Sntesis de RNA

Todos los organismos vivos deben ser capaces

de almacenar y preservar su informacin
gentica.
Todos los organismos vivos deben ser capaces
de transmitir su informacin gentica a las
generaciones siguientes y futuras.
Todos los organismos vivos deben ser capaces
de expresar la informacin gentica que
contienen porque ella es la que lleva la
informacin para la ejecucin y regulacin
de todos los procesos que implica la vida.
Para que la informacin gentica almacenada en el DNA pueda
realizar su funcin debe haber un mecanismo que le permita ser
expresada o transmitida.
Este mecanismo se inicia por la transcripcin de la informacin
contenida en el DNA en una molcula que pueda ser leda y
destruida segn sea conveniente para el funcionamiento celular.
El Mecanismo de Complementaridad hace posible la cesin
exacta de la informacin gentica transcribindola en una
molcula de RNA cuya secuencia de bases es una copia exacta de
una secuencia complementaria de DNA.
El DNA mismo slo debe funcionar como molde y no debe ser
alterado durante el proceso de transcripcin de manera que la
informacin pueda ser conservada y leda una y otra vez sin
modificaciones, cada vez que sea requerida para el mantenimiento
de la homeostasis.
TRANSCRIPCIN
1) Aspectos generales
2) Transcripcin en Procariotes
3) Transcripcin en Eucariotes
4) Mecanismos reguladores
Se refiere al sistema fundamental de mantenimiento y flujo de la
informacin gentica en los organismos vivos.







La informacin gentica contenida en el DNA se mantiene mediante su
capacidad de replicacin.
La informacin contenida en el DNA se expresa:
1. Mediante el proceso de transcripcin, paso por el que la
informacin se transfiere a una molcula de RNA mensajero
(RNAm)
2. Mediante el proceso de la traduccin, el mensaje transportado
por el RNAm se traduce a protena
Dogma Central de la Biologa
Molecular (2)
Este esquema central de flujo de la informacin pronto fue
modificado, ya que en algunos virus cuyo material hereditario
es RNA, la informacin se conserva o mantiene mediante
replicacin del RNA.
Adems, tambin se comprob que la informacin no va
siempre del DNA hacia el RNA (DNARNA), en algunos casos
la informacin puede fluir del RNA hacia el DNA (RNADNA),
es decir sintetizar DNA tomando como molde RNA, teniendo
lugar el fenmeno de la transcripcin inversa.
Transcripcin
Con la excepcin de los RNAs de ciertos virus, todas las
molculas de RNA se forman a partir de informacin
almacenada permanentemente en el DNA.
Durante la transcripcin, un sistema enzimtico convierte la
informacin gentica de un segmento del DNA de doble
cadena en una cadena de RNA con una secuencia
complementaria a la de una de las cadenas del DNA.
En la replicacin se copia el cromosoma entero, mientras que la
transcripcin es ms selectiva. En un momento dado solo son
transcritos genes o grupos de genes determinados y algunas
regiones del genoma no son transcritas nunca.
Secuencias reguladoras especficas indican el principio y el final
de los segmentos de DNA que deben ser transcritos y designan
que cadena de DNA se debe utilizar como molde.
Transcripcin = sntesis de RNA.
En las bacterias la transcripcin y la traduccin
tienen lugar en el citoplasma bacteriano y al mismo
tiempo, son simultneas.
En eucariontes la transcripcin tiene lugar en el
ncleo y la traduccin en el citoplasma.
En ambos casos necesita:
Una cadena de DNA que acte como molde.
Enzimas: RNA-polimerasa.
Ribonucletidos trifosfato de A, G, C y U.
Cofactores y reguladores
Proceso, se realiza en tres fases:
Iniciacin
Elongacin
Terminacin.


Flujo de la informacin gentica en eucariotas
Transcripcin
RNA Polimerasa
Este proceso constituye un evento central en la expresin
de la informacin gentica.
Consiste en el copiado de la secuencia de la hebra con
sentido de un gene para formar un transcrito de RNA
complementario que transcriba con exactitud la informacin
gentica contenida en el DNA.
El proceso es catalizado por la RNA-Polimerasa
dependiente de DNA, enzima que se encuentra presente
en todos los tipos celulares.
La bioqumica del proceso de transcripcin es
relativamente sencilla, pero los mecanismos regulatorios
que han sido desarrollados para el control de la
transcripcin son complejos y muestran grandes
variaciones.
La RNA polimerasa, enzima que cataliza la polimerizacin
de los ribonucletidos debe tener las siguientes capacidades:
a) Reconocer las secuencias promotoras que marcan el inicio de
la transcripcin, para lo que cuenta con la ayuda de los factores
proteicos de transcripcin.
b) Leer la hebra molde del DNA en sentido 3 5; lee la
secuencia de bases y selecciona los ribo nucletidos trifosfatos,
cuya base debe ser complementaria a la base del molde.
c) Cataliza la formacin del enlace ster entre los nucletidos.
La enzima cataliza la incorporacin del nucletido monofosfato a
la cadena del RNA en formacin mediante un enlace ster. Al
mismo tiempo utiliza la energa desprendida de su hidrlisis al
liberar un resto de pirofosfato.
d) Polimeriza invariablemente en sentido 5 3.
e) Reconocer las secuencias de terminacin de la transcripcin.

Transcripcin: Biosntesis de RNA
Una de las dos cadenas que componen el DNA de
un gene acta como molde para la sntesis de una
cadena de RNA.
Pero en el DNA hay secuencias gnicas distintas:
a) Genes que se transcriben y se traducen: porque
poseen informacin para la sntesis de protenas. Al
transcribirse originan RNAm
b) Genes que se transcriben pero no se traducen: por
ejemplo aquellos que tienen informacin para la sntesis
del RNAr y del RNAt, que colaboran en la sntesis de
las protenas.
c) Secuencias que ni se transcriben, ni se traducen
pero son fundamentales como Secuencias gnicas
reguladoras, indicando dnde y cuando se debe
comenzar a transcribir el gene y dnde debe finalizar la
lectura.


RNA Polimerasa
En bacterias, existe solamente una RNA
polimerasa que es capaz de sintetizar todos los
tipos de RNA, el ribosomal, el de transferencia y los
mensajeros.
En bacterias, con mucha frecuencia, los RNAm son
polignicos o policistrnicos, de manera que un solo
RNAm contiene informacin para la sntesis de
varios polipptidos distintos. Habitualmente se trata
de genes que comparten un sistema comn que
controla su expresin (opern).
En eucariontes hay diferentes polimerasas
encargadas de sintetizar distintos tipos de RNA y el
RNAm es usualmente monognico, solo transcribe
la informacin para un solo poliptido.
Actividad Correctora
Un error en la replicacin del ADN puede transmitirse a todas
las clulas que deriven por divisin de la clula afectada.
Esto exige que durante la replicacin exista un mecanismo
eficaz que corrija cualquier error que se haya podido
introducir en la secuencia de bases del DNA.
A diferencia de lo que ocurre con las DNA polimerasas, las
RNA polimerasas o transcriptasas, habitualmente carecen de
funcin "correctora de pruebas".
Esta diferencia se debe:
1. los transcritos son cortos y la probabilidad de que uno de los RNA
posea una alteracin es baja, y
2. la vida media de los RNA es corta y pronto se vuelve a sintetizar
otro RNA nuevo.
Por consiguiente no es grave que se transcriba un RNA con
una alteracin ya que durar poco y ser remplazado pronto
por otro nuevo sin la alteracin.
A. Estructura de la enzima
B. Unin al molde
C. Iniciacin de cadenas
D. Elongacin de cadenas
E. Terminacin de cadenas
F. RNA polimerasas eucariotas
La RNA polimerasa, la enzima responsable de la sntesis
de RNA dirigida por DNA, fue descubierta en 1960 por
Samuel Weiss y Jerard Hurwitz (trabajando de manera
independiente).
La enzima une entre s los ribonucletidos trifosfato ATP,
CTP, GTP y UTP, utilizando como molde secuencias
especficas de DNA las cuales transcribe siguiendo el
principio de complementaridad: la A del DNA empareja
con U del RNA, la G con C, la C con G y la T con A
Esta serie de reacciones es posible gracias a la energa
producida por la liberacin de PP, y su hidrlisis posterior,
durante cada una de las adiciones de nucletidos a la
cadena de RNA.
Todas las clulas contienen RNA Polimerasa.
En las bacterias, una variedad de esta enzima sintetiza
todos los RNAs celulares, exceptuando los cortos
cebadores que se utilizans en la replicacin del DNA.
Varios bacterifagos sintetizan tambin RNA polimerasas
que slo producen RNAs especficos de fago.
Las clulas eucariotas contienen cuatro o cinco RNA
polimerasas, cada una de las cuales sintetiza una clase
diferente de RNA.
En esta seccin consideraremos primero las caracteristicas
del enzima de E. coli debido a que es la RNA polimerasa
mejor caracterizada; otras RNA polimerasas poseen
propiedades similares.
Finalmente consideraremos las enzimas eucariotas.
Para cumplir con su funcin la RNA polimerasa:
1. Reconoce y se une a las localizaciones especficas o promotores
de la molcula de RNA. Este proceso incluye aparentemente dos
pasos, reconocimiento por la subunidad de elementos
indicadores situados entre los lugares -40 a -70 y reconocimiento
por el factor del promotor en la regin entre -10 a -35.
2. Desenrolla parcialmente la molcula del DNA molde , gracias a su
actividad intrnseca de helicasa, e inicia la transcripcin.
3. Polimeriza algunas pocas molculas de ribonucletidos formando
una especie de cebador que ser posteriormente alargado.
4. Se desprende del complejo de iniciacin o de la subunidad
5. Cataliza consecutivamente la elongacin de la cadena de RNA, al
mismo tiempo que enrolla y desenrolla la doble cadena de DNA.
6. Termina la transcripcin cuando encuentra la seal adecuada.

RNA POLIMERASA DE E. COLI
La RNA polimerasa de E. coli cataliza la sntesis de todas las clases
de RNA y es un complejo polipeptdico relativamente grande con un
peso molecular de ~ 450 kD.
La holoenzima (enzima completa) se compone de varias subunidades
diferentes:
2
, , , y .
La fijacin del factor a la parte central activa de la enzima es
transitoria y su presencia la hace capaz de seleccionar y unirse tanto a
la hebra correcta, como al molde correcto en la estructura del DNA
para iniciar la sntesis de RNA.
Despus de que la polimerasa transcribe ~10 pares de bases, la
subunidad es liberada.
La enzima activa o enzima central (
2
, , y ) es la estructura que
realmente lleva a cabo el proceso de polimerizacin del RNA.
Las subunidades y constituyen el sitio activo para polimerizar los
ribonucletidos trifosfato (NTPs) de acuerdo a la hebra molde del
DNA.
1
2

Estructura esquemtica de la RNA Polimerasa procariota en
funcionamiento
Imagen del complejo transcripcional compuesto
por DNA, RNA polimerasa y transcripto de RNA,
obtenida por cristalografa de rayos X. En gris se
muestra la estructura de la RNA polimerasa, en
azul, el DNA que se usa como "molde" en la
transcripcin, y en rojo, el RNA transcripto.
Factor
La interaccin de la subunidad , llamada tambin factor
, con un promotor indica a la polimerasa que inicie la
transcripcin de las secuencias especficas que
constituye el molde de DNA a partir del sitio +1.
Se han identificado varios tipos de factores con
diferente selectividad. Por ejemplo, el factor
70
en E.
coli, participa en la transcripcin de la gran mayora de
los genes, mientras que
32
y
28
promueven la
transcripcin de los genes de las protenas de choque
trmico (heat schock genes) y del gene de la flagelina
(protena importante en la estructuracin del flagelo) ,
respectivamente. En estos casos los exponentes indican
el peso molecular del factor en kilodaltones.

La fijacin del factor a la parte central activa de la enzima es transitoria y su presencia la hace capaz
de seleccionar y unirse tanto a la hebra correcta, como al molde correcto en la estructura del DNA para
iniciar la sntesis de RNA.
Despus de que la polimerasa transcribe ~10 pares de bases, la subunidad es liberada.

Tipos de RNA Polimerasas dependientes de DNA
Polimerasa Genes Transcritos
Bacterias
RNA Polimerasa

Todos los genes
Eucariotas (Ncleo)
RNA Polimerasa I
RNA Polimerasa II
RNA Polimerasa III
RNA Polimerasa IV (plantas)

RNAr (excepto 5SRNAr)
RNAm, RNAsno, RNAmi
RNAt, 5SRNAr, RNAsn
RNAsi (heterocromatina)
Eucariotas (Organelos)
RNA Polimerasa Mitocondrial
RNA Polimerasas Cloroplasto
(mltiples)

Genes mitocondriales
Genes del Cloplasto
RNA Polimerasa de E. coli
La forma de la enzima es irregular, de ~100 x 100 x 160 .
Su caracterstica ms notable es una proyeccin digitiforme
que rodea un canal cilndrico que tiene un dimetro de ~25
y una profundidad de 55 .
El canal posee un tamao suficiente para acomodar unos 16
pares de bases de -DNA, lo que no es suficiente para
explicar los 50 a 60 pares de bases de -DNA que se sabe
que se encuentran asociados simultneamente a la RNA
polimerasa durante la transcripcin.
La subunidad contiene dos tomos de Zn
+
, que se piensa
que participan en la funcin cataltica de la enzima.
La enzima activa requiere tambin de la presencia de Mg
2+
.
Estructuras cristalinas de alta resolucin de la RNA Polimerasa II de levadura
(derecha) y la RNA Polimerasa de Thermus thermophilus (izquierda)
mostrando la similitud entre las estructuras principales de ambas enzimas.
Verde = Rpb1/
Azul violaceo = Rpb2/
Rojo = Rpb3/1
Amarillo = Pb11/2
Magenta = Rpb6/
La RNA Polimerasa es una de las
mayores enzimas solubles
conocidas, y su tamao de cerca de
100 de dimetro permite su
visualizacin en micrografas
electrnicas. Estas fotografas
indican claramente que la RNA
polimerasa se une a los promotores
del DNA.
El gran tamao de la holoenzima deriva
probablemente de sus varias y complejas funciones,
que incluyen
1. la unin al molde
2. la iniciacin de la cadena de RNA
3. la elongacin de la cadena
4. la terminacin de la cadena.
Etapas de la transcripcin:
Iniciacin en Eucariotas
Para que la RNA polimerasa transcriba los genes, existen en los
genes eucariotas tres tipos de secuencias gnicas reguladoras:
1. El promotor: es la regin ms prxima al inicio de la transcripcin
y esta formada por la secuencia -25 TATA, -80CAAT y -120 GC.
Los factores proteicos de transcripcin que se unen al promotor,
conocidos como factores basales, ayudan a la RNA polimerasa a
colocarse en el sitio de iniciacin del gen.
2. Las secuencias potenciadoras (enhancers): situadas mucho ms
lejos, entre -200 y -10000, a ellas se unen los factores activadores
de la transcripcin, que cumplen dos funciones:
1. Desempaquetar la cromatina al disgregar los nucleosomas, y consiguen
desenrollar la doble vuelta del ADN, para que la regin promotora quede
accesible.
2. Incrementar la velocidad de transcripcin.
3. Las secuencias silenciadoras (silencers): se encuentran
intercaladas entre las activadoras y a ellas se unen los represores,
disminuyendo la velocidad de transcripcin.
HRE = Elemento Respuesta Hormonal
TAFs = Factores asociados a TBP
TBP = Protena fijadora de TATA
A H = Factores basales de Transcripcin
La Transcripcin y la traduccin funcionan de manera acoplada en las bacterias
Puesto que en las bacterias ambos procesos ocurren en el mismo compartimiento, la
traduccin del mensajero por los ribosomas puede iniciarse tan pronto el extremo 5 del
RNAm es accesible. Cuando el primer ribosoma se aleja funcionalmente del extremo 5
del RNAm, puede fijarse un segundo ribosoma y as sucesivamente.
En procariotas, el proceso completo de transcripcin y
traduccin ocurre en minutos. En contraste, en los eucariotas el
proceso completo puede tomar horas, o en algunos casos,
meses, debido a que la sntesis del RNAm y la sntesis de
protenas ocurren en compartimientos celulares separados.
La Iniciacin de la Transcripcin es el punto en el cual es
regulada la transcripcin de la mayora de los genes, tanto en
procariotas como en eucariotas
No obstante, puesto que la transcripcin y la traduccin estn
desacopladas en los eucariotas, el control de la expresin
gentica puede ocurrir en estos organismos a otros niveles,
incluyendo el procesamiento del RNA transcrito, el transporte
del RNAm al citoplasma y la estabilidad del RNAm en el citosol.
Representacin esquemtica de la RNA polimerasa de E. coli fija al DNA.
Elongacin
El DNA se desenrolla temporalmente durante la transcripcin. En
todo momento durante el progreso de este proceso est
desenrollado unos 17 pares de bases.
La RNA Polimerasa se desplazan de izquierda a derecha a lo largo
del DNA.
El DNA se desenreda por delante y se vuelve a enredar por detrs
a medida que se transcribe el RNA.
A medida que el DNA se vuelve a enrollar, se desplaza el hbrido
RNA-DNA y se expulsa la hebra de RNA.
Nuevos nucletidos trifosfatos son llevados hacia el sitio activo de la
RNA-Polimerasa para ser incorporados al RNA que se est
sintetizando.
Unin al Molde
El RNA se sintetiza en direccin 5' 3'
La sntesis de RNA se inicia, por lo general, nicamente en sitios
especficos del molde de DNA.
La RNA polimerasa se une a estos sitios de iniciacin a travs de
secuencias de bases conocidas como promotores, que son reconocidas
por el correspondiente factor .
Un par de bases de una regin promotora o reguladora recibe una
numeracin que puede ser positiva (downstream) o negativa
(upstream), segn se encuentre respectivamente hacia 3' o hacia 5'
del sitio de inicio de transcripcin. Por convencin el sitio de inicio de
la transcripcin recibe el nmero +1
El promotor est formado por una secuencia 40 pb que est situada
en el lado 5 (upstream) del sitio de inicio de la transcripcin.

Caja TATA o Caja de Pribnow
La holoenzima forma complejos muy fuertes con los promotores (constante de
disociacin K lO
-14
M) y, por tanto, protege a los segmentos de DNA a los que se
une de la digestin por DNasa 1.
La regin comprendida entre los residuos -20 a +20 resulta protegida, durante la
transcripcin, de la degradacin por DNasa 1.
Las determinaciones de la secuencia de las regiones protegidas de numerosos
genes de E. coli y de fagos han revelado una secuencia consenso para los
promotores de E. coli. Su secuencia ms conservada es un hexmero centrado
alrededor de la posicin -10, conocido como la Caja TATA o Caja de Pribnow (de
David Pribnow, quien seal su existencia en 1975). Su secuencia consenso es
TATAAT, donde las TA iniciales y la T final son altamente conservadas.
Secuencias de bases de nmeros ms negativos, situadas ms hacia 5',
alrededor de la posicin -35, tambin contienen una regin conservada,
TCTTGACAT, la cual es ms evidente en promotores eficientes.
El espacio entre las secuencias 10 y 35 y el punto inicial de la transcripcin es
muy importante, deleciones o inserciones que cambian este espaciamiento son
deletreas.
Los promotores bacterianos poseen dos secuencias consenso diferentes.

Su secuencia ms conservada es un hexmero centrado alrededor de la posicin -10, conocida
como la caja TATA o caja de Pribnow. Su secuencia consenso es TAtAaT, donde las TA iniciales y la
T final son altamente conservadas. Secuencias situadas alrededor de la posicin -35, tambin
contienen una regin conservada, tcTTGACat, la cual es ms evidente en promotores eficientes. Las
letras maysculas indican las bases ms conservadas (>50%), las minsculas las menos
conservadas (<50%)
La primera base transcrita esta marcada como +1. Los indicadores upstream y downstream son
nomeclatura tradicional.
El espacio entre las secuencias 10 y 35 y el punto inicial de la transcripcin es muy importante,
deleciones o inserciones que cambian este espaciamiento son deletreas.
La holoenzima contacta con el promotor
solamente alrededor de la caja de Pribnow y
de la regin de -35.
Los modelos indican que estos sitios
protegidos se encuentran ambos sobre el
mismo lado de la doble hlice, son por lo
tanto elementos cis, lo cual sugiere que la
RNA polimerasa se une a una sola de las
hebras del promotor bihelicoidal.
Complejo Abierto
Los anlisis de huellas indican que la unin de la
holoenzima "funde" (en el sentido de que desenrolla a la
doble hlice separando las cadenas) al DNA en una regin
de 11 pb que se extiende del centro de la caja de Pribnow
hasta justo despus del sitio de iniciacin (posiciones -9 a
+2).
La necesidad de formar este "complejo abierto" explica por
qu la eficiencia del promotor tiende a disminuir conforme
aumenta el nmero de pares de bases G-C en la caja de
Pribnow; probablemente esto aumenta la dificultad para
abrir la doble hlice en la forma necesaria para la iniciacin
de la cadena (vale la pena recordar que los pares G-C son
ms fuertes que los pares A-T).
Transcripcin
En Resumen, con extrema sencillez, el
proceso de transcripcin se puede estudiar
como compuesta de tres procesos sucesivos:
La iniciacin
La elongacin de la cadena y
La terminacin
Iniciacin
La RNA polimerasa se desliza a lo largo del DNA hasta que encuentra la secuencia del
promotor.
Una vez que la enzima encuentra al promotor se produce, cerca de la caja de Pribnow, el
desenrollamiento de una corta regin del DNA.
La transcripcin empieza con la fijacin del primer nucletido trifosfato (usualmente ATP o
GTP) al complejo de la RNA polimerasa.
Entonces se produce un ataque nucleoflico del grupo 3'-OH del primer nucletido trifosfato
sobre el segundo nucletido trifosfato (posicionado por enlaces de hidrgeno de acuerdo a la
complementariedad con el DNA que sirve de molde) y se produce el primer enlace
fosfodister.
Puesto que los grupos fosfato del primer nucletido no participan en estas reacciones, el
extremo 5 del transcrito primario termina en un grupo trifosfato.
Cuando la secuencia de transcripcin alcanza unos 10 nucletidos, la conformacin de la RNA
polimerasa cambia, el factor es liberado y la fase de iniciacin termina.
Tan pronto la RNA polimerasa ha iniciado la transcripcin y ha dejado libre el sitio del
promotor, este queda listo para ser ocupado por una nueva enzima e iniciar otro proceso
similar de transcripcin de dicha regin del DNA.
Para iniciar la transcripcin la RNA polimerasa se fija sobre el DNA y se
desliza sobre l buscando una secuencia de bases que funcione como
un promotor adecuado e indique el extremo 5 de una secuencia de
bases del DNA donde debe iniciarse la transcripcin:
a. El factor se fija a la secuencia 5-TATAAT-3, llamada caja TATA, uniendo
la holoenzima a tal sitio,
b. La actividad de la RNA pol desenrolla 17 pares de bases (pb) del DNA para
formar el Complejo de Preiniciacin
c. La RNA Pol forma el primer enlace fosfodister entre los dos primeros
ribonucletidos que se aparean satisfactoriamente, iniciando la nueva
cadena, sin la necesidad de un iniciador
d. Una vez que se han formado los primeros enlaces fosfodister el factor se
disocia, lo cual disminuye la afinidad de la polimerasa por el promotor y
facilita el progreso de la RNA Pol a lo largo de la cadena del DNA
sintetizando la cadena de RNA
Elongacin
El alargamiento de la cadena de RNA se realiza mediante la
incorporacin de nuevos ribonucletidos complementarios
a la secuencia de bases del DNA
a. La RNA pol, la porcin de DNA cuyas hebras se han separado y
la cadena naciente de RNA forman la Burbuja de Transcripcin
que se desliza a lo largo del DNA durante el proceso
b. Los ribonucletidos son unidos a la cadena naciente de acuerdo
a la ley de complementariedad, con la excepcin de que el
uracilo se aparea con la adenina del DNA en lugar de la timina
c. La enzima Topoisomerasa previene la ocurrencia de super-
enrollamiento tanto por delante, como por detrs del avance
de la burbuja de transcripcin
d. La RNA pol no tiene actividad de nucleasa y por lo tanto no
posee la posibilidad de corregir los errores que se produzcan
durante la transcripcin. De esto depende que la transcripcin
sea un proceso mucho ms sujeto a errores que la replicacin.
Elongacin
Una vez que se libera el factor y la afinidad del complejo de la
polimerasa por el promotor disminuye, se inicia la fase de elongacin.
La RNA polimerasa fija algunas protenas accesorias y se convierte en un
activo complejo de transcripcin.
Segn la sntesis procede en la direccin 5' > 3 (downstream), el DNA se
va desenrollando por delante de la llamada burbuja de transcripcin (el
segmento en el cual el DNA permanece desenrollado transitoriamente
mientras progresa el avance del Complejo Enzima-DNA-RNA transcrito)
La actividad desenrolladora de la RNA polimerasa produce
superenrollamiento por delante de la burbuja de transcripcin y
subenrollamiento por detrs, que sern resueltos por la actividad de la
Toposiomerasa.
La incorporacin de nucletidos continuar hasta que la actividad de la
enzima encuentre una seal de final de la transcripcin.
Elongacin
Segn la RNA polimerasa avanza, mantiene separadas las
dos hebras del DNA formando una burbuja de
transcripcin caracterstica que progresa al mismo tiempo
que la doble hlice del DNA se desenrolla enfrente de ella y
se vuelve a enrollar atrs.
Al mismo tiempo que avanza, la polimerasa proteje un
espacio, o huella, de cerca de 30 pb en la secuencia del DNA
contra el ataque por endonucleasas. Este espacio, o huella,
comprende tanto la burbuja de transcripcin como algo de
la doble hlice del DNA en ambos extrremos de la burbuja.
Dentro de la burbuja de transcripcin una hebra del DNA
sirve como molde para la sntesis de RNA complementario
por apareamiento de bases.


El sitio cataltico de la polimerasa tiene un
subsitio fijador de sustratos en donde los
nucletidos trifosfato entrantes (NTP) son
fijados por la enzima y seleccionados por
su apareamiento complementario con los
nucletidos en la hebra molde del DNA.
Tambin tiene un subsitio fijador del
producto, en el cual est localizado el
extremo 3-OH del RNA en crecimiento.

En este subsitio, durante la reaccin de
crecimiento, se remueve un pirofosfato
del NTP sustrato y se forma un enlace
fosfodister con el extremo 3-OH del
ltimo nucletido incorporado a la
cadena de RNA.
La hidrlisis subsecuente del pirofosfato
facilitar la reaccin y producir energa
suficiente para producirla
El ion Mg
2+
fijo en el sitio activo de la
enzima ayuda aumentando la
nucleofilicidad del grupo 3-OH y/o
estabilizando la carga negativa del grupo
pirofosfato liberado.
La transcripcin, como la duplicacin del
DNA, procede invariablemente en la
direccin 5 3.

La adicin de cada uno de los nuevos nucletido
trifosfatos se acompaa de un cambio en la
posicin del sitio activo de la polimerasa que
avanza una posicin a lo largo del molde de DNA.
Como resultado de este avance, el hbrido DNA-
RNA mantiene un tamao constante de 9-12
pares dentro de la burbuja de transcripcin,
pero el RNA aumenta una base en su crecimiento
y el camino a seguir disminuye una base para
llegar al final.
Este ciclo de aumento en la cadena de RNA
contina de una manera progresiva de manera
que se forme una cadena de RNA que responda
fielmente a la regla de complementariedad de
bases con la hebra molde del DNA.
Las secuencias de terminacin contienen palndromos.
El RNA transcrito en una seal palindrmica del DNA produce un
segmento inestable en forma de orquilla.
Aparentemente esta estructura produce que la actividad de la
polimerasa se interrumpa o se retarde y se rompa parcialmente el
hbrido RNA-DNA.
Terminacin independiente de (rho). En este tipo, varios residuos
de uridina (~6) continan la estructura de la orquilla. Puesto que las
interacciones U-A son dbiles, estas cortas secuencias de U-A en el
hbrido promueven la disociacin del RNA recientemente transcrito de
su molde de DNA.
Terminacin dependiente de . El factor (una enzima que cataliza el
desenrollamiento de las dobles hlices RNA-DNA, mediante la
utilizacin de ATP) promueve la disociacin del complejo de la RNA
polimerasa y la separacin del hbrido RNA-DNA.
El factor se fija directamente al RNA y no a la RNA polimerasa.
Terminacin
La finalizacin del proceso de transcripcin de una regin
especfica del DNA, se realiza cuando la RNA pol
atraviesa por donde existe una seal de terminacin de la
transcripcin
Este proceso requiere con frecuencia de la actividad de
algunos factores llamados factores (rho)
Molculas maduras de RNAr y RNAt son producidas a partir de largos
transcritos por procesamiento postranscripcional.
El genoma de E. coli contiene varias repeticiones de los genes para los 16S,
23S, and 5S RNAr, todos estos genes forman parte de un opern. El transcrito
es un RNA 30S policistrnico que debe ser procesado.
Inicialmente el RNA 30S policistrnico es metilado y despues segmentado por
varias RNAsas en varios segmentos ms pequeos. Segmentacin posterior,
por otras RNAsas, producir el RNA maduro del tamao adecuado.
Este mismo RNA policistrnico produce algunas molculas de RNAt durante
el procesamiento. Los dems RNAt son producidos a partir de otros
transcritos primarios por un procesamiento similar en el que intervienen
varias RNAsas.
En el ltimo paso del procesamiento del RNA un nmero importante de bases
son modificadas mediante varios tipos de actividad (desaminacin, metilacin
y reduccin).
Procesamiento del RNA Ribosomal en E. coli.
Cada opern de RNAr codifica un transcrito primario que contiene una copia de cada
uno de los RNA ribosomales 16S, 23S, y 5S rRNAs. Cada transcrito codifica tambin
por uno o dos RNAt llamados espaciadores y hasta por dos RNAt en el extremo final del
transcrito.
El procesamiento incluye un gran nmero de reacciones de hidrlisis catalizados por
RNAsas (identificadas en la figura por letras o nmeros) y varios procesos de splicing.
Es adecuado hacer notar que la RNAsa marcada P, es una ribozima.

Desplazamiento
El ncleo de la enzima, que no se une al promotor de
manera especfica, se une estrechamente al DNA
bicatenario (la constante de disociacin del complejo es K
5 x lO
-12
M y su vida media es ~60 min).
Por el contrario, la enzima se une al DNA no promotor de
una manera comparativamente ms dbil (K 1O
-7
M y vida
media > 1 s).
Aparentemente, la subunidad permite que la holoenzima
se desplace rpidamente a lo largo de una hebra de DNA
buscando el promotor correspondiente a la subunidad de
que se trate.
Una vez que se ha iniciado la transcripcin y la subunidad
ha sido liberada, la fuerte unin entre el ncleo de la
enzima y el DNA estabiliza el complejo ternario enzima-
DNA-RNA.
Iniciacin
La RNA polimerasa como holoenzima, es decir con el factor ,
se une inicialmente al promotor para formar un complejo
reversible, llamado cerrado puesto que el DNA permanece
formando su doble hlice de bases apareadas.
Este complejo experimenta una transicin estructural a la forma
llamada abierta, en la cual aproximadamente 18 pb del DNA,
alrededor del punto inicial de la transcripcin, se funden (las
dos hebras de la doble hlice se separan) para exponer la
hebra que servir de molde para la sntesis del RNA.
La transcripcin parece ser favorecida por la existencia de un
superenrollamiento negativo de la regin del promotor, la cual
requiere el empleo de una cantidad menor de energa libre para
la separacin de las dos hebras del DNA. Asimismo las
regiones ricas en AT tambien requieren menos energa para
iniciar su fusin.
La formacin del complejo abierto es generalmente irreversible
Iniciacin
Una vez que la holoenzima ha iniciado la transcripcin
del RNA, el factor se disocia del complejo enzima-
DNA-RNA, y as puede unirse a otro ncleo para formar
un nuevo complejo de iniciacin.
La base 5'-terminal de los RNAs procariticos es casi
siempre una purina, siendo la A ms frecuente que la G.
La reaccin de iniciacin de la transcripcin es la unin de
dos nuclesidos trifosfato en la reaccin:
pppA + pppN pppApN + PPi
Los RNAs bacterianos, por tanto, poseen grupos 5'-
trifosfato terminales.
Dos antibiticos emparentados, la rifamicina B producida por
Streptomyces mediterranei, y su derivado semisinttico,
rifampicina, inhiben especficamente el inicio de la transcripcin
por RNA polimerasas procariotas, aunque no la catalizada por
RNA polimerasas eucariotas.
Esta selectividad, y su elevada potencia (la RNA polimerasa
bacteriana es inhibida en un 50 % por concentraciones 2 x lO-'M de
rfampicina), han hecho de estos dos antibiticos dos agentes
bactericidas de aplicacin mdica contra bacterias gram-positivas
y la tuberculosis.
Sin embargo, una vez que ha tenido lugar la iniciacin de la cadena
de RNA las rifamicinas no tienen efecto alguno sobre el proceso de
elongacin posterior. Por esta razn las rfamicinas son
herramientas de investigacin muy tiles debido a que permiten
que el proceso de transcripcin sea diseccionado en sus fases de
iniciacin y de elongacin.
El crecimiento de la cadena de RNA se hace en la direccin 5' 3.
Esta conclusin, primero establecida midiendo la incorporacin
de marcaje radiactivo en el RNA utilizando
32
P(ATP), queda
corroborada por la observacin de que el antibitico
cordicepina, que es un anlogo de la adenosina que carece de un
grupo 3'-OH, inhibe la sntesis del RNA bacteriano.
Su adicin al extremo 3' del RNA, cosa esperada si el
crecimiento es en la direccin 5' 3', evita que el RNA contine
alargndose.
La cordicepina no tendra este efecto si el crecimiento de la
cadena fuera en la direccin opuesta, ya que no puede unirse a
un extremo 5' del RNA.
Elongacin
La transcripcin probablemente sobre enrolla al DNA.
La elongacin de la cadena de RNA requiere que el
molde de DNA bicatenario sea abierto en el punto de
sntesis de RNA, de manera que la cadena con sentido
pueda ser transcrita a su hebra de RNA complementaria.
Durante este proceso, la cadena de RNA forma cortos
segmentos bicatenarios hbridos RNA-DNA, aunque slo
de manera transitoria.
Esto se deduce de la observacin de que la transcripcin
deja intacto al DNA bicatenario original, con la liberacin
de RNA de cadena sencilla.
La "burbuja" de DNA no apareado de los complejos de
iniciacin abiertos se desplaza aparentemente a lo largo
del DNA junto con la RNA polimerasa. Esto podra ocurrir
de dos maneras:
(a) La RNA polimerasa sigue la ruta marcada por la hebra con sentido a lo largo
de la doble hlice de DNA, con lo que el transcrito acabara envolviendo al
DNA una vez por cada vuelta del dplex. El RNA no se desenrollara
espontneamente en un tiempo razonable del largo DNA.
(b) El RNA se desplaza en lnea recta al mismo tiempo que el DNA gira por debajo.
En este caso, el RNA no se enrollara alrededor del DNA, sino que el DNA
situado por delante de la burbuja de transcripcin se sobreenrollara a medida
que sta va avanzando, y se ira desenrollando por detrs
Superhelicoicidad
Si la RNA polimerasa acompaa a la hebra molde en
su ruta helicoidal alrededor del DNA, ste no ganar
ms superhelicoicidad debido a que el dplex de
DNA nunca ser desenrollado en ms de una vuelta,
sin embargo, el transcrito de RNA se enrollar en
torno al DNA, una vez por cada vuelta del dplex.
Este modelo no es posible debido a que no parece
probable que la maraa de DNA y RNA sea
deshecha de manera sencilla. El RNA no se
desenrollara espontneamente en un tiempo
razonable del largo DNA, a menudo en forma
circular, y no existen topoisomerasas conocidas que
aceleren este proceso,
Segundo Mecanismo
Si la RNA polimerasa se desplaza en linea recta mientras que
es el DNA el que rota, entonces el RNA y el DNA no se
enredarn, en lugar de ello, las vueltas de hlice del DNA sern
empujadas hacia adelante de la burbuja de transcripcin en
movimiento, de forma que el DNA situado por delante de la
burbuja quedar enrollado ms fuertemente (cosa que
promueve el sobre enrollamiento positivo), mientras que el DNA
situado por detrs de la burbuja ser desenrollado de forma
equivalente (y esto promueve el sobre enrollamiento negativo;
obsrvese que el nmero de ligamiento del DNA completo
permanece inalterado).
Este modelo est apoyado por las observaciones de que la
transcripcin de plsmidos en E. coli mutantes para la girasa
(incapaces de relajar sobre enrollados positivos) genera
plsmidos sobre enrollados positivamente, mientras que un
experimento similar en mutantes para la topoisomerasa 1
(incapaces de relajar sobre enrollados negativos) genera
plsmidos sobre enrollados negativamente,
Terminacin
Las micrografas electrnicas sugieren que el DNA contiene sitios especificos
en los cuales se detiene la transcripcin. Las secuencias de terminacin de la
transcripcin de varios genes de E. col comparten dos caracteristicas:
1. Una serie de 4 a 10 pares A-T consecutivos, con la A sobre la cadena molde. El RNA
transcrito acaba dentro o justo despus de esta secuencia.
2. Una regin rica en G +C con una secuencia palindrmica (de simetra doble) que
precede inmediatamente a la serie de pares A-T, que obliga al transcrito de RNA ha
adquirir una forma de orquilla
Las secuencias de terminacin antes indicadas inducen la terminacin
espontnea de la transcripcin.
Terminacin
Sin embargo, existen otros sitios de terminacin que
carecen de similitudes obvias con stas, y que son
incapaces de formar horquillas fuertes; estos sitios
requieren la participacin de una protena conocda como
factor rho para la terminacin de la transcripcin.
Se ha dicho que el factor rho
distingue los RNAms que
estn siendo traducidos
activamente de aquellos que
se encuentran relativamente
libres de ribosomas (cabe
recordar que en procariotas
los ribosomas se unen a los
RNAms nacientes poco
tiempo despus de la
iniciacin de su
transcripcin), y que por
tanto hace que la traduccin
continuada del RNAm
naciente sea dependiente de
su utilizacin funcional.

Transcripcin en Eucariotas
Es bastante ms complejo que en procariotas,
debido principalmente a que: existen varias RNA
polimerasas, la formacin del complejo de pre-
iniciacin y la necesidad de procesar el RNA
sintetizado.
Se conocen 3 RNA pol que catalizan la transcripcin
de los genes en los eucariotas
a. RNA pol I transcribe los genes para los RNAs de 28s,
18s, y 5.8s. Esta actividad se localiza en el nuclolo.
b. RNA pol II es la responsable de la transcripcin de los
genes que codifican para el RNAm, que codificarn
para la sntesis de protenas
c. RNA pol III es la responsable de la transcripcin de los
genes que codifican para los RNAt y para el RNAr de
5s

Factores de Transcripcin
Los factores generales de transcripcin (GTFs) que
se fijan a los promotores en los eucariotas son
funcionalmente semejantes al factor s de los
procariotas.
a. La protena fijadora a TATA (TBP), reconoce la caja
TATA del promotor en los genes de tipo II (los que son
transcritos por la RNA pol II) y se fija a ella en un
proceso de gran especificidad. Recluta despus otros
factores de transcripcin para formar un complejo.
b. La RNA pol II es incorporada a este complejo para
formar el complejo de pre-iniciacin
c. Adems del TBP, otros factores de transcripcin son
ms selectivos y especficos y se incorporan al
complejo dependiendo del gene de tipo II que ser
transcrito, lo cual regula la transcripcin de dichos
genes.
Complejo de Iniciacin
El complejo de iniciacin en eucariotas consiste de la RNA polimerasa
II, dependiente de DNA, un conjunto de factores basales de
transcripcin (TFIIX, X =A H).
Primero, el factor TFIID se fija al promotor. TFIID, es un gran complejo
de numerosas protenas que contiene una protena con gran afinidad
por la caja-TATA (TBP, TATA box binding protein) y algunos factores
asociados denominados TAFs (TBP-associated factors).
La Polimerasa se fija a este complejo central con la ayuda del factor
TFIIB.
Antes de que se inicie la transcripcin se requiere la participacin de
otros factores de transcripcin, incluyendo a TFIIH que tiene actividad
de Helicasa y separa las dos hebras del DNA durante la elongacin
En conjunto son requeridas unas 35 protenas diferentes para la
formacin del complejo de iniciacin. Pero esto no es suficiente para
que se inicie la transcripcin. Se requieren adicionalmente seales
positivas que deben ser emitidas por factores transactivantes,
integrados por el complejo coactivador/mediador y transferidos al
complejo basal.
Procesamiento del RNA
1. Supresin de los intrones del RNAhn (RNA
heterogneo nuclear), de manera de dejar slo los
exones para que sean utilizados en la sntesis de
protenas. Esto se realiza dentro del ncleo en las
estructuras llamadas espliceosomas
2. Fijacin de una extremo ad hoc, llamado casquete,
gorra o cachucha (cap), formado por una 7-metil
guanina- trifosfato en el extremo 5 del RNA que
promueve la traduccin del RNA y lo protege contra
las exonucleasas.
3. Casi todos los RNAs terminan downstream en una
estructura de nucletidos AAUAA que induce la
adicin de una larga cola de poli A que protege el
mensaje de la actividad de exonucleasas.
Restructuracin del DNA
En los eucariotas, el DNA se encuentra bloqueado por Histonas
(formando cromatina) y es po lo tanto imposible que pueda ser
transcrito sin mecanismos especiales de regulacin.
En los eucariotas son, pues, las histonas las que desempean el papel
de represores.
Para que la transcripcin pueda siquiera iniciar, la cromatina debe ser
primero re-estructurada.
En el estado de reposo, el extremo amino-terminal de residuos de
lisina en las histonas no estn acetiladas. En este estado, que puede
ser producido por la actividad de Histona-Desacetilasas, el
nucleosoma es completamente estable.
Se requiere la interaccin de activadores y protenas reguladoras con
sus elementos de control que permita la fijacin de complejos
coactivadores con actividad de Histona Acetiltransferasa.
Esta interaccin realiza la acetilacin de extremos de lisina en las
histonas y relaja la estructura nucleosomal de manera que la
formacin del complejo basal de iniciacin transcripcional pueda ser
efectuada.
Fosforilacin de la Polimerasa
La seal efectiva para iniciar la
transcripcin consiste de la fosforilacin
mltiple de un dominio en el extremo
carboxi-terminal de la Polimerasa.
En su forma fosforilada, la Polimerasa
puede liberarse del complejo basal,
junto con algunos de los factores de
transcripcin, e iniciar la sntesis de lo
que ser el RNAhn (RNA heterogneo
nuclear).
RNA Polimerasas Eucariticas
El ncleo eucariota contiene tres tipos de RNA
polimerasas, que difieren en los RNAs que sintetizan:
RNA polimerasa I, localizada en el nuclolo, sintetiza los
precursores de la mayora de RNAs rbosomales.
RNA polimerasa II, que est situada en el nucleoplasma,
sintetiza los precursores del RNAm y de ciertos RNAs pequeos
nucleares estables.
RNA polimerasa III, que tambin est presente en el
nucleoplasma, sintetiza los precursores del RNA ribosmico de
5S, de los RNAts y de una variedad de otros RNAs pequeos
nucleares y citoslicos.
Adems de estas enzimas nucleares (que tambin son
conocidas como RNA polimerasa A, B y C), las clulas
eucariotas contienen RNA polimerasas mitocondriales y de
cloroplastos que son independientes
Pre-iniciacin
Al contrario de la replicacin de ADN, durante el inicio de la
transcripcin no se requiere la presencia de un cebador para
sintetizar la nueva cadena, de ARN en este caso. Antes del
inicio de la transcripcin se necesitan toda una serie de factores
de transcripcin que ejercen de factores de iniciacin, que se
unen a secuencias especficas de ADN para reconocer el sitio
donde la transcripcin ha de comenzar y se sintetice el ARN
cebador. Esta secuencia de ADN en la que se ensamblan los
complejos de transcripcin se llama promotor. Los promotores
se localizan en los extremos 5'-terminales de los genes, antes
del comienzo del gen, y a ellos se unen los factores de
transcripcin mediante fuerzas de Van der Waals y enlaces de
hidrgeno. Los promotores tienen secuencias reguladoras
definidas, muy conservadas en cada especie, donde las ms
conocidas son la caja TATA (situada sobre la regin -10), con la
secuencia consenso TATA(A/T)A(A/T); y la caja TTGACA
(situada en el punto -35).
La formacin del complejo de transcripcin se
realiza sobre el promotor TATA, all se forma el
ncleo del complejo de iniciacin. Sobre la caja
TATA se fija una protena de unin (TBP) junto con el
factor de transcripcin TFII D (TF proviene del
ingls: transcription factor).
Despus, a ellos se unen otros factores de
transcripcin especficos: TFII A, que estabiliza el
complejo TFII D-ADN; los factores TFII B y TFII E se
unen al ADN y el TFII F (una helicasa dependiente
de ATP) y al final la ARN polimerasa.
Todo ello forma un complejo que se llama complejo
de preiniciacin cerrado. Cuando la estructura se
abre por mediacin del factor de transcripcin TFII
H, da comienzo la iniciacin.
Iniciacin

La ARN polimerasa simplemente se une al ADN y separa las hebras de
ADN en colaboracin con otros cofactores permitiendo, de esta
manera, el acceso de la ARN polimerasa al molde de ADN de cadena
simple. Aunque la bsqueda del promotor por la ARN polimerasa es
muy rpida, la formacin de la burbuja de transcripcin o apertura del
ADN y la sntesis del cebador es muy lenta.
La burbuja de transcripcin es una apertura de ADN desnaturalizado
de 18 pares de bases, donde empieza a sintetizarse el ARN cebador a
partir del nucletido nmero 10 del ADN molde de la burbuja de
transcripcin. La burbuja de transcripcin se llama complejo abierto.
La ARN polimerasa es una enzima formada por 5 subunidades: 2
subunidades , 1 subunidad , 1 subunidad ' y 1 subunidad que
tiene como funcin la unin de ribonucletidos trifosfato. Cuando se
forma el complejo abierto, la ARN polimerasa comienza a unir
ribonucletidos mediante enlaces fosfodister, y una vez que se forma
el primer enlace fosfodister, acaba la etapa de iniciacin y comienza
la siguiente etapa.
Disgregacin del promotor

Una vez sintetizado el primer enlace fosfodister, se debe
deshacer el complejo del promotor para que quede limpio
para volver a funcionar de nuevo. Durante esta fase hay
una tendencia a desprenderse el transcrito inicial de ARN
y producir transcritos truncados, dando lugar a una
iniciacin abortada, comn tanto en procariotas como
eucariotas. Una vez que la cadena transcrita alcanza una
longitud de unos 23 nucletidos, el complejo ya no se
desliza y da lugar a la siguiente fase, la elongacin.
La disgregacin del promotor coincide con una
fosforilacin de la serina 5 del dominio carboxilo terminal
de la ARN polimerasa, que es fosforilado por el TF
II H
(que
es una protena quinasa dependiente de ATP)

Elongacin

La ARN polimerasa cataliza la elongacin de cadena
del ARN. Una cadena de ARN se une por
apareamiento de bases a la cadena de ADN, y para
que se formen correctamente los enlaces de
hidrgeno que determina el siguiente nucletido del
molde de ADN, el centro activo de la ARN
polimerasa reconoce a los ribonucletidos trifosfato
entrantes. Cuando el nucletido entrante forma los
enlaces de hidrgeno idneos, entonces la ARN
polimerasa cataliza la formacin del enlace
fosfodister que corresponde. A esto se le llama
elongacin, la segunda etapa de la transcripcin del
ARN.

Terminacin

Al finalizar la sntesis de ARNm, esta molcula ya se ha separado
completamente del ADN (que recupera su forma original) y tambin de
la ARN polimerasa, terminando la transcripcin.
La terminacin es otra etapa distinta de la transcripcin, porque justo
como el complejo de transcripcin se ha ensamblado activamente
debe desensamblarse una vez que la elongacin se ha completado.
La terminacin est sealizada por la informacin contenida en sitios
de la secuencia del ADN que se est transcribiendo, por lo que la ARN
polimerasa se detiene al transcribir algunas secuencias especiales del
ADN. Estas secuencias son ricas en guanina y citosina, situadas en el
extremo de los genes, seguidas de secuencias ricas en timina,
formando secuencias palindrmicas, que cuando se transcriben el ARN
recin sintetizado adopta una estructura en horquilla que desestabiliza
el complejo ARN-ADN, obligando a separarse de la ARN polimerasa,
renaturalizndose la burbuja de transcripcin.
Algunas secuencias de ADN carecen de la secuencia de terminacin,
en este caso poseen otra secuencia a la que se unen una serie de
protenas reguladoras especficas que indican la terminacin de la
transcripcin como el factor llamado rho.