G.P Microbiología Ii PDF

ASOCIACIN
UNIVERSIDAD PRIVADA SAN JUAN BAUTISTA

FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD
ESCUELA PROFESIONAL DE MEDICINA HUMANA
GUIA DE PRCTICA DE
MICROBIOLOGIA MDICA
CUARTO CICLO
SEMESTRE ACADMICO 2013-II
ASOCIACIN
RECOMENDACIONES GENERALES PARA EL USO DEL LABORATORIO DURANTE EL CURSO DE

MICROBIOLOGA MDICA
1. El estudiante deber asistir a las clases prcticas llevando consigo la Gua de Prcticas,
mandil, plumn indeleble para escribir sobre vidrio y lpices de colores.
2. No se podr ingresar sin mandil a la sala de prcticas, para evitar contaminaciones
3. Durante las prcticas no se debe comer, beber ni fumar, para evitar o prevenir posibles
contaminaciones.
4. Sobre la mesa de trabajo slo debern colocar su gua de prctica y su libreta de apuntes.
5. Eliminar el material de desecho, como papeles, trozos de algodn, etc. al tacho de basura
6. Las coloraciones deben efectuarse en el lavadero de cada mesa de prctica para evitar que se
tian la mesa de trabajo, ropa o manos.
7. Colocar las lminas preparadas sobre hojas de papel blanco.
8. Dejar los cultivos ya usados, en la canastilla de tubos. Tener cuidado que permanezcan
debidamente cerrados y en posicin vertical para evitar que se derramen.
9. Las lminas coloreadas a desecharse debern ser colocadas en frascos de boca ancha con
desinfectante.
10. Todos los cultivos que se preparen debern incubarse, teniendo en cuenta las siguientes
anotaciones:
Nombre o iniciales de los estudiantes
Nombre del germen, nmero de mesa, turno y fecha de la siembra
Las placas debern ser invertidas, a menos que el profesor de instrucciones contrarias
Los tubos debern estar bien tapados y colocados en gradillas
Los alumnos se responsabilizan de colocar estos cultivos en estufa a 37C
11. Al finalizar el trabajo:
Limpiar con algodn los objetivos del microscopio
Tener cuidado de dejar el objetivo de menor aumento frente al condensador y que no
queden lminas sobre la platina
Limpiar la mesa de trabajo
Comprobar que la llave de gas este cerrada
Lavarse prolijamente las manos con jabn carblico.
12. El Protocolo de cada prctica ser controlado por el profesor al final de la prctica.
ASOCIACIN
PRACTICA N 1
MICROSCOPIA: ESTUDIO Y MANEJO DEL MICROSCOPIO
I.
OBJETIVO
1. Conocer e identificar correctamente las partes pticas y mecnicas del microscopio compuesto.
2. Familiarizar al alumno con el uso correcto, cuidado y conservacin del microscopio.
II.
MATERIALES
Microscopios
Lminas portaobjetos
Laminillas cubreobjetos
Lminas coloreadas
Suero fisiolgico
Pipeta Pasteur
Plumn indeleble
Papel lente
Tela de felpa(25 cms)
Fibra de pelo y lana
III. PARTES DEL MICROSCOPIO

Reconocer cada una de las siguientes partes del microscopio:
PARTE MECANICA
Tubo portalentes y cremallera

Tornillos macro y micromtrico
Revolver
Platina
Condensador
Brazo y Pie
Charnela
PARTE OPTICA
Ocular
Objetivos
Espejo
Lentes de condensador
Diafragma
IV. SISTEMAS QUE COMPRENDE EL MICROSCOPIO

1.
2.
3.
4.
Sistema de soporte: comprende el brazo, el pie, el tubo ocular, el revolver y la platina.

Sistema de Iluminacin: comprende el foco, condensador y diafragma.
Sistema de Ajuste: comprende el macromtrico, micromtrico y cremallera
Sistema de Aumento: comprende el ocular generalmente de 10 x , 15 x, y los objetivos de 4x, 10, 20x, 40,
y 100x.
ASOCIACIN
MICROBIOLOGIA MEDICA
Pgina 4
ASOCIACIN
PRACTICA N 1 - A
METODOS DE COLORACIONES: COLORACIONES SIMPLES., DIFERENCIALES Y ESPECIALES.

INTRODUCCION
La mayor parte de los colorantes usados en Microbiologa son de tres tipos:
A) Aquellos en los cuales el ion portador del color (cromfero) es el anin llamados colorantes cidos Ej. Eosinato
de sodio Eosina.
B) Aquellos cuyo cromforo es el catin llamados colorantes bsicos Ej. Cloruro azul de metileno.
C) Los colorantes neutros, compuestos por bsicos y cidos Ej. Hematoxilina (bsico) Eosina (cido).
Para los trabajos bacteriolgicos generales se usan colorantes bsicos como el azul de metileno, cristal de violeta,
fucsina bsica, safranina, todos ellos pertenecen al grupo de los colorantes derivados de la anilina.
Las coloraciones pueden ser segn el nmero de colorantes que utilizan:
A) Simples: cuando se utiliza un solo colorante como el Azul de metileno, Tinta China, Azul de metileno
B) Diferenciales: cuando utilizan ms de un colorante como la coloracin de Gram, y Ziehl - Neelsen.
C) Especiales: cuando se usan colorantes que permiten reconocer ciertas estructuras celulares como la coloracin de
Leishman, Vago, etc.
A. COLORACIONES SIMPLES
Son aquellas coloraciones que utilizan un solo colorante para visualizar la morfologa de los microorganismos.
MATERIAL
Muestra con mezcla bacteriana

Lminas portaobjetos
Laminillas cubreobjeto
Asa bacteriolgica de Kolle en aro
Colorante Azul de metileno
Colorante Tinta China
Colorante Azul de lactofenol
Mechero de Bunsen
Varillas para coloracin
Aceite de cedro
Xylol
Papel lente
Microscopio de luz con objetivo de inmersin
COLORACIN AZUL DE METILENO:

1.
2.
3.
4.
Preparar un frotis con la mezcla bacteriana y fijar al calor

Cubrir el frotis con una gota del colorante y dejar actuar por 3 5 minutos
Lavar con agua y dejar secar
Observar al microscopio con objetivo de inmersin y aceite de cedro.
Pgina 5
RESULTADO: Los microorganismos se observan de color azul intenso
COLORACIN DE TINTA CHINA O NEGATIVA:

1.
2.
3.
4.
Colocar una gota de tinta china sobre la lamina portaobjetos

Agregar una gota de la mezcla bacteriana
Cubrir la preparacin con una laminilla cubreobjeto
Observar con lente de menor y mayor aumento.
RESULTADO: Los microorganismos sin teir resaltan sobre un fondo oscuro
COLORACIN AZUL DE LACTOFENOL:

1
2
3
4
Colocar una gota del colorante sobre la lmina portaobjetos

Colocar una muestra de un cultivo de hongo sobre el colorante
Cubrir con una laminilla cubreobjeto
Observar con lente de menor y mayor aumento
RESULTADO: Los microorganismos se observaran en un fondo azul celeste
PROTOCOLO
CLASE DE
COLORACION SIMPLE
MORFOLOGIA DEL
MICROORGANISMO
ESQUEMA DE LA
OBSERVACION
AZUL DE METILENO
TINTA CHINA
AZUL DE LACTOFENOL
Pgina 6
CUESTIONARIO
1.
2.
3.
Que tipo de colorantes son el azul de metileno, tinta china y el azul de lactofenol, cido, bsico, neutro?
Cules son los componentes del azul de metileno
Qu estructura de la bacteria se colorea con el azul de metileno?
B. COLORACIONES DIFERENCIALES
Son aquellas coloraciones que utilizan ms de un colorante y, generalmente el segundo colorante es llamado colorante
de contraste. Entre los mas usados tenemos la coloracin de Gram y la de Ziehl Neelsen o tambin llamado cidoalcohol resistente
COLORACION DE GRAM
Es una coloracin diferencial que permite diferenciar a las bacterias en Gram positivas y Gram negativas, segn la
estructura y composicin de la pared celular. En las Gram negativas, el peptidoglucano tiene una sola capa y las cadenas
no estn entrelazadas; en las Gram positivas la mayora presenta muchas capas de cadenas mucopptidas .
Existen varias modificaciones del Gram, una de ellas es la de Kopeloff
MATERIAL
Muestra con mezcla de bacterias

Solucin fisiolgica al 0.85%
Lminas portaobjetos
Asa bacteriolgica de Kolle en aro
Set de colorante de Gram, modificado por Kopeloff:
Violeta de Cristal violeta (colorante primario)
Bicarbonato de sodio
Lugol (mordiente)
Alcohol- acetona (decolorante)
Fucsina bsica (colorante de contraste)
Mechero de Bunsen
Microscopio de luz con objetivo de inmersin
Aceite de cedro
Xylol
Papel lente
PROCEDIMIENTO
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
Dividir la lmina en 3 partes: 1/3 para rotular el N de muestra y 2/3 para la preparacin del frotis.
Con el asa bacteriolgica previamente esterilizada, tomar la muestra y realizar un frotis en el centro de la lmina
portaobjeto, extendindola en espiral del centro a la periferia, para obtener una preparacin en capa fina.
Fijar la muestra, mediante el secado completo del frotis a temperatura ambiente, o con la ayuda de la llama dbil del
mechero de Bunsen.
Colocar la lmina portaobjetos con la preparacin sobre la varilla de coloracin.
Cubrir el frotis con el colorante Violeta de Genciana, agregar 1- 2 gotas de la solucin de bicarbonato de sodio,
dejar actuar por 2 minutos.
Lavar con agua corriente (evitar la cada del chorro de agua directamente sobre el frotis)
Cubrir con Lugol durante 1- 2 minutos.
Lavar con agua.
Pgina 7
9.
10.
11.
12.
13.
14.
Decolorar el frotis con la solucin de alcohol- acetona (inclinar la lmina y decolorar hasta que no arrastre
colorante) mximo por 10 segundos.
Lavar con agua.
Cubrir con el colorante de contraste fucsina bsica durante 30 segundos.
Lavar con agua.
Secar a temperatura ambiente o con ayuda de la llama dbil del mechero de Bunsen
Observar al microscopio con el objetivo de inmersin.
RESULTADO
Las bacterias Gram positivas se colorean de violeta y las bacterias Gram negativas de color rosado.
PROTOCOLO
CATEGORIA
BACTERIANA
MORFOLOGIA
BACTERIANA
ESQUEMA DE
LO OBSERVADO
GRAM POSITIVAS
GRAM NEGATIVAS
CUESTIONARIO
1.
2.
3.
A que se debe que las bacterias Gram negativas no retengan el complejo cristal violeta- yodo?
A que se debe que los colorantes bsicos tian el ncleo de las clulas?
Con que clase de colorante teira el protoplasma de la clula?
Pgina 8
ASOCIACIN
PRACTICA N 2
COLORACION DIFERENCIAL DE ZIEHL-NEELSEN
INTRODUCCION
Coloracin diferencial que permite la tincin de microorganismos que poseen elevado contenido de lpidos, como el
gnero Mycobacterium (bacilo tuberculoso), llamados tambin cido-alcohol-resistente. Al teirse los microorganismos
con el colorante primario (fucsina bsica fenicada) que es soluble en sustancias lipodes y aplicando el calor, el colorante
es forzado a penetrar en la clula y en esta forma resistir a la decoloracin.
MATERIAL
Lminas con frotices de bacilo tuberculoso

Set de coloracin Ziehl-Neelsen:
Fucsina fenicada al 5% (colorante primario)
Alcohol cido (alcohol etlico con 3% de HCl)
Azul de metileno (colorante de contraste)
Mechero de alcohol
PROCEDIMIENTO
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Cubrir con fucsina fenicada el frotis realizado en la lmina y calentar la preparacin con el mechero de alcohol hasta
apreciar el desprendimiento de vapores, repetir este procedimiento por tres veces , evitando que hierva el colorante.
Lavar con agua corriente.
Decolorar con alcohol cido hasta que se aprecie una coloracin rosada.
Lavar con agua corriente
Cubrir con colorante de contraste: Azul de metileno por un minuto.
Secar y observar con lente de inmersin.
RESULTADO
Las bacterias cido alcohol resistentes se tien de color rojo y las no cido alcohol resistentes se tien de color azul.
PROTOCOLO
LAMINA
MORFOLOGA
ESQUEMA
COLORACION DE
ZIEHL- NEELSEN
Pgina 9
CUESTIONARIO
1.
2.
3.
Para que clase de microorganismos es recomendable le coloracin cido alcohol resistente.

Cual es la funcin de la Fucsina bsica fenicada
A que se denomina colorante primario y colorante de contraste
ASOCIACIN
PRACTICA N 3
COLORACION ESPECIAL: COLORACION DE LEISHMAN Y VAGO
INTRODUCCION
Son coloraciones especiales que permiten colorear algunas bacterias que no tienen afinidad con los colorantes de anilina
como: las espiroquetas. As como tambin la coloracin de microorganismos presentes en la sangre.
COLORACION DE LEISHMAN
Es una coloracin especial policromtica utilizada para demostrar la presencia y morfologa de microorganismos en
sangre y tejidos como: Bartonella, Hongos, Rickettsias.
MATERIALES
Frotis de sangre con Bartonella

Solucin de colorante Leishman
Agua destilada tamponada
Microscopio con lentes de 100X
Aceite de inmersin
PROCEDIMIENTO
1.
2.
3.
4.
5.
Cubrir el frotis con el colorante y dejar actuar por 5 minutos.

Agregar agua destilada tamponada mezclando bien y esperar 15 minutos
Lavar con agua de cao y dejar secar
Observar con objetivo de inmersin
Anotar los resultados en el protocolo.
COLORACIN DE VAGO
Es utilizado para la coloracin de grmenes fuso-espirilares y espiroquetas, que no se colorean por el mtodo de Gram,
ni por el Ziehl-Neelsen y que se colorean muy dbilmente con el Leishman.
Pgina 10
MATERIALES
Lmina portaobjetos
Palito mondadientes
Set de coloracin de Vago:
Mercuro cromo al 2%
Violeta de genciana
Asa de siembra en aro
Microscopio con lentes de 100X
Aceite de inmersin
PROCEDIMIENTO
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
En una lamina colocar una gota de suero fisiolgico al o.85%

Con el palito mondadientes obtener una muestra de sarro dentario y realizar un frotis en capa fina extendiendo en
sentido espiral de adentro hacia fuera.
Fijar el frotis al calor suave
Cubrir con Mercuro cromo durante 3 minutos
Cubrir el frotis con Violeta de genciana por 3 minutos
Secar y observar al microscopio con objetivo de inmersin.
RESULTADOS
Coloracin Leishman: Los microorganismos se tien de color rosado oscuro
Coloracin de Vago: Observar Treponema phagadeni, espiroqueta que se encuentra formando parte de la flora normal
de la boca, en forma de espiral y de color violeta- rosado.
PROTOCOLO
LAMINA
MORFOLOGIA
ESQUEMA
COLORACION
LEISHMAN
COLORACION VAGO
Pgina 11
CUESTIONARIO
1.
2.
3.
4.
Para que clase de microorganismos es recomendable le coloracin cido alcohol resistente

Cual es la funcin de la Fucsina bsica fenicada
A que tipo de colorante pertenece el colorante Leishman
A que grupo bacteriano se les denomina grmenes fuso-espirilares
Pgina 12
ASOCIACIN
PRACTICA N4
MEDIOS DE CULTIVO SIMPLES, DIFERENCIALES Y ENRIQUECIDOS
INTRODUCCION
Para el aislamiento de bacterias de un material patolgico, es necesario su cultivo en medios especiales con una
determinada concentracin de iones de hidrgeno, sales, compuestos nitrogenados, hidratos de carbono, humedad y
temperatura. Segn su utilizacin pueden ser: simples, enriquecidos y diferenciales.
MATERIALES
Caldo nutritivo
Extracto de carne
Peptona
Dextrosa
Cloruro de sodio
Agua destilada
pH
Goteros de vidrio
Trpodes con malla de Asbesto
Tubos de 16x150 mm
Tubos de 13x100 mm
Placas Petri
Frascos estriles
Agua destilada
Tubo con sangre citratada
Agar simple
Extracto de carne
Peptona
Dextrosa
Cloruro de sodio
Agua destilada
Agar
pH
0.3 g
1.0 g
0.5 g
0.5 g
100 ml
7.0 - 7.4
Probetas de 100 ml.

Balones de 250 ml.
Tiras de Papel indicador de pH
Frasco con solucin NaOH (N/10)
Frasco con solucin HCl (N/10)
Pinzas rectas
Bagetas de vidrio
0.3 g
1.0 g
0.5 g
0.5 g
100 ml
1.5 g
7.0 - 7.4
Caldo peptonado
Peptona
2.0 g
Cloruro de sodio 1.0 g
5.0 gr. de Agar Mac Conkey deshidratado.

6.0 gr. de Agar SS deshidratado.
6.5 gr. de Agar TSI.
2.2 gr. de Agar Citrato de Simmons
2.1 gr. de Agar Urea.
1.7 gr. de Caldo MR VP
3.3 gr. de Agar Lisina Hierro.
PREPARACION
I.
1.
MEDIOS DE CULTIVO SIMPLES

Para el Caldo nutritivo; primero disolver los ingredientes en los 100 ml de agua destilada y someter al calor hasta
su completa dilucin. Luego tomar el pH con el papel indicador. Si el medio es cido agregar gota a gota la solucin
de NaOH; si el medio es alcalino agregar gota a gota solucin de HCl hasta lograr el pH indicado. Envasar y
dejar en refrigeracin hasta su utilizacin.
2.
Para el Agar simple; disolver primero el Agar en los 100 ml de agua destilada tibia, luego agregar los dems
ingredientes. Controlar el pH con ayuda de las soluciones de NaOH HCl. Luego envasar y esterilizar a 121C por
utilizacin.
Pgina 13
II.
1.
MEDIOS ENRIQUECIDOS
Para el Agar Sangre; primero preparar Agar simple y esterilizar en autoclave, luego dejar enfriar hasta una
obtener un buen homogenizado y distribuir en Placas Petri estriles; dejar luego solidificar y realizar el control de
esterilidad. Mantenerlo en refrigeracin hasta su utilizacin. El color normal del medio debe ser rojo cereza.
2.
Para el Agar chocolate

torne
color chocolate, luego repartir en placas Petri estriles y realizar control de esterilidad y dejarlo despus en
refrigeracin.
3.
Para el Agar Mac Conkey; disolver el medio en los 100 ml de Agua destilada, calentar hasta su completa
disolucin. Autocl
4.
Para el Agar SS; disolver el medio deshidratado en 100 ml. de Agua destilada, someter al calor hasta su completa
disolucin . Repartir luego en placas estriles. No necesita autoclavar.
III.
1.
MEDIOS DIFERENCIALES
Para el Agar TSI (Hierro tres azcares);disolver el medio en 100 ml de Agua destilada, hervir hasta su completa
autoclavar colocar los tubos en plano inclinado. El medio al final tendr un color rojo naranja.
2.
Para el Agar Citrato Simmons, seguir los pasos para el Agar TSI, el medio tendr un color verde.
3.
Para el Agar Urea; disolver el medio en agua destilada, hervir hasta su completa disolucin y autoclavar. Despus
adicionar 5 ml de Solucin de Urea al 40% esterilizada por filtracin; mezclar homogneamente y repartir en tubos
de 13x100mm en plano inclinado. El medio tendr un color amarillo.
4.
Para el Caldo Peptonado; disolver los medios en agua destilada tibia, repartir en tubos de 13x100mm y autoclavar
5.
Agar Lisina Hierro; disolver el medio en agua destilada por calor hasta su completa disolucin y repartir en tubos
no inclinado.
PROTOCOLO
Realizar un cuadro indicando:
A.
Los medios de cultivo preparados en cada mesa.
B.
El color que presentan cada medio de cultivo preparado.
C.
Materiales que usaron para la preparacin.
Pgina 14
ASOCIACIN
PRACTICA N 4- A
SIEMBRA BACTERIANA. MEDIOS DE AISLAMIENTO.
INTRODUCCION
Cuando las bacterias se siembran en un medio de cultivo y en condiciones adecuadas, ocurre un incremento marcado del
nmero de clulas. Algunas especies alcanzan una poblacin mxima a las 24 horas y otras necesitan un perodo ms
prolongado para alcanzar su mximo desarrollo.
Los microorganismos que desarrollan en medios de cultivo en el laboratorio, se denominan cultivos y el resultado de la
multiplicacin bacteriana colonia, as como el procedimiento por el cual se pone en contacto un microorganismo con un
medio de cultivo, se llama siembra. Existen varias tcnicas de siembra, siendo las ms usadas : La siembra por
estra, por dispersin-agotamiento, por inoculacin y por puntura.
Las principales caractersticas morfolgicas que presentan las colonias son:
FORMA
:
Circular, elptica, puntiforme y filamentosa.
ELEVACIN
:
Plana, convexa, acuminada, umbilicada.
BORDE
:
Entera, ondulada, dentada y filamentoso.
SUPERFICIE
:
Lisa, rugosa, granulada.
TAMAO
:
Dimetro en milmetros.
CONSISTENCIA:
Cremosa, membranosa y mucosa.
CROMOGENESIS:
Pigmentacin verde, amarilla, roja, etc.
MATERIALES
Tubos con suero fisiolgico estril

Tubos de 16x150 con Caldo nutritivo
Tubos de 16x150 con Agar nutritivo
Placas con Agar nutritivo
Placas con Agar Mac Conkey
Tubos de 16x150 con medio hipertnico de Chapman
Placas con Agar hipertnico de Chapman
Tubos con Agar Sabouraud
Torundas estriles
Asas de siembra en aro y punta
PROCEDIMIENTO
A) TIPOS DE SIEMBRA
Siembra por estra: Diseminar en forma de zigzag, una pequea cantidad de muestra bacteriana sobre la superficie del
medio de cultivo slido con la ayuda de un Asa de siembra en aro.
Siembra por dispersin-agotamiento: Sembrar la muestra bacteriana en zigzag, hasta la mitad de la superficie del
medio de cultivo
que se agote toda la muestra del Asa de siembra en aro.
Siembra por puntura: Sembrar la muestra bacteriana en un tubo con Agar semi-slido, con ayuda del Asa de siembra
en punta, introducindola en forma vertical hasta la mitad de Agar.
Pgina 15
Siembra por inoculacin: Con ayuda de un Asa en aro, tomar una muestra bacteriana e introducirlo hasta el fondo del
tubo con medio lquido, procurando no tocar las paredes del tubo.
B) LECTURA :
Con la ayuda del profesor:
1.
2.
El alumno proceder a hacer el estudio de lo que ha desarrollado en los medios de cultivos sembrados.
Realizar un protocolo con los resultados obtenidos.
PROTOCOLO
METODOS DE SIEMBRA
DESCRIPCION DE LA SIEMBRA
MEDIO DE CULTIVO
USADO
OBSERVACION DE COLONIAS
MEDIO DE CULTIVO
USADO
ESTRIA
DISPERSION AGOTAMIENTO
PUNTURA
INOCULACIN
CARACTERISTICA DE LA
COLONIA
FORMA
ELEVACIN
BORDES
SUPERFICIE
TAMAO
CONSISTENCIA
CROMOGENESIS
RESULTADO DE LAS SIEMBRAS REALIZADAS:
Pgina 16
ASOCIACIN
PRACTICA N 5
METABOLISMO BACTERIANO
INTRODUCCION
La identificacin bacteriana inicial puede realizarse mediante la determinacin de las caractersticas de las colonias y
morfologa con tincin de Gram u otras coloraciones. Sin embargo, la caracterizacin final de un aislamiento bacteriano
desconocido, para identificarlo a nivel de gnero y especie se lleva a cabo estudiando ciertos sistemas enzimticos que
son nicos para cada especie y sirvan como marcadores de identificacin.
En el laboratorio, estos sistemas enzimticos se detectan inoculando una pequea porcin de la colonia bacteriana aislada
en una serie de medios de cultivo que contienen substratos especficos e indicadores qumicos que permiten detectar
cambios del pH o la presencia de subproductos especficos.
I.
ACCION SOBRE LOS CARBOHIDRATOS
Por definicin, la fermentacin es un proceso metablico de oxido- reduccin que ocurre en un medio ambiente
anaerobio, y en lugar de oxgeno, un substrato orgnico sirve como el aceptor final de hidrgeno (electrones). Este
trmino de fermentacin se refiere a la utilizacin de hidratos de carbono como la glucosa los cuales les servirn como
fuente de energa y carbono.
Las bacterias se diferencian por los hidratos de carbono que utilizan, los tipos y cantidades de cidos mixtos producidos,
dando como resultado la acidificacin del medio, el cual es visible por el cambio de color en el medio de cultivo de
fermentacin (pH- indicador); la presencia de gas (CO2 e H+) se manifiesta por la presencia de burbujas o rotura del
medio slido.
A) REACCIONES DE OXIDACIN- FERMENTACIN DE AZUCARES:
EN MEDIO TSI (Triple Sugar Iron)
EL medio TSI fue diseado para la diferenciacin de Bacilos Gram negativos, basndose en la capacidad potencial de
estas bacterias para fermentar carbohidratos y producir sulfuro de hidrgeno (H2S).
El medio contiene tres azcares: glucosa, lactosa y sacarosa en proporciones de 1:10:10 respectivamente. Para detectar
los productos cidos generados se emplea un indicador de pH que es el rojo de fenol cuyo rango de viraje est entre pH
8.4 (rojo) y pH 6.8 (amarillo).
Los patrones de comportamiento de los bacilos Gram negativos ante los carbohidratos presentes en este medio pueden
ser fundamentalmente tres:
1. Fermentacin de glucosa nicamente.
2. Fermentacin de glucosa + lactosa, glucosa + sacarosa o glucosa + ambos carbohidratos.
3. No fermentacin de carbohidratos.
Como producto de la fermentacin de los diferentes carbohidratos se puede formar gas, que se detecta como pequeas
burbujas o grietas en el medio o por desplazamiento del mismo hacia arriba del tubo.
El medio tiene incorporado tiosulfato de sodio como fuente de azufre para generar H2S, y sales de hierro que al
reaccionar con el gas forman un precipitado negro insoluble de sulfuro ferroso (FeS).
Pgina 17
MATERIAL
Tubo con medio TSI en plano inclinado.
Cepas control: E. coli, S. aureus, Ps. aeruginosa
PROCEDIMIENTO
1.
2.
Con el asa de siembra inocule una porcin pequea de la colonia en el centro del tubo y estre la superficie del pico
de flauta.
Rotular e incubar a 37C por 18- 24 horas.
INTERPRETACION
Es indispensable que la lectura se haga en el tiempo de incubacin indicada.
1. Producto de H2S: ennegrecimiento en el fondo del tubo.
2. Fermentacin de la glucosa nicamente: (rojo/amarillo), esto se debe a que la glucosa (que se encuentra en baja
concentracin con respecto a los otros azcares), ha sido utilizada y la cantidad de cido producido no es suficiente
para neutralizar los productos alcalinos generados por la utilizacin de la peptona; adems los cidos pueden ser
utilizados.
Estos procesos, que son oxidativos, ocurren en la superficie del medio, mientras que en el fondo, por no estar en
contacto con el oxgeno, slo hay fermentacin y el medio permanece cido.
3. Fermentacin doble o triple de carbohidratos:(Amarillo/amarillo).La fermentacin de la glucosa y alguno (o
ambos) de los otros dos azcares produce gran cantidad de cidos, por lo que el tubo permanece amarillo.
4. No fermentacin de carbohidratos:(rojo/anaranjado). Se presenta nicamente utilizacin oxidativa de peptonas,
por lo que slo la superficie del tubo se alcaliniza.
5. Produccin de gas: Formacin de burbujas (CO2 e H+), grietas o desplazamiento del medio.
B) PRODUCCION DE ACIDOS Y ACETIL- METIL- CARBINOL (Acetoina)
1.
PRUEBA DEL ROJO DE METILO ( RM )

La prueba de Rojo de metilo es una prueba cuantitativa que proporciona una caracterstica valiosa para identificar
especies bacterianas que producen cidos fuertes (lctico, actico, frmico) a partir de glucosa.
Estas bacterias que primariamente siguen la va de fermentacin de cidos mixtos frecuentemente producen
suficiente cido despus de una incubacin prolongada, como para mantener un pH por debajo de 4.4 (el punto
cido lmite del indicador rojo de metilo), superando el sistema amortiguador del pH del medio.
2.
PRUEBA DE VOGES PROSKAUER ( VP )

El cido pirvico, un compuesto fundamental formado en la degradacin fermentativa de la glucosa, es
metabolizado por algunos microorgansmos produciendo el acetil- metil- carbinol(Acetoina)un subproducto
neutro de la va 2,3- butilenglicol.
La prueba se basa en la conversin del acetil- metil- carbinol en diacetil a travs de la accin del KOH y Oxgeno
atmosfrico. El diacetilo es convertido en un complejo rojo bajo la accin cataltica del Alfa naftol y Creatinina.
MATERIALES
Cepa bacteriana MR positivo y negativo

Cepa bacteriana VP positivo y negativo
Reactivo Rojo de metilo
Reactivo de Voges- Proskauer(Alfa naftol al 5% y KOH al 40%)
Cepas bacterianas E. coli y Klebsiella
PROCEDIMIENTO
1.
2.
Por la tcnica de inoculacin, sembrar independientemente la cepa control MR positivo y negativo, en el medio
MR- VP. Rotular los tubos e incubar durante 48- 72 horas a 37C.
Proceder del mismo modo con las cepas VP controles, incubar por 18- 24 horas.
Pgina 18
INTERPRETACION
1.
2.
II.
Para la prueba Rojo de Metilo, aadir al cultivo unas gotas del reactivo del mismo nombre, cuyo rango de
viraje est entre pH 4.4(rojo) y 6.0 (amarillo). La prueba positiva se manifiesta de color rojo estable y la
negativa de color amarillo- naranja.
Para la prueba de Voges- Proskauer, agregar al cultivo 0.6 ml(12 gotas) de Alfa naftol y 0.2 ml (4 gotas) de
KOH. Agitar el tubo por 1 minuto y dejarlo en reposo durante 15 minutos. Es importante aadir los reactivos en
el orden especfico.
Una prueba positiva, color rojo localizado en la mitad superior o en todo el tubo es observada dentro de los
primeros 15 minutos. Si la lectura se realiza despus de una hora los cultivos pueden presentar un color cobrizo,
siendo esta una interpretacin falsa positiva.
En la prueba negativa no cambia el color inicial del medio de cultivo.
ACCION SOBRE LAS PROTEINAS
PRODUCCION DEL INDOL
Las bacterias que poseen la enzima triptofanasa son capaces de actuar sobre el aminocido triptofano,
produciendo indol, un benzil pirrol, cido pirvico y amoniaco(NH3). El indol puede detectarse en un medio
rico en triptofano, observando la aparicin de un color rojo(en forma de anillo o impregnado en la tira de
papel), luego de agregar una solucin que contiene p- dimetilaminobenzaldehido.
MATERIALES
Cepa indol positivo y negativo.

Medio lquido peptonado y/o Medio SIM
Reactivo de Kovac(alcohol amilico + HCL concentrado + p- dimetilamino benzaldehido).
Cepas bacterianas E. coli, Salmonella.
PROCEDIMIENTO
La aparicin de un color rojo fucsia brillante en la interfase del reactivo y el caldo, pocos segundos despus de
haber agregado el reactivo es indicativo de la presencia de indol y constituye una prueba positiva. Las
bacterias que ha pesar de desarrollar en el medio, pero que no producen indol, al agregar el reactivo, este
aparecer sin cambio alguno, siendo esta una prueba negativa.
III.
UTILIZACION DEL CITRATO COMO UNICA FUENTE DE CARBONO

Esta prueba se utiliza principalmente para identificar varias especies de la familia Enterobacteriaceae, las
cuales pueden obtener energa por va distinta de la fermentacin de los carbohidratos, utilizando el citrato de
sodio como nica fuente de carbono para su metabolismo y desarrollo, por lo tanto,cualquier medio que se
emplee para determinar esta caracterstica no debe contener protenas ni carbohidratos.
El citrato de sodio es una sal del cido ctrico, compuesto orgnico simple que constituye uno de los
metabolitos del ciclo de Krebs.
PRINCIPIO
La utilizacin del citrato por una bacteria se detecta por su crecimiento en un medio con citrato con formacin
de subproductos alcalinos. El medio (Citrato de Simmons)incluye citrato de sodio, un anin como nica
fuente de carbono y fosfato de amonio como nica fuente de nitrgeno.
Las bacterias que pueden utilizar citrato tambin pueden extraer nitrgeno de la sal de amonio, con produccin
de amonio(NH3), alcalinizando el medio por conversin del NH3 en hidrxido de amonio(NH4OH),
detectndolo con el indicador de pH incorporado el azul de bromotimol cuyo rango de viraje esta entre pH
6.9(verde) y pH 7.8(azul).
Pgina 19
MATERIALES
Cepa control citrato positivo y negativo.

Medio de Citrato de Simmons en plano inclinado
PROCEDIMIENTO
1.
2.
Con el asa de siembra bien esterilizada, sembrar por la tcnivca de estra en cada tubo la cepa citarto
positiva y negativa.
Rotular los tubos e incubar a 37C por 18- 24 horas.
INTERPRETACION
Prueba positiva:Color azul en 24 a 48 horas y crecimiento en la superficie
del medio inclinado.
Prueba negativa: No hay cambio de color ni crecimiento.
IV.
HIDRLISIS DE LA UREA (PRUEBA DE LA UREASA)

Prueba importante para la identificacin de especies bacterianas que poseen la enzima ureasa que hidroliza la
urea, segn el siguiente esquema:
O
NH2- C- NH2 + 2HOH
------------------- CO2 + H2O + 2 NH (NH4)2 CO3

Ureasa
El amoniaco reacciona en la solucin para dar carbonato de amonio, producindose una alcalinizacin y un
aumento del pH del medio que lleva como indicador el rojo neutro.
MATERIALES
Cepa patrn ureasa positiva y negativa ( E. coli, Proteus )

Medio Agar urea segn Christensen
PROCEDIMIENTO
1.
2.
Por medio de la siembra por estra, sembrar la cepa positiva y negativa. No inocular en el fondo.
Incubar durante 18- 24 horas a 37C
INTERPRETACION
Prueba positiva: se observa de color rosado en la superficie o en todo el medio.
Prueba negativa: El medio permanece del color original
V.
PRUEBA DE LA CATALASA
La catalasa es una enzima que poseen la mayora de las bacterias aerobias y facultativa anaerobias.
El perxido de hidrgeno (H2O2) es uno de los productos finales del metabolismo oxidativo de los
carbohidratos y s se acumula es letal para el microorganismo.
La catalasa convierte el perxido de hidrgeno en agua y oxgeno de acuerdo a la siguiente reaccin:
2 H2O2 --------> 2 H2O + O2
La prueba es de vital importancia en la diferenciacin de los estreptococos (catalasa negativa) de los
estafilococos (catalasa positiva).
Pgina 20
MATERIALES
Cepas Controles: S. aureus, Streptococcus Enterococcus

Solucin de Perxido de hidrgeno (H2O2) al 3%
Medio de cultivo: cualquier medio slido, no inhibitorio, y sin sangre ya que los eritrocitos poseen
actividad de catalasa, por lo que su presencia puede dar resultados falsos positivos.
PRUEBA EN LMINA
a)
Con el asa bacteriolgica en punta o un aplicador estril, picar el centro de una colonia bien aislada y
transferir l inoculo a un portaobjetos limpio.
b) Aadir 1 a 2 gotas de H2O2 al 3%
c) Observar si se forman burbujas o no inmediatamente despus que se aade el reactivo.
d) Descartar la lmina en un recipiente con desinfectante.
PRECAUCIONES
1.
2.
3.
El orden de la prueba en lmina no debe invertirse cuando se use asa de platino, ya que puede resultar falso
positivo. El alambre de nichrone no interfiere en el resultado de la prueba.
La prueba debe realizarse en cultivos de 18- 24 horas; cultivos ms viejos pueden perder su actividad de
catalasa dando una reaccin falsa negativa.
El H2O2 es extremadamente acstico, por lo que se debe evitar que toque la piel, en caso que ocurra
inundar el rea afectada con alcohol de 70% para neutralizar la accin. NO DEBE USARSE AGUA.
INTERPRETACION
Prueba cualitativa: La aparicin rpida y prolongada de burbujas, de gas o efervescencia son indicativas de
catalasa positiva. Algunas bacterias poseen enzimas diferentes a la catalasa que descomponen el H2O2, dando
pocas burbujas diminutas durante 20- 30, stas no son catalasa positivas.
VI.
PRUEBA DE LA CITOCROMO OXIDASA

Los citocromos son hemoprotenas que contienen hierro y actan como el ltimo eslabn de la cadena
respiratoria aerobia, transfiriendo electrones (H) al oxgeno con formacin de agua. El sistema citocromo se
encuentra en los organismos aerobios o anaerobios facultativos, permitiendo identificar a organismos que
carecen de la enzima o son anaerobios estrictos.
En el laboratorio se hace reaccionar la bacteria con un sustrato oxidable como el dimetil o tetrametil- pfenilendiamina ( el cual se presenta en solucin, discos o tiras llamados comnmente oxidasa).
MATERIAL
Cepa control: sembrada en Agar nutritivo
Reactivo de oxidasa
PROCEDIMIENTO
1. Directo: Se aaden a las placas sobre la bacteria dos o tres gotas del reactivo.
2. Indirecto: Se toma con el asa un poco de la colonia bacteriana y se extiende sobre los discos o tiras de
papel que tienen ya el reactivo de oxidasa
INTERPRETACIN
Las colonias bacterianas con actividad Citocromo oxidasa desarrollan inmediatamente un intenso color azul
oscuro.
Pgina 21
VII.
PRUEBA DE LA HEMOLISINA
Algunos microorganismos son capaces de producir una serie de enzimas y sustancias txicas que pueden ser
detectadas al sembrar el microorganismo en una placa de Agar sangre, produciendo la lisis de los eritrocitos,
segn el tipo de lisis que producen pueden clasificarse en tipo Alfa, Beta y Gamma.
MATERIALES
Cepa bacteriana
Placas con Agar sangre de carnero

PROCEDIMIENTO
1. Con el asa en aro sembrar la cepa bacteriana en la placa de Agar sangre
2. Incubar por 18 24 horas a 37 C
INTERPRETACIN
Hemlisis tipo Alfa: Es un tipo de hemlisis incompleta, hay un enverdecimiento del medio debido a la salida
de un derivado del tipo de la metahemoglobina, que es oxidado a compuestos del tipo de la biliverdina
Hemlisis tipo Beta: Hay una lisis completa del eritrocitos observndose una zona clara alrededor de la colonia
VIII.
PROTOCOLO
PRUEBAS
BIOQUMICAS
MEDIO DE
CULTIVO
REACTIVO Y /O
INDICADOR
LECTURA
TSI
(Fermentacin- H2S)
VOGES- PROSKAUER
(VP)
ROJO DE METILO
(MR)
INDOL
CITRATO
CATALASA
UREASA
CITOCROMO
OXIDASA
HEMOLISINA
Pgina 22
ASOCIACIN
PRACTICA N 6
PRUEBAS DE SENSIBILIDAD A LOS ANTIBIOTICOS (ANTIBIOGRAMA)
INTRODUCCION
Es una prueba de laboratorio clnico que se utiliza para medir la actividad antibacteriana de los antibiticos y
quimioterapeticos empleados en el tratamiento de las enfermedades infecciosas.
La medida de la actividad antibacteriana puede realizarse por los siguientes mtodos:
Mtodo de dilucin
Mtodo de Difusin en Agar
OBJETIVOS
1.
2.
3.
Realizar la tcnica de difusin en Agar simple para determinar la susceptibilidad a los antibiticos.
Interpretar los resultados del mtodo utilizado.
Precisar las indicaciones y limitaciones de la tcnica empleada.
DILUCION EN TUBO
Permite estimar cuantitativamente la susceptibilidad de un antibitico, midiendo la concentracin inhibitoria mnima
(CIM), es decir, la concentracin ms baja que inhibe el crecimiento in vitro bacteriano.
Consiste en la preparacin de una serie de diluciones del antibitico estudiado en caldo o en medio agar al cual se
inocula luego una suspensin del germen. Luego de una incubacin por 24 horas, se puede observar la CIM como la
dilucin ms alta en la que no existe crecimiento macroscpico bacteriano. Esta tcnica es costosa por la cantidad de
material que se utiliza.
DIFUSION EN AGAR (Segn Kirby- Bauer y col.)

Es un mtodo simple de rutina en Microbiologa mdica, para seleccionar el antibitico o quimioterpico ms adecuado
en la terapia de las enfermedades infecciosas. Consiste en sembrar la muestra en estudio sobre toda la superficie de una
placa de Agar y colocar luego discos de papel filtro que contienen los antibiticos y que despus de una incubacin de 24
horas, se observan las zonas de inhibicin alrededor de cada disco de antibitico. La cantidad de antibitico presente en
el disco difiere para los distintos frmacos.
MATERIALES
Placas de Agar nutritivo

Placas de Agar Mller Hilton o Tripticase soya
Tubos con caldo nutritivo
Tubos con Agar semi- slido
Tubos con cultivo bacteriano
Asas de siembra
Torundas estriles
Discos impregnados con diferentes antibiticos o quimioterpicos (sensi- disck).
Pinzas
Mecheros
Pgina 23
PROCEDIMIENTO
1.
Sumergir la torunda en el caldo bacteriano, escurrir en las paredes del tubo y sembrar uniformemente sobre la
superficie de la placa de Agar.
2.
Dejar reposar por 5 minutos a temperatura ambiente.
3.
Con la pinza en condiciones estriles, colocar los discos impregnados con los diferentes antimicrobianos sobre la
superficie del Agar. La distancia entre los discos debe ser de 20mm.
4.
Incubar a 37C durante 24 horas.
LECTURA
a)
Medir en milmetros el dimetro de las zonas de inhibicin del desarrollo bacteriano alrededor de los discos,
incluyendo el dimetro del disco.
b) Comparar con la tabla el dimetro de las zonas de inhibicin obtenidas y determinar si el microorganismo es
Resistente ( R) , intermedio (I), o susceptible (S) a los diferentes antimicrobianos utilizados.
Un resultado intermedio (I) indica que el aislado es menos susceptible de lo normal, pero puede responder a dosis
altas del antibitico.
La cantidad de antibitico presente en el disco depende de la concentracin y de su capacidad de difusin en el agar.
c)
Anotar e interpretar los resultados.
PROTOCOLO
Desarrollar y esquematizar un cuadro indicando los resultados que se han obtenido en la prctica desarrollada.
CUESTIONARIO
1.
2.
3.
Cul es la importancia de su aplicacin.

En que casos usted indicara esta prueba
Que indica la Resistencia o Susceptibilidad de un microorganismo en esta prueba.
Pgina 24
ASOCIACIN
PRACTICA N 7
REACCION ANTIGENO ANTICUERPO: AGLUTINACIN
La aglutinacin es un fenmeno inmunolgico producto de una reaccin antgeno-anticuerpo en el que uno de los
reactantes es de naturaleza particulada, de tamao grande. Estas partculas pueden ser bacterias, eritrocitos, partculas de
ltex, bentonita, etc., y se encuentran recubiertas en forma natural o artificial por antgenos o anticuerpos. Al ser
suspendidas en un medio salino y mezclarse con antisueros o antgenos especficos, formaran los respectivos complejos
Ag-Ac observables a simple vista o con lentes de poco aumento.
AGLUTINACION BACTERIANA
Existen muchos mtodos comnmente empleados para demostrar la aglutinacin bacteriana, uno de los ms simples es la
aglutinacin en lmina o prueba de Widal, que consiste en la mezcla del antgeno con el suero del paciente en una
lmina. Esta tcnica ofrece un mtodo de muestreo rpido para anlisis de rutina.
MATERIALES
Lmina para aglutinacin ( lminas excavadas)

Antgeno bacteriano
Suero de paciente
Pipetas serolgicas de 0.2 ml
Palitos mondadientes
PROCEDIMIENTO
1.
2.
3.
4.
Con la pipeta colocar una gota del suero problema, en cada uno de los pocitos de una lmina de vidrio excavada.
Agregar una gota de cada uno de los antgenos a cada gota de suero de un mismo paciente.
Mezclar uniformemente con ayuda de un mondadientes distinto para cada gota.
Hacer rotar suavemente la lmina por espacio de 2 a 3 minutos.
RESULTADO
La aglutinacin se observa por la aparicin de grumos de tamao variable que tienden a agruparse en la periferia de la
gota. Anotar los resultados en su protocolo.
PROTOCOLO
TUBOS
REACTIVOS
ANTISUERO
0.08
0.04
0.02
0.01
0.005
ANTIGENO
TITULO
AGREGAR UNA GOTA A CADA TUBO

1/20
1/40
1/80
1/160
1/320
RESULTADO:
Ttulo del suero: .
Pgina 25
ASOCIACIN
PRACTICA N 7- A
FAGOCITOSIS
La lnea celular de defensa est ntimamente asociada con la lnea humoral. La fagocitosis o el englobamiento de
partculas extraas por ciertas clulas es un fenmeno no especfico, pero se incrementa cuando intervienen anticuerpos
especficos o complementos. Entre las clulas fagocticas se encuentran los polimorfonucleares y los macrfagos
(monocitos libres). A estas sustancias que demuestran habilidad para hacer a los antgenos ms susceptibles a la
fagocitosis se les llama OPSONINAS.
FAGOCITOSIS IN VITRO
Las pruebas OPSONOCITOFAGICAS son difciles de realizar, en comparacin con otras pruebas serolgicas, pero en
ciertos sistemas es la nica a ser utilizada. El antgeno y la sangre total (conteniendo los anticuerpos, complemento y
leucocitos) se incuban juntos y luego, muestras de estas mezclan se colorean.
El ndice fagoctico es el nmero promedio de partculas ingeridas por cada 100 Neutrfilos de la sangre.
MATERIAL
Cultivo en caldo de Staphylococcus y/o Klebsiella

Tubos de 13x100 con 0.5 ml de EDTA sdica al 1%
Una jeringa de 5 ml con aguja N 20
Pipetas Pasteur con perilla de jebe
Lminas portaobjetos
Colorante Wright
Agua tamponada
Bao Mara a 37C
Centrfuga
Gradilla
Microscopio con objetivo de inmersin
Aceite de cedro
PROCEDIMIENTO
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Con la jeringa hipodrmica recolectar 5 ml de sangre venosa.

Colocar en cada tubo con EDTA, 5 ml de sangre y mezclar suavemente.
Agregar 0.5 ml de cultivo bacteriano a cada tubo respectivamente.
Llevar los tubos a Bao Mara por 30 minutos, mezclando suavemente cada 10 minutos.
Centrifugar a 3000 r.p.m. por 5 minutos, cada tubo.
Recolectar con una pipeta Pasteur los elementos formes de la capa de glbulos blancos de cada tubo.
Realizar los frotices y colorear con Wright:
Cubrir el frotis con colorante Wright por espacio de 3 minutos.
Aadir agua tamponada y soplar suavemente realizando una buena mezcla.
Despus de 15 minutos, lavar con agua de cao.
Secar y observar con objetivo de inmersin.
RESULTADO
Se observar la presencia de grmenes intracelulares que han sido fagocitados.
Pgina 26
ASOCIACIN
PRACTICA N 8
REACCION DE PRECIPITACION
INTRODUCCION
Es una reaccin antgenoanticuerpo, en el que el antgeno es de naturaleza soluble. Cuando se mezcla un antgeno
soluble con su anticuerpo correspondiente se forma un precipitado en la zona de equivalencia y visibles por lo general
macroscpicamente. Las reacciones de precipitacin pueden realizarse en un gel como el Agar.
INMUNODIFUSION SIMPLE
Llamada tcnica de Mancini, se utiliza para determinar la concentracin de Inmunoglobulinas en el suero humano. En el
que, un anticuerpo conocido se incorpora a un medio de Agar noble y se deja gelificar; luego se realizan perforaciones en
el Agar donde se coloca el antgeno, procedindose luego a incubar, luego de lo cual, se realiza la lectura observndose
la formacin de un halo circular de precipitacin cuyo dimetro es proporcional a la concentracin antignica.
INMUNODIFUSION DOBLE
Llamada tambin mtodo de Ouchterloni, es til para comparar antgenos, detectar anticuerpos precipitantes, anticuerpos
antinucleares y antgenos en enfermedades. En esta prueba se emplea Agar semi-slido en portaobjetos, en el cual se
efectan perforaciones, los cuales se llenan con los elementos reaccionantes (antgenoanticuerpo) y luego de 12 a 24
horas de incubacin a temperatura ambiente, observamos la aparicin de bandas de precipitacin.
INMUNOELECTROFORESIS
Es til para la separacin de las protenas en un campo elctrico, permitiendo medir e identificar componentes sricos:
IgA, IgM, IgG, IgD e IgE, cadenas livianas y componentes monoclonales.
Resulta de la combinacin de la electroforesis con la inmunodifusin. En una primera fase los antgenos son colocados
en las perforaciones realizadas en el Agar y separados de acuerdo a su movilidad en un campo elctrico, luego de una
corrida electrofortica, se coloca el antisuero en una especie de surco longitudinal que se abre en el Agar frente a las
protenas que han migrado. Luego de incubar, se forman bandas de precipitacin frente a las Inmunoglobulinas
reaccionantes.
MATERIALES
Suero positivo
Antgeno
Lminas de vidrio con Agar noble al 1%
Placas Petri
Pipetas capilares
Lminas preparadas y coloreadas
PROCEDIMIENTO
1.
2.
3.
Con una pipeta capilar, colocar el suero (contiene los anticuerpos) en el orificio central.
Depositar en los orificios perifricos los antgenos a estudiar.
Colocar las lminas en una cmara hmeda.
RESULTADO
Observar las bandas de precipitacin que se forman:
Identidad total : Las bandas de precipitacin se unen.
Identidad parcial : Se observa un espoln.
No identidad
: Las bandas se cruzan.
Pgina 27
ASOCIACIN
PRACTICA N 9
PRUEBAS INMUNOENZIMATICAS: ELISA
INTRODUCCION
En los ltimos aos se han desarrollado numerosos mtodos para la deteccin de antgenos virales como de anticuerpos
especficos (Ig. M, Ig. G o Ig. Totales).
Se trata de procedimientos de alta sensibilidad, mucho mayor que la prueba de Hemaglutinacin o la prueba de Fijacin
de Complemento y similar a la prueba de Radioinmunoensayo (RIA).
Esta prueba se usa para medir la cantidad de anticuerpo presente en una muestra determinada utilizando colorantes
fluorescentes o enzimas con sustratos cromognicos, las que producen una reaccin de color.
Estas pruebas se conocen como Anlisis de Inmunoabsorbencia Ligada a Enzimas (enzime- linked immunosorbent
assay) ELISA.
La ventaja de ELISA con respecto a la prueba de Inmunofluorescencia consiste en que no es necesario un observador
experimentado y en que es posible procesar un gran nmero de muestras simultneamente en forma rpida y
automatizada.
PROCEDIMIENTO
Determinacin de Anticuerpo en fase slida
Sensibilizar una placa de poliestireno, tubo perla, esto consiste en absorber la superficie de la placa con el
anticuerpo especfico antiviral o anticuerpo de captura.
Luego se aade la muestra clnica, si esta contiene antgeno viral se unir al anticuerpo de captura
Esta unin se detectar mediante otro anticuerpo marcado con una enzima. Las enzimas ms usadas son la
peroxidasa, fosfatasa alcalina biotina- aviclina.
Luego, lavar cuidadosamente para eliminar el anticuerpo marcado no combinado con el antgeno.
Aadir el sustrato de la enzima.
Observar la presencia de color.
LECTURA
El desarrollo de color puede observarse visualmente o de preferencia con un colormetro o un espectrofotmetro.

A mayor cantidad de antgeno presente en la muestra, ms intenso ser el color observado.
Pgina 28
PRUEBA DE ELISA
(ESQUEMA)
Pgina 29
REACCIN DE PRECIPITACIN
(ESQUEMA)
Pgina 30
ASOCIACIN
PRACTICA N 10 - 11
SEMINARIO I: VACUNACIN Y SEROTERAPIA.
1. Objetivos de la vacunacin y Requisitos de una buena vacuna.

2. Tipos de vacunas y Consecuencias patolgicas de la vacunacin.
3. Practicas de vacunacin actual y Medidas de control
INMUNIDAD
4. Clulas del Sistema Inmune.

5. Respuesta inmunitaria en infecciones bacterianas y virales.
Pgina 31
ASOCIACIN
PRACTICA N 12
PREPARACION DE ANTIGENOS BACTERIANOS
INTRODUCCION
Antgeno es toda sustancia que introducida parenteralmente en el hombre o en los animales, induce la formacin de
anticuerpos o la aparicin de fenmenos de hipersensibilidad. "In vitro" y en presencia de factores accesorios, pueden
reaccionar con el anticuerpo especfico, dando lugar a fenmenos perceptibles.
Los Antgenos ms comunes en Medicina son: las bacterias, virus, toxinas, esporas de hongos, hematies, suero, etc.
Se aplican en las inmunizaciones y consisten en inocular un antgeno en dosis adecuadas y generalmente progresivas con
las siguientes finalidades.
1. Inducir en el hombre o en los animales, la formacin de anticuerpos que los protejan contra determinados procesos
infecciosos. Este mtodo conocido como vacunacin confiere inmunidad adquirida activa.
2. Obtener antisueros, o sea sueros que contengan anticuerpos, los cuales sern empleados en:
a) Seroterapia, para el tratamiento de diferentes enfermedades, como la difteria, ttanos, etc., en las cuales se
administran anticuerpos pre- formados confiriendo al paciente una inmunidad adquirida pasiva.
B) La tipificacin de especies bacterianas, lo que ha dado lugar a verdaderos esquemas de clasificacin, como el
de Kauffmann-White para las Salmonellas, el de Ewing para las Shigellas y el de Kauffmann-KnipschildtVahlne para Escherichia coli.
I.
PREPARACION DE ANTIGENOS BACTERIANOS SOMATICOS Y FLAGELARES,A PARTIR DE

CULTIVOS EN MEDIO SOLIDO.
A.
MATERIAL
B.
Cultivo bacteriano en medio slido y en desarrollo confluente

Cultivo bacteriano en medio lquido (caldo nutritivo)
Pipetas graduadas estriles de 5 cc.
Suero fisiolgico estril, repartido en frascos de 100 cc.
Embudos y gasa, estriles para filtrar
Acido fnico concentrado en tubos de 13x100 ml.
Formol concentrado, en tubos de 13x100 ml.
Pipetas de Pasteur, estriles
Escala de MacFarland (tubo N 3)
Pipetas graduadas de 1 ml.
Tubos vacos estriles de 16x150 ml.
Algodn y Alcohol yodado
Agar nutritivo en placas y tubos
PROCEDIMIENTO
1.
2.
3.
4.
Con una pipeta graduada, agregar 2 cc. de suero fisiolgico estril a los cultivos bacterianos presentados en
medio slido
Recoger por lavado todo el desarrollo bacteriano, tratando de no arrastrar agar
Filtrar a travs de gasa estril
Separar la suspensin en cantidades iguales en dos tubos de 13x100
Pgina 32
5.
Para preparar el Antgeno somtico "O", medir la cantidad de suspensin bacteriana de uno de los
tubos y agregar fenol en volumen necesario para alcanzar una concentracin de 0.5%.
Se puede as mismo inactivar las fracciones flagelares, sometiendo el antgeno a la ebullicin durante
dos horas, o tratndolo con alcohol absoluto.
Para preparar el Antgeno flagelar "H", inactivar las fracciones somticas en el otro tubo de suspensin
bacteriana, agregando formol puro hasta alcanzar una concentracin del 0.5%
Ambas suspensiones para poder ser inoculadas, se llevaran a una densidad de 9x10 8 grmenes por cc. para
lo cual se agregan con pipeta Pasteur a un tubo con 10 cc. de suero fisiolgico, gotas de cada uno de los
antgenos concentrados hasta alcanzar una turbidez similar al tubo N3 de la Escala de MacFarland.
6.
7.
Este es un Mtodo turbidimtrico de clculo bacteriano, que consiste en diluir el antgeno y apreciar la turbidez
obtenida comparndola con la de los tubos patrones de un nefelmetro o determinndola con exactitud mediante un
Espectrofotmetro.
El Nefelmetro ms conocido es el de MacFarland, que se obtiene de la siguiente manera:
Preparar una solucin de Cloruro de Bario al 1%
Otra de cido sulfrico al 1%.
Colocar una serie de 10 tubos vacos y estriles
Agregar las soluciones, de acuerdo al siguiente cuadro:
TUBO N
Cl2Ba 1%
0.1 cc.
10
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
1.0
9.4
9.3
9.2
9.1
9.0
2.1 x
109
2.4 x
109
2.7 x
109
3.0 x
109
H2SO4 1%
9.9 cc.
9.8
9.7
9.6
9.5
Bacterias
por cc.
3.0 x
108
6.0 x
108
9.0 x
108
1.2 x
109
1.5
109
1.8
109
La unin de ambos reactivos qumicos forma un precipitado blanco de Sulfato de bario que al homogenizarse da una
turbidez que es ms intensa cuanto mayor es la cantidad de Cloruro de bario empleado. A cada tubo corresponde una
concentracin de grmenes determinada, de acuerdo a lo sealado en el cuadro.
C. CONTROL DE ESTERILIDAD
Sembrar cada uno de los antgenos preparados, en caldo nutritivo y/o agar sangre, con la finalidad de
controlar su esterilidad
Realizar la observacin a las 18 24 horas, no debe haber crecimiento bacteriano.
Resultado: Realizar un protocolo del trabajo realizado en la prctica.

D. INOCULACION
1.
2.
D.
Inocular en la vena marginal de la oreja del conejo dosis de 0.25 cc., 0.5cc., 0.75cc., 1.0cc., 1.5cc., 2.0cc.,
2.5cc., hasta 3.0cc., del antgeno, con intervalo de 4 a 5 das.
Realizar la sangra despus de 4 das de la ltima inyeccin.
DESARROLLAR UN PROTOCOLO DE INOCULACIN (DEMOSTRACION)
Pgina 33
ASOCIACIN
PRACTICA N 13
AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE COCOS GRAM POSITIVOS:

GENERO STAPHYLOCOCCUS
INTRODUCCION
Los Estafilococos pertenecen a la Familia Micrococcaceae y son organsmos redondos u ovales, agrupados
generalmente en forma de racimos, inmviles, no esporulados, y Grampositivos en los cultivos jvenes. Son habitantes
naturales de la flora nasal, boca, piel e intestinos, pero como patgeno es causante de diversos procesos infecciosos que
van desde fornculos, abscesos, intoxicaciones alimentarias hasta septicemias mortales. De las tres especies conocidas
S. aureus, S. epidermidis y S. saprophyticus, slo dos tienen importancia mdica. Slo la especie patgena S. aureus
produce una enzima llamada coagulasa.
MATERIALES
Tubos con secrecin purulenta

Placas Petri con Agar hipertnico de Chapman
Placas Petri con Agar sangre
Tubos con Caldo plasma
Lminas portaobjetos
Set de colorantes para Gram
Asa de platino en aro
PROCEDIMIENTO:
1.
2.
3.
4.
5.
Sembrar la muestra problema en las placas con Agar hipertnico de Chapman y Agar sangre, empleando el mtodo
de dispersin-agotamiento
Realizar un frotis de la muestra y colorearla con Gram.
Observar placas sembradas con Staphylocococcus con 24-48 horas de incubacin a 37C, estudiando las
caractersticas de las colonias en medios de Agar sangre y Agar Hipertnico de Chapman (tamao, forma ,
pigmento, hemolisis, etc.)
De la placa con Agar sangre y Agar Hipertnico de Chapman, tomar una asada de una colonia de color amarillo e
inocularlo el tubo con caldo plasma e incubar a 37C (Prueba de la coagulasa)
Realizar la prueba de la Catalasa.
RESULTADOS:
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Caractersticas macroscpicas de la muestra:

Resultado de la coloracin realizada
Resultado de la reaccin de la Coagulasa, en caldo plasma observar que slo S. aureus coagula el plasma.
Resultado de la reaccin de Catalasa, agregando agua oxigenada y observando la aparicin de burbujas.
Resultado en Agar hipertnico de Chapman observar las colonias amarilla (manita positivas) de S. aureus y S.
epidermidis.
Observar la presencia de hemlisis en las placas con Agar sangre
Pgina 34
PROTOCOLO:
Realizar un protocolo de trabajo indicando: la especie bacteriana que se trabajo, tamao de la colonia, forma que
presenta, pigmento, hemlisis, y otras caractersticas que crea conveniente.
Complete el cuadro con lo realizado durante la practica.
CEPAS
BACTERIANAS
TRABAJADAS
MH
AS
COAGULASA
CATALASA
GRAM
Caracterstica
morfolgica
CUESTIONARIO:
1.
2.
3.
4.
Que factores condicionan la patogenicidad de Staphylococcus aureus.

Que caractersticas fisiolgicas identifican a Staphylococcus aureus.
Mencione de que cuadros infecciosos son causantes las especies de Staphylococcus.
Cul es la composicin del Medio hipertnico de Chapman
Pgina 35
ASOCIACIN
PRACTICA N 14
AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE COCOS GRAM POSITIVOS:

GENERO STREPTOCOCCUS
INTRODUCCION
El gnero Streptococcus comprende muchas especies agrupadas segn la clasificacin de Lancefield en los grupos A (S.
pyogenes); B (S. agalactiae); C (Ej. S. equi); D (Ej. Enterococos); G (S. canis); H (S. sanguis); K (S. salivarius) y
Streptococcus pneumoniae (no pertenece a ningn grupo). Con la coloracin de Gram se comportan como positivos
adoptando formas de cadenas. Algunos son patgenos para el hombre y los animales, otros forman parte de la flora
normal o transitoria del cuerpo humano y otros son saprofitos.
Los Streptococcus desarrollan en medios enriquecidos como el agar sangre, que permite diferenciar algunas especies en
base a la hemlisis producida. La hemolisis tipo es incompleta, los glbulos rojos que rodean a la colonia son
parcialmente daados pero no lisados como sucede en la hemolisis tipo . Existe un enverdecimiento del medio debido a
la salida del eritrocito de un derivado del tipo de la metahemoglobina, que es oxidado a compuestos como la biliverdina.
El grupo de estreptococos alfa hemolticos se denominan S. viridans. La mayora de Streptococcus pueden desarrollar
en presencia o ausencia de oxgeno. Diversas pruebas bioqumicas permiten la diferenciacin de las especies de
Streptococcus.
MATERIAL
Cultivo de Streptococcus en medio de caldo BHI

Placas con Agar sangre de carnero
Torunda estril y bajalengua
Tubos con Thioglicolato
Tubos con caldo Inulina
Discos de Bacitracina
Discos de Optochin
Solucin de Desoxicolato al 2%
Tubo con ClNa al 6.5%
Lminas portaobjetos
Set de colorantes de Gram- Kopeloff
Asas de Kolle, pinzas
Microscopio, aceite de inmersin.
PROCEDIMIENTO
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Observar el desarrollo de la cepa de Streptococcus en el medio de caldo BHI, observe si el crecimiento produce
turbidez o sedimenta.
Tomar una muestra de la garganta con ayuda de la torunda estril, y sembrar en el Agar sangre por el mtodo de
dispersin y agotamiento, rotular, incubar a 37C por 18- 24 horas. Con la misma torunda realizar un frotis en la
lmina portaobjetos y colorear por Gram.
Realizar la siembra de la cepa en la otra placa con Agar sangre por el mtodo de dispersin agotamiento, en el
primer cuadrante colocar un disco de Bacitracina, en el segundo cuadrante el disco de Optochin, incubar a 37C por
18- 24 horas.
Sembrar la cepa en el medio de Thioglicolato.
Sembrar la cepa en el caldo de Inulina.
Sembrar la cepa en el tubo con ClNa al 6.5%
Pgina 36
LECTURA
1.
2.
3.
4.
5.
Observar el desarrollo en el Agar sangre sembrada con muestra de la garganta, determinar que colonias son
sospechosas de Streptococcus . Realizar el frotis de las colonias sospechosas y colorear por Gram.
Observar el tipo de hemlisis, la sensibilidad a la Bacitracina y Optochin en la otra placa de Agar sangre. En la
misma placa agregar una gota del Desoxicolato de sodio al 2% sobre una o varias colonias aisladas e incubar a 35C
durante 30 minutos. De otra colonia aislada, realizar un frotis y colorear por Gram.
Observar el metabolismo a la Inulina.
Observar el desarrollo en el medio de Thioglicolato.
Observar el desarrollo en la solucin de ClNa al 6.5%
PROTOCOLO
Realizar un protocolo de trabajo de la prctica realizada
IDENTIFICACION PRESUNTIVA DE STREPTOCOCOS
ORGANISMO
- hemolticos
GRUPO A
S. pyogenes
CAM
SENSIBILIDAD P
Baci
Opto
tra
chin
cina
Hidrlisis
De
Hipu Escu
Rato lina
Metabo
Lismo
De
La
Inulina
Desarro
llo
Lisis por
Bilis
NaCl
6.5%
Desoxi
colato
Sodio
GRUPO B
S. agalactiae
R*
P*
GRUPO C, F, G
- hemolticos
GRUPO Viridans
R*
N*
S. pneumoniae
P*
S= Sensible; R= Resistente; N= Negativo; P= Positivo; *= Reaccin variable
CUESTIONARIO
1.
2.
3.
Que prueba de laboratorio realizara para diferenciar Str. Pneumoniae de los Streptococcus del grupo viridans
El Streptoccocus beta hemoltico es causante de que tipo de infecciones.
Cual es la importancia de la cpsula polisacrida que presenta el Pneumococo
Pgina 37
ASOCIACIN
PRACTICA N 15
AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE COCOS GRAM NEGATIVOS: GENERO NEISSERIA
INTRODUCCION
Las Neisserias son cocos Gram negativos, que se presentan caractersticamente en pares, con los lados adyacentes
aplanados, simulando granos de caf. Comprende varias especies, entre stas N. Gonorrhoeae, y N. Meningitidis,
causan frecuentemente enfermedad significativa en el hombre. En muestras clnicas del tracto urogenital u otras, se tien
adicionalmente con el colorante azul de metileno, observndose las Neisseria intra y extracelularmente.
Estos microorganismos son exigentes y requieren medios enriquecidos como el Agar chocolate, que le proporciona una
rica fuente de hierro y el Agar Thayer Martin.
La mayora de las especies requieren para el crecimiento una humedad relativamente alta y una tensin de CO2 entre 5 a
10%. Desarrollan a temperaturas exactas entre 35 a 37C y un pH de 7.2 a 7.6.
Todas las especies producen catalasa y Citocromo- oxidasa, que permiten diferenciarlos de otros microorganismos
morfolgicamente similares.
La diferenciacin bioqumica se realiza por pruebas de utilizacin de hidratos de carbono: Glucosa, maltosa, sacarosa y
lactosa.
El diagnstico de gonorrea requiere una estrecha cooperacin entre el mdico y el laboratorio.
Se debe considerar los siguientes aspectos:
a) Recoleccin correcta de la muestra.
b) Seleccin del recipiente apropiado para el transporte y rpido envo al laboratorio.
c) Seleccin del medio de cultivo apropiado
d) Aislamiento e identificacin de la bacteria en el laboratorio.
MATERIALES
Placa con Agar Thayer Martin sembrada con Neisseria

Placa con Agar chocolate sembrada con Neisseria
Muestra clnica de secrecin endocervical.
Lmina control con frotis de Neisseria coloreada con Gram
Reactivo de Citocromo- oxidasa
Reactivo de catalasa
Lminas portaobjetos
Set de coloracin de Gram
Colorante de Azul de metileno
Microscopio
Asas de siembra en aro y punta
Solucin de alcohol yodado
Algodn y Xilol.
Pgina 38
METODOLOGIA
1.
2.
3.
4.
Observar en el medio de Thayer Martin y Agar chocolate, las colonias pequeas, circulares de bordes continuos,
blanco- grisaceos, convexas, brillantes o ligeramente opacas si corresponden a N. Gonorrhoeae y si es N.
Meningitidis colonias pequeas de borde entero, circulares, translcidas o ligeramente opacas.
Dejar caer una gota del reactivo de oxidasa sobre una colonia y observar entre los 2- 3 minutos el cambio de color
del rosado al marrn o negro, que corresponde a una prueba de oxidasa positiva.
Realizar un frotis de la colonia oxidasa positiva y colorearla por el Gram. Comparar con la lmina control.
Realizar un frotis de la muestra clnica de secrecin endocervical y colorearla con el azul de metileno.
PROTOCOLO
MEDIO DE CULTIVO
MUESTRA
COLONIAS
TAMAO
OXIDASA
CATALASA
GRAM
AZUL
DE
METILENO
AGAR THAYER MARTIN
AGAR CHOCOLATE
SECRECION
ENDOCERVICAL
PRUEBAS BIOQUIMICAS
Cuestionario:
1.
2.
3.
Como diferenciara bioqumicamente Neisseria gonorrhoeae de N. meningitidis

Porque necesitan de un medio enriquecido como el Agar chocolate para su desarrollo
Que otras Neisserias conoce y cual es su habitat.
Pgina 39
ASOCIACIN
PRACTICA N 16
AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE BACILOS GRAM POSITIVOS:

GENERO BACILLUS
INTRODUCCION
El gnero Bacillus agrupa microorganismos aerobios Grampositivos, formadores de esporas y que pueden sobrevivir en
el ambiente por muchos aos. Algunas especies causan enfermedades en el hombre y los animales como el B. anthracis
causante de la enfermedad conocida como "carbunco", otros como el B. cereus, B. subtilis, B. megaterium y B.
mycoides son saprofitas y se encuentran en el suelo, agua y aire.
La especie patgena B. anthracis, causante del carbunco en los procesos patolgicos se presenta como un bacilo
rectilneo, Gram positivo, grueso, inmvil y capsulado. En los cultivos, las colonias son grandes, mates, rugosas con
bordes festoneados (aspecto de cabeza de medusa), se agrupan en largas cadenas, sin cpsula y conforme el cultivo
envejece forman esporas.
MATERIALES
Muestra bacteriana
Placas Petri con Agar nutritivo
Tubos con Caldo nutritivo
Tubos con Agar semi-slido
Tubos con gelatina
Lminas para frotices
Set de coloracin de Hiss para cpsula
Set de coloracin de Wirtz Conklin para esporas
Asa de Kolle
PROCEDIMIENTO
1.
2.
Sembrar la muestra en placas de Agar sangre, Agar nutritivo, caldo nutritivo y gelatina.
Preparar frotices para colorear con Gram, Hiss, y Wirtz Conklin.
COLORACION HISS (PARA CAPSULA)

1) Preparar un frotis
2) Cubrir con Fucsina bsica y calentar hasta el desprendimiento de
De vapores por 30 segundos
3) Lavar con solucin acuosa de Sulfato de cobre al 20%.
4) Lavar con agua corriente y secar
5) Observar al microscopio con lente de inmersin
Pgina 40
COLORACION DE WIRTZ CONKLIN ( PARA ESPORAS)

1) Preparar un frotis
2) Cubrir con verde de malaquita y calentar hasta el desprendimiento de
vapores por 5 minutos (adicionar colorante cada vez que falte)
3) Lavar con agua corriente
4) Colorear con safranina al 0.5% por 1 minuto
5) Lavar y secar
6) Observar al microscopio con lente de inmersin
LECTURA:
EN LOS CULTIVOS
En Agar sangre: Las colonias se observan blanco grisceo, no hemoflica en las especies patgenas y - hemolticas en
las especies saprofitas.
En Agar nutritivo: Se observan bacilos endoesporulados
En caldo nutritivo: Se observa un sedimento en el fondo del tubo.
En Agar semi-slido: Se observa un crecimiento en forma de pino invertido
En Gelatina: slo las especies saprofitas producen hidrlisis.
EN LAS LAMINAS COLOREADAS
Gram
Hiss
Wirtz Conklin
: Bacilos Grampositivos dispuestos en cadenas, las esporas generalmente se ubican en el centro de

bacilo.
: El cuerpo bacteriano se observa de color prpura y la cpsula de color claro o incolora.
: El cuerpo bacteriano se observa de color rosado y la espora de color verde.
RESULTADOS
A) DE LOS MEDIOS DE CULTIVO:
GENERO
ESPECIE
PATGENA
BACILLUS
ESPECIE
SAPROFITA
Caldo nutritivo
Agar nutritivo
Agar sangre
Agar semi-slido
Hemolisis
Hidrlisis de la gelatina
Prueba de la Catalasa
Fermentacin salicina
Movilidad
Pgina 41
ASOCIACIN
PRACTICA N 16 - A
AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE BACILOS GRAM POSITIVOS: GENERO LISTERIA
INTRODUCCION
El gnero Listeria comprende bacilos Grampositivos, microaerfilos, no esporulados, mviles y presentan flagelos
peritricos. Se presentan aislados o en grupos de dos en cadena o en forma de V de Y. Esta ampliamente distribuido en
la naturaleza, en los vegetales en descomposicin, en el suelo, en las heces de los portadores sanos animales y hombres.
La especie patgena es Listeria monocytogenes y la enfermedad que causa se le conoce como Listeriosis, la cual
compromete los ganglios linfticos, produce sntomas neurolgicos, encefalitis aguda y monocitosis en sangre.
El microorganismo se puede aislar de la sangre, lquido cefalorraqudeo y de las heces, desarrolla bien en medios de
cultivo comunes.
MATERIAL
Tubos con Caldo nutritivo

Tubos con medios semislidos (Motilidad)
Placas Petri con Agar nutritivo
Tubos de 13x100 con:
Agar urea de Christensen
Citrato de Simmons
Caldo rojo de fenol con glucosa
Caldo rojo de fenol con sacarosa
Caldo rojo de fenol con lactosa
Caldo rojo de fenol con manita
Caldo rojo de fenol con salicina
Caldo esculina
Caldo MR-VP
PROCEDIMIENTO
1.
2.
3.
4.
Hacer frotices a partir de una colonia en Agar y colorearla con Gram.

Preparar una lmina en fresco a partir de una suspencin bacteriana en caldo nutritivo, entre lmina y laminilla.
Sembrar la muestra en el medio semi-slido, placas de Agar sangre, Agar nutritivo, y en los diferentes medios
diferenciales
Dejar en incubacin por 24 a 48 horas a 37C.
LECTURA
FROTICES CON GRAM

: Se observaran como bacilos Grampositivos.
LAMINAS EN FRESCO
: Se observar la movilidad peritrica, utilizando los objetivos de 40 aumentos.
EN CALDO NUTRITIVO
: Se observar una turbidez tenue y homognea.
EN AGAR SANGRE
: Se observar colonias pequeas con hemolisis tipo Beta.
EN MEDIOS DIFERENCIALES
: Observar
MOVILIDAD
HEMOLISINA
CATALASA
OXIDASA
UREA
CITRATO
+
+
+
-
GLUCOSA
SACAROSA
LACTOSA
MANITA
SALICINA
ESCULINA
+
+
+
MR
VP
+
+
Pgina 42
ASOCIACIN
PRACTICA N 17 - 18
"ESTUDIO MICROBIOLOGICO DE LA FLORA NORMAL DE LA SECRECION BUCOFARINGEA
INTRODUCCION
La flora normal se adquiere con rapidez durante y poco despus del nacimiento, y cambia de forma continua a lo largo
de la vida. Los organsmos presentes en un determinado momento dependen de la edad, nutricin y medio ambiente del
individuo, por lo que es difcil determinar la flora normal de cada individuo ya que depende en gran parte de los factores
antes enunciados; ejemplo, los lactantes alimentados con leche materna tienen Estreptococos y Lactobacilos en su tracto
gastrointestinal, en los pacientes que estn recibiendo grandes dosis de antibiticos presentan un gran desarrollo de
levaduras.
La nariz y la boca pueden ser intensamente colonizados por bacterias como Estreptococos, Estafilococos, difteroides, y
cocos gramnegativos.
La superficie de los dientes y los surcos gingivales contienen un gran nmero de bacterias anaerobias.
La rinofaringe esta habitada generalmente por estreptococos no hemolticos y diplococos gramnegativos, en ella puede
poblarse un gran numero de especies patgenas como Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis, S.
pyogenes, Klebsiella pneumoniae y Haemophilus influenzae.
MATERIALES
Caldo nutritivo en tubos (13 x 100)

Agar nutritivo en placas
Agar sangre en placas
Agar chocolate en placas
Medio hipertnico de Chapman en placas
Agar Mac Conkey en placas
Agar Sabouraud en tubos
Torundas estriles (2 x tubo)

Baja lengua
Asa de Kolle en aro
Laminas portaobjetos
Set de colorante Gram
PROCEDIMIENTO
A. PRIMER DIA
1.
2.
3.
Con ayuda de torundas estriles y el baja lengua, tomar una muestra de la orofaringe.
Sembrar las muestras, en los diferentes medios de cultivo.
Incubar las placas y tubos sembrados por 24 a 48 horas a 37C
B. SEGUNDO DIA
LECTURA
Con la ayuda del Profesor, el alumno proceder a hacer el estudio de lo que ha desarrollado en los medios de cultivos.
IDENTIFICACION
Sembrar en los diferentes medios de cultivo para el estudio bioqumico correspondiente y pruebas de patogenicidad si se
requiere.
- Caldo plasma en tubo
- Reactivo de Citocromo- oxidasa
- Disco de Bacitracina
- Reactivo de catalasa
- Disco de Optochin
PROTOCOLO
El alumno realizar un cuadro estadstico con los resultados obtenidos.
Pgina 43
ASOCIACIN
PRACTICA N 19 - 20
AISLAMIENTO E IDENTIFICACCION DE BACILOS ACIDO- ALCOHOL- RESISTENTES

GENERO MYCOBACTERIUM.
INTRODUCCION
Este gnero esta conformado por microorganismos que se caracterizan por tener morfologa bacilar, poseen un alto
contenido de lpidos complejos en su estructura qumica y se desarrollan lentamente en los medios de cultivo frente a los
cuales son exigentes con los componentes nutritivos.
Existen especies patgenas para el hombre y los animales, as como especies saprofitas en el aire, en el agua y en la
tierra.
Las especies patgenas para el ser humano son: Mycobacterium tuberculosis variedad Hominis, que puede infectar
cualquier lugar del organismo, siendo la localizacin pulmonar, renal y digestiva los mas frecuentes y el esputo es el
espcimen clnico ms comn para establecer el diagnstico especfico a travs de la baciloscopia.
Mycobacterium leprae produce la lepra enfermedad de Hansen; Mycobacterium bovis, Mycobacterium avium,
Mycobacterium kansasi y Mycobacterium simiae, con menor frecuencia, tambin, son patgenos.
MATERIALES
Un frasco de boca ancha con muestra de esputo positivo

Lminas portaobjetos nuevas y desengrasadas
Lminas con extensiones de M. Tuberculosis var. Hominis
Lminas con extensin de otros tipos de Mycobacterias
Set de colorante de Gram
Set de colorante de Ziehl- Neelsen (col. A. A. R.)
Cepas patrones sembradas en medio Lownstein jensen + verde de malaquita
PROCEDIMIENTO
1.
2.
3.
4.
Observar los caracteres macroscpicos del esputo: sangre, mucoide, mucopurulento.

Tomar una partcula mucopurulenta del esputo y hacer una extensin homognea sobre la lmina portaobjetos
nueva.
Fijar la preparacin.
Realizar una coloracin con Gram y otra con Ziehl- Neelsen
El mismo procedimiento se sigue con muestras de orina, heces, lquido cefalorraqudeo, lquido pleural, etc.
LECTURA
Observar como los grmenes visibles por el Gram, no aparecen en la coloracin de Ziehl- Neelsen porque no son cidos
alcoholes resistentes.
El bacilo de Koch y los otros Mycobacterium en cambio aparecen como elementos bacilares rojos en un fondo azul.
Pgina 44
EXAMEN MICROSCOPICO CUANTITATIVO

Enfocar con el objetivo de 100x la lmina referencial, cuantificar la cantidad de bacilos en toda la longitud de los 2/3 del
extendido que corresponde aproximadamente a 100 campos y anotar los resultados, segn el siguiente cuadro:
Negativo
Positivo (+)
Positivo (++)
Positivo (+++)
: No se observan bacilos en 100 campos.

: Menor de 1 bacilo por campo, en 100 campos.
: De 1 a 10 bacilos por campo, en 50 campos.
: Ms de 10 bacilos por campo, en 25 campos.
La lectura cuantitativa permite controlar la evolucin del paciente que esta en tratamiento y permite detectar aquellos que
sean resistentes al tratamiento.
TIPIFICACIN DE MICOBACTERIAS
Se investiga la velocidad de desarrollo y la produccin de pigmento, permitiendo clasificarlos en grupos.
I. Cepas que desarrollan en 8 ms das. Llamadas de desarrollo lento.
GRUPO I:
Pigmentan por estmulo de la luz. Son fotocromgenas.

Ejemplo: M. kansasi , M. simiae
GRUPO II:
Pigmentan sin necesidad de estmulo luminoso. Son escotocromgenas. Ejemplo: M. scrofulaceum
GRUPO III:
No pigmentan espontneamente, ni por estmulo luminoso.

Son no cromgenas. Ejemplo: M. tuberculosis var. Humano
y M. tuberculosis var. Bovina
II. Cepas que desarrollan en 7 das o menos.
GRUPO IV:
Pueden pigmentar o no pigmentar. Ejemplo: M. fortuita
PROTOCOLO DE TRABAJO:
Realizar esquemas de lo realizado y observado en la prctica correspondiente.
Pgina 45
ASOCIACIN
PRACTICA N 21 - 22
SEMINARIO II: ANTIBITICOS Y QUIMIOTERPICOS
1. Clases de agentes antibacterianos

1.1: Inhibidores de la sntesis de la pared celular
1.2: Inhibidores de la sntesis de protenas
2. Clases de agentes antibacterianos y antituberculostticos

2.1: Inhibidores de la sntesis de cidos nucleicos
2.2: Inhibidores de la funcin de la membrana citoplasmtica
3. Resistencia a los agentes antibacterianos

1. : Gentica de la resistencia
2. : Mecanismos de resistencia
4. Clases de agentes antivirales

4.1: Gentica de la resistencia
4.2: Mecanismos de resistencia
5. Clases de agentes antimicticos

5.1: Gentica de la resistencia
5.2: Mecanismos de resistencia
Pgina 46
ASOCIACIN
ASIGNATURA: MICROBIOLOGIA MDICA
PRACTICA N 23
AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE BACILOS GRAM NEGATIVOS: GENERO PSEUDOMONA
INTRODUCCION
La especie Pseudomona aeruginosa es un bacilo Gram negativo, casi todas son mviles con flagelos polares
monotricos y multitricos, no poseen cpsula, no forman esporas, no son exigentes para su desarrollo In Vitro.
Pseudomona aeruginosa es la especie ms frecuentemente asociada con enfermedad humana, principalmente
quemaduras severas, pero tambin se aslan de orina, sangre, lavados bronquiales, esputo y tracto genital femenino.
En pacientes comprometidos pueden causar infecciones con riesgo de vida fatales.
La deteccin del pigmento piocianina en el medio de cultivo es virtualmente diagnstica de P. aeruginosa, la
mayora de los aislamientos producen tambin el pigmento fluoresceina y desarrollan bien a 42C.
MATERIAL
Cepa de Pseudomona aeruginosa en caldo nutritivo.

Caldo Tripticase en tubo de 16 x 150
Agar nutritivo en Placa Petri
Agar Mac Conkey en tubo 16 x 150
Agar semi-slido en tubo de 13 x 100
Medio TSI
Reactivo de Oxidasa
Frasco con cloroformo
Set de colorantes Gram
Lminas portaobjetos
PROCEDIMIENTO
1.
2.
3.
Hacer un frotis a partir de la cepa Pseudomona aeruginosa y colorear por el mtodo de Gram.
Sembrar la cepa de P. aeruginosa en los diferentes medios de cultivo, por las tcnicas conocidas.
Incubar a 37C por 24- 48 horas.
RESULTADOS
COLORACION DE GRAM
CALDO NUTRITIVO
AGAR MAC CONKEY
MEDIO TSI
AGAR NUTRITIVO
CALDO TRIPTICASE
: Bacilos pequeos, Gram negativos.

: Observar el crecimiento abundante en el medio, el pigmento de color verdoso
y un olor caracterstico.
: Observar colonias grises claro, no fermentadoras de lactosa.
: No hay cambios, ya que P. aeruginosa y otras especies de este gnero no
fermentan los carbohidratos [utilizan los carbohidratos slo por va oxidativa
en el medio de oxidacin- fermentacin (OF)].
: Describir la colonia, observar la difusin del pigmento en el agar, y realizar la
prueba de la oxidasa, que es positiva para P. aeruginosa.
: Agregar 1 ml de cloroformo para extraer el pigmento de la piocianina.
Pgina 47
PROTOCOLO
CARACTERSTICAS
MICROORGANISMOS
Pseudomona aeruginosa
Crecimiento en Mac Conkey
Reacciones en TSI
Difusin de Pigmento en Agar nutritivo
Prueba de Citocromo- oxidasa
Solubilidad Cloroformo- piocianina
Crecimiento Agar nutritivo
Agar semislido
Pgina 48
ASOCIACIN
PRACTICA N 24
AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE BACILOS GRAM NEGATIVOS: GENERO BRUCELLA

HEMOCULTIVO Y SEROLOGIA
INTRODUCCION
Son microorganismos pequeos, usualmente cocobacilares, inmviles no formadores de esporas. Son Gram negativos y
necesitan una tincin prolongada con la fucsina bsica de por lo menos 2 minutos en lugar de los 30- 60 segundos de
tincin convencional de Gram.
La enfermedad conocida como Brucelosis o Fiebre Malta es causada por las siguientes especies Brucella melitensis,
Brucella suis, Brucella abortus.
Su multiplicacin y desarrollo in vitro es muy lento, necesitan de medios especiales como el Agar Brucella o Caldo
tripticasa soya.
Para la identificacin de especies se utiliza una serie bioqumica para observar la produccin de H 2S, hidrlisis de la
urea, desarrollo en medios especiales con fucsina 0.002 % , Thionina 0.002 % y requerimiento de CO2.
DIAGNOSTICO DE LABORATORIO
Este microorganismo puede ser aislado de la sangre, lquido cefalorraqudeo, mdula sea o biopsias de ganglios
linfticos e hgado.
I: HEMOCULTIVO
Para el Hemocultivo se utiliza el medio de doble fase (slido + lquido) de Ruiz- Castaeda. La incubacin debe hacerse
en una atmsfera de 5- 10% de CO2 a 35- 37C. Las colonias aparecen entre el 4 al 5 da, pero los cultivos deben ser
incubados hasta los 30 das antes de ser descartado como negativo.
II: SEROLOGIA
Para el diagnstico serolgico se utilizan las tcnicas de:
1. Aglutinacin rpida en placa (Huddleson)
2. Aglutinacin lenta en tubo (Wright)
3. Prueba de aglutinacin del 2- mercaptoethanol (2- ME)
4. Prueba modificada de Coombs (antiglobulina)
5. ELISA
MATERIAL
Tubo con cepa de Brucella

Frascos con medio de Ruiz- Castaeda
Muestra de sangre total de paciente
Agar fucsina en placa
Agar Thionina en placa
Suero positivo y suero control negativo
Antgeno estandarizado de Brucella
Lminas excavadas
Pipetas de 0.2 ml
Palito mondadientes
Lminas portaobjetos
Pgina 49
PROCEDIMIENTO
I: HEMOCULTIVO
Agregar 5 ml. de sangre de paciente sospechoso a Brucelosis en el medio de Ruiz- Castaeda, e incubar por 4 a 5 das a
37C.
COLORACION
Realizar un frotis de la cepa desarrollada en Caldo trypticase y colorearla por el mtodo de Gram, siguiendo las
recomendaciones sealadas anteriormente.
II: SEROLOGIA
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Con la pipeta de 0.01 colocar una gota de suero negativo en el primer crculo de la 2da. Lnea de la lmina
excavada.
Con la pipeta de 0.01 ml colocar en la lmina excavada, las siguientes cantidades de suero positivo:
0.08, 0.04, 0.02, 0.01 y 0.005 ml respectivamente.
A cada alicuota de suero aadir una gota de antgeno, equivalente a 0.03 ml.
Mezclar cuidadosamente por rotacin, con ayuda de un palito mondadiente empezando por el suero negativo y la
dilucin ms alta 1:400
Dejar en reposo por espacio de 3 minutos, luego rotar la lmina durante un minuto y dejar en reposo por 4 minutos
ms.
A los 8 minutos no ms, observar la presencia de grumos (aglutinacin) que indica una reaccin positiva antgenoanticuerpo y el titulo de anticuerpo alcanzado.
INTERPRETACION
SUERO
0.08
0.04
0.02
0.01
0.005
ANTIGENO
+
+
+
+
+
0.03
0.03
0.03
0.03
0.03
DILUCION / TITULO
25
50
100
200
400
+
++
+++
++++
+++++
DIFERENCIACION BIOQUIMICA
ESPECIES
DE
BRUCELLA
B.abortus
B.melitensis
B.suis
B.canis
Husped
Preferido
Bovino
Cabra, oveja
Cerdos
Perros
PRUEBAS DE DIFERENCIACION
Necesidad
Produccin
Hidrlisis
Crecimiento en
CO2(5%)
de H2S
de Urea
Fucsina
Thionina
0.002 %
0.002 %
+
++
Dbil
+
Dbil
+
+
+
Fuerte
+
Fuerte
+
Pgina 50
ASOCIACIN
PRACTICA N 25 26
SEMINARIO III:
EPIDEMIOLOGIA DE LA TUBERCULOSIS EN EL PER
1. PREVALENCIA Y RIESGO ANUAL DE INFECCIN POR TUBERCULOSIS EN

ESCOLARES DE LIMA CALLAO
2. PREVALENCIA Y RIESGO ANUAL DE INFECCINPOR TUBERCULOSIS EN
ESCOLARES DE PROVINCIAS DEL PAIS
3. PREVALENCIA Y RIESGO ANUAL DE INFECCIN POR TUBERCULOSIS EN
PERSONAS ADULTAS Y ADULTOS MAYORES EN LIMA Y CALLAO.
4. NORMAS Y PROCEDIMIENTOS ACTUALES PARA EL CONTROL DE LA
TUBERCULOSIS EN EL PER
Pgina 51
ASOCIACIN
PRACTICA N 27 - 28
AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE ENTEROBACTERIAS: COPROCULTIVO
INTRODUCCION
En el intestino del hombre existe una flora bacteriana constituida por Enterobacterias (Escherichia coli , Salmonella,
Shigella, Klebsiella) y otros microorganismos anaerobios y aerobios, algunos de los cuales son patgenos para el
hombre y causantes de enfermedades.
El diagnstico y aislamiento del microorganismo causante de la enfermedad se realiza mediante el COPROCULTIVO,
es decir el cultivo de las heces en la fase evolutiva de la enfermedad, para el aislamiento del agente patgeno bacteriano.
La mayora de las Enterobacterias tienen una accin invasiva penetrando en la mucosa intestinal produciendo
ulceraciones o abscesos, y el modo de transmisin es generalmente por ingesta de alimentos contaminados con heces
humanas.
Escherichia coli, bacilo Gram negativo no esporulados, es miembro de la flora intestinal y en determinadas condiciones
patgena para el hombre, poseen factores de virulencia que les permite causar infecciones en el tracto gastrointestinal as
como en el sistema urinario. La E. coli enterotoxignico (ECET) es la causa comn de la "Diarrea del viajero" y
produce en el organismo enterotoxinas potentes y poseen factores de colonizacin; la E.coli enteroinvasiva (ECEI) y la
E.coli enterohemorragica (ECEH) son causantes de diarrea sanguinolenta.
Klebsiella pneumoniae, bacilos Gram negativos a veces con cpsula producen infecciones oportunistas en el husped
comprometido (generalmente hospitalizado), el tracto respiratorio y urinario son los lugares de infeccin ms comunes,
es difcil distinguir entre colonizacin e infeccin y son productoras de endotoxinas.
Salmonella typhi, bacilo Gram negativo mvil con flagelos peritricos son exclusivas del hombre y causan la fiebre
tifoidea; otras, causan infecciones intestinales y a veces septicemias como la Salmonella paratyhi A, B C.
El gnero Shigella, comprende especies que son bacilos Gramnegativos inmviles, causan la Disenteria bacteriana,
enfermedad que produce diarrea, moco, sangre, calambres abdominales y fiebre. La especie S. dysenteriae es la mas
virulenta.
El gnero Proteus, presenta especies que son bacilos Gram negativos rectos, mviles con flagelos peritricos, anaerobio
facultativo. Son habitantes de la flora intestinal y otras causantes de infecciones urinarias, heridas crnicas adquiridas
generalmente en el hospital.
MATERIALES
Muestra de heces.
. Placas Petri con Agar Mac Conkey
Placas Petri con Agar SS
. Placas con Agar Manitol
Tubos con Agar Sabouraud
. Tubos con medio TSI, LIA
Tubos con caldo peptonado
. Tubos con Citrato de Simmons
Tubos con caldo MR-VP
. Frasco con Lugol
Reactivo para Citocromo-oxidasa
. Reactivo de Kovacks (prueba de indol)
Reactivo para Rojo de metilo
. Lminas portaobjeto y cubreobjeto
Reactivo para VP (Alfa- naftol al 5% e Hidrxido de Potasio al 40%)
Juego de colorantes para Gram
Material bsico para laboratorio
Pgina 52
PROCEDIMIENTO
1.
2.
3.
Realizar un estudio macroscpico de la muestra de heces (aspecto, color, presencia de sangre, moco, etc.)
Realizar un estudio microscpico de la muestra con Lugol y suero fisiolgico y Gram.
Realizar la siembra de la muestra de heces en medios de cultivos:
a) Suspender aproximadamente un gramo de heces (dos asadas) en un tubo con 3 ml. de solucin salina.
b) Tomar una asada de la suspensin de heces y sembrar en las placas de Agar Mac Conkey, Agar SS, Agar
Manitol, y tubos con Agar Sabouraud e incubar a 37C por 24 horas.
c) Sembrar las cepas bacterianas aisladas en medios de diferenciacin bioqumica: SLU, TSI,LIA, Caldo
peptonado, Citrato de Simonns y Caldo MR-VP. Incubar a 37C por 24 horas.
LECTURA
EN AGAR MAC CONKEY, observarlas colonias rojas (Lactosa +) que han metabolizado la Lactosa y las colonias
Lactosa negativas que no han metabolizado la Lactosa.
EN AGAR SS, observar el desarrollo de colonias Lactosa negativas y presencia de color negro en las colonias que son
SH2.
EN AGAR MANITOL Y AGAR SABOURAUD, observar el desarrollo de colonias y anotar las caractersticas.
EN TSI (Glucosa, Sacarosa, Lactosa), cuando las bacterias metabolizan los carbohidratos toma el medio un color
amarillo y cuando producen SH2 se torna de color negro.
EN LIA (Agar, Lisina, Hierro ), observar si hay descarboxilacin y desaminacin de la Lisina y produccin de SH2 por
las bacterias. Si hay Descarboxilacin de la lisina se eleva el pH del medio debido a la produccin de aminas, pH= 5.2
(color amarillo), pH 6.8 (color prpura) [indicador prpura de bromocresol]
EN CALDO PEPTONADO, observar la produccin de Indol por las bacterias, al agregar el reactivo de Kovac
tornndose rojo grosella.
EN CITRATO DE SIMMONS, se tornar de color azul cuando la bacteria utiliza el citrato como fuente de energa y
alcaliniza el medio. (formacin de Hidrxido de amonio). Positivo (color azul), negativo (color verde).
EN CALDO MR, observar el color rojo que toma cuando se le aade el Rojo de metilo. Cuando hay produccin de
cidos mixtos con un pH < 4.4 (positivo color rojo); pH > 4.4 (negativo color amarillo).
EN CALDO VP, observar el color rojo en anillo que se forma despus de 15 minutos cuando se le aade alfa-naftol y
KOH por la produccin de acetil-metil-carbinol. Positivo (color rojo), negativo (color amarillo).
PRUEBA DE CITOCROMO- OXIDASA agregando una gota del reactivo oxidasa sobre la colonia y observar a los 5
minutos un intenso color azul si son productoras de la enzima en caso contrario no habr ningn cambio de color
COLORACION DE GRAM observar los bacilos Gram negativos.
CON SUERO FISIOLOGICO Y LUGOL observar la muestra de heces y verificar si hay movilidad utilizando
objetivos de 40 aumentos.
DIFERENCIACION BIOQUMICA
Especies
SLU
(sacarosa, lactosa,
movilidad)
urea,
TSI
(glucosa, sacarosa
lactosa,SH2 )
LIA
Cp
Ct
Ci
Tra
To
Oxi
da
sa
Al
Ac.
Gas
Mov
Ac.
Sup
Ac.
Fon
Gas
SH2
Li
si
na
Escherichia
Coli
+ -
Klebsiella
- +
Salmonella
typhi
+ -
Shigella
- -
Proteus
+ -
In
Dol
MR-VP
Pgina 53
ASOCIACIN
PRACTICA N 29
ESTUDIO E IDENTIFICACION DE VIBRIO CHOLERAE
INTRODUCCION
Los miembros de la familia Vibrionaceae, se encuentran en el agua dulce y salada. Incluye los gneros: Vibrio,
Aeromonas y Plesiomonas. El gnero Vibrio comprende muchas especies siendo las de importancia mdica Vibrio
cholerae, causante del clera epidmico; V. parahaemolyticus, causante de gastroenteritis; V. vulnificus, causante de
bacteriemia, infecciones en heridas cutneas, celulitis; y V. alginoliticus, responsable de otitis externa, infeccin de
heridas cutneas, tejidos blandos.
Son bacilos Gramnegativos, curvados, con aspecto de coma de 1-5 m, se presentan solos, en parejas o en cadenas que
semejan espirilos, muy mviles, poseen un flagelo polar, no forman esporas, sin cpsula, aerobios y oxidasa positivo.
La ltima pandemia fue producida por el biotipo El Tor, serotipo Ogawa.
Desarrollan en medios enriquecidos como el agar sangre, el medio selectivo TCBS (tiosulfato, citrato, sales biliares,
sacarosa, indicador Azul de timol y Azul de bromotimol) y medios alcalinos.
MATERIAL
Placa Petri con medio TCBS sembrada con V. cholerae y V. parahaemolyticus

Tubos con TSI
Tubos con LIA
Tubo con Caldo peptonado
Tubo con MR-VP
Tubo con Citrato de Simmons
Desoxicolato de sodio al 0.5 %
Lminas portaobjetos
Microscopios
Aceite de cedro
PROCEDIMIENTO Y LECTURA
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
En Agar TCBS (thiosulfato, citrato, sales biliares, sacarosa): Se observan las colonias de V. cholerae, de 2-4 mm
de dimetro, lisas, con un centro opaco y periferia transparente, circulares, de color amarillo (resultado de la
utilizacin del citrato y formacin de cidos a partir de la utilizacin de la sacarosa)
En Agar TCBS las colonias de V. parahaemolyticus se observan colonias circulares, de aspecto verde- gris
translucido; V. alginolyticus se observa de color amarillo (sacarosa positiva)
En medio TSI, observar si hay acidez en la superficie y en el fondo por metabolismo de la sacarosa, no produce
H2 S.
En el caldo peptonado, detectar la presencia de indol
En el medio LIA observar si hay decarboxilacin de la Lisina.
En el medio MR- VP detectar la produccin del acetil-metil-carbinol
En el medio Citrato de Simmons, observar la formacin o no de hidrxido de amonio
Realizar un frotis de ambas especies y colorear con Gram
Pgina 54
8.
9.
Realizar la prueba de la cuerda positiva, colocando una gota de la solucin de Desoxicolato sobre una lamina
portaobjetos, luego con el asa de siembra en aro transferir una colonia de V. cholerae, mezclar y observar que se
produce una suspensin viscosa al retirar el asa como una cuerda larga que se torna mas pegajosa despus de 60
segundos mas.
Realizar las lecturas en los medios diferenciales bioqumicos sembrados.
PROTOCOLO
MEDIOS
Vibrio cholerae
Vibrio parahaemolyticus
TSI
Acidez en superficie y profundidad
Acidez superficie y profundidad
LIA
Positiva por descarboxilacin de la Lisina
Positiva
VP
10- 50% cepas es positivo
Negativo
MR
Negativo
Negativo
Indol
Positivo
Positivo
Citrato
Negativo
Negativo
Urea
Negativo
Negativo
Oxidasa
Positiva
Positivo
Catalasa
Positiva
Positiva
Prueba de la cuerda
Positiva
Negativo
RESULTADOS
1. Realizar esquemas de lo observado en la practica
2. Realizar las pruebas bioqumicas correspondientes.
Pgina 55
ASOCIACIN
PRACTICA N 30 - 31
SEMINARIO IV: BARTONELLA Y VERRUGA PERUANA
1. Antecedente histrico de la Verruga Peruana.

2. Formas Fases de la Enfermedad de Carrin.
3. Etiologa y patogenia de la Enfermedad de Carrin.
4. Aspectos epidemiolgicos de la Enfermedad de Carrin.
5. Diagnstico bacteriolgico de la Enfermedad de Carrin.
6. Control y Profilaxis de la Enfermedad de Carrin.
Pgina 56
ASOCIACIN
PRACTICA N 32
ESTUDIO E IDENTIFICACION DEL GENERO LEPTOSPIRA
INTRODUCCION
Las Leptospiras son microorganismos helicoidales, flexibles, con las espiras estrechamente unidas, muy mviles, con
una longitud de 6 a 20 m y 0.1 m de dimetro, sus extremos semejan a ganchos semicirculares (ocasionalmente se
presentan rectos).
El gnero Leptospira (Noguchi, 1917) pertenece a la Familia Leptospiraceae, Orden Spirochetales; comprende 6 especies
patgenas Leptospira interrogans con 18 variantes serolgicas, L. noguchi, L. santarosai, L. borgpetersenii, L.
weilii, L. kirhneri y L. inadai, y mas de 200 serovares saprofitos comprendidos dentro de Leptospira biflexa. Se
diferencian por su virulencia, sus propiedades antignicas, reactividad frente a anticuerpos monoclonales, la prueba de
la endonucleasa de restriccin o la composicin de su DNA.
La Leptospirosis es una zoonosis de distribucin mundial. Los reservorios naturales son los roedores y una gran variedad
de animales silvestres y domsticos, los cuales eliminan con la orina el agente etiolgico, contaminando el agua, suelo,
alimento, etc. El mecanismo de transmisin puede ser directo (orina, rganos de animales infectados) o indirecto (a
travs del agua o material contaminado. La puerta de ingreso al organismo humano es a travs de lesiones de la piel y
mucosas incluyendo la conjuntiva ocular.
Se colorean por mtodos especiales como Fontana Tribondeau (contiene nitrato de plata) y coloracin de Kiktenko, ya
que toman dbilmente los colorantes de anilina. Son visibles al microscopio de campo oscuro en preparaciones frescas.
Desarrolla en medios especiales lquidos, semislidos y slidos enriquecidos con suero de conejo o carnero al 8-10%, a
una temperatura ptima de 28 30C, en un periodo de incubacin de 5- 10 das, en condiciones de aerobiosis.
Para el diagnstico definitivo de Leptospirosis se requiere de:
1. Aislamiento de la Leptospira a partir de muestras clnicas (sangre, lquido cefalorraqudeo, orina) en medios de
cultivo o inoculacin en hmster o cobayo.
2. Evidencia sexolgica en sueros pareados con incremento cudruple del ttulo de diagnstico inicial de 1:100
MATERIAL
Cultivo de Leptospira en medio semislido de Fletcher- modificado
Lamina control coloreada por el mtodo de Kiktenko, Vago, Fontana Tribondeau, o Rojo de Congo.
Microscopio.
LECTURA
En el medio semislido de Fletcher- modificado observar el desarrollo de las Leptospiras en todo el tubo y la
formacin de un anillo a unos milmetros de la superficie del medio
En la coloracin de Kiktenko las Leptospiras se tien de un color rosado- violeta en fondo incoloro, presentndose
sueltas o entrelazadas, semejando la letra C S, generalmente con los extremos en forma de semigancho y con las
espiras bien unidas.
En la observacin al microscopio de campo oscuro, las leptospiras se observan como un collar de perlas son
muy mviles, realizan movimientos de translacin, rotacin y al rededor de su eje.
RESULTADOS
1. Caractersticas del cultivo observado.
2. Realiza esquema de la observacin en las lminas coloreadas.
Pgina 57
UNIVERSIDAD
PRIVADA SAN JUAN BAUTISTA
PRACTICA N 32 -A
ESTUDIO E IDENTIFICACCON DE BARTONELLA
INTRODUCCIN
La familia Bartonelaceae comprende cinco (5) especies, siendo B. bacilliformes la causante de la Bartonelosis humana
o Enfermedad de Carrin y se transmite a travs de la picadura de un insecto alado hematfago conocido como
Lutzomya.
Bartonella bacilliformes presenta un marcado pleomorfismo (bacilar, cocobacilar, cocoide), su tamao vara entre 1- 3
m de longitud por 0.25- 0.30m de dimetro, presenta flagelos unipolares en nmero de 1 a 10. En los cultivos jvenes
predominan las formas bacilares (forma virulenta), en los cultivos viejos las formas cocoides(no virulenta)
Se colorea escasamente con los colorantes de anilina (Gram negativas), pero si tiene afinidad por los colorantes
derivados de Romanowski (Giemsa, Leishman, Wright).
Desarrolla en aerobiosis y microaerobiosis, a una temperatura ptima de 29C en medios enriquecidos con peptona,
triptosa, y plasma (gel de fases) y medio bifsico con sangre y plasma, durante un periodo de incubacin de 5- 10 das.
Su crecimiento es lento por lo general semanas, enturbia el medio con sedimento y a veces se observa pelculas o
tmpanos en la superficie de la parte lquida del medio.
Puede ser aislada de la sangre (Hemocultivo) en la fase hemtica de la enfermedad, de las lesiones eruptivas (fase
verrucosa o histioide) y del LCR en los casos de neurobartonelosis.
En el laboratorio se puede aislar la bacteria por Hemocultivo (fase hematica) usando el agar de fases, medio de
aislamiento primario, por cultivo del verrucoma (fase eruptiva); se pueden realizar pruebas serologicas (aglutinaciones,
fijacin de complemento, Elisa, etc.), por Infeccin de los hemates humanos por Bartonella (Danza de los hemates) e
Inhibicin del movimiento de los hemates por accin de anticuerpos especficos antibartonella
MATERIAL
Frotices coloreados por Leishman, Wrigth Giemsa procedentes de cultivo.

Cultivo de la bacteria en Medio Agar Gel de Fases
Cortes histolgicos de verrucoma coloreados con Hematoxilina eosina
PROCEDIMIENTO E INTERPRETACIN
Observar al microscopio las lminas coloreadas y apreciar la morfologa y tincin de Bartonella.

En las lminas coloreadas observar las bacterias en forma de empalizada y en forma aislada.
En los cultivos observar la turbidez del medio, la formacin de sedimento y la formacin de pelculas o tmpanos
Realizar esquemas de las observaciones realizadas.
Pgina 58
ASOCIACIN
PRACTICA N 32 B
ESTUDIO E IDENTIFICACIN DE TREPONEMA PRUEBA DE VDRL
INTRODUCCIN
Las espiroquetas constituyen un grupo grande y heterogneo de microorganismos espirilares mviles, dentro de las
cuales se encuentra la familia Treponemataceae que comprende tres gneros de microorganismos patgenos para el
hombre: Treponema ( T. pallidum, causa la sifilis, T. pertenue, produce el pian, T. carateneum, produce el pinto),
Borrelia ( B. recurrentis produce la fiebre recurrente, B. burgdorferi causa la enfermedad de Lyme), y Leptospira que
origina infecciones generales con fiebre, ictericia y meningitis.
La especie T. pallidum se caracteriza por ser de forma espiral delgados y miden 0.2 m de ancho y 5 a 15 m de largo,
son mviles y giran constantemente, no se tien bien con los colorantes de anilina y es difcil su cultivo en medios
artificiales.
PRUEBAS DE DIAGNOSTICO
1.
2.
3.
4.
Las muestras obtenidas de las lesiones superficiales tempranas (lquidos tisulares) pueden observarse en un
microscopio de campo oscuro buscando las espiroquetas mviles caractersticas.
Por inmunofluorescencia usando suero antitreponema marcado con fluoresceina
Pruebas serolgicas para sfilis, estas pueden usar antgenos treponmicos o antgenos no treponmicos (cardiolipina
purificada del corazn de buey)
Prueba de Floculacin (VDRL), el antgeno VDRL es una solucin alcohlica que contiene 0.03% de cardiolipina,
0.9% de colesterol y lecitina purificada; esta prueba esta basada en que las partculas del antgeno lipido
(cardiolipina) permanecen dispersas en suero normal y en enfermos se combina con la reagina de la sfilis (la
reagina es una mezcla de IgM e IgA dirigidos contra algunos antgenos).
MATERIALES
Suero problema
Antgeno VDRL
Laminas excavadas
Pipetas
graduadas
PROCEDIMIENTO
Tomar con una pipeta 0.05 ml de suero calentado (bao Mara a 56C x 30) sobre la lamina excavada
Aadir una gota del antgeno VDRL sobre el suero
Rotar durante cuatro (4) minutos
Observar al microscopio con objetivo de menor aumento la formacin de floculos cuando la reaccin es positiva.
RESULTADOS
N ( No reactivo)
........................
RD ( Reactivo dbil) ........................
R ( Reactivo)
.......................
Ausencia de floculos
Floculos pequeos
Floculos medianos y grandes
Pgina 59
ASOCIACIN
PRACTICA N 33 34 - 35
CULTIVO DE MUESTRAS DE INFECCIONES URINARIAS: UROCULTIVO
INTRODUCCION
El Urocultivo es el examen de muestras de orina que permiten el aislamiento de agentes patgenos causantes de una
infeccin urinaria.
Para la obtencin de muestras debe considerarse:
La recoleccin debe ser con un mnimo de contaminacin
Establecer el momento ptimo para la recoleccin, con el objeto de tener la mejor probabilidad de recuperar
microorganismos causales.
Obtener una cantidad suficiente de la muestra para efectuar las tcnicas de cultivo necesarias.
Toda vez que sea posible, obtener las muestras antes de la administracin de antibiticos.
Normalmente la orina es estril, pero al tomarse la muestra existe la posibilidad de contaminacin por lo que se realiza
de rutina el Urocultivo cuantitativo:
1.
2.
3.
Si existe menos de 10,000 grmenes por ml. se considera como contaminantes, siendo la muestra negativa.
Cuando la orina tiene ms de 100,000 bacterias por ml, se considera que hay infeccin urinaria.
Si el nmero de grmenes oscila entre 1,000 a 100,000 se interpreta como dudoso y ser necesario repetir el cultivo.
La orina debe ser procesada en el laboratorio dentro de las 2 horas siguientes a la recoleccin para lograr recuentos de
colonias exactos, luego se deber identificarlas y realizar el Antibiograma correspondiente.
MATERIAL
Muestra de orina patolgica

Sedimento de orina
Agar Mac Conkey, Medio hipertnico de Chapman (Agar Manitol), Agar Sabouraud, en placas
Agar nutritivo en tubos con 20 ml licuado +/- 50C
Agar Mac Conkey en tubos con 20 ml licuado +/- 50C
Tubos con medio TSI, LIA, Caldo peptonado, MR-VP, Agar Citrato de Simmons, Agar Urea de Christensen.
Tubos con 9.9 ml de Suero fisiolgico 0.85%
Pipetas de 1 ml. estriles
Placas Petri, vacas estriles
Bocal con desinfectante
Microscopio
Serie de colorantes de Ziehl- Neelsen
Serie de colorantes de Gram
Lminas portaobjetos y laminillas
PROCEDIMIENTO
PRIMER DIA:
A.
Estudio de las caractersticas macroscpicas

Describir el aspecto de la orina:
Color (amarillo, oscuro, castao o incoloro)
Sealar si la orina es clara o turbia.
Pgina 60
B. Estudio de las caractersticas microscpicas

1.
2.
Obtener una gota del sedimento urinario y observarlo entre lmina y laminilla al microscopio con objetivos de
10X y 40X
Realizar un frotis y colorear por el mtodo de Gram y Ziehl- Neelsen
6.
Siembra de la muestra de orina:
1.
Tomar 0.01 ml. de la orina sin centrifugar y sembrar por dispersin agotamiento en las placas con Agar Mac
Conkey, Agar Manitol y Agar Sabouraud
Mtodo de dilucin : Preparar una dilicin de la orina de la siguiente manera.
a) Con la pipeta de 1 ml, obtener 0.1 ml de orina sin centrifugar y transferirlo al tubo con suero fisiolgico
0.85% estril. Mezclar bien.
b) Con la misma pipeta transferir 0.1 ml de la mezcla a cada una de las placas Petri vacas estriles.
c) A cada una de las placas agregar el Agar Mac Conkey licuado y a la otra el Agar nutritivo licuado, rotar
sobre la mesa del laboratorio para obtener una mezcla homognea.
d) Una vez solidificado el Agar, incubar a 37C por 18- 24 horas.
2.
LECTURA
1.
2.
En el sedimento de la orina los elementos que pueden observarse son: pus, eritrocitos, cristales anormales,
leucocitos, levaduras, parsitos, espermatozoides, clulas epiteliales, cilindros.
En los frotices coloreados por Gram, observar la presencia de bacterias Gram positivas y Gram negativas, y por el
mtodo de Ziehl- Neelsen las bacterias cido alcohol resistentes(en caso de infeccin por Mycobacterium).
SEGUNDO DIA:
1.
2.
3.
En la siembra de la orina sin centrifugar, observar en la placa de Agar Mac Conkey el crecimiento de colonias
lactosa positivas; en las placas de Agar Manitol, el desarrollo de colonias resistente a altas concentraciones de sales,
y en el Agar Sabouraud, si hay presencia de levaduras.
En la siembra por dilucin, observar el desarrollo bacteriano en las placas, contar el nmero de colonias en un 1/8
de la placa y multiplicarlo por 8 y luego por 1000.
Se deber seleccionar una colonia lactosa positiva y negativa del Agar Mac Conkey, preparar suspensiones en caldo
nutritivo y realizar las pruebas diferenciales en la serie bioqumica respectivamente: TSI, Caldo peptonado, MR-VP,
Citrato de Simmons, LIA y Urea de Christensen. Incubar a 37C por 18-24 horas.
Nota: El agente causal aislado e identificado deber ser sometido a Pruebas de Susceptibilidad Antimicrobiana. El
Antibiograma se realiza tomando 5 colonias del Agar Mac Conkey, se prepara una suspensin en un tubo con SF al
0.85%, y se determina la Concentracin Mnima Inhibitoria (MIC) del antibitico cuya finalidad es orientar en la
teraputica y la concentracin del antibitico alcanzado en el suero o en foco de infeccin.
El mtodo de disco-difusin estandarizado [Kirby - Bauer] es el que se usa de rutina en el laboratorio, para dicha
determinacin (MIC).
REPORTE FINAL
Disear el protocolo correspondiente, sealando:
1. La observacin macroscpica y microscpica de la muestra clnica.
2. Las caractersticas del desarrollo bacteriano, y los principios bioqumicos en cada uno de los medios selectivos
empleados.
3. Los resultados del comportamiento bioqumico.
4. La determinacin del agente patgeno causante de la infeccin urinaria.
Pgina 61
ASOCIACION
PRACTICA N 36 - 37
AISLAMIENTO E IDENTIFICACIN DE ESPIROQUETAS. PRUEBAS DE FLOCULACIN: VDRL
RPR
INTRODUCCIN
Las espiroquetas constituyen un grupo grande y heterogneo de microorganismos espirilares mviles, dentro de las
cuales se encuentra la familia Treponemataceae que comprende tres gneros de microorganismos patgenos para el
hombre: Treponema ( T. pallidum, causa la sifilis, T. pertenue, produce el pian, T. carateneum, produce el pinto),
Borrelia ( B. recurrentis produce la fiebre recurrente, B. burgdorferi causa la enfermedad de Lyme), y Leptospira que
origina infecciones generales con fiebre, ictericia y meningitis.
La especie T. pallidum se caracteriza por ser de forma espiral delgados y miden 0.2 m de ancho y 5 a 15 m de largo,
son mviles y giran constantemente, no se tien bien con los colorantes de anilina y es difcil su cultivo en medios
artificiales.
PRUEBAS DE DIAGNOSTICO
5.
6.
7.
8.
Las muestras obtenidas de las lesiones superficiales tempranas (lquidos tisulares) pueden observarse en un
microscopio de campo oscuro buscando las espiroquetas mviles caractersticas.
Por inmunofluorescencia usando suero antitreponema marcado con fluoresceina
Pruebas serolgicas para sfilis, estas pueden usar antgenos treponmicos o antgenos no treponmicos (cardiolipina
purificada del corazn de buey)
Prueba de Floculacin (VDRL), el antgeno VDRL es una solucin alcohlica que contiene 0.03% de cardiolipina,
0.9% de colesterol y lecitina purificada; esta prueba esta basada en que las partculas del antgeno lpido
(cardiolipina) permanecen dispersas en suero normal y en enfermos se combina con la reagina de la sfilis (la
reagina es una mezcla de IgM e IgA dirigidos contra algunos antgenos).
MATERIALES
Suero problema
Antgeno VDRL
Laminas excavadas
Pipetas graduadas
PROCEDIMIENTO
Tomar con una pipeta 0.05 ml de suero calentado (bao Mara a 56C x 30) sobre la lamina excavada
Aadir una gota del antgeno VDRL sobre el suero
Rotar durante cuatro (4) minutos
Observar al microscopio con objetivo de menor aumento la formacin de floculos cuando la reaccin es positiva.
RESULTADOS
N ( No reactivo)
........................
RD ( Reactivo dbil) ........................
R ( Reactivo)
.......................
Ausencia de floculos
Floculos pequeos
Floculos medianos y grandes
Pgina 62
ASOCIACIN
PRACTICAS N 37 - 38 - 39
SEMINARIO V: ENFERMEDADES DE TRANSMISION SEXUAL (ETS) Y SIDA
1. Sfilis Congnita. Fases de la enfermedad. Diagnstico serolgico.
2. Papilomavirus y Virus de la Hepatitis B
3. Virus de la inmunodeficiencia humana (VIH):

3. A : Etiopatogenia del SIDA y Estructura del VIH
3. B: Aspectos generales del Curso de la infeccin por VIH
3. C: Epidemiologa. Tratamiento y Prevencin
Pgina 63
ASOCIACIN
PRACTICA N 40
AISLAMIENTO DE VIRUS EN HUEVOS EMBRIONADOS Y EN RATONES LACTANTES.
OBSERVACION DE LMINAS COLOREADAS
INTRODUCCION
Los virus son agentes infecciosos responsables de numerosas enfermedades del hombre, de los animales, de las plantas y
tambin de las bacterias (bacterifagos).
En este captulo analizaremos solamente los virus que producen patologa en el ser humano; debido a sus caractersticas
especiales como son su pequeo tamao y su parasitismo intracelular obligado, los virus no pudieron ser estudiados
hasta principios del siglo XX, si bien algunas de las enfermedades producidas por ellos ya se conocan desde la
antigedad (viruela, rabia, hepatitis, etc.). Dado que los virus carecen de los constituyentes fundamentales para el
crecimiento y multiplicacin deben necesariamente utilizar los sistemas de las clula que parasitan y por ello se
denominan parsitos intracelulares obligados.
En los ltimos aos, se han desarrollado mtodos de diagnstico rpido para la mayora de las infecciones virales as
como drogas antivirales especficas para muchos virus.
Se emplean mtodos directos para el diagnstico de los virus, y dado que estos solo se replican en el interior de las
clulas vivas, para su cultivo in Vitro es necesario el empleo de mtodos especiales en el laboratorio de virologa, tales
como:
a) Cultivos tisulares de humanos o animales. La mayora de los virus pueden multiplicarse en cultivo de clulas
apropiadas.
b) Embriones de pollo (membrana corioalantoidea, cavidad amnitica, cavidad alantoidea y saco vitelino).
c) Animales de laboratorio (ratones lactantes, Hmsters, monos)
d) Serologa o demostracin de anticuerpos frente al virus.
e) Demostracin directa del virus o de antgenos vricos a partir de frotis de las lesiones.
OBJETIVO DE LA PRCTICA
El aislamiento de los virus es de gran importancia en la investigacin mdica y epidemiologa y constituye un mtodo
muy extendido para el diagnstico de la infeccin.
Por lo tanto estas prcticas nos orientan a conocer los diversos mtodos de aislamiento directo o indirecto para demostrar
los efectos citopticos de los diferentes virus y sus formas como se deben evaluar en los diferentes procesos infecciosos
que generan en el ser humano.
METODOS DE DIAGNOSTICO VIROLGICO:
A. USO DE LOS HUEVOS EMBRIONADOS PARA LA PROPAGACION DE LOS VIRUS.

Muchos de los virus y rickettsias patgenas para el hombre y los animales pueden propagarse en las clulas vivas de las
membranas extraembrionarias o en el propio embrin de huevos embrionados de gallina. Estas tcnicas fueron
introducidas por Footdpasture y col., en 1931, y desde entonces estn siendo ampliamente usadas.
Las vas de inoculacin y la edad del embrin a usar dependen del agente viral que va a ser inoculado.
Pgina 64
MATERIALES
Huevos embrionados de 7-9 das.

Huevos embrionados de 10-12 das.
Jeringas de tuberculina con aguja N 25 x y 22 x 2.
Colorante Fucsina al 1% con agua destilada
Colorante Azul de metileno al 1% con agua destilada
Frascos con Alcohol yodado
Algodn
Ovoscopio
Cinta adhesiva o parafina para sellar los huevos embrionados
Equipo de diseccin (Pinzas, tijeras curvas, guantes)
INOCULACION DEL COLORANTE POR VIA ALANTOIDEA

a) Marcar y limpiar con alcohol yodado, huevos de 10-12 das.
b) Hacer un pequeo orificio con el punzn en la zona marcada de huevos embrionados.
c) Introducir la aguja de la jeringa cargada con colorante aproximadamente en ngulo de 45 e inocular 0.2 ml. de
colorante.
d) Se tapa la abertura con cinta adhesiva o cera calentada y se deja en incubacin a 33-35C por 2-4 das , luego
cosechar y observar.
INOCULACION POR VIA AMNIOTICA

a)
b)
c)
d)
Marcar la cmara de aire y la posicin del embrin de 10-12 das.

Limpiar con alcohol yodado un rea de la cmara de aire que est situada por encima del embrin.
Hacer una perforacin rectangular de 0.5 cm, con el punzn.
Deja caer una gota de suero fisiolgico o aceite mineral estril, para visualizar una zona no vascularizada de la
membrana corioalantoidea subyacente.
e) Con una pinza curva introducir a travs de esta rea, coger hacia arriba la membrana amnitica, formando una
pequea tienda en la base del cual se inyecta 0.2 ml, de la solucin de Azul de metileno o del inoculo problema.
f) Se suelta la membrana que se localiza en su sitio de origen.
g) Se sella la abertura del huevo con cinta adhesiva o cera caliente y se deja incubando a 33-35C por 2-4 das (sujeto a
la muestra: Influenza)
INOCULACION DEL SACO VITELINO

a) Limpiar con alcohol yodado, la porcin de la cscara que cubre la cmara de aire del huevo embrionado de 6-7 das.
b) Perforar la cscara en el centro de la cmara de aire.
c) Con una jeringa de 1 ml y aguja de 22x inocular 0.5 ml de Azul de metileno, introduciendo la aguja
verticalmente a travs de la cmara de aire, hasta 35 mm de profundidad.
d) Sellar la abertura e inocular (diferentes periodos de tiempo segn la investigacin virolgica a realizarse).
COSECHA DE LOS LIQUIDOS (SEGN LAS CAVIDADES INOCULADAS)

a)
Comprobar que el embrin este vivo. Enfriar a 4C los huevos embrionados por algunas horas (2-3 horas antes)
para prevenir sangrado de los embriones.
b) Cortar la cscara que cubre la cmara de aire y separar con pinzas, las membranas subyacentes.
c) Verter el contenido del huevo embrionado en una placa Petri. Observar la localizacin del Azul de metileno y/o
Fucsina en las zonas de inoculacin (Membrana alantoidea, amnitica, corioalantoidea y saco vitelino).
d) Cosechar las membranas en estudio y extraer el liquido alantoideo, amnitico y realizar las pruebas de diagnstico
correspondientes segn la investigacin solicitada
Pgina 65
B.
INOCULACIN EN RATONES LACTANTES:
C.
Se utilizaran ratones lactantes y las vas de inoculacin sern:

Intraperitoneal.
Intracraneal,
Subcutnea y
Nasal.
OBSERVACIN DE LAMINAS COLOREADAS:
Observar la presencia de cuerpos anormales intracelulares denominados cuerpos de inclusin (Efecto citoptico).
Estas estructuras pueden encontrarse en el ncleo o en el citoplasma y su localizacin es especfica de la
enfermedad viral.
Se considera estos cuerpos de inclusin (efecto citoptico) como conglomerados de virus asociados a productos de
reaccin de la clula infectada.
OBSERVACIN DE LMINAS:
Cultivo de clulas normales, coloreadas con Hematoxilina eosina (HE), no se tie de rosado el citoplasma.
Rabia: corte histolgico de cerebro. Coloracin HE. Observar inclusiones eosinofilas intracitoplasmticas
denominadas corpsculos de negri.
Enterovirus- Virus Polio: En cultivos de clulas humanas (HEP-2), observar la degeneracin celular, el
redondeamiento celular, la picnosis nuclear y desplazamiento del ncleo hacia el borde de la clula.
Herpes simple en cultivos de clulas: Observar las clulas gigantes polinucleadas, las inclusiones
eosinofilas intracelulares denominadas cuerpos de Lipschutz.
Citomegalovirus en sedimento de orina: Observar la inclusin intranuclear basfila en ojos de lechuza

rodeada de un halo claro y el citoplasma ce color azulado (Basfilo).
Adenovirus en cultivo de clulas HEP-2: Observar la agrupacin de clulas en racimo y las inclusiones
basfilas intranucleares.
PROTOCOLO
Esquematizar los resultados de las inoculaciones realizadas.
Pgina 66
ASOCIACIN
PRACTICA N 41
ESTUDIO E IDENTIFICACIN DE HONGOS AMBIENTALES
INTRODUCCION
Los hongos ambientales se encuentran ampliamente distribuidos en la naturaleza viviendo a expensas de la materia inerte
existente, la mayora se encuentra como saprofito, otros pueden ser causantes de inducir hipersensibilidad as como
tambin ser responsables de infecciones. Entre los hongos ambientales comunes tenemos: Aspergillus, Penicilluim,
Fusarium, Rhizopus, Cephalosporium, Helmintosporium, Rhodotorula
MATERIALES
Tubos con cultivo de Aspergillus, Penicillium, Fusarium, Rhizopus, Cephalosporium, Rhodotorula y

Helmintosporium.
Lminas con azul de lactofenol de cada uno de los hongos mencionados.
Microscopios
PROCEDIMIENTO
1.
2.
Estudie las caractersticas macroscpicas de los diferentes cultivos, observando el tipo de micelio areo, aspecto de
la colonia, produccin de pigmento y consistencia de la colonia.
Observar al microscpico utilizando lentes de menor y mediano aumento, las caractersticas microscpicas de cada
uno de los hongos preparados en las lminas con azul de lactofenol.
CARACTERISTICAS DE LOS HONGOS AMBIENTALES
Aspergillus
Colonias al inicio de color blanco, luego vara de acuerdo a la especie en:
amarillo, verde azufrado, marrn o negro.
Microscpicamente presenta hifas tabicadas que forman conidiforos no tabicados que se ensanchan en su extremo distal
dando lugar a la cabeza aspergilar que da origen a los esterigmas y de donde salen las conidias en cadena.
Penicillium
Colonias de color azul, verdosas, pulverulentas y desarrollo abundante.
Microscpicamente presenta hifas tabicadas con conidiforos ramificados en cuyo extremo se hallan los esterigmas en
forma de pincel del cual se originan las conidias en cadena.
Fusarium
Colonias de micelio areo algodonoso de color rosado violeta en la superficie.
Microscpicamente presenta filamentos tabicados con cortos conidiforos, macroconidias septadas y alargadas,
fusiformes.
Pgina 67
Rhizopus
Colonias de micelio areo, de aspecto algodonoso, de un color blanco grisceo.
Microscpicamente presenta hifas sin septos, rizoides a partir de los cuales se forman largos esporangioforos que
terminan en una estructura globosa llamada esporangio en cuyo interior se encuentran las esporas.
Cephalosporium
Colonias de micelio areo de color blanco- rosado o blanco- amarillento.
Microscpicamente presentan hifas septadas, conidiforos cortos que dan origen a conidias hialinas agrupadas.
Helmintosporium
Colonias de color gris al inicio, despus se torna de color
Negro en el centro, con la periferia elevada de color gris.
Microscpicamente se observan hifas septadas y macroconidias con septos longitudinales sobre conidiforos cortos y
nudosos
Rhodotorula
Desarrolla colonias de aspecto cremoso, de color rojo o rosado debido a que forma
Pigmentos carotenoides.
Microscpicamente se observa clulas ovoides o redondeadas con o sin yema.
PROTOCOLO
CARACTERISTICAS DE LA COLONIA
HONGO
MICROSCOPIA
DESARROLLO
ASPECTO
PIGMENTO
Aspergillus
Penicillium
Fusarium
Rhizopus
Cephalosporium
Helmintosporium
Rhodotorula
Pgina 68
Aspergillus
Estructuras de Aspergillus
a
Penicillum
Rhizopus
Helmintosporium
Fusarium
Cephalosporium
Estructuras del Rhizopus
Rhodotorula
Pgina 69
ASOCIACIN
PRACTICA N 42 - 43
ESTUDIO E IDENTIFICACIN DE HONGOS DERMATOFITOS
INTRODUCCION
Los dermatofitos son organsmos queratinfilos que invaden las estructuras queratinizadas del cuerpo como la piel, pelo
y uas. Las artrosporas se adhieren a los queratinocitos, germinan y los invaden, son causantes de las micosis
superficiales y constituyen una de las infecciones ms comunes en los humanos.
Los agentes causales mas importantes son los hongos del gnero Trichophyton, Microsporum y Epidermophyton,
as como tambin Malassezia furfur que es causante de la Tia versicolor o Pitiriasis versicolor y la Piedraia hortai
que afecta los pelos y produce ndulos en el tallo piloso de los cabellos, barba y bigote.
Por su hbitat pueden clasificarse en: Zooflicos (Microsporum canis), Geoflicos (Microsporum gypseum), y
Antropoflicos (Epidermophyton).
MATERIALES
Tubos con cultivo de: T. rubrum, T. mentagrophytes, T. tonsurans, M. canis, M. gypseum y E. floccosum.
Lmina con azul de lactofenol de cada uno de los hongos mencionados.
Lminas preparadas de M. furfur en hidrxido de potasio al 20%.
Lminas preparadas de pelo infectado con Piedraia hortai.
Material bsico de laboratorio(xilol, algodn, alcohol)
Microscopios con lentes de menor y mediano aumento.
PROCEDIMIENTO
1.
2.
Estudiar las caractersticas macroscpicas de los diferentes cultivos, observando el tipo de micelio ,aspecto de la
colonia , produccin de pigmento y consistencia de la colonia.
Observar al microscopio las caractersticas microscpicas de cada uno de los hongos preparados en lminas.
CARACTERISTICAS DE LOS HONGOS DERMATOFITOS, MALASESSIA Y PIEDRAIA.

Trichophyton rubrum
Colonias de micelio areo blanco, de aspecto algodonoso, al reverso puede observarse un pigmento de color prpura.
Al microscopio se observan hifas septadas con microconidias ssiles piriformes, a veces puede observarse
macroconidias, clamidosporas y cuerpos nodulares.
Trichophyton mentagrophytes
Colonias blanquecinas pulverulentas, granuladas, yesosas, al reverso puede observarse un pigmento amarillo- pardusco.
Al microscopio se observan hifas septadas con abundante microconidias esfricas agrupadas, pueden presentar hifas en
espiral y macroconidias.
Trichophyton tonsurans
Colonias membranosas, crateriformes o cerebriformes de consistencia acartonada con pigmentacin amarillo- castao
al reverso.
Al microscopio se observan microconidias piriformes hialinas, clamidosporas, e hifas en raquetas septadas, pueden
observarse macroconidias.
Pgina 70
Microsporum gypseum
Colonias poco elevadas pulverulentas con pigmento de color canela.
Al microscopio se observan hifas septadas , macroconidias con tabiques transversales en nmero de 4-6, rara vez se
observan microconidias.
Microsporum canis
Colonias de color blanquecino poco elevado, con pigmento amarillo- naranja en el reverso de la colonia.
Al microscopio se observan macroconidias fusiformes hasta con 8 tabiques transversales y con pequeas excrecencias en
la superficie, pueden tambin observarse microconidias y clamidosporas.
Epidermophyton floccosum
Colonias de aspecto aterciopelado, pulverulentas de color amarillo- azufre con pliegues en la colonia.
Al microscopio se observan macroconidias con su extremo distal romo y con 3-4 tabiques transversales, pueden
encontrarse aisladas o en racimo.
Malassezia (Pityrosporum) furfur

Al microscopio se observan hifas cortas de extremos romos al lado de formas redondeadas agrupadas; este hongo no
desarrolla en medios comunes por lo que el diagnstico se da por el examen directo de la muestra
Piedraia hortai
Los ndulos se observan en el tallo piloso como costras arenosas, duras de color pardo a negro que envuelven
completamente el tallo piloso.
PROTOCOLO
HONGO
MICROSCOPIA
DESARROLLO
ASPECTO
PIGMENTO
Trichophyton
rubrum
Trichophyton
mentagrophytes
Trichophyton
tonsurans
Microsporum
gypseum
Microsporum canis
Epidermophyton
floccosum
Malassezia
Furfur
Piedraia
Hortai
Pgina 71
Trichophyton rubrum
Trichophyton mentagrophytes
Trichophyton tonsurans
T. mentagrophytes (espiral)
Microsporum gypseum
aa
Malassezia furfur
Epidermophyton foccosum
Microsporum canis
Piedraia hortai
Pgina 72
ASOCIACIN
PRACTICA N 44
ESTUDIO DE HONGOS LEVADURIFORMES.
OBSERVACION DE CORTES HISTOPATOLOGICOS.
INTRODUCCION:
Los hongos levaduriformes son frecuentes al estado saprofito en el suelo, aguas, plantas y en las cavidades naturales del
hombre como el tubo digestivo y en las regiones de los pliegues cutneos.
Muchas especies han sido vinculadas a infecciones humanas como la Candida albicans y otras especies de Candida
que puede producir infecciones agudas o crnicas en la piel o mucosas, aparato genito- urinario, y respiratorio; otras
levaduras como Cryptococcus neoformans pueden causar infecciones cerebrales y rara vez infecciones cutneas; en el
hombre la infeccin primaria es casi siempre pulmonar.
MATERIALES
Cultivo con Candida albicans y Cryptococcus neoformans.

Lminas de Candida albicans en Agar harina de maz.
Lminas de Cryptococcus neoformans en tinta china.
Cortes histolgicos con C. albicans y Cr. neoformans.
Material bsico de laboratorio (xilol, algodn, alcohol)
Microscopios con lentes de menor y mayor aumento.
PROCEDIMIENTO
1.
2.
Estudiar las caractersticas macroscpicas de los diferentes cultivos, observando el aspecto y consistencia de la
colonia.
Observar al microscopio las caractersticas que presentan cada especie de los hongos en el Agar harina de maz,
tinta china y en los cortes histolgicos.
CARACTERISTICA DE LOS HONGOS LEVADURIFORMES

Candida albicans
Las colonias son de aspecto cremoso y consistente, de color blanco perlado.

En el Agar- almidn- arroz, se observan clamidosporas, pseudomicelio y blastosporas que tipifican a Candida
albicans.
En los cortes histopatolgicos observar la presencia de filamentos cortos y levaduras en las lesiones rodeadas de
una zona de histiocitos.
Cryptococcus neoformans
Las colonias son de color blanquecino perlado al inicio, luego se tornan de color ocre, de aspecto mucoide viscosas
y brillantes con tendencia a deslizarse hacia el fondo del tubo de cultivo.
En las lminas con tinta china se aprecia la cpsula como un halo brillante entre el borde de la levadura y el fondo
oscuro dado por la tinta china.
En los cortes histopatolgicos, se observan como levaduras a lo largo de los vasos en las lesiones, las cuales
comprimen los tejidos vecinos y los necrosan produciendo escasa infiltracin celular.
Pgina 73
PROTOCOLO
OBSERVACION
Candida albicans
Cryptococcus neoformans
Caractersticas del
Cultivo
Agar Harina de Maz
Tinta china
Corte histopatolgicos
Candida albicans (corte histolgico)
Cryptococcus neoformans (tinta china)
Candida albicans (en Agar almidn arroz)
Cryptococcus neoformans (en tejido)
Pgina 74
ASOCIACIN
PRACTICA N 45 - 46
ESTUDIO DE HONGOS DIMORFICOS.
OBSERVACION DE CORTES HISTOPATOLOGICOS.
INTRODUCCION
Los hongos dimrficos, son hongos causantes de infecciones mucocutneas y/o sistmicas en el hombre y algunos
animales.
Paracoccidioides brasiliensis
En su fase inicial esporgena, se encuentra en el suelo, fragmentos vegetales, espinas, etc. Y en su fase de levadura en
tejidos infectados.
Es el agente causante de la Paracoccidioidomicosis, infeccin crnica, granulomatosa de la piel, mucosa, ganglios y
vsceras. Es ms frecuente entre los trabajadores rurales.
Histoplasma capsulatum
En el ambiente natural se encuentra en la fase micelial esporgena, que se desarrolla principalmente sobre compuestos
nitrogenados, tales como excretas de aves (gallina, lechuza), excremento de murcilagos, etc., y en su fase de levadura se
encuentra en tejido infectado.
Es el agente causal de la Histoplasmosis que puede afectar el sistema respiratorio en su forma benigna pudiendo
producir calcificaciones dispersas en los campos pulmonares.
Sporothrix schenckii
Hongo que vive en el suelo, sobre plantas, produce la Esporotricosis en el hombre y algunos animales, el hongo ingresa
generalmente por traumatismo con restos punzantes de vegetales contaminados con el hongo. La infeccin esta
localizada preferentemente en los ganglios linfticos
MATERIALES
Cultivo en Agar Sabouraud de P. brasiliensis, H. Capsulatum, S. schenckii.
Cultivos en Agar BHI de estos hongos.
Microcultivos coloreados con Azul de lactofenol de estos hongos
Cortes histolgicos infectados por estos hongos.
Material bsico de laboratorio.
PROCEDIMIENTO
1.
2.
Estudiar las caractersticas macroscpicas de los diferentes cultivos, observando el tipo de micelio, aspecto de la
colonia y consistencia de la colonia.
Observar las caractersticas microscpicas de cada uno de los hongos.
CARACTERISTICAS DE LOS HONGOS DIMORFICOS

Paracoccidioides brasiliensis
En los frotices coloreados con Leishman o en cortes histolgicos, se presentan como clulas esfricas u ovaladas de 10 a
80 micras de dimetro, con doble membrana y multigemante.
En cultivo en Agar Sabouraud glucosado desarrolla colonias de micelio areo de color blanco compacto, de crecimiento
lento. Microscpicamente se observan filamentos hialinos, tabicados con microconidias esfricas o piriformes.
En Agar Infusin cerebro corazn (BHI), se observan colonias cerebriformes, de color beige claro. Microscpicamente
se observan clulas esfricas.
Pgina 75
Histoplasma capsulatum
En frotices o cortes histolgicos se observan intracelularmente como nidos de levadura incluidas en los histiocitos o
polimorfonucleares. Las levaduras son pequeas, redondas u ovaladas de 1-3 micras de dimetro.
En Agar Sabouraud glucosado, desarrolla colonias algodonosas de color blanco. Microscpicamente se observan hifas
tabicadas con escasa produccin de microconidias y gran cantidad de macroconidias tuberculadas redondas y grandes de
pared gruesa Clamidospora tuberculada.
En el medio BHI desarrolla colonias pequeas de aspecto membranoso rugoso, color marrn claro. Microscpicamente,
se observan como clulas ovaladas a veces gemantes.
En Agar Sabouraud glucosado desarrolla colonias al inicio pequeas , blanquecinas presentando posteriormente un
aspecto hmedo, rugoso y membranoso, de un color que puede variar de crema a negro.
Microscpicamente se observan hifas finas tabicadas con cortos conidiforos en cuyo extremo se encuentran las conidias
agrupadas dando el aspecto de una margarita.
En medio BHI, desarrolla colonias levaduriformes. Al microscopio se observan clulas en gemacin ovales o en forma
de cigarrillos Gram positivos.
PROTOCOLO
MICROSCOPIA
HONGO
TEMPE
RATURA
DESARRO
LLO
ASPECTO
PIGMENTO
Paracoccidioides
brasiliensis
Histoplasma
capsulatum
Sporothrix
schenckii
Pgina 76
Paracoccidioides brasiliensis (fase filamentosa)
Histoplasma capsulatum (fase filamentosa)
Paracoccidioides brasiliensis (fase levaduriforme)
Histoplasma capsulatum (en corte histolgico)
aa
Sporothrix schenckii (fase filamentosa)
Pgina 77

G.P Microbiología Ii PDF

Cargado por

Información del documento

Título original

Derechos de autor

Formatos disponibles

Compartir este documento

Compartir o incrustar documentos

Opciones para compartir

¿Le pareció útil este documento?

¿Este contenido es inapropiado?

Copyright:

Formatos disponibles

G.P Microbiología Ii PDF

Cargado por

Copyright:

Formatos disponibles

ASOCIACIN

UNIVERSIDAD PRIVADA SAN JUAN BAUTISTA

RECOMENDACIONES GENERALES PARA EL USO DEL LABORATORIO DURANTE EL CURSO DE

MICROSCOPIA: ESTUDIO Y MANEJO DEL MICROSCOPIO

III. PARTES DEL MICROSCOPIO

Tubo portalentes y cremallera

IV. SISTEMAS QUE COMPRENDE EL MICROSCOPIO

Sistema de soporte: comprende el brazo, el pie, el tubo ocular, el revolver y la platina.

METODOS DE COLORACIONES: COLORACIONES SIMPLES., DIFERENCIALES Y ESPECIALES.

Muestra con mezcla bacteriana

COLORACIN AZUL DE METILENO:

Preparar un frotis con la mezcla bacteriana y fijar al calor

RESULTADO: Los microorganismos se observan de color azul intenso

COLORACIN DE TINTA CHINA O NEGATIVA:

Colocar una gota de tinta china sobre la lamina portaobjetos

RESULTADO: Los microorganismos sin teir resaltan sobre un fondo oscuro

COLORACIN AZUL DE LACTOFENOL:

Colocar una gota del colorante sobre la lmina portaobjetos

RESULTADO: Los microorganismos se observaran en un fondo azul celeste

Muestra con mezcla de bacterias

Lminas con frotices de bacilo tuberculoso

Para que clase de microorganismos es recomendable le coloracin cido alcohol resistente.

COLORACION ESPECIAL: COLORACION DE LEISHMAN Y VAGO

Frotis de sangre con Bartonella

Cubrir el frotis con el colorante y dejar actuar por 5 minutos.

En una lamina colocar una gota de suero fisiolgico al o.85%

Para que clase de microorganismos es recomendable le coloracin cido alcohol resistente

Probetas de 100 ml.

5.0 gr. de Agar Mac Conkey deshidratado.

MEDIOS DE CULTIVO SIMPLES

Para el Agar chocolate

Los medios de cultivo preparados en cada mesa.

El color que presentan cada medio de cultivo preparado.

Materiales que usaron para la preparacin.

SIEMBRA BACTERIANA. MEDIOS DE AISLAMIENTO.

Tubos con suero fisiolgico estril

RESULTADO DE LAS SIEMBRAS REALIZADAS:

ACCION SOBRE LOS CARBOHIDRATOS

PRUEBA DEL ROJO DE METILO ( RM )

PRUEBA DE VOGES PROSKAUER ( VP )

Cepa bacteriana MR positivo y negativo

Cepa indol positivo y negativo.

UTILIZACION DEL CITRATO COMO UNICA FUENTE DE CARBONO

Cepa control citrato positivo y negativo.

HIDRLISIS DE LA UREA (PRUEBA DE LA UREASA)

NH2- C- NH2 + 2HOH

------------------- CO2 + H2O + 2 NH (NH4)2 CO3

Cepa patrn ureasa positiva y negativa ( E. coli, Proteus )

Cepas Controles: S. aureus, Streptococcus Enterococcus

PRUEBA DE LA CITOCROMO OXIDASA

Placas con Agar sangre de carnero

PRUEBAS DE SENSIBILIDAD A LOS ANTIBIOTICOS (ANTIBIOGRAMA)

DIFUSION EN AGAR (Segn Kirby- Bauer y col.)

Placas de Agar nutritivo

Dejar reposar por 5 minutos a temperatura ambiente.

Incubar a 37C durante 24 horas.

Anotar e interpretar los resultados.

Cul es la importancia de su aplicacin.

Lmina para aglutinacin ( lminas excavadas)

AGREGAR UNA GOTA A CADA TUBO

Cultivo en caldo de Staphylococcus y/o Klebsiella

Con la jeringa hipodrmica recolectar 5 ml de sangre venosa.

PRUEBAS INMUNOENZIMATICAS: ELISA