Tcnicas analticas:

identificacin de familias
de compuestos
M.J. Garca Martnez
Ingeniero de Minas
J.E. Ortiz
Dr. Ingeniero de Minas
Laboratorio de Estratigrafa
Biomolecular
E.T.S.I. de Minas de Madrid
Esquem a 1.
Distintas
fracciones y
tcnicas de
anlisis de una
m uestra de
petrleo.
de plstico (botes, bolsas) con-
taminan la muestra debido a
que contienen productos org-
nicos. Tambin es muy impor-
tante conservar las muestras a
una temperatura igual o infe-
rior a 4 C. De esta forma, esta-
mos inhibiendo la actividad de
las bacterias que, de otro mo-
do, estara variando la composi-
cin de nuestra muestra, tanto
ms cuanto ms tiempo pase
entre la recogida y el anlisis de
la muestra. Esto es especialmen-
te necesario hacerlo en estudios
de biorremediacin en los que
precisamente se estudia la ca-
pacidad que tienen estas bacte-
rias para degradar los compues-
tos que vamos a analizar.
En el esquema 1 aparecen los
distintos tipos de anlisis ms
utilizados para determinar los
constituyentes de una muestra
de petrl eo. En ni ngn mo-
mento se va a hacer referencia
a voltiles, dado que se supone
que las muestras que estamos
re cogi e ndo han pe rdi do ya
prcticamente todos los volti-
les (que han sido liberados a la
atmsfera). De todas formas si
se quieren estudiar se podra
hacer un anlisis por headspa-
ce o espacio en cabeza, que
consistira en coger la muestra
de hidrocarburo, meterla den-
tro de un frasco que tuvi era
una membrana de silicona en
la parte superior, cerrar bien el
frasco y cuando se llega al la-
boratori o se pi nchar a sobre
esta membrana de silicona y se
extraeran as los gases, sin ne-
cesidad de abrir el frasco.
En este artculo se van exponer
los mtodos ms utilizados para
la extraccin y anlisis de mues-
tras de petrleo, es decir, todos
los pasos que hay que dar, des-
A
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C
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O
31
En este artculo se estudian
las tcnicas ms utilizadas
para el anlisis de compues-
tos orgnicos (petrleo) en
muestras slidas y lquidas.
Se describir ms detenida-
mente la tcnica de "Croma-
tografa de Gases Espectro-
metra de Masas" por ser
muy til en la identificacin
de compuestos individuales.
In this paper, the most used
techniques for organic
compounds (oil) analysis in
solid and liquid samples
are studied. The "Gas Chro-
matography Mass Spec-
trometry" technique will
be described in more detail
because of its usefulness in
the individual compounds
identification.
Introduccin
Antes de comenzar con los m-
todos de anlisis propiamente
di chos, es i mportante tener
unas ligeras nociones acerca de
cmo se ha de recoger y alma-
cenar la muestra hasta su mo-
mento de anlisis. Esta conside-
racin, que a menudo se pasa
por alto, es muy importante,
dado que si no se hace de for-
ma correcta, l a muestra que
analicemos al final no va a ser
representativa de nuestro pro-
blema y no nos va a ser til.
Los mtodos de anlisis que va-
mos a estudiar van a estar refe-
ridos al anlisis de compuestos
orgnicos, por lo que todas las
muestras que se recojan han de
guardarse en recipientes de vi-
drio, dado que los recipientes
Extracciny Anlisis de Muestras de Petrleo
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de que una muestra llega al la-
boratorio, hasta que obtene-
mos la informacin acerca de la
composicin de la misma.
Lo primero que hay que tener
en cuenta cuando hablamos de
petrleo es que bajo este tr-
mino englobamos a una serie
de familias de productos que
tienen distintas propiedades f-
sicas y qumicas y que una vez
liberadas en el medio natural,
tienden a separarse. Unas fami-
lias tienden a disolverse, otras a
sobrenadar y otras a precipitar.
El petrl eo est consti tui do
por una f ase gaseosa (com-
puesta fundamentalmente por
hi drocarburos de bajo peso
mol e cu l ar : me tan o, e tan o,
propano, butano...) y por una
fase lquida (compuesta por hi-
drocarburos con ms de cinco
tomos de carbono). En este
art cul o nos vamos a centrar
en el anlisis de la fase lquida.
Dentro de esta parte lquida
del petrleo, encontramos tres
fracciones principales: los asfal-
tenos, las resinas y los hidrocar-
buros. Los asfaltenos y las resi-
nas son compuestos pesados
que contienen N, S y/o O (peso
molecular>500), mientras que
los hidrocarburos son molcu-
las con menor peso molecular.
La forma de analizar estos pe-
trleos se basa en separarlos
en distintas fracciones, corres-
pondientes a los tipos estructu-
rales principales. Para ello, y
como veremos ms adelante,
se utiliza hexano, para disolver
todas l as f racci ones (a esta
fraccin disuelta se le denomi-
na maltenos), menos la de los
asfaltenos, que va a precipitar.
Mediante cromatografa lqui-
da (que estudiaremos ms ade-
lante) vamos a ser capaces de
separar el resto de las fraccio-
nes (maltenos) en una fraccin
aliftica, otra aromtica y por
otro lado las resinas:
Los hi drocarburos satura-
d os comp r e n d e n al can os
normales y ramificados (de-
nomi nados parafi nas) y ci -
cloalcanos (naftenos).
Los hi drocarburos aromti -
cos incluyen compuestos pu-
ros aromticos, molculas ci-
cloalcanoaromticas y com-
puestos cclicos del azufre.
Estas dos fracciones se suelen
analizar con cromatografa de
gases-espectrometr a de ma-
sas que es la tcnica ms utili-
zada en este tipo de estudios
para controlar la biodegrada-
cin de los hidrocarburos.
Las resinas y los asfaltenos es-
tn constituidos por fracciones
de al to peso mol ecul ar que
contienen tomos de N, S y O.
Los asfaltenos son insolubles en
alcanos ligeros, de ah que pre-
cipiten con el hexano. Las resi-
nas son ms solubles, pero, al
mismo tiempo, son muy polares
y suelen quedarse retenidas en
la almina cuando se realiza la
cromatografa lquida, o nece-
sitan utilizar disolventes muy
polares como el metanol para
su liberacin de la almina. El
hecho de que sean fracciones
que conte ngan compue stos
con alto peso molecular, impli-
ca que no se van a poder anali-
zar mediante cromatografa de
gases-espectrometra de masas,
por lo que se recurre a la utili-
zacin de otras tcnicas, como
pueden ser el anlisis elemen-
tal y la espectrofotometra de
infrarrojos.
Es muy i mportante tener en
cuenta que estos cuatro par-
metros no son independientes,
ya que los petrleos consisten
en estos cuatro grupos de com-
puestos. Normalmente, a medi-
da que se van obteniendo cada
una de estas fracciones de com-
puestos, se suele eliminar el di-
solvente y pesar la cantidad de
compuestos que hay en cada
una de las fracciones, obtenin-
dose los porcentajes relativos
de cada una de las fracciones.
Por ejemplo, en el caso de una
muestra del fuel del Prestige
tomada en una mancha sobre
l a superfi ci e del mar, obten-
dramos la siguiente composi-
cin (ver tabla I).
A partir de los resultados de
l a tabl a I, se deduce que se
puede obtener i nf ormaci n
aproxi madamente del 70%
de los compuestos presentes
en una muestra, mediante el
anlisis por cromatografa de
gases-espectrometra de ma-
sas (GC-MS). Par a l os com-
puestos ms pesados, tendra-
mos que recurrir a otras tc-
ni cas anal ti cas, como l a Es-
pectroscop a de Inf rarrojos,
que se basa en el estudio de
los enlaces de las molculas.
El hecho de que nos centremos
en la Cromatografa de gases
Espectrometra de masas es de-
bido a que es una tcnica ana-
l ti ca muy potente, que pro-
porciona muchsima informa-
cin a partir de muy poca can-
tidad de muestra y que es de
vital importancia en el estudio
de las tcnicas de biorremedia-
cin. Esta importancia radica,
como se ver ms adelante, en
que se va a poder tener infor-
macin acerca de la eficiencia
con la que distintos microorga-
nismos son capaces de degra-
dar los hidrocarburos.
Vamos a empezar viendo las
t cn i cas d e an l i si s q u e se
uti l i zan pri nci pal mente para
32
Tabla I.
C om posicin
qum ica general
de una m uestra
del fuel del
Prestige tom ado el
18/11/02 por el
Ailette en una
m ancha en el m ar
(Fuente C edre,
2002).
Hidrocarburos Hidrocarburos Resinas Asf altenos
saturados (%) aromticos (%) (%) (%)
Musem National
d'Histoire Naturelle 26.6 52.8 8.4 12.2
IFP (original) 23 54 12.5 10.3
IFP (mulsion) 21 54 27.7
CSIC Barcelone 21.6 50.7 34.7
Determinacin del
contenido en nitrgeno
Su determinacin es necesaria
para el clculo del contenido
en oxgeno. Actualmente exis-
ten equipos que dan el conte-
nido en nitrgeno, junto con
los del anlisis elemental clsi-
co. Al oxidar la materia orgni-
ca, no slo miden el CO
2
y el
H
2
O producidos, tambin mi-
den el NO
2
y a partir de ese da-
to, calculan el contenido de ni-
trgeno en la muestra. El nitr-
geno deriva de las protenas,
alcaloides y clorofila, presentes
en la materia orgnica inicial.
Determinacin del
contenido en azufre
Tambin es necesaria su deter-
minacin para poder calcular
el ox geno. Exi sten equi pos,
diseados principalmente pa-
ra el anlisis de carbones, que
permiten determinar el conte-
ni do total en azuf re de una
forma barata, precisa y rpida.
El procedimiento ms utilizado
es, tambin, mediante su com-
bustin y la posterior medida
del SO
2
producido. El proble-
ma, o la ventaja, de esta tcni-
ca es que, dependiendo de la
temperatura de anlisis, puede
ser que parte del azufre conte-
nido en la muestra permanezca
en ella sin llegar a ser medido.
Por ejemplo, algunos sulfatos.
En el caso del petrleo, al no
l l evar pi ri ta i ncorporada, se
simplifica el problema analtico.
Espectrofotometra de
Infrarrojos
La determinacin que se suele
hacer medi ante esta tcni ca
es la de hidrocarburos de pe-
trleo totales (TPH) por lo que
normalmente se hace a partir
del anl i si s de l a muestra de
la muestra, tal cual se recibe;
es decir, el anlisis elemental
y l a e spe ctrof otome tr a de
infrarrojos.
Anlisis Elemental
Determinacin del
contenido en carbono e
hidrgeno
El contenido en carbono e hi-
d r g e n o se d e te r mi n a p or
combustin total de la mate-
ria orgnica y midindolos co-
mo CO
2
y H
2
O (ver figura 1).
Por lo tanto, el agua presente
en la muestra puede ser inter-
pretada como hidrgeno, por
lo que es imprescindible, an-
tes de utilizar los datos, ase-
gurarse de que est hecha la
correccin pertinente.
Con la mayora de los equipos
uti l i zados en el anl i si s el e-
mental tambin se puede ob-
tener el contenido en cenizas.
Este dato no se corresponde
exactamente con el determi-
nado segn normas, ya que
las condiciones del ensayo son
mucho ms oxidantes, pero s
da una estimacin del porcen-
taje de fraccin mineral.
Determinacin del
contenido en Oxgeno
Aunque existen mtodos espe-
cficos para la determinacin
del contenido en oxgeno, en
realidad son mucho ms labo-
riosos y producen mayor dis-
persi n de resul tados que el
mtodo ms utilizado: el de de-
terminacin por diferencia:
Esta forma de clculo deriva
de suponer que la materia or-
gnica est compuesta nica-
mente por C, H, N, S y O. Pe-
ro, adems, l a expresi n an-
terior supone que el 100% es
materia orgnica. Esto exige
que dicha expresin slo ser
vl i d a e n b ase se ca to tal
e xe nta de mate ri a mi ne ral
(STEMM).
petrleo inicial (sin separar en
fracciones).
Para el caso de muestras slidas
(norma ISO 11046) (suel os o
arenas en las que ha habido un
derrame de hidrocarburos), ha-
bra que tomar unos 15 gramos
de muestra de suelo y triturar-
los. Se tritura para que el tama-
o de grano sea fino, aumen-
tando as la superficie de con-
tacto entre disolvente y mues-
tra. Despus se mezcla con sul-
fato sdico anhidro, que es un
desecante qumico que va a re-
tener la humedad, dado que la
muestra que se va a anal i zar
por infrarrojos no ha de tener
agua en su composicin.
Una vez preparada la muestra,
se procede a su extraccin, pa-
ra lo que se mezcla con 20 ml
de CFE-113 y se agita con una
pl aca agi tadora, durante 30
minutos. Una vez pasado este
tiempo se espera a que decan-
te el suelo, se filtra y se recoge
el di sol vente. Al suel o se l e
aaden otros 20 ml de CFE-113
y se repi te el proceso. Al ex-
tracto final se le aaden 5 gra-
mos de silicato magnsico, que
va a limpiar la muestra (es de-
cir, retener aquellos compues-
tos que no se consideran como
TPHs), y se agita durante otra
media hora, se filtra, llevamos
el volumen final del extracto a
50 ml y ya tenemos nuestra
muestra lista para ser analiza-
da en el equipo de infrarrojos.
En el caso de muestras lquidas
(mtodo EPA 413.2) (aguas don-
de ha habido un derrame de hi-
drocarburos), la extraccin se
suele realizar con un litro de
muestra. En primer lugar, se aci-
difica la muestra hasta un pH<2
con HCl. Una vez hecho esto, se
procede a la extraccin de la
muestra de agua, para lo que se
coloca en un embudo de decan-
Figura 1.
Determ inacin de
C e H m ediante
com bustin de la
m ateria orgnica.
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O
33
%O = 100 - [(%C) + (%H) + (%N) + (%S)]
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Figura 2. Em budos
de decantacin
para la extraccin
de m uestras de
agua.
Figura 3.
Espectrofotm etro
de Infrarrojos.
presi n y temperatura, nos
puede servir para ilustrar c-
mo se aplicara esta tcnica al
estudio de la biodegradacin.
Normal me nte , cuando una
muestra se biodegrada, lo que
suele ocurrir es que disminuye
el contenido en cadenas alif-
ticas, que son las primeras que
metabolizan los microorganis-
mos; por lo tanto, lo primero
que se detectar ser una dis-
minucin del pico correspon-
diente a las cadenas alifticas.
Anlisis mediante
Cromatografa de Gases-
Espectrometra de Masas
(GC-MS)
Mediante las tcnicas que se
de scri bi rn a conti nuaci n
(cromatograf a de gases-es-
pectrometr a de masas) sl o
tacin como el de la figura 2, se
aaden 30 ml de CFE-113 y se
agita durante 3 minutos. Son l-
quidos inmiscibles y el CFE-113
va a quedar en la parte inferior
del embudo de decantacin. Se
recoge el CFE-113, filtrndolo
sobre un filtro con sulfato sdi-
co para evitar recoger las gotas
de agua que puedan quedar
en l a i nterf az entre l os dos
f l ui dos. Se vue l ve a aadi r
otros 30 ml de disolvente en
el embudo de agitacin y se
vuelve a agitar durante otros
tres minutos, repitindose el
proceso otras dos veces. El ex-
tracto final se lleva a un volu-
men final de 100 ml y ya est
en condiciones de ser analiza-
do por infrarrojos.
Sin embargo, lo que nosotros
q u e r e mo s e s d ar u n val o r
cuanti tati vo, para l o se cal i -
bra el equi po con patrones
de hexadecano, i sooctano y
benceno, con seis concentra-
ciones diferentes.
En la figura 3 podemos ver un
e qui po de i nf rarroj os. Este
equipo va a estudiar los enlaces
de las molculas. Por lo tanto,
lo que va a hacer es estudiar las
di sti ntas l ongi tudes de onda
(abcisas) en las que absorben
estos enlaces; en ordenadas se
tiene la absorbancia: a mayor
absorbancia en un determina-
do enlace, mayor cantidad de
compuestos que tienen ese en-
lace tiene la muestra. En la fi-
gura 4 vemos los seis patrones
en distintas concentraciones y
se estudia las bandas de enlace
donde absorben los aromti-
cos, los alifticos y los ccliclos.
A partir de los resultados, se di-
bujan las rectas de calibracin
como la de la figura 5. En este
caso tendramos tres rectas de
calibracin, una para cada lon-
gitud de onda de estudio. La
que tenemos en la figura co-
rresponde a los aromticos.
Aunque la figura 6 correspon-
de a cmo evoluciona la mate-
ria orgnica a medida que se
va vi endo someti da a mayor
se pueden anal i zar aquel l os
compuestos cuyo peso mole-
cu l ar n o se a mu y e l e vad o,
por lo que no vamos a poder
anal i zar ni l as resi nas ni l os
asfaltenos.
Extraccin de Muestras de
Hidrocarburos
Las di sti ntas tcni cas de ex-
tracci n que se pueden usar
dependen fundamentalmente
de la matriz en la que se en-
cuentren dichos hidrocarburos
(ver esquema 2). Para nuestros
propsi tos, cabe di f erenci ar
tres matrices distintas:
Muestra sl i da. Cuando se
qui eran estudi ar l os com-
puestos de un suel o en el
que ha habido un derrame
de hidrocarburos. Requiere
l a extracci n para separar
l os compuestos de i nters
de la matriz slida. El mto-
do de extraccin que se uti-
lizar ser el de extraccin
con Soxhlet.
Muestra lquida. En el caso
de que se desee analizar un
agua que ha estado en con-
tacto con un derrame de hi-
dr ocar bur os. Re qui e r e l a
extraccin para separar los
compuestos de inters de la
matri z l qui da. El mtodo
de extraccin que se utiliza-
r ser el de extraccin en
fase slida (SPE).
Muestra del crudo de petr-
leo. No requiere extraccin,
ya que la muestra est com-
puesta por hidrocarburos.
34
antes y despus de meterla
en la estufa. Hay que tener
en cuenta que esta muestra
no se va a extraer porque,
junto con el agua, ha perdi-
do aquellos compuestos cu-
ya temperatura de vaporiza-
cin sea inferior a 110C.
Una vez que se han prepara-
do las muestras, se comienza
con la extraccin propiamen-
te dicha, segn el mtodo de
extraccin de la EPA 3540 C.
La muestra se introduce en
un cartucho de extraccin de
fibra de cuarzo. Si se quiere
realizar el anlisis cuantitati-
vo de unos compuestos de-
terminados, se aade el pa-
trn subrogado que sirve pa-
ra medir la eficiencia de la
extracci n. Este patrn su-
brogado est formado por
uno o dos compuestos, que
Extraccin de Hidrocarburos en
Muestras Slidas con Soxhlet
A continuacin se ver cul es
el proceso a segui r cuando
una muestra slida en la que
ha habido un derrame de hi-
drocarburos llega al laborato-
rio. El primer paso consiste en
la preparacin de las muestras:
Se coge entre 5 y 20 gramos
de muestra, en funcin de
la cantidad de compuestos
orgni cos que suponemos
tiene la muestra; es decir, si
se sospecha que la muestra
ti ene muchos compuestos,
se coge menor cantidad, y a
la inversa. En el caso de que
haya habido un derrame de
hidrocarburos, normalmen-
te valdr con 5 gramos, o in-
cluso con menor cantidad.
Se tritura la muestra, para
permi ti r obtener una ma-
yor superfi ci e de contacto
entre la muestra y los disol-
ventes que van a extraer los
compuestos.
Se mezcla con sulfato sdico
anhidro, que es un desecan-
te qumico que va a retener
el agua que pudiera tener la
muestra; tambin se puede
meter la muestra en la estu-
fa durante una noche para
eliminar parte de la hume-
dad. En este ltimo caso, la
temperatura no ha de ser
muy alta (mximo 50C) ya
que si no, se perderan los
compuestos ms voltiles.
Se calcula el peso en seco de
l a muestra, tomando una
cantidad de muestra similar
a la que se va a extraer, me-
ti ndol a en l a estuf a una
noche a 110C y pesndola
se eligen con propiedades si-
milares a las de los compues-
tos orgnicos que se quieren
cuantificar. De esta forma, se
aade una determinada can-
tidad conocida al inicio del
anlisis, para determinar la
cantidad de dichos compues-
tos que perdemos durante la
extraccin.
El cartucho de extraccin se
introduce en un Soxhlet co-
mo el de la figura 7.
Debajo del soxhlet se coloca
un matraz de vidrio, donde
va a estar inicialmente el di-
solvente con el que se van a
extraer l os compuestos or-
gni cos de l a muestra. La
mezcl a de di sol ventes que
se suele usar es: Diclorome-
tano-Metanol (2:1).
Debajo del matraz se colo-
car una manta calefactora,
que va a hacer que el disol-
vente se evapore.
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O
35
Figura 4.
Espectros de
infrarrojos de
los patrones de
calibracin.
Esquem a 2.
Extraccin y
anlisis m ediante
G C -M S.
Figura 5.
Ejem plo de
recta de
calibracin.
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da, que consta de ci nco pa-
sos (ver fi gura 8):
a) Se el i ge un tubo de ti po
SPE ad e cu ad o, q u e va a
depender de los compues-
tos que queremos extraer
y de la matriz en la que se
e n cu e n tr e n . Estos tu b os
tienen una pequea canti-
dad de slido (25-500 mg),
donde se van a quedar re-
tenidos los compuestos de
inters.
b) Se acondiciona el tubo, pa-
sando disolventes adecua-
dos y agua ultrapura, para,
por un l ado, el i mi nar l as
impurezas que pudiera ha-
ber y, por otro, para prepa-
rarlo para que retenga los
compuestos que se quieren
extraer de l a muestra. Al
humedecer l a f ase sl i da
previ amente a l a extrac-
cin de la muestra, se va a
mejorar la reproducibilidad
del mtodo.
c) Se a ad e l a mu e str a d e
agua que llevar el patrn
subrogado, para ver la efi-
ciencia de la extraccin. Es-
te p atr n se a ad e a l a
muestra justo antes de co-
menzar la extraccin.
d) Se aade agua ul trapura,
para l avar el tubo y tratar
de el i mi nar aquel l os com-
p u e sto s "n o r e te n i d o s"
que todav a permanezcan
e n e l i nte ri or de l a f ase
sl i da.
e) Se utiliza diclorometano u
otro disolvente adecuado,
en funcin de la naturale-
za de los compuestos que
se quieren extraer.
Debajo de la manta se colo-
ca un agi tador magnti co,
que va a permitir que el ca-
lor se reparta por igual en
e l d i so l ve n te q u e se e n -
cuentra en el matraz.
Encima del Soxhlet se colo-
ca un refrigerante, que per-
mite que el disolvente que
se ha evaporado condense y
vaya lavando la muestra, a
medida que va llenando el
Soxhlet. Cuando el nivel de
lquido llega a una posicin
cercana a la parte superior,
si fona y cae en el matraz,
de tal manera que lo que se
evapora es disolvente puro
y l o que queda en el ma-
traz son los compuestos ex-
trados de la muestra.
Extraccin de Hidrocarburos
en Muestras Lquidas
A conti nuaci n se expl i car
en qu consi ste l a extracci n
de l os compuestos orgni cos
di suel tos en el agua (tras un
ve r ti d o d e h i d r ocar b u r os).
Este mtodo consi ste en l a
se p a r a ci n d e l o s co mp o -
nentes de un l qui do en un
medi o de extracci n sl i do.
El mtodo que se uti l i za es
el de extracci n en fase sl i -
Limpieza en columna
(cromatografa lquida en
columna)
Una vez extra da l a muestra
por cual qui era de l os mto-
dos anteriores, se van a tener
los compuestos de inters di-
suel tos en un determi nado
volumen de disolvente. Antes
de real i zar esta cromatogra-
fa lquida en columna, es ne-
cesario reducir el volumen de
disolvente a dos mililitros. Es-
to se hace mediante un apa-
rato denomi nado rotavapor,
como el de la figura 9.
El matraz con el disolvente al
que se hace girar, se coloca en
un bao de agua caliente. Al
mismo tiempo, se aplica el va-
co a la muestra. Tanto el vaco
como el calor, van a hacer que
el di sol vente se vaya evapo-
rando. El vapor llega a una zo-
na donde hay un refrigerante
que hace que el di sol vente
condense y caiga en otro ma-
traz de residuos, de tal manera
que en el matraz de la mues-
tra, el vol umen del extracto
di smi nuye hasta l l egar a un
volumen final de 2 ml.
Una vez que se ti enen com-
puestos de inters concentra-
dos en un volumen de 2 ml,
se procede a real i zar l a l i m-
pi eza (f racci onami ento) en
columna pero, por qu es in-
teresante realizar esta limpie-
za? Tiene fundamentalmente
dos objetivos:
a) Evitar que pasen sustancias
que puedan daar al equi-
Figura 6. Espectros
de infrarrojos que
m uestran cm o
evoluciona la
m ateria orgnica,
a m edida que se
va viendo som etida
a m ayor presin y
tem peratura.
Figura 7.
Esquem a de una
extraccin con
Soxhlet.
36
(2 ml ); despus se van aa-
diendo, sucesivamente, las fa-
ses mvi l es. En nuestro caso
van a ser 3, que van de me-
nor a mayor polaridad:
60 ml de hexano, que va a
permitir separar compuestos
poco polares, tales como los
hidrocarburos alifticos.
70 ml de diclorometano:he-
xano (4:1), que va a permi-
ti r separar compuestos de
polaridad intermedia, tales
co mo l o s h i d r o car b u r o s
aromticos.
60 ml de metanol, que va a
permi ti r separar l os com-
puestos de mayor polaridad.
En el caso de que estemos se-
parando una muestra de pe-
trl eo, se puede hacer una
me d i d a ap r o xi mad a d e l a
canti dad de compuestos de
di sti nta natural eza qu mi ca
que conti ene. Se toma una
pequea cantidad de muestra
(menos de un gramo) y se pe-
sa. A continuacin se disuelve
con hexano. La parte que no
se disuelve, que corresponde
po de anl i si s (sustanci as
de elevado peso molecular,
que pueden daar l a co-
lumna), en nuestro caso un
cromatgrafo de gases con
espectrmetro de masas.
b) Se p ar ar l o s co mp u e sto s
que tenemos en la muestra
en varias familias de distin-
ta polaridad, de tal mane-
ra que despus sea ms f-
ci l su i denti f i caci n. Hay
que tener en cuenta que
en estas muestras proce-
de nte s de hi drocarburos
exi ste una gran canti dad
de compuestos orgni cos,
l o cual va a di f i cul tar su
p oste r i or i d e n ti f i caci n ,
por lo que es buena idea el
ir separando los compues-
tos en distintas fracciones.
Este paso de limpieza en co-
lumna de la muestra va a ser
previo a su anlisis y conviene
hacerlo siempre que se estn
analizando muestras slidas o
muestras de hi drocarburos.
En e l caso d e mu e str as d e
agua no es tan i nteresante,
dado que va a haber una mu-
cho menor cantidad de com-
puestos orgni cos a extraer.
Estos compuestos suel en ser
de bajo peso molecular (dado
que los de alto peso molecu-
lar no se disuelven, por lo ge-
neral ), por l o que no van a
daar el equipo de anlisis.
En qu consi ste l a l i mpi eza
en columna?
Las col umnas son de vi dri o
(ver figura 10). En la parte in-
ferior se coloca lana de vidrio
y se rellenan, en nuestro caso,
con slice y almina, que va a
ser la fase estacionaria.
Se moja l a col umna con he-
xano y se aade l a muestra
a los asfaltenos, se pesa, para
determi nar el porcentaje de
asf al te n o s, co mp ar n d o l o
con el peso total. Despus se
procede a hacer la separacin
en col umna, de tal manera
que:
Al obtener la primera frac-
cin, se puede evaporar el
di sol vente y pesar el resi -
duo (compuestos separados
con hexano). De esta f or-
ma, se tendr el porcentaje
de hidrocarburos alifticos.
Si se evapora el disolvente
de la segunda fraccin y se
pesa el residuo, se tendr el
porcentaje de hi drocarbu-
ros aromticos.
Si se evapora el disolvente
de l a tercera fracci n y se
pesa el residuo, se tendr el
porcentaje de lpidos.
Al f i nal , se van a obtener 3
fracciones con familias de dis-
ti nta pol ari dad, cuyo vol u-
men se va a reducir en un ro-
tavapor hasta 1 mililitro.
Cromatografa de gases
Espectrometra de masas
(GC-MS) (ver figura 11)
La cromatografa de gases es
u n a t cn i ca e n l a q u e u n a
mezcla de compuestos se pa-
sa sob r e u n a su p e r f i ci e d e
material inmvil (o fase esta-
cionaria que puede ser slida
o l qui da) que ti ene di sti nta
A
R
T

C
U
L
O
37
Figura 8.
Extraccin de
com puestos
orgnicos
disueltos en
agua.
Figura 9. Detalle
de un rotavapor.
A
R
T

C
U
L
O
se mvil (proceso conocido co-
mo elucin), de tal forma que
no hay dos compuestos que
el uyan al mi smo ti empo. Los
compuestos se separan como
resultado de la retencin pro-
duci da por l a fase estaci ona-
ri a. Dado que un compuesto
slo se puede mover a lo largo
de la columna cuando se en-
cue ntra e n f ase gase osa, e l
tiempo que tarda en eluir (su
tiempo de retencin) depende
de su presin de vapor (punto
de ebullicin) y de su afinidad
qumica por la fase estaciona-
ria (por ejemplo, solubilidad).
Cuanto menor sea su presin
d e vap o r (mayo r p u n to d e
ebul l i ci n) y/o mayor sea su
solubilidad, ms tiempo tarda-
r en el ui r, debi do a que l a
proporcin de tiempo que pa-
afi ni dad por l os di sti ntos ti -
pos de compuestos de la mez-
cla. Esta mezcla se mueve so-
bre la superficie de la fase es-
taci onari a en un fl ui do ade-
cuado (un gas en el caso de la
cr omatog r af ad d e g ase s),
que se denomina fase mvil,
y l a separaci n de l os com-
puestos se produce en f un-
cin del distinto grado de re-
tencin de la fase estaciona-
ria. En la aplicacin de la cro-
matografa de gases al anli-
sis de hidrocarburos lquidos,
la fase estacionaria es una pe-
l cul a fi na, si tuada en l a pa-
red interior de una columna
capilar, larga y tubular. Estas
columnas suelen estar hechas
de s l i ce, con unos 25 m de
longitud y un dimetro inter-
no de 0,25 mm. La fase esta-
cionaria suele ser una pelcula
l qui da de me ti l si l i cona de
u n o s 0,25 mm d e e sp e so r,
que puede inmovilizarse me-
di ante enl aces qu mi cos a l a
pared de vidrio de la colum-
na. La f ase mvi l es un gas
i nerte, normal mente hel i o,
que pasa a travs de l a co-
lumna bajo presin. El nom-
bre exacto de esta tcnica es
cromatograf a gas-l qui do,
dado que i mpl i ca una f ase
mvi l gaseosa (tambi n l l a-
mada gas portador) y una fa-
se estacionaria lquida.
Tericamente, los compuestos
presentes en la muestra emer-
gen de la columna de forma
individual y a distintos inter-
valos, transportados por la fa-
Figura 10.
C olum na de
C rom atografa.
sar en fase gaseosa ser i n-
feri or. Para una seri e hom-
l oga, como l os n-al canos, l a
n a tu r a l e za q u mi ca d e l o s
mi embros i ndi vi dual es es si -
mi l ar, as que su i nteracci n
con l a fase estaci onari a ser
si mi l ar. El orden de el uci n
est, por lo tanto, determina-
do por su volatilidad, la cual
de sci e nde cuando aume nta
el nmero de carbonos.
Se i ntroduce una mezcl a en
extracto en una pequea can-
tidad de disolvente (por ejem-
plo, 1 ml de hexano) en cabe-
za de columna. Un sistema de
introduccin tpico es median-
te una jeri nga, se i nyecta a
travs de un septum (l o que
causa una m ni ma al teraci n
del flujo de gas portador) en
un puerto de inyeccin que se
calienta (300C) para que to-
da la muestra se vaporice r-
pi damente y entre en l a co-
lumna en un corto perodo de
tiempo. La cromatografa gas-
lquido requiere que los com-
ponentes se encuentren en fa-
se gaseosa, por lo que deben
tener presiones de vapor sufi-
ci entemente al tas. Los com-
puestos no vol ti l es no pue-
den analizarse mediante esta
tcni ca, dado que nunca sal -
drn de l a col umna. La el u-
cin de los compuestos menos
vo l ti l e s d e u n a me zcl a se
Figura 11.
C rom atgrafo
de G ases
Espectrm etro
de M asas.
38
Evaluacin de la distribucin
de los distintos compuestos
Como se puede observar en
l a f i g u r a 12, e s i mp o si b l e
identificar aquellos compues-
tos que no han podido ser se-
parados del resto y forman el
abultamiento (UCM) en la ba-
se del cromatograma.
Sin embargo, dado que los io-
nes de fragmentacin produ-
cidos a partir de un in mole-
cular son caractersticos de la
estructura de un compuesto,
ayudan en l a i denti f i caci n
estructural de un compuesto
previamente desconocido. Al-
gunos i ones de f ragmenta-
ci n so n p ar ti cu l ar me n te
consigue aumentando la tem-
peratura de l a col umna uni -
f orme me nte a l o l argo de l
anl i si s. El ti empo que pasa
entre que emerge la primera
y l a l ti ma mol cul a de un
mi smo co mp u e sto e s mu y
corto.
Una vez que las molculas sa-
len de la columna del GC, en-
tran en l a regi n de i oni za-
ci n d e l e sp e ctr me tr o d e
masas. Una vez all, son bom-
b ar d e ad as co n e l e ctr o n e s
energti cos, que expel en al
menos un el ectrn de cada
molcula, produciendo iones
mol ecul ares cargados posi ti -
vamente, que son acelerados
hacia el sistema de deteccin.
El e spe ctrme tro de masas
trabaj a a una pre si n muy
baja (cerca de un vac o per-
fecto), para faci l i tar el paso
de los iones hacia el detector.
Los iones moleculares tienen
una gran canti dad de ener-
ga, por lo que suelen ser bas-
tante inestables, lo que hace
que se fragmenten en i ones
ms pequeos, relativamente
estables. Mediante la aplica-
ci n de campos el ectromag-
nticos, puede modificarse la
trayectoria de estos iones de
tal forma que va a depender
del rati o masa/carga (repre-
se n tad o n o r mal me n te p o r
m/z) de un in individual. Es-
tos campos hacen que en ca-
da momento slo los iones de
un valor m/z determinado lle-
g u e n al d e te cto r (n o r mal -
me nte un mul ti pl i cador de
electrones), produciendo una
corriente medible. Modifican-
do e stos campos, se pue de
barrer un rango de val ores
m/z durante un determinado
peri odo de ti empo (1 s). La
cor r i e n te d e i on e s, q u e e s
proporci onal al nmero de
iones producidos, se registra
para cada valor de m/z duran-
te el barrido, lo que permite
construir un espectro de ma-
sas. Tambin se puede obte-
ner un grfico (ver figura 12)
(denominado cromatograma)
de la corriente total de iones
versus el tiempo.
abundantes y pueden perte-
necer a compuestos rel aci o-
nados que ti enen uni dades
estructural es en comn. Por
ejemplo, en el caso de los n-
al canos, un i n de fragmen-
tacin caracterstico de dicha
f ami l i a e s e l d e m/z=57. A
partir del cromatograma ini-
cial, se pueden seleccionar s-
l o aquel l os compuestos que
tienen el in 57 y obtendra-
mos el cromatograma de l a
figura 13.
La se l e cci n d e u n i n d e
fragmentaci n caracter sti co
se real i za para l a i denti fi ca-
cin de todas las familias de
co mp u e sto s q u e co n ti e n e
nuestro extracto (figuras 14 y
A
R
T

C
U
L
O
39
Figura 12. C rom atogram a de una m uestra de hidrocarburo poco degradado. Se pueden ver una
serie de picos correspondientes principalm ente a los n-alcanos. Estos com puestos son m uy
biodegradables. Tam bin se puede observar un abultam iento en la base del crom atogram a, que se
conoce com o m ezcla com pleja de sustancias (UC M ) que no han sido separadas por
crom atografa. A m edida que aum enta la biodegradacin, va a ir aum entando la UC M y
dism inuyendo la altura de los picos de alcanos.
10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.00 45.00
0
5000000
1e+07
1.5e+07
2e+07
2.5e+07
3e+07
3.5e+07
4e+07
4.5e+07
5e+07
5.5e+07
6e+07
6.5e+07
7e+07
7.5e+07
8e+07
8.5e+07
9e+07
Time >
Abundance
TIC: 207F1A1.D
Figura 13. C rom atogram a con slo aquellos com puestos que contienen el in 57. Podem os
observar en este caso que la UC M ha dism inuido debido a que ya no aparecen aquellos
com puestos que no tengan el in 57. Q uiz en este caso no facilita dem asiado la identificacin de
los n-alcanos porque eran fcilm ente identificables, pero en otras ocasiones es m uy til esta opcin.
10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.00 45.00
0
200000
400000
600000
800000
1000000
1200000
1400000
1600000
1800000
2000000
2200000
2400000
2600000
2800000
3000000
Time-->
Abundance
Ion 71.00 (70.70 to 71.70): 207F1A1.D
A
R
T

C
U
L
O
y, por lo tanto, una gran can-
ti dad de i nf ormaci n. Nor-
mal me n te , al e stu d i ar u n a
muestra nos solemos centrar
en una o vari as f ami l i as de
compuestos que nos permi -
ten obtener l a i nf ormaci n
15): al canos meti l substi tu -
dos, insaturados, cicloalcanos,
aromticos
Como podemos observar, en
una sol a muestra exi ste una
gran cantidad de compuestos
que andamos buscando. Es
prcti camente i mposi bl e es-
tudi ar todas l as f ami l i as de
compuestos, no slo cuantita-
tivamente (dada su cantidad)
sino tampoco cualitativamen-
te, dado que hay compuestos
para los cuales no existen ni
patrones comerciales. Sin em-
bargo, es i mportante tener
en cuenta que existen much-
si mas ms f ami l i as de com-
puestos que no se estudian, y
que tambin pueden propor-
cionar informacin.
El cromatograma de corriente
total de iones frente al tiem-
po, para cada muestra, se al-
macena despus del anlisis,
para que e n cual qui e r mo-
mento tengamos toda esta
informacin a nuestro alcan-
ce. Para hacernos una idea de
la cantidad de compuestos (y,
por l o tanto, l a canti dad de
i nformaci n) que hay en un
solo cromatograma, baste de-
cir que la informacin conte-
n i d a e n u n cr o mato g r ama
puede l l egar a ocupar unos
12 Megabytes.
Bibliografa
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Petrol eum Geochemi stry.
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Agencia Medioambiental
Estadouni dense (U.S.-
E.P.A.) (www.epa.gov).
Norma ISO TR 11046: "Soi l
Qual i ty Determi nati on
of mi neral oi l content
Method by infrared spec-
trometry and gas chroma-
tographic method.
10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.00 45.00
0
5000000
1e+07
1.5e+07
2e+07
2.5e+07
3e+07
3.5e+07
4e+07
4.5e+07
5e+07
5.5e+07
6e+07
6.5e+07
7e+07
7.5e+07
8e+07
8.5e+07
9e+07
Time-->
Abundance
TIC: 207F1A1.D
10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.00 45.00
0
200000
400000
600000
800000
1000000
1200000
1400000
1600000
1800000
2000000
2200000
2400000
2600000
2800000
3000000
Time-->
Abundance
Ion 71.00 (70.70 to 71.70): 207F1A1.D
10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.00 45.00
0
100000
200000
300000
400000
500000
600000
700000
800000
900000
1000000
1100000
1200000
1300000
1400000
Time-->
Abundance
Ion 183.00 (182.70 to 183.70): 207F1A1.D
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0
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400000
600000
800000
1000000
1200000
1400000
1600000
1800000
2000000
Time-->
Abundance
Ion 191.00 (190.70 to 191.70): 207F1A1.D
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0
50000
100000
150000
200000
250000
300000
350000
400000
450000
500000
550000
600000
650000
Time-->
Abundance
Ion 217.00 (216.70 to 217.70): 207F1A1.D
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0
200000
400000
600000
800000
1000000
1200000
1400000
1600000
1800000
2000000
2200000
2400000
2600000
2800000
Time-->
Abundance
Ion 83.00 (82.70 to 83.70): 207F1A1.D
Ion 55.00 (54.70 to 55.70): 207F1A1.D
A
B
C
D
E F
Figura 14. C rom atogram a de la prim era fraccin (A) (hidrocarburos saturados) de la m uestra de
chapapote y de distintas fam ilias presentes en dicha fraccin m ediante la seleccin de iones de
fragm entacin caractersticos: (B) alcanos (in 71), (C ) isoprenoides (in 183), (D) hopanos (in
191), (E) esteranos (in 217) y (F) cicloalcanos (iones 83 y 55).
10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.00 45.00
0
50000
100000
150000
200000
250000
300000
350000
400000
450000
500000
Time-->
Abundance
Ion 128.00 (127.70 to 128.70): 207F2A1.D
10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.00 45.00
0
2000000
4000000
6000000
8000000
1e+07
1.2e+07
1.4e+07
1.6e+07
1.8e+07
2e+07
2.2e+07
2.4e+07
Time-->
Abundance
TIC: 207F2A1.D
10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.00 45.00 0 20000 40000 60000
80000
100000
120000
140000
160000
180000
200000
220000
240000
260000
280000
300000
320000
340000
Time-->
Abundance
Ion 252.00 (251.70 to 252.70): 207F2A1.D
Ion 253.00 (252.70 to 253.70): 207F2A1.D
Ion 125.00 (124.70 to 125.70): 207F2A1.D
10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.00 45.00
0
50000
100000
150000
200000
250000
300000
350000
400000
450000
500000
Time-->
Abundance
Ion 134.00 (133.70 to 134.70): 207F2A1.D
A
C D
B
10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.00 45.00
0
100000
200000
300000
400000
500000
600000
700000
800000
900000
1000000
1100000
1200000
Time-->
Abundance
Ion 191.00 (190.70 to 191.70): 207F2A1.D
10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.00 45.00
0
100000
200000
300000
400000
500000
600000
700000
800000
900000
1000000
Time-->
Abundance
Ion 212.00 (211.70 to 212.70): 207F2A1.D
F
E
Figura 15. C rom atogram a de la segunda fraccin (A) (hidrocarburos arom ticos y benzotiofenos)
de la m uestra de chapapote y de distintas fam ilias presentes en dicha fraccin m ediante la
seleccin de iones de fragm entacin caractersticos: (B) naftaleno (in 128) y dim etilnafatalenos
(in 156, 141 y 128), (C ) benzo(a)pireno (iones 252, 253 y 125), (D) m etilbencenos (in 134),
(E) m etilfenantrenos y m etilantracenos (in 191) y (F) benzotiofenos (in 212).
40