Electroforesis o cataforesis

Es el movimiento de molculas o partculas

cargadas en un campo elctrico
Se puede realizar con propsitos analticos de
identificacin o para caracterizacin fsica de
los componentes de una muestra o para su
separacin preparativa.
Se usa para analizar y separa molculas (ej.
protenas) o para depositar recubrimientos,
como en los elementos usados en los tubos de
electrones.

Electroforesis o cataforesis
La migracin electrofortica de una molcula
puede realizarse dentro de cualquier medio
pero generalmente es una matriz.
Si el fluido es el que se pone en movimiento,
por ejemplo a travs de un diafragma fijo, se le
llama electrosmosis.

Movimiento de molculas en la
electroforesis
Las molculas siempre se mueven hacia el
electrodo de polaridad opuesta a la carga
neta de la molcula (los cationes se mueven
hacia el ctodo y los aniones hacia el
nodo).
El medio necesita estar amortiguado al pH
que produce la direccin y taza apropiada
de migracin.

Electroforesis
ctodo

()

++

(+)

nodo

Movilidad y pI
Las movilidades de las protenas se
incrementan proporcionalmente al
alejamiento de sus puntos isoelctricos ya
que se incremente su carga neta.
Los cidos nucleicos y las protenas en
presencia de SDS presentan movilidades
ms altas en un rango de pH arriba de la
neutralidad.

Factores que afectan la movilidad

electrofortica
Composicin del solvente
Presencia de detergentes

Temperatura
Fuerza inica
Ejemplos: la estabilidad de los cidos nucleicos
depende de los iones Na+
Las protenas se agregar a bajas fuerzas inicas
Altas fuerzas inicas pueden sobrepasar la disipacin
de calor de Joule del aparato de electroforesis

Invencin
El primer aparato sofisticado de
electroforesis fue desarrollado por Tiselius
en 1937
Desarroll la moving boundary, que se
convertira en la electroforesis zonal y la
utiliz para separar protenas del suero.

Arne Wilhelm Kaurin Tiselius

(1902-71)
Tesis (1930): The moving-boundary
method of studying the
electrophoresis of proteins"
(publicado en Nova Acta Regiae
Societatis Scientiarum Upsaliensis,
Ser. IV, 7, No. 4)
(1937) A new apparatus for
electrophoretic analysis of colloidal
mixtures. Transactions of the
Faraday Society, 33 524.

Tubo de Tiselius
nodo

Ctodo

Amortiguador
Lmite o
frontera
ascendente

Fronteras
iniciales

Molculas de
protena

Lmite o
frontera
descendente

Desarrollo
La electroforesis se desarrollo
completamente de los aos 40s a los 50s.
Se utiliz para separar molculas que van
desde las protenas ms grandes,
aminocidos y hasta iones inorgnicos.

Aplicaciones

Bioqumica
Qumica clnica, forense, de alimentos
Toxicologa
Farmacia, farmacologa
Enzimologa, inmunologa
Microbiologa,
Botnica, citologa,
Biologa Molecular, etc.

Electroforesis zonal
Empleando geles de slice o de acetato de
celulosa y aplicando las protenas en una
zona estrecha en torno a los electrodos se
pueden determinar diferencias de carga neta
entre protenas (carga total/masa).
Este mtodo se denomina electroforesis
zonal.

 Adems de la electroforesis zonal, se desarrollaron

dos otros tipos:
Isoelectoenfoque e isotacoforesis.
Estos tres mtodos se basan en propiedades fsicas
diferentes.
Es posible hacer tres anlisis separados sobre una
misma muestra o los mtodos se pueden combinar.

Diversificacin de soportes
Los soportes o matrices sobre los que se ha
realizado la electroforesis se ha diversificado
durante el tiempo de desarrollo de la
electroforesis.
Se ha observado que diferentes matrices dan
diferentes ventajas para diferentes tipos de
muestras.
Algunas matrices utilizadas han sido geles de
polmeros, papeles o capilares.

Papel
Fue el primer soporte usado en las tcnicas
de electroforesis desarrolladas para separar
compuestos (Tiselius, 1937).
Es fcil de usar porque no se requiere
preparacin de la matriz.
Es limitada su capacidad resolutiva.
En 1957, Kohn us acetato de celulosa
como medio de soporte.
Kohn, J., A cellulose acetate supporting medium for zone
electrophoresis, Clin. Chim. Acta, 2, 297, 1957.

Almidn
Para ver esta pelcu la, de be
disponer de QuickTime y de
un descompresor TIFF (sin comprimir).

Smithies us un gel de almidn como medio

para electroforesis en 1955.
Smithies, O., Zone electrophoresis in starch
gels: group variations in the serum proteins of
normal human adults, Biochem. J., 61, 629,
1955.

Capilares
Jorgenson y Lukacs utilizaron capilares
como matrices para la electroforesis a
principios de los 1980's.

Jorgenson, J. W. and Lukacs, K. D. Anal. Chem., 53, 1928, 1981.

Jorgenson, J. W. and Lukacs, K. D., Science, 222, 266, 1983.

Poliacrilamida
En 1959 Ornstein/Davis y Raymond y
Weintraub utilizaron geles de
poliacrilamida.

Ornstein, L. and Davis, B. J., Disc Electrophoresis,

Distillation Products Industries (Division of Eastman Kodak
Co.), 1959.
Raymond, S. and Weintraub, L., Acrylamide gel as a
supporting medium for zone electrophoresis, Science, 130,
711, 1959.

Velocidad de migracin
Es proporcional a la relacin entre las
cargas de la protena y su masa.
Cuanto mayor carga por unidad de
masa ms rpida ser la migracin.

Velocidad y movilidad de las

molculas en una electroforesis
V=
Movilidad =

EQ

F
m = V
E

Q
F

V, velocidad
E, campo elctrico
Q, carga neta
F, coeficiente de friccin

Poliacrilamida
Los geles de poliacrilamida se forman
por la polimerizacin de la acrilamida
por accin de un agente formador de
enlaces cruzados (cross-linking), la
bis-acrilamida.

Reaccin de polimerizacin
La reaccin se desencadena por la presencia de un
iniciador y se continua con ayuda de un
catalizador.
El iniciador es el ion persulfato (S2O8-) que se aade en
forma de persulfato amnico (APS).
Como catalizador se suele utilizar TEMED (N,N,N,N'tetrametilendiamina).
En algunas situaciones, como por ejemplo en el
isoelectroenfoque en el que la presencia de persulfato
puede interferir con la electroforesis se emplean otros
sistemas catalizador-iniciador.

Oxgeno y polimerizacin
El oxgeno es un inhibidor de la polimerizacin de
la acrilamida, por lo que
Las soluciones de acrilamida se desgasifican para
que la polimerizacin sea completa y a con buena
velocidad.
Adems, durante la polimerizacin se libera calor
(reaccin exotrmica), lo que podra provocar la
formacin de burbujas en el seno del gel.

 La velocidad de polimerizacin es
proporcional a la concentracin de
persulfato
(iniciador)
y
TEMED
(catalizador) adicionados.

 La porosidad del gel la determina las proporciones

relativas de poliacrilamida y bis-acrilamida
Es menor el poro cuanta ms bisacrilamida vs. acrilamida
se use.
El porcentaje total de acrilamida/bisacrilamida determina
el rango de separacin del gel.
Los geles se denominan en funcin del % de
acrilamida/bisacrilamida que contienen.
La mayora de las protenas se separan bien en el rango 5 a
15%. Un menor porcentaje (mayor tamao de poro) es
mejor para separar protenas de gran tamao.

Radicales libres en la
polimerizacin de la acrilamida
S2O8=

SO4 .

Sulfato radical libre

SO4 .

+ CH2= CH C NH2
Acrilamida

Persulfato

CH2 CH
C
.

NH2

Acrilamida radical libre

Enlace acrilamida - bisacrilamida

O
CH2 C

C
CH2 CH CH
2
O
CH2 CH2

C O
C
C
CH2 CH2 C

CH2

CH2

CH2
O

Estructura de la poliacrilamida

Ventajas de los geles de

poliacrilamida
Qumicamente inertes,
Transparentes
Estables en un amplio rango de pH,
temperatura y fuerza inica.

CH2

(CH2)n

CH2

(CH2)n

CH2

CH2

(CH2)n

Relaciones %T y %C
%T = a
%C =

+
m

b
a

X 100%
X 100%

a = acrilamida (g)
b = N,N-metilenbisacrilamida
m = volumen final (ml)

 C, es crtica si es menor a 10 los geles son

rgidos y opacos si excede 100 en geles con 5
% de acrilamida son pastosos y se rompen.
Geles elsticos y completamente transparentes
se obtienen con C de 30 y con acrilamida
superior al 3%

 No hay gelificacin si la acrilamida es

menor al 2% y la Bis menor a 0.5%.
Para que los geles sean elsticos la
concentracin de bisacrilamida debe
disminuir. Puede usarse la frmula :
C = 6.5 - 0.3T
en un rango de 5-20% de acrilamida

 Las protenas presentan una carga

elctrica neta si se encuentran en un
medio que tenga un pH diferente al de
su punto isoelctrico y por eso tienen la
propiedad de desplazarse cuando
encuentran en un campo elctrico.

Electroforesis nativa
Las protenas se someten a una migracin sin
desnaturalizacin.
Las protenas migran en funcin de su carga, de su tamao
y de su forma.
Se mantienen, en ciertos casos, las interacciones entre
subunidades y entre protenas.
Los sistemas amortiguadores (tampn) usados son :
tris-glicina (rango de pH 8.3 a 9.5),
tris-borato (rango de pH 7.0 a 8.5) y
tris-acetato (rango de pH 7.2 a 8.5).

Electroforesis desnaturalizante
Somete a las protenas a migracin
asegurando su desnaturalizacin completa
(prdida de la estructura tridimensional).
La migracin es proporcional a la carga y al
tamao de la molcula pero no a su forma.
El agente desnaturalizante ms empleado es
el detergente dodecilsulfato de sodio o SDS.

Sistemas de amortiguadores
Se puede realizar empleando sistemas de uno o ms
amortiguadores de pH, se habla entonces de sistemas
amortiguadores continuos o discontinuos.
En los sistemas discontinuos el amortiguador del primer
gel asegura la migracin de todas las protenas en el frente
de migracin, provocando la acumulacin de todas las que
se han cargado en el pozo.
La separacin realmente comienza a partir del momento en
el que el frente de migracin alcanza la frontera del
segundo tampn.

PAGE
La electroforesis de protenas en geles en una
matriz de poliacrilamida es denominada
electroforesis en poliacrilamida o PAGE,
(PolyAcrilamide Gel Electrophoresis).
Es una de las tcnicas ms ampliamente usada
para caracterizar mezclas complejas de protenas.
Es un mtodo conveniente, rpido y econmico a
nivel de muestra, pues se requieren slo
cantidades del orden de microgramos de protena.

PAGE -SDS
Su nombre significa Electroforesis en geles
de poliacrilamida que se realiza en
presencia de SDS (SDS-polyacrilamide gel
electrophoresis).
PAGE-SDS es la electroforesis de protenas
ms ampliamente usada.
Descrita por Laemmli (1970, Nature,
277:680)

PAGE -SDS
Electroforesis desnaturalizante
Las muestras se desnaturalizan por calor en
presencia de agentes desnaturalizantes:
beta-mercaptoetanol, destruye los puentes
disulfuro,
SDS, desnaturaliza y recubre a la protena y se
separan como cadenas polipeptdicas aisladas.

PAGE -SDS
Se emplea un sistema de dos tampones
(discontinuo).
Permite la separacin de volmenes
relativamente grandes de muestra sin prdida de
resolucin.
La concentracin se produce por isotacoforesis
de la muestra en el primer gel ('stacking').

PAGE -SDS
El efecto de estrechamiento de las bandas se basa
en que:
los iones glicinato, cargados negativamente de manera
incompleta (en el amortiguador superior) tienen una
movilidad electrofortica inferior que los complejos de
protenas-SDS,
Estos complejos, a la vez, tienen menor movilidad que
los iones Cl- del amotiguador de muestra en el gel de
compactacin (stacking).

PAGE -SDS
Cuando se someten las protenas a el campo
elctrico todas las especies deben migrar a la
misma velocidad para mantener el circuito
elctrico.
Los iones glicinato slo se pueden desplazar a la
misma velocidad que los iones Cl- si hay una
regin de con un gradiente de alto voltaje.
El gradiente es inversamente proporcional a la
conductividad que es a su vez proporcional a la
concentracin.

PAGE -SDS
El resultado es que las tres especies de inters ajustan sus
concentraciones de forma que [Cl-] > [protena-SDS] >
[glicinato-].
Como slo hay una pequea concentracin de protenaSDS este complejo se concentra en una banda muy delgada
entre las fronteras de migracin del Cl- y del glicinato-.
Cuando el glicinato- alcanza el borde del gel de separacin
adquiere una carga mayor en el nuevo medio, debido al pH
superior, e incrementa su movilidad.
A partir de ese momento la interfase entre el glicinato- y el
Cl- deja atrs a los complejos de protena-SDS que se
desplazarn a su propia velocidad.

SDS
Otros nombres, Dodecilsulfato de sodio, laurilsulfato de sodio.
Detergente aninico
Desnaturalizante
Se une a las cadenas polipeptdicas con una
relacin de 1.4 g de SDS por g de protena,
aproximadamente una molcula de SDS por cada
dos aminocidos de la cadena.

SDS
La unin masiva de molculas de SDS bloquea la
carga propia de la molcula de protena
Le confiere al complejo una carga neta negativa
proporcional a su masa.
Todas las protenas acomplejadas con SDS viajan
hacia el nodo.

SDS
La separacin de los complejos SDS-protena es
proporcional slo a la masa de la protena pues todas
tienen la misma carga por unidad de masa.

Se puede determinar el peso molecular aparente de

cualquier protena por comparacin con un patrn
de protenas de pesos moleculares conocidos.
Las movilidades de las protenas en los geles de
SDS-PAGE son funciones lineales del logaritmo
de su peso molecular.

Inicio de la PAGE discontinua

Al inicio de la
electroforesis, las
muestras se colocan
en un pozo. El
volumen puede ser
variable en cada
muestra aunque la
cantidad de protena
debe ser constante.

Reserva de amortiguador
Tris-glicina, pH 8.3

Muestra
Tris-HCl, pH 6.8

Gel de
compactacin
Tris-HCl,
pH 6.8
Gel de
resolucin
Tris-HCl, pH
8.8

Reserva de amortiguador
Tris-glicina, pH 8.3

Compactacin (stacking)

El primer gel o gel de

compactacin
(stacking) es de
mayor poro (menor
porcentaje de
acrilamida+bisacrilamid
a) y tiene un pH ms
cido que el segundo
gel.

Las protenas
se focalizan
(compactan)
formando una
banda delgada

Separacin en el gel resolutivo.

El segundo gel, o
gel de resolucin,
es el que realmente
separa a las
protenas. Presenta
un poro menor y
un pH de 8.8.

Protenas
fraccionadas en el
gel de separacin

Frontera
Glicina/cloruro

Relacin entre la movilidad electrofortica y la masa

molecular (PAGE-SDS)

Logaritmo de la
Masa molecular

kDa
200
100
50
40
30
20
0
0

0.16 0.33

10

12

0.5

0.66

0.8

Movilidad electrofortica (cm)

Movilidad relativa

Geles en gradiente
El uso de geles de poliacrilamida que tienen un
gradiente creciente de concentracin de
acrilamida+bisacrilamida, y en consecuencia un
gradiente decreciente en el tamao de poro,
pueden tener ventajas sobre los geles de
concentraciones uniformes de acrilamida.

Caractersticas de los geles en

gradiente.
Generalmente los gradientes se establecen entre el 3 y el
30% de acrilamida en gradientes lineales o cncavos.
El rango a emplear depender del tamao de las protenas a
separar.
En un gel en gradiente la protena migra hasta que alcanza
una zona donde el tamao de poro impide cualquier
avance.
Una vez se alcanza el lmite de poro no se produce una
migracin apreciable aunque no se detiene completamente.

Ventajas
Resuelve mejor las bandas pues las
concentra en regiones muy estrechas.
Incrementa el rango de pesos moleculares
que se pueden resolver en un mismo gel
comparado con los de una concentracin
fija.

Preparacin de gradientes
Los geles en gradiente se preparan mezclando las
soluciones de acrilamida de las concentraciones
extremas en un formador de gradientes.
Se suele adoptar la inclusin en la solucin de
polimerizacin de glicerol o sacarosa para
aumentar la densidad de las soluciones y evitar las
mezclas en el proceso de preparacin del
gradiente.

Formadores de gradientes
Cncavos

Lineales

Estructura de la Agarosa

Tipos de EF
Electroforesis el geles en gradiente
Electroforesis Andica (protenas acidicas o
neutras)
Electroforesis catdica (protenas bsica)
PAGE-SDS
Websert y Osborn (fosfato)
(OFarrel)
Anderson y Anderson

Isolectroenfoque
Denominada electroenfoque o isofocalizacin
Se basa en el desplazamiento de las molculas en un
gradiente de pH.
Las molculas anfotricas, como los aminocidos, se
separan en un medio en el que existe una diferencia de
potencial y un gradiente de pH hasta que encuentran su pH
isoelctrico.
La regin del nodo (+) es cida y la del ctodo (-) es
alcalina. Entre ambos se establece un gradiente de pH tal
que las molculas que se han de separar tengan su punto
isolctrico dentro del rango.

Movilidad en un gradiente de pH
Las sustancias que se encuentran inicialmente en regiones
de pH inferior a su punto isoelctrico estarn cargadas
positivamente y migrarn hacia el ctodo,
Las que se encuentren en medios con pH ms bajos que su
pI tendrn carga negativa y migrarn hacia el nodo.
Al alcanzar la regin donde el pH coincidir con su pI,
tendrn una carga neta nula (forma un zwiterion) y se
detendrn.
De esta forma las molculas anfotricas se sitan en
estrechas bandas donde coincide su pI con el pH (se
focalizan).

 En esta tcnica el punto de aplicacin suele no ser crtico

pues las molculas siempre se desplazarn hacia la regin
de su pI (aunque existen excepciones).
La capacidad de resolucin es de 0.01 unidades de pH.
El gradiente de pH estable entre los electrodos se consigue
usando una mezcla de anfolitos (anfolinas) de bajo peso
molecular cuyos pI cubren un rango preestablecido de pH.
Los anfolitos suelen ser cidos poliamino policarboxlicos
alifticos sintticos y son comercializados en mezclas que
cubren determinados rangos de pH.

Detecciones especficas
Carbohidratos
Transferencia electrofortica
Tincin de Plata