TRANSFORMACIN DE ESCHERICHIA COLI CON ADN

PLASMIDICO
T. de la Rubia y J. Martnez

OBJETIVOS: el alumno tras realizar esta prctica aprender a:

1. Modificar el genoma de una bacteria
2. Provocar la transformacin de E. coli con ADN plasmdico
3. Utilizar los antibiticos como agentes de seleccin.

Contenido:
I

INTRODUCCIN

II MTODOS
III RESULTADOS
IV AUTOEVALUACIN

TRANSFORMACIN DE ESCHERICHIA COLI CON ADN

PLASMIDICO
I. INTRODUCCIN
Las bacterias pueden transmitir la informacin gentica verticalmente mediante la
divisin celular y reparto equitativo del material gentico o bien de forma horizontal
entre clulas que coexisten
La transferencia horizontal de genes, tambin conocida como transferencia lateral
de genes, es por tanto un proceso en el que el organismo transfiere material
gentico a otra clula no emparentada. Este mecanismo se considera fundamental
en la evolucin de los procariotas.
Es el principal mecanismo por el cual las bacterias diseminan genes de resistencia a
los antibiticos.

1.

Mecanismos
de
transferencia de material
gentico

1.1.

1.2.

Conjugacin

Transduccin

Existen tres mecanismos de transferencia

horizontal
de
informacin
gentica:
la
conjugacin
la
transduccin
y
la
transformacin.
La conjugacin es la transferencia de material
gentico a travs del contacto clula-clula y
mediado por factores de fertilidad (plsmidos
de fertilidad). Es un proceso de transmisin
sexual de informacin gentica.
Encontrar informacin ms completa sobre la
conjugacin bacteriana en los apuntes on line
del Profesor D. E. Iaez
La transduccin es el proceso de transferencia
de material gentico desde una bacteria
donadora a otra receptora mediada por
partculas de bacterifagos (virus bacterianos)
que contienen ADN del genomio de la bacteria

donadora.

1.3.Transformacin

Encontrar informacin ms completa sobre la

transduccin en los apuntes on line del
Profesor D. E. Iaez
La transformacin gentica es el intercambio de
material gentico producido cuando una
bacteria es capaz de captar fragmentos de ADN
de otra bacteria que se encuentran dispersos en
el medio donde vive y expresar los genes
transferidos.
Solo algunas bacterias pueden ser
transformadas. Las que pueden serlo se dice
que son competentes.
Encontrar informacin ms completa sobre la
transformacin bacteriana en los apuntes on
line del Profesor D. E. Iaez

1.3.1. Estado de competencia

para la transformacin

Para que se produzca la transformacin de una

bacteria sta debe encontrarse en un estado
fisiolgico denominado de competencia. Las
clulas competentes son aquellas susceptibles
de ser transformadas y, por lo tanto, tomar
ADN externo e introducirlo en su citoplasma. El
ADN asimilado de esta forma puede expresar
sus genes en la bacteria transformada.

II. MTODOS
1.Material necesario
Dos tubos Eppendorf con 40 l de clulas
competentes de Escherichia coli
2 placas de medio LB agar sin ampicilina
2 placas de medio LB agar con ampicilia
1 tubo Eppendorf con 1-2 g de plsmido pGEMT que es portador de un gen de resistencia a la
ampilicila.
Micropipetas de diferentes volmenes (2,50,100
y 500 l)
Puntas de micropipetas estriles
Tubo con medio LB caldo
Bao a 42C
Incubador a 37C

 Contenedor con hielo picado

Tubos Eppendorf estriles

2.

Caldo de LB: (Luria

Bertani broth)

Medio lquido para ensayos generales de gentica

molecular con Escherichia coli.
Composicin por Litro:
Peptona de casena
Extracto de levadura
ClNa
pH 7.2

2.1. Preparacin de las

placas de LB y LB con
ampicilina

10g
5g
5g

Para solidificar este medio (Agar LB) aadir 15 g

de agar bacteriolgico por litro. Autoclavar y
repartir en placas
Para las placas de LB agar con ampicilina proceder
igual que en la anterior y una vez autoclavado el
medio, mantener a 50C para aadir el antibitico
(ampicilina).
Preparacin de la Ampicilina: Preparar una
solucin madre 1000x de ampicilina (disolver
100mg en 1ml de agua destilada). Esterilizar por
filtracin.

3.Preparacin de las clulas

competentes de
Escherichia coli

Aadir la solucin de ampicilina (1 l por ml de

medio) al medio LB agar a 50C y repartir en
placas
La mayora de las clulas deben ser manipuladas
para que se vuelvan competentes o capaces de
tomar ADN de medio.
Cultivar E. coli en medio LB
Cuando los cultivos estn en fase exponencial
se centrifugan.
Desechar el sobrenadante y lavar las clulas
repetidamente con solucin de CaCl2 100mM
Suspender las clulas en un volumen 10 veces

inferior al del cultivo

Mantener tubos Eppendorf en hielo
Repartir alcuotas en los tubos Eppendorf
preenfriados
Almacenar rpidamente las suspensiones a
-70C hasta que las clulas vayan a ser
transformadas
4. Tcnica de transformacin

1.

Introducir dos tubos Eppendorf estriles

en hielo marcar uno como +ADN y el otro
como -ADN

3.

Aadir a cada tubo 40 l de la suspensin

de clulas competentes

4.

Aadir a la suspensin marcada como +ADN

2 l de solucin de plsmido pGEM-T (la otra
suspensin se somete a la misma
manipulacin para verificar al final del
experimento que las clulas competentes
son sensibles al antibitico).

5.

Incubar ambas suspensiones en hielo

durante 2 minutos

6.

Colocar ambas suspensiones en un bao a

42C durante no mas de 60 segundos.
Hemos sometido a las clulas a un choque
trmico durante el cual se debe producir la
entrada del ADN plasmdico en las clulas
competentes.

7.

Enfriar las suspensiones en hielo durante 2

minutos

8.

Aadir 400 l de caldo LB a ambos tubos

9.

Incubar a 37C en agitacin a 150 rpm

durante 1 hora. Durante este periodo se
reinicia la actividad metablica y se
expresarn los genes introducidos.

5. Deteccin de transformantes

1.

Diseminar 50 l de la suspensin de clulas

transformadas (ADN+) en ambos medios
de cultivo LB agar selectivo (con
ampicilina) y no selectivo.

2. Diseminar 50 l de la suspensin de clulas

no transformadas (ADN-) en ambos medios
de cultivo LB agar selectivo (con
ampicilina) y no selectivo.

3. Incubar las placas a 37C durante 24 horas

III. Resultados

La aparicin de colonias en el medio selectivo

Agar LB con ampicilina indica las clulas que han
adquirido resistencia a la ampicilina por
transformacin con el plsmido de resistencia

IV. AUTOEVALUACIN:
1. Qu es la transferencia horizontal de genes?
a. Es la transferencia de material gentico a la descendencia
b. Es

la

transferencia

de

material

gentico

otra

clula

no

descendiente.
c. Aquella que ocurre durante la fase logartmica de crecimiento
2. Cmo

pueden

obtenerse

clulas

competentes

para

la

transformacin?
a. Mediante la incubacin a bajas temperaturas
b. Mediante tratamiento con Cl2Ca
c. Mediante sonicacin
3. Qu es la transformacin gentica?
a. La transferencia de material gentico entre bacteria a travs de
bacteriogafos
b. La transferencia de material gentico por contacto fsico de las
clulas
c. La transferencia de materia gentico del medio