1.

INTRODUCCIN
www.fao.org/docrep/ field/003/AB489S/AB489S03.htm
El desarrollo de la acuacultura en sistemas semi intensivos e intensivos ha
forzado el desarrollo de patrones de alimentacin cada vez ms eficientes,
basados en los requerimientos nutricionales de cada una de las especies a
cultivar. Para que el animal presente un crecimiento adecuado en el menor
tiempo y ms bajo costo posibles, el alimento suministrado debe poseer
caractersticas nutricionales ptimas, por lo cual en la industria de alimentacin
de peces, como en las dems especies animales, la elaboracin, los
ingredientes y el almacenamiento de los alimentos procesados, deben de estar
sometidos a estrictos controles de calidad.
En la acuacultura semi-intensiva e intensiva, la calidad del alimento est
considerada como uno de los factores de mayor influencia en el xito de un
cultivo, ya que los costos del alimento y la alimentacin, representan por lo
general entre el 50 y 70% de los costos de operacin en un sistema de este
tipo. La calidad de los alimentos va a depender en primer trmino de la calidad
de los ingredientes utilizados en la preparacin del alimento balanceado, as
como tambin del tipo de procesamiento a que se sometan antes y durante la
elaboracin del alimento. Adicionalmente, el cuidado que se tenga para
almacenar tanto ingredientes como alimento terminado, influir notablemente en
sus propiedades nutritivas.
Los alimentos balanceados son preparados con base en los requerimientos
nutricionales de cada especie y an cuando la dieta se formula para
satisfacerlos, no siempre contiene los niveles de nutrientes calculados una vez
preparado, debido a que el proceso usado en su elaboracin puede alterar
significativamente su valor nutricional; por ejemplo, el calor puede daar
algunos nutrientes y/o puede hacerlos ms disponibles eliminando los txicos
termolbiles, mientras que por otro lado la molienda puede afectar la
digestibilidad de protenas y carbohidratos (Harris, 1980). La calidad del
alimento tambin se modifica despus de pasar cierto tiempo en el almacn,
donde adems de sufrir cambios en el valor nutricional, se pueden presentar
alteraciones en otras caractersticas como son el color, la textura, el sabor y el
olor. Por otra parte existe el grave riesgo de contaminarse con los desechos de
roedores, insectos y micoorganismos que aceleran an ms su deterioro
(Limborg, 1979; Chow et al., 1980; Smith and Moss, 1985).
Teniendo en consideracin todos estos factores, resalta la importancia de tener
un control de calidad de los ingredientes alimenticios y del producto terminado,
con el fin de asegurar que la dieta posea los niveles nutricionales mnimos
requeridos, ya que nos proporciona la composicin exacta del material y el nivel
de sustancias txicas normalmente presentes. Este control se inicia con el
anlisis de los ingredientes con que se elaborar el alimento y finaliza con la
certificacin de los niveles de nutrientes en el alimento preparado, as como su
adecuado almacenaje (Frazer, 1967; Harris, 1980). Adicionalmente, es claro
que solo es posible formular una dieta completa, si se conoce con precisin al
menos la composicin proximal de los ingredientes con que se elaborar, sin
embargo, Tacon (1979) recomienda que el valor nutricional de un material
usado en la formulacin de alimentos, debe evaluarse con base en:
1
a. Su contenido de Nitrgeno proteico y no proteico.
b. La composicin de aceites y cidos grasos.
c. El contenido de fibra cruda y carbohidratos solubles
d. Su contenido de minerales y vitaminas.
e. La presencia de microbios.
f. La presencia de compuestos orgnicos txicos.
g. La variabilidad de la composicin qumica.
De manera ideal cualquier ingrediente debera pasar por los puntos de control
sealados, sin embargo, si por limitaciones econmicas o de equipo no es
posible, se debe entonces procurar cubrir al menos aquellos anlisis que
garanticen una calidad mnima deseable y una seguridad de que los animales
no presentarn reacciones adversas al alimento.
An cuando el control de calidad es un tema que merece tratarse
exhaustivamente, este manual est enfocado particularmente a los mtodos
bsicos de anlisis qumicos necesarios para una adecuada evaluacin de
ingredientes y dietas elaboradas, con el objeto de ponerlos a la disposicin de la
mayora de acuacultores y personas interesadas en este tipo de evaluaciones
que posean conocimientos bsicos de qumica. Los mtodos propuestos han
sido recopilados de diferentes fuentes y la mayora son considerados como
estndares de norma.
Con fines prcticos los anlisis se han agrupado en tres secciones; en la
primera se incluyen los mtodos considerados dentro del anlisis proximal, para
determinar el contenido de humedad, protena cruda, lpidos crudos, fibra cruda,
ceniza y extracto libre de nitrgeno; este anlisis permite conocer los niveles
porcentuales de cada nutriente en el material pero no indica nada acerca de la
calidad de los nutrientes, para lo cual se requieren otros anlisis
complementarios, algunos de los cuales se incluyen en este manual en la
segunda seccin donde se consideran como anlisis especiales.
En un tercer apartado se incluyen las tcnicas ms sencillas para la deteccin
de algunos de los txicos y antinutrientes ms comunes, ya que su presencia
puede afectar negativamente la eficiencia de utilizacin de los alimentos, e
inclusive, ser causa de mortalidad. Consideramos que este captulo es
particularmente importante cuando se incluye en los alimentos subproductos
agroindustriales como harina de soya, algodn, o nuevas fuentes proteicas,
particularmente de origen vegetal.
Antes de realizar alguna tcnica analtica, es importante considerar las
siguientes recomendaciones:
a. Asegurarse de que cuenta con los reactivos y equipo necesarios para
efectuar la determinacin deseada, ya que una vez iniciado un anlisis,
por lo general no es posible suspenderlo temporalmente en tanto se
consiguen los faltantes.
b. Efecte cada anlisis por TRIPLICADO. Es ms exacto trabajar con
valores promedio que con un slo dato; si los resultados entre las
rplicas varan notablemente, es preferible repetir todo el anlisis.
c. Pese la muestra con la mayor aproximacin posible. Tres o cuatro
decimales nos dan una mayor exactitud en el clculo. Siempre utilice
una balanza analtica.
d. Despus de pasar la muestra al recipiente donde se realizar el anlisis,
pese nuevamente el contenedor a fin de ajustar el peso final. La
2
exactitud en el peso es fundamental para obtener un buen resultado, ya
que la mayor parte de las tcnicas son gravimtricas.
e. Nunca modifique el tamao de muestra, los tiempos en las diferentes
etapas o el tipo de reactivos, a menos de que se hagan pruebas
comparativas que garanticen la precisin de los resultados. Recuerde
que los anlisis normalmente se basan en mtodos estndar aceptados
o exigidos por las autoridades reguladoras.
f. Utilice siempre los equipos y accesorios de seguridad requeridos, como
son campanas de extraccin, mscaras y batas.
g. Recuerde que estar manejando substancias txicas o peligrosas para
el organismo, por ello extreme las precauciones requeridas segn el
caso y no omita ninguna.
2. PREPARACION DE LA MUESTRA PARA
ANALISIS
La muestra utilizada en el anlisis debe ser representativa del total del lote de
material, por lo cual se debe de aplicar la metodologa apropiada para la toma
de muestras. Se recomienda la siguiente rutina para tener una buena
representatividad:
a. En lotes a granel menores de 10 ton tomar dos muestras por cada
tonelada.
b. En lotes a granel mayores de 10 ton tomar una muestra por tonelada.
c. Para materiales encostalados, para 1 a 10 costales tomar muestras de
cada uno; con ms de 10 costales muestrear un 10% del total al azar.
Las muestras se debern tomar de diferentes puntos para que el material sea
representativo del total del lote; posteriormente se mezclan perfectamente y se
dividen en sublotes de 12 kg, se colocan en recipientes hermticos y se
almacenan de manera apropiada hasta su anlisis.
Para cada material se debe llevar un registro para conocer el tipo de proceso al
que ha estado sujeto previamente (subproductos industriales), su origen
(vegetal, animal, mineral, frmaco) y la parte usada como alimento
(principalmente si ha estado sometido a un proceso que impida su
reconocimiento). Estos datos son importantes particularmente cuando se estn
usando productos agrcolas, ya que stos pueden variar su composicin
dependiendo de la variedad cultivada, las condiciones de cultivo o la poca de
cosecha; pueden tambin contener residuos de pesticidas o estar contaminados
por mohos y en el caso de subproductos animales, presentar contaminacin por
antibiticos y hormonas (Frazer, 1967; Harris, 1980).
2.1. Preparacin de la muestra.
Para que un material pueda ser utilizado en el laboratorio de anlisis deber ser
preparado de manera apropiada, esto con el fin de que los resultados obtenidos
sean representativos del total y puedan ser utilizados de manera confiable para
la formulacin del alimento o para la valoracin del mismo, para lo cual se
hacen las siguientes recomendaciones:
3
a. La cantidad de material debe ser adecuada para realizar todos los
anlisis necesarios; debe ser una muestra homognea y representativa.
b. El manejo de la muestra debe ser cuidadoso para evitar cualquier
cambio o contaminacin.
c. La muestra deber molerse finamente, tamizarse y mezclarse
homogneamente. Esta operacin debe hacerse rpidamente y con la
mnima exposicin al medio ambiente. Evite su sobrecalentamiento
durante el molido, por lo cual materiales sensibles al calor debern ser
molidos a mano. Antes de usar el molino asegrese de que est
perfectamente limpio.
d. Si la muestra contiene mucha humedad y la preparacin del material no
puede hacerse sin cambios significativos en sta, determine la humedad
antes y despus de la preparacin.
e. Se recomienda un examen fsico macro y microscpico para detectar la
presencia de materiales contaminantes.
f. Mezcle la muestra perfectamente y divdala en dos partes iguales. De
ser necesario haga un molido preliminar para facilitar esta operacin.
Almacene una de las partes en un frasco hermtico, limpio y seco; la
otra parte ser usada en los anlisis y su tamao deber ser adecuado
para la totalidad de las pruebas requeridas.
g. Al menos que el mtodo de anlisis indique lo contrario, los materiales
sern molidos de inmediato y pasados por una malla de 1 mm
2
; mezcle
perfectamente la muestra tamizada y almacnela en un recipiente
hermtico. Antes de tomar material para cada anlisis mzclese
nuevamente.
h. Al menos que se seale lo contrario, las muestras hmedas debern
secarse para su molido y tamizado, siguiendo las indicaciones del punto
anterior.
i. Las muestras lquidas y semilquidas debern conservarse en frascos
tapados y mezclarse perfectamente antes de su anlisis.
j. Los materiales debern conservarse en refrigeracin o a temperaturas
que eviten cambios en su composicin. Muestras para anlisis de
vitaminas u otras substancias sensibles a la luz se colocarn en
recipientes de vidrio color mbar.
3. ANALISIS PROXIMAL.
Los anlisis comprendidos dentro de este grupo, tambin conocido como
anlisis proximales Weende, se aplican en primer lugar a los materiales que se
usarn para formular una dieta como fuente de protena o de energa y a los
alimentos terminados, como un control para verificar que cumplan con las
especificaciones o requerimientos establecidos durante la formulacin. Estos
anlisis nos indicarn el contenido de humedad, protena cruda (nitrgeno total),
fibra cruda, lpidos crudos, ceniza y extracto libre de nitrgeno en la muestra.
Una descripcin ms amplia de estos anlisis se puede encontrar en Osborne y
Voogt (1978), MAFF (1982) y AOAC (1984).
3.1. Humedad.
4
Durante el balanceo de la racin, es fundamental conocer el contenido de agua
en cada uno de los elementos que la compondrn; as mismo, es necesario
vigilar la humedad en el alimento preparado, ya que niveles superiores al 8%
favorecen la presencia de insectos y arriba del 14%, existe el riesgo de
contaminacin por hongos y bacterias (Cockerell et al., 1971). El mtodo se
basa en el secado de una muestra en un horno y su determinacin por
diferencia de peso entre el material seco y hmedo.
Aparatos
Horno de secado.
Desecadores.
Procedimiento
1. Pese alrededor de 510 g de la muestra previamente molida.
2. Coloque la muestra en un horno a 105C por un mnimo de 12 h.
3. Deje enfriar la muestra en un desecador.
4. Pese nuevamente cuidando de que el material no este expuesto al
medio ambiente.
Clculos
Contenido de humedad (%) = 100(((B-A) - (C-A))/(B-A))
Donde:
A = Peso de la charolilla seca y limpia (g)
B = Peso de la charolilla + muestra hmeda (g)
C = Peso de la charolilla + muestra seca (g)


FIGURA 1
Determinacin del contenido de humedad en ingredientes alimenticios.
5
3.2. Protena cruda.
Por su costo es este el nutriente ms importante en la dieta en una operacin
comercial; su adecuada evaluacin permite controlar la calidad de los insumos
proteicos que estn siendo adquiridos o del alimento que se est suministrando.
Su anlisis se efecta mediante el mtodo de Kjeldahl, mismo que evala el
contenido de nitrgeno total en la muestra, despus de ser digerida con cido
sulfrico en presencia de un catalizador de mercurio o selenio.

a) Mtodo simple propuesto por Chow et al. (1980)
Reactivos
Oxido de mercurio, grado reactivo.
Sulfato de potasio o sulfato de sodio anhidro, grado reactivo.
Acido sulfrico (98%), libre de Nitrgeno.
Parafina.
Solucin de hidrxido de sodio al 40%; disolver 400 g de hidrxido de
sodio en agua y diluir a 1,000 ml.
Solucin de sulfato de sodio al 4%.
Solucin indicadora de cido brico; agregue 5 ml de una solucin con
0.1% de rojo de metilo y 0.2% de verde de bromocresol a un litro de
solucin saturada de cido brico.
Solucin estndar de cido clorhdrico 0.1N.
Materiales y Equipo
Unidad de digestin y destilacin Kjeldahl.
Matraces Kjeldahl de 500 ml.
Matraces Erlenmayer de 250 ml.
Perlas de ebullicin.
Procedimiento
1. Pese con precisin de miligramos 1g de muestra y colquelo en el
matraz Kjeldahl; agrguele 10g de sulfato de potasio, 0.7g de xido de
mercurio y 20 ml de cido sulfrico concentrado.
2. Coloque el matraz en el digestor en un ngulo inclinado y caliente a
ebullicin hasta que la solucin se vea clara, contine calentando por
media hora ms. Si se produce mucha espuma, adicinele un poco de
parafina.
3. Deje enfriar; durante el enfriamiento adicione poco a poco alrededor de
90 ml de agua destilada y desionizada. Ya fro agregue 25 ml de
solucin de sulfato de sodio y mezcle.
4. Agregue una perla de ebullicin y 80 ml de la solucin de hidrxido de
sodio al 40% manteniendo inclinado el matraz. Se formarn dos capas.
5. Conecte rpidamente el matraz a la unidad de destilacin, caliente y
colecte 50 ml del destilado conteniendo el amonio en 50 ml de solucin
indicadora.
6. Al terminar de destilar, remueva el matraz receptor, enjuague la punta
del condensador y titule con la solucin estndar de cido clorhdrico.
6
Clculos:
A = Acido clorhdrico usado en la titulacin (ml)
B = Normalidad del cido estndar
C = Peso de la muestra (g)
Nitrgeno en la muestra (%) = 100[((A B)/C) 0.014]
Protena cruda (%) = Nitrgeno en la muestra * 6.25


FIGURA 2
Determinacin de protena cruda por el mtodo Kjeldahl.

b) Mtodo estndar MAFF (1982) para la determinacin de protenas en
alimentos y sus ingredientes.
Reactivos:
Oxido de mercurio.
Sulfato de potasio o sulfato de sodio anhidro.
Sacarosa.
Zinc granulado.
Granulado de piedra pomex lavada con cido sulfrico y quemada.
Acido sulfrico concentrado (d = 1.84 g/ml).
Solucin de hidrxido de sodio al 40 %.
Solucin saturada de sulfato de sodio.
Solucin de tiosulfato de sodio; 8g de Na
2
S
2
O
3
5H
2
O en 100ml.
Solucin de hidrxido de sodio 0.1N.
Solucin de hidrxido de sodio 0.25N.
Solucin de cido sulfrico 0.1N.
7
Solucin indicadora de rojo de metilo; disuelva 0.3 g de rojo de metilo en
100 ml de etanol (9596 % V/V).
Solucin indicadora rojo de metilo-azul de metileno; (a) disuelva 0.2g de
rojo de metilo en 100ml de etanol (9596 % V/V) y (b) disuelva 0.1g de
azul de metileno en 100ml de etanol (9596 % V/V), mezcle un volumen
de (a) con uno de (b).
Materiales y Equipo
Unidad de digestin y destilacin Kjeldahl.
Matraces Kjeldahl.
Procedimiento
1. Pese 1g de muestra con aproximacin de miligramos y psela a un
matraz Kjeldahl; adicione 10g de sulfato de potasio o sulfato de sodio,
0.6 0.7g de xido de mercurio, 25 ml de cido sulfrico y unos pocos
granos de piedra pomex.
2. Caliente el matraz moderadamente al principio, agitando ocasionalmente
hasta que la materia este carbonizada y las burbujas hayan
desaparecido, luego aumente la temperatura y permita que se
establezca una ebullicin suave. Evite que las paredes del matraz se
sobrecalienten para que no se le peguen partculas orgnicas.
3. Cuando la solucin se vea clara y sin color, contine la ebullicin por 2
horas ms y luego permita que se enfre. Si despus de la digestin y
del enfriamiento se cristaliza la solucin repita el anlisis; si sigue
ocurriendo la cristalizacin repita el anlisis usando una mayor cantidad
de cido sulfrico.
4. Adicione con cuidado al matraz 250350ml de agua destilada,
mezclando el contenido al mismo tiempo; deje enfriar y agrguele unas
lentejas de Zinc.
5. Transfiera 25 ml de solucin de cido sulfrico 0.1 0.5N al matraz de
colecta del aparato de destilacin, de acuerdo con el valor esperado de
Nitrgeno en la muestra, as como unas cuantas gotas de indicador de
rojo de metilo.
6. Tomando precauciones para evitar prdida de amonio, adicione
cuidadosamente a la muestra 100 ml de solucin de hidrxido de sodio y
luego 10 ml de solucin de sulfato de sodio o 25 ml de solucin de
tiosulfato de sodio. Mezcle bien y conecte inmediatamente al aparato de
destilacin.
7. Caliente el matraz de tal manera que se destilen alrededor de 150 ml del
lquido en 30 min. Al finalizar, mida con papel indicador el pH del
destilado resultante y si es alcalino contine con la destilacin, la cual se
suspender cuando el pH aparezca neutro. Durante este proceso agite
ocasionalmente el contenido del matraz. Si el destilado se torna alcalino,
la determinacin deber ser abandonada y el anlisis repetido con los
ajustes apropiados.
8. En el matraz de colecta titule el exceso de cido sulfrico con hidrxido
de sodio 0.1 0.25N, de acuerdo con la normalidad del cido empleado,
al punto final del indicador de rojo de metilo o rojo de metilo-azul de
8
metileno.
9. Corra un blanco de reactivos usando 1g de sacarosa en lugar de la
muestra, para usarlo en el clculo de los resultados.
Clculos
a. Determine el H
2
SO
4
consumido. 1 ml de cido 1.4mg de Nitrgeno.
b. Calcule el porcentaje de Nitrgeno en la muestra y convirtalo a
porcentaje de protena multiplicando el resultado por 6.25.
c. Si se sospecha de la presencia de Nitrgeno amoniacal o nitratos en la
muestra, debern ser evaluados para restarse del Nitrgeno total.
Exceptuando los alimentos para rumiantes, se deber evaluar el
contenido de Nitrgeno no proteico y tambin substraerse del Nitrgeno
total.

FIGURA 3
Mtodo estndar MAFF para la determinacin de protena cruda
3.3. Lpidos crudos
En este mtodo, las grasas de la muestra son extradas con ter de petrleo y
evaluadas como porcentaje del peso despus de evaporar el solvente.
Reactivos, Materiales y Equipo
9
- Eter de petrleo, punto de ebullicin 4060C.
Aparato de extraccin Soxhlet.
Horno de laboratorio ajustado a 105C.
Desecador.
Dedales de extraccin.
Procedimiento
1. Saque del horno los matraces de extraccin sin tocarlos con los dedos,
enfrelos en un desecador y pselos con aproximacin de miligramos.
2. Pese en un dedal de extraccin manejado con pinzas, de 3 a 5g de la
muestra seca con aproximacin de miligramos y colquelo en la unidad
de extraccin. Conecte al extractor el matraz con ter de petrleo a 2/3
del volumen total.
4. Lleve a ebullicin y ajuste el calentamiento de tal manera que se
obtengan alrededor de 10 reflujos por hora. La duracin de la extraccin
depender de la cantidad de lpidos en la muestra; para materiales muy
grasosos ser de 6 horas.
5. Al trmino, evapore el ter por destilacin o con rotovapor. Coloque el
matraz en el horno durante hora y media para eliminar el ter. Enfre los
matraces en un desecador y pselos con aproximacin de miligramos.
La muestra desengrasada puede usarse para la determinacin de fibra
cruda.
Clculos
A = Peso del matraz limpio y seco (g)
B = Peso del matraz con grasa (g)
C = Peso de la muestra (g)
Contenido de lpidos crudos (%) = 100((B - A)/C)
10

FIGURA 4
Determinacin de lpidos por el mtodo de Soxhlet
3.4. Fibra cruda
Este mtodo permite determinar el contenido de fibra en la muestra, despus de
ser digerida con soluciones de cido sulfrico e hidrxido de sodio y calcinado
el residuo. La diferencia de pesos despus de la calcinacin nos indica la
cantidad de fibra presente.
Reactivos
Solucin de cido sulfrico 0.255N.
Solucin de hidrxido de sodio 0.313N, libre de carbonato de sodio.
Antiespumante (ej. alcohol octil o silicona).
Alcohol etlico al 95% (V/V).
Eter de petrleo.
Solucin de cido clorhdrico al 1% (V/V).
Materiales y equipo.
Matraz de bola fondo plano, 600 ml, cuello esmerilado.
Unidad de condensacin para el matraz.
Matraz Kitazato de un litro.
Embudo Buchner.
Crisol de filtracin.
11
Conos de hule.
Papel filtro Whatman No. 541.
Pizeta de 500 ml.
Desecador.
Horno de laboratorio.
Mufla.
Mtodo
1. Pese con aproximacin de miligramos de 2 a 3 gramos de la muestra
desengrasada y seca. Colquela en el matraz y adicione 200ml de la
solucin de cido sulfrico en ebullicin.
3. Coloque el condensador y lleve a ebullicin en un minuto; de ser
necesario adicinele antiespumante. Djelo hervir exactamente por 30
min, manteniendo constante el volumen con agua destilada y moviendo
peridicamente el matraz para remover las partculas adheridas a las
paredes.
4. Instale el embudo Buchner con el papel filtro y precalintelo con agua
hirviendo. Simultneamente y al trmino del tiempo de ebullicin, retire
el matraz, djelo reposar por un minuto y filtre cuidadosamente usando
succin; la filtracin se debe realizar en menos de 10 min. Lave el papel
filtro con agua hirviendo.
5. Transfiera el residuo al matraz con ayuda de una pizeta conteniendo
200ml de solucin de NaOH en ebullicin y deje hervir por 30 min como
en paso 2.
6. Precaliente el crisol de filtracin con agua hirviendo y filtre
cuidadosamente despus de dejar reposar el hidrolizado por 1 min.
7. Lave el residuo con agua hirviendo, con la solucin de HCI y
nuevamente con agua hirviendo, para terminar con tres lavados con ter
de petrleo. Coloque el crisol en el horno a 105C por 12 horas y enfre
en desecador.
8. Pese rpidamente los crisoles con el residuo (no los manipule) y
colquelos en la mufla a 550C por 3 horas, djelos enfriar en un
desecador y pselos nuevamente.
Clculos
A = Peso del crisol con el residuo seco (g)
B = Peso del crisol con la ceniza (g)
C = Peso de la muestra (g)

Contenido de fibra cruda (%)= 100((A - B)/C)
Recomendaciones
Uno de los problemas ms frecuentes durante la evaluacin de la fibra cruda es
la oclusin de los filtros, por lo que en algunos casos se recomienda sustituir el
papel (paso 4 del mtodo) por una pieza de tela de algodn. Para evitar la
saturacin del crisol de filtracin (paso 6) colquelo ligeramente inclinado y
agregue muy lentamente el material a filtrar, de manera que gradualmente se
vaya cubriendo la superficie filtrante.
Con el uso los crisoles de filtracin tienden a taparse. Para su limpieza
12
calcnelos a 500 C y hgales pasar agua en sentido inverso. Cuando se han
tapado con partculas minerales, prepare una solucin que contenga 20% KOH,
5% de Na
3
PO
4
y 0.5% de EDTA sal sdica, calintela y hgala pasar por el
crisol en sentido inverso. Este tratamiento erosiona al filtro de vidrio.



FIGURA 5
Determinacin proximal de fibra cruda
3.5. Cenizas
El mtodo aqu presentado se emplea para determinar el contenido de ceniza
en los alimentos o sus ingredientes mediante la calcinacin. Se considera como
el contenido de minerales totales o material inorgnico en la muestra.
Materiales y equipo.
Crisoles de porcelana.
Mufla.
Desecador.
Procedimiento
1. En un crisol de porcelana que previamente se calcin y se llevo a peso
constante, coloque de 2.5 a 5g de muestra seca.
2. Coloque el crisol en una mufla y calcnelo a 550 C por 12 horas, deje
enfriar y pselo a un desecador.
3. Cuidadosamente pese nuevamente el crisol conteniendo la ceniza.
13
Clculos
A = Peso del crisol con muestra (g)
B = Peso del crisol con ceniza (g)
C = Peso de la muestra (g)

Contenido de ceniza (%)= 100((A - B)/C)


FIGURA 6
Determinacin del contenido de ceniza en ingredientes alimenticios.
3.6. Extracto Libre de Nitrgeno (ELN)
Dentro de este concepto se agrupan todos los nutrientes no evaluados con los
mtodos sealados anteriormente dentro del anlisis proximal, constituido
principalmente por carbohidratos digeribles, as como tambin vitaminas y
dems compuestos orgnicos solubles no nitrogenados; debido a que se
obtiene como la resultante de restar a 100 los porcientos calculados para cada
nutriente, los errores cometidos en su respectiva evaluacin repercutirn en el
cmputo final.
Clculo
Extracto Libre de Nitrgeno (%) = 100-(A+B+C+D+E)
Donde:
A = Contenido de humedad (%)
B = Contenido de protena cruda (%)
C = Contenido de lpidos crudos (%)
D = Contenido de fibra cruda (%)
E = Contenido de ceniza (%)

14
3.7. Correcciones
Debido a que los anlisis normalmente se hacen con muestras preparadas para
tal fin, es necesario realizar ciertas correcciones en los resultados para que
reflejen el contenido real de nutrientes en el material en las condiciones en que
se usar.
a) Humedad
Si los anlisis se efectuaron en base seca (BS), esto es material deshidratado,
es necesario corregir el resultado para expresarlo en base hmeda (BH), tal
como se encuentra en el alimento o material para su elaboracin, mediante la
siguiente expresin:
A = Contenido de nutriente (%/BS)
B = Contenido de humedad de el material (%)
Contenido de nutriente (%/BH) = (A ((100 - B)/100))
b) Lpidos
Cuando se usa material desengrasado, por ejemplo en el anlisis de fibra cruda,
se aplica una expresin similar a fin de obtener un valor representativo de la
muestra:
A = Contenido de fibra (desengrasada, %)
B = Contenido de lpidos en el material (%)
Contenido de fibra ajustado (%) = (A ((100 - B)/100))
4. ANALISIS ESPECIALES
Entre estas tcnicas se incluye algunos mtodos aplicables a la determinacin
de la calidad de los ingredientes y los productos terminados, con base en su
contenido de micronutrientes, tales como fibra digerible, minerales, vitaminas,
actividad enzimtica, etc.; as mismo, se presenta el mtodo ms ampliamente
utilizado para la cuantificacin de xido de cromo durante la evaluacin de la
digestibilidad de las dietas.
4.1. Determinacin de Fibra por Detergente Acido.
Este mtodo permite tener una aproximacin del grado de digestibilidad de las
fibras en el alimento. La muestra es digerida por medio de cetil-trimetil-amonio
en cido sulfrico y el residuo es considerado como la fibra no digerible.
Reactivos
Solucin de detergente cido al 1 % p/v. A un litro de agua agregar poco
a poco 56 ml de cido sulfrico concentrado, lleve la solucin a un
volumen final de 2 1 con agua y agregue 20g de Cetil-trimetil-amonio.
Antiespumante Dekalin (decahidronaftaleno).
Acetona.
Materiales y Equipo
Horno
Matraces erlenmayer de 500 ml.
Mantilla de calentamiento.
15
Condensador de dedo fro.
Crisoles de filtracin, porosidad 1.
Procedimiento
1. Muela la muestra en un molino de martillos para que pase la malla de 1
mm.
2. Tome una submuestra y squela durante la noche en un horno a 105 C.
3. Enfre la muestra en un desecador.
4. Pese con aproximacin de miligramos un gramo de la muestra seca y
colquela en un matraz erlenmayer de 500 ml.
5. Adicione 100 ml de la solucin de detergente cido y 2 ml del
antiespumante.
6. Coloque el matraz en la mantilla con el condensador instalado.
7. Lleve rpidamente a ebullicin (3 a 5 minutos) y contine el
calentamiento por 2 horas.
8. Filtre el contenido del matraz por gravedad en un crisol previamente
pesado.
9. Enjuague el matraz con agua destilada caliente y filtre.
10. Enjuague el contenido del crisol con 300 ml de agua destilada caliente.
Use succin dbil (por vaco).
11. Enjuague el residuo con acetona y seque.
12. Coloque el crisol en el horno a 105 C durante 12 horas.
13. Enfre dentro de un desecador la muestra e inmediatamente despus
determine el peso.
Clculos
Contenido de Fibra (%) = 100 (W
2
/W
1
)
Donde
W
1
= Peso de muestra (g).
W
2
= Peso del residuo (g).


FIGURA 7
Determinacin del contenido de fibra por el mtodo de detergente cido.
16
4.2. Determinacin de Fibra por Detergente Neutro.
Este mtodo es til para la determinacin de fibras vegetales en alimentos.
Aparentemente tiene la capacidad de separar los componentes nutricionales
solubles de aquellos que no son totalmente aprovechables o que dependen de
la fermentacin biolgica para su aprovechamiento. El mtodo tiene limitaciones
en su precisin cuando los valores de protena son muy altos y los valores de
fibra son bajos.
Reactivos
Solucin detergente neutra. Agregue a un litro de agua destilada 30 mg
de sulfato lauril sdico USP, 18.61 g de etilendiamino tetra acetato
disdico dihidrogenado dehidratado, 6.81 g de borato de sodio
decahidrato y 4.56 g del reactivo fosfato cido disdico anhidro. Agtese
hasta disolver y mantenga el pH entre 6.9 y 7.1.
Amilasa (Sigma A 1278) 2g en 90ml H
2
O mas 10 ml de etilenglicol.
Acetona grado reactivo.
Sulfito de sodio anhdro. Se usa nicamente en anlisis de subproductos
animales.
Materiales y Equipo
Equipo de reflujo. Cualquier equipo estndar adecuado para el anlisis
de fibra.
Crisoles de filtracin en vidrio. Use crisoles de tipo alto, con porosidad
gruesa y placa de filtracin de 40mm de dimetro con capacidad para 40
50 ml de lquido.
Cuando los crisoles se obstruyen despus de un uso continuo se
prepara una solucin limpiadora de 20% KOH, 5% de Na
3
PO
4
y 0.5% de
EDTA de sodio que se hace pasar caliente en sentido opuesto a travs
del crisol. Se debe de evitar el uso continuo de la solucin pues tiende a
erosionar el vidrio.
Procedimiento
1. Pese aproximadamente 1 g de muestra molida para pasar el tamiz de 1
mm y depostela en un matraz de fondo redondo para iniciar el reflujo.
2. Agregue en orden 100 ml de detergente neutro a temperatura ambiente
y 2 ml de amilasa por muestra.
3. Caliente para que la solucin hierva en 5 a 10 minutos; en el momento
de iniciar la ebullicin reduzca la temperatura para evitar la formacin de
espuma. Ajuste la temperatura para que la solucin hierva suavemente y
mantenga en reflujo por 60 minutos a partir del instante en que empieza
a hervir.
4. Agite el matraz para suspender y decante la muestra en un crisol
previamente pesado y preparado para succin al vaco. Use poco vaco
al principio incrementndolo a medida que lo vaya requiriendo. Pase
toda la muestra al crisol utilizando un mnimo de agua caliente (80 C)
para el lavado del matraz. Elimine el vaco, afloje con cuidado la capa de
muestra en el fondo del crisol sin removerla y agregue agua caliente,
17
repitiendo el lavado varias veces. Finalmente lave dos veces con
acetona sin remover la muestra del filtro y seque con vaco.
5. Seque los crisoles a 105 C durante 12 h y pselos en caliente (esta
operacin no debe durar ms de 30 seg). Si no se puede pesar de
inmediato, enfre los crisoles en un desecador que contenga como
desecante pentxido de fsforo (P
2
O
5
).
6. El residuo de fibra recuperado se registra en trminos de paredes
celulares.
7. Calcule el contenido celular (material soluble) substrayendo este valor
de 100.
NOTA:
En el caso de granos y subproductos de molinos es posible que se forme un
material gelatinoso derivado de los almidones y la protena, el cual obstruye el
filtro e impide el lavado. Para mejorar la filtracin haga pasar aire en sentido
inverso en el crisol. As mismo al evite que la muestra se adhiera al fondo del
matraz durante el inicio del calentamiento hasta la ebullicin, calentando
rpidamente con agitacin constante.
Clculos
a. Paredes celulares (%) en base seca o como se ofrece. 100 ((peso del
crisol + paredes celulares) - (peso del crisol))/peso de la muestra.
b. El porciento del contenido celular se calcula substrayendo de 100 el %
de paredes celulares.
% contenido celular = 100 - % paredes celulares.Van Soest, P.J. and R.H.
Wine, 1967, J. Assoc. Official Anal. Chem., 50:50.


FIGURA 8
Determinacin del contendido de fibra por el mtodo de detergente neutro
18
4.3. Ceniza insoluble en Acido Clorhdrico
Este mtodo determina el contenido de substancias minerales insolubles en
cido clorhdrico contenidos en los alimentos; de acuerdo con el contenido
mineral de la muestra se aplica ya sea el mtodo A, para alimentos con alto
contenido de materia orgnica, o el mtodo B, recomendable para alimentos
con un alto contenido de minerales, incluyndose aquellos cuyo contenido de
ceniza insoluble es mayor a 1 % al evaluarse previamente con el mtodo A.
Reactivos
Solucin HCI 3N.
Solucin A de cido tricloroactico al 20%, 20 g en 100 ml.
Solucin B de cido tricloroactico al 1 %, 1 g en 100 ml.
Materiales y Equipo
Placa de calentamiento.
Mufla elctrica con termostato.
Crisoles de calcinacin: Platino o aleacin de platino y oro (10% Pt, 90%
Au); Rectangulares (60 40 25 mm) o circulares (6075 mm de
dimetro con 20 25 mm de alto).
Mtodo A
Calcine la muestra siguiendo el mtodo de determinacin de ceniza. Transfiera
el residuo a un vaso de precipitado de 250 400 ml usando 75 ml de cido
clorhdrico 3N y evapore a sequedad, contine calentando durante una hora
ms para deshidratar cualquier slice presente. Enfre y agregue 75 ml de
solucin de HCI 3N y caliente a ebullicin suavemente por 15 minutos. Filtre la
solucin en caliente a travs de un papel filtro libre de ceniza y lave el residuo
con agua caliente hasta que el filtrado deje de ser cido.
Seque el papel filtro conteniendo el residuo y calcine a 550700 C en un crisol
de platino prepesado, enfre en un desecador y posteriormente pese.

FIGURA 9
Determinacin de ceniza insoluble en cido clorhdrico. Mtodo A.

19
Mtodo B
Pese alrededor de 5 g de muestra con una aproximacin de 0.001 g y
transfirala a un vaso de precipitado de 250 400 ml. Adicione 25 ml de agua
destilada y 25 ml de solucin de cido clorhdrico 3N. Mezcle con cuidado y
espere hasta que ya no se liberen gases.
Agregue otros 50 ml de cido clorhdrico y espere hasta que cese la liberacin
de gases y coloque el vaso en un bao mara a ebullicin durante 30 minutos,
con el fin de hidrolizar los almidones presentes. Filtre la solucin cuando todava
este caliente con papel filtro libre de cenizas, posteriormente lave el filtro con 50
ml de agua tibia hasta que el filtrado deje de ser cido (ver nota). Coloque el
papel filtro conteniendo el residuo en un crisol de platino previamente pesado,
seque y calcine la muestra a 550 700 C. Transfiera las cenizas a un vaso de
precipitado usando 75 ml de cido clorhdrico 3N y contine el anlisis como en
el mtodo anterior a partir de la etapa en la que se calienta la muestra
suavemente por 15 minutos.
NOTA:
Si se hace difcil filtrar, repita el anlisis reemplazando los 50 ml de cido
clorhdrico 3N con 50 ml de la solucin A de cido tricloroactico y enjuague el
filtro con una solucin tibia de la solucin B de cido tricloroactico.
Clculos
Calcule el peso de residuo y exprese el resultado como porciento (%) de la
muestra.

FIGURA 10
Determinacin de ceniza insoluble en cido clorhdrico. Mtodo B.
20
4.4. Carbohidratos Totales Disponibles (Clegg-Anthrone).
Este mtodo determina la cantidad de carbohidratos totales, basndose en su
contenido de almidones hidrolizables y azcares solubles.
Reactivos
Solucin de cido perclrico al 52 %. 279ml de cido perclrico (grado
especfico 1.70) en 100 ml de agua destilada; deje enfriar antes de usar.
Solucin de cido sulfrico. 760ml de H
2
SO
4
(grado especfico 1.84) en
330ml de agua destilada; deje enfriar antes de usar.
Reactivo Anthrone. Prepare suficiente reactivo Anthrone preparando una
solucin de cido sulfrico al 0.1 % con el fin de usarla el mismo da.
Solucin estndar de glucosa. Disuelva 100mg de glucosa en 100ml de
agua.
Solucin estndar de glucosa diluida. Diluya 10ml del estndar de
glucosa a 100 ml de agua destilada (1ml = 0.1mg de glucosa).
Materiales y Equipo
Espectrofotmetro.
Papel filtro Wathman no. 542 o Schleicher y Schill no. 150.
Procedimiento
Extraccin:
1. Pese con aproximacin de 0.001g 1.0g de muestra seca 2.5g de
muestra hmeda conteniendo aproximadamente de 60 a 300 mg de
carbohidratos totales disponibles.
2. Transfiera cuantitativamente a una probeta graduada de 100 ml con
tapn.
3. Adicione 10 ml de agua y agite con una varilla de vidrio para dispersar la
muestra.
4. Adicione 13 ml de la solucin de cido perclrico. Agite constantemente
con la varilla de vidrio durante 20 minutos.
5. Enjuague la varilla con agua destilada y lleve el volumen a 100 ml.
Mezcle y filtre a un matraz volumtrico de 250 ml.
6. Enjuague la probeta graduada con agua destilada y adicione al matraz
volumtrico. Afore el matraz con agua destilada y agite.
Determinacin:
1. Diluya 10 ml del extracto a 100 ml con agua destilada. Con una pipeta
pase a un tubo de ensaye 1 ml del filtrado diluido.
2. Tome con la pipeta dos muestras de 1 ml de agua destilada que servirn
como blancos por duplicado y coloque cada uno de ellos en un tubo de
ensaye.
3. Tome dos blancos duplicados de 1 ml usando la solucin de glucosa
diluida.
4. Agregue rpidamente a todos los tubos 5ml de reactivo de anthrone
recin preparado. Tape los tubos y mezcle vigorosamente. Colquelos
21
en un bao mara y caliente durante 12 minutos.
5. Enfre rpidamente a temperatura ambiente. Transfiera la solucin a celdas
para espectrofotmetro de 1 cm. El color verde es estable slo por 2 horas.
6. Lea la absorbancia a 630 nm contra el blanco.
Clculos
Carbohidratos totales disponibles (% de glucosa) = (25 b)/(a W)
Donde
W = Peso en g de la muestra.
a = Absorbancia del estndar diluido
1
.
b = Absorbancia de la muestra diluida.
1
El grfico es una lnea recta en el rango de 0 0.15 mg de glucosa (manual) 0.0 1.5 mg de glucosa
(automtico).
Clegg, K.M. (1956). J.Sci. Food Agric. 7, 40.

FIGURA 11
Determinacin de carbohidratos totales disponibles en alimentos.

22
4.5. Nitrgeno Proteico y No Proteico
Esta tcnica permite reconocer la porcin de nitrgeno de origen proteico y no
proteico de los materiales analizados. Puede aplicarse a todo tipo de materiales.
Reactivos
Acetato de cobre monohidratado en solucin al 3 % p/v.
Sulfato de aluminio y potasio (2 H
2
O) en solucin al 10% p/v.
Antiespumante de silicona.
Materiales y Equipo
Matraces kjeldhal de 800 ml.
Embudos buchner de 12 cm de dimetro.
Matraces kitazato.
Papel filtro Whatman no. 541 Schleicher y Schill no. 1505, de 18 cm.
Procedimiento
Pese 2 g de muestra con ms de 25 % de protena cruda, 1 g para rangos de 25
50 % de protena y 0.5 g para materiales con ms de 50 % de protena cruda.
Transfierala a un matraz kjeldahl y agregue aproximadamente 50 ml de agua
destilada, unos pocos grnulos de antiebullente y una o dos gotas del
antiespumante.
Caliente a ebullicin durante 30 minutos (teniendo cuidado de que no se seque).
Cuando la muestra est todava caliente agregue 2 ml de la solucin de sulfato
de aluminio y potasio, mezcle perfectamente y caliente a ebullicin, adicione 50
ml de la solucin de acetato de cobre mezclando perfectamente bien y deje
enfriar. Filtre usando vaco. Lave el matraz y el precipitado con 50 ml de agua
destilada fra.
Para evaluar el nitrgeno proteico analice el residuo por medio de la marcha de
nitrgeno total de kjeldahl. El nitrgeno no proteico se analiza por medio de la
misma tcnica a partir del lquido filtrado. Los resultados respectivos de los
slidos y lquidos por medio de kjeldahl ofrecern directamente los datos de
nitrgeno proteico (NP) y no proteico (NNP) respectivamente.


FIGURA 12
Determinacin del contenido de nitrgeno proteico y no proteico en alimentos.
23
4.6. Determinacin de Protenas por el Mtodo de Lowry.
El mtodo ms preciso para la determinacin de concentraciones proteicas es
probablemente el mtodo de hidrlisis cida. La mayor parte de los otros
mtodos son sensibles a la composicin de aminocidos de las protenas y no
pueden ser obtenidas concentraciones absolutas. El procedimiento de Lowry no
es la excepcin, pero es sensiblemente constante de protena a protena, lo cual
ha hecho que sea ampliamente usado y que las determinaciones sean una
alternativa completamente aceptable con un rigor absoluto en todas las
determinaciones en casi todas las circunstancias en donde se involucren
mezclas de protenas o extractos crudos.
Reactivos
Reactivo de formacin compleja. Preprese inmediatamente antes de
usarse, mezclando las soluciones A, B y C en proporcin 100:1:1
respectivamente.
Solucin A: 2% (P/V) Na
2
CO
3
en agua destilada.
Solucin B: 1% (P/V) CuSO
4
.5H
2
O en agua destilada.
Solucin C: 2% (P/V) Tartrato de Sodio y Potasio en agua destilada.
Solucin de Hidrxido de sodio 2N.
Reactivo de Foln (disponible comercialmente): sese en concentracin
21N.
Estndares: Use una solucin madre de protena estndar (por ejem.
fraccin V de albmina de suero bovino) conteniendo 4 mg / ml de
protena en agua destilada, almacenada a 20 C. Prepare los
estndares diluyendo la solucin madre con agua destilada tal como se
indica en la siguiente tabla:
PREPARACION DE ESTANDARES DE PROTEINA
Solucin madre (l) 0 1.25 2.50 6.25 12.50 25.00 62.50 125.0 250.0
Agua (l) 500 499 498 494 488 475 438 475 250
Concentracin de protena (g/ml) 0 10 20 50 100 200 500 1000 2000
Procedimiento
1. A 0.1 ml de muestra o sol. estndar, adicinele 0.1 ml de sol. NaOH 2N.
Caliente a 100 C durante 10 min a bao mara hirviendo para hidrolizar
la muestra.
2. Deje enfriar a temperatura ambiente y agrguele 1 ml del reactivo de
formacin de complejo recin preparado y deje reposar a temperatura
ambiente por 10 min.
3. Adicione 0.1 ml de reactivo de Foln, agite con un mezclador de vrtice y
deje reposar a temperatura ambiente durante 3060 min (no exceda
este tiempo).
4. Lea la absorbancia a 750 nm si la concentracin de la protena fuera
menor a 500 g/ml, 550 nm si fuese entre 100 y 2000 g/ml.
5. Trace una curva estndar de absorbancia como funcin de
concentracin inicial de protena y sela para determinar el contenido de
protena en la muestra.
24
NOTA
a. Si la muestra se encuentra como precipitado, disulvalo en NaOH 2N e
hidrolice como en el paso 1. Use alcuotas de 0.2 ml del hidrolizado para
el paso 2.
b. Todas las clulas u otras muestras complejas pueden requerir un
pretratamiento como el descrito por Burton (1984) para DNA.
c. Mezcle rpidamente en cuanto el reactivo de Foln sea adicionado; esto
es importante para obtener una adecuada reproductibilidad.
d. Se requiere un grupo de estndares para cada ensayo, preferentemente
por triplicado o duplicado.


FIGURA 13
Determinacin de protena en alimentos por el mtodo de Lowry
4.7. Determinacin de Urea
Este mtodo permite cuantificar el contenido de urea en ingredientes
alimenticios.
Reactivos
Carbn activado
Solucin Carrez I: disuelva 21.9 g de acetato de zinc dehidratado en
agua, agregue 3 ml de cido actico glacial y diluya a 100 ml con agua
destilada.
Solucin Carrez II: disuelva 10.6 g de ferrocianuro de potasio en 100 ml
de agua destilada.
25
Acido clorhdrico 0.02N.
Solucin de acetato de sodio: disuelva 136 g de acetato de sodio
trihidratado en 1000 ml de agua.
Solucin de 4-dimetilaminobenzaldehdo: disuelva 1.6 g de 4-
dimetilaminozenzaldehdo (4-DMAB) en 100 ml de etanol al 96% y
adicione 10 ml de cido clorhdrico (d = 1.18 g/ml).
Solucin estndar de urea: disuelva 0.1 g de urea en 100 ml de agua.
Materiales y Equipo
Agitador rotatorio
Espectrofotmetro con celdas de 10 mm.
Procedimiento
Pese aproximadamente 2 g de muestra con una precisin de 0.001 g, o una
cantidad que se espera contenga de 50 a 200 mg de urea y colquela en un
matraz volumtrico de 500 ml. Agregue 150 ml de cido clorhdrico 0.02N, agite
por 30 min y adicione 10 ml de la solucin de acetato de sodio y mezcle.
Agregue 1 g de carbn activado, agite perfectamente bien y deje reposar la
mezcla por 15 min. Adicione 5 ml de la solucin Carrez I, seguido por 5 ml de la
solucin Carrez II, mezclando perfectamente bien entre las adiciones. Afore con
agua destilada y mezcle bien. Filtre una parte con un papel filtro seco en un
vaso de precipitado de 250 ml limpio y seco.
Determinacin
Transfiera 10 ml del filtrado a un tubo de ensaye con tapn esmerilado, adicione
10 ml de la solucin 4-DMAB, mezcle y deje reposar por 15 min. Mida la
absorbancia de la solucin a 435 nm en una celda de 10 mm, contra una
solucin de referencia preparada con los reactivos.
Curva de Calibracin
Diluya 5, 10, 20, 30 y 40 ml de solucin de urea a 100 ml de agua. Transfiera 10
ml de cada solucin a tubos de ensaye con tapn esmerilado y adicione 10 ml
de la solucin 4-DMAB a cada uno. Mezcle y deje reposar por 15 minutos, mida
la absorbancia como se seal anteriormente contra una solucin de referencia
preparada con 10 ml de solucin 4-DMAB y 10 ml de agua, haga una grfica
relacionando las absorbancia con la cantidad de urea presente.
Expresin de Resultados
Determine la cantidad de urea en la muestra por referencia con la curva de
calibracin elaborada. Exprese los resultados como por ciento de la muestra.
% Urea 0.4665 = % N urea.
NOTA:
Si la muestra est muy coloreada, la cantidad de carbn activado deber ser
incrementada arriba de 5 g. La solucin final despus del filtrado deber ser
incolora.
26

FIGURA 14
Determinacin del contenido de urea en ingredientes alimenticios.
4.8. Acido Urico.
A travs de este mtodo es posible determinar el contenido de cido rico y sus
sales tanto en gallinaza como en alimentos e ingredientes que los constituyen.
Reactivos
Solucin de hidrxido de sodio. Disuelva 50 g de NaOH en 50 ml de
agua, mezcle bien y almacene la solucin en un envase de plstico.
Solucin neutra de formaldehido.
a. Verifique la concentracin de la solucin disponible, para lo cual mezcle
30 ml de sta con 50ml de solucin de NaOH IN y 25ml de solucin de
Perxido de hidrgeno (20 volmenes). Caliente en bao de vapor hasta
que no haya ms efervescencia. Enfre y titule con NaCl IN usando
indicador de fenoftalena. Realice una titulacin de blanco usando 3 ml
de agua en lugar del formaldehdo y calcule la concentracin como
sigue:
1ml de la solucin de NaOH IN = 0.0300 g de formaldehdo.
Conc. de formaldehdo (g/100 ml) = ((B-T) ((0.0300 100)/3)
Donde
B = Titulacin del blanco.
T = Titulacin de la muestra.
b. Prepare una solucin neutra que contenga 17.5g de formaldehdo con
250ml de agua y 500ml de etanol. Ajuste el pH a 7.0 con una solucin de
27
NaOH 0.1N. Diluya a 1000ml con agua, mezcle y ajuste nuevamente el
pH de ser necesario.
Solucin buffer de succinato. Disuelva con calentamiento 29.5g de cido
succnico en 750ml de agua y 20ml de la solucin de NaOH. Deje enfriar
y adicione una cantidad adecuada de solucin de formol que contenga
17.5g de formaldehdo, mezcle bien y ajuste el pH a 6.0 con la solucin
de NaOH. Diluya a 1000ml con agua destilada, mezcle y ajuste el pH si
es necesario.
Solucin de tiosulfato de sodio. Disuelva 25g de Na
2
S
2
O3.5H
2
O en
1000ml de agua destilada.
Solucin de lactato de plata. Disuelva con calentamiento 3g de lactato
de plata en 50ml de agua destilada y 1ml de cido lctico. Diluya a
100ml con agua, filtre y almacene en un frasco obscuro. No lo exponga a
la luz directa.
Solucin de magnesio amoniacal. Disuelva 8.75g de MgSO
4
.7H
2
O y
17.5g de NH
4
CL en 50ml de agua. Agregue 30ml de NH
4
OH (d =
0.88g/ml), mezcle bien y diluya a 100ml con agua.
Reactivo de Benedict y Hitchcock. Mezcle 35ml de solucin de lactato de
plata con 15ml de solucin de magnesio amoniacal. Adicione 50ml de
hidrxido de amonio (d = 0.88 g/ml) mzclese bien. Preprese
inmediatamente antes de usarse.
Solucin estndar de cido rico. Pese 250 mg de cido rico con una
precisin de 0.1mg y transfiralo a un matraz de fondo redondo
acoplado a un condensador de reflujo. Adicione 100ml de la solucin de
formaldehdo etlico y caliente a reflujo en un bao de vapor por 30min
agitando frecuentemente. Enfre y transfiera a un matraz volumtrico de
250ml, lavando el matraz redondo con sol. de formaldehdo etlico, afore
con esta solucin y mezcle. 1 ml contiene 1 mg de cido rico.
Eter de petrleo, punto de ebullicin 40 60 C.
Materiales y Equipo
Epectrofotmetro con celdas de cuarzo de 10 mm.
Tubos de cristal para percolacin, con aproximadamente 240 mm de
longitud, 18 mm de dimetro interno, y en la parte inferior
aproximadamente 120mm de longitud y 8 mm de dimetro interno.
Extraccin del cido rico:
1. De la gallinaza: Pese con una aproximacin de 0.001 g cerca de 0.4g de
gallinaza seca y colquela en un matraz de fondo redondo de 150ml.
Adicione 60ml de solucin neutra de formaldehdo, conecte a un
condensador de reflujo y caliente en bao de vapor por una hora. Enfre
y filtre a travs de un crisol (Porosidad 4) a un matraz volumtrico de
100ml. Enjuague el matraz 3 veces consecutivas con porciones de 10ml
de solucin de formaldehdo etlico, pasando cada porcin por el crisol
de filtracin al matraz volumtrico. Afore con la misma solucin y agite.
2. De los alimentos: Pese 4 a 5g de muestra con una aproximacin de
0.001 g y desengrasela por extraccin con ter de petrleo. Transfiera
28
cuantitativamente la muestra desengrasada a un matraz de fondo
redondo y remueva el solvente residual con una corriente suave de aire.
Contine el anlisis como previamente se seal, iniciando con la
adicin de 60 ml de solucin de formaldehdo etlico.
Determinacin
Transfiera con una pipeta de 20 ml de extracto de la muestra prepesado, segn
los mtodos descritos, a un tubo de centrfuga de 50 ml. Adicione 10 ml del
reactivo de Benedict y Hitchcock, mezcle bien y djelos reposar en la oscuridad
por una hora. Centrifuge a 2000 rpm por 15 min. Retire el sobrenadante y deje
escurrir por 10 min. Cuidadosamente limpie cualquier lquido remanente sin
perturbar el precipitado y adicione 20 ml de solucin de tiosulfato de sodio.
Disuelva el precipitado, agitando con una varilla de vidrio delgada. Con una
pipeta transfiera 5 ml de esta solucin a un matraz volumtrico de 200 ml
conteniendo 40 ml de solucin buffer de succinato, afore con agua destilada y
mezcle bien. Mida la absorbancia de la solucin a 294 nm en celdas de slice de
10 mm comparada contra una solucin preparada mezclando 5 ml de solucin
de tiosulfato de sodio con 40 ml de solucin buffer de succinato aforada a 200
ml con agua destilada. Determine la cantidad de cido rico mediante una curva
de calibracin.
Curva de Calibracin:
En una serie de tubos de centrfuga de 50 ml de capacidad transfiera con una
pipeta 2, 4, 6, 8, 10 y 12 ml de solucin estndar de cido rico (equivalentes a
una cantidad similar de cido rico en mg) y llvelos a 20 ml con la solucin de
formaldehdo etlico. Adicione a cada tubo 10 ml de reactivo de Benedict y
Hitchcock, mezcle bien y djelo reposar en la oscuridad por una hora. Contine
el mtodo como en la determinacin a partir del centrifugado. Mida la
absorbancia de la solucin y trace la curva de calibracin graficando
absorbancia (y) contra la cantidad correspondiente de cido rico en mg (x).
Expresin de Resultados
El contenido de N del cido rico como % de la muestra est dado por la
frmula:
% N = A/(6 W)
Donde
A = mg de cido rico (en la alcuota del extracto de la muestra) determinado
por la medicin fotomtrica.
W = peso de la muestra en g.
29


FIGURA 15
Determinacin de cido rico en gallinaza e ingredientes alimenticios
4.9. Ceniza Soluble e Insoluble en Acido.
Este mtodo proporciona una estimacin de la disponibilidad de minerales en
base a su digestibilidad en cido.
Reactivos, Materiales y Equipo
Acido clorhdrico (12.5 % v/v)
Papel filtro libre de ceniza
Crisoles de porcelana
Procedimiento
Use el residuo obtenido de la determinacin de ceniza. Caliente 25 ml de cido
clorhdrico con cuidado para evitar salpicar y filtre en el papel y enjuague con
agua caliente hasta que quede libre del cido. Coloque el papel filtro y el
residuo en un crisol de porcelana prepesado seco y colquelo en la mufla a 600
C durante 2 horas o hasta que quede libre de carbn.
Clculos
Ceniza insoluble (%) = 100(Peso de la ceniza tratada con cido/Peso de la
muestra)
30


FIGURA 16
Determinacin de ceniza soluble e insoluble en cido clorhdrico
4.10. Determinacin de Calcio en el Alimento.
La evaluacin de calcio en la dieta reviste una gran importancia ya que un
desbalance con el fsforo u otros minerales generar un bajo crecimiento.
Reactivos
Acido clorhdrico (1 3 %)
Acido ntrico 70%
Hidrxido de amonio (1:1 v/v)
Indicador de rojo de metilo (1 g en 200 ml de etanol)
Solucin de oxalato de amonio 4.2 %

Acido sulfrico 98 %
Solucin estndar de permanganato de potasio 0.05N
Materiales y Equipo
crisoles de porcelana
matraces volumtricos de 250 ml
vasos de precipitado de 250 ml
Papel filtro para anlisis cuantitativos libre de cenizas
Procedimiento
Calcine en crisol de porcelana 2.5g de muestra finamente molida. Adicione 40
ml de HCI y unas gotas de HNO
3
al residuo, caliente el crisol hasta ebullicin,
enfre y transfiera a un matraz volumtrico de 250ml, afore y mezcle. Pase a un
vaso de precipitado 100ml de sol. para cereales o alimentos con cereales
25ml para alimentos con minerales. Diluya a 100ml y adicione 2 gotas de rojo
de metilo. Adicione NH
4
OH gota a gota hasta que vire a pardo anaranjado,
31
luego adicione 2 gotas de HCl para dar un color rosa. Diluya con 50ml de agua,
hierva y adicione con agitacin 10ml de sol 4.2% de oxalato de amonio. Ajuste
el pH con cido para regresar al color rosa si es necesario.
Dje reposar, filtre y lave el precipitado con la solucin de NH
4
OH (1.5%).
Coloque el papel filtro con el precipitado en un vaso, adicione una mezcla de
125ml de agua y 5ml de H
2
SO
4
, caliente a 70C y titule con la solucin de
permanganato y calcule:
Ca (%)= 0.1((ml Sol. Permanganato / Peso de la Muestra) (Alicuota usada en
ml/250)

FIGURA 17
Determinacin de calcio en alimento e ingredientes alimenticios.
4.11. Determinacin de Fsforo
Al igual que el calcio, este mineral es indispensable para el buen desarrollo de
los organismos cultivados, debiendo estar presente en las dietas en cantidades
suficientes para satisfacer las necesidades metablicas de los organismos. Este
elemento en protenas de origen vegetal puede estar formando parte de fitatos,
por lo cual su disponibilidad puede estar limitada, por lo que se recomienda una
determinacin de cido ftico previa al uso de tales materiales.
Reactivos
Reactivo de Molibdato. Disuelva 40 g de molibdato de amonio 4.H
2
O en
400 ml de agua caliente y enfre. Disuelva 2 g de metavanadato de
amonio en 250 ml de agua caliente, enfre y adicione 450 ml de cido
perclrico al 70%. Gradualmente adicione la sol. de molibdato a la sol.
de vanadato con agitacin y diluya a 2 1.
Estndar de Fsforo. Prepare una solucin stock disolviendo 8.788 g de
Ortofosfato dihidrgeno potasio en agua y llvelo a 1 1. Prepare la
solucin de trabajo diluyendo la sol. stock 1 en 20 (Conc. de trabajo 0.1
mg P//ml).
Materiales y Equipo
32
Espectrofotmetro para leer a 400 nm
Matraces graduados de 100 ml
Procedimiento
1. Pase una alcuota como en la determinacin de Ca a un matraz de 100
ml y adicione 20 ml del reactivo de molibdovanato. Afrelo, mezcle y
deje reposar por 10 min.
2. Transfiera alcuotas del estndar de trabajo conteniendo 0.5, 0.8, 1.0 y
1.5 mg de P en matraces de 100 ml y trtelos como al anterior.
3. Lea la muestra a 400 nm ajustando el estndar de 0.5 mg a 100% de
transmisin.
4. Determine mg de fsforo en la muestra usando una curva estndar.

FIGURA 18
Determinacin de fsoforo en dietas e ingredientes alimenticios.
4.12. Determinacin de Cloruro de Sodio
Este mtodo permite determinar la cantidad de sal presente en harina de
pescado y otros ingredientes.

Reactivos
Solucin estndar 0.1N de Nitrato de Plata
Solucin estndar 0.1N de Tiocianato de Amonio
33
Indicador Frrico - Solucin acuosa saturada
Solucin de Permanganato de Potasio 6 % p/v
Solucin de Urea 5 % p/v
Acetona grado analtico
Acido Ntrico concentrado
Procedimiento
1. Pese 2 g de muestra en un matraz erlenmayer de 250 ml, humedezca la
muestra con 20 ml de agua, adicione con pipeta 15 ml de la solucin de
nitrato de plata y mezcle bien.
2. Adicione 20 ml de Acido Ntrico concentrado y 10 ml de la solucin de
Permanganato de Potasio y mezcle. Caliente continuamente la mezcla
hasta que el lquido se aclare y desaparezca los vapores nitrosos, enfre.
3. Adicione 10 ml de Solucin de Urea y deje reposar por 10 min.
4. Adicione 10 ml de acetona y 5 ml de indicador frrico y titule el exceso
de nitrato de plata con la solucin de Tiocianato hasta el punto final rojo-
caf.
Clculos
Calcule resultados como NaCl
%NaCI= (15.00 - ml 0.1N NH
4
CNS 0.585)/g de muestra


FIGURA 19
Determinacin de cloruro de sodio en harina de pescado y otros ingredientes
4.13. Determinacin de Potasio
Reactivos
34
Acido Clorhdrico concentrado.
Solucin estndar de Potasio: Para preparar solucin stock (500 ppm),
disuelva 0.477 g de Cloruro de Potasio y llvelo a 500 ml con agua
destilada. Para preparar el estndar de trabajo (10 ppm), diluya 1:50.
Aceite de oliva (puro)
Materiales y Equipo
Crisoles de Slice.
Fotmetro de flama
Mufla
Procedimiento
1. Seque 2 g de muestra en un crisol de slice a 100C para eliminar la
humedad. Adicione unas cuantas gotas de aceite de oliva y caliente
sobre la flama hasta que deje de producir flama.
2. Calcine a 500C en la mufla por 24 h, enfre y adicione 2 ml de HCI
concentrado para disolver el residuo.
3. Llvelo a 100 ml con agua destilada, tome 1 ml de la solucin y haga
una nueva dilucin a 100 ml con agua destilada.
4. Ajuste el fotmetro de flama para que de una lectura de 100 con el
estndar de 10 ppm y lea la solucin muestra.
5. Si la lectura no se encuentra entre 50 y 100 haga una dilucin al
momento para dar una lectura apropiada.



FIGURA 20
Determinacin del contenido de potasio en ingredientes alimenticios.
4.14. Cuantificacin de xido de cromo en heces y
alimentos (Furukawa y Tsukahara, 1966)
35
El xido de cromo es el marcador ms ampliamente utilizado durante la
evaluacin de la digestibilidad en dietas experimentales para peces. El mtodo
aqu presentado es una modificacin del propuesto por Furukawa y Tsukahara,
a fin de manejar micromuestras durante la determinacin del contenido de xido
de cromo en dietas y heces.
Reactivos
Acido ntrico concentrado, gr.
Acido perclrico, g.r.
Materiales y equipo
Espectrofotmetro
Digestor kjeldahl para tubos de 100 ml
Matraces kjeldahl de 100 ml
Matraces volumtricos de 25 ml
Procedimiento
Muela finamente el alimento y las heces, a las cuales se les habr eliminado
previamente escamas y cualquier otra materia extraa; mantngalos a
sequedad. Pese con precisin de 0.0001g de 50 a 100mg de muestra,
colquela en un matraz kjeldahl de 100 ml y pese nuevamente la charolilla para
ajustar peso de la muestra. Adicione 5ml de HNO
3
y ponga a digerir en
ebullicin suave por un mnimo de 30 min hasta que desaparezcan los vapores
amarillentos. En caso de que disminuya notablemente la cantidad de lquido y
contine habiendo vapores nitrosos, adicione otros 5ml de cido ntrico y siga
digiriendo. Al trmino la solucin debe ser clara, de color verdoso y no debe
desprender vapores ocres. Deje enfriar.
Ya fra la solucin, agregar cuidadosamente resbalando por las paredes del
matraz 3ml de cido perclrico. Realizar la adicin dentro de una campana de
extraccin y con mucho cuidado, ya que en caso de una digestin incompleta se
puede presentar una reaccin explosiva. Coloque nuevamente el matraz en el
digestor y contine la ebullicin hasta que la solucin vire de verde a amarillo
limn; apague el digestor y deje enfriar. Ya fro se debe formar un anillo rojizo
en el borde del lquido; en caso de no formarse o si el lquido se torna verde
nuevamente, volver a digerir hasta que el cambio sea permanente.
Pase el lquido fro a un matraz volumtrico de 25 ml, enjuagando el matraz
kjeldahl varias veces con agua destilada y afore. Ajuste a O el
espectrofotmetro con un blanco de reactivos y leer a 350 mm. El blanco se
prepara simultneo a la muestras usando solamente los cidos y agua
destilada.
Clculos
a) Calcule la cantidad de xido de cromo (mg) presente en la muestra:
X = ((Y - 0.0032)/0.2089)/4
Donde
Y = absorbancia

0.0032 y 0.2089 son constantes
b) Calcule el % de xido de cromo en la muestra:
O.C.% = 100(X/A)
36
Donde
X = peso del xido de cromo
A = peso de la muestra


FIGURA 21
Determinacin de xido de cromo en alimentos y heces.
4.15. Mtodo de Carpenter para la determinacin de Lisina
Disponible (Tejada, 1985)
El mtodo permite determinar la cantidad de lisina libre que reacciona con el l-
fluorodinitro benceno.
Reactivos
Solucin madre de Mono E N dinitrofenil - lisina HCI (p. m. 366.77, 39.85
% lisina) Disolver 314 mg en 250 ml de HCl concentrado. Se disuelve
lentamente, de manera que hay que iniciar su preparacin un da antes.
Solucin estndar diluida de DPN-lisina. Diluya 10 ml de la solucin
madre en 100 ml de agua destilada para formar el estndar. Hecho lo
anterior, 2 ml de la solucin contienen alrededor de 0.1 mg de lisina y
disuelto a 100 ml da una absorcin neta de alrededor de 04 a 435 nm
en celdilla de 1 cm.
Solucin de 1 - fluoro 2,4 dinitrobenceno (FDNB). Manjese con guantes
de plstico desechables. S el FDNB est slido colquese en balo de
37
agua caliente para que se funda, tome con una pipeta automtica
aproximadamente 0.4 ml y disuelva en 15 ml de alcohol etlico por
muestra. Debe prepararse diariamente.
Cloruro de metoxicarbonil (cloroformato de metilo). El MCC es inestable
por lo que se debe almacenar en refrigeracin. Manjese con cuidado.
Solucin de bicarbonato de sodio al 8% en agua destilada.
Eter etlico libre de perxidos.
Solucin de fenoftalena, 500 mg/l de alcohol etlico al 60%.
Solucin de hidrxido de sodio al 12%. Se usa para incrementar el pH a
8.5 durante la reaccin del MCC. Debe almacenarse en frasco de
plstico. Tener a la mano un gotero con HCI 1M para corregir cualquier
exceso.
Buffer de bicarbonato de sodio - carbonato, pH 8.5. Disuelva 19.5g de
NaHCO
3
y 1g de Na
2
CO
3
en 250 ml de agua destilada; ajuste el pH si es
necesario. Almacenar en un frasco bien lleno y bien cerrado para evitar
prdida de CO
2

Acido clorhdrico concentrado
Materiales y Equipo
Tamiz de 0.5 mm
Matraces de fondo redondo
Matraz volumtrico de 250 ml
Bao mara
Rotoevaporador
Aparato de reflujo
Papel filtro Whatman 541
Tubos de ensaye con tapn
Perlas de vidrio
Espectrofotmetro
Procedimiento
Muela la muestra para que pase el tamiz de 0.5 mm. La cantidad de muestra a
utilizar deber contener alrededor de 12mg de lisina disponible, lo que equivale
a 0.3 2g de la muestra. Psela a un matraz de fondo redondo. Agregue 23
perlas de vidrio y 10ml de NaHCO
3
, agitar suavemente para que la muestra no
se adhiera a las paredes.
Adicione 15 ml de FDNB y agite suavemente durante 2 horas. No permita que la
muestra se quede en las paredes. Evapore el etanol pero no el agua; en un
bao de agua hirviendo el matraz debe perder aproximadamente 12.5g.
Enfre y adicione 30ml de HCI 8.1M para neutralizar al NaHCO
3
. Sumando el
agua presente, se tendr un volumen de 40ml y una concentracin de cido de
6M. Reflujar suavemente durante 16 horas.
Desconecte el matraz y lave el refrigerante con un poco de agua. Filtre en
caliente a un matraz volumtrico de 250 ml. Enjuague el matraz y el filtro varias
veces con agua destilada y colecte en el matraz volumtrico; afore en fro con
agua destilada. En ocasiones se forma un precipitado de dinitrofenol que se
puede extraer con pipeta una vez precipitado, o se elimina con el ter.
Colocar 2 ml del filtrado en dos tubos con tapn, etiquetndolos A y B. Agregar
38
al tubo B 5 ml de ter y agita. Extraiga el ter (capa superior) con una pipeta
automtica. Coloque el tubo en un bao a 90 C hasta que se elimine todo el
ter y enfre.
Agregue una gota de fenoftalena al tubo, adicione gota a gota la solucin de
NaOH hasta que aparezca un ligero color rosado; aada 2ml de buffer de
carbonato y agregue dentro de una campana 0.5 ml de metilcloroformato. Tapar
el tubo y agitar vigorosamente, liberando la presin con cuidado. Despus de 5
10 min, adicione gota a gota 0.75 ml de HCI concentrado agitando para evitar
la formacin de espuma. Se extrae cuatro veces la solucin con ter como se
describi anteriormente. Elimine el ter residual en bao mara, enfre y lleve el
volumen 10 ml con agua destilada.
Durante las pausas de las manipulaciones del tubo B, extraiga tres veces con
ter el tubo A; elimine el ter residual y lleve a 10 ml con HCl. Lea la
absorvancia de ambos tubos a 435 nm en el espectrofotmetro contra agua
destilada. La lectura del tubo menos la del tubo B (blanco) es la absorvancia
atribuible al DNP - lisina.
Absorbancia del estndar DPN - Lisina
Coloque 2 ml de DNP-L diluido en dos tubos A y B siguiendo el procedimiento
ya indicado-Practicar hasta que se tenga confianza en las manipulaciones. La
absorbancia neta se usar para calcular las muestras problema. El blanco B
tiene generalmente una absorbancia de 0.01; si el valor es mucho mayor revisar
el procedimiento, especialmente el frasco de servicio, el pH del buffer de
carbonato, la longitud de onda a que se est leyendo y el ter libre de
perxidos.
Precauciones con alimentos de origen vegetal.
En alimentos de origen vegetal en ocasiones no se logra una hidrlisis total a
las 16 horas y como un tiempo ms largo se descompone el DNP-L, debe
hacerse una segunda digestin con materiales desconocidos. Para lograr esto,
despus de la digestin se filtra, se lava y se procesa el filtrado como se seal.
El residuo se coloca en un matraz de fondo redondo con HCI 6 M y algunas
perlas de vidrio (se pueden juntar los residuos de las rplicas); el volumen del
cido clorhdrico debe ser menor a 30 ml. Se deja en reflujo por 16 horas, se
filtra en caliente y se lleva a 100 ml segn el procedimiento ya descrito. Si el
resultado es muy pequeo se elimina, o de lo contrario, se hacen las
correcciones necesarias para el material.
Para determinar la prdida de DNP-L se debe calcular un factor de correccin,
el cual vara con el material. Para su clculo, consultar a: Makade, M.L. y
Liener, I.E., 1969. Anal. Biochem., 27:271.
Clculos
C = (Ws Au V 100 100)/Wu As a (cp)
Donde
C= g de lisina/16g de N
Ws= Peso del estndar expresado como mg de Lis en 2 ml; 0.1 s se prepara
como se indica.
Wu= Peso de la muestra en mg
As= Absorcin neta del estndar
Au= Absorcin neta del desconocido
V= Volumen del hidrolizado filtrado. Se recomienda 250 ml (menos por la
segunda digestin).
a= Alcuota del filtrado. Se recomiendan 2 ml.
CP= Protena cruda, 6.25 g N/100g material.
39
Para expresar el resultado como g lisina/Kg de PC, cambiar un 100 por 10 en la
frmula.
NOTA:
El material de vidrio puede tomar un tinte amarillento debido al dinitrofenol. Los
hidrolizados y soluciones de DNP-Lisina deben protegerse de la luz
especialmente a pH alcalino.


FIGURA 22
Determinacin de lisina disponible en ingredientes alimenticios.
4.16. Anlisis de Melazas
Los peces, segn su especie, presentan una capacidad diferencial para utilizar
carbohidratos en su dieta, por lo cual se considera importante contar con un
mtodo rpido para la determinacin de azcares totales disponibles.
Reactivos:
Solucin de Fehling (modificada por Soxhlet):
a. Disuelva 34.639g de Sulfato de Cobre 5H
2
O en agua destilada,
afore a 500ml, filtre.
b. Disuelva 173 g de tartrato de sodio y potasio 4.H
2
O y 50 g de
Hidrxido de Sodio en agua destilada, diluya a 500 ml, deje reposar
por 2 das y filtre a travs de asbesto preparado.
Estndar de Azcar invertida. Prepare una solucin stock adicionando
5ml de HCL (Sp. g 1.18) a 9.5g de sacarosa en solucin y diluya a 100ml
con agua destilada. Despus de almacenar por 2 das a temperatura
ambiente, afore a 1000 ml con agua destilada. Prepare soluciones de
trabajo que contengan 5mg/ml, para lo cual mida con una pipeta
volumtrica una alcuota de 100 ml de la solucin stock. Vace a un
matraz volumtrico de 200 ml y neutralice con una solucin de NaOH al
20%, usando fenoftalena como indicador, lleve a volumen y mezcle.
Acido Clorhdrico concentrado (Sp.g 1.18).
Acido Clorhdrico (0.5N).
Hidrxido de Sodio, Solucin 20%.
40
Indicador de Fenoftalena (1% en etanol).
Indicador de azul de metileno (1% en agua).
Materiales y Equipo
Calentador elctrico
Matraces erlenmayer de 500 ml
Procedimiento
Disuelva 8g de melaza y llvela a 500ml con agua destilada (filtre). Hidrolice
100 ml del filtrado con 5ml de HCI (Sp. g 1.18) y deje reposar por 24 h.
Neutralice con NaOH al 20% usando fenoftalena como indicador y diluya a 200
ml.
Estandarizacin de la Solucin Soxhlet: Mida 10ml de la solucin Soxhlet (a) y
(b) con una pipeta volumtrica y vace a un matraz erlenmayer, mezcle y
agregue 30ml de agua. Adicione con una bureta un volumen de estndar de
trabajo casi suficiente para reducir el Cobre en la solucin Soxhlet. Llvelo a
ebullicin y djelo hervir por 2 min., adicione 4 gotas de azul de metileno y
rpidamente complete la titulacin mientras est hirviendo, hasta que se
obtenga un color naranja brillante. Repita varias veces y determine el volumen
de solucin requerido para reducir completamente 20 ml de solucin Soxhlet.
Titulacin de Muestra: Primero realice una titulacin aproximada; pase a un
matraz 10ml de las soluciones (a) y (b), adicione alcuotas de 10ml de la
solucin muestra. Aada 40 ml de agua y llvelo a ebullicin. Si persiste el color
azul, titule con una solucin estndar de trabajo y calcule el contenido
aproximado de azcar en la muestra. Para determinar con precisin el
contenido de azcar, pase a un matraz 10 ml de las soluciones Soxhlet (a) y (b);
adicione una alcuota de la solucin muestra. El volumen de muestra usado
depender del contenido de azcar en la muestra. Adicione agua como se
indica en la tabla, mezcle y hierva. Durante la ebullicin, agregue estndar de
trabajo con una bureta hasta que la titulacin sea casi completa. Aada azul de
metileno y complete la titulacin.

VOLUMEN DE MUESTRA USADO EN LA TITULACION SOXHLET (AOAC, 1970)
ml de H
2
O ml de muestra g de muestra en alcuota Total como azcar invertida (%)
40 10 0.08 73
35 15 0.12 82-58
30 20 0.16 61-41
25 25 0.20 49-35
20 30 0.24 49-29
Calcule el % de azcar (como invertida) = (F - M) I 100/w
Donde:
F= Volumen de estndar necesario para reducir 20 ml de Solucin Soxhlet.
M= Volumen de solucin estndar de azcar requerido para completar la
titulacin
I= Peso de la azcar invertida en 1 ml de Standard de trabajo.
W= Peso de la muestra en la alcuota usada.
41

FIGURA 23
Determinacin de azcares totales disponibles en melaza

5. ANTIMETABOLITOS Y TOXINAS EN ALIMENTOS
El valor nutricional de un alimento depende en gran medida de la calidad de los
ingredientes utilizados, la cual se mide en funcin de su capacidad de promover
el crecimiento y mantener en buen estado a los organismos. En este sentido, el
origen y/o el tratamiento previo a que se someten los materiales influir sobre
su calidad, en funcin de la disponibilidad de nutrientes para usarse en las
funciones metablicas del animal, o tambin, el contenido de factores txicos
endgenos caractersticos de cada material, particularmente aquellos de origen
vegetal, que funcionan como antinutrientes afectando negativamente al
organismo.
En este sentido, existen varias tcnicas que permiten conocer la disponibilidad
de un nutriente determinado, principalmente aminocidos, as como tambin,
determinar el contenido de sustancias txicas a fin de eliminarlas o desechar el
material. En este documento se incluyen los mtodos para anlisis de los
antinutrientes ms comunes encontrados en las protenas vegetales.
5.1. Mtodo Rpido Potenciomtrico para Medir Actividad
Uresica en Harina de Soya
42
Este mtodo determina la ureasa residual en harina de soya y sus derivados de
acuerdo al mtodo Caskey-Knapp (1944) modificado por AACC (1969) y Qum.
Leticia Comar (Nutrimentos del Sureste, Mrida, Yucatn, Mxico). El resultado
esta dado en unidades de pH proporcionales a la actividad uresica. Los
valores aceptables oscilan entre 0.05 y 0.5; valores menores indican
sobrecocimiento y mayores falta de cocimiento.
Reactivos
Solucin bufer de fosfatos 0.05M. Disuelva 3.403g de fosfato de potasio
monobsico g.r. (KH
2
PO
4
) en 100ml de agua destilada recin hervida.
Disuelva 4.355g de fosfato de potasio dibsico g.r. (K
2
HPO
4
) en 100ml
de agua destilada. Combine ambas soluciones, adicione 10ml de
indicador rojo de fenol al 0.1% y afore a 1000ml con agua destilada.
Ajuste el pH a 7.0 con un cido o base fuerte antes de usarse. En
refrigeracin tiene una vida til de 90 das.
Solucin bufer de urea. Disuelva 15g de urea g.r. en 500ml de sol. bufer
de fosfatos. Ajuste el pH a 7.0 como en el caso anterior.
Indicador rojo de fenol al 0.1%. Disuelva 0.1g de rojo fenol en 15ml de
sol. de hidrxido de sodio 0.02N y afore a 100ml.
Materiales y Equipo
Bao mara con agitacin, precisin 0.5C.
Medidor de pH con electrodo de vidrio y calomel adecuado para medir
muestras de 5ml, precisin de 0.02 unidades de pH y compensacin
de temperatura.
Tubos de ensaye, 20 150mm con tapn de hule
Vasos de precipitado de 10ml
Procedimiento
1. Pese 0.2g de harina de soya finamente molida (sin sobrecalentar) por
duplicado y colocar en tubos de ensaye (A y B); adicione al tubo A 10ml
de la solucin bufer de urea. Tape, agite e incube en bao mara por 30
min a 30 0.5C.
2. Despus de 5 min, adicione al tubo B 10ml de sol. bufer de fosfatos,
tape, agite y coloque en el bao mara.
3. Agitar cada uno de los tubos cada 5 minutos (seis agitaciones en 30
min).
4. Retire el tubo A del bao mara, decante el sobrenadante en un vaso de
pp de 10ml y mida el pH dentro de un perodo menor a 3 min. Repita el
procedimiento con el tubo B 5 minutos despus del A.
5. Calcule el ndice de actividad uresica como unidades de pH resultantes
de la diferencia de las lecturas del tubo A menos el tubo B y determine la
calidad de la muestra segn la tabla de ejemplo incluida:
IAU= pH tubo A (muestra + bufer urea) - pH tubo B (muestra + bufer
fosfatos)

43
Grado de cocimiento Unidades de pH pH tubo A pH tubo B Color
Cruda 1.9 8.80 6.90 Rojo
Subcocida 0.80 7.60 6.80 Rosa
Cocido adecuado 0.30 7.10 6.80 Rosa
Cocido adecuado 0.08 6.98 6.90 Rosa tenue
Sobrecocida 0.03 6.93 6.90 Ambar

FIGURA 24
Determinacin de actividad uresica en harina de soya y sus derivados.
5.2. Gosipol Libre en Harina de Semilla de Algodn
Este antinutriente es caracterstico de la harina de algodn, siendo necesario
determinar su contenido debido a sus efectos adversos sobre los organismos
alimentados con la semilla, aun cuando los peces aparentemente resisten
mayores concentraciones del alcaloide debido al elevado contenido proteico de
su dieta. En este documento se describen dos mtodos, el primero para harinas
normales y el segundo para harinas que han sido tratadas qumicamente y
contienen dianilinogosipol.
Reactivos:
Acetona acuosa, 7 partes de acetona en 3 partes de agua destilada
(v/v).
Solucin de Acetona acuosa - Anilina. En 700 ml de acetona y 300 ml de
agua, adicione 0.5ml de anilina purificada. Prepare diariamente.
Solucin acuosa de alcohol isoproplico, 8 partes de alcohol isoproplico
+ 2 partes de agua destilada (v/v).
Anilina purificada. Destile anilina grado reactivo sobre una pequea
cantidad de polvo de zinc, descartando el primero y ltimo 10% del
destilado. Almacene refrigerada en un frasco mbar de vidrio. Estable
por varios meses.
44
Solucin estndar de Gosipol:
a. Disuelva 25 mg de gosipol puro en acetona libre de anilina y
transfiera a un matraz aforado de 250 ml, usando 100 ml de
acetona. Adicione 75 ml de agua destilada, afore con acetona y
mezcle.
b. Tome 50 ml de la solucin (a), adicione 100 ml de acetona pura,
60 ml de agua destilada, mezcle y diluya a 250 ml con acetona
pura. La solucin (b) contiene 0.02 mg de gosipol/ml y es estable
por 24 h en oscuridad.
Materiales y Equipo
Agitador mecnico.
Espectrofotmetro
Matraces erlenmayer de 250 ml
Matraces Volumtricos de 25 y 250 ml
Bao mara
Procedimiento
Muela la muestra para que pase la malla de 1 mm, cuidando de no
sobrecalentarla. Tome aproximadamente 1 g de la muestra y agrguele 25 ml
de acetona pura. Agite por unos minutos, filtre y divida el filtrado en dos. A una
porcin, adicinele una lenteja de Hidrxido de Sodio y caliente en bao mara
por unos minutos. Un extracto ligeramente amarillo que no cambia de color con
el Hidrxido indica que la harina no ha sido tratada, proceda con el mtodo 1. Si
se obtiene un color rojo-anaranjado profundo, indica la presencia de
dianilinogosispol y requiere del mtodo 2.
Mtodo 1
Pese 0.51 g de muestra, dependiendo de la cantidad de gosipol esperada, en
un matraz erlenmayer y adicione 2 3 perlas de vidrio. Agregue 50 ml de
solucin de acetona acuosa, tape el matraz y agite por una hora. Filtre, deseche
los primeros mililitros de filtrado y luego tome dos alcuotas iguales (210 ml,
dependiendo del contenido de gosipol esperado) y pselas a matraces
volumtricos de 25 ml. Diluya una de las alcuotas, afore a volumen con alcohol
isoproplico acuoso (solucin a), mientras la otra alcuota (solucin b).
Adicinele 2 ml de anilina purificada, caliente en bao mara (90100C) por 30
min. junto con un blanco conteniendo 2 ml de anilina y un volumen de solucin
acuosa de acetona igual a la alcuota. Retire la solucin b y el blanco, adicione
suficiente alcohol isoproplico acuoso para efectuar solucin homognea, y
enfra a temperatura ambiente en un bao con agua. Afore con alcohol
isoproplico acuoso.
Lea las muestras a una absorbancia de 400 nm en el espectrofotmetro. Ajuste
el instrumento a 0 absorbancia con alcohol isoproplico acuoso y determine la
absorbancia de la solucin (a) y el blanco de reactivo. Si el blanco est abajo de
0.022 de absorbancia contine con el anlisis, de lo contrario repita el anlisis
usando anilina recin destilada.
Determine la absorvancia de la solucin (b) con el blanco de reactivo ajuste a 0
absorvancia. Calcule la absorvancia corregida de la alcuota: absorbancia de la
solucin (b) menos absorbancia de la solucin (a). Determine los mg de gosipol
libre presentes en la solucin de la muestra usando la curva de calibracin.
Mtodo 2.
45
Pese 1 g de muestra en un matraz erlenmayer, agregue 50 ml de acetona
acuosa, agite y filtre como el anterior. Agregue alcuotas duplicadas del filtrado
(de 2 a 5 ml, dependiendo de la cantidad esperada de gosipol libre) a matraces
volumtricos de 25 ml. Afore una de las alcuotas (solucin a) con el alcohol
isoproplico acuoso y djelo reposar 30 minutos antes de leerlo en el
espectrofotmetro. Afore la otra alcuota (solucin b) como en el procedimiento
(1), determine las absorbancia de las soluciones a y b como el procedimiento
anterior y calcule el contenido aparente de gosipol de ambas soluciones usando
la curva de calibracin.
Preparacin de la Curva de Calibracin.
Tome alcuotas duplicadas de 1, 2, 3, 4, 5, 7, 8 y 10 ml de estndar de gosipol
0.02 mg/ml y colquelas en matraces volumtricos de 25 ml. Diluya una serie
(solucin A) aforando con alcohol isoproplico acuoso y determine la
absorbancia como en el anterior. A la otra serie (solucin b) adicinele 2 ml de
anilina purificada y proceda como anteriormente. Prepare un blanco de
reactivos usando 2 ml de anilina y 10 ml de acetona acuosa, calentada junto
con el estndar. Determine absorbancia como en el procedimiento (1) y calcule
la densidad ptica corregida para cada solucin estndar:
Absorbancia Corregida = (Abs. solucin b - Abs. solucin a)
Trace la curva estndar, graficando absorbancia corregida contra concentracin
de gosipol en 25 ml.
Calule % de gosipol libre en harinas normales.
Gosipol libre % = 5G/WV
Donde:
G= Lectura en la Grfica
W= Peso de la muestra
V= Volumen de la alcuota usada.
Para harinas qumicamente tratadas.
Gosipol libre % = 5(B - A)/WV
Donde:
A = mg Gosipol libre aparente en alcuota (a)
B= mg Gosipol libre aparente en alcuota (b)

FIGURA 25
Determinacin de gosipol libre en harinas de semilla de algodn.
46
5.3. Determinacin de Tioglucsidos
El mtodo descrito proporciona el contenido aproximado de tioglucsidos pero
no determina tioglucsidos e isocianatos individuales.
Reactivos y Aparatos
Solucin Cloruro de Bario 5%
Matraces volumtricos de 600 ml
Bao de vapor
Procedimiento
1. A 10 g de harina (desengrasada por extraccin Soxhlet) adicinele 250
ml de agua destilada, hidrolice a 54 C por 1 h y caliente a ebullicin por
2 h., manteniendo el volumen constante.
2. Filtre, reteniendo el filtrado y lave el residuo tres veces con 50 ml de
agua caliente, agregando el lquido al filtrado inicial y afore a 600 ml.
3. Precipite el sulfato de bario por calentamiento y adicionando un exceso
de solucin de Cloruro de bario. Djelo en un bao de vapor por algunas
horas y filtre.
4. Calcine en una mufla y pese el precipitado.
Calcule el contenido aproximado de tioglucsido como:
% Tiogl = (M. wt. tioglucsido Peso de BaSO
4
) 100/M.wt. BaSO
4
Peso
Muestra


FIGURA 26
Determinacin de tioglucsidos en ingredientes alimenticios.
5.4. Anlisis de Aflatoxinas
47
El mtodo que se incluye es adecuado para materiales como harina de
cacahuate, harina de copra y harina de palma kernel; para detalles del mtodo,
as como para procedimientos alternativos, refirase a Methods of Aflatoxin
Analysis por B.D. Jones (1972), Report No. G70, Tropical Products Institute,
London.
Reactivos:
Cloroformo (G.R.)
Eter etlico (G.R.)
Mezcla cloroformo/metanol (95/5 v/v)
Celita, tierra de diatomeas
Gel de slica G (Merck)
Estndares Cualitativos. Permiten distinguir marcas de aflatoxina de
otras manchas fluorescentes que puedan estar presentes. Se puede
usar con este propsito harina de cacahuate conteniendo aflatoxina B
obtenible en el Inst. de Productos Tropicales de Londres.
Materiales y Equipo
Placas para cromatografa de capa fina 20 20 cm.
Lmparas UV pico de emisin a 365
Botellas de boca ancha de 250 ml
Micropipetas
Agitador
Rotoevaporador
Procedimiento
1. Pese 10 mg del material en un frasco de boca ancha y mzclelo con 10
ml de agua (si se usa material con alto nivel de grasa, ser necesaria
una extraccin previa con soxhlet). Adicione 100 ml de cloroformo y
agite por 30 min.
2. Filtre el extracto a travs de la celita, tome 20 ml del filtrado y llvelo a
25 ml (solucin a). Tome otros 20 ml del filtrado y concntrelos a 5 ml
(solucin b).
3. Prepare placas de cromatografa agitando 100 g de gel de slica G con
220 ml de agua por 20 min y aplicando la mezcla a las placas con el
aparato apropiado, con un grosor de 509. Djela reposar por 1 hora y
seque a 100C.
4. Coloque gotas de 10 y 20 l de solucin b y 15 y 10l de solucin a en la
placa, junto con una gota de estndar cualitativo, en una lnea a 2 cm del
fondo de la placa y al menos a 2 cm de cada lado. Realice la aplicacin
bajo luz tenue.
5. Revele la placa en ter etlico a una altura de 12 cm, djela secar en luz
tenue y luego vulvala a revelar en mezcla de cloroformo/metanol hasta
una altura de 10 cm desde la lnea basal.
6. Examine la placa en un cuarto obscuro a 30 cm de la fuente de UV. La
presencia de una mancha azul fluorescente a Rf 0.50.55 indica
aflatoxina B (asegrese de que la mancha del estndar se encuentre
48
tambin en ese rango). la presencia de una segunda mancha a Rf 0.45
0.5 indica aflatoxina G.
La toxicidad de una muestra puede ser clasificada en trminos de aflatoxinas B
y G de acuerdo con la tabla siguiente:
TABLA COMPARATIVA PARA DETERMINAR TOXICIDAD DE AFLATOXINAS B Y G
Conc. de Aflatoxina (mg/kg)
Volumen aplicado (ml)
No fluoresencia c/fluoresencia
Toxicidad de fluorescencia observada
5 (sol. A) <1000 >1000 Muy alta
10 (sol. A) <500 5001000 Alta
10 (sol. B) <100 100500 Media
20 (sol. B) <50 50100 Baja
Tomado de Harris, 1980

FIGURA 27
Determinacin cromatogrfica de aflatoxinas en ingredientes alimenticios.
5.5. Mtodo Colorimtrico para la Determinacin de
Mimosina (Matsumoto y Sherman, 1951).
La mimosina es un aminocido libre muy comn en algunas leguminosas,
incluyendo a Leucaena leucocephala y L. glauca, consideradas excelentes
fuentes de protena para la alimentacin animal. Su presencia limita el uso de
las hojas y semillas en la alimentacin de monogstricos, ya que afecta la
funcin de la tiroides, provocando reduccin del crecimiento.
Reactivos
Solucin de Mimosina, 0.1% en HCl 0.1N (mimosina de L. glauca
recristalizada)
Solucin de Cloruro frrico al 0.5% en HCl 0.1N
Carbn Activado.
Acido Clorhdrico 0.1N.
49
Materiales y Equipo
Colormetro (usar espectrofotmetro 535 nm) Klett-Summerson con
Filtro No. 54.
Matraz Kitazato.
Tubos de ensaye.
Crisol de Filtracin.
Vasos de precipitado de 250 ml.
Vasos de precipitado de 150 ml.
Matraz Volumtrico de 250 ml.
Matraz Volumtrico de 100 ml.
Procedimiento
Extraccin: Coloque 1.25 g de hoja seca de leucaena en un Vaso de precipitado
de 250 ml y digiera con 100 ml de HCl 0.1N por hora con agitacin constante,
deje enfriar y transfiera todo a un matraz volumtrico de 250 ml, agite bien y
deje reposar hasta que los slidos se asienten en el fondo.
Clarificacin: Transfiera 10 ml de sobrenadante a un V.P. de 150 ml con 30 mg
de Carbn. Agregue agua para llevar el volumen a 25 ml, cbralo con un vidrio
de reloj y caliente a ebullicin por 15 min., deje enfriar y filtre con vaco en el
crisol de filtracin; el filtrado es colectado en un tubo colocado en el matraz
kitazato. Enjuague el vaso de precipitado y el material en el crisol con 10 ml de
HCl 0.1N dividido en tres porciones. Enjuague finalmente el crisol con 5
pequeas porciones de agua.
Determinacin Colorimtrica:
Transfiera el lquido obtenido a un matraz volumtrico de 100 ml, agregue 4 ml
de solucin de cloruro frrico al 0.5% en HCl 0.1N y afore con agua. El pH
deber ser entre 1.5 y 2.5. Lea en el Colormetro y calcule la cantidad de
mimosina en una curva de calibracin.
Curva de Calibracin: Disuelva 0.1046 g de mimosina pura en HCl 0.1N y afore
a 100 ml con el cido. La solucin contiene 0.1% de mimosina. Coloque 1 ml de
solucin de mimosina en un matraz volumtrico de 100 ml y adicione 10 ml de
HCl 0.1N y 4 ml de la solucin de cloruro frrico al 0.5% y afore con agua. Lea
la intensidad del color en el Colormetro (espectro 535 nm). Use agua destilada
como referencia y repita el procedimiento usando 2,3,4 y 5 ml de solucin de
mimosina. Se obtiene una lnea al graficar la lectura del Colormetro contra la
concentracin.
50

FIGURA 28
Determinacin colorimtrica de mimosina.
5.6. Mtodo Colorimtrico para la Determinacin de
Canavanina (Archibald, 1946)
Las semillas y hojas de leguminosas y en particular las de canavalia (Canavalia
ensiformis) y sesbania (Sesbania spp.) contienen cantidades variables del
aminocido libre canavanina, el cual es txico para animales monogstricos. El
mtodo permite determinar la cantidad del antinutriente en ingredientes
alimenticios.
Reactivos
Buffer fosfato 1 M, pH 7.2. Mezcle 34.5 g de NaH
2
PO
4
.H
2
O con 130.6g
de K
2
PO
4
y ajuste el volumen a 1 litro
Solucin de nitroprusiato de sodio al 2%. Se debe usar solucin recin
preparada. Es estable por una semana cuando se almacena en
obscuridad a 04C.
Perxido de hidrgeno (30% H
2
O
2
)
Solucin de carbonato de potasio al 20%
Solucin stock de canavanina. 2.5mg de canavanina/ml. Almacenar en
hielo seco
Solucin estndar de canavanina. Lleve 1 ml de la solucin stock a 10
ml con agua
Reactivo de acuoprusiato. Mezcle 0.5ml de la solucin de carbonato al
20% y 0.4 ml de H
2
O
2
con 10ml de la solucin de nitroprusiato. Deje
reposar por 30 min a temperatura ambiente (2025C). Deber
prepararse diariamente. El uso de cantidades mayores de perxido
disminuye el color obtenido con la canavanina.
Materiales y Equipo
51
Tubos de ensaye
Colormetro
Espectrofotmetro
Procedimiento
1. Ponga en un tubo de ensaye una muestra de 1 ml de extracto de la
muestra, conteniendo 00.25 mg de canavanina, se le adicionan 0.5 ml
de buffer fosfato y 0.5 ml de reactivo de acuoprusiato. Maneje de la
misma manera blancos conteniendo 0.2, 0.5, 0.8, y 1 ml de solucin
madre diluida y llevados a 1 ml con agua, as como tambin un blanco
de reactivos con 1 ml de agua, tratados con el fosfato y acuoprusiato.
2. Mezcle vigorosamente y guarde los tubos en un gabinete obscuro; se
desarrollar una coloracin rojiza en presencia de canavanina.
3. Despus de 2 horas lea en un colormetro o espectrofotmetro. En este
ltimo, ajuste a una longitud de onda de 520 nm y el blanco a una
densidad ptica de cero. Puede usar cubetas del espectrofotmetro para
desarrollar el color; si usa cubetas de ms de 2 ml, puede adicionarles
hasta 10 ml de agua despus de las 2 horas de incubacin para
desarrollo del color.
Clculos
Se grafica la densidad ptica de cada estndar contra su cantidad
correspondiente de canavanina y el contenido de canavanina de las muestras
se calcula a partir de la curva.

FIGURA 29
Determinacin colorimtrica de canavanina en ingredientes alimenticios.
52
5.7. Determinacin de Acido Cianhdrico
El cido cianhdrico se encuentra de manera natural en diferentes materiales
como son la semilla de lino, harina de yuca y algunas semillas de leguminosas.
Este mtodo permite determinar el cido libre o en forma de glucsido, para lo
cual, la muestra se suspende en agua, se libera el cido mediante enzimas y se
separa por destilacin para colectarse en una solucin de nitrato de plata
acidificada.
Reactivos
Antiespumante (Silicona)
Acido ntrico (d= 1.42g/ml)
Solucin de amonio: Prepare diluyendo un volumen de hidrxido de
amonio (d=0.88 g/ml) en dos volmenes de agua.
Sulfato frrico amoniacal, solucin saturada
Suspensin de almendras dulces. Triture 20 almendras dulces
blanqueadas en 100 ml de agua a 3740 C. Asegrese de que no
existe cido cianhdrico en 10 ml de la suspensin usando papel de
picrato de sodio o corriendo un blanco testigo como se describe ms
adelante
Solucin de acetato de sodio, neutral a la fenoftalena: 10g de acetato de
sodio anhidro en 100 ml de agua destilada.
Solucin 0.02N de tiocianato de amonio
Solucin 0.02N de nitrato de plata.
Materiales y Equipo
Estufa regulada a 3738 C
Aparato para destilacin de vapor
Matraz de fondo plano de 1000 ml con tapn esmerilado
Bao de aceite
Bureta graduada a 0.05 ml
Procedimiento
Pese con exactitud de 0.005 g aproximadamente 20 g de la muestra preparada,
colquela en un matraz de fondo plano de 1000 ml, adicione 50 ml de agua y 10
ml de suspensin de almendras dulces. Tape el matraz y pngalo en la estufa
durante 16 horas a 3738 C. Enfre a temperatura ambiente, adicione 80 ml de
agua, 10 ml de solucin de acetato de sodio y una gota de antiespumante.
Conecte el matraz al aparato de destilacin y colquelo en el bao de aceite
previamente ajustado a una temperatura ligeramente superior a 100 C; destile
200300 ml de lquido pasando una corriente de vapor a travs del matraz y
calentando suavemente el bao de vapor. Colecte el destilado en un matraz
erlenmayer protegido de la luz conteniendo exactamente 50ml de solucin de
nitrato de plata 0.02N y 1ml de cido ntrico. Asegrese de que la extensin del
condensador est sumergida en la solucin de nitrato de plata.
Transfiera el contenido del matraz erlenmayer a un matraz aforado de 500 ml y
llvelo al volumen con agua, mezcle y filtre. Remueva 250 ml del filtrado,
adicione aproximadamente 1 ml de sulfato frrico amoniacal y titule el exceso
de nitrato de plata con la solucin de tiocianato de amonio. Si se desea, se
53
puede correr un blanco siguiendo el mismo procedimiento con 10ml de
suspensin de almendras dulces omitiendo la muestra.
Expresin de resultados
Si el blanco indica que la solucin de nitrato de plata ha sido consumida, reste
su valor del volumen consumido por la destilacin de la muestra. 1 ml de 0.02N
AgNO
3
0.54mg de HCN. Exprese el resultado como porcentaje de la muestra.
NOTA: Si la muestra (ej. frijoles) contiene una elevada cantidad de azufre, se
formar un precipitado negro de sulfato de plata, el cual se filtra junto con el
depsito de cianuro de plata. La formacin de este precipitado consume
solucin de nitrato de plata y su efecto debe ser eliminado para el clculo de
contenido de HCN, para lo cual, trate el depsito sobre el papel filtro con 50ml
de amonaco a fin de disolver el cianuro de plata. Lave el residuo en amonaco
diluido y determine su contenido de plata. Convierta el valor a ml de solucin
0.02N de solucin de nitrato de plata y rsteselo al volumen de solucin de
nitrato de plata consumida por el destilado de la muestra.

FIGURA 30
Determinacin de cido cianhdrico en ingredientes alimenticios.
5.8 Taninos en Plantas y Forrajes. (Krishna y Ranjhan,
1980)
Los taninos son glucsidos de polipptidos solubles en agua presentes en
muchas plantas, con un sabor agrio astringente, confiere sabor y olor
indeseable a los alimentos. Afectan la utilizacin de las protenas debido a que
ligan a la lisina, hacindola indisponible para animales monogstricos.
Reactivos
54
Solucin 0.1N de cido oxlico. 1 ml = 0.006235 g de cido quercitnico
0.0008g 0
2
absorbido
Solucin de permanganato de potasio. Disuelva 1.333g de KMnO
4
en un
litro de agua y estandarice contra el cido oxlico.
Solucin ndigo. Disuelva 6g de indigotin disulfonato de sodio en 500ml
de agua mediante calentamiento, enfra y adicione 50ml de cido
sulfrico. Diluya a 1 litro y filtre.
Procedimiento
1. Extraiga 2g de muestra durante 20 horas con ter anhidro. Hierva el
residuo por 2 horas con 300ml de agua, enfre, diluya a 500 ml y filtre.
2. Mida 25 ml de la infusin dentro de una cpsula de porcelana de 2 litros,
adicione 20ml de la solucin de ndigo y 750ml de agua. Adicione la
solucin estndar de permanganato, 1 ml a la vez, hasta que cambie el
color azul a verde, luego agregue otras gotas hasta que se torne de
color amarillo dorado.
3. De manera similar, titule una mezcla de 20ml de solucin de ndigo y
750ml de agua. Multiplique la diferencia entre las titulaciones por el
factor deseado para obtener cido quercitnico u oxgeno absorbido.
55

FIGURA 31
Mtodo simple para la determinacin de taninos en ingredientes alimenticios
5.9. Mtodo Simple para la Determinacin de Acido Ftico
(Wheeler y Ferrel, 1971).
El cido ftico se puede encontrar en algunas semillas como ajonjol, trigo, arroz,
avena, sorgo, cebada, etc. Su presencia puede provocar deficiencias de fsforo
en monogstricos por ligar y formar fitatos indigeribles que hacen indisponible
ese elemento; afecta tambin la disponibilidad de calcio, magnesio o el fierro
con los que forma el complejo fitina.
Reactivos
Solucin de cido tricloroactico (ATA) al 3%
Solucin concentrada de FeCl
3

Solucin de sulfato de sodio al 3% en ATA
Solucin 1.5N de hidrxido de sodio
Solucin 3.2N de HNO
3

56
Solucin 1.5M de KSCN
Solucin FeCl
3
- ATA que contenga 2 mg de Fe
2
en sol 3% ATA
Materiales y equipo
Matraz erlenmayer de 125 ml
Tubos cnicos para centrfuga
Matraz volumtrico de 100 ml
Bao mara
Agitador mecnico
Espectrofotmetro
Centrfuga de laboratorio
Embudos
Papel filtro Whatman 2
Procedimiento
1. Coloque en un matraz erlemayer de 125 ml una muestra finamente
molida (40 mallas), estimada para contener de 5 a 50 mg de fitato-P.
Extraiga durante 30 min con 50 ml de solucin al 3% de ATA bajo
agitacin constante.
2. Centrifuge la suspensin y transfiera una alcuota de 10 ml del
sobrenadante a un tubo de centrfuga cnico. Agrguele 4 ml de la
solucin de FeCl
3
preparada para contener 2 mg de Fe
2
soplando
rpidamente la pipeta.
3. Caliente durante 45 min el tubo con la muestra en un bao mara a 90
100C. Si el sobrenadante no est claro despus de 30 min adicione 1
2 gotas de la sol. al 3% de sulfato de sodio en ATA y contine con el
calentamiento. Centrifuge por 1015 min y decante con cuidado el
sobrenadante. Lave dos veces el precipitado con 2025 ml de solucin
de ATA al 3% dispersndolo bien y calentndolo en agua a ebullicin por
510 min y centrifuge. Finalmente repita una vez el lavado con agua.
4. Disperse el precipitado en un poco de agua destilada, adicione 3 ml de
la solucin 1.5N de NaOH y mezcle. Lleve el volumen a
aproximadamente 30 ml con agua destilada y caliente en agua a
ebullicin durante 30 minutos. Filtre en caliente (cuantitativamente) con
un papel de retencin moderada (Whatman 2 SyS 597).
5. Lave el precipitado con 6070 ml de agua destilada caliente y deseche
el filtrado. Si se desea hacer determinacin de fsforo se puede usar el
filtrado. Disuelva el precipitado en el papel con 40 ml de la solucin 3.2N
de HNO
3
pasndolo a un matraz volumtrico de 100 ml. Lave varias
veces el papel con agua destilada colectndola en el matraz. Enfre la
muestra a temperatura ambiente y afore con agua destilada.
6. Transfiera una alcuota de 5 ml a un matraz volumtrico de 100 ml y
diluya a aproximadamente 70 ml. Agregue 20 ml de la solucin 1.5M de
KSCN y afore con agua destilada. Lea de inmediato (dentro de un lapso
de 1 min) en el espectrofotmetro a 480 nm.
7. Corra un blanco de reactivos con cada muestra. Calcule el contenido de
fierro a partir de un estndar de Fe(NO
3
)
3
corrido al mismo tiempo o
mediante una curva estndar preparada con anterioridad.
57
Clculos
Calcule el fitato-P a partir de los resultados de fierro, asumiendo una tasa
molecular de 4:6 fierro:fsforo


FIGURA 32
Mtodo simple para la determinacin de cido ftico en ingredientes
alimenticios.
5.10. Determinacin de Saponinas en Vegetales y
Alimentos (Fenwick y Oakenfull, 1983)
Las saponinas se pueden encontrar en una gran variedad de plantas incluyendo
la alfalfa, soya y semillas de leguminosas, habindose demostrado un efecto
negativo sobre el crecimiento de monogstricos. Es un antinutriente estable al
calor.
Reactivos
Acetona G.R.
Metanol
Solucin n-butanol-metanol-amonaco concentrado (3.5:1:2.5)
Solucin estndar de saponina purificada en metanol
Solucin de cido sulfrico en metanol (100 ml por litro)
Materiales y equipo
Extractor soxhlet
Rotoevaporador
Densitmetro con graficador
Planmetro
Desecador
58
Placa de gel de slica para cromatografa (Kieselgel 60 F-254 Merck)
Procedimiento
Muela finamente la muestra y squela a peso constante. Pese alrededor de 40
g y colquela a reflujo con acetona en el extractor soxhlet por al menos 24
horas para remover lpidos, pigmentos, etc. Cambie el solvente por metanol y
contine la extraccin por al menos otras 24 horas. Deje enfriar el extracto
metanlico y llvelo a 250 ml con metanol.
En este punto hay una modificacin al mtodo propuesta por Miriam Monforte
(CICY, Mrida, Yucatn, Mxico). En lugar de llevarlo a 250 ml como sugiere el
mtodo original, es ms recomendable concentrar la muestra, lo que permite
cuantificar cantidades muy pequeas de saponina, para lo cual, pase el extracto
metanlico a un rotoevaporador y concentre a sequedad. Resuspenda el
residuo con un mnimo de metanol y pselo a un vial previamente pesado; si no
se va a usar de inmediato, seque con nitrgeno y gurdelo en desecador. Pese
el vial con la muestra seca y calcule el peso del residuo. Para utilizar la muestra,
resuspenda con una cantidad conocida de metanol (alrededor de 1 ml).
Cromatografa cualitativa en capa fina
Coloque puntos del extracto sobre una placa de gel de slica y revlelos con una
solucin n-butanol-etanol-amonaco concentrado (3.5:1:2.5). Se pueden aplicar
tres diferentes mtodos para identificar las manchas de saponina: (1) asperson
con cido actico-anisaldeido; (2) tratamiento con nitrato de plata seguido de
hidrxido de sodio y (3) tratamiento con una suspensin de eritrocitos en buffer
isotnico. Para mayores detalles consulte a Fenwick y Oakenfull (1981).
Cromatografa cuantitativa en capa fina
Coloque series de puntos con volmenes conocidos del extracto y de una
solucin estndar de saponina sobre las placas de cromatografa. Los puntos
deben ser colocados de tal manera que cada punto de extracto vaya al lado de
los de estndar de saponina. Revele las placas de la misma manera que en el
apartado anterior y las manchas deben ser visualizadas mediante la asperson
de una solucin de cido sulfrico en metanol, seguida de calentamiento a 110
C por 30 min. Mida la intensidad de las manchas de saponina por medio de un
densitmetro y calcule las reas de los picos en el graficador con un planmetro.
los resultados son expresados como la relacin (R) de las reas de los picos de
la muestra desconocida con respecto a la del estndar.
Se ha determinado que la concentracin de saponina en la muestra (en g) es
proporcional al cuadrado de las reas relativas (R
2
). Grafique R
2
contra el
volumen de la gota de extracto metanlico colocada en la placa. La pendiente
de la lnea (calculada por el mtodo de cuadrados mnimos), divido entre la
pendiente de una lnea obtenida de una curva patrn, dar la concentracin de
la saponina en el extracto y de esa manera, el contenido de saponina en la
muestra. El mtodo puede tener un error experimental acumulado de 20%.

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FIGURA 33
Determinacin de saponinas en ingredientes alimenticios

6. REFERENCIAS
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