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OFICINA ESPANOLA DE PATENTES Y MARCAS ESPANA

11 N umero de publicaci on: 21 51

k 2 109 182 kN umero de solicitud: 9502266 kInt. Cl. : A01N 63/04

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C12N 1/14 //(C12N 1/14 C12R 1:885)

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SOLICITUD DE PATENTE

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22 Fecha de presentaci on: 07.11.95

71 Solicitante/s: Universidad de Salamanca

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Patio de Escuelas Menores, N 1 37007 Salamanca, ES Consejo Superior de Investigaciones Cient cas. Grondona Espa na, Isabel y Garc a Ancha, Isabel

43 Fecha de publicaci on de la solicitud: 01.01.98

72 Inventor/es: Monte V azquez, Enrique;

43 Fecha de publicaci on del folleto de la solicitud:

74 Agente: Hern andez Covarrubias, Arturo

01.01.98

54 T tulo: Formulaci on l quida a base de cepas de los hongos lamentosos Trichoderma harzianum y

Trichoderma viride.

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Formulaci on l quida a base de cepas de los hongos lamentosos Trichoderma harzianum y Trichoderma viride. Comprende fuentes de carbono, sales minerales y trazas de elementos como nutrientes org anicos e inorg anicos, y estructuras vegetativas y reproductoras de cepas del hongo lamentoso Trichoderma harzianum Rifai identicadas como Trichoderma harzianum IMI 352939, Trichoderma harzianum IMI 352940, Trichoderma harzianum IMI 352941; y Trichoderma harzianum CECT 20179; y Trichoderma viride Pers.: Fr identicada como Trichoderma viride CECT 20178. La formulaci on es util como agente de control biol ogico, frente a enfermedades de vegetales y de material vegetal y biodeterioro producidos o transmitidos por hongos lamentosos y otros enemigos de las plantas, y como agente de biolixiviaci on.

57 Resumen:

Venta de fasc culos: Ocina Espa nola de Patentes y Marcas. C/Panam a, 1 28036 Madrid

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DESCRIPCION Formulaci on l quida a base de cepas de los hongos lamentosos trichoderma harzianum y trichoderma viride.
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Esta invenci on se relaciona con una formulaci on con Trichoderma spp. para su aplicaci on como agente de control biol ogico de los enemigos de las plantas y material vegetal, entidades biol ogicas causantes de biodeterioro y como agente de biolixiviaci on. M as concretamente, la presente invenci on se relaciona con una formulaci on l quida, con nutrientes org anicos e inorg anicos en disoluci on, que contiene en suspensi on estructuras vegetativas y reproductoras de una mezcla de cepas de los hongos lamentosos Trichoderma harzianum Rifai y Trichoderma viride Pers.:Fr. La formulaci on seg un la invenci on es u til como agente de control biol ogico, frente a enfermedades de vegetales y de material vegetal y biodeterioro producidos o transmitidos por hongos lamentosos y otros enemigos de las plantas, y como agente de biolixiviaci on. Los componentes qu micos y biol ogicos de la formulaci on est an concentrados para que, durante el transporte y almacenamiento, no se produzca la germinaci on de las esporas de Trichoderma. Una vez dilu da la formulaci on, inmediatamente antes de su aplicaci on al suelo, cultivos, etc., los componentes qu micos de la misma pueden ser asimilados por las esporas del hongo que iniciar a la germinaci on en pocos minutos. En varias horas se consigue que el microorganismo se multiplique. A trav es del uso de la formulaci on seg un la invenci on, se pueden conseguir los siguientes efectos beneciosos: Controlar enfermedades de vegetales y material vegetal aprovechando la capacidad antagonista que tienen cuatro cepas de T. harzianum y una de T. viride sobre otros hongos del suelo.

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Reducir la concentraci on de in oculo de microorganismos pat ogenos y sus vectores, aprovechando la facilidad de colonizaci on de las cinco cepas de Trichoderma. Reducir la aplicaci on de pesticidas qu micos polucionantes, con incidencia sobre la salud humana y sobre otros seres vivos, actualmente utilizados en Agricultura. Controlar microorganismos causantes de biodeterioro de alimentos y sus envases, productos almacenados, materiales de construcci on, postes, cercados, etc.

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Obtenci on selectiva de material geol ogico por medio de la acci on microbiana de las cepas de T. harzianum y de T.viride presentes en la formulaci on. En consecuencia, la formulaci on seg un la invenci on puede aplicarse espec camente para:

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- el control de pat ogenos y/o vectores de pat ogenos, de origen f ungico y bacteriano, con importancia en Agricultura, Silvicultura, Jardiner a, Praticultura y causantes de alteraci on y descomposici on de material vegetal; - el control de microorganismos causantes de biodeterioro de alimentos y sus envases, materiales de construcci on, materias primas y productos manufacturados; - la colonizaci on de suelos que requieran el establecimiento de una nueva microora, especialmente despu es de una desinfecci on y solarizaci on del suelo;

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- la extracci on biol ogica de material geol ogico (Biolixiviaci on). Puede denirse el Control Biol ogico como la utilizaci on de organismos naturales o modicados, genes o productos g enicos, para reducir los efectos de organismos indeseables, y para favorecer a organismos u tiles para el hombre, tales como cultivos, a rboles, animales y microorganismos beneciosos. M as de la mitad de los hongos lamentosos que se utilizan en el Control Biol ogico de otros hongos pat ogenos de vegetales, pertenecen a los g eneros Trichoderma y Gliocladium. Trichoderma es un hongo ampliamente distribu do en la naturaleza, f acil de aislar y cultivar, que 2

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crece de forma r apida en muchos sustratos, no afecta al hombre, animales y plantas superiores, act ua como micopar asito (par asito de otros hongos), compite bien por el alimento y por el espacio, produce antibi oticos y tiene un sistema enzim atico capaz de atacar a una amplia gama de pat ogenos. Los hongos del g enero Trichoderma, y en particular la especie Trichoderma harzianum, constituyen una alternativa biol ogica m as limpia, no acumulable en la cadena alimentaria y respetuosa con el medio ambiente, en contraposici on a los pesticidas qu micos polucionantes de uso com un en Agricultura. Desde muy antiguo se sabe que existen hongos capaces de controlar a otros hongos y en ello se ha sustentado el equilibrio natural de los microorganismos existentes en el suelo. As , se conoce el valor potencial de Trichoderma como agente de Control Biol ogico al haberse podido observar que Trichoderma lignorum (T. viride) era un par asito que se enroscaba en torno a las hifas de otro hongo, Rhizoctonia solani, produciendo su muerte. A este respecto, especies tales como Phytophthora, Pythium y Rhizopus as como Sclerotium rolfsii pod an ser parasitadas por T. viride. En base a estos resultados, surgi o la posibilidad de utilizar inoculaciones abundantes con T. viride para controlar ciertos pat ogenos. Aunque Trichoderma se reconoci o, en principio, como un antagonista de hongos, tambi en se ha descrito como antagonista de ciertas bacterias pat ogenas. Trichoderma ha sido estudiado ampliamente por sus propiedades antibi oticas de posible utilizaci on cl nica, por sus sistemas enzim aticos en procesos alimentarios y por su poder de biodegradaci on de residuos s olidos y aguas residuales. Otros estudios han establecido el micoparasitismo de Trichoderma sobre muchos Oomicetos, Zigomicetos, Ascomicetos, Basidiomicetos y hongos anam orcos. As , la omnipresencia de Trichoderma en suelos naturales y agr colas de todo el mundo, es una prueba m as de que es un excelente competidor por el espacio y por recursos nutritivos.
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Por ejemplo, los hongos de la podredumbre de la madera han sido controlados en muchos casos por la presencia o el uso de Trichoderma spp., debido a la capacidad de Trichoderma para utilizar todos los carbohidratos no estructurales, evitando el establecimiento del Basidiomiceto destructivo y dejando la madera m as permeable a la penetraci on de conservantes qu micos.
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La capacidad competitiva de Trichoderma, y su exito como agente de Control Biol ogico, se ven afectados por las propiedades del suelo. As , se ha observado que el pH ten a inuencia sobre el valor relativo de Trichoderma como antagonista de R. solani, afectando al crecimiento y desarrollo de cada hongo.
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Cuando las condiciones de sequ a en el suelo se mantienen durante largos per odos de tiempo, las poblaciones de Trichoderma descienden. Sin embargo, ha de mencionarse que ciertas cepas de T. hamatum y T. pseudokoningii est an adaptadas a condiciones de elevada humedad del suelo y que T. viride y T. polysporum est an restringidos a a reas donde prevalecen las bajas temperaturas, mientras que T. harzianum es m as frecuente en regiones de clima templado, y T. hamatum y T. koningii est an ampliamente distribuidos en a reas de condiciones clim aticas diversas. La disponibilidad de hierro es importante para el crecimiento y la capacidad competitiva de Trichoderma.

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La competici on por un determinado sustrato no excluye otros mecanismos de acci on, como puede ser el micoparasitismo. Tambi en se ha observado que cuando se aplicaban fungicidas que eran t oxicos para Trichoderma, para controlar las manchas de las hojas de cacahuete, hab a un aumento de la enfermedad causada por S. rolfsii. No obstante, no todos los fungicidas son t oxicos para Trichoderma. As , el fungicida Tiram no ten a efecto sobre Trichoderma y Penicillium. En suelos tratados con Tiram, Trichoderma sobreviv a bien, se multiplicaba, y proteg a, frente a Pythium, las pl antulas de guisante, durante un tiempo considerable, despu es de que el fungicida alcanzara niveles no t oxicos para el pat ogeno. Igualmente, se han encontrado efectos beneciosos similares con T. harzianum y el fungicida Metalaxyl ha proporcionado efectos interesantes, aplicado a la semilla de guisante, antes de pildorarla con conidios de T. harzianum. El Benomilo as como otros fungicidas benzimidaz olicos (como Tiabendazol y Metiltiofanato), inhiben fuertemente a Trichoderma. Captan, Procimidona y Vinclozolin no son inhibidores de Trichoderma. El antagonismo del suelo frente a Trichoderma es el factor m as importante en la regulaci on del nivel 3

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del posible in oculo de este hongo cuando se aplica en un ambiente natural. El conjunto de formas vivas del suelo y la naturaleza f sica y qu mica del mismo, desempe nan el papel m as importante en la reduccci on del n umero de prop agulos de Trichoderma, despu es de su introducci on como agente de Control Biol ogico.
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Seg un el estado de la t ecnica, el Control Biol ogico con Trichoderma se puede llevar a cabo: -. Introduciendo el antagonista en el suelo con una base alimenticia, mediante formulaciones con conidios o en polvos, pasta o p ldoras de alginato, que contienen biomasa obtenida por fermentaci on.

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-. Por tratamiento de semillas. Se requiere menor cantidad de material biol ogico y el exito depender a de: los aislamientos utilizados el tipo de enfermedad el tipo de cultivo la edad de los antagonistas la temperatura y pH del suelo el tipo de suelo y los microorganismos que existan en el el estado nutricional del antagonista la densidad del in oculo en la semilla el potencial de in oculo del antagonista en el suelo el momento de la siembra

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-. Por aplicaci on a partes a ereas de la planta (en hojas, en heridas de a rboles o en el momento de la poda) Estas formulaciones suelen ser l quidas. Los primeros resultados pr acticos de control de enfermedades de plantas con Trichoderma fueron los obtenidos mediante esterilizaci on parcial del suelo, en la lucha contra la podredumbre de la ra z de c tricos debida a A. mellea. Se demostr o que la esterilizaci on parcial del suelo con pesticidas selectivos debilitaba el crecimiento del pat ogeno y permit a una proliferaci on de Trichoderma, que era capaz de invadir y matar a A. mellea. El tratamiento del suelo con vapor, la solarizaci on y otros m etodos, pueden modicar el ecosistema hasta el punto de favorecer la proliferaci on de Trichoderma. El calentamiento subletal de suelos infectados con A. mellea, por ejemplo, estimulaba al residente m as resistente al calor, Trichoderma, que entonces proliferaba y parasitaba a un debilitado A. mellea. Como sustratos para la aplicaci on de Trichoderma en el Control Biol ogico, se han utilizado gr anulos de tierra de diatomeas impregnado con melazas, salvado de trigo, gr anulos de corteza de a rbol, turba m as salvado de trigo, granos de cebada, compost de corteza de madera y una formulaci on de gr anulos de material vegetal conteniendo T. harzianum y T. polysporum. Un Trichoderma sp. formulado en aceite de motor, ha sido utilizado con exito para inocular pinos durante el per odo de poda. Otros ejemplos incluyen la adici on de esporas de Trichoderma al suelo junto con un fertilizante l quido, en caso de que los aislamientos utilizados puedan tolerar una presi on osm otica alta. Los medios de cultivo para la fermentaci on l quida deben incluir productos agr colas accesibles y baratos, tales como glucosa, almid on, ma z hidrolizado y productos de soja, suero y melazas. As , se han producido in oculos viables de Trichoderma, en un tanque de fermentaci on, para obtener, despu es de un per odo de incubaci on, una gran cantidad de biomasa compuesta de micelio, clamidosporas y alg un conidio. Tambi en se ha preparado otra formulaci on, secando al aire la biomasa, moli endola y dilua disponible comercialmente como transportador para el in oculo del yendo el polvo con Pyrax R , que est hongo. Otros soportes comerciales que se vienen utilizando con frecuencia en el Control Biol ogico son el AgroLig R y el Pelgel R . Una mejora en los sistemas de aplicaci on es la encapsulaci on de prop agulos, basada en la capacidad de las soluciones acuosas de alginato s odico para reaccionar con cationes de ciertos metales (Ca 2+) y formar geles. Una modicaci on posterior a esta t ecnica ha sido la incorporaci on de transportadores alimenticios (ej. salvado) al alginato, en ntimo contacto con el antagonista, para proporcionar los nutrientes necesarios.

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Igualmente, la adici on de quitina o de paredes celulares a los in oculos, durante el pildorado de las semillas, aumenta la ecacia de T. hamatum como protector de guisantes y r abanos. El compost de corteza de arboles ha demostrado ser un medio excelente para el crecimiento y la liberaci on de Trichoderma spp.
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Como sistema de aplicaci on tambi en se ha propuesto el uid drilling para Control Biol ogico en plantas con semillas peque nas. El salvado de trigo, junto con turba, constituye una mezcla o ptima para la supervivencia de Trichoderma, como una fuente de in oculo de Control Biol ogico, para mezclar en suelo y macetas. Tambi en se ha recurrido a la aplicaci on de micelio joven de Trichoderma sobre un sustrato parcialmente consumido, al considerarse que el micelio es mucho m as resistente a la fungistasis del suelo que los conidios al germinar. Por tanto, podr a parecer m as ecaz aplicar Trichoderma con una base alimenticia parcialmente consumible, que suplementar Trichoderma con nutrientes adicionales, en el momento de su aplicaci on. Los gr anulos de alginato presentan variabilidad en cuanto a calidad y comportamiento en el suelo. Actualmente, y como forma alternativa, se aplica Trichoderma a las semillas en forma de monocapa on bituminoso. alrededor de las mismas, sobre una matriz s olida, que puede ser de Agro-Lig R o carb

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A la vista de estos antecedentes, y de acuerdo con la presente invenci on, se han realizado estudios de selecci on de cepas de Trichoderma para su aplicaci on como agentes de Control Biol ogico en el control de enfermedades producidas por hongos del suelo en vegetales, principalmente remolacha. Como resultado de estas investigaciones, se seleccionaron tres cepas de Trichoderma harzianum, las cuales han sido depositadas, al amparo del Tratado de Budapest, en la Colecci on de Cultivos del International Mycological Institute de Egham (Reino Unido), con los n umeros de registro IMI 352939, IMI 352940 e IMI 352941, respectivamente; y una cepa de Trichoderma viride y otra de Trichoderma harzianum que tambi en se depositaron, al amparo del Tratado de Budapest, en la Colecci on Espa nola de Cultivos Tipo de Burjasot (Valencia), con los n umeros de registro CECT 20178 y CECT 20179, respectivamente. La ecacia de la aplicaci on de estos microorganismos en una p ldora recubriendo la semilla, como alternativa a los pesticidas qu micos habitualmente utilizados, ha sido demostrada en ensayos realizados a nivel de campo, en ambiente natural. Sin embargo, el pildorado de semillas limita el espectro de actuaci on de Trichoderma, al restringir su aplicaci on al momento de la siembra.

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Ser a por tanto interesante poder aportar una formulaci on l quida que sirviera de veh culo al in oculo de Trichoderma. Partiendo de las premisas de que no existe un agente de Control Biol ogico universal y que no todas las cepas de Trichoderma presentan la misma capacidad antagonista cuando son utilizadas como agentes de Control Biol ogico, ya que dentro de la especie T. harzianum existen diferentes tipos siol ogicos que pueden ser ecaces o inecaces en cada caso concreto frente a un determinado pat ogeno, la utilizaci on de una mezcla con cuatro cepas de T. harzianum y una de T. viride seleccionadas frente a distintos pat ogenos, ampl a el espectro de actuaci on de la formulaci on. Por ello, su aplicaci on en patosistemas en los que se vean implicados diversos microorganismos (como pueden ser los diferentes hongos que intervienen en las ca das de pl antulas o los pat ogenos causantes de colapsos facilitados por un estr es h drico, etc.), resulta ventajosa al no existir un u nico agente, ya sea qu mico o biol ogico, que los controle. Dado que cada cepa de Trichoderma es sumamente espec ca frente a unos pat ogenos concretos, la aplicaci on de las tres cepas en una mezcla, dentro de la misma formulaci on, incrementa las posibilidades de exito del producto bajo condiciones ambientales y pat ogenos diferentes. Por tanto, de acuerdo con la presente invenci on, se proporciona ahora una formulaci on l quida, con nutrientes org anicos e inorg anicos en disoluci on, que contiene en suspensi on estructuras vegetativas y reproductoras de una, dos, tres o cuatro de las cepas del hongo lamentoso Trichoderma harzianum Rifai y/o Trichoderma viride Pers.:Fr. anteriormente identicadas. La formulaci on seg un la invenci on es u til, como ya ha sido indicado, como agente de control biol ogico y como agente de biolixiviaci on.
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Concretamente, la presente invenci on proporciona una formulaci on l quida cuya composici on cuantitativa (%, p/v) es la siguiente: 5

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Sorbitol K3PO3 KNO3 MgSO4.7H2O (NH4)H2PO4 Cobre Zinc Molibdeno Boro Hierro Manganeso Componentes biol ogicos
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Trichoderma Trichoderma Trichoderma Trichoderma Trichoderma

harzianum IMI 352939 c.s.p. 3x105 -10x107 conidios/ml harzianum IMI 352940 c.s.p. 3x105 -10x107 conidios/ml harzianum IMI 352941 c.s.p. 3x105 -10x107 conidios/ml harzianum CET 20179 c.s.p. 3x105 -10x107 conidios/ml viride CET 20178 c. s. p. 3x105 -10x107 conidios/ml.

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La formulaci on de acuerdo con la invenci on posee componentes qu micos que pueden ser utilizados como nutrientes por T. harzianum y T.viride, a la vez que mantienen la humedad suciente para la germinaci on de prop agulos de estos hongos. La formulaci on l quida de la invenci on permite utilizar los antagonistas en cualquier momento y situaci on, sin necesidad de limitar la aplicaci on al momento de la siembra, como sucede cuando se formulan los agentes de Control Biol ogico en medios y sustratos s olidos o recubriendo las semillas y otros materiales de propagaci on. La formulaci on l quida puede mantenerse, concentrada diez veces, en condiciones de refrigeraci on, no; a esta concentraci on se puede almacenar y transportar hasta su uso. a 4 C, durante al menos 1 a Para ello, basta con diluir diez veces para que la formulaci on alcance una composici on cuantitativa, de acuerdo con la invenci on, que permitir a la germinaci on, viabilidad y actividad biol ogica de los componentes f ungicos de la misma. La formulaci on puede ser aplicada de forma directa sobre suelo y material vegetal y/o animal y/o f ungico, vivo o muerto; o mezclada con sustancias utilizadas en Agricultura para vehicular otros productos tosanitarios como fertilizantes, abonos, microgr anulos, compost o las aplicadas en la pildoraci on, revestimiento y encapsulaci on de semillas y embriones, etc. Como ventaja, la diluci on del producto favorece la dispersi on de T. harzianum y T.viride. Se ofrecen ahora ejemplos de formulaciones l quidas seg un la invenci on, en funci on de la v a de aplicaci on de las mismas. Ha de entenderse que estos ejemplos se ofrecen s olo con car acter ilustrativo y de ning un modo limitativo del alcance de la invenci on. Considerando que es pr actica habitual en la aplicaci on de agentes tosanitarios que para tratar 1 Ha de cultivo se utilizan 3 litros de producto por v a foliar o 6 litros de producto v a suelo, podr an utilizarse en cada caso 3 y 6 litros de la formulaci on objeto de invenci on, concentrada diez veces para su transporte y almacenamiento, y dilu da diez veces antes de su uso. As , para tratamientos foliares, los 3 litros de formulaci on diez veces concentrada deber an diluirse con 27 litros de agua; y en aplicaciones al suelo los 6 litros de formulaci on diez veces concentrada deber an diluirse con 54 litros de agua. En situaciones de tratamiento de problemas topatol ogicos serios, conviene triplicar e incluso sextuplicar la dosis de producto por lo que para tratar 1 Ha habr a que concentrar la formulaci on 30 y 60 veces, seg un se aplique, respectivamente, sobre la planta o directamente al suelo. En tratamientos foliares, se pueden utilizar 3 litros de formulaci on 30 veces concentrada (diluida 30 veces en el momento de su uso con 87 litros de agua); y en tratamiento ed acos, 6 litros de formulaci on 60 veces concentrada (diluida 60 veces en el momento de su uso con 354 litros de agua). La formulaci on resultante ten a la siguiente composici on:

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Ejemplo 1 V a foliar (formulaci on 30 veces concentrada):
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Sorbitol K3PO3 KNO3 MgSO4.7H2O (NH4)H2PO4 Cobre Zinc Molibdeno Boro Hierro Manganeso Componentes biol ogicos

3-180 g 0.6-60 g 1.5-60 g 0.06-30 g 0.6-60 g 0.6-60 g 0.6-60 g 0.6-60 g 0.6-30 g 0.6-30 g 0.6-60 g

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Trichoderma Trichoderma Trichoderma Trichoderma Trichoderma Ejemplo 2

harzianum IMI 352939 c.s.p. 9x106 -3x109 conidios/ml harzianum IMI 352940 c.s.p. 9x106 -3x109 conidios/ml harzianum IMI 352941 c.s.p. 9x106 -3x109 conidios/ml harzianum CECT 20179 c.s.p. 9x106 -3x109 conidios/ml viride CECT 20178 c.s.p. 9x106 -3x109 conidios/ml.

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Aplicaci on sobre suelo (formulaci on 60 veces concentrada): Sorbitol K3PO3 KNO3 MgSO4.7H2O (NH4)H2PO4 Cobre Zinc Molibdeno Boro Hierro Manganeso Componentes biol ogicos Trichoderma Trichoderma Trichoderma Trichoderma Trichoderma harzianum IMI 352939 c.s.p. 1.8x107-6x109 conidios/ml harzianum IMI 352940 c.s.p. 1.8x107-6x109 conidios/ml harzianum IMI 352941 c.s.p. 1.8x107-6x109 conidios/ml harzianum CECT 20179 c.s.p. 1.8x107-6x109 comidios/ml viride CECT 20178 c.s.p. 1.8x107. 6x109 comidios/ml. 6-360 g 1.2-120 g 3-120 g 0.12-60 g 1.2-120 g 1.2-120 g 1.2-120 g 1.2-120 g 1.2-60 g 0.6-60 g 0.6-120 g

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La invenci on puede desarrollarse a escala industrial ya que los diferentes sistemas de fermentaci on disponibles permiten obtener rendimientos de in oculo de T. harzianum y de T.viride de m as de 10 gramos de biomasa por 1 litro de sustrato fermentable. A continuaci on, se ofrece una descripci on de los microorganismos usados en las formulaciones l quidas seg un esta invenci on.

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a) Caracter sticas morfol ogicas, siol ogicas y bioqu micas Trichoderma harzianum INI 352939
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Posee los atributos morfol ogicos caracter sticos de la especie Trichoderma harzianum Rifai, la conidiog enesis es enterobl astica al dica, con c elulas conidi ogenas con una longitud inferior a 10 mm; los conidios son subglobosos, con di ametro superior a 2,4 mm; y produce clamidosporas intercalares y terminales con di ametro superior a 10 mm. De acuerdo con la metodolog a usada: crece en la supercie del medio, con esporulaci on variable, cuando se cultiva en glucosa 1 % como fuente de carbono;

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crece muy bien en la supercie del medio, con esporulaci on variable, cuando se cultiva en etanol 1 % como fuente de carbono; crece en la supercie del medio, con esporulaci on, cuando se cultiva en a cido c trico 1 % y en acido l actico 1 % como fuentes de carbono;

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crece en la supercie del medio, con esporulaci on variable, cuando se cultiva en glicina 0.2 % como fuente de nitr ogeno; crece muy bien en la supercie del medio, y esporula d ebilmente, cuando se cultiva en oxalato am onico 0.2 % como fuente de nitr ogeno; crece en la supercie del medio, con esporulaci on, cuando se cultiva en urea 0.2 % como fuente de nitr ogeno;
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no crece en la supercie del medio cuando se cultiva en creatina 0.2 % como fuente de nitr ogeno; crece a 4 C; no crece en medios adicionados con cristal violeta a una concentraci on de 10 mg/litro;

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no esporula pero crece, formando agrupaciones de hifas a ereas en forma de roset on, cuando se cultiva en medios adicionados de selenito s odico a una concentraci on de 320 mg/litro; desarrolla colonias de di ametro inferior a 25 mm en el medio agar extracto de malta adicionado de 200 mg/litro de sulfato de cobre II, despu es de 24 horas de incubaci on a 25 C; hidroliza la gelatina y esporula en ese mismo medio de cultivo; crece, con esporulaci on variable, en agar Czapekamonio despu es de 10 d as de incubaci on a 25C;
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crece, con fuerte esporulaci on, en agar nitrito-sacarosa despu es de 10 d as de incubaci on a 25C; las colonias no alcanzan un di ametro superior a 20 mm en el medio agar glicerol-nitrato, despu es de 10 d as de incubaci on a 25 C.

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Produce las siguientes actividades enzim aticas extracelulares, medidas con el sistema API ZYM (Biom erieux S.A., Marcy-l Etoile, Francia): fosfatasa alcalina leucina arilaminidasa, fosfatasa acida, naftol-AS-BI -fosfato, alfa-galactosidasa, beta-galactosidasa, alfa -glucosidasa, beta-glucosidasa, y Nacetil-beta-glucosaminidasa con intensidad m axima; esterasa, esterasa lipasa, lipasa, valina arilaminidasa, cistina arilamidasa, tripsina, alfa-quimiotripsina, beta-glucuronidasa y alfa -manosidasa, con intensidad moderada; y no se detecta alfa-fucosidasa. De acuerdo con la metodolog a usada, presenta los siguientes bandas de isoenzimas, obtenidas mediante electroforesis en geles de poliacrilamida al 7.5 % (10 % para la actividad catalasa):

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actividad fosfatasa alcalina (Rf 0.43-0.51) variable; actividad catalasa (Rf 0.16-0.34); 8

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actividad actividad actividad actividad actividad actividad actividad actividad actividad actividad actividad actividad actividad fosfatasa acida (Rf 0.25-0.31), fosfatasa acida (Rf 0.32-0.43); celulasa (Rf 0.28-0.33), celulasa (Rf 0.45-0.48); esterasa (Rf 0.25) variable, esterasa (Rf 0.31) d ebil y variable, esterasa (Rf 0.55) d ebil y variable, esterasa (Rf 0.57) d ebil y variable, esterasa (Rf 0.65) variable, esterasa (Rf 0.74) variable, esterasa (Rf 0.78) variable, esterasa (Rf 0.82-0.84) variable, y esterasa (Rf 0.88) variable.

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Trichoderma harzlanum INI 352940 Posee los atributos morfol ogicos caracter sticos de la especie Trichoderma harzianum Rifai, la conidiog enesis es enterobl astica al dica, con c elulas conidi ogenas con una longitud inferior a 10 mm; los conidios son subglobosos, con di ametro superior a 2,4 mm; y produce clamidosporas intercalares con di ametro inferior a 10 mm. De acuerdo con la metodolog a usada: crece en la supercie del medio, con esporulaci on variable, cuando se cultiva en glucosa 1 % como fuente de carbono; crece en la supercie del medio, pero no esporula, cuando se cultiva en etanol 1 % como fuente de carbono; crece en la supercie del medio, con esporulaci on, cuando se cultiva en a cido c trico 1 % como fuente de carbono;

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crece d ebilmente en la supercie del medio, pero esporula, cuando se cultiva en a cido l actico 1 % como fuente de carbono; crece d ebilmente en la supercie del medio, con esporulaci on variable, cuando se cultiva en glicina 0.2 % como fuente de nitr ogeno; crece d ebilmente en la supercie del medio, con esporulaci on, cuando se cultiva en oxalato am onico 0.2 % como fuente de nitr ogeno;

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crece d ebilmente en la supercie del medio, con fuerte esporulaci on, cuando se cultiva en urea 0.2 % como fuente de nitr ogeno; no crece en la supercie del medio cuando se cultiva en creatina 0.2 % como fuente de nitr ogeno;

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no crece a 4 C; no crece en medios adicionados con cristal violeta a una concentraci on de 10 mg/litro; no esporula pero crece, formando agrupaciones de hifas a ereas en forma de copos, cuando se cultiva en medios adicionados de selenito s odico a una concentraci on de 320 mg/litro; desarrolla colonias de di ametro superior a 30 mm en el medio agar extracto de malta adicionado de 200 mg/litro de sulfato de cobre II, despu es de 24 horas de incubaci on a 25C;

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produce un pigmento amarillo difusible en el medio de cultivo, cuando se incuba en agar extracto de malta adicionado de 200 mg/litro de sulfato de cobre II, despu es de 14 d as de incubaci on a 25 C, en oscuridad; hidroliza fuertemente la gelatina pero no esporula en ese mismo medio de cultivo;

ES 2 109 182 A1
crece, con poca esporulaci on, en agar Czapek-amonio y agar nitrito-sacarosa, despu es de 10 d as de incubaci on a 25C; las colonias no alcanzan un di ametro superior a 20 mm y desarrollan, de forma variable, un pigmento difusible de color naranja en el medio agar glicerol-nitrato, despu es de 10 d as de incubaci on a 25 C. Produce las siguientes actividades enzim aticas extracelulares, medidas con el sistema API ZYM (Biom erieux S.A., Marcy-l Etoile, Francia): fosfatasa alcalina esterasa lipasa, leucina arilaminidasa, fosfatasa acida, naftol-AS-BI-fosfato, alfa-galactosidasa y beta-glucosidasa, con intensidad m axima; esterasa, lipasa, valina arilaminidasa, cistina arilamidasa, tripsina, alfa-quimiotripsina, beta-galactosidasa, alfa-glucosidasa, N-acetil-beta-glucosaminidasa y alfa-manosidasa, con intensidad moderada; y no se detectan beta-glucuronidasa y alfa-fucosidasa. De acuerdo con la metodolog a usada, presenta los siguientes bandas de isoenzimas, obtenidas mediante electroforesis en geles de poliacrilamida al 7.5 % (10 % para la actividad catalasa): actividad actividad actividad actividad actividad actividad actividad actividad actividad actividad actividad actividad actividad fosfatasa alcalina (Rf 0.43-0.51); catalasa (Rf 0.16-0.34); fosfatasa acida (Rf 0.25-0.31) d ebil y variable, fosfatasa acida (Rf 0.32-0.43); esterasa (Rf 0.53) variable, esterasa (Rf 0.57), esterasa (Rf 0.63) d ebil y variable, esterasa (Rf 0.67) variable, esterasa (Rf 0.69) variable, esterasa (Rf 0.74) variable, esterasa (Rf 0.76), esterasa (Rf 0.78) variable, y esterasa (Rf 1.00).

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Trichoderma harzianum INI 352941 Posee los atributos morfol ogicos caracter sticos de la especie Trichoderma harzianum Rifai, la conidiog enesis es enterobl astica al dica, con c elulas conidi ogenas con una longitud superior a 10 mm; los conidios son subglobosos, con di ametro superior a 2,4 mm; y produce clamidosporas terminales con di ametro inferior a 10 mm. De acuerdo con la metodolog a usada. crece muy bien en la supercie del medio, con esporulaci on variable, cuando se cultiva en glucosa 1 % como fuente de carbono; crece muy bien en la supercie del medio, con esporulaci on variable, cuando se cultiva en etanol 1 % como fuente de carbono;

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crece en la supercie del medio, con buena esporulaci on, cuando se cultiva en a cido c trico 1 %; crece d ebilmente en la supercie del medio, y es capaz de esporular, cuando se cultiva en a cido l actico 1 % como fuente de carbono;

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crece en la supercie del medio, con esporulaci on variable, cuando se cultiva en glicina 0.2 % como fuente de nitr ogeno; crece muy bien en la supercie del medio, con buena esporulaci on, cuando se cultiva en oxalato am onico 0.2 % como fuente de nitr ogeno;

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crece en la supercie del medio, con esporulaci on, cuando se cultiva en urea 0.2 % como fuente de nitr ogeno;

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no crece en la supercie del medio cuando se cultiva en creatina 0.2 % como fuente de nitr ogeno; crece a 4 C;
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no crece en medios adicionados de cristal violeta a una concentraci on de 10 mg/litro; no esporula, pero crece, formando agrupaciones de hifas a ereas en forma de roset on, cuando se cultiva en medios adicionados de selenito s odico a una concentraci on de 320 mg/litro;

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desarrolla colonias de di ametro inferior a 25 mm en el medio agar extracto de malta adicionado de 200 mg/litro de sulfato de cobre II, despu es de 24 horas de incubaci on a 25C; hidroliza fuertemente la gelatina y esporula en ese mismo medio de cultivo;

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crece y esporula bien en agar Czapek-amonio despu es de 10 d as de incubaci on a 25C; crece, con fuerte esporulaci on, en agar nitrito-sacarosa despu es de 10 d as de incubaci on a 25C; las colonias no alcanzan un di ametro superior a 20 mm en el medio agar glicerol-nitrato, despu es de 10 d as de incubaci on a 25 C. Produce las siguientes actividades enzim aticas extracelulares, medidas con el sistema API ZYM (Biom erieux S.A., Marcy-l Etoile, Francia): fosfatasa alcalina, esterasa, leucina arilaminidasa, fosfatasa acida, naftol -AS-BI-fosfato, alfa-galactosidasa, beta-galactosidasa, alfa-glucosidasa, beta-glucosidasa, y N-acetil-beta -glucosaminidasa con intensidad m axima; esterasa lipasa, lipasa, valina arilaminidasa, cistina arilamidasa, tripsina, alfa-quimiotripsina, beta-glucuronidasa y alfa -manosidasa, con intensidad moderada; y no se detecta alfa-fucosidasa. De acuerdo con la metodolog a usada, presenta los siguientes bandas de isoenzimas, obtenidas mediante electroforesis en geles de poliacrilamida al 7.5% (10% para la actividad catalasa): actividad fosfatasa alcalina (Rf 0.40-0.48); actividad catalasa (Rf 0.16-0.34); actividad fosfatasa acida (Rf 0.32-0.43) variable; actividad celulasa (Rf 0.10-0.13), actividad celulasa (Rf 0.15-0.18), actividad celulasa (Rf 0.28-0.33), actividad celulasa (Rf 0.45-0.48); actividad esterasa (Rf 0.25), actividad esterasa (Rf 0.31) d ebil, actividad esterasa (Rf 0.51), actividad esterasa (Rf 0.53), actividad esterasa (Rf 0.55), actividad esterasa (Rf 0.62),

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actividad esterasa (Rf 0.65), actividad esterasa (Rf 0.78), actividad esterasa (Rf 0.82-0.84), y actividad esterasa (Rf 1.00). Trichoderma harzianum CECT 20179 Posee los atributos morfol ogicos caracter sticos de la especie Trichoderma harzianum Rifai, la conidiog enesis es enterobl astica al dica, con c elulas conid genas con una longitud superior a 10 mm y anchura algo mayor de 3 mm; los conidios son subglobosos, con di ametro superior a 2,4 mm; y produce clamidosporas terminales e intercalares con di ametro superior a 10 mm.

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De acuerdo con la metodolog a usada: crece muy bien en la supercie del medio, con esporulaci on variable, cuando se cultiva en glucosa 1 % como fuente de carbono;
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crece muy bien en la supercie del medio, con esporulaci on d ebil, cuando se cultiva en etanol 1 % como fuente de carbono; crece en la supercie del medio, con buena esporulaci on, cuando se cultiva en a cido c trico 1 % como fuente de carbono; crece d ebilmente en la supercie del medio, y es capaz de esporular, cuando se cultiva en a cido l actico 1 % como fuente de carbono;
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crece muy bien en la supercie del medio, con esporulaci on variable, cuando se cultiva en glicina 0.2 % como fuente de nitr ogeno; crece muy bien en la supercie del medio, con buena esporulaci on, cuando se cultiva en oxalato am onico 0.2 % como fuente de nitr ogeno;

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crece en la supercie del medio, con esporulaci on d ebil, cuando se cultiva en urea 0.2 % como fuente de nitr ogeno; no crece en la supercie del medio cuando se cultiva en creatina 0.2 % como fuente de nitr ogeno;
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no crece a 4 C; no crece en medios adicionados de cristal violeta a una concentraci on de 10 mg/litro;

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no esporula, pero crece en medios adicionados de selenito s odico a una concentraci on de 320 mg/litro; desarrolla colonias de di ametro superior a 25 mm y normalmente inferior a 31 mm, en el medio agar extracto de malta adicionado de 200 mg/litro de sulfato de cobre II, despu es de 24 horas de incubaci on a 25 C;

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no hidroliza la gelatina, pero esporula en ese mismo medio de cultivo; crece y esporula muy bien en agar Czapek-amonio despu es de 10 d as de incubaci on a 25 C;
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crece muy bien, con fuerte esporulaci on, en agar nitrito-sacarosa despu es de 10 d as de incubaci on a 25C; las colonias no alcanzan un di ametro superior a 20 mm en el medio agar glicerol-nitrato, despu es de 10 d as de incubaci on a 25 C.

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Produce las siguientes actividades enzim aticas extracelulares, medidas con el sistema API ZYM (Biom erieux S.A., Marcy-lEtoile, Francia): fosfatasa alcalina, leucina arilaminidasa y naftol-AS-BI fosfatoesterasa con intensidad m axima; esterasa lipasa, lipasa, valina arilaminidasa, cistina arilamidasa, fosfatasa acida, alfa-galactosidasa, beta-galactosidasa, alfa-glucosidasa, beta-glucosidasa, N-acetil-beta -glucosaminidasa y alfa-manosidasa con intensidad moderada; y no se detectan esterasa, tripsina, alfaquimiotripsina, beta-glucuronidasa y alfa-fucosidasa. De acuerdo con la metodolog a usada, presenta las siguientes bandas de isoenzimas, obtenidas mediante electroforesis en geles de poliacrilamida al 7.5 % (10 % para la actividad catalasa):

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actividad actividad actividad actividad actividad actividad

catalasa (Rf 0.20-0.30), catalasa (Rf 0.26-0.34); fosfatasa acida (Rf 0.10), fosfatasa acida (Rf 0.28-0.43); malato deshidrogenasa (Rf 0.01), malato deshidrogenasa (Rf 0.16-0.17), 12

ES 2 109 182 A1
actividad actividad actividad actividad actividad actividad actividad actividad actividad actividad actividad actividad actividad actividad malato deshidrogenasa (Rf 0.20-0.24), malato deshidrogenasa (Rf 0.30-0.40); celulasa (Rf 0.28-0.33), celulasa (Rf 0.40) variable, celulasa (Rf 0.42-0.54) variable, celulasa (Rf 0.69-0.82); esterasa (Rf 0.44), esterasa (Rf 0.50), esterasa (Rf 0.72) d ebil, esterasa (Rf 0.75) d ebil, esterasa (Rf 0.77), esterasa (Rf 0.82-0.84), esterasa (Rf 0.87) esterasa (Rf 0.92-0.95).

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Trichoderma viride CECT 20178 Posee los atributos morfol ogicos caracter sticos de la especie Trichoderma viride Pers.:Fr., la conidiog enesis es enterobl astica al dica, con c elulas conidi ogenas con una longitud inferior a 10 mm y anchura inferior a 3 mm; los conidios son ovales, con supercie rugosa, con di ametro superior a 2,4 mm; y produce clamidosporas terminales e intercalares con di ametro superior a 10 mm. De acuerdo con la metodolog a usada:

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crece muy bien en la supercie del medio, con esporulaci on abundante, cuando se cultiva en glucosa 1 % como fuente de carbono; crece muy bien en la supercie del medio, con esporulaci on muy abundante, cuando se cultiva en etanol 1 % como fuente de carbono;

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crece en la supercie del medio, con esporulaci on variable, cuando se cultiva en a cido c trico 1 % como fuente de carbono; crece muy bien en la supercie del medio, y es capaz de esporular d ebilmente, cuando se cultiva en acido l actico 1 % como fuente de carbono; crece en la supercie del medio, pero no esporula, cuando se cultiva en oxalato am onico 1 % como fuente de carbono;

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crece de forma variable en la supercie del medio, con esporulaci on tambi en variable, cuando se cultiva en nitrito s odico 0.2 % como fuente de nitr ogeno; crece muy bien en la supercie del medio, con buena esporulaci on, cuando se cultiva en glicina 0.2 % como fuente de nitr ogeno;

50

crece de forma variable en la supercie del medio, con buena esporulaci on, cuando se cultiva en oxalato am onico 0.2 % como fuente de nitr ogeno; crece en la supercie del medio, con buena esporulaci on, cuando se cultiva en urea 0.2 % como fuente de nitr ogeno; crece en la supercie del medio y esporula cuando se cultiva en creatina 0.2 % como fuente de nitr ogeno; no crece a 4 C;

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crece bien en medios adicionados de cristal violeta a una concentraci on de 10 mg/litro, y d ebilmente en medios adicionados de cristal violeta a una concentraci on de 50 mg/litro;

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no esporula, pero crece, formando agrupaciones de hifas a ereas en forma de roset on, en medios adicionados de selenito s odico a una concentraci on de 320 mg/litro; desarrolla colonias con un di ametro 21 % inferior al del testigo sin agente inhibidor, en el medio agar extracto de malta adicionado de 200 mg/litro de sulfato de cobre II, despu es de 24 horas de incubaci on a 25 C; desarrolla colonias con un di ametro superior a 65 mm, en el medio agar extracto de malta adicionado de 200 mg/litro de sulfato de cobre II, despu es de 14 d as de incubaci on a 25C;
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hidroliza la gelatina, con esporulaci on abundante en ese mismo medio de cultivo; crece, con micelio a ereo abundante, y esporula muy bien en agar Czapek-amonio despu es de 10 d as de incubaci on a 25 C;
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crece bien y esporula en agar nitrito-sacarosa despu es de 10 d as de incubaci on a 25 C; crece bien en el medio agar glicerol-nitrato, despu es de 10 d as de incubaci on a 25 C.

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Produce las siguientes actividades enzim aticas extracelulares, medidas con el sistema API ZYM (Biom erieux S.A., Marcy-l Etoile, Francia): fosfatasa alcalina, esterasa lipasa, valina arilaminidasa y alfa-glucosidasa, con intensidad m axima; leucina arilaminidasa, naftol-AS-BI-fosfatoesterasa, cistina arilamidasa, fosfatasa acida, alfa-galactosidasa, beta -glucosidasa, N-acetil-beta-glucosaminidasa y alfa -manosidasa con intensidad moderada; y no se detectan lipasa, tripsina, alfa-quimiotripsina, beta galactosidasa, beta-glucuronidasa y alfa-fucosidasa. b) Caracter sticas moleculares Los microorganismos utilizados en la formulaci on objeto de patente son cepas sin adiciones ni deleciones de DNA, que han sido aislados de la Naturaleza y su genoma no ha sido modicado. El hecho de que sean cepas naturales diculta su caracterizaci on al no existir DNA ex ogeno que sirva de marcador de cada una de ellas. Dado que se trata de microorganismos fenot picamente muy parecidos, y que sus atributos morfol ogicos, siol ogicos y bioqu micos pueden ser dif ciles de valorar, hemos recurrido a la b usqueda, dentro del genoma de estos microorganismos, de marcadores moleculares que fueran estables, a nivel de especie y de cepa, para poder caracterizar e identicar cada uno de los tres aislamientos utilizados en la formulaci on. Nos jamos en la regi on ITS11-ITS4, que engloba el gen que codica al RNAr 5.8 S, y sintetizamos cebadores para amplicarla mediante reacci on en cadena de la polimerasa (PCR). Se amplic o el gen 5.8S rRNA con las regiones adyacentes al mismo, usando los cebadores ITS1 e ITS4, mediante PCR, obteni endose fragmentos de aproximadamente 0,6 kbp, para las cepas de T. harzianum IMI 352939, IMI 352940 e IMI 352941, seg un se observ o mediante electroforesis en gel de agarosa, al 1 %. El gen 5.8S rRNA (nucle otidos del 212 al 358) posee una gran semejanza con otros hongos lamentosos, y, por tanto, entre las 3 cepas de T. harzianum. Las diferencias se encontraron en las regiones adyacentes al gen, fundamentalmente en las secuencias comprendidas entre los nucle otidos 100 y 200, y entre los nucle otidos 408 y 440. Las secuencias caracter sticas obtenidas para las 3 cepas de T. harzianum se indican a continuaci on:

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Trichoderma harzianum IMI 352939 (regi on ITS1-ITS4 del gen 5.8S rRNA): 568 nucle otidos:
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Trichoderma harzianum IMI 352940 (regi on ITS1-ITS4 del gen 5.8S rRNA): 582 nucle otidos:

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Trichoderma hazianum INI 352941 (regi on ITS1-ITS4 del gen 5.8S rRNA):
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568 nucle otidos:

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Las secuencias correspondientes a las cepas Trichoderma harzianum IMI 352939 y Trichoderma harzianum IMI 352941, han resultado ser id enticas para este gen. Por este motivo no se han secuenciado las regiones ITS1 -ITS4 del gen 5.8S rRNA de las cepas Trichoderma harzianum CECT 20179 y Trichoderma viride CECT 20178. No obstante, se est an buscando nuevos atributos moleculares que permitan identicar cada una de estas cepas sin la necesidad de recurrir a marcadores ex ogenos.

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REIVINDICACIONES 1. Una formulaci on l quida a base de cepas de los hongos lamentosos Trichoderma harzianum y Trichoderma viride, caracterizada porque presenta la siguiente composici on cuantitativa en % p/v:
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Sorbitol K3PO3 KNO3 MgSO4.7H2O (NH4)H2PO4 Cobre Zinc Molibdeno Boro Hierro Manganeso

0.1-6 0.02-2 0.05-2 0.002-1 0.02-2 0.02-2 0.02-2 0.02-2 0.02-1 0.02-1 0.02-2

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Componentes biol ogicos: al menos una cepa elegida del grupo consistente en: Trichoderma harzianum IMI 352939 c.s.p. 3x105 -10x107 conidios/ml, Trichoderma harzianum IMI 352940 c.s.p. 3x105 -10x107 conidios/ml, Trichoderma harzianum IMI 352941 c.s.p. 3x105 -10x107 conidios/ml Trichoderma hazrianum CECT 20179 c.s.p. 3x105 -10x107 conidios/ml, Trichoderma viride CECT 20178 c.s.p. 3x105 -10x107 conidios/ml y mezclas de tales cepas. 2. El uso de una formulaci on l quida seg un la reivindicaci on 1 de Trichoderma harzianum IMI 352939, Trichoderma harzianum IMI 352940, Trichoderma harzianum IMI 352941, Trichoderma harzianum CECT 20179 y Trichoderma viride CECT 20178 s olos o mezclados, como agentes de control biol ogico de los enemigos de las plantas y material vegetal, y entidades biol ogicas causantes de biodeterioro.

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 OFICINA ESPANOLA DE PATENTES Y MARCAS ESPANA

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kES 2 109 182 kN. solicitud: 9502266 kFecha de presentaci on de la solicitud: 07.11.95 kFecha de prioridad:

INFORME SOBRE EL ESTADO DE LA TECNICA

51 Int. Cl.6 :

A01N 63/04, C12N 1/14 // (C12N 1/14, C12R 1:885)

DOCUMENTOS RELEVANTES Categor a Documentos citados Reivindicaciones afectadas

US-5288634-A (HARMAN GARY E et al.) 22.02.94 * Columnas 3,4 * US-4915944-A (CHET ILAN et al.) 10.04.90 * Columna 2, l neas 13-47 * US-5266316-A (ELAD YIGAL et al.) 30.11.93 * Reivindicaciones 1-5 * EP-0285987-A (CORNELL RES FOUNDATION INC) 12.10.88 * Columna 1, l nea 32 - columna 2, l nea 27 * EP-0124388-A (SANTERRE ORSAN) 07.11.84 * P agina 1, p arrafo 1 * PHYTOPATHOLOGY, Vol. 76, n um. 3, 1986, p aginas 306-312, L. MIHUTA-GRIMM et al.: Trichoderma spp. as biocontrol agents of rhizoctonia damping-o radish in organic soil and comparison of four delivery systems. * P agina 307, columna 2, p arrafo 3 * PLANT PATHOLOGY, Vol. 38, 1989, p aginas 277-286, G.C. PAPAVIZAS et al.: Eect of Gliocladium and Trichoderma on damping-o and blight of snapbean caused by Sclerotium rolfsii in the greenhouse. * Tabla 1 *

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Categor a de los documentos citados

X: de particular relevancia Y: de particular relevancia combinado con otro/s de la misma categor a ecnica A: reeja el estado de la t on no escrita O: referido a divulgaci on P: publicado entre la fecha de prioridad y la de presentaci de la solicitud es de la fecha E: documento anterior, pero publicado despu de presentaci on de la solicitud

El presente informe ha sido realizado para todas las reivindicaciones Fecha de realizaci on del informe 24.11.97

para las reivindicaciones n : Examinador A. Polo D ez

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 OFICINA ESPANOLA DE PATENTES Y MARCAS ESPANA

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kES 2 109 182 kN. solicitud: 9502266 kFecha de presentaci on de la solicitud: 07.11.95 kFecha de prioridad:

INFORME SOBRE EL ESTADO DE LA TECNICA

51 Int. Cl.6 :

A01N 63/04, C12N 1/14 // (C12N 1/14, C12R 1:885)

DOCUMENTOS RELEVANTES Categor a Documentos citados Reivindicaciones afectadas

FR-2345921-A (SEPPIC) 28.10.77 * Reivindicaciones *

1,2

Categor a de los documentos citados

X: de particular relevancia Y: de particular relevancia combinado con otro/s de la misma categor a ecnica A: reeja el estado de la t on no escrita O: referido a divulgaci on P: publicado entre la fecha de prioridad y la de presentaci de la solicitud es de la fecha E: documento anterior, pero publicado despu de presentaci on de la solicitud

El presente informe ha sido realizado para todas las reivindicaciones Fecha de realizaci on del informe 24.11.97

para las reivindicaciones n : Examinador A. Polo D ez

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