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Introduccin
Significa "Escribir en Colores.

Cromatografa

Los componentes de una mezcla pueden

presentar una tendencia diferente a
permanecer en cualquiera de las fases
involucradas.

Es la separacin de dos o ms
compuestos qumicos en un medio.

Aspectos histricos de la
cromatografa
La tcnica de cromatografa aparece en
1850.
El qumico F.F.Runge, que trabajaba con
tintas, descubre que los cationes orgnicos se
podan separar por migracin cuando se
colocaba una solucin que los contena sobre
un material poroso, como papel.

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Aspectos histricos de la
cromatografa

Aspectos histricos de la
cromatografa

En 1906 el botnico ruso Tswett utiliz la

cromatografa de columna para separar
extractos vegetales coloreados.

A partir de 1940 los mtodos cromatogrficos

adquieren extensin mundial.

Por primera vez se utiliza el nombre de cromatografa.

En 1930 Lederer consigue separar los

colorantes de la yema de huevo.
Los qumicos Khun, Kamer y Ruzucca
desarrollan la cromatografa en el campo de la
qumica orgnica e inorgnica.
Obtienen el premio Nbel por sus trabajos en 1937,
1938, 1939 respectivamente.

En 1940 Tiselius divide los mtodos cromatogrficos en

cromatografa por anlisis frontal, desarrollo por elusin
y desarrollo por desplazamiento, obtuvo el premio Nbel
por sus trabajos en 1948.

Para el mismo tiempo la cromatografa

comienza a aplicarse en el campo de la
bioqumica.
Martin consigue separar algunos aminocidos
acetilados.

Conceptos generales

Tipos de cromatografa

La cromatografa se basa en un conjunto de tcnicas

asociadas al principio de retencin selectiva.

Cromatografa plana: La fase estacionaria se

sita sobre una placa plana o sobre un papel.

Permite separar los distintos componentes de una mezcla,

permitiendo identificar y determinar las cantidades de dichos
componentes.

Posee:
Fase mvil: consiste en un fluido (gas, lquido o fluido
supercrtico).
Fase estacionaria: se trata de un slido o un lquido fijado en
un slido.

Los componentes de la mezcla interaccionan en forma

diferente con la fase estacionaria y con la fase mvil.
Los componentes atraviesan la fase estacionaria a distintas
velocidades y se van separando.

Las principales tcnicas son:

Cromatografa en papel
Cromatografa en capa fina

Cromatografa en columna: La fase estacionaria

se sita dentro de una columna.
Segn el fluido empleado como fase mvil se
distinguen:
Cromatografa de lquidos
Cromatografa de gases
Cromatografa de fluidos supercrticos`

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Aspectos histricos de los distintos

tipos de cromatografa

Aspectos histricos de los distintos

tipos de cromatografa

Cromatografa en papel

Cromatografa en capa fina

Fue desarrolla por Martin.

Tiene como soporte un papel de celulosa.
Es una tcnica sencilla y presenta la ventaja de
poder utilizar cantidades pequeas de muestra
(miligramos y microgramos).

Fue originada en 1938 por los trabajos de los

investigadores rusos Izmailov y Schraiberen.
Lograron separar mezclas de tinturas farmacuticas.

En este tipo de cromatografa la fase

estacionaria se extiende sobre un soporte
inerte (silica).
Stahl estandariz el mtodo para elaborar
capas finas por mtodos mecnicos.

Cromatografa de columna

Trminos relacionados con el proceso

Consiste en la aplicacin de una muestra

compleja a una columna de cristal.

Matriz de la columna
Longitud de la columna
Volumen de la columna: volumen total
de gel.
Run Throught: volumen de muestra mas
solvente.

Contiene una matriz slida porosa que est inmersa en

el solvente.
Se bombea una gran cantidad de solvente a travs de
la columna.
Las diferentes mezclas se van retrasando de manera
distinta segn sus interacciones con la matriz.
Se pueden separar de acuerdo a su carga, su
hidrofobicidad, su tamao o su capacidad de unirse a
grupos qumicos particulares.
La pureza de las fracciones obtenidas se suele comprobar
mediante la electroforesis en geles de poliacrilamida.

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Aspectos histricos de los distintos

tipos de cromatografa
Cromatografa de intercambio inico
Esta tcnica apareci durante la II Guerra
Mundial.
Tena la finalidad de separar los elementos
alcalinotrreos y los elementos de transicin.

En 1938 Taylor y Urey utilizan este mtodo

para separar istopos de Litio y Potasio
utilizando resinas de zeolita.
En 1939 Samuel logra sintetizar resinas de
intercambio inico.

Cromatografa de intercambio inico

Cromatografa de intercambio inico

Se realiza sobre matrices que tienen una carga

neta.

Funcionamiento

Carga negativa: intercambio de cationes

Carga positiva: intercambio de aniones

La carga de la matriz de la columna as como la

carga de la muestra depender del pH del
solvente y de su fuerza inica (proporcional a la
concentracin de iones).
Se usa en la separacin de molculas grandes
(protenas y cidos nucleicos).
Cuando las separaciones exigen condiciones qumicas
fuertes se emplean intercambiadores inicos
inorgnicos.

En unas condiciones determinadas sern retenidas

en la columna las muestras que tengan una carga
complementaria a la de la matriz de la gel, siendo
eluidas las restantes.
Para eluir las muestras retenidas se puede variar la
carga inica del solvente o su pH de forma que se
alcance el punto isoelctrico de la muestra de
inters o el de la matriz, neutralizando de este
modo la fuerza que retiene a la muestra en la
columna.

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Aspectos histricos de los distintos

tipos de cromatografa
Cromatografa de gel-filtracin
Fodin y Porath en 1958 descubren que usando como
fase estacionaria geles se puede separar polmeros
sintticos de alto peso molecular.

Cromatografa de afinidad.
Porath en 1967 utiliza un pptido o protena unida
covalentemente a un ligando y la utiliza para la
separacin de molculas proteicas.

Cromatografa de gas.
Es una de las tcnicas ms utilizadas e importantes.
Ha revolucionado el campo de la qumica analtica.

Cromatografa de exclusin
La cromatografa de exclusin molecular o de filtracin
en gel, separa las muestras en base a su tamao.
La matriz de la columna esta formada por un polmero
entrecruzado con poros de tamaos determinados.
Las muestras de mayor tamao migran a lo largo de la
columna con mayor velocidad que las de tamao
pequeo.
Las muestras de menor tamao, entran en los poros y
se mueven a lo largo de la columna lentamente porque
tienen que atravesar los laberintos que se encuentran en
el interior de las bolas de polmero en su marcha a lo
largo de la columna.

Cromatografa de exclusin

Caractersticas de las matrices

Hay diferentes tamaos de partcula para

un gel:

Deben ser estables.

Tener bajo contenido en grupos inicos.
Uniformidad de poro y tamao.
Los compuestos utilizados pueden ser
derivados de:

a menor tamao mayor resolucin y menor

gasto en la columna.

Este tcnica se emplea en la separacin

de protenas de alimentos, determinacin
de glucosa y fructosa en zumos de fruta,
etc.

Dextranos (Sephadex)
Agarosa (Sepharosa)
Acrilamidas (Biogel P)
Esferas de vidrio

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Cromatografa de afinidad

Ligandos de afinidad

Permite la separacin de mezclas por su afinidad o

capacidad de unin a un determinado ligando.
Las muestras que se retienen en la columna son
aquellas que se unen especficamente a un ligando que
previamente se ha unido covalentemente a la matriz de
la columna.
Despus de que las muestra que no se unen al ligando
son lavadas o eludas a travs de la columna, la muestra
de inters que ha quedado retenida en la columna se
eluye (se libera) mediante el empleo de una solucin
que contiene bien ligando libre u otro compuesto que
rompa la interaccin entre el ligando y la protena

Son las molculas bioqumicas que se encuentran

ancladas qumicamente sobre el soporte slido
inerte, y son las responsables de la adsorcin
especfica de los solutos-analitos.
Se clasifican segn su:
Naturaleza - pueden ser macromolculas biolgicas o bien
molculas de bajo peso molecular.
Actuacin - se fundamenta en la selectividad de la retencin
que condiciona las caractersticas de la cromatografa de
afinidad. Se distinguen dos grandes grupos:
Ligandos especficos , como los anticuerpos , que se enlazan
reversiblemente a un solo soluto.
Ligandos generales enlazados con un determinado grupo de
compuestos bioqumicos, como las lectinas y nucletidos.

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Electroforesis

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Introduccin

Conceptos generales

La electroforesis fue desarrollada por primera vez por el

qumico sueco Arne Tiselius.

La electroforesis es un proceso que se utiliza

para separar macromolculas en una solucin.

Gana el Premio Nbel en 1948 por los trabajos realizados.

La electroforesis es una tcnica analtica de separacin

de fundamento cintico basada en el movimiento o
migracin de las macromolculas disueltas en un
determinado medio a travs de una matriz o soporte
reticulado como resultado de la aplicacin de un campo
elctrico.
El comportamiento de la molcula viene dado por su
movilidad electrofortica:
La movilidad depende de la carga, tamao y forma.
Cuanto mayor es la relacin carga/tamao ms rpido migra
un in.

Conceptos generales

Cuando una mezcla de molculas ionizadas y con carga

neta son colocadas en un campo elctrico, estas
experimentan una fuerza de atraccin hacia el polo que
posee carga opuesta.
Las molculas cargadas positivamente se desplazarn
hacia el ctodo (el polo negativo) y aquellas cargadas
positivamente se desplazarn hacia el nodo (el polo
positivo).

Conceptos generales
Los iones comenzarn a moverse formando
un frente cuya anchura aumentar con el
tiempo.
Para reducir la anchura de este frente podemos
reducir el movimiento de las molculas empleando
un medio que oponga mas resistencia a dicho
movimiento.
Una forma comn de hacer esto es formar un gel.

La friccin con el solvente dificultaran este movimiento originando

una fuerza que se opone , por otro lado, las molculas tienen que
moverse en forma aleatoria o movimiento browniano debido a que
poseen energa cintica propia denominado difusin.

El gel consiste de un polmero soluble de muy alto

peso molecular que atrapa molculas de agua y forma
un tamiz que dificulta el movimiento de los solutos.

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Conceptos generales
La velocidad de migracin (v) de la
partcula es directamente proporcional al
producto de su carga efectiva (q) y el
gradiente de potencial elctrico (E) e
inversamente proporcional al coeficiente
de friccin (f) relativo a la talla y forma de
la molcula, o sea, a la resistencia que le
ofrece el medio.
V = q E / f

Mtodos electroforticos zonales

Tipos de soportes

Son los ms comunes, dada su alta

aplicabilidad en diferentes campos.
Son tiles para lograr la separacin de
mezclas complejas.
Se aplican pequeas cantidades de la
muestra a un soporte slido.
Los soportes son en general polmeros y
forman un gel poroso que restringe el
movimiento de las molculas a travs del
medio durante la electroforesis y disminuyen
los flujos de conveccin del solvente.

papel (celulosa)
almidn
poliacrilamida
agarosa
acetato de celulosa

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Electroforesis de gel

Electroforesis de gel

La electroforesis en gel se utiliza en la

deteccin, control de pureza, caracterizacin,
cuantificacin (por comparacin con controles),
preparacin y purificacin (por extraccin de
bandas desde el gel) de diferentes molculas.
Esta tcnica tiene como ventaja su capacidad
de separar macromolculas de inters en la
industria biotecnolgica y qumica.

Los geles ms comunes son agarosa y

poliacrilamida.
La electroforesis en gel tiene dos
mecanismos de separacin:

Ha sido un mtodo muy til para la separacin de

protenas (enzimas, hormonas) y cidos nucleicos (DNA
y RNA) con gran resolucin.

por la relacin carga/tamao

por tamao

Electroforesis de agarosa

Electroforesis de poliacrilamida

Permite separar molculas de DNA, cuando

stas son sometidas a un campo elctrico y
atradas hacia el polo opuesto a su carga neta.
La agarosa es un polisacrido (originalmente
obtenido de algas, como el agar-agar, pero de
composicin homognea), cuyas disoluciones
(tpicamente de 0.5 a 2 %) poseen la propiedad
de permanecer liquidas por encima de 50
grados C y formar un gel, semislido al
enfriarse.

Los geles de poliacrilamida se forman por

la polimerizacin de la acrilamida por
accin de:
Agente entrecruzador ('cross-linking'): bisacrilamida
Catalizador: TEMED (N,N,N,N'tetrametilnediamina)
Iniciador: in persulfato que se aade en forma
de persulfato amnico

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Clasificacin
Electroforesis desnaturalizante
La ms comn: somete a las protenas a migracin
asegurando la completa desnaturalizacin (prdida de
la estructura tridimensional).
La migracin es proporcional a la carga y al tamao de
la molcula pero no a su forma.
El agente desnaturalizante ms empleado es el
sodiododecilsulfato o SDS, un detergente.

Electroforesis nativa
Es la que somete a las protenas a migracin sin
desnaturalizacin.
Las protenas migran en funcin de su carga, de su
tamao y de su forma.

SDS-PAGE

Electroforesis capilar
Es una tcnica alterna a la electroforesis convencional.
Surge debido a que la velocidad de separacin y
resolucin de los compuestos mejora a medida que
aumenta el campo elctrico aplicado.
Se realiza la electroforesis en un tubo capilar con un
dimetro interno inferior a 0.1 mm y una longitud de 50
cm a 1 m.
El mecanismo de separacin est basado en las
relaciones carga/masa de los analitos.
Su utilidad est en la separacin de protenas y pptidos
entre otras sustancias.

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