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UNIVERSIDAD AUTNOMA DE CHIAPAS

FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA

CAMPUS II

PROTOCOLO DE TESIS:

PARA LA OBTECION DEL TITULO COMO MEDICO VETERINARIO Y ZOOTECNIA

AISLAMIENTO E IDENTIFICACIN DE Salmonella spp EN TRES ESPECIES DE TORTUGA


MANTENIDAS EN EL ZOOLGICO REGIONAL MIGUEL LVAREZ DEL TORO, UBICADO
EN TUXTLA GUTIERREZ, CHIAPAS

PRESENTA

Samantha

DIRECTOR:

Dr. Gerardo Uriel Bautista Trujillo

Tuxtla Gutirrez, Chiapas. Abril 2016

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Introduccin.

Se tiene conocimiento de que los reptiles pueden ser portadores asintomticos de Salmonelosis
(Monsalve et al, 2009); las tortugas, iguanas y serpientes son algunos ejemplos de ellos.
Adems, la salmonelosis no slo representa un peligro potencial para la salud de los humanos,
sino que tambin pueden afectar a los reptiles que interactan entre ellos mismos. Se tiene
conocimiento de que los reptiles son reservorios de enterobacterias tales como Escherichia coli,
Klebsiella spp, Pseudomonas, Shigella spp y Salmonella spp (Monsalve et al 2009, Nelson et
al 2010, Velsquez 2010, Chitty & Raftery 2013). sta ltimo es de inters por su virulencia y
patogenicidad hacia los humanos y animales. La salmonelosis es una enfermedad producida
por microorganismos del gnero Salmonella, y es la zoonosis de mayor riesgo para las
personas que mantienen reptiles en cautiverio (Duque & Giraldo, 2008). Las fuentes de
infeccin de Salmonella spp., provienen frecuentemente de aguas contaminadas, alimentos,
medio ambiente y portadores asintomticos; reptiles principalmente (Parra M., Durango M.,
Mttar 2002, Nelson et al 2010).

En regiones tropicales especies de tortugas pueden contaminar cisternas de agua potable, las
tortugas no son extraas como juguete infantil y podran representar una amenaza en la salud
humana. A comienzos de la dcada de 1970, pequeas tortugas mascotas fueron una
importante fuente de infecciones por Salmonella en estados unidos. Desde 1986 la popularidad
de reptiles que pueden transmitir la infeccin a seres humanos ha dado lugar a un aumento de
la incidencia de infecciones por Salmonella causada por serotipos asociados a reptiles (Beer,
1981).

La presente tesis de licenciatura tiene como objetivo aislar e identificar especies de Salmonella
en tortuga blanda (Dermatemys mawii), tortuga de sienes rojas (Trachemys scripta elegans) y
tortuga mojina (Rhinoclemmys areolata) residentes del zoolgico regional Miguel lvarez del
Toro. Estas especies de tortuga son de un gran valor cultural, econmico y social, la tortuga
blanda (Dermatemys mawii) es la nica especie viva de la familia Dermatemidae y de acuerdo
a la SEMARNAT 2012 se encuentra en peligro de extincin, tambin es usada para consumo
humano por lo que es muy perseguida, la tortuga japonesa o de sienes rojas (Trachemys scripta
elegans) es comercializada como animal de compaa y se ha convertido en una especie
invasora. Adicionalmente, esta investigacin busca responder la pregunta de si las tortugas que

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se encuentran resguardadas por el rea de Anfibios y Reptiles del zoolgico son reservorios
de Salmonella spp, que podran representar una fuente de contagio para las personas, ya sea
visitantes o personal del zoolgico, as como con los animales con los que conviven.

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MORCO TEORICO

2.1 ENTEROBACTERIAS

La familia Enterobacteriaceae constituye un grupo grande y heterogneo de bacterias


gramnegativos. Reciben su nombre por la localizacin habitual como saprfitos en el tubo
digestivo, aunque se trata de grmenes ubicuos, encontrndose de forma universal en suelo,
agua y vegetacin, as como formando parte de la flora intestinal normal de muchos animales
adems del hombre (Puerta-Garca y Mateos-Rodrguez, 2010).

De acuerdo a una lista publicada permanente de la NCBI (2016) esta familia est compuesta
por alrededor de 80 gneros, siendo esta lista actualizada constantemente.

2.1.1 CARACTERSTICAS GENERALES

La famillia Enterobacteriaceae est formada por bacilos y cocobacilos gramnegativos


anaerobios facultativos, no formadores de esporas, fermentadores de glucosa, no presentan
actividad de citocromooxidasa (son oxidasa negativa), reducen nitratos a nitritos y las especies
mviles lo son mediante flagelos de distribucin pertrica (Merino y Lsch, 2008).

Poseen una estructura antignica compleja; se distinguen tres tipos de antgenos: Antgeno O
o somtico constituido por el lipopolisacrido (LPS) de la membrana externa; Antgenos K
(termolbiles) o capsulares (protenas o polisacridos) y Antgenos o protenas H (flagelares)
(UFMG, s.f.).

Poseen fimbrias que las ayudan a adherirse a superficies o mucosas. Los pili sexuales permiten
el intercambio de la informacin gentica entre las clulas, que incluye la resistencia a los
antibiticos. Tambin producen protenas denominadas bacteriocinas que causan la lisis de
especies estrechamente relacionadas y pueden colaborar para mantener el equilibrio ecolgico
de diversas bacterias en el intestino (Tortora, Funke y Case, 2007).

2.1.2 ESPECIES MS IMPORTANTES

Enterobacterias patgenas oportunistas: Aquellas especies que forman parte de la flora normal
del hombre y los animales, presentes en suelo, agua y plantas. Producen infeccin cuando
salen de su hbitat o hay alteraciones de las defensas locales. Incluye los gneros: Escherichia,

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Klebsiella, Serratia, Enterobacter, Citrobacter, Proteus, Morganella, Providencia, etc. (Merino y
Lsch, 2008).

Enterobacterias patgenas obligadas: No forman parte de la flora normal y su presencia en la


muestra es indicativa de infeccin. Incluye los gneros Escherichia, Shigella, Salmonella,
Yersinia. Se transmiten por va oral-fecal o a partir de aguas y alimentos contaminados.
Producen infecciones intestinales excepto Salmonella que puede producir sepsis, neumonas,
etc (Merino y Lsch, 2008).

2.2 ENTEROBACTERIAS EN REPTILES

Los reptiles poseen una flora intestinal abundante. Principalmente enterobacterias,


pseudomonaceas y streptococaceas. Las patologas gastroentricas son producidas por un
gran nmero de bacterias, entre ellas, las enterobacterias aisladas comnmente son: Klebsiella
spp., Proteus spp., Yersinia spp., Citrobacter sp. (Barragn y Karol, 2002).

La flora microbiana que poseen es muy diferente a la que se encuentran en animales


homeotermos, es as que microorganismos como Salmonella spp son considerados flora normal
del tracto gastrointestinal en muchas de estas especies. Los huevos muchas veces se
contaminan por su paso a travs de la cloaca. (Carriquiriborde, 2010)

Los reptiles en cautiverio son ms vulnerables a estar colonizados por microorganismos


zoonticos que los que se encuentran en estado salvaje. (Carriquiriborde, 2010)

En un estudio realizado con muestras orales y cloacales de anfibios y reptiles, se lograron aislar
bacterias gramnegativas tales Aeromonas sp., Plesiomonas sp., Vibrio sp., Citrobacter sp.,
Enterobacter sp., Escherichia sp., Klebsiella sp., Edwardsiella sp, Hafnia sp., Proteus sp.,
Providencia sp. Y Pseudomonas sp. Determinando que stos forman parte de la flora
microbiana en dichos organismos (Hacioglu y Tosunoglu, 2014).

La herpetofauna ha estado frecuentemente relacionada con casos de enfermedades asociadas


a salmonelosis, por lo cual se reconoce que estas especies son una va directa de transmisin
de Salmonella sp. a los seres humanos (Pachn, 2009)

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En los reptiles, Salmonella sp. es un microorganismo natural de la flora intestinal, sin embargo,
estos animales son catalogados como portadores asintomticos de la bacteria. (Pachn, 2009).

2.4 ENTEROBACTERIAS EN TORTUGAS

De acuerdo con Palacios (s.f.), plantea que algunas especies de bacterias que menciona la
literatura y conforman parte de la microbiota normal en reptiles son: Bacillus spp.,
Campylobacter spp., Citrobacter freundii, Enterobacter spp., Escherichia coli, Klebsiella spp.,
Hafnia alvei, Pseudomonas aeruginosa, Shigella spp. y Salmonella sp.

En un estudio realizado para la identificacin de enterobacterias en hisopos cloacales de


Trachemys scripta elegans, se demostr la presencia de Kluyvera ascorbata, Leclercia
adecarboxylata, Raoultella planticola, Citrobacter freundii, Proteus spp y Escherichia coli en la
mayora de los individuos, sin embargo no hubo crecimiento de Salmonella spp (Gioia-Di et.
Al., 2014).

Otro estudio realizado con Dermatemys mawii arroj en sus resultados bacteriolgicos la
presencia de microorganismos potencialmente patgenos en lesiones, incluyendo
Staphylococcus aureus, Candida spp, y enterobacterias como Escherichia coli, Proteus
vulgaris, Serratia spp. y Klebsiella spp. (Rangel-Mendoza, Snchez-Gonzlez, Lpez-Luna y
Weber, 2014).

2.4.1 ENTEROBACTERIAS POTENCIALES DE ENFERMEDADES.

Salmonella spp. es un gnero de bacterias gramnegativas capaces de causar enfermedades


en una amplia variedad de animales acuticos y terrestres, incluyendo seres humanos. Las
tortugas marinas y terrestres han sido reconocidas como portadoras de este patgeno
zoontico (Clayton, et. Al. 2013)

La presencia de Salmonella spp. en rganos internos de reptiles que muestran signos clnicos
est generalmente asociada con factores predisponentes, tales como estados de estrs, carga
parasitaria, traumas, tumores, enfermedades infecciosas (Pasmans et al., 2000).

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Los serovares de Salmonella enterica muestran una adaptacin a los reptiles pero conservando
su patogenicidad para animales de sangre caliente; sin embargo, tambin existen cepas
invasivas de Salmonella enterica subespecie Enterica que han sido aisladas de cocodrilos
(Pasmans et al., 2000; Corrente et al., 2004).

La incidencia de salmonelas en tortugas ha sido el tema de extensas investigaciones, ya que


son comnmente usados como mascotas (Strohl et al., 2004), y reportadas como responsables
de salmonelosis en humanos, sin embargo, no existen trabajos definitorios sobre el rol que
juegan los reptiles de vida libre as como en cautiverio en la transmisin de salmonelosis
(Hidalgo-Vila et al., 2007).

Dado que la bacteria se encuentra en el tracto digestivo de los animales, la ruta de infeccin
puede ser por contacto directo con las heces del animal o directamente con la piel contaminada
con el excremento. En los reptiles, la transmisin puede darse perinatalmente, por ingestin de
presas contaminadas o por contacto directo con la materia fecal de otros reptiles; las altas tasas
de ejemplares portadores de Salmonella spp. se relacionan con el comportamiento de
coprofagia por parte de las cras, lo que asegura la transmisin prematura de dichos
microorganismos. (Pachn, 2009)

2.4.2 RESPUESTA INMUNE

Las tortugas pueden considerarse animales resistentes en cuanto a la incidencia de


enfermedades, sin embargo, la mayora de las enfermedades se presentan en tortugas en
cautiverio, con respecto a otros reptiles. Las bacterias Gram-negativas se han relacionado como
los agentes etiolgicos de septicemia en tortugas acuticas de vida libre y en cautiverio,
adems, los animales infectados pueden convertirse en portadores al excretar de forma
intermitente los patgenos (Santoro, Orrego, & Gmez, 2006).

Estudios previos realizados en otros pases, indican que las tortugas que conviven como
mascotas con los humanos, pueden ser reservorios de Salmonella spp., bacteria que produce
cuadros clnicos severos en los humanos y en las tortugas inmunosuprimidas. (Duque, 2007)

Estos animales son reservorios naturales, y adems se ha reportado que algunos serotipos de
Salmonella spp. especficos de tortugas como S. Java, S. Urbana y S. Hartford y otros serotipos

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como S. Arizonae, S. Enteritidis y S. Typhimurium son potencialmente patgenos para animales
y humanos (Duque, 2007)

En los animales y humanos la inmunidad alude a la capacidad general de un husped de resistir


a una determinada infeccin o enfermedad producida por agentes patgenos y que adems
agrupa la actividad de varios rganos y tipos de clulas que interactan en diversas formas
para desencadenar la respuesta inmunolgica, que ejerce una respuesta a la presencia de
sustancias extraas (antgenos) y como resultado del estmulo se produce protenas especficas
que se llaman anticuerpos o inmunoglobulinas que constituyen la inmunidad 27 humoral y
clulas especficas llamadas clulas T activadas comprendidas en la inmunidad
celular(Carrascal et al., 2014).

La funcin de las clulas rojas de los reptiles es similar a los de los mamferos. Los halterfilos
de los reptiles componen entre el 30 y el 45% de los leucocitos en la sangre perifrica. Estudios
citoqumicos y ultra estructurales han demostrado que la funcin de estas clulas es similar a
la de los neutrfilos de los mamferos, que consiste principalmente en la fagocitosis de bacterias
y material extrao. Su aumento est asociado a procesos inflamatorios o infecciosos. (Carrascal
et al., 2014)

La morfologa celular de los reptiles es variable en tamao, lo cual muchas veces dificulta su
diferenciacin. Por ejemplo, los linfocitos ms pequeos en algunas tortugas pueden ser muy
similares morfolgicamente a los trombocitos. La morfologa de las clulas encontradas en este
estudio concuerda con las descritas por diferentes autores para reptiles y en especial para
quelonios. (Carrascal et al., 2014)

2.3.2 SALMONELLA SSP.

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Las salmonellas pertenecen a la familia de las enterobacterias, que estn formadas por
especies o tipos gram-negativas, no esporulados, casi todos con flagelos peritricos y algunos
inmviles. Las Salmonellas crecen en medios sencillos, reducen nitratos a nitritos, son oxidasa
negativa y fermentan los hidratos de carbono. (Beer, 1981)

Frecuentemente son portadores y excretores de Salmonella animales de sangre fra, como


tortugas, culebras y lagartos, afectando este hecho tambin a los animales en libertad. En
regiones tropicales especies de lagartos pueden contaminar cisternas de agua potable, las
tortugas no son extraas como juguete infantil. (Beer, 1981)

La salmonelosis ha sido asociada tambin con el contacto directo o indirecto con reptiles. A
comienzos de la dcada de 1970, pequeas tortugas mascotas fueron una importante fuente
de infecciones por Salmonella en estados unidos (Beer, 1981)

Desde 1986 la popularidad de las iguanas y de otros reptiles que pueden transmitir la infeccin
a seres humanos ha dado lugar a un aumento de la incidencia de infecciones por Salmonella
causada por serotipos asociados a reptiles. (Beer, 1981)

Adems, deben considerarse las condiciones que posibilitan un enriquecimiento de salmonellas


entre ellas se encuentras el almacenamiento de piensos bajo el influjo de la humedad en el
almacn o en el comedero, as como el mantenimiento de los animales en muy pequeo espacio
sin medidas higinicas adecuadas para eliminar constantemente heces y orina. (Beer, 1981)

2.3.2. PATOGENIA

Segn la concepcin tradicional, los grmenes tomados por va oral son muertos en el
estmago, liberndose en el intestino endotoxinas termolbiles y absorbindose por va linftica
y sangunea. Estas daan el organismo y permiten la multiplicacin en el intestino de los
grmenes supervivientes. Por ltimo, la pared intestinal, daada tambin se vuelve permeable
para las bacterias supervivientes. Junto con esto tambin parece posible la reaccin atreves
del anillo linftico farngeo. Casi siempre se producen manifestaciones de los distintos rganos
con alteraciones patolgicas tras la diseminacin por el organismo. (Joachim Beer, 1981)

2.3.3. DIAGNOSTICO

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2.3.3.1. AGAR TETRATIONATO

Medio de cultivo utilizado para el enriquecimiento selectivo de Salmonella spp., a partir de


heces, alimentos y otros materiales de importancia sanitaria. (MacFaddin, 1985)

El medio de cultivo contiene peptona que provee los nutrientes necesarios para el desarrollo
bacteriano, y carbonato de calcio que neutraliza y adsorbe metabolitos txicos. La selectividad
est dada por la presencia de sales biliares y tetrationato (compuesto generado en el medio de
cultivo al reaccionar el tiosulfato de sodio con la solucin iodo-iodurada) que inhiben el
desarrollo de microorganismos Gram positivos y algunas enterobacterias. Salmonella spp.,
contiene la enzima tetrationato reductasa y puede crecer satisfactoriamente en el medio de
cultivo debido a que no la afecta la toxicidad del tetrationato. Para evitar la proliferacin de
especies de Proteus spp., se recomienda agregar 40 mg/l de Novobiocina previo al agregado
de la solucin iodo iodurada. (MacFaddin, 1985)

2.3.3.2 AGAR SALMONELLA SHIGELLA

El agar Salmonella-Shigella es una modificacin del agar citrato desoxicolato descrito por
Leifson. Se le considera un medio moderadamente selectivo segn el nivel de inhibicin de los
microorganismos Gram positivos y Enterobacteriaceae diferentes de Salmonella y Shigella, que
inhibe por contenido de sales biliares, verde brillante y citratos.

En Salmonella Shigella Agar, la diferenciacin de los organismos entricos se logra mediante


la incorporacin de lactosa en el medio. Los organismos que fermentan lactosa producen cido
que, en presencia del indicador rojo neutro, propicia la formacin de colonias de color rojo. Los
organismos no fermentadores de lactosa forman colonias incoloras. Este ltimo grupo incluye
la mayora de los patgenos intestinales, incluidos Salmonella y Shigella. El tiosulfato sdico y
el citrato frrico permiten la deteccin de produccin de cido sulfhdrico, como lo demuestran
las colonias con centros de color negro. Este medio se utiliza para el aislamiento primario de
Salmonella a partir de muestras fecales. (Leifson, 1998)

2.3.3.3 PROCEDIMIENTO DE ANLISIS

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Extender las muestras tan pronto como sea posible despus de recibirlas en el laboratorio. La
placa de extensin se utiliza principalmente para aislar los cultivos puros de las muestras con
flora mixta. Si, por el contrario, el material se cultiva directamente empleando una torunda,
hacerla girar en una seccin pequea cercana al borde, extendiendo luego a partir de esta rea
inoculada. Incubar las placas, protegidas de la luz, a una temperatura de 35 2 C durante un
perodo de 18 a 24 h o durante ms tiempo si es necesario. (MacFaddin, 1985)

2.3.4 AGAR TSI

Medio universalmente empleado para la diferenciacin de enterobacterias, en base a la


fermentacin de los hidratos de carbono glucosa, lactosa y sacarosa y a la produccin de cido
sulfhdrico. (Ewing, 1985)

En el medio de cultivo, el extracto de carne y la pluripeptona, aportan los nutrientes adecuados


para el desarrollo bacteriano. La lactosa, sacarosa y glucosa son los hidratos de carbono
fermentables. El tiosulfato de sodio es el sustrato necesario para la produccin de cido
sulfhdrico, el sulfato de hierro y amonio, es la fuente de iones Fe3+ , los cuales se combinan
con el cido sulfh- drico y producen sulfuro de hierro, de color negro. El rojo de fenol es el
indicador de pH, y el cloruro de sodio mantiene el balance osmtico. El agar es el agente
solidificante. Por fermentacin de azcares, se producen cidos, que se detectan por medio del
indicador rojo de fenol, el cual vira al color amarillo en medio cido. El tiosulfato de sodio se
reduce a sulfuro de hidr- geno que reacciona luego con una sal de hierro proporcionando el
tpico sulfuro de hierro de color negro. (Ewing, 1985)

2.3.4.2 SIEMBRA

A partir de un cultivo puro del microorganismo en estudio, con aguja de inoculacin inocular el
medio de cultivo, picando el fondo y extendiendo sobre la superficie del mismo. (Ewing, 1985)

2.3.4.3 INCUBACIN

En aerobiosis, a 35-37C durante 18 a 24 horas. (Ewing, 1985)

2.3.4.4 INTERPRETACIN DE LOS RESULTADOS

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Observar el color del medio de cultivo y la produccin de gas.

1- Superficie alcalina/profundidad cida (pico rojo/fondo amarillo): el microorganismo


solamente fermenta la glucosa.

2- Superficie cida/Profundidad cida (pico amarillo/fondo amarillo): el microorganismo


fermenta glucosa, lactosa y/o sacarosa.

3- Superficie alcalina/Profundidad alcalina (pico rojo/fondo rojo): el microorganismo es no


fermentador de azcares.

4- La presencia de burbujas o la ruptura del medio de cultivo indican que el microorganismo


produce gas (Ewing, 1985)

2.3.5 AGAR SIMMONS CITRATO

Medio utilizado para la diferenciacin de enterobacterias en base a la capacidad de usar citrato


como nica fuente de carbono y energa. (Murray, 1999)

En el medio de cultivo, el fosfato monoamnico es la nica fuente de nitrgeno y el citrato de


sodio es la nica fuente de carbono. Ambos componentes son necesarios para el desarrollo
bacteriano. Las sales de fosfato forman un sistema buffer, el magnesio es cofactor enzimtico.
El cloruro de sodio mantiene el balance osm- tico, el azul de bromotimol es el indicador de pH,
que vira al color azul en medio alcalino y el agar es el agente solidificante. El medio de cultivo
es diferencial en base a que los microorganismos capaces de utilizar citrato como nica fuente
de carbono usan sales de amonio como nica fuente de nitrgeno, con la consiguiente
produccin de alcalinidad. El metabolismo del citrato se realiza, en aquellas bacterias
poseedoras de citrato permeasa, a travs del ciclo del cido tricarboxlico. El desdoblamiento
del citrato genera progresivamente, oxalacetato y piruvato. Este ltimo, en presencia de un
medio alcalino, da origen a cidos orgnicos que al ser utilizados como fuente de carbono,
producen carbonatos y bicarbonatos alcalinos. El medio entonces vira al azul y esto es
indicativo de la produccin de citrato permeasa. (Murray, 1999)

2.3.5.1 SIEMBRA

Estriar la superficie del medio de cultivo. (Murray, 1999)

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2.3.5.2 INCUBACIN

En aerobios, a 35-37C durante 24-72 horas. Algunos microorganismos pueden requerir hasta
7 das de incubacin. (Murray, 1999)

2.3.5.3 INTERPRETACIN DE LOS RESULTADOS

- Positivo: crecimiento bacteriano con un intenso color azul en el pico de flauta.

- Negativo: ausencia de crecimiento y permanencia del color verde del medio de cultivo.
(Murray, 1999)

2.3.6 CALDO UREA

Caldo urea est recomendado para la diferenciacin de Enterobacterias, particularmente


Proteus de Salmonella y Shigella, a partir de muestras clnicas (Nicolet, 1986)

El medio de cultivo, la triptena y la glucosa, aportan los nutrientes para el desarrollo de


microorganismos. El cloruro de sodio mantiene el balance osmtico, y el rojo de fenol es el
indicador de pH.

Algunas bacterias hidrolizan la urea por medio de la enzima ureasa liberando amonaco y
dixido de carbono. Estos productos alcalinizan el medio haciendo virar el rojo de fenol del
amarillo al rojo. En este medio, la fermentacin de la glucosa activa la enzima ureasa,
acelerando la velocidad del metabolismo en aquellos organismos que hidrolizan lentamente la
urea, como especies de Enterobacter o Klebsiella (Nicolet, 1986)

2.3.6.1 SIEMBRA

A partir de un cultivo puro de 18-24 horas, estriar la superficie del pico de flauta. Algunos
microorganismos pueden requerir mayor tiempo de incubacin.

Se recomienda no punzar la capa profunda para controlar el color (Nicolet, 1986)

2.3.6.2 INCUBACIN

En aerobios, durante 24-48 horas a 35-37 C (Nicolet, 1986)

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2.3 TORTUGAS

Las tortugas (Testudines y Chelonios) forman un orden de reptiles caracterizados por tener
un tronco ancho y corto, con un caparazn o envoltura que protege los rganos internos de
su cuerpo. Como otros reptiles, son ectotermos que varan su temperatura interna en
funcin del entorno ambiental. Al igual que otros amniotas respiran aire y no ponen huevos bajo
el agua, aunque muchas especies viven en o cerca del agua (Velsquez-Reyes, 2010).

2.3.1 TORTUGA BLANCA O BLANDA (Dermatemys mawii)

Clase: Reptilia; Orden: Testudines; Familia: Dermatemidae; Gnero: Dermatemys; Especie: D.


mawii

La tortuga blanca (Dermatemys mawii) es la especie dulceacucola ms grande que habita en


las regiones tropicales de Mxico. (lvarez del Toro, 1982)

Debido a su historia evolutiva, es el nico representante de la familia Dermatemidae que


sobrevive en nuestros das. (Guichard, 2006, Urea 2007)

Actualmente, las poblaciones de tortuga blanca son tan bajas en Mxico que la recuperacin
quiz no sea posible en la mayor parte de su rea de distribucin. Las nicas poblaciones
viables de D. mawii existen actualmente en reas prcticamente inaccesibles para la mayora
de las personas (SEMARNAT, 2012).

Desafortunadamente esta tortuga se encuentra ahora en peligro de extincin, situacin similar


a otras especies de tortugas dulceacucolas, debido a su captura excesiva, prdida de su
hbitat, por lo tanto sitios con las caractersticas adecuadas para reproducirse y su maduracin
sexual tarda, la hacen totalmente vulnerable (Guichard, 2006, Urea, 2007 y Zenteno y
Hernndez, 2006).

Descripcin: Dermatemys mawii llega a medir 65 cm y 22 Kg de peso. Posee un caparazn


muy ancho y aplanado de color gris claro a gris olivo. El plastrn es rgido, su color puede ir de
crema a amarillo claro. Los machos adultos tienen en la parte superior de la cabeza una
coloracin amarilla, mientras que en las hembras es griscea con tonalidades pardas
lateralmente (SEMARNAT, 2012).

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Hbitat: En Mxico se distribuye en los estados de Veracruz, Tabasco, Campeche, norte de
Oaxaca, norte de Chiapas y sur de Quintana Roo. Habita en ros, lagos y lagunas permanentes
con abundantes plantas acuticas emergentes, alrededor y dentro de las cuencas hidrolgicas
del Papaloapan, Coatzacoalcos, Grijalva - Usumacinta; as como en selvas inundables en la
poca de lluvias. (Urea-Aranda, 2007)

Alimentacin: La tortuga blanca es de hbitos exclusivamente herbvoros, aunque tambin se


ha reportado que incluye en su dieta algunos insectos (Guichard, 2006).

Reproduccin: De acuerdo con lvarez del Toro (1982), anidan dos veces en el ao (abril y
diciembre en Chiapas, Mxico) y segn Urea-Aranda (2007) la cpula se realiza cuando la
hembra permite la monta y permanece con poco movimiento y dura de 120 a 240 minutos
aproximadamente.

Acorde a la SERMARNAT (2012), Dermatemys mawii est legalmente protegida por diversas
leyes y acuerdos internacionales y est listada en la categora de en Peligro de Extincin (P) en
la NOM-059-SEMARNAT-2010.

2.3.2 TORTUGA MOJINA (Rhinoclemmys areolata)

Orden: Testudines; Familia: Geoemydidae; Gnero: Rhinoclemmys; Especie: R. areolata

Rhinoclemmys areolata es una tortuga de tamao medio con un alto caparazn de color marrn
oscuro con puntos de sutura y puntos amarillos moteados, llega a 207 mm de longitud de
caparazn. Su cabeza es estrecha, con un hocico ligeramente puntada y el maxilar superior
con muescas. La cabeza y el cuello son de color verde o marrn claro con un patrn muy
variable de rayas rojas y amarillas. (Vogt et al, 2009)

Son tortugas semiacuticas de actividad diurna y crepuscular. Su dieta es omnvora, constituida


por vegetales y pequeos invertebrados. Su reproduccin es ovpara y depositan de uno a tres
huevos que eclosionan entre los dos o tres meses despus de la postura, principalmente
durante la poca de lluvias. (ZOOMAT, 2014)

Habita en pampas y sabanas, preferentemente en zonas inundables de la costa del Golfo de


Mxico con selvas subhmedas o de vegetacin primaria. (ZOOMAT, 2014)

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Esta especie est considerada por la Norma Oficial Mexicana en la categora de Proteccin
Especial, lo que determina la necesidad de promover su recuperacin y conservacin.
(ZOOMAT, 2014)

2.3.3 TORTUGA DE SIENES ROJAS O JAPONESA (Trachemys scripta elegans)

Orden: Testudines; Familia: Emydidae; Gnero: Trachemys; Especie: T. scripta; Subespecie:


elegans

Tortuga de tamao medio a grande (20-60 cm) de agua dulce, caracterizada por el rojo
prominente de manchas en cada lado de la cabeza. Trachemys scripta elegans es la
subespecie de mayor comercializacin. Cuando son juveniles su dieta es altamente y se vuelve
omnvora cuando adultos (Scalera, 2006).

De acuerdo a la CONABIO, se estima que la especie presenta una distribucin amplia en


Mxico, principalmente en las vertientes del Golfo y el Pacfico.

El rea de distribucin natural de la tortuga de orejas rojas es en el valle del Mississippi (Burger
2009).

La principal amenaza que tiene esta especie es la sobre explotacin que est haciendo el
hombre, ya que no solamente aprovecha los individuos adultos sino que tambin trafica con las
cras de esta especie y extrae sus huevos o destruye sus nidos. (CONABIO, 2002)

MATERIAL Y METODOS.

Poblacin muestral

La investigacin se llevar a cabo usando iguanas verdes mantenidas en unidades de manejo


para la conservacin de la vida silvestre (UMAs) en el estado de Chiapas, Mxico. El muestreo
ser entre mayo y septiembre del 2016, bajo condiciones climatolgicas promedio de la regin
que comprende un rgimen de lluvias con una precipitacin media anual de 3500 mm,
temperatura promedio de 24C y humedad relativa de 77 %.

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Se realizar un muestreo al azar en una poblacin de 5132 iguanas distribuidas en 105
criaderos juveniles y 86 criaderos de adultos. Las muestras recolectadas sern: heces fecales
cloacales.

Toma de muestras

Las heces cloacales sern recolectadas por hisopado cloacal, para ello se introducir a travs
de la cloaca un hisopo estril haciendo movimientos de rotacin contra las paredes cloacales
garantizando suficiente muestra, todos los procedimientos de muestreo sern de acuerdo a la
gua Americam Society of Icthyologists and Herpetologists (HACC, 2014), que garantiza las
buenas practicas durante el muestreo de reptiles. Los hisopos sern transportados en caldo
tetrationato (compuesto generado en el medio de cultivo al reaccionar el tiosulfato de sodio con
la solucin iodo-iodurada).

Aislamiento e Identificacin bacteriana

Se inocular una alcuota de la muestra (100 l) en agar Salmonella-Shigella (BD-BBL), La


muestra ser dispersada en el agar usando un hisopo estril con la finalidad de homogeneizar
la carga de la muestra. Los medios de cultivo sern incubados aerbicamente a 37 C durante
18 h a 24 h. Los criterios de identificacin en Agar SS sern de acuerdo a las indicaciones del
fabricante: Shigella y la mayor parte de las Salmonellas presentan colonias claras, incoloras y
transparentes. Las colonias de Escherichia coli por lo general son pequeas que van del rosa
al rojo. Enterobacter y Klebsiella son colonias de mayor tamao (2 mm a -4 mm), mucosas,
opacas de crema plido hasta rosa. Proteus y algunas Salmonellas son colonias Incoloras,
transparentes; con un centro negro si producen H2S.

Todas las colonias sern subcultivadas en agar de infusin cerebro y corazn (BHI, BD-BBL)
para garantizar su pureza, se observar su morfologa microscpica usando la tincin de Gram,
posteriormente se proceder inocularlas en una serie de pruebas bioqumicas especficas para
la identificacin de enterobacterias. Las pruebas usadas sern Agar sangre, Agar de Hierro y
Triple Azcar (TSI, BD-BBL), Indol, Caldo Urea, Voges-Proskauer, Agar citrato de Simmons
(BD-BBL), Agar de Hierro y lisina (LIA).

Identificacin molecular

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Para la obtencin de ADN genmico las colonias puras sern inoculadas en caldo BHI e
incubadas a 37 C durante 24 h. La suspensin bacteriana se centrifugar a 13 000 rpm durante
1 min y se recolectar la biomasa bacteriana. Se proceder a preparar una suspensin
bacteriana con 100 l de buffer TEN (30 mM TRIS-HCl pH 8; 5 mM EDTA pH 8; 100 mM NaCl),
30 l de SDS al 10 %, 100 l de NaCl 5 M y 20 l de Proteinasa K (20 mg/mL 10 mM Tris-HCl
pH 8), la suspensin ser incubada a 55C durante 2 horas. El producto obtenido ser purificado
con solucin de cloroformo: alcohol isoamilico (24:1) saturado con Tris-HCl 0.1 M pH 8, la
suspensin se centrifugar a 12 000 rpm durante 10 min con posterior recuperacin del
sobrenadante. La purificacin se realizar con Isopropanol y etanol helado al 70 %. El producto
de ADN obtenido ser suspendido en buffer de Tris-HCl 1M (pH 8) y EDTA 0.5 M para su
conservacin (Fitzgerald y col., 1997).

Para determinar la identidad bacteriana se realizar la amplificacin de gen rrs 16S rRNA. La
amplificacin se realizar en un termociclador C1000 marca BioRad, la polimerizacin se llevar
a cabo bajo las siguientes condiciones: un ciclo a 95 durante 4 min, seguido de 32 ciclos a 95
por 30 s, la temperatura de alineamiento fue de 60C por 45 s y la temperatura de extensin
fue de 72 C por 1 min. Se completar la reaccin con una extensin final a 72C durante 7 min.
Los oligonucletidos utilizados sern: fD2 5 AGA GTT TGA TCA TGG CTC AG 3 y rP1 5 ACG
GTT ACC TTG TTA CGA CTT 3 (Weisburg y col., 1991). Los productos amplificados sern
analizados por electroforesis en gel de agarosa (2 %) a 80 V durante 1 h. Los geles obtenidos
se teirn con SyberGreen (Invitrogen) y las bandas sern visualizadas en un
fotoducumentador modelo Molecular Imager Gel Doc XR System marca BioRad. Se utilizar
marcador de peso molecular lambda 1 kb (Invitrogen, USA). La determinacin del ndice de
similitud de la bacteria se llevar a cabo con el algoritmo BLAST
(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) del National Center for Biotechnology Information
(NCBI).

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