Manual Salmonella 2008

Manual de Procedimientos
Diagnstico y caracterizacin
de Salmonella spp.
2008
AUTORES
Mara Ins Caffer
Raqurel Terragno
Norma Binsztein
Departamento Bacteriologa
Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas
A.N.L.I.S. Dr. Carlos G. Malbrn
Centro Regional de Referencia del WHO Global Salm Surv
para Amrica del Sur
INDICE
CAPTULO I- INTRODUCCIN
CAPTULO II- AISLAMIENTO Y CARACTERIZACIN DE SAMONELLA spp. 9

9
1.-EPECMENES
2.-PROCESAMIENTO
10
2.1.-AISLAMIENTO
10
Flujograma de aislamiento e identificacin bioqumica de Salmonella spp

14
a partir de heces
2.2.-IDENTIFICACIN Y CARACTERIZACIN BIOQUIMICA DE
SALMONELLA spp.
15
2.2.1.- Pruebas Bioqumicas
22
Agar Hierro Tres Azcares y Agar Kligler
22
Prueba de la -Galactosidasa
23
Agar Lisina Hierro
25
Agar SIM
26
Test de Utilizacin de Azcares
27
Test de Decarboxilasa-Dehidrolasa
29
Prueba del Malonato
32
Ensayo del Rojo de Metilo
33
Ensayo de Voges-Proskauer
35
Prueba de la Urea
36
Prueba del Indol
38
2.2.2.- Problemas de Diagnstico Diferencial
40
2.3.-SEROTIPIFICACIN DE SALMONELLA spp.
42
Antgenos Somticos
43
Antgenos Flagelares
44
Antgeno Capsular
45
Descripcin del Esquema de Kauffmann-White
45
2.3.1. SEROTIPIFICACION SOMTICA O
49
2.3.2. SEROTIPIFICACION FLAGELAR H
51
Flujograma para Serotipificacin de Salmonella spp.
56
CAPTULO III- PRECAUCIONES DE BIOSEGURIDAD
59
1.- NIVEL DE LABORATORIOS
59
2.-ELEMENTOS DE PROTECCIN.
60
3.- INSTRUCCIONES PARA EL TRABAJO.
61
4.- ACCIONES A REALIZAR EN CASO DE INCENDIO
61
5.- CENTROS PARA REQUERIR AYUDA
62
6.- TRANSPORTE DE MUESTRAS
62
CAPTULO IV- MEDIOS DE CULTIVO Y SOLUCIONES
64
Caldo Selenito
64
Caldo Tetrationato
64
Caldo Flagelar
65
Solucin Salina
65
Agar Movilidad (Swarm Agar)
65
Agar Nutritivo
65
Agar Mueller-Hinton
66
Agar EMB
66
Agar McConkey
66
Agar SS
67
Agar Hektoen
68
Agar Verde Brillante
69
Agar XLD
69
CAPTULO V- PLANILLAS DE RESULTADOS
71
CAPTULO I - INTRODUCCIN
El gnero Salmonella pertenece a la tribu Salmonelleae, de la familia Enterobacteriaceae.
Los miembros del gnero Salmonella son bacilos gram-negativos, de 0,7-1,5 x 2,0-5m,
generalmente mviles por flagelos pertricos (excepto S. Gallinarum), anaerobios facultativos,
no esporulados.
El gnero Salmonella fue objeto de sucesivas modificaciones, a travs de los aos, en lo que
respecta a su nomenclatura y taxonoma. Sin embargo, todava siguen vigentes las ideas
desarrolladas por P.R. Edwards y H.W. Ewing, en la dcada del 40, cuando definieron e
identificaron las primeras cepas del gnero Salmonella y de otros miembros de la familia
Enterobacteriaceae.
Estudios del DNA mediante tcnicas de hibridacin mostraron que el gnero Salmonella est
constitudo por 2 especies: Salmonella enterica y Salmonella bongori. Salmonella enterica
est compuesta por 6 subespecies: Salmonella enterica subespecie enterica, Salmonella
enterica subespecie salamae, Salmonella enterica subespecie arizonae, Salmonella enterica
subespcie diarizonae, Salmonella enterica subespespecie houtenae y Salmonella enterica
subespecie indica.
A su vez las subespecies de Salmonella enterica y la especie Salmonella bongori se dividen
en ms de 2400 serovariedades, que estn definidas en funcin de diferentes asociaciones de
factores antignicos somticos O y flagelares H.
La mayora de las serovariedades aisladas del hombre y de los animales de sangre caliente
pertenecen a la subespecie enterica (subespecie I) y llevan un nombre por lo general
relacionado con el lugar geogrfico donde se la aisl por primera vez.
Como las serovariedades no tienen nivel taxonmico de especie, sus nombres no siguen las
reglas del International Code of Nomenclature of Bacteria, de manera que sus nombres se
deben escribir en letras romanas (no itlicas) y con mayscula; por ejemplo el nombre
completo de Salmonella Typhimurium es Salmonella enterica subesp. enterica serovariedad
Typhimurium. Como este nombre es muy largo, a los fines prcticos se usa directamente
Salmonella Typhimurium
Las serovariedades pertenecientes a las subespecies restantes y a Salmonella bongori, de baja

incidencia en patologa humana o animal, se designan con el nombre de la subespecie, seguido
de la frmula antignica, por ej: Salmonella subesp. IV 50: b : - (Salmonella enterica subesp.
houtenae 50:b : -)
Los nombres de todas las serovariedades estn contenidos en el Esquema de KauffmannWhite, publicado por el Centro Colaborador de la OMS de Referencia e Investigacin de
Salmonella, del Instituto Pasteur de Pars (1).
Los miembros del gnero Salmonella estn ampliamente distribuidos en la naturaleza, se los
encuentra como comensales y como patgenos en el tracto gastrointestinal de mamferos
domsticos y salvajes, reptiles, aves e insectos, causando un amplio espectro de enfermedades
en el hombre y los animales.
Los miembros del gnero se pueden clasificar en tres grupos:
a) Los que no tienen preferencia por algn husped en especial, por lo que infectan tanto
al hombre como a los animales. En este grupo se encuentran la mayora de las
serovariedades responsables de las salmonelosis.
b) Los que infectan slo al hombre: Salmonella Typhi, Salmonella Paratyphi A y
Salmonella Paratyphi C
c) Los que estn adaptados a un husped animal: S. Abortusovis, a los ovinos; S.
Abortusequi, a los equinos y S. Gallinarum, a las aves
La salmonelosis es una zoonosis de distribucin mundial. La tasa de incidencia de la infeccin
es mayor en los lactantes y en nios de corta edad. Epidemiologicamente, las infecciones por
Salmonella pueden causar pequeos brotes en la poblacin en general, sin embargo el 60 80% de los casos son espordicos; a veces se producen grandes brotes en hospitales, jardines
maternales, geritricos, restaurantes.
Es una enfermedad fundamentalmente de origen alimentario, la fuente ms frecuente de
infeccin son los alimentos contaminados, incluido agua. Tambin puede ocurrir la
transmisin de persona a persona.
A pesar de todos los controles que se han puesto en prctica, las infecciones por Salmonella
debidas al consumo de alimentos contaminados contina siendo un problema serio con
millones de casos que ocurren anualmente en todo el mundo, provocando grandes prdidas
econmicas. En el 2003, se estim que solamente en los Estados Unidos, el costo de las
salmonelosis producidas por alimentos contaminados llegaba a la cifra de 3.000.000.000
dlares.
La vigilancia de Salmonella spp. en todas las etapas de la cadena de procesamiento de los
alimentos constituye un elemento importante en la investigacin de la epidemiologa de la
salmonelosis transmitida por alimentos y en el desarrollo e implementacin de estrategias
eficientes de control de la misma.
En programas de monitoreo y control es esencial contar con mtodos de laboratorio eficientes
para el aislamiento, identificacin y tipificacin de Salmonella spp.
Se debe destacar que hay muchos procedimientos distintos para el aislamiento de Salmonella.
El mtodo ideal debe tener una alta sensibilidad y especificidad, y ser al mismo tiempo
simple, rpido y econmico. Ningn mtodo cumple con todos criterios y ninguno es ptimo
para todas las condiciones. Por lo tanto es aconsejable consultar la literatura antes de elegir un
mtodo para un determinado propsito y es recomendable la comparacin frecuente de los
mtodos de cada laboratorio con los nuevos mtodos que surjan.
Los criterios para la identificacin bioqumica de Salmonella spp. estn ampliamente
descritos, sin embargo estas pruebas dependen de la expresin fenotpica de las caractersticas
analizadas y pueden verse afectadas por variaciones en los medios de cultivo y en las
condiciones de incubacin. Como una alternativa se estn introduciendo cada vez ms los
mtodos moleculares; que permiten un diagnstico ms rpido y pueden ser ms simples de
realizar, pero tienen la desventaja que son caros.
El sistema de serotipificacin de Salmonella spp. es probablemente el mejor sistema de
tipificacin fenotpica bacteriano. Tiene un alto poder discriminatorio y provee informacin
con significado epidemiolgico, desde el punto de vista de la vigilancia basada en laboratorio.
La disponibilidad y el costo de antisueros de alta calidad es un problema en algunos pases y
regiones. La subtipificacin molecular da informacin adicional, de mayor discriminacin sin
embargo no es un sustituto de la serotipificacin.
Los microorganismos del gnero Salmonellae son bacilos Gram negativos (0.7 a 1.5 x 5 m),
no fermentadores de lactosa. Son mviles por medio de flagelos peritricos, con la excepcin
de Salmonella Pullorum y Salmonella Gallinarum. Fermentan glucosa con produccin de
7
cido y gas (excepto S. Typhi). Tambin fermentan L-arabinosa, maltosa, D-manitol, Dmanosa, L-ramnosa, D-sorbitol, trehalosa, D-xilosa y D-dulcita.
Son oxidasa negativo,
catalasa positivo, indol y Voges-Proskauer (VP) negativo, rojo de metilo y citrato de Simmons
positivo, urea negativo y producen SH2.
Los procedimientos siguientes servirn como gua para realizar los pasos necesarios para
aislar adecuadamente Salmonella spp. de heces, efectuar la identificacin bioqumica de
Salmonella spp. y serotipificar los aislamientos utilizando antisueros somticos y flagelares
adecuados.
Recoleccin y transporte de muestras
Aislamiento de Salmonella spp. de heces.
Identificacin bioqumica de Salmonella spp.
Serotipificacin de Salmonella spp.
Bioseguridad
Los procedimientos de laboratorio se realizan de acuerdo con las recomendaciones
establecidas en Biosefety in Microbiological and Biomedical Laboratories, 4 th. CDC/NIH
(Ver Captulo III - Precauciones de Bioseguridad)
CAPTULO II AISLAMIENTO Y CARACTERIZACIN DE SALMONELLA

spp.
1.-. ESPECMENES
Para el diagnstico de Salmonella spp. se pueden usar muestras de materia fecal y fluidos
(sangre, orina, bilis y pus de abscesos).
a) Materia fecal:
La muestra debe obtenerse en el perodo agudo de la enfermedad, antes de iniciar el
tratamiento con antimicrobianos. Con un hisopo estril, se recoge una pequea cantidad de
una evacuacin espontnea reciente, seleccionando las partes mucosas o sanguinolentas. En
caso de no poder obtener esta muestra, se hace un hisopado rectal. Las muestras que no se
pueden procesar dentro de las dos horas, se deben colocar en medio de transporte. Como
medio de transporte se usa Cary Blair, que tiene la ventaja de ser estable hasta 18 meses
despus de su preparacin, cuando las condiciones de almacenamiento son correctas. En este
medio de transporte se puede conservar la muestra hasta 5 das, siempre en refrigeracin.
b) Sangre:
La muestra se toma en el momento del pico de fiebre. Se siembran 10 ml de sangre en un
frasco de hemocultivo de 100 ml (relacin 1:10). Se incuba a 35 - 37C, durante 7 das,
haciendo un control (en medio de agar sangre) a ciegas a las 8 horas de incubacin y controles
peridicos de acuerdo a la turbidez observada. El hemocultivo reviste un inters especial en el
caso de fiebre tifoidea y paratifoidea; pero no es constantemente positivo. Los porcentajes de
positividad, en ausencia de tratamiento antibitico, son: 90% durante la primera semana de
evolucin, 75% en la segunda, 40% en la tercera y 10% en la cuarta.
Los hemocultivos son negativos en los sindromes de infecciones transmitidas por alimentos
por serovariedades como S. Typhimurium S. Enteritidis, sin embargo estas serovariedades
causan septicemia en los inmunocomprometidos.
c) Material de abscesos y orina:
El pus y la orina se recogen en recipientes estriles y una alcuota se siembra directamente en
los medios de cultivo.
2.- PROCESAMIENTO
2.1.- AISLAMIENTO
Materiales y equipamiento
Ansas descartables (10 l)
Placas de Petri descartables (9 cm dimetro) estriles
Balanza
Estufas a 37oC
Mechero bunsen
Hisopos de algodn
Medios
Caldo nutritivo
Caldo selenito
Agar hierro tres azcares (TSI)
Agar lisina hierro (LIA)
Estras de agar tripticas de soja (TSA)
Placas de agar Salmonella Shigella (SS)
Placas de agar MacConkey (MC)
Procedimiento
Comentarios
Da 1 Cultivo primario en placas de agar

(Camino I) y enriquecimiento selectivo
(Camino II) (Figura 1)
Para estas muestras se recomiendan dos
Resuspender el hisopo en 1 ml de
caminos simultneos:
caldo nutritivo de manera de tener una

suspensin homognea de la materia fecal.
Cultivo directo en medios slidos,
Sembrar con ansa una muestra de la
aislamiento e identificacin de las colonias
suspensin de materia fecal, en placas de

agar MC y SS (o XLD) (Camino I- Cultivo
directo)
Subcultivar el hisopo en un tubo de
10
Enriquecimiento en caldo selectivo,
caldo selenito, (Camino II - Enrequicimiento
se usa para favorecer el aislamiento de los
para la deteccin de Salmonella spp)
microorganismos cuando se encuentran en

muy bajo nmero en la muestra. La eleccin
del
mtodo
depende
del
nmero
de
microorganismos presentes en la materia

fecal, que est en relacin con el proceso
diarreico o el estado de portador.
Si en el camino de aislamiento directo
(Camino I) se identifica
y confirma
Salmonella spp., no es necesario continuar

la va del enriquecimiento (Camino II)
Incubar las placas del Camino I y el
tubo (con el hisopo incluido) del Camino II,

a 37C, 18-24 horas
Da 2 Subcultivo de las colonias
sospechosas de ser Salmonella
y
En la placa de agar MC las colonias
caractersticas fenotpicas de las colonias
tpicas son lactosa negativas e incoloras, y
aisladas en las placas de agar MC y de agar
en las de agar SS: las colonias tpicas son
SS (Camino I).
incoloras, translcidas con un centro negro
Observar
la
morfologa
Anotar los resultados en la Planilla 1
debido a la produccin de SH2. (Ver Tabla
Registro de Resultados: Aislamiento de
1: Caractersticas de las colonias en medios
Salmonella spp. Morfologa en placas de
selectivos y diferenciales )
agar selectivo (Camino I)
Subcultivar 2 colonias sospechosas
El subcultivo de colonias sospechosas
de ser Salmonella de las placas de agar MC
de Salmonella en estras de agar TSA al
y SS en estras de agar TSA, agar TSI y agar
mismo tiempo que la inoculacin en TSI y
LIA (Camino I).
LIA
11
permite
ganar
un
da
en
la
identificacin y serotipificacin
Sembrar con ansa una muestra del caldo
Si se obtienen resultados por el Camino I,
selenito en placas de agar MC y SS. Incubar
no continuar adelante por el Camino II.
todos los medios a 37C, 18-24 horas.

(Camino II)
Da
Confirmacin
bioqumica
serotipificacin de Salmonella (Camino I) y

subcultivo de colonias sospechosas de
Salmonella provenientes del camino de
enriquecimiento (Camino II)
Leer las reacciones bioqumicas TSI
y LIA, si son compatibles con Salmonella

spp.,
realizar
las
complementarias
pruebas
y
la
bioqumicas
serotipificacin
somtica (Camino I). [Ver Procedimiento

Identificacin
caracterizacin
de
Salmonella spp (2.2) y Serotipificacin de

Salmonella spp. (2.3) ]
Subcultivar 2 colonias sospechosas
Si se obtienen resultados por el
de Salmonella de las placas de agar MC y
Camino I, no continuar adelante por el
SS provenientes del enriquecimiento en
Camino II
caldo selenito (Camino II), en estras de agar

TSA, agar TSI y agar LIA.
Da 4
Leer los resultados
de las pruebas
bioqumicas complementarias y realizar la

serotipificacin flagelar de Salmonella spp.
12
(Camino I) y/ o los resultados

confirmacin
bioqumica
de la
preliminar
realizar la serotipificacin somtica de

Salmonella spp. (Camino II).
TABLA 1. Caractersticas de las colonias en medios selectivos y diferenciales

Medio de cultivo
Agar MC
Agar EMB
Agar SS
Agar XLD
Agar HK
Agar BGA
Selectividad
Baja
Baja
Alta
Alta
Alta
Alta
Aspecto de las colonias

Incoloras
Incoloras
Incoloras con centro negro
Rojas con centro negro
Verdes-azuladas con centro negro
Rosadas plidas
Ver Flujograma de aislamiento e identificacin bioqumica (Figura 1)
13
FIGURA 1.- FLUJOGRAMA DE AISLAMIENTO E IDENTIFICACIN

BIOQUMICA DE SALMONELLA spp. A PARTIR HECES
Camino II
Camino I
MATERIA FECAL (HISOPO)
1er. da
Suspensin en
solucin fisiolgica
Aislamiento en medios
selectivos y diferenciales (2)
Caldo de enriquecimiento (1)

18-24 hs, 37C
Aislamiento en medios
selectivos y diferenciales (2)
Colonias tpicas (3)
2do. da
TSI
LIA
Estra
18-24 hs, 37C
3er. da
Serotip. O (6)
Lectura (4)
Colonias tpicas (3)
P. bioq. (5)
TSI
LIA
Estra
Caldo
Flagelar
18-24 hs, 37C
Lectura (4)
Serotip. O (6)
Lectura
Serotip. H
4to. da
P. bioq. (5)
(1) Caldo selenito

(2) Agar MacConkey y agar SS, o agar Hektoen, o agar xilosa lisina desoxicolato, o agar verde
brillante.
(3) Se seleccionan de 2 a 3 colonias.
(4) Si TSI y LIA dan resultados compatibles con Salmonella, se siembran Pruebas bioqumicas
complementarias (P.bioq.) y se realiza la serotipificacin O (Serotip. O)
(5) Pruebas bioqumicas complementarias: RM-VP, decarboxilasas, dulcita, malonato.
(6) Serotip: Serotipificacin. Si la serotipificacin somtica O de las colonias obtenidas por ambos
procedimientos de aislamiento diera igual, la serotipificacin flagelar H debe hacerse en una sola
de ellas.
14
2.2.- IDENTIFICACIN Y CARACTERIZACIN BIOQUIMICA DE

SALMONELLA spp.
Las probables colonias de Salmonella spp. en los medios de aislamiento utilizados se

confirman mediante pruebas bioqumicas recomendadas por Le Minor y Richard: desarrollo
en agar hierro-tres- azcares (TSI), utilizacin de urea de Christensen, determinacin de lisina
y ornitina decarboxilasa y de arginina dehidrolasa, prueba de la beta-galactosidasa (ONPG),
prueba del rojo de metilo, reaccin de Voges-Proskauer, prueba de fermentacin de la dulcita
y utilizacin del malonato.
La mayora de las serovariedades (99,8%) de Salmonella aisladas del hombre y de los
animales de sangre caliente pertenecen a Salmonella enterica subesp. enterica (I) y tienen
propiedades bioqumicas caractersticas (Tabla 2), siendo excepciones las serovariedades
S. Typhi y S. Paratyphi A.
TABLA 2. Pruebas bioqumicas de Salmonella enterica subesp. enterica (I)
Pruebas bioqumicas
Salmonella enterica subep. enterica (I)
Lactosa ***
ONPG
Produccin de SH2
Glucosa (fermentacin) ***
Dulcita (fermentacin) ***
Adonita (fermentacin) ***
Lisina decarboxilasa **
Ornitina decarboxilasa**
Arginina dihidrolasa **
Urea (hidrlisis)**
Indol
Rojo de Metilo *
Voges Proskauer *
Citrato de Simmons **
Malonato (utilizacin)*
+
+/con gas
+
+
+
+
+
+
-
*Lectura a los 2 das; ** Lectura hasta los 4 das; *** Lectura hasta los 7 das; **** Lectura hasta los 30 das
15
Las caractersticas bioqumicas que permiten diferenciar las distintas subespecies dentro de la
especie S. enterica y la diferenciacin con la especie S. bongori se indican en la Tabla 3.
TABLA 3. Propiedades bioqumicas diferenciales de las subespecies de Salmonella spp.
S.
enterica
Pruebas
subesp.
bioqumicas
Enterica
(I)
Dulcita
+
ONPG
Malonato
Gelatina
Sorbita
+
KCN
L(+) tartrato
+
Mucato
+
Salicina
Lactosa
Habitat de
Animales
las cepas
de sangre
caliente
S.
enterica
subesp.
salamae
(II)
+
+
+
+
+
-
S.
enterica
subesp.
arizonae
(IIIa)
+
+
+
+
+
- (75%)
S.
S.
S. enterica
enterica enterica
S.
subesp.
bongori
subesp. subesp.
diarizonae
houtenae indica
(V)
(IIIb)
(VI)
(IV)
d
+
+
d
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
- (70%)
+
+
+
+ (75%)
d
-
Animales de sangre fra y medio ambiente
+ 90% ms de los resultados positivos; - 90% ms de los resultados negativos; d: diferentes

reacciones
Es importante tener en cuenta la posibilidad de aislar ms de una serovariedad de Salmonella

de un alimento de un material patolgico. Si bien esto no ocurre con frecuencia, hay que
tenerlo presente cuando se trabaja con muestras de materia fecal o de ganglios mesentricos y
sobre todo en el caso de ciertos alimentos para consumo humano o animal, como huevos a
granel, embutidos, harinas de carnes o huesos. Es por ello que se recomienda estudiar varias
colonias simultneamente.
Ansas descartables (1 l)
Ansa aguja
Mechero Bunsen
Estufa a 37oC
16
Medios
Medio para la prueba de urea
Medio para la prueba de fenilalanina
Medio Citrato de Simmons
Medio para la prueba de la lisina decarboxilasa (LDC)
Medio para la prueba de la ornitina decarboxilasa (ODC)
Medio para la prueba de la arginina dihidrolasa (ADH)
Medio control para las pruebas con aminocidos.
Vaselina estril
Medio base para azcares
Solucin madre de dulcita al 5%
Solucin madre de salicina al 10%
Solucin madre de sorbita al 10%
Solucin madre de lactosa al 10%
Solucin madre de adonita al 10%
Solucin madre de glicerol al 10%
Slucin madre de manita al 10%
Solucin madre de glucosa al 10%
Solucin madre de dulcita al 10%
Solucin madre de ramnosa al 10%
Solucin madre de silosa al 10%
Caldo Malonato
Discos de o-nitrofenil--D-galactopiransido (ONPG) o reactivo para la prueba de la
-galactosidasa
Agar SIM
Reactivo de Erlich para la prueba de indol
Medio RM/VP para la prueba de Voges-Proskauer
Solucin de KOH 40% para la prueba de Voges-Proskauer
Solucin alcohlica de alfa-naftol para la prueba de Voges Proskauer
17
Cepas bacterianas
Cepas de referencia para el control de calidad de los medios.
Procedimiento
Comentarios
Da 3 Siembra de las pruebas bioqumicas

complementarias
Inocular a partir de un cultivo en estras

de agar TSA, los medios para las
siguientes pruebas:
Medio para la prueba urea.
Medio para la prueba de LDC, ADH y
ODC y el medio control. Cubrir con una
capa de vaselina estril.
Medio para ONPG.
Medio RM/VP.
Agar SIM.
Dulcita
Caldo Malonato
Incubar todas las pruebas bioqumicas a

37C por 18-24 horas.
Test de la -galactosidasa: Resuspender
La
un ansa del cultivo proveniente del TSI en
inducible, y como la lactosa, presente en el
un tubo que contiene 0.5 ml de medio de
TSI, es uno de los inductores del opern
ONPG e incubar a 37C. Se debe ver una
lactosa, la prueba se realiza a partir del
reaccin positiva dentro de los 20 minutos
desarrollo en este medio.
pero usualmente la prueba se lee a las 3-4

horas o ms. Tambin se pueden usar discos
de ONPG siguiendo las indicaciones del
fabricante
18
-galactosidasa
es
una
enzima
Da 4 Lectura de las pruebas bioqumicas

complementarias
Prueba de urea.
Si
se
presentan
resultados
no
Prueba de LDC, ADH y ODC.
concordantes con los esperados para la
Prueba de ONPG.
identificacin bioqumica de Salmonella
Prueba de RM/VP.
spp. se deben realizar pruebas diferenciales.
Prueba de SIM.
Ver Problemas de Diagnstico Diferencial,
Fermentacin de Dulcita
donde se presentan pruebas bioqumicas
Utilizacin de Malonato
comparativas con otros gneros de la familia

Enterobacteriaceae
Agregar los reactivos correspondientes a

las siguientes pruebas:
RM: agregar a 0,5 ml del caldo
RM/VP 1 gota de rojo de metilo
VP: agregar a 1 ml del caldo RM/VP,
Agitar muy bien luego de la adicin de
0,6 ml de la solucin alcohlica de -
cada reactivo
naftol y 0,2 ml de la solucin de KOH.
Indol: agregar 1 ml del reactivo de

.
Erlich al medio SIM.

Leer los resultados de acuerdo a las
Tablas 4, 5 y ver Pruebas Bioqumicas
Propiedades
Interpretacin
de
los
Resultados.
Anotar los resultados en las planillas de
registro.
19
TABLA 4. Pruebas bioqumicas: interpretacin de los resultados
Medio
TSI
TSI
TSI
TSI
LIA
Resultados
Reacciones/enzimas
Produccin de cido (si el fondo es
amarillo y la estra es roja, (la
produccin de cido es slo a partir
de glucosa).
Produccin de cido a partir de
lactosa y/o sacarosa.
Produccin de gas
Negativo
Positivo
Fondo rojo
Fondo amarillo
Estra roja
Estra amarilla
No hay burbujas en el
fondo
No hay color negro
Burbujas de aire en el
fondo
Color negro
Botn
purpura/Superficie
amarilla
Botn prpura/Superficie
prpura
LIA
Urea
LDC
Produccin de H2S
La decarboxilacin de la lisina
produce una reaccin alcalina
(color violeta) a travs del medio.
Los organismos que no
decarboxilan la lisina producen una
estra alcalina y un fondo cido
(color amarillo).
Produccin de H2S
Ureasa
Lisina decarboxilasa
No hay color negro

Amarillo
Color amarillo/marrn
ODC test
Ornitina decarboxilasa
ADH test
Arginina dihidrolasa
ONPG
Voges
Proskauer
Indol
SIM agar
SIM agar
SIM agar
-Galactosidasa
Produccin de acetona
Permanece incoloro
Permanece incoloro
Color negro
Rosa/Cereza
Color prpura y color
amarillo/marrn en el
medio control.
Color prpura y color
medio control
Color prpura y
medio control
Amarillo
Color rojo/rosado
Produccin de Indol
Produccin de H2S
Produccin de indol
Movilidad
anillo amarillo
No color negro
Anillo amarillo
Desarrollo solo a lo
largo de la lnea de
puncin
20
anillo rojo/rosado
Color negro
anillo rojo/rosado
Muestra un crecimiento
difuso que se disemina a
partir del punto de
inoculacin
TABLA 5. Resultados de las pruebas bioqumicas para Salmonella spp.

Prueba1)
TSI glucosa (cido)
TSI glucosa (gas)
TSI lactosa
TSI sacarosa
TSI sulfuro de hidrgeno
LIA agar
SIM agar (H2S)
SIM agar (indol)
SIM agar (movilidad)
Utilizacin de urea
Reaccin de -galactosidasa
Reaccin de Voges-Proskauer
Reaccin de indol
Utilizacin del Malonato
Reaccin positiva o
negativa
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
1)
% de aislamientos de Salmonella
que muestran la reaccin2)
100
91.93)
99.24)
99.5
91.6
98
97
98.9
97
99
94.65)
97
70
98.44)
100
98.9
100
96
Ewing W. H. and Ball M. M., The biochemical reactions of members of the genus Salmonella.
National Communicable Disease Center, Atlanta, Georgia, USA (1966).
2)
Estos porcentajes indican solo que no todas las cepas de Salmonella muestran las reacciones
marcadas + o -.
3)
Salmonella Typhi es anaerognica.
4)
Salmonella (subgnero) subespecie III (Arizona) da reacciones + o para lactosa pero es siempre galactosidasa positiva. Salmonella (subgnero) subespecie II da una reaccin negativa para lactosa y
una reaccin negativa para -galactosidasa, (Antigenic Formulas of the Salmonella serovars, 2001).
Para el estudio de las cepas, puede ser til realizar pruebas bioqumicas complementarias.
5)
S. Paratyphi A es negativa.
21
2.2.1.- PRUEBAS BIOQUMICAS
Agar Hierro Tres Azcares (TSI) y Agar Kligler

I. Principio
El medio fue diseado para determinar la habilidad de las bacterias de fermentar hidratos de
carbono y producir sulfuro de hidrgeno (SH2). El medio contiene 1 parte (0.1%) de glucosa y
10 partes (1.0%) de lactosa y sacarosa. El indicador de pH es el rojo fenol y el sulfato ferroso
pone en evidencia la formacin de SH2. Si el microorganismo fermenta glucosa, tanto la
puncin como la estra aparecern de color amarillo. Si el organismo fermenta lactosa y/o
sacarosa, la estra permanecer cida (amarilla). Si no fermenta lactosa, la estra se vuelve
alcalina (roja). Los organismos que no fermentan glucosa no producen cambios en el pH del
medio o producirn productos alcalinos y el medio TSI permanecer rojo. La produccin de
SH2 se manifiesta por un ennegrecimiento del medio.
El agar de Kligler contiene dos azcares: lactosa (1%) y glucosa (0.1%). Este medio puede
reemplazar al TSI, la diferencia entre ambos es la ausencia de sacarosa. Los fundamentos
bioqumicos y la interpretacin de los resultados son los mismos para ambos medios.
II. Materiales
El medio est disponible comercialmente. Disolver en agua destilada y dispensar volumenes
de 5.0 ml en tubos con tapa a rosca; autoclavar a 121C por 15 minutos y enfriar inclinado
dejando un fondo de 5 a 10 mm. El sustrato es estable por 3 meses. Rotular indicando fecha
de preparacin y de expiracin.
Guardar en heladera; si hay cambio de color no usar.
II. Resultados
A. Estra cida/fondo cido (amarillo/amarillo): fermentacin de glucosa, sacarosa y/o
lactosa (E. coli).
B. Estra alcalina/fondo cido (rojo/amarillo): fermentacin de glucosa solamente
(Shigella spp.).
C. Estra alcalina/fondo alcalino (rojo/rojo): no fermentador (Pseudomonas aeruginosa).
D. Precipitado negro en el fondo: produccin de SH2 (Salmonella spp).
22
E. Burbujas o roturas: produccin de gas (E. coli, Salmonella spp.).

III. Control de Calidad
Bacteria
Salmonella Typhi
Puncin
Ac
Estria
Sh2
Alc
+ (*)
Salmonella Paratyphi A Ac/g
Alc
Salmonella spp.
Ac
Alc
Shigella spp.
Ac
Alc
Enterobacter aerogenes Ac/g
Ac
Enterobacter cloacae
Ac/g
Ac
Escherichia coli
Ac/g
Ac
Citrobacter
Ac/g
Ac
Klebsiella
Ac/g
Ac
Proteus vulgaris
Ac/g o Ac
Ac
+(sucio)
Proteus mirabilis
Ac/g o Ac
Alc
+ (sucio)
Klebsiella pneumoniae
Ac/g o Ac
Alc
(*) slo en la parte superior de la puncin o formacin de un anillo.

Para el control de calidad selecionar entre aquellos microorganismos disponibles.
Prueba de la -galactosidasa
I. Principio
La fermentacin de la lactosa requiere dos enzimas; mientras
la permeasa facilita la
penetracin de la molcula de lactosa dentro de la clula bacteriana, la -galactosidasa

hidroliza la lactosa para formar galactosa y glucosa. Las bacterias no fermentadoras de lactosa
carecen de ambas enzimas, sin embargo hay bacterias que tienen -galactosidasa pero no
permeasa. El o-nitrofenil--D-galactsido (ONPG) es un compuesto incoloro estructuralmente
similar a la lactosa. En presencia de -galactosidasa, ONPG se rompe en galactosa y onitrofenil, un compuesto color amarillo. Como la familia Enterobacteriaceae se agrupan de
acuerdo a su habilidad de fermentar lactosa, este test es til en la identificacin de
fermentadores de lactosa.
23
II. Materiales
A. Solucin de ONPG
Disolver 80.0 mg de ONPG en 15.0 ml de agua destilada a 37 C, agregar 5.0 ml del buffer
fosfato, ajustar a pH 7.0 y esterilizar por filtracin. La solucin es estable por 6 meses.
Guardar refrigerada
(4 a 8 C), en recipientes de color caramelo o envueltos en papel de aluminio.
Rotular la solucin, indicando fecha de preparacin y de expiracin.
B. Buffer fosfato de sodio 1M (pH 7.0)
Disolver 6,9 gr de NaHPO4.H2O en 45.0 ml de agua destilada. Agregar 3.0 ml de una
solucin de NaOH al 30% (w/v) y ajustar el pH a 7.0. Llevar el volumen a 50.0 ml con agua
destilada y guardar a 4 C.III. Procedimiento
A. A partir de un cultivo en TSI, hacer una suspensin espesa del organismo a ensayar en
0.5 ml de solucin salina. El volumen no tiene mayor importancia porque es una
prueba basada en la observacin de un cambio de color.
B. Agregar un disco o dos gotas de solucin de ONPG.
C. Incubar la mezcla a 37C y examinar cambio de color hasta 24 horas.
IV. Resultados
Ensayo positivo: desarrollo de color amarillo.
Ensayo negativo: no hay desarrollo de color.
V. Control de calidad
Escherichia coli (+)
Salmonella (-)
VI. Consideraciones
A. Se puede partir de estras de agar nutritivo con 1% de lactosa, cuando no se dispone de
TSI.
B. La solucin de ONPG preparada debe ser incolora antes de su empleo.
24
Agar Lisina Hierro (LIA)

I. Principio
La decarboxilacin de la lisina a cadaverina produce una alcalinizacin del medio y un viraje
al violeta del indicador prpura de bromocresol. Como la reaccin tiene lugar en medio cido,
es necesaria la fermentacin previa de la glucosa.
Los microorganismos que no decarboxilan lisina, pero fermentan la glucosa producen un
viraje al amarillo en todo el medio.
La formacin de SH2 produce una coloracin negra debido al sulfuro de hierro producido.
Las bacterias del grupo Proteus-Providencia, con excepcin de Morganella morganii,
desaminan la lisina a cido -cetocarbnico que forma compuestos pardo-rojizos en el medio
de cultivo con la sal de hierro y en aerobiosis.
II. Materiales
El medio est disponible comercialmente. Disolver el polvo en agua destilada y dispensar en
volmenes de 3 ml en tubos con tapa a rosca. Esterilizar a 121C por 15 minutos. Enfriar de
manera de tener estra y fondo. Guardar en heladera.
II. Resultados
Los microorganismos que descarboxilan la lisina producen un viraje al violeta.
Los microorganismos que no descarboxilan la lisina y fermentan glucosa producen un viraje al
amarillo.
La formacin de SH2 se indica por la aparicin de una coloracin negra.
25
III. Control de Calidad

Bacteria
Puncin
Estria
Sh2
Salmonella sp.
Violeta
Violeta
Proteus mirabilis
Amarilla
Pardo-rojiza
Proteus vulgaris
Amarilla
Pardo-rojiza
Morganella morganii
Amarilla
Pardo-rojiza
Prov. rettgeri
Amarilla
Pardo-rojiza
Providencia spp.
Amarilla
Pardo-rojiza
Citrobacter spp.
Amarilla
Violeta
Escherichia coli
Amarilla
Violeta
Shigella spp.
Amarilla
Violeta
Klebsiella
Violeta
Violeta
Para el control de calidad seleccionar entre aquellos microorganismos disponibles.

Agar SIM
I. Principio
Es un medio que se usa para determinar la formacin de sulfuro de hidrgeno, la produccin
de indol y la movilidad en el diagnstico de Enterobacterias.
II. Materiales
El medio est disponible comercialmente. Disolver en agua destilada, calentar suavemente
hasta su disolucin y dispensar en volumenes de 5 ml en tubos con tapa a rosca. Autoclavar a
121C, 15 minutos; enfriar en posicin vertical y guardar en heladera.
III. Procedimiento
A.Con un ansa tomar material de una colonia y sembrar por puncin.
B.Incubar a 37C por 18 a 24 horas.
IV. Resultados
A. Para la produccin de SH2
Ensayo positivo: ennegrecimiento del medio.
26
Ensayo negativo: no hay ennegrecimiento.

B. Para la movilidad
Ensayo positivo: hay una turbidez difusa del medio.
Ensayo negativo: slo hay crecimiento a lo largo de la puncin.
C. Para la produccin de indol
Ensayo positivo: aparicin de color rojo cuando se agrega el reactivo de Erlich.
Ensayo negativo: no hay aparicin de color.
V. Control de Calidad
Escherichia coli: SH2 -, indol +, movilidad +
Klebsiella pneumoniae: SH2 -, indol -, movilidad Proteus vulgaris: SH2 +, indol +, movilidad +
VI. Consideraciones
Un organismo que produce sulfuro de hidrgeno puede mostrar ennegrecimiento en SIM pero
no en TSI por la presencia de sacarosa en este ltimo medio. La utilizacin de la sacarosa
puede suprimir los mecanismos enzimticos responsables de la produccin del sulfuro de
hidrgeno.
Test de Utilizacin de Azcares
I. Principio
Es un ensayo para determinar la capacidad de un microorganismo de fermentar un hidrato de
carbono con produccin de cido o cido y gas. El patrn de utilizacin de azcares ayuda en
la diferenciacin e identificacin de muchas bacterias. En este ensayo, determinados azcares
se agregan a un medio basal estril. La produccin de cido se manifiesta por un cambio de
color del indicador. La eleccin del medio y del indicador depende del camino metablico del
organismo y de la claridad visual del cambio de pH.
II. Materiales
A. Medio base
Peptona
10.0 g
Extracto de carne
1.0 g
27
Cloruro de sodio
5.0 g
Azul de bromotimol
10.0 ml
Indicador de Andrade
5.0 ml
Agua destilada
1000 ml
Rehidratar los ingredientes con agua destilada, calentando suavemente si es necesario; ajustar
el pH a 7.1-7.2 (7.4). Autoclavar a 121C por 15 minutos y enfriar en bao de agua a 50C.
Fraccionar el medio base en alcuotas y agregar los azcares esterilizados por filtracin en
concentraciones de: 0.5% para dulcita y salicina y 1.0% para los otros azcares. Dispensar en
volumenes de 4-5 ml en tubos con tapa a rosca, estriles. El medio se guarda en heladera y es
estable por 3 meses.
Para la glucosa y glicerol, el medio base se dispensa en tubos con campanita de Durham antes
de autoclavar. La campanita se llenar con el medio y luego se agrega el azcar en forma
estril despus de enfriar a 50 C.
B. Indicador de Andrade
Disolver 0.5 gr de fucsina cida en 100 ml de agua destilada, agregar 15.0 ml de NaOH 1N
(4%); mezclar bien y dejar descansar a temperatura ambiente durante 24 horas, agitando
frecuentemente. El color rojo se debe transformar en un color castao. Si no se produce una
decoloracin suficiente agregar 1.0 ml de NaOH 1N (4%).
III. Procedimiento
1) Con un ansa estril tomar material de un cultivo en medio slido.
2) Sumergir el ansa en cada tubo de hidrato de carbono.
Para una batera de 8 a 10 azcares, es suficiente un nico inculo, no hay necesidad
de flamear el ansa entre tubo y tubo. La posibilidad de transportar el hidrato de
carbono de tubo a tubo es infinitesimal y no afectar los resultados. Para una batera
grande (15 a 20) de azcares, puede ser necesario emplear 2 a 3 inculos, flameando el
ansa antes de tomar nueva muestra.
3) Incubar a 37 C y examinar da por da por 4 a 5 das. Para algunos microorganismos
puede ser necesario una incubacin ms prolongada (7 das), registrando los resultados
da por da.
4) En laboratorios de referencia las lecturas se deben prolongar hasta 30 das.
28
IV. Resultados
Ensayo positivo: viraje del indicador al rojo-rosado por acidificacin del medio.
Ensayo negativo: no hay cambio de color.
Con distintos microorganismos que fermenten los azcares, como por ejemplo:
Escherichia coli: glucosa +
Klebsiella: lactosa +
Yersinia enterocolitica: sacarosa +
VI. Consideraciones
A. Inocular un medio basal sin azcar para cada microorganismo.
B. La campanita de Durham se usa en el tubo con glucosa.
C. Como cualquier indicio de gas, an una burbuja pequea, es evidencia de produccin
de gas, observar cuidadosamente la campanita antes de inocular.
D. La campanita de Durham se agrega nicamente al medio con glucosa porque si el
microorganismo produce gas con glucosa producir gas con los otros azcares. No
obstante, si se sabe que el microorganismo en estudio no fermenta glucosa, es
aconsejable agregar campanita a otros azcares, pero hay que tener en cuenta que todas
las Enterobacterias son fermentadoras de glucosa por definicin, entonces slo se pone
campanita al medio con glucosa.
Test de Decarboxilasa-Dehidrolasa
I. Principio
La descarboxilacin es un proceso en el cual las decarboxilasas atacan el extremo carboxilo de
los aminocidos, formando la correspondiente amina. Los tres aminocidos que se ensayan en
la identificacin de Enterobacterias son arginina, lisina y ornitina. La decarboxilacin de lisina
y ornitina da cadaverina y putrescina (diaminas), mientras que arginina da citrulina por accin
de una dihidrolasa. El test se debe acompaar con un tubo control que contiene el medio base
sin aminocido. Como la decarboxilacin es una reaccin anaerbica, se debe cubrir el medio
con una capa de aceite mineral estril. El proceso ocurre en dos etapas: por fermentacin de la
glucosa se produce una acidificacin del medio (pH < 6.0), apareciendo color amarillo. La
29
acidificacin es necesaria para que ocurra la decarboxilacin. Este ltimo proceso de lugar a la
formacin de las aminas que elevan el pH con el consiguiente viraje del indicador al color
violeta.
La prueba de la lisina ayuda en la diferenciacin de Edwardsiella (+), y Salmonella (+) de
Citrobacter (-); de Enterobacter aerogenes (+) de Enterobacter cloacae (-) y Enterobacter
agglomerans (-)
La prueba de ornitina ayuda a diferenciar Klebsiella (-), Proteus mirabilis (+) de Proteus
vulgaris (-); Morganella morganii (+) de Providencia rettgeri (-); Yersinia enterocolitica (+)
de Yersinia pestis y Yersinia pseutuberculosis (-).
II. Materiales
El medio basal ms utilizado es el medio de decarboxilasa de Moeller. El medio contiene
peptona 5.0 g, extracto de carne 5.0 g, glucosa 0.5 g, bromocresol prpura 0.01 g, rojo cresol
0.005 g piridoxal 0.005 g pero est disponible comercialmente. Las concentraciones de
aminocidos a usar son: 1% para la forma L y 2% para la forma DL. Fraccionar el medio base
en 4 porciones de 250 ml cada una. Agregar los aminocidos a 3 porciones del medio. El pH
de la fraccin que lleva ornitina se debe reajustar despus de agregar el aminocido y antes de
esterilizar. Fraccionar en volumenes de 3 a 4 ml en tubos con tapa a rosca y autoclavar a
121C por 10 minutos. El sustrato es estable por 3 meses. Rotular los tubos, indicando fecha
de preparacin y de expiracin y guardar en heladera.
Al aceite mineral se le agrega 1 ml de agua por cada 100 ml de vaselina, y se autoclava a
121C por 45 minutos.
III. Procedimiento
A. Tomar material con un ansa e inocular el tubo control y los tubos con los aminocidos.
B. Cubrir todos los tubos con una capa de vaselina estril.
C. Incubar a 37C
D. Efectuar las lecturas da por da hasta 4 das, registrando los resultados da por da.
IV. Resultados
Ensayo positivo: medio turbio y prpura a prpura amarillento.
30
Ensayo negativo: color amarillo

Tubo control: permanece con su color original o se vuelve amarillo si el organismo es un
fermentador de glucosa (se debe ver turbidez en el tubo).
Bacteria
Arginina
Lisina
Ornitina
Proteus vulgaris
Morganella morganii
Enterobacter cloacae
Enterobacter
S. Typhimurium
Klebsiella
aerogenes
VI. Consideraciones
A. Inocular siempre un tubo control.
B. Debe haber desarrollo para que el resultado sea vlido.
C. Si se observan capas de color amarillo y violeta, agitar suavemente el tubo antes de
interpretar la reaccin.
D. Comparar todos los tubos positivos con el tubo control. Un color grisceo puede
indicar reduccin del indicador ms que formacin de productos alcalinos. Se debe
agregar ms indicador antes de interpretar el resultado.
E. Si la reaccin es difcil de interpretar, comparar el tubo con un tubo sin inocular.
Luego de 24 horas cualquier traza de color prpura indica un resultado postivo.
F. Si se usa el medio de Moeller, se debe incubar por lo menos 18 horas ante de
interpretar los resultados.
G. Si no se agrega el aceite mineral, las reacciones se deben leer slo a las 24 horas.
H. Un pequeo precipitado floculento en la ornitina no interfiere con su uso.
31
Prueba del Malonato

I. Principio
El ensayo pone en evidencia la capacidad de las bacterias de utilizar malonato como fuente de
carbono. Las cantidades mnimas de glucosa del medio, permiten el desarrollo de organismos
que no pueden usar malonato o sales de amonio, sin embargo esos organismos no pueden
mantener un pH alcalino. La produccin de cido por la fermentacin de la glucosa impide
una posible alcalinizacin. Solamente los microorganismos que pueden usar simultneamente
malonato de sodio como fuente de carbono y sulfato de amonio como fuente de nitrgeno son
capaces de ejercer una accin buffer produciendo hidrxido de sodio. El aumento de la
alcalinidad resultante hace que el azul de bromotimol cambie
de verde a azul. Los
microorganismos malonato negativos que fermentan glucosa hacen que el indicador cambie
de verde a amarillo. La mayora de las especies de Enterobacter y Klebsiella utilizan malonato
de sodio. El ensayo tambin sirve para separar Salmonella arizonae (+) de otras especies de
Salmonella (-).
II. Materiales
El medio contiene: extracto de lavadura 1.0g, sulfato de amonio 2.0g, fosfato dipotsico 0.6g,
fosfato monopotsico 0.4g, ClNa 2.0g, malonato de sodio3.0g, glucosa 0.25g, azul de
brotimol (1g/500ml) 12.5g . Disolver en 1000 ml de agua destilada, dispensar 3 ml en tubos
con tapa a rosca y autoclavar a 121C por 15 minutos. Enfriar antes de usar; el sustrato es
estable por 2 a 3 meses. Rotular los tubos, indicando fecha de preparacin y de expiracin y
guardar en heladera. Si hay cambio de color en el medio no usar.
III. Procedimiento
A. Con ansa estril tomar material e inocular el medio.
B. Incubar a 37C por 24 a 48 horas.
C. Continuar incubando los tubos negativos hasta 4 das, registrando los resultados da
por da.
IV. Resultados
Ensayo positivo: reaccin alcalina (azul).
32
Ensayo negativo: no hay cambio de color (verde).

Ensayo negativo: reaccin cida, slo fermentacin de glucosa (amarillo).
Enterobacter aerogenes +
Escherichia coli VI. Consideraciones
A. Algunos organismos malonato (+) producen una ligera alcalinidad, que hace la
interpretacin difcil. Cuando hay duda comparar con un tubo sin inocular. Cualquier
vestigio de color azul denota una prueba positiva luego de una incubacin de 48 horas.
No se debe hacer una interpretacin final negativa hasta no haber incubado los tubos
durante 48 horas.
B. A veces es necesario agregar extracto de levadura y glucosa para estimular el
crecimiento de algunos organismos.
C. Algunas cepas malonato (-) dan color amarillo por la fermentacin de la glucosa
solamente. Esto produce una disminucin del pH y el viraje del indicador al amarillo.
Ensayo del Rojo de Metilo
I. Principio
El test se usa para determinar la presencia de iones hidrgeno cuando un microorganismo
fermenta glucosa. Todos los miembros de la familia Enterobacteriaceae convierten glucosa en
cido pirvico por el camino de Embden-Meyerhof. Los organismos que metabolizan cido
pirvico producen cido y bajan el pH a menos de 4.4. Los organismos que utilizan, en
cambio, el camino del butilenglicol producen acetona y butanodiol (diacetilo). El indicador
del medio, rojo de metilo, es rojo a pH < 5.0 y amarillo a pH > 5.8. El test es til para la
diferenciacin de Escherichia coli (rojo metilo positivo) de Klebsiella (rojo metilo negativo).
La mayora de las Enterobacteriaceae tienen uno u otro camino metablico, pero raramente
ambos.
II. Materiales
A. Preparacin del medio
33
El medio est disponible comercialmente. Disolver en agua destilada, dispensar 5 ml en tubos

con tapa a rosca y autoclavar a 121C por 15 minutos. El sustrato es estable por 2 a 3 meses.
Rotular los tubos, indicando fecha de preparacin y de expiracin. Guardar en heladera.
B. Preparacin del reactivo
Disolver 0.1 gr de rojo de metilo en 300 ml de etanol y diluir con 200 ml de agua destilada,
para alcanzar un volumen total de 500 ml. El reactivo es estable por 1 ao. Rotular indicando
fecha de preparacin y de expiracin. Guardar en heladera.
III. Procedimiento
A. Con un ansa estril tomar material e inocular un tubo con caldo RM/VP.
B. Incubar a 35 C por un mnimo de 48 horas.
C. Transferir 2.5 ml de la suspensin a un tubo.
D. Agregar 5 gotas del indicador y observar si hay cambio de color.
IV. Resultados
Ensayo positivo: el reactivo permanece rojo.
Ensayo negativo: el reactivo se torna amarillo-naranja.
Si el resultado es negativo continuar la incubacin de la bacteria por 24 horas ms.
Escherichia coli +
Enterobacter aerogenes VI. Consideraciones
A. Variaciones en la cantidad de peptona del medio puede afectar el resultado.
B. Aumentando la concentracin de glucosa en el medio no se acelera la reaccin del rojo
de metilo.
C. No sobreinocular, el crecimiento bacteriano se inhibe cuando el inculo es grande.
D. Una incubacin de 48 horas es suficiente para la mayora de los cultivos; pero el
ensayo no se debe realizar con cultivos que tengan menos de 48 horas de incubacin.
34
Ensayo de Voges-Proskauer
I. Principio
El piruvato es un intermediario en el metabolismo de la glucosa. A partir del cido pirvico un
microorganismo puede seguir varios caminos. Algunos lo rompen para formar como
productos finales cidos lctico, actico o frmico. Otros metabolizan el piruvato por el
camino del butilenglicol para formar como productos finales acetona (acetilmetilcarbinol) y
2,3-butanodiol (diacetilo). El ensayo de Voges-Proskauer (VP) detecta estos productos
metablicos. En presencia de oxgeno e KOH, la acetona se oxida a diacetilo, que da un
complejo rojo. La sensibilidad del ensayo se aumenta por el agregado de -naftol antes del
agregado de KOH.
II. Materiales
A.Preparacin del medio
El medio est disponible comercialmente. Para la preparacin del caldo RM/VP, ver el
procedimiento indicado para el test de rojo de metilo.
B. Preparacin de solucin de -naftol
Disolver 5.0 gr de - naftol en una pequea cantidad de alcohol absoluto y luego llevar el
volumen a 100 ml. La solucin debe ser incolora. El reactivo es estable por 1 ao. Rotular
indicando fecha de preparacin y de expiracin. Guardar en heladera en frascos color
caramelo.
C. Preparacin de la solucin de KOH
Disolver los pellets de KOH en agua destilada y luego llevar el volumen final a 100 ml
(trabajar sobre bao de agua fra para evitar recalentamiento). El reactivo es estable por 1 ao.
Rotular indicando fecha de preparacin y de expiracin.
III. Procedimiento
A. Con un ansa estril tomar material e inocular un tubo de caldo RM/VP.
B. Incubar a 37C por un mnimo de 48 horas.
C. Transferir 2.5 ml de la suspensin a otro tubo.
D. Agregar 0.6 ml del reactivo de -naftol.
35
E. Agregar 0.2 ml del reactivo de KOH.

F. Agitar el tubo y dejar descansar 10 a 15 minutos.
G. Observar la formacin de un color rosado a rojo.
IV. Resultados
Ensayo positivo: desarrollo de color rojo dentro de los 15 minutos.
Ensayo negativo: no hay desarrollo de color.
Klebsiella pneumoniae
Escherichia coli +
VI. Consideraciones
A. Cuando hay una incubacin prolongada (ms de 3 das) algunos organismos VP +
pueden producir un aumento de la acidez del medio, dando reacciones positivas
dbiles o falsas reacciones negativas.
B. La mayora de los miembros de la familia Enterobacteriaceae dan reacciones opuestas
entre el rojo de metilo y VP, sin embargo algunos organismos como Hafnia alvei
pueden dar ambas reacciones positivas.
C. Los reactivos se deben agregar en el orden indicado. Una inversin del orden puede
dar un resultado positivo dbil o un falso negativo.
D. No se debe agregar KOH en exceso, porque se puede enmascarar una reaccin positiva
dbil por la formacin de un color cobrizo por la reaccin del KOH con el -naftol.
No leer el ensayo despus de 1 hora; puede aparecer una coloracin cobriza dando un
resultado falso positivo.
Prueba de la Urea
I. Principio
La urea es una diamida del cido carbnico, cuya hidrlisis por accin de la ureasa da 2
molculas de amonaco. La ureasa es una enzima constitutiva que se sintetiza
independientemente de la presencia o no de la urea. La prueba determina la capacidad de la
bacteria de desdoblar la urea, con la consiguiente alcalinizacin del medio. Es una actividad
36
caracterstica de especies de Proteus y se usa para diferenciar Klebsiella (+) de Escherichia (-)
y Proteus (+ rpido) de Providencia (-); Yersinia pseudotuberculosis (+) de Yersinia pestis (-)
II. Materiales
El medio base est disponible comercialmente, es el medio base de urea de Christensen, que
contiene peptona 1.0 g, glucosa 1.0 g cloruro de sodio 5.0 g, fosfato monopotsico 5.0 g,
solucin de rojo fenol al 0.2% 6 ml. Se disuelve medio en agua destilada y esterilizar a 121C
por 15 minutos. Enfriar a 50C y agregar 5 ml de una solucin de urea al 40% por cada 100 ml
de medio. Mezclar y fraccionar en volumenes de 2.5 ml en tubos estriles. Guardar en
heladera.
La urea se pesa asepticamente, se disuelve en agua y se calienta a 70C por 20 minutos, se
guarda en frascos estriles con cloroformo (igual que para los azcares).
III. Procedimiento
A) Con un ansa estril se toma abundante material y se inocula por puncin
B) Se incuba a 37C y se efectan lecturas a las 2, 4, 6 y 18 horas. Los tubos negativos se
observan diariamente por 4 a 7 das para detectar reacciones tardas que dan ciertos
miembros de la familia, registrando los resultados da por da.
IV. Resultados
Ensayo positivo: aparicin de color rojo en el medio por una alcalinizacin del mismo.
Ensayo negativo: no hay cambio de color.
Enterobacter aerogenes
Escherichia coli
Proeus vulgaris +
37
Prueba del Indol

I. Principio
El indol es uno de los productos del metabolismo del aminocido triptofano. Con un medio
rico en triptofano, el indol se puede detectar por su habilidad para combinarse con ciertos
aldehidos para formar un compuesto coloreado. El ensayo constituye un mtodo rpido para
detectar organismos productores de indol. Como indicador de la presencia del aldehdo se usa
el reactivo de Erlich. Es especialmente til en la identificacin preliminar de Escherichia coli,
y para diferenciar Edwardsiella (+) de Salmonella (-).
II. Materiales
A. Caldo triptofano
Peptona
20.0 gr
Cloruro de sodio
5.0 gr
Agua destilada
1000 ml
A este caldo se le incorpora triptofano en una concentracin del 1%. El medio se esteriliza a
121C durante 15 minutos y luego se ajusta el pH a 7.5. Dejar enfriar antes de su empleo y
guardar a 4-10C para su conservacin.
B. Reactivo de Erlich
p-dimetilaminobenzaldehido
1.0 g
alcohol etlico, 95%
95.0 ml
cido clorhidrco, concentrado
20.0 ml
Se disuelve el aldehdo en el alcohol (puede requerir un calentamiento suave), luego se agrega

lentamente el cido. El reactivo de color amarillo es estable por un ao. Identificar el reactivo
con una etiqueta donde conste la fecha de preparacin y de expiracin. Guardar refrigerado en
botellas color caramelo.
III. Procedimiento
1) Con un ansa tomar material de una colonia aislada e inocular el caldo que contiene
triptofano.
2) Incubar a 37C por 18 a 24 horas.
38
3) Transferir 2 ml de la suspensin de caldo a un segundo tubo.

4) Agregar 5 gotas del reactivo de Erlich por la pared del tubo.
5) Agitar el tubo y observar un color rosado en la interfase entre el caldo y el reactivo.
6) Si el ensayo es negativo, el cultivo se debe reincubar otras 24 horas.
IV. Resultados
Ensayo positivo: desarrollo de un color rojo en la interfase del reactivo y el caldo, segundos
despus de agregar el reactivo.
Ensayo negativo: no hay cambio de color o hay un color amarillo en la interfase.
Cualquiera de los reactivos debe ser controlado con cultivos positivos y negativos conocidos,
antes de su empleo general. Como controles resultan convenientes cepas de fcil obtencin y
que su conservacin en cultivos madre no ofrezca problemas.
Escherichia coli +
Enterobacter aerogenes Klebsiella pneumoniae
VI. Consideraciones
1) El pH ptimo para la actividad de la triptofanasa es ligeramente alcalino (7.4-7.8). La
disminucin del pH provoca una reduccin en la produccin de indol y una reaccin
falsamente negativa o dbilmente positiva.
2) Los cultivos a los cuales se les efecta la prueba del indol deben ser incubados
aerobicamente. El descenso en la tensin de oxgeno disminuye la produccin de
indol.
3) No debe emplearse un medio de peptona que contenga glucosa porque la elevada
acidez producida por la fermentacin del azcar puede inhibir la actividad de la
triptofanasa. El agregado de triptofano estimula la produccin de indol, mientras que la
glucosa la inhibe.
39
2.2.2.-PROBLEMAS DEL DIAGNSTICO DIFERENCIAL
A) Salmonella Typhi y Salmonella Paratyphi A, pueden diferenciarse de otras Salmonella spp,

por las siguientes pruebas bioqumicas:
TABLA 6. Pruebas bioqumicas diferenciales entre Salmonella Typhi, Salmonella Paratyphi A y
Salmonella spp.
P. Bioqumicas
S. Typhi
S. Paratyphi A
Salmonella spp.
Trazas
Glucosa (gas)
Citrato Simmons
SH2 (TSI)
+ 90% ms de los resultados positivos; - 90% ms de los resultados negativos
B) Algunas cepas de Salmonella spp.
se pueden confundir con otras enterobacterias
productoras de SH2 como Proteus mirabilis y Citrobacter freundii que son comensales del
aparato digestivo del hombre y de los animales de sangre caliente, pero que no son
enteropatgenos.
TABLA 7. Caracteres bioqumicos diferenciales entre Salmonella subesp. enterica (I) Proteus
mirabilis y Citrobacter freundii
Pruebas bioqumicas
Salmonella enterica
subesp. enterica (I)
Citrobacter freundii
Proteus mirabilis
SH2 (TSI)
Urea (hidrlisis)
Fenilalanina deaminasa
Lactosa (fermentacin)
Dulcita (fermentacin)
ONPG
+ 90% ms de los resultados positivos; - 90% ms de los resultados negativos; d: diferentes reacciones
40
C) Las cepas de Citrobacter freundii suelen ser identificadas por error como S. enterica
subesp. arizonae (IIIa) (serovariedades monofsicas) y S.enterica subesp. diarizonae (IIIb)
(serovariedades difsicas), (ex-gnero Arizona), en razn de compartir caracteres bioqumicos
tales como: SH2 (TSI) +, ONPG + y un perfil de fermentacin de hidratos de carbono muy
parecido.
TABLA 8. Caracteres bioqumicos diferenciales entre Salmonella subesp. enterica IIIa y IIIb y
Pruebas bioqumicas
Salmonella subesp. enterica
IIIa y IIIb
- (con excepciones)
Glicerol (fermentacin)
Malonato (utilizacin)
+ (lenta)
Gelatina (hidrlisis)
D) Muy raramente Salmonella pueden confundirse con otras entrobacterias productoras de

SH2, como E. coli SH2 + o Edwardsiella tarda
TABLA 9. Caracteres bioqumicos diferenciales entre Salmonella enterica subesp. enterica (I),
Edwarsiella tarda y Esherichia coli SH2 +
P. Bioqumicas
S. enterica subesp.
enterica (I)
E. tarda
E. coli SH2 +
Indol
Citrato Simmons
-/+
Manita (fermentacin)
Dulcita (fermentacin)
+/-
Ramnosa (fermentacin)
Xilosa (fermentacin)
ONPG
41
E) Puede suceder que dos o ms serovares tengan la misma frmula antignica global, por lo
que su diferenciacin se hace en base a pruebas bioqumicas.
TABLA 10. Caracteres diferenciales de las serovariedades S.Cholerasuis, S. Typhisuis y S.
Paratyphi C.
Pruebas Bioqumicas
Cholerasuis
Paratyphi C
Typhisuis
Citrato deSimmons
+ o (+)
+o-
+o-
Arabinosa
Dulcita
Sorbita
+ o (+)
SH2
Tartrato de Jordan
+ 90% o ms de los resultados positivos; - 90% o ms de los resultados negativos; (+) reacciones
positivas despus de 3 o ms das.
2.3.- SEROTIPIFICACIN DE SALMONELLA spp.

La serotipificacin constituye un importante complemento de la identificacin bioqumica y
desde el punto de vista epidemiolgico permite determinar la prevalencia de una serovariedad
en distintas zonas geogrficas, como as tambin es de utilidad para el estudio de brotes y para
conocer la fuente de infeccin y las vas de transmisin.
El uso de reacciones antgeno anticuerpo para la serotipificacin de las bacterias se basa en
que los microorganismos presentan diferencias en su constitucin antignica, an entre grupos
de microorganismos relacionados. Los microorganismos expresan una gran variedad de
antgenos (Ags): componentes estructurales de la clula (pared, cpsula, fimbrias); productos
de excrecin (exotoxinas, enzimas extracelulares).
Qumicamente, los Ags pueden ser protenas, hidratos de carbono y complejos de polipptidos
y carbohidratos. Como son molculas complejas tienen ms de una subestructura que puede
servir como determinante antignico. Debido a esto en los sueros inmunes se encuentran
anticuerpos que reaccionan contra distintos determinantes antignicos de la misma molcula.
42
La base de la serotipificacin para todas las enterobacterias es similar: se pone en evidencia la

presencia de antgenos somticos, flagelares y capsulares.
La serotipificacin de cepas de Salmonella enterica involucra la identificacin de antgenos
somticos de superficie (LPS, antgenos O) y antgenos flagelares (protenas, antgenos H). La
mayora de las cepas de Salmonella expresan dos fases flagelares pero tambin se conocen
variantes afsicas, monofsicas y trifsicas.
La identificacin de las serovariedades surge como consecuencia de la combinacin
antignica de factores somticos O y flagelares H, con el agregado del antigeno capsular Vi
para unas pocas serovariedades y se presenta en el Esquema de Kauffmann-White (Popoff,
M.Y., 8 Ed, WHO Centre for Referente and Research on Salmonella, Instituto Pasteur, Pars,
Francia, 2001).
A) Antgenos somticos (Ags O)
Estn compuestos por complejos de fosfolpidos y polisacridos; su composicin es
aproximadamente: 60% polisacridos, 20-30% lpidos y 3,5-4% hexosamina.
Son cadenas laterales de polisacridos del lipopolisacrido de envoltura (LPS) que se
encuentra en todos los microorganismos gram-negativos.
La cadena de polisacridos del Ag O es un polmero de unidades repetidas de oligosacridos
(de 3 a 5 azcares) lineales o ramificados. La naturaleza de los grupos terminales y el orden en
que se encuentran las unidades repetidas de la cadena determina la especificidad antignica
somtica de la bacteria. Como esta estructura difiere ampliamente entre las distintas
serovariedades, hay diferencias en la especificidad antignica O.
Estos antgenos son termoestables y resistentes a cidos diluidos y alcohol.
La estructura somtica se denomina con la letra O seguida de nmeros arbigos separados por
comas, por ej. S. Typhimurium O:1,4,5,12; S. Enteritidis O:1,9,12
43
Los Ags O se pueden clasificar de la siguiente manera:

1) Factores mayores, que identifican el grupo antignico O; por ej., el factor O:4, el
factor O:9
2) Factores menores, que pueden ser:
a) Los que tienen poco o ningn valor discriminativo porque siempre estn asociados
a otro factor; por ej., O:12 que siempre est asociado con O:2, O:4 y O:9, como se presenta en
S. Paratyphi A O: 1,2,12; S. Typhimurium O: 1,4,5,12 y S. Enteritidis O: 1,9,12
b) Los que surgen como consecuencia de una modificacin qumica de los Ags
mayores; por ej., O:5 resulta de la acetilacin de la abecuosa presente en las unidades
repetidas del polisacrido responsable de la especificidad O:4,12; O:1 resulta de la insercin
de un residuo de glucosa en la galactosa de la cadena de polisacrido, como es el caso de la
serovariedad S. Typhimurium O:1,4,5,12
B) Antgenos Flagelares (Ags H)
El flagelo es una estructura compleja que consiste en un cuerpo basal, un segmento de unin
(hook) y un filamento. El cuerpo basal ancla el flagelo a la envoltura de la clula y el
hook une el cuerpo basal con el filamento. En la serotipificacin flagelar de Salmonella se
usa solamente la especificidad antignica del filamento.
El filamento esta constituido por flagelina, protena de alto peso molecular. En Salmonella se
han encontrado ms de 60 especificidades antignicas flagelares. Las diferencias antignicas
surgen debido a variaciones en la estructura primaria (contenido en aminocidos y orden de
ubicacin) de las distintas molculas de flagelina.
Estos antgenos son sensibles al calor.
Unas pocas serovariedades de Salmonella poseen una sola fase flagelar, esas cepas se llaman
monofsicas, por ej. Salmonella Enteritidis (9,12:g,m:-), Salmonella Typhi (9,12 [VI]:d:-);
pero la gran mayora de las serovariedades tienen dos fases flagelares o sea son cepas
difsicas; por ej., Salmonella
Typhimurium (1,4,5,12:i:1,2) y
Salmonella Hadar
(6,8:z10:e,n,x), que expresan la fase 1 (constituida en los ejemplos por los antgenos: i z10 ) y
la fase 2 ( por los antigenos: 1,2 y e,n,x respectivamente).
44
C) Antgeno Capsular (Ag Vi)

El antgeno capsular es un polisacrido, constituido por cido N-acetilglucosaminournico.
Entre los antgenos capsulares de las Enterobacterias, el Vi es el ms importante en el gnero
Salmonella. Se encuentra en slo tres serovariedades: S. Typhi, S. Paratyphi C y en algunas
cepas de S. Dublin.
Descripcin del Esquema de Kauffmann - White
Sobre la base de los componentes antignicos somticos O y flagelares H se ha establecido lo
que se denomina el Esquema de Kauffmann-White, que agrupa a todas las serovariedades
conocidas.
El esquema est conformado por cuatro columnas:
Primera columna: indica el nombre de la serovariedad, si la misma pertenece a
S. enterica subesp. enterica (I) las siglas S. II, S. IIIa, S. IIIb, S. IV, S. V, S. VI; indicando
que la serovariedad considerada pertenece a la subespecie II III a, etc.
Segunda columna: Antgenos somticos (O). Los nmeros indican el los factores del
antgeno O y se escriben, separados por una coma. Las serovariedades son agrupadas en
grupos somticos, cada uno de ellos caracterizado por un factor O mayor. As se determinan
los grupos A, B, C, etc. Por ej. el grupo O:2 (A) est integrado por S. Paratyphi A (1,2,12:a:-)
entre otras, el grupo O:4 (B) por S. Typhimurium (1,4,5,12:i:1,2); S. Agona (1,4,12:f,g,s:- );
S. Saintpaul (1,4,5,12:e,h:1,2), entre otras, etc.
El Esquema de Kauffmann-White presenta 67 grupos O, desde el grupo A hasta el Z y luego
contina con nmeros, desde el O:51 hasta el O:67
Tercera y cuarta columna: Antgenos flagelares (H). Se indican los factores de las fases 1 y
2, del antgeno H, respectivamente. Para la fase 1 los factores se denominan con letras
minsculas, seguidas algunas veces por un nmero que figura como subndice y para la fase 2
se emplean en general nmeros arbigos, aunque tambin se utilizan letras minsculas. Un
signo "negativo" indica que la fase considerada est ausente y por lo tanto la serovariedad es
monofsica.
45
Los smbolos para los factores somticos determinados por conversin fgica estn
subrayados (por ej. 1,2,12)
[ ] = los factores O o H entre corchetes, no subrayados, pueden estar presentes o
ausentes sin relacin con la conversin fgica. Por ej. factor [5] del grupo O:4 (B).
Cuando los factores H
estn entre corchetes significa que ellos se encuentran
excepcionalmente en cepas salvajes.

Ejemplos:
Salmonella Enteritidis
1, 9,12:g,m:El Ag O es 1, 9,12; el Ag H (fase 1) es g,m;

El Ag H (fase 2)es -; la fase 2 est ausente, por lo tanto
la serovariedad es monofsica.
Salmonella Typhimurium
1, 4,5,12:i:1,2
El Ag O es 1,4,5,12 ; el Ag H (fase 1) es i ; el Ag H (fase
2) es 1,2; las dos fases flagelares estn presentes, por lo
tanto la serovariedad es difsica.
Salmonella Hadar
6,8:z10:e,n,x
Salmonella Typhi
1, 9,12[Vi]:d:-
46
ESQUEMA DE KAUFFMANN-WHITE (*)
47
Estufa de cultivo a 37C
Heladera a 4C
Bao de agua a 50C
Ansas
Tubos de ensayo
Tubos de 13x100 mm con tapa a rosca
Tubos de Craigie
Cajas de Petri
Lminas de vidrio de 20x20 cm
Pipetas de 5 ml
Gradillas
Mecheros
Lmparas para leer aglutinaciones
Palillos de madera
Estras de agar tripticasa de soja (TSA)
Agar movilidad al 0,7% (para inversin de fase)
Agar movilidad al 0,5% (para Craigie)
Caldo flagelar
Medios
Reactivos y Soluciones
Antisueros diagnsticos O y H
Solucin salina al 2%
Solucin fisiolgica formolada al 1%
Cepas bacterianas
Cepas de Salmonella spp. en agar TSA, cultivos de 18 horas a 37C
Esquema de Kauffmann-White (Poppof, M.Y., 8 Ed, WHO Centre for Referente and
Research on Salmonella, Instituto Pasteur, Pars, Francia, 2001).
48
2.3.1- SEROTIPIFICACIN SOMTICA O

Procedimiento
Comentario
Dia 1 Serotipificacin somtica O

La determinacin del antgno O de
La deteccin de los antgenos somticos se
Salmonella spp. se hace en lmina a partir
realiza por aglutinacin en lmina. Los
de un cultivo en agar TSA, incubado a 37C
anticuerpos en el suero especfico aglutinan
por 18-24 horas
con
la
bacteria
correspondiente
cuando
est
el
antgeno
presente.
Es
importante que el aislamiento est en forma

lisa.
Verificar que el cultivo se encuentre en
La aglutinacin con solucin salina al
forma lisa:
2% debe dar negativa
- Mezclar una ansada de cultivo puro se

mezcla con una gota de solucin salina al
2%, cuiadosammente con un palillo. Rotar
suavemente la lmina, durante 2 minutos.
Observar la presencia o ausencia de grumos:
a) Si hay grumos la cepa est rugosa.
Para revertir la rugosidad se deben

realizar subcultivos de la cepa en agar
sangre o en agar Mueller Hinton, de manera
de recuperar la forma lisa y poder continuar
con la serotipificacin somtica O.
Si no es posible la reversin de la forma
rugosa a la lisa, se debe confirmar su
identificacin bioqumica y realizar la
seropitificacin flagelar H.
b) Si no presenta grumos se realiza la

serotipificacin somtica O
49
Enfrentar sobre una lmina de vidrio una
Estos polivalentes comprenden el 98%
ansada del cultivo en agar TSA, con una
de las serovariedades aisladas del hombre y
gota de los antisueros polivantes OS-A y
de los animales. Estos antisueros cumplen
OS-B. Mezclar cuidadosamente con un
la funcin de una primera seleccin en
palillo.
lmina,
grandes grupos. Si la aglutinacin no ocurre
durante 2 minutos, para favorecer la
con los polivalentes OS-A y OS-B puede
reaccin antgeno-anticuerpo y
ser:
Mover
suavemente
la
observar
presencia o ausencia de aglutinacin, con luz
a) Una serovariedad no comprendida
indirecta.
en dichos antisueros, en tal caso remitir

la cepa al Laboratorio de Referencia
b) Una serovariedad que presente
antgeno de envoltura Vi (S. Typhi, S.
Paratyphi C y algunas cepas de S.
Dublin). En este caso se debe enfrentar
el cultivo con el antisuero Vi
Si hay aglutinacin con alguno de los dos

antisueros polivalentes, probar los antisueros
de grupo O correspondientes.
Si hay aglutinacin con un antisuero de
grupo O, probar los antisueros de factores O
Lectura e interpretacin de resultados

Registrar el grado de aglutinacin de la
siguiente manera:
4+: 75 a 100% de microorganismos
aglutinados
3+:
75%
aproximadamente
de
50
microorganismos aglutinados
2+:
50%
aproximadamente
de
microorganismos aglutinados
1+: menos de 2% de microorganismos
aglutinados
Negativo: ausencia de aglutinacin. Se
observa una suspensin homognea.
Registrar los resultados tanto negativos
como positivos para los antgenos O
estudiados, en la Planilla 3 - Registro de
Resultados: Serotipificacin Somtica de
Cepas de Salmonella.
2.3.2- SEROTIPIFICACIN FLAGELAR H
Procedimiento
Comentario
Da 1 Serotipificacin flagelar H
Sembrar la cepa de Salmonella spp. en 5
La deteccin de los antgenos flagelares
ml de caldo flagelar e incubar a 37C,
H se realiza por aglutinacin en tubo o en
durante 18-24 horas.
placa dependiendo de las caractersticas de

los antisueros. En este protocolo se describe
la aglutinacin en tubo, ya que los
antisueros estn preparados por el productor
para realizar la aglutinacin en tubo.
Da 2
Separar del caldo flagelar una alcuota de
0.5 ml en un tubo estril de 13x100 con tapa
a rosca.
Agregar al caldo flagelar restante 5 ml de
solucin fisiolgica formolada al 1% (caldo
51
formolado) y dejar reposar durante 1 hora a

temperatura ambiente
Colocar en 4 tubos de ensayo una gota de
cada uno de los antisueros flagelares
polivalentes (HS-1, HS-A, HS-B y HS-C) y
agregar a cada tubo 0.5 ml del caldo
formolado.
Incubar 1 hora a 50C en bao de agua y
La
aglutinacin
flagelar
registrar la presencia o ausencia de flculos
apariencia flocular, menos compacta que la
con luz indirecta.
aglutinacin
somtica.
Su
tiene
una
estructura
tridimensional no es estable, por lo tanto no

se deben agitar los tubos luego de la
incubacin a fin de no disgregar los
flculos.
Si hay aglutinacin, con uno o dos de los
Si la cepa de Salmonella spp., de la cual
antisueros flagelares polivalentes, enfrentar
se ha identificado el antgeno O, no
el caldo formolado, con los antisueros de
reacciona con ninguno de los antisueros
fase H correspondientes (una gota del
flagelares polivalentes, hay que tener en
antisuero ms 0,5 ml del caldo formolado)
cuenta:
a)
La cepa puede presentar un
Si el antisuero de fase flagelar est
antgeno
compuesto por ms de un factor (por ej. 1,2),
antisueros polivalentes, en este caso
determinar los factores H correspondientes,
debe ser remitida al Laboratorio de
utilizando
Referencia,
los
antisueros
de
factores
no
incluido
para
en
completar
los
su
serotipificacin
especficos
b) Se puede tratar de una cepa

inmvil, por la ausencia de flagelos
c) Se puede tratar de una cepa con
movilidad reducida. En este caso se
debe
52
exaltar
la
movilidad
por
pasajes sucesivos en tubos Craigie o

en tubo en U con agar movilidad al
0.5%
Si el cultivo aglutina con un solo
antisuero polivalente flagelar, puede ser:
a)
Que
se
trate
de
una
serovariedad monofsica
b)
Que sea una serovariedad
difsica, de acuerdo al Esquema de

Kauffmann-White,
por
los
resultados de la aglutinacin O y
nicamente se expresa una sola fase
H, por lo tanto hay que poner en
evidencia la fase no detectada,
usando el Mtodo de inversin de
fase.
Mtodo de Inversin de Fase

Fundir 10 ml de agar movilidad al 0.7%,
Es un mtodo que permite poner en
dejar enfriar a 50C.
evidencia,
en
caso
de
serovariedades
difsicas, la fase que no se expres. Para

Mezclar en una caja de Petri dos gotas
ello
del
flagelar
establecida previamente con el antisuero
predeterminada con el agar movilidad al
correspondiente a esa fase flagelar. Se trata
0.7%, homogenizar con movimientos de
de
rotacin y dejar solidificar.
microorganismos que presentan la fase
antisuero
de
la
fase
se
un
inmoviliza
mtodo
de
la
fase
seleccin
flagelar
de
flagelar no expresada hasta ese momento.
53
los
Sembrar una ansada del cultivo sin

formolar en el centro de la superficie del
agar
Incubar a 37C, durante 18-24 horas.
Da 3
Tomar el desarrollo bacteriano de la
periferia de la placa y enfrentar con el
antisuero de la fase sospechada.
Lectura e interpretacin de resultados
Registrar el grado de aglutinacin de la
siguiente manera:
4+: 75 a 100% de microorganismos
aglutinados y el sobrenadante es un lquido
claro
3+:
75%
aproximadamente
microorganismos
aglutinados
de
el
sobrenadante es un lquido ligeramente

turbio
2+:
50%
aproximadamente
microorganismos
aglutinados
de
el
sobrenadante es un lquido moderamente

turbio
1+: menos de 2% de microorganismos
aglutinados y el sobrenadante es turbio
Negativo:
ausencia
de
aglutinacin,
caracterizada
por
una
suspensin
homognea.
54
Registrar los resultados tanto negativos

como positivos para los antgenos H
estudiados, en la Planilla 4 - Registro de
Resultados: Serotipificacin Flagelar de
Cepas de Salmonella spp.
Identificacin de la serovariedad
Combinando
los
antgenos
identificados se determina la serovaridad de

acuerdo con el Esquema de KauffmannWhite.
Ver Tubos de Craigie y en U (Figura 2)

Ver Flujograma de Serotipificacin (Figura 3)
FIGURA 2.- TUBOS DE CRAIGIE Y EN U
Tubo de Craigie
Siembra del inculo

Recoleccin del
desarrollo
Recoleccin del
desarrollo
Siembra del Inculo
Tubo en U
55
FIGURA 3.- FLUJOGRAMA DE SETROTIPIFICACIN DE SALMONELLA
Cepa con caractersticas bioqumicas de Salmonella
Serotipificacin somtica
(aglutinacin en lmina)
Estra en TSA
Serotipificacin flagelar
(aglutinacin en tubo)
Aglutinacin con solucin salina al 2%
Negativa
Positiva
Aglutinacin c/
antisueros poliv.
somticos (1)
Negativa (3)
Caldo flagelar
Aglutinacin c/ antisueros
poliv. flagelares H (4)
Cepa Rugosa (2)

Negativa (5)
Positiva
Aglutinacin c/
antisueros de fases H / factores H (6)
Positiva
de grupo O
Positiva
Positiva
de factores O
RESULTADO FINAL
Positiva
(1) Antisueros polivalentes somticos: OS-A y OS-B

(2) Para revertir una cepa de la forma rugosa a lisa, se realizan subcultivos en agar sangre o Mueller Hinton. Si
no es posible revertir la rugosidad, se debe confirmar la identificacin por pruebas bioqumicas y realizar la
serotipificacin flagelar H.
(3) Ver Consideraciones a tener en cuenta en "Serotipificacin somtica"
(4) Antisueros polivalentes flagelares: HS-1; HS-A; HS-B; HS-C
(5) Ver Consideraciones a tener en cuenta en "Serotipificacin flagelar.
(6) Si la serovariedad de Salmonella es difsica y slo expresa una fase, realizar "Mtodo de inversin de fases"
56
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10. Le Minor, L., Richard, C. (1993) Mthodes de laboratoire pour lidentificaction des Entrobacteries. Institut
Pasteur, Paris, France.
11. Mac Fadin, J.F. (1980). Pruebas bioqumicas para la identificacin de bacterias de importancia clnica. Ed.
Panamericana.
57
12. Manual de Laboratorio de Infecciones Entricas Agudas (1983). Organizacin Panamericana de la Salud.
Oficina Regional dela OMS. Ed. Espaola,.
13. Miller, S.I., Hohmann, E.L., Pegues, D.A. (1995). Salmonella (Including Salmonella Typhi) En Principles
and Practice of Infectious Diseases. Mandell, G.L., Douglas and Bennetts (ed.) 4th Edition. Chapter 200.
De. By Mandell, G.L. M.D.; Bennet,J.E. MD.; Dollin, R. M.D.
14. Peluffo, C. (1973). Salmonella: Mtodo simplificado de diagnstico serolgico. Oficina Sanitaria
Panamericana. Oficina Regional de la OMS.
15. Wray, C., Wray, A. (2000). Salmonella in domestic animals. CABI Publishing
16. Popoff M.Y., (2001). Antigenic formulas of the Salmonella serovars, 8th edition. World Health Organization,
Centre for Reference and Research on Salmonella. Institut Pasteur, Paris.
58
CAPTULO III PRECAUCIONES DE BIOSEGURIDAD

Los laboratorios de microbiologa son ambientes de trabajo que pueden presentar riesgos de adquirir
enfermedades infecciosas para las personas que trabajan en ellos. Los accidentes en el laboratorio
ocurren por ausencia de entrenamiento, desconocimiento, experiencia escasa, cansancio, trabajar muy
rpido, no seguir prcticas seguras y subestimar la peligrosidad del trabajo.
Frente a estas situaciones se introdujo el concepto de bioseguridad que es el conjunto de mtodos
tendientes a minimizar el riesgo asociado al manejo de microorganismos, mediante la proteccin de
los operadores, personas del entorno, productos y medio ambiente. Define las condiciones de
contencin provistas por el uso de equipos de seguridad.
Los microorganismos se han clasificado en grupos de riesgo en funcin de su patogenicidad, forma y
facilidad de transmisin, la dosis infecciosa, y la existencia de tratamiento.
Los microorganismos con los cuales se trabajar Salmonella, Shigella y otros miembros de la Familia
Enterobacteriaceae, pertenecen al Grupo de Riesgo II, donde el riesgo individual es moderado y el
riesgo comunitario limitado. Estos microorganismos pueden provocar enfermedades en humanos y
animales, pero con pocas probabilidades de riesgo grave para el personal de laboratorio, animales o
medio ambiente. La exposicin en el laboratorio puede provocar una infeccin pero se dispone de
medidas de tratamiento y de prevencin y el riesgo de propagacin es limitado.
1.- NIVEL DE LABORATORIO
El laboratorio donde se trabaja con estos microorganismos es de Nivel de Bioseguridad 2. En
este nivel el personal debe contar con una capacitacin especfica para el manejo de los
agentes patgenos y el director es un profesional competente. El acceso al laboratorio est
restringido cuando se estn desarrollando actividades y la puerta de entrada debe tener el
smbolo indicador. Se toman precauciones especiales cuando se manejan elementos cortopunzantes y se utilizan elementos de proteccin (ambos, delantales, guantes, mscaras
faciales) con los procedimientos que pueden representar un riesgo para el operador. Las
mesadas de trabajo tienen que ser impermeables al agua, resistentes al calor moderado y a los
productos qumicos empleados en la desinfeccin.
59
El laboratorio debe disponer de un lavatorio para el lavado de manos y de adecuados sistemas

de decontaminacin del material.
En los laboratorios est prohibido comer, beber, fumar, manipular lentes de contacto,
maquillarse.
2.- ELEMENTOS DE PROTECCION
a) Ambos, delantales o uniformes de laboratorio durante la permanencia en el mismo; esta
vestimenta no debe salir del laboratorio y el personal no puede llevarla a su casa para el
lavado.
b) Guantes cuando es posible que las manos entren en contacto con materiales infecciosos o
superficies contaminadas. Los guantes se descartan luego de su uso, no se lavan ni se reusan y
no se deben usar fuera del laboratorio.
c) Proteccin facial se requiere su uso cuando existe la posibilidad que algn procedimiento
genere gotas o aerosoles La proteccin facial esta dada por anteojos, mscaras faciales,
barbijos.
d) Gabinete de seguridad biolgica, cuando existe la posibilidad de generacin de gotas o
aerosoles. El gabinete que se utiliza es Clase II que protege al operador, los productos y el
medio ambiente.
El aire externo no entra directamente a la mesa de trabajo sino que
previamente pasa por un filtro HEPA para luego ingresar al rea de trabajo, y tambin sale al
ambiente a travs de otro filtro, (Fig. 1).
Es obligatorio que los gabinetes se evalen y certifiquen en el momento de la instalacin en el
laboratorio, cuando se trasladan y por lo menos una vez por ao a partir de ese momento.
FIGURA 1
60
Dentro del gabinete debe ingresar solamente el material indispensable para trabajar para
perturbar lo menos posible la circulacin del aire dentro del gabinete.
3.- INSTRUCCIONES PARA EL TRABAJO
1. Leer cuidadosamente todas las instrucciones antes de comenzar con los protocolos de
trabajo.
2. Considerar POTENCIALMENTE CONTAMINADO a todo material de vidrio,
plstico, pipetas, esptulas, que est en contacto con las suspensiones bacterianas.
3. Todo material contaminado potencialmente infeccioso se tratar en autoclave. No
efectuar ninguna limpieza del mismo en el laboratorio.
4. Descartar los residuos plsticos potencialmente infecciosos en recipientes resistentes a
la perforacin, que contienen hipoclorito de sodio al 1%. Estos NO SE DEBEN
LLENAR COMPLETAMENTE.
5. Descartar los materiales con cultivos microbianos en recipientes con bolsas plsticas
de color rojo, para su posterior eliminacin.
6. Descartar material de vidrio en recipientes de acero inoxidable con tapa de seguridad
para su posterior descontaminacin en autoclave.
7. Cada mesada debe tener propipetas, guantes, alcohol 70% y una solucin de
hipoclorito de sodio al 10%.
8. Notificar a las personas responsables del rea o instructores de trabajos prcticos
cuando se produzcan derrames, quienes tomarn las medidas adecuadas segn el caso.
9. Descartar el material de vidrio roto envolviendo los trozos en papel, colocarlo en bolsa
plstica y finalmente en un recipiente resistente y rotulado con claridad vidrios rotos.
4.- ACCIONES A REALIZAR EN CASO DE INCENDIO
1. Mantener la calma y avisar al resto de las personas.
2. Dar aviso al Departamento de Seguridad e Higiene.
3. Si el fuego es pequeo y sabe utilizar un extintor, selo. Si el fuego es de
consideracin no se arriesgue y evacue el laboratorio.
4. No corra, camine rpido, cerrando a su paso la mayor cantidad de puertas.
5. No lleve objetos ya que pueden entorpecer su salida.
61
6. Si pudo salir del laboratorio, por ninguna causa vuelva a entrar. Deje que los equipos
especializados se encarguen.
5.- CENTROS PARA REQUERIR AYUDA
Se deben tener disponibles los nmeros telefnicos correspondientes.
6.- TRANSPORTE DE MUESTRAS
El acondicionamiento seguro de muestras para diagnstico bacteriolgico es responsabilidad
de todos los involucrados en el proceso: el profesional, el responsable del laboratorio y el
personal de la empresa de transporte. El embalaje de los materiales infecciosos debe evitar la
fuga de los mismos por rotura o mal empaque del envo.
Los materiales para diagnstico se deben enviar en el sistema de triple envase de acuerdo a
las recomendaciones de la Organizacin Mundial de la Salud WHO/EMC/97.3. (Fig. 2)
El sistema consiste de:
a) Recipiente primario, a prueba de prdidas, con cierre hermtico (tubo pequeo o vial),
en el cual se coloca la muestra.
b) Recipiente secundario, resistente, a prueba de fugas, impermeable, donde se incluye el
recipiente primario.
c) Envoltorio externo, para proteger el envase secundario de influencias externas, como
dao fsico o agua.
El espacio entre los recipientes primario y secundario se debe llenar con material absorbente,
para retener el contenido del recipiente primario en caso que ocurra una prdida durante el
transporte.
Los formularios con datos de la muestra, notas y todo otro tipo de informacin que
identifiquen o describan a la muestra, al remitente y al destinatario, se deben colocar alrededor
del recipiente secundario.
62
FIGURA 2
REFERENCIAS
Laboratory Biosafety Manual, 3rd ed., World Health Organization Geneva, 2004 www.who.int
Biological Safety. Principles and Practices, 3rd ed. Fleming, D.O., Hunt, D.L. Ed.
Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories, 4th ed., Richmond J., McKinney Ed. CDC/NIH,
2001. www.cdc.gov.
Safety in Health-Care Laboratories. World Health Organization Geneva, 1997. www.who.int/.
63
CAPTULO IV - MEDIOS DE CULTIVOY SOLUCIONES

Descripcin y Preparacin
La mayora de los medios de cultivo se encuentran disponibles comercialmente
Caldo Selenito
Para el enriquecimiento selectivo de Salmonella en materia fecal, orina y tejidos infectados,
includa Salmonella Typhi, pero no sirve para Shigella.
El selenito inhibe el crecimiento de coliformes intestinales y enterococos, principalmente en
las primeras 6 a 12 horas de incubacin.
No son inhibidos Salmonella, Proteus, Pseudomonas.
Los componentes del medio son: peptona o triptona 5.0 g, lactosa 4.0 g, selenito de sodio 4.0
g, fosfato dipotsico (K2HPO4) 3.5 g, fosfato monopotsico (KH2PO4) 6.5 g. Disolver los
componentes en 1000 ml de agua destilada calentando hasta 60C si es necesario y esterilizar
por filtracin. NO AUTOCLAVAR
Si se observa un color rojo ladrillo de selenito precipitado, el medio no se debe utilizar.
El material slido se inocula directamente en el caldo, el material lquido se debe mezclar en
una relacin 1:1 con caldo a doble concentracin. Se incuba 24 horas a 37C. El pasaje a
medios selectivos se puede hacer al cabo de 6 a 12 horas.
Caldo Tetrationato
Es un caldo que se usa para el enriquecimiento selectivo de Salmonella, excepto para S.
Typhi, S. Pullorum y S. Gallinarum. El tetrationato junto con el tiosulfato inhibe los
coliformes, mientras que las bacterias reductoras de tetrationato como Salmonella y Proteus
pueden crecer sin dificultad. Las sales biliares inhiben a todos los micoorganismos intestinales
acompaantes y el verde brillante inhibe la flora gram positiva.
Solucin de verde brillante: se disuelve 0.1 g del colorante en 100 ml de agua destilada estril.
Solucin de iodo-ioduro de potasio: se disuelven en 16 g de yodo y 20 g de yoduro de potasio
en 80 ml de agua destilada estril.
64
Los componentes del medio son: extracto de carne 0.9g, peptona 4.5 g, extracto de levadura
1.8 g, cloruro de sodio 4.5 g, carbonato de calcio 25.0 g, tiosulfato de sodio 40.7 g, sales
biliares 4.75 g, solucin de verde brillante 1:1000 10 ml, solucin de iodo-ioduro de potasio
20 ml. Se disuelven los componentes 1000 ml de agua destilada estril con agitacin. Se
agrega en forma asptica la solucin de verde brillante y luego la solucin de iodo-ioduro de
potasio. Se ajusta el pH a 7.4-7.8 a 25C. El caldo se guarda en heladera. NO
AUTOCLAVAR. El caldo preparado y listo para usar debe ser utilizado el mismo da de su
preparacin.
Caldo Flagelar
Es un caldo que se usa para la determinacin de antgenos flagelares. Los componentes del
medio son: caldo tripticasa de soja 15.0 g, caldo triptosa 13.0 g. Disolver los componentes en
1000 ml de agua destilada con ebullicin hasta disolucin completa. Se fracciona en
volmenes de 5 ml en tubos de 16x150 con tapa a rosca y se autoclava a 121C por 15
minutos.
Solucin Salina
Se disuelve 8.5 g de cloruro de sodio en 1000 ml de agua destilada, ajustar a pH 7.0 y
autoclavar a 121C por 20 minutos.
Agar Movilidad (Swarm Agar)
Los componentes del medio son: extracto de levadura 1,0g, extracto de carne 5,0g, caldo
tripticasa de soja 30g, agar-agar de 5 a 10g dependiendo de la dureza deseada. Los
componentes se disuelven en 1000 ml de agua destilada calentando si es necesario. Se ajusta
el pH a 7.4 y se autoclava a 121C por 15 minutos.
Agar Nutritivo
Los componentes del medio son: extracto de carne 3.0 g, peptona 5.0 g, agar 12.0 a 18.0 g.
Disolver los componentes en 1000 ml de agua destilada con ebullicin si es necesario,
autoclavar a 121C por 20 minutos, ajustar el pH a 7.0 luego de esterilizar.
65
Agar Mueller-Hinton
El medio contiene: extracto de carne 2.0 g, hidrolizado cido de casena 17.5 g, almidn 1.5 g,
agar 17.0. Disolver los componentes en 1000 ml de agua destilada calentando si fuera
necesario, ajustar el pH a 7.2-7.4 y autoclavar a 110C por 20 minutos.
Agar EMB
Es un medio selectivo y diferencial para el aislamiento de bacterias patgenas intestinales
Gram (-). El contenido de lactosa y sacarosa hace posible la diferenciacin de Salmonella y
Shigella lac/sac (-), de la flora acompaante lac (-)/lac (+) (Proteus vulgaris, Citrobacter,
Aeromonas hydrophila). La combinacin de colorantes es la que permite diferenciar entre los
fermentadores y no fermentadores de lactosa. La sacarosa se incluye porque algunos
coliformes la fermentan ms rpido que a la lactosa.
El desarrollo de las bacterias Gram (+) est inhibido por los colorantes del medio (eosina
amarilla y azul de metileno).
Agar EMB Levine contiene solamente lactosa.
Los componentes del medio son: peptona 10.0 g, fosfato dipotsico (K2HPO4) 2.0 g, lactosa
5.0 g, sacarosa 5.0 g, eosina amarilla 0.4 g, azul de metileno 0.07 g. Disolver los componentes
en 1000 ml de agua destilada y autoclavar a 121C por 15 minutos.
Salmonella, Shigella
transparentes, mbar rosado
Escherichia
violceas con brillo metlico y centro negro azulado
Enterobacter, Klebsiella
ms grandes que las anteriores, mucosas sin brillo

metlico y centro oscuro.
Bacterias lac (+)
negras o centro oscuro, halo transparente
Bacterias lac (+) o sac (-)
incoloras
Agar MacConkey
Es un medio selectivo y diferencial para aislar microorganismos fermentadores y no
fermentadores de lactosa.
66
Sirve para aislar Salmonella, Shigella, y coliformes de materia fecal, orina, alimentos y aguas
residuales.
Es un medio de baja selectividad para usar con inculos pequeos.
Las sales biliares y el cristal violeta inhiben microorganismos Gram (+). La presencia de
lactosa permite el desarrollo de las cepas lac (+) que se manifiesta por el viraje del indicador
debido a la produccin de cido; luego se absorbe el rojo neutro dando color rojo a la colonia
y un halo turbio por la precipitacin de las sales biliares por la acidez del medio. Las bacterias
no fermentadoras de lactosa (S. Typhi, S. Paratyphi, Shigella dysentariae) no alteran el medio,
dando colonias incoloras y transparentes. Para detectar S. Typhi hay que usar medio
MacConkey con agar SS y agar bismuto sulfito.
Los componentes del medio son: peptona 1.7 g, proteosa-peptona 3.0 g, lactosa 10.0 g sales
biliares 1.5 g, rojo neutro 0.03 g, cristal violeta 0.001g, cloruro de sodio 5.0 g. Disolver los
componentes en 1000 ml de agua destilada, calentando si es necesario, ajustar a pH 7.1 y
esterilizar a 121C, durante 15 minutos.
Salmonella, Shigella
incoloras, medio amarillo
Escherichia
rojas, halo turbio
Enterobacter, Klebsiella
grandes, rosadas a rojo, mucosas
Proteus
Incoloras
Agar SS
Es un medio selectivo para Salmonella y Shigella a partir de materia fecal, alimentos y
animales; pero no es el ideal para Sh. dysenteriae y Sh. boydii. Sirve tambin para Y.
enterocolitica y para diferenciar fermentadores de lactosa de los no fermentadores. La
presencia de verde brillante, bilis de buey, alta concentracin de tiosulfato y el citrato inhiben
la flora acompaante. El tiosulfato y la sal de hierro ponen en evidencia la formacin de
sulfuro de hierro. La degradacin de la lactosa a cido provoca el viraje del indicador rojo
neutro a rojo.
67
Los componentes del medio son: extracto de carne 5.0 g, proteosa-peptona 5.0 g, lactosa 10.0
g, citrato de hierro amoniacal 1.0 g, tiosulfato de sodio 8.5 g, sales biliares 8.5 g, verde
brillante 0.003 g, rojo neutro 0.025 g, agar 13.5 g. Disolver los componentes en 1000 ml de
agua destilada calentando hasta disolucin de los mismos. NO AUTOCLAVAR
Salmonella
incoloras, transparentes, centro negro
Shigella
incoloras, transparentes, medio amarillo
Proteus
transparentes, centro rojo, medio amarillo
Escherichia coli
rosadas a rojo, medio rojo
Enterobacter aerogenes
rosadas a crema, opacas, mucosas
Bacterias lactosa+
rojizas, mucoides, centro negro
Agar Hektoen
Es un medio selectivo para bacterias intestinales, includas algunas shigellas. No tiene efecto
inhibidor sobre Salmonella y Shigella pero si sobre flora acompaante. Debido a los dos
indicadores (azul de bromotimol y fucsina), las colonias lac+ tienen una diferencia cromtica
con las colonias lac-; lo mismo ocurre con bacterias fermentadoras de sacarosa y salicina. El
tiosulfato con el hierro dan coloracin negra a las colonias sulfdrico+. Las sales biliares
inhiben a la flora acompaante. Puede agregarse novobiocina para inhibir Citrobacter y
Proteus.
Los componentes del medio son: peptona 15.0 g, extracto de levadura 3.0 g, sacarosa 14.0 g,
lactosa 14.0 g, salicina 2.0 g, tiosulfato de sodio 5.0 g, citrato de hierro amoniacal 1.5 g, sales
biliares 2.0 g, azul de bromotimol 0.05 g, fucsina cida 0.08 g, agar 13.5 g. Disolver los
componentes en 1000 ml de agua destilada estril. NO AUTOCLAVAR.
Shigella, Providencia verdes, planas, transparentes
Salmonella, Proteus
verde-azuladas, c/s centro negro
Pseudomonas
verde-azuladas, planas, borde irregular
Coliformes
salmn, halo de precipitacin
68
Agar Verde Brillante

Excelente medio de gran selectividad para el aislamiento de Salmonella a partir de materia
fecal; pero no puede usarse para aislar S. Typhi.
Los fermentadores de lactosa o sacarosa que pueden crecer en este medio se diferencian
rpidamente debido a la formacin de colonias verde-amarillentas, rodeadas de una zona de
igual color. Esto se debe a la fermentacin de los azcares que produce acidez, haciendo virar
el indicador (rojo fenol) a amarillo. En medio alcalino se observa un color rojo intenso.
El verde brillante inhibe microorganismos Gram (+), S. Typhi y Shigella. Para inhibir Proteus
se recomienda agregar 0,2% de desoxicolato de sodio. La selectividad del medio permite usar
inculos densos. Si se exceden los 15 minutos de esterilizacin a 121C, disminuye la
selectividad del medio.
Los componentes del medio son: proteosa-peptona 10.0 g, lactosa 10.0 g, sacarosa 10.0 g
extracto de levadura 3.0 g, rojo fenol 0.09 g, verde brillante 0.0047 g, agar 12.0 g. Disolver
los componentes en 1000 ml de agua destilada hasta ebullicin y mantener por 1 minuto;
ajustar a pH 6.7-7.1. NO AUTOCLAVAR
Salmonella a veces Proteus y Citrobacer rosa plido, transparentes
E. coli, Enterobacter
verde-amarillo
Klebsiella, Bacterias lactosa +
opacas, halo verde-amarillo
Agar XLD
Es un medio de selectividad moderada a alta que permite ser usado con Salmonella y Shigella.
La degradacin de xilosa, lactosa y sacarosa produce acidez que hace virar el indicador al
amarillo. El tiosulfato y la sal de hierro ponen en evidencia la produccin de sulfdrico. La
decarboxilacin de la lisina a cadaverina se visualiza por la presencia de un color rojo prpura
por aumento del pH. El desoxicolato inhibe Gram (+). La diferenciacin de
Salmonella/Shigella de otras enterobacterias se basa en tres reacciones: fermentacin de
xilosa, decarboxilacin de lisina y produccin de sulfdrico. La xilosa diferencia Shigella de
Providencia que no fermenta xilosa o lo hace muy lentamente; la lisina diferencia Salmonella
69
de los fermentadores de xilosa no patgenos. La lactosa y la sacarosa en exceso evitan que los
coliformes lis+ reviertan la condicin alcalina de los microorganismos consumidores rpidos
de xilosa/lisina. La produccin de sulfdrico ocurre en condiciones alcalinas dando colonias
con centro negro; en condiciones cidas la precipitacin negra se inhibe.
Los componentes del medio son: extracto de levadura 3.0 g, xilosa 3.75 g, lactosa 7.5 g,
sacarosa 7.5 g, l-lisina hidrocloruro 5.0 g, desoxicolato de sodio 1.0 g, tiosulfato de sodio 6.8
g, citrato de hierro amoniacal 0.8 g, rojo fenol 0.08 g,cloruro de sodio 5.0 g, agar 15.0 g.
Disolver los componentes en 1000 ml de agua destilada. Calentar hasta que comience a hervir
(no sobrecalentar); llevar a un bao de 50C siempre con agitacin. Ajustar el pH a 7.40.2 a
25C. Guardar a 4C por 14 das, en la oscuridad.
El precipitado que ocasionalmente presenta el medio no perjudica su rendimiento, puede
eliminarse por filtracin.
E. coli, Enterobacter
amarilla, opacas, con precipitado
Aeromonas
amarilla, opacas, con precipitado
Klebsiella
amarilla, opacas, mucosas, c/precipitado
Citrobacter
amarilla, opacas, centro negro
Serrati, Hafnia
amarilla, opacas
P. vulgaris, P. mirabilis
amarilla, translcidas, centro negro
Salmonella
igual color del medio, centro negro
Shigella, Providencia
igual color del medio, translcidas
S. Typhi
amarilla, ligeramente opacas
70
CAPITULO V - PLANILLA DE RESULTADOS
PLANILLA 1 REGISTRO DE RESULTADOS:

AISLAMIENTO DE SALMONELLA spp.
MORFOLOGIA EN PLACAS DE AGAR SELECTIVO
Fecha:
Nombre:
Muestra: ____________
Color
Resultados
Morfologa en MC
Morfologa en SS
Morfologa en XLD
De Selenito:
Morfologa en MC
Morfologa en SS
71
Comentarios
PLANILLA 2 REGISTRO DE REDULTADOS: AISLAMIENTO DE

SALMONELLA spp. PRUEBAS BIOQUIMICAS
Fecha:
Nombre:
Muestra:
Color
Resultados
TSI Botn
TSI Estra
TSI Gas
TSI H2S
LIA Botn
LIA Estra
LIA H2S
Hidrlisis de urea
Arnina dehidrolasa
Reaccin de-galactosidasa
Reaccin de Voges-Proskauer
Reaccin de indol
Agar SIM (H2S)
Agar SIM (Indol)
Agar SIM (Movilidad)
Utilizacin del Molonato
Resultado general: _______________________________________
72
Comentarios
PLANILLA 3 REGISTRO DE RESULTADOS: SEROTIPIFICACION SOMATICA

DE CEPAS DE SALMONELLA spp.
Fecha:
Nombre:
Muestra: ________________
OSA
OMB
OMC
OMD
OME
OMF
OSA
1,2,12
4,5,12
9,12
9,46
3,10
3,15
1,3,19
21
OSB
6,7,8
6,7
6,8
13,22
13,23
6,14,24
6,14
8,20
11
OSC
16
17
18
28
30
OSD
35
38
39
40
41
43
44
45
OSE
47
48
50
51
52
OSF
73
Control
42
PLANILLA 4 REGISTRO DE RESULTADOS: SEROTIPIFICACION FLAGELAR

DE CEPAS DE SALMONELLA spp.
Fecha:
Nombre:
Muestra: ______________
HSA
HSB
HSC
HS1
Control
HSA
z10
Z29
HSB
e,h
e,n,x
e,n,z15
f.g
g,m
g,p
m,t
HSC
l,v
l,w
z4,z23
HS1
1,2
1,5
1,6
1,7
z6
HSA
HSB
HSC
HSD
HS1
HSA
z10
z29
HSB
e,h
E,n,x
e,n,z15
f.g
g,m
g,p
m,t
HSC
l,v
l,w
z4,z23
HS1
1,2
1,5
1,6
1,7
z6
Control
74
PLANILLA 5 REGISTRO DE RESULTADOS: SEROTIPIFICACION DE CEPAS

DE SALMONELLA spp.
Fecha:
Nombre:
Muestra: ________________
Antgeno O
Antgeno H
A-67
A-I
Gr. A
Gr. B
Gr. C
Gr. D
Gr. A
O:1
O:2
O:12
Gr. B
O:1
O:4
Gr. C
O:6
Gr. D
Gr. E
O:5
O:12
O:27
O:7
O:8
O:14
O:20
O:1
O:9
O:12
O:46
Gr. E
O:1
O:10
O:15
O:19
H:H(a-z)
H:L
H:G
H: no especfico
H:L
H:lv
H:v
H:w
H:z13
H:z28
H:G
H:f
H:g
H:s
H:t
H:m
H:p
H: no especfico
H:2
H:5
H:6
H:7
H:z6
Gr. B
H:a
H:b
H:c
H:d
H:eh
H:i
Gr. C
H:a
H:b
H:c
H:eh
H:r
H:h
H:x
H:z15
H:z23
H:z24
H:z32
O:34
Frmula Antigncia: ___________________________ Serovariedad: _____________________
75
H:q
PLANILLA 6 REGISTRO DE RESULTADOS: SEROTIPIFICACION DE CEPAS

DE SALMONELLA spp.
Fecha:
Nombre:
Muestra: ________________
O:5
O:9
O:10
O:15
O:19
O:27
O:34
O:46
O:7
O:8
O:20
O:22
O:23
H:h
H:x
H:z15
H:m
H:p
H:s
H:t
H:f
H:v
H:w
H:z23
H:z24
H:z32
H:z13
H:z28
H:2
H:5
H:6
H:7
H:q
Frmula Antigncia: ___________________________ Serovariedad: _____________________
76
H:u

Manual Salmonella 2008

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Manual de Procedimientos

CAPTULO II- AISLAMIENTO Y CARACTERIZACIN DE SAMONELLA spp. 9

Flujograma de aislamiento e identificacin bioqumica de Salmonella spp

2.2.1.- Pruebas Bioqumicas

Agar Hierro Tres Azcares y Agar Kligler

Agar Lisina Hierro

Test de Utilizacin de Azcares

Prueba del Malonato

Ensayo del Rojo de Metilo

Prueba del Indol

2.2.2.- Problemas de Diagnstico Diferencial

2.3.-SEROTIPIFICACIN DE SALMONELLA spp.

Descripcin del Esquema de Kauffmann-White

2.3.1. SEROTIPIFICACION SOMTICA O

2.3.2. SEROTIPIFICACION FLAGELAR H

Flujograma para Serotipificacin de Salmonella spp.

CAPTULO III- PRECAUCIONES DE BIOSEGURIDAD

1.- NIVEL DE LABORATORIOS

3.- INSTRUCCIONES PARA EL TRABAJO.

4.- ACCIONES A REALIZAR EN CASO DE INCENDIO

5.- CENTROS PARA REQUERIR AYUDA

6.- TRANSPORTE DE MUESTRAS

CAPTULO IV- MEDIOS DE CULTIVO Y SOLUCIONES

Agar Movilidad (Swarm Agar)

Agar Verde Brillante

CAPTULO V- PLANILLAS DE RESULTADOS

Las serovariedades pertenecientes a las subespecies restantes y a Salmonella bongori, de baja

Son oxidasa negativo,

Aislamiento de Salmonella spp. de heces.

Identificacin bioqumica de Salmonella spp.

Serotipificacin de Salmonella spp.

CAPTULO II AISLAMIENTO Y CARACTERIZACIN DE SALMONELLA

Ansas descartables (10 l)

Placas de Petri descartables (9 cm dimetro) estriles

Agar hierro tres azcares (TSI)

Agar lisina hierro (LIA)

Estras de agar tripticas de soja (TSA)

Placas de agar Salmonella Shigella (SS)

Placas de agar MacConkey (MC)

Da 1 Cultivo primario en placas de agar

Para estas muestras se recomiendan dos

caldo nutritivo de manera de tener una

Cultivo directo en medios slidos,

Sembrar con ansa una muestra de la

aislamiento e identificacin de las colonias

suspensin de materia fecal, en placas de

Subcultivar el hisopo en un tubo de

Enriquecimiento en caldo selectivo,

caldo selenito, (Camino II - Enrequicimiento

se usa para favorecer el aislamiento de los

para la deteccin de Salmonella spp)

microorganismos cuando se encuentran en

microorganismos presentes en la materia

Salmonella spp., no es necesario continuar

Incubar las placas del Camino I y el

tubo (con el hisopo incluido) del Camino II,

En la placa de agar MC las colonias

caractersticas fenotpicas de las colonias

tpicas son lactosa negativas e incoloras, y

aisladas en las placas de agar MC y de agar

en las de agar SS: las colonias tpicas son

incoloras, translcidas con un centro negro

Anotar los resultados en la Planilla 1

debido a la produccin de SH2. (Ver Tabla