Un cultivo in vitro es aquel realizado sobre un medio

nutritivo en condiciones estriles. Puede ser de: plantas,

semillas, embriones, rganos, explantos, clulas y
protoplstos.
Cultivo in vitro: propagacin de plantas
Hojas de crisantemo
enraizando
Plntula de crisantemo en envase
Magenta
Caractersticas del cultivo in vitro:
Es empleado a microescala
Hay optimizacin de las condiciones
ambientales
No se produce el patrn normal de
desarrollo de una planta
Hace factible la manipulacin de las clula
individuales o tejidos. Fundamental para
transformacin gentica.
Pioneros del Cultivo in vitro
Tipos de Cultivo in vitro. Propagacin y
regeneracin de plantas
Planta donante
Plantas regeneradas
Microesporas/gametos
Explantos:
trozos hojas, tallos,
meristemos, etc.
Protoplastos
Suspensin
de clulas
Callos
ORGANOGNESIS
EMBRIOGNESIS
Protoplastos
Callos
Suspensin de clulas
Microesporas/gametos
Explantos:
trozos hojas, tallos,
meristemos, etc.
Condiciones de los cultivos in vitro
ESTERILIDAD!!
Esterilizacin del material vegetal
Se emplean medios nutritivos muy ricos, por lo que
la esterilizacin de todo el material es esencial
TOTIPOTENCIA Capacidad de las clulas vegetales
de regenerar un organismo completo.
REPROGRAMACIN DESARROLLO Se altera el
patrn de clulas que estaban completamente
diferenciadas.
COMPETENTES No todas las clulas que responden
al cambio de programa de desarrollo.
Crecimiento
Incremento biomasa por
divisin y elongacin celular
Morfognesis
Organizacin de la estructura de
tejidos y rganos. Arquitectura y
simetra de la planta
Diferenciacin
Cambios de forma y funcin de
orgnulos, clulas y tejidos
DESARROLLO
Microescala
Auxinas
Se transporta polarmente desde el pice de parte
area o raz.
El transporte de larga distancia se produce por el
floema.
Junto con las citoquininas son esenciales para la
viabilidad de las plantas: no hay mutantes
deficientes.
La estructura qumica de las auxinas es diversa.
Pueden acumularse en formas inactivas
conjugadas a oligosacridos y aminocidos.
Auxinas naturales encontradas en plantas
Auxinas sintetizadas qumicamente
Proliferacin de races secundarias
[Auxina] > 10
-8
M causa el inicio
de divisiones celulares en el
periciclo.
Regeneracin de plantas
favoreciendo el enraizamiento
Control Alta [auxina]
Interaccin con citoquinina y cido
abscsico en la dominancia apical de tallo
La auxina est implicada en la redistribucin de las citoquininas
sintetizadas en la raz hacia el pice.
Escisin del pice: mayor nivel de citoquinina en las yemas
laterales.
El cido abscsico se acumula en las yemas laterales latentes. La
escisin del pice disminuye su contenido.
Escisin del pice causa
proliferacin de tallos axilares
Las se descubrieron al buscar factores que
indujeran divisiones celulares y promoviesen el
crecimiento de material vegetal.
Se probaron multitud de substancias: extractos de levadura, jugo
de tomate, etc.
La leche de coco (rica en zeatina) fue muy efectiva, ms en
conjuncin con auxina
Skoog descubri que DNA desnaturalizado de esperma de
arenque era muy efectivo en promover divisin celular
La kinetina fue la primera citoquinina identificada producida de
sntesis por la degradacin trmica de DNA
Citoquininas: descubiertas en cultivos in vitro
Diferentes tipos de citoquininas
Natural Sinttica
Bencilamino
purina (BAP)
Sinttica
Produccin de callos por acumulacin
de citoquininas: Agrobacterium
CALLO tejido desdiferenciado en
continua divisin.
AGALLA tumor producido por la
infeccin de Agrobacterium
tumefaciens por acumulacin de
citoquininas y auxinas
En la infeccin, se produce la insercin de genes bacterianos en el
genoma de la clula vegetal, portados en el T-DNA. stos codifican
enzimas para la sntesis de dichas fitohormonas.
Proliferacin de parte area
Control + Citoquinina
Distintas molculas tienen diferente actividad
Auxinas y citoquininas tienen diferente nivel de
actividad biolgica segn la molcula empleada:
establecer la dosis.
Regeneracin por organognesis
Concentracin de IAA (mg/L)
0 0,005 0,03 0,18 1,18 3,0
0
0
,
2
1
,
0
C
o
n
c
e
n
t
r
a
c
i

n

d
e

k
i
n
e
t
i
n
a
(
m
g
/
L
)
R
A

Z
C
A
L
L
O
H
O
J
A
Regeneracin de plantas por organognesis
El callo se somete a una relacin auxina/citoquinina baja, para
inducir la formacin de parte area.
En condiciones de esterilidad, se secciona la parte area
formada.
Se transplanta a un medio de cultivo con una relacin
auxina/citoquinina alta, para inducir la formacin de races.
Una vez generadas races, se transfieren a un sustrato con alta
capacidad de retencin de agua (p. ej. turba).
Las plntulas se cultivan en condiciones de humedad ptima
para evitar su desecacin, hasta que la raz se afianza.
Protoplastos
Obtencin enzimtica
Diversos materiales se pueden incorporar a un
protoplasto: orgnulos, DNA plasmdico, bacterias, etc.
Variacin somaclonal
Beneficiosa
Perjudicial: indeseable
en la generacin de
plantas transgnicas
Transformacin de plantas: Agrobacterium
Insercin del T-DNA con
oncogenes y genes de
metabolismo de opinas
Pioneros del desarrollo de vectores de
transformacin basados en Agrobacterium
Jeff Schell Mark Van Montagu
Plsmido Ti de Agrobacteriumtumefaciens
Estructura general del T-DNA
LB
RB
Genes vir NO se transfieren
SELECCIN DE
PLANTAS
TRANSGNICAS
Seleccin de trasngnicos con kanamicina
Slo unas pocas
clulas son
transgnicas: varios
pasos de seleccin
Vectores binarios desarmados derivados
del plsmido Ti de A. tumefaciens
MnSOD
35S
nptII
35S LB RB Nos T 35S T
gcgggactctaatcataaaaac
nos02R
gaatcctgttgccggtcttgcg
nos01F
Nos term
(127 pb)
cctctccaaatgaaatgaac
35S02R
tgccatcattgcgataaagg
35S01F
35S
(234 pb)
gaagaactcgtcaagaaggc
nptII02R
gaagagcatcaggggctc
nptII01F
nptII
(317 pb)
gtcgcataaaattgaaggag
Rbcs02R
tccctgtttcaaggaagc
Rbcs01F
Rubisco
(349 pb)
Cebador negativo Cebador positivo Fragmento
Cebadores especficos utilizados