

Disolver todos los componentes en el agua, a excepcin del agar,

calentando suavemente y ajustar el pH a 7,3. Aadir el agar calentando de
nuevo hasta ebullicin y distribuir en tubos a razn de unos 5 ml por tubo.
Esterilizar a 121C durante 15 minutos y dejar solidificar en posicin vertical.
Agar Meller-Hinton:
Infusin de carne
Peptona de casena
Almidn soluble
Agar
Agua destilada, c.s.p.

300 g
17,5 g
1,5 g
17 g
1000 ml

Disolver todos los componentes en el agua, a excepcin del agar, y ajustar

a pH 7,3. Aadir el agar y calentar hasta ebullicin para que se disuelva por
completo. Esterilizar a 121C durante 15 minutos y una vez atemperado,
dispensar en placas de Petri estriles a razn de unos 20 ml por placa, con el
fin de obtener un espesor de 4 mm.
Agar nutritivo:
Peptona
Extracto de carne
Extracto de levadura
NaCl
Agar
Agua destilada, c.s.p.

5
1
2
5
15
1000

g
g
g
g
g
ml

Disolver los componentes por calentamiento, excepto el agar, y ajustar el

pH a 7,1. Aadir el agar y llevar hasta ebullicin, repartiendo el medio en
tubos de ensayo a razn de 15 a 20 ml por tubo Esterilizar en autoclave a
121C durante 15 minutos.
Agar sangre:
Utilizar una base de agar nutritivo o de otro medio ms rico, como el agar
triptona soja, al que se aadir en condiciones aspticas, una vez esterilizado
45

en autoclave a 121C durante 15 minutos y atemperado a 45-50C, un 5% de

sangre de caballo desfibrinada estril. Mezclar suavemente para evitar la
formacin de burbujas y dispensar en placas de Petri.
Agua de peptona:
Peptona
Cloruro sdico
Agua destilada, c.s.p.

10 g
5g
1000 ml

Disolver todos los componentes en el agua calentando suavemente y

ajustar el pH a 7,2. Dispensar en tubos y esterilizar en autoclave a 121C
durante 15 minutos.
Medio fluido de tioglicolato:
L-cistina
0,5 g
Cloruro sdico
2,5 g
Glucosa monohidrato
5,5 g
Extracto de levadura
5g
Digerido pancretico de casena
15 g
Tioglicolato sdico
0,5 g
Solucin de resazurina sdica al 0,1% 1 ml
Agar
0,75 g
Agua destilada, c.s.p.
1000 ml
Aadir el tioglicolato sdico o el cido tiogliclico a la solucin formada
por el resto de los componentes, excepto la solucin de resazurina sdica que
se aade despus de ajustar el pH a 7,10,2. Distribuir en tubos a razn de 15
ml y esterilizar a 121C durante 20 minutos.
COLORANTES Y REACTIVOS
Agua oxigenada: solucin al 3% en agua destilada.
Azul de lactofenol
cido lctico
Fenol
Azul de anilina
Glicerol
Agua destilada, c.s.p.

20 ml
20 g
005 g
40 ml
20 ml

Disolver el fenol en cido lctico, glicerol y agua, calentando suavemente.

Luego agregar el azul de anilina (azul algodn, azul de Poirrier)
Azul de metileno: solucin al 0,3%.en agua destilada.
Cristal violeta oxalatado (modificacin de Hucker):
Solucin A:
Cristal violeta
Etanol de 95%
46

10 g
100 ml

Solucin B:
Oxalato amnico
1g
Agua destilada, c.s.p.
1000 ml
Mezclar 20 ml de la solucin A y 80 ml de la solucin B. Guardar durante
24 horas y filtrar a travs de papel de filtro.
Etanol de 95% (vol/vol).
Lugol (solucin yodo-yodurada):
Yoduro potsico
Yodo
Agua destilada, c.s.p.

2g
1g
300 ml

Disolver el yoduro potsico en un poco de agua y agregar el yodo. Una vez

disuelto, se agrega el agua restante. Guardar en frascos de color mbar.
Nigrosina de Dorner:
Nigrosina
Agua destilada, c.s.p.

10 g
100 ml

Aadir la nigrosina al agua y mezclar en un matraz. Calentar en un bao

de agua hirviendo durante 20-30 minutos. Ajustar el volumen final a 100 ml
con agua Como la nigrosina puede contaminarse con microorganismos,
aadir 0,5 ml de formol como conservador. Filtrar dos veces a travs de un
papel de filtro doble.
Safranina:
Safranina O
Etanol de 95%
Agua destilada, c.s.p.

0,25 g
10 ml
100 ml

Disolver la safranina en el etanol y aadir entonces el agua destilada.

Solucin salina:
Cloruro sdico
Agua destilada, c.s.p.

9g
1000 ml

Disolver el cloruro sdico en el agua por calentamiento suave y ajustar el

pH a 6,6. Dispensar en tubos y esterilizar en autoclave a 121C durante 15
minutos.

47

BIBLIOGRAFA
Beishir, L. Microbiology in practice. A self-instructional laboratory course.
5 Ed. Harper Collins Pub. Inc., 1991.
Case, C.L. y T.R. Johnson. Laboratory experiments in Microbiology. The
Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc. 1984.

Claus, GW. Understanding microbes: A laboratory textbook

microbiology. 1 Ed. W.H. Freeman and Co. New York, 1989.

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Collins, C.H. y P.M. Lyne. Microbiological methods. Butterworth & Co.(Pub)

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Daz, R., C. Gamazo e I. Lpez-Goi. Manual prctico de Microbiologa. 2
Ed. Masson, S.A. Barcelona, 1999.
Baron, E.J., L.R. Peterson, y S.M. Finegold. Bailey and Sccotts diagnostic
Microbiology. 10 Ed. The C.V. Mosby Company, 1998.
Gerhardt, P., R.GE. Murray, W.A. Wood y N.R. Krieg Methods for general
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Koneman, E.W., S.D. Allen, W.M. Janda, P.C. Schreckenberger y W.C. Winn.
Diagnstico microbiolgico. Texto y atlas en color. 5 Ed. Panamericana,
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Seeley, H.W., P.J. Vandemark y J.L. Lee. Microbes in action. A laboratory
manual of Microbiology. 4 Ed. W.H. Freeman, New York, 1991.

48

49

CALENDARIO DE PRCTICAS

LUNES

MARTES

MIRCOLES

Siembras de
microorganismos
aerobios y
anaerobios en
medios lquidos
y slidos
Lectura de
siembras.

Tincin y
Siembra en Agar
Sangre en
aerobiosis y
anaerobiosis de
la muestra oral
Observacin y
Lectura
tinciones de
de
gram de las
Control
ambiental colonias de Agar
Sangre

Tincin de las
colonias

Siembra del
antibiograma por
difusin
JUEVES

50

Lectura de los
antibiogramas

Control
ambiental
hongos

Observacin
en fresco
Tincin
negativa
Siembra y
aislamiento de
Candida.

Tincin
simple
Tincin de
Gram

Observacin y
tinciones de
gram de las
colonias de Agar
Sangre
Tipo respiratorio
en Caldo
Tioglicolato

Prueba de
filamentacin de
C. albicans

Lectura del tipo

respiratorio.
Pruebas
bioqumicas
catalasa y
oxidasa

Lectura

Tincin de
Gram

Antifungigrama
Tincin con
azul de
lactofenol