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Introduccin
En PCR, el cido desoxirribonucleico (ADN) es
el analito. Por tanto, una buena muestra impli-
ca siempre un correcto proceso de obtencin de
esta molcula a partir de material biolgico.
La extraccin de ADN consta de una etapa de
lisis, que consiste en romper las estructuras
que confinan el citoplasma y liberar al medio su
contenido y otra de purificacin, que implica la
retirada de la solucin final de la mayora de
elementos que pueden interferir en la PCR.
De los tres pasos crticos que componen el an-
lisis de patgenos por PCR (Fig. 1), la extrac-
cin de ADN es quizs el ms desconocido y
sobre el que ms control podemos ejercer.
La extraccin del ADN de las clulas o virus
donde se halla confinado es un paso previo en
muchos procedimientos analticos y diagnsti-
cos.
EtapasenlaextraccindeADN
Los pasos necesarios para una correcta extrac-
cin y purificacin del ADN mediante un proce-
dimiento qumico son:

1. Lisis de las clulas o virus. Las sales caotr-
picas ayudan a romper la estructura tridi-
mensional de macromolculas como las
protenas o los cidos nucleicos consiguien-
do su desnaturalizacin. La adicin de un
detergente como el SDS es necesaria a me-
nudo para eliminar las membranas.
2. Degradacin de la fraccin proteica asocia-
da al ADN. Se consigue mediante la adicin
de una proteasa. La fraccin proteica puede
precipitarse mejor con la ayuda de sales
como el acetato de amonio o el acetato
sdico.
3. Purificacin. Consta de 3 fases:
Precipitacin del ADN. El ADN es insolu-
ble en alcohol, por lo que se puede preci-
pitar etanol fro o isopropanol i recuperar
mediante una centrifugacin. El alcohol
del sobrenadante se llevar las sales aa-
didas previamente.
Lavado del pellet. Se realiza con alcohol
fro volviendo a centrifugarse
Recuperacin. El sedimento se puede re-
suspender en agua o tampn Tris tras ser
secado completamente.
La confirmacin de la presencia de ADN se
lleva a cabo mediante electroforesis en un gel
de agarosa i posterior tincin con bromuro de
etidio y observacin con luz UV o directamente
al espectrofotmetro mediante espectro de
absorcin de 200 a 350 nm. El ADN purificado
se puede cuantificar con un espectrofluormetro
mediante el uso de fluorforos especficos
(Picogreen, Molecular Probes)
El paso 3 puede realizarse con la ayuda de mi-
nicolumnas equipadas con una membrana de
slica que retiene especficamente el ADN per-
mitiendo el paso de las molculas y sales que
acompaan la reaccin de lisis. Finalmente se
lava con alcohol y se eluye el contenido
InhibidoresdelaPCR
Se trata de substancias que interfieren con las
ADN polimerasas termoestables ya sea median-
te el bloqueo directo total o parcial de su activi-
dad cataltica o mediante la unin directa al
ADN de doble cadena. Por ejemplo, algunas
substancias interaccionan con los iones Mg
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La extraccin y purificacin del ADN para el anlisis por PCR.
Mitos y realidades
De los tres pasos
crticos que com-
ponen el anlisis de
patgenos por
PCR, la extraccin
de ADN es quizs
el ms desconoci-
do...

...las suspensiones
densas de bacterias
gramnegativas
pueden liberar su
ADN en condicio-
nes bastante sua-
ves...

La incorporacin
de controles inter-
nos de amplifica-
cin en los kits
permite el control
del nivel de inhibi-
cin de las reaccio-
nes...
Nm. 3
EneroFebrerode2009
InformacionessobreAnlisisMicrobiolgicosporPCR
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Figura1.LaextraccindeADNesunpasoclaveenlosanlisismicrobiolgicosporPCR
Enriquecimiento ExtraccinADN DeteccinPCR
Tabla 1. Principales substancias inhibidoras de la PCR
Inhibidor Origen
Sales biliares Heces
Polisacridos complejos Heces, material vegetal
Colgeno Tejidos
Grupo hemo Sangre
cidos hmicos Suelo, material vegetal
Melanina y eumelanina Pelo, piel
Mioglobina Tejido muscular
Proteinasas Leche
Iones de calcio Leche, huesos
Urea Orina
Hemoglobina, Lactoferrina Sangre
Inmunoglobina G (IgG) Sangre
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(un cofactor crtico de la actividad cataltica) o disminuyen su
disponibilidad pudiendo inhibir la PCR.
En la tabla 1 se recogen algunas de las principales substancias
inhibidoras conocidas.
Otra importante fuente de inhibicin son los propios reactivos
que se usan en el proceso de extraccin de ADN, como por
ejemplo, el exceso de KCl, NaCl y otras sales, detergentes ini-
cos, etanol e isopropanol, fenol y otros.
Los inhibidores pueden eliminarse mediante purificacin
qumica del extracto (pasos 3 a 6) o fsica mediante columnas
de slica.
ExtraccindeADNensuspensionesbacterianas
De todas las muestras biolgicas que podemos someter a un
proceso de extraccin de ADN, las suspensiones bacterianas,
son quizs las que ofrecen menos problemas por la homoge-
neidad y riqueza del material. En particular, las suspensiones
densas de bacterias gramnegativas pueden liberar cantidad
suficiente de ADN en condiciones bastante suaves como pue-
den ser una simple ebullicin, congelacin o una combinacin
de ambas (frezze & thaw).

EsnecesarialapurificacindeADNenladeteccin
depatgenosenalimentosporPCR?
El laboratorio de Microbiologa que decide incorporar la PCR
a sus mtodos de investigacin de bacterias patgenas en
alimentos, lo hace buscando rapidez y simplicidad. La purifi-
cacin del ADN tras el proceso de lisis y liberacin tiene como
ventaja la obtencin de un analito sin inhibidores a cambio de
un sensible aumento del tiempo de anlisis y de los pasos de
manipulacin.
Analizar directamente un caldo de enriquecimiento tras un
proceso de extraccin primaria de ADN (lisis celular) suele
producir resultados satisfactorios para la mayora de matrices
alimentarias por lo que un paso
de purificacin no es estricta-
mente necesario. Adems, los
kits de anlisis de patgenos
por PCR incorporan detectores
de inhibicin (controles inter-
nos de amplificacin). Sola-
mente aquellas matrices cuya
presencia de inhibidores no
pueda ser contrarrestada dilu-
yendo el extracto de ADN obli-
garn a plantear la adopcin de
tcnicas de extraccin de ADN
que aseguren un extracto puro.

ObtencindeADNsinpasodepurificacin.
Cada casa comercial acompaa a sus detectores con un mto-
do de extraccin de ADN. stos son fundamentalmente tres:
1. Chelex. El uso de una resina de slica ayuda a separar
selectivamente el ADN de la solucin. Es un mtodo rpi-
do, pero muy poco eficacia en bacterias grampositivas.
2. Ebullicin (combinado con congelacin). Algunos fabri-
cantes incorporan un paso de ebullicin de la muestra
previo a la PCR como nica accin para extraer el ADN de
la muestra. Si bien esto puede ser usado en suspensiones
con nmeros elevados de bacterias gramnegativas, su baja
eficiencia especialmente con organismos grampositivos,
reduce notablemente el nivel de deteccin del mtodo.
3. DNAready (Microbial) Se trata de un tampn de lisis
que incorpora los elementos necesarios para buscar un
equilibrio entre eficiencia y pureza que adems est des-
arrollado para ser especialmente efectivo con bacterias
grampositivas.

Conclusiones
En Microbiologa de los alimentos, los inhibidores de la PCR
provienen principalmente de la matriz alimentaria analizada o
de los medios utilizados para el enriquecimiento. La incorpo-
racin de controles internos de amplificacin en los kits per-
mite conocer el nivel de inhibicin de las reacciones.
Las bacterias no suelen contener substancias inhibidoras, por
lo que en la mayora de casos una extraccin primaria (lisis y
liberacin del ADN) es suficiente para tener resultados satis-
factorios. Esto no significa necesariamente que se puedan
siempre usar mtodos poco drsticos, pues stos no son efecti-
vos para extraer el ADN de las bacterias grampositivas.
La utilizacin de mtodos de purificacin post-extraccin
como por ejemplo las minicolumnas de slica implica un au-
mento en el coste y en el nmero de manipulaciones (Tabla 2)
lo que hace que slo sea aconsejable en aquellas matrices en
las que los mtodos primarios no pueden eliminar los inhibi-
dores.

Bibliografa
Rdstrm, P. et al. (2004) Pre-PCR processing: Strategies to
generate PCR-compatible samples. Mol. Biotechnol. 26, 133
46.

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Edificio J. Casademont, E
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Tabla 2. Comparacin del material, tiempo y costes asociados a diferentes mtodos de extraccin de
ADN comnmente utilizados.
Caracterstica Macherey-Nagel DNAready Chelex F&T
Pasos centrifugacin 6 1 2 2
Pasos pipeteo 10 2 3 3
Cambios de tubo 3 1 2 2
Coste por reaccin () >3 <1,5 <1,5 <1,5
Tiempo (h)* 2h 30min 1h 1h 20min 1h 30min
Cambios T 2 3 3 7