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Extraccin y purificacin de los cidos nucleicos

Todos los tipos de macromolculas biolgicas tienen una caracterstica en comn que va a permitir el desarrollo de un mtodo de separacin especifico para ellas. Estos mtodos deben ser completamente biocompatibles para que puedan ser posteriormente tiles al investigador y, al mismo tiempo, lo suficientemente potentes para permitir el aislamiento de la molcula deseada de entre un mezcla compleja de multicomponentes que hacen las veces de contaminantes de nuestra molcula en cuestin. En este sentido, la cromatografa en columna ha demostrado ser una herramienta muy til ya que se dispone de varios mecanismos de separacin. La modificacin de las diferentes fases estacionarias ya existentes, as como el desarrollo de nuevas es la base principal para la obtencin de las condiciones necesarias para la rpida y eficiente separacin de biomolculas. Cromatografa de penetrabilidad. El componente bsico es una columna empaquetada con una matriz en gel especial, que son partculas de un polmero orgnico de estructura tridimensional, que originan una red de poros hidroflicos equilibrados con un tampn acuoso. La tcnica consiste en que las molculas de gran tamao no penetran por los poros del polmero, por lo que migran mucho ms rpidamente que las de menor tamao que s son capaces de penetrar por los poros de la matriz. Al principio del desarrollo de la tcnica, se realizaba a bajas presiones por lo que el rango de aplicaciones estaba restringido debido a los elevados tiempos de separacin y su poca resolucin. En la actualidad se han desarrollado matrices de slica estables a elevadas presiones que se utilizan columnas de alta presin, para la separacin de biomolculas en funcin de su forma y tamao.

Cromatografa de intercambio inico. Es el mtodo ms utilizado para la separacin de cidos nucleicos. El mecanismo bsico es el intercambio reversible de los iones en solucin con los grupos funcionales unidos covalentemente a una fase estacionaria insoluble llamada resina. Por ejemplo, un cido nucleico con carga negativa a pH 7,0 se unir a un intercambiador inico con grupos cargados positivamente, pero eluir de la columna al cambiar al pH del tampn (tampn de elucin) ya que los iones del tampn de elucin interaccionan con los grupos cargados del cido nucleico o del intercambiador inico, respectivamente; primero eluirn de la columna las molculas cargadas positivamente que no se unen a la fase estacionaria y posteriormente, al aadir el tampn de elucin, eluirn las molculas con poca carga negativa neta y luego las de mayor carga negativa neta.

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Una modificacin de este mtodo es la extraccin en fase slida, en la que se utiliza una matriz intercambiadora de aniones empaquetada en columnas de polipropileno. La unin se produce bajo condiciones de baja salinidad y durante los pasos de lavado y elucin se va incrementando la concentracin de sales en los tampones correspondientes. Las impurezas se eliminan debido a su diferente capacidad de unin y se obtienen una rpida y eficiente purificacin de los cidos nucleicos (DNA y/o RNA).

Cromatografa de adsorcin. Se basa en la adsorcin y desorcin de los cidos nucleicos en presencia de sales caotrpicas. Bajo condiciones nativas, los cidos nucleicos estn recubiertos de una capa hidratante de molculas de agua que mantienen la solubilidad del DNA en soluciones acuosas. Con la adicin de iones caotrpicos a los cidos nucleicos, se destruye esta ordenada estructura de molculas de agua de la capa hidratante, por lo que las sales caotrpicas crean un entorno hidrofbico alrededor del DNA. Bajo estas condiciones hidrofbicas, los cidos nucleicos se unen perfectamente a la membrana de slica de las columnas, mientras que las protenas, los metabolitos y otros contaminantes no se unen y, por lo tanto, son eliminados de la muestra durante los pasos de lavado. Posteriormente, los cidos nucleicos se eluyen de la membrana de slica mediante tampones de elucin con baja concentracin de sales (ligeramente alcalinos) o simplemente agua, ya que permiten recuperar la capa hidratante de los cidos nucleicos, liberndolos as de la membrana. Con esta tecnologa, no se produce ningn efecto sobre las molculas de los cidos nucleicos ya que la unin intramolecular de los mismos no es de naturaleza hidrofbica. Con este rpido proceso de purificacin mediante la tecnologa de la adsorcin-desorcin sobre membranas de slica, se obtiene cidos nucleicos altamente purificados y listos para usar en procesos posteriores como PCR, RT-PCR, QPCR, secuenciacion, blotting, clonaje, etc.

Ultrafiltracin. En esta tecnologa, la muestra se carga directamente sobre la membrana de ultrafiltracin y mediante vaco o centrifugacin, se eliminan todos los contaminantes mientras que la muestra con los cidos nucleicos permanecen retenidos en la superficie de la membrana. Despus de un paso de lavado opcional, se recuperan los cidos nucleicos aadiendo agua o un tampn adecuado.

Bolas magnticas. Con esta tecnologa, los cidos nucleicos se unen selectivamente a bolas paramagnticas en presencia de sales caotrpicas mientras que el resto de los contaminantes son eliminados de la muestra. Los cidos nucleicos purificados se eluyen de la solucin con las bolas paramagnticas bajo condiciones de baja salinidad y estn listos para ser usados en posteriores aplicaciones. Pasos generales de la extraccin. Todos los mtodos de preparacin de las muestras pueden dividirse en una serie de pasos generales, de tal forma que la necesidad de cada paso dependen del microorganismo y de la muestra: Liberacin de los cidos nucleicos de las bacterias, hongos o virus. Puede ser un paso muy sencillo en el caso de los virus y algunas bacterias (Mycoplasma spp.) pero muy difcil en el caso de otras bacterias (Mycobacterium tuberculosis) y hongos. Hay una gran variedad de mtodos para la liberacin de los cidos nucleicos de diferentes microorganismos, entre los que se encuentran el hervir en agua destilada o tampn de PCR, el uso de detergentes con o sin calor, hidrxido sdico con calor, ciclos de congelacindescongelacin, SDS-proteinasa K, cido perclrico, enzimas (lisozima), sonicacin, etc. aunque la utilizacin de enzimas no es muy recomendable ya que la propia muestra puede contener inhibidores de las mismas. Proteccin y estabilizacin de los cidos nucleicos frente a la degradacin. El RNA es mucho ms difcil de estabilizar que el DNA.

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Eliminacin de inhibidores de la amplificacin. Para algunas muestras (esputo, sangre) pueden ser necesarios ms pasos que para otras (orina, LCR). Concentracin de la muestra y la diana en un pequeo volumen. Algunas muestras (esputo para M.tuberculosis y Legionella pneumophila y sangre para sepsis) requieren una mayor grado de concentracin que otras (orina para Chlamydia o Gonococcus) para alcanzar la sensibilidad deseada Colocacin de la diana en un medio acuoso compatible con el mtodo de amplificacin Los laboratorios generalmente utilizan diferentes mtodos para aislar el DNA de diferentes bacterias (ya sean gramnegativas o grampositivas); esto es un problema ya que requiere la preparacin y almacenamiento de una gran cantidad de reactivos y tampones y la utilizacin de diferentes protocolos de extraccin. A continuacin se muestra un protocolo universal de extraccin de DNA genmico con el que se pueden extraer entre 100 y 400g de DNA; consta de un mdulo central (til para la extraccin de DNA de bacterias gramnegativas, incluyendo las encapsuladas y las productoras de polisacridos) y un mdulo opcional (permite la extraccin de bacterias grampositivas): Mdulo central Cultivar los microorganismos en el medio ms adecuado o en 5-10mL de medio de cultivo. Si se utilizan placas de agar, recoger las colonias con un asa estril y suspenderlas en 5mL de buffer de suspensin (3,3mL de NaCl 3M; 1,0mL de Tris 1M pH 8,0; 2,0mL de EDTA 0,5M pH 8,0; 58,5mL de sacarosa y ajustar el volumen a 100mL). Si se utiliza medio de crecimiento, centrifugar las colonias durante 5min a 3600g a 4C, eliminar el sobrenadante y resuspender el pellet en 5mL de buffer de suspensin. Centrifugar la suspensin durante 5min a 3600g a 4C. Eliminar el sobrenadante. Resuspender el pellet en 3,78mL de buffer de suspensin. Aadir 200L de SDS al 20% y mezclar completamente mediante inversin. Incubar la mezcla a 37C durante 30min. Aadir 20L de proteinasa K (20mg/mL), mezclar y continuar incubando a 37C durante otro 30min. Aadir 720L de NaCl (5M), mezclar completamente, aadir 600L de CTAB (bromuro de hexadeciltrimetilamonio) y mezclar por inversin. Incubar a 65C durante 10min y a 37C durante 5min. Aadir un volumen igual de PCI (25:24:1 fenol-cloroformo-alcohol isoamlico). Centrifugar a 1500g durante 15min. Traspasar la fase acuosa superior a un nuevo tubo. Aadir un volumen igual de CI (24:1 cloroformo-alcohol isoamlico) y centrifugar durante 15min a 1500g. Traspasar la fase acuosa superior a un nuevo tubo. Aadir 2,5 volmenes de etanol fro al 95%, mezclar por inversin y mantener a -70C durante 30min. Centrifugar durante 30min a 14500g. Eliminar el sobrenadante y secar el pellet mediante vaco. Resuspender el pellet en 400L de buffer TE (Tris HCl 10mM; EDTA 1mM pH 8,0) Aadir 1L de una dilucin 1:3 en agua estril de RNasa T1. Incubar la mezcla a 37C durante 1h. Centrifugar a 19900g durante 2min. Traspasar la fase acuosa superior a un nuevo tubo. Aadir 0,1 volmenes de acetato sdico 3M y mezclar bien. Precipitar el DNA con 2,5 volmenes de etanol fro al 95%. Mantener a -70C durante 20-30min. Centrifugar durante 8min a 19900g. Eliminar el sobrenadante. Lavar el pellet con 500L de etanol al 70% y volver a centrifugar durante 8min. Descartar el sobrenadante, secar el DNA a vaco (15-30min) y disolver el pellet de DNA en 100-400L de agua estril. Medir la concentracin de DNA en un espectrofotmetro: diluir un alcuota 1:20 (15L en 285L de H2O), y leer a = 260nm. La A260 es igual a la concentracin de DNA en gr/L.

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Esquema del mdulo central del protocolo universal de extraccin de DNA genmico. Mdulo opcional para bacterias grampositivas Cultivar las bacterias en el medio ms adecuado o en 5-10mL de medio de crecimiento. Si se utilizan placas de agar, recoger las colonias con un asa estril y suspenderlas en 5mL de buffer de suspensin. Centrifugar las colonias durante 5min a 3600g a 4C. Eliminar el sobrenadante y resuspender en 1mL de solucin de prelisis (0,25mL de Tris 2M pH 7,0; 3,1mL de lipasa pancretica; 0,3mL de taurocolato sdico; 0,5mL de CaCl2 0,1M; 5,85mL de sacarosa y 0,05gr de lisozima) e incubar a 37C durante 45min. Si se utiliza medio de crecimiento, centrifugar las colonias durante 5min a 3600g a 4C, eliminar el sobrenadante y resuspender el pellet en 5mL de buffer de suspensin. Centrifugar durante 5min a 3600g a 4C y eliminar el sobrenadante. Resuspender en 1mL de solucin de prelisis e incubar a 37C durante 45min. 02.2006 www.cultek.com Pgina 4 de 11

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PCR en tiempo real.

La PCR en Tiempo Real es, bsicamente, una PCR convencional en la que los equipos de amplificacin (termocicladores) llevan incorporados un sistema de deteccin de fluorescencia (fluormetro), basndose la tecnologa en la utilizacin de unas molculas especficas denominadas fluorforos y quenchers. Ambos factores, nos va a permitir monitorizar, en tiempo real, lo que esta ocurriendo dentro de cada tubo en cada ciclo de amplificacin y va a sustituir a los pasos de amplificacin, electroforesis y anlisis de imagen de una PCR tradicional. Los factores que afectan a la PCR cuantitativa son, entre otros: optimizacin del protocolo de reaccin para maximizar su eficiencia. Hay que tener en cuenta que una pequea diferencia en la eficiencia de reaccin por ciclo, puede originar una substancial diferencia en la cantidad final de producto; por ejemplo, si una reaccin es tan solo un 90% tan eficiente como otra, la relacin de producto final entre ambas reacciones despus de 40 ciclos ser alrededor de 65 a 1 evitar un nmero excesivo de ciclos de amplificacin un adecuado procesamiento de las muestras que asegure la eliminacin de los inhibidores que pueden disminuir la eficiencia de amplificacin El parmetro fundamental en una PCR en Tiempo Real y en funcin del cual se van a realizar todos los clculos analticos y obtencin de resultados, es el denominado Ciclo Umbral (Threshold Cycle o Ct), que se define como el ciclo a partir del cual la fluorescencia es estadsticamente significativa por encima del ruido de fondo (background).

Las principales propiedades de este parmetro Ct son:

Ct

Ct

Ct

Ct

Ct

Ct

Ct

Ct

separa los datos del ruido de fondo determina el ciclo inicial de amplificacin es inversamente proporcional al nmero de copias inicial del template

se suele establecer como 10 veces el ruido de fondo, aunque se puede modificar manualmente Una de las principales ventajas de la PCR en Tiempo Real frente a la PCR convencional (aparate de su mayor sensibilidad) es que a la hora de cuantificar, en la PCR convencional se hace en funcin del producto final y debido a que la propia PCR es una reaccin enzimtica, las variaciones que se pueden observar son muy significativas; sin embargo, en la PCR en Tiempo Real, dicha cuantificacin se realiza en funcin del valor de Ct, que al ser al principio de la amplificacin, no se ve afectado por todas esas variaciones, con lo que los resultados son completamente reproducibles y mucho ms precisos. En la siguiente figura se muestran los resultados de 96 replicados de una muestra puestos en una misma placa de PCR y en ella se pueden observar las enormes variaciones que se pueden obtener en los resultados del producto final frente a nula variacin observable en el valor de Ct en todos los replicados.

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Ct

Como ya se ha mencionado anteriormente, la tecnologa de la PCR en Tiempo Real se basa en la utilizacin conjunta de termocicladores con un fluormetro incorporado y fluorforos.

Mecanismo de accin de un fluorforo. Estos fluorforos determinan dos tipo de mecanismos de deteccin: No especficos. Detectan todos los DNA de doble cadena (dsDNA) producidos durante la reaccin de amplificacin (ya sea producto especfico, producto inespecfico o dmeros de primers). Es el mtodo estndar y consiste en aadir un agente intercalante de la doble cadena o un fluorforo que emite fluorescencia cuando se une a sta. El ms utilizado es el SYBR Green I que se excita a 497nm y emite a 520nm.

Para discriminar si las muestras con curva de amplificacin positivas corresponden a productos especficos o a dmeros de primers o productos inespecficos, se suele realizar una curva de desnaturalizacin (melting curve) al final de la reaccin: la reaccin se calienta lentamente desde 50C hasta 95C monitorizando continuamente la fluorescencia; la temperatura a la cual el DNA se desnaturaliza se observa como una drstica cada de la fluorescencia debido a la disociacin del SYBR Green I. Los productos de PCR de diferente longitud y diferentes secuencias se desnaturalizan a diferentes temperaturas, observndose diferentes picos cuando se representa la derivada de la dF fluorescencia con respecto a la temperatura frente a la temperatura. dT

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Una posibilidad para evitar este problema es desnaturalizar los productos de PCR incrementando la temperatura de la muestra. A la temperatura de melting (Tm) del producto, se puede observar una drstica reduccin de la intensidad de fluorescencia, ya que los productos de PCR inespecficos (cortos) se desnaturalizan a una temperatura muy inferior que los especficos (largos). Esto permite corregir las curvas de desnaturalizacin de la contribucin de los productos de PCR inespecficos, incrementando la sensibilidad de la tcnica a una copia por reaccin. En estas condiciones el SYBR Green I se puede utilizar para cuantificar e incluso para la deteccin de mutaciones puntuales (SNPs), ya que incluso los amplicones que difieren en un solo nucletido, pueden desnaturalizarse a diferentes temperaturas y pueden detectarse por sus picos de desnaturalizacin (es posible distinguir muestras homocigotas -un solo pico- de muestras heterocigotas -dos picos-). Especficos. Estos sistemas de deteccin son capaces de distinguir entre la secuencia de inters y los dmeros de primers o las amplificaciones inespecficas. Todos ellos se basan en la utilizacin de quenchers y sondas marcadas con un amplio rango de fluorforos con diferentes espectros de excitacin y emisin. Un fluorforo es una molcula que absorbe energa y pasa a un estado excitado; posteriormente, al volver al estado inicial emite el exceso de energa en forma de fluorescencia. Los quenchers son molculas que aceptan la energa de un fluorforo y la disipan en forma de calor o fluorescencia:

Mecanismo de actuacin de un quencher. Las dos formas de disipacin de la energa de los quenchers definen los dos posibles mecanismos de actuacin: Quenching colisional: se produce cuando el fluorforo est en contacto o muy prximo al quencher de tal forma que se produce la transferencia de energa al quencher, el cual la disipa en forma de calor.

Quenching FRET: se produce cuando el fluorforo transfiere la energa al quencher (que en este caso puede ser otro fluorforo) y esta energa es disipada en forma de fluorescencia a una mayor longitud de onda. La eficiencia del proceso depende de la distancia entre el fluorforo y el quencher.

Los fluorforos y quenchers ms utilizados se detallan en la siguiente tabla II, as como las longitudes de onda de excitacin y emisin. Fluorforos y quenchers ms utilizados. Nombre Excitacin (nm) Emisin (nm) Fluorforos FAM 492 515 TET 521 536 JOE 527 548 HEX 535 556 TAMRA 555 580 ROX 575 602 Cy3 552 565 Cy3.5 581 596 Cy5 651 674 Cy5.5 675 694 Cy7 743 767 R6G 518 543 Texas Red 583 603 VIC 528 546 Nombre Methyl Red ElleQuencher Dabcyl Dabsyl TAMRA Excitacin (nm) Quenchers 410 650,600 453 466 555 Emisin (nm) No No No No disponible disponible disponible disponible 580

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A continuacin se describen algunas de las sondas ms ampliamente utilizadas: Sondas TaqMan. Son las sondas ms utilizadas y suelen ser las sondas de eleccin (despus del SYBR Green) de los investigadores que empieza a trabajar con la Q-PCR. Fueron inicialmente desarrolladas por Roche y Applied Biosystems y en ellas se une un fluorforo al extremo 5 de la sonda (tradicionalmente FAM) y un quencher al 3 (tradicionalmente TAMRA pero tambin se utiliza Dabcyl, Methyl Red o ElleQuencher). Cuando el fluorforo es excitado, transfiere su energa por quenching FRET al quencher. Cuando la Taq empieza amplificar a partir del primer unido al DNA diana, desplaza el extremo 5 de la sonda que es degradado por la actividad exonucleasa 5 3 de la Taq. Este proceso libera el fluorforo al medio separndolo del quencher, lo que ocasiona un aumento irreversible de la fluorescencia detectada.

Sondas Molecular Beacon. Difieren de las sondas anteriores tanto en su estructura como en su mecanismo de accin. Consisten en una estructura de horquilla en la cual el bucle es DNA monocatenario (ssDNA) complementario del amplicn; el brazo de la horquilla tiene una longitud aproximada de 6 bases, esta formada por C y G y es la encargada de mantener la estructura de la horquilla. El fluorforo esta unido a uno de los extremos del brazo y el quencher (normalmente Dabcyl o Methyl Red) al otro extremo; el brazo de la horquilla mantiene al fluorforo y al quencher prximos, de tal forma que el quenching que se observa es colisional.

Durante la PCR, la sonda se une a la secuencia especfica del DNA diana ya que el heterodplex sonda-diana es termodinmicamente ms estable que la estructura de horquilla de la sonda. Una vez que la sonda se ha unido a su diana, la horquilla se abre, separndose el fluorforo y el quencher, con lo que se produce un incremento de la fluorescencia.

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Este incremento de fluorescencia que se observa es completamente reversible (al contrario que con las sondas TaqMan), ya que a elevadas temperaturas, la sonda se disocia de su diana y vuelve a la estructura de horquilla original.

El brazo de la estructura aade especificidad a este tipo de sonda ya que el hbrido formado entre la sonda y la diana tiene que ser ms estable que la del propio brazo para que se mantenga la unin sonda-diana. Todas aquellas dianas que no sean totalmente complementarias formarn el dplex con la sonda pero se disociarn a una temperatura bastante menor que las que apareen perfectamente. El estudio de las curvas de disociacin permite detectar hasta mutaciones puntuales. La principal desventaja de los Molecular Beacons es que su diseo es bastante complicado ya que, adems de hacer un estudio de secuencia, como ocurre en el caso de las sondas TaqMan, para que la secuencia del bucle sea complementaria del amplicn, hay que hacer un estudio termodinmico para que la energa de unin bucle-amplicn sea termodinmicamente ms estable que la del brazo del propio Molecular Beacon, ya que si no es as, aunque la regin complementaria del bucle se encuentre presente en el amplicn, ste nunca se abrir para unirse al amplicn. Adems, aunque se haga un diseo perfecto, la seal suele ser bastante pobre, ya que muchas veces ocurre que cuando el Molecular Beacon se abre e hibrida con el amplicn, el fluorforo y el quencher quedan lo suficientemente prximos para que el quencher siga capturando la fluorescencia del fluorforo. Sondas Scorpions. Difieren de las sondas anteriores en que su mecanismo de accin es intramolecular. La horquilla esta unida al extremo 5 de un primer especifico por medio de un bloqueante de la PCR.

Despus de la extensin del primer durante la amplificacin, la secuencia especifica de la sonda se une a la regin complementaria dentro de la misma hebra de DNA. Esta hibridacin abre la estructura de horquilla de tal forma que el quencher ya no queda prximo al fluorforo y se observa un incremento en la fluorescencia. El bloqueante de la PCR evita que contine la amplificacin a lo largo de la sonda, lo que provocara que se abriera la estructura de horquilla de la sonda (con el correspondiente incremento de fluorescencia) en ausencia de secuencias diana especificas. La unin intramolecular de la sonda es cinticamente favorable y altamente efectiva. Adems, no es necesaria la ruptura enzimtica de la sonda, por lo que se reduce el tiempo necesario para obtener seal. No obstante, como el quencher y el fluorforo permanecen en la misma hebra de DNA y relativamente prximos, a veces se puede producir el quenching incluso cuando la horquilla est abierta.

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Sondas Amplifluor. Este sistema consta de 2 pasos realizados en la misma reaccin de PCR: uno de los primers especficos lleva una secuencia universal (llamada secuencia Z) en el extremo 5, por lo que durante la amplificacin la secuencia Z se aade al amplicn. A continuacin se utiliza un segundo primer (llamado Uniprimer) complementario de la secuencia Z y que incorpora una horquilla en su extremo 5 con un fluorforo y un quencher. Esta horquilla se incorpora al producto de PCR cuando se produce la extensin del Uniprimer, de tal forma que cuando este nuevo producto de PCR se convierte en molde durante el siguiente ciclo de amplificacin, la Taq abre la horquilla, lo cual separa el fluorforo y el quencher que se encontraban prximos en la estructura inicial, observndose un incremento de la fluorescencia fcilmente detectable.

Sondas de hibridacin. Han sido desarrolladas por Roche para su utilizacin con su equipo capilar (LightCycler). Se disean dos sondas para que se unan adyacentemente en el amplicn; uno de los primers incorpora un fluorforo (FAM) en el extremo 3 y el otro primer otro fluorforo (LC Red 640 705, ROX Cy5) en el 5. Durante la reaccin de PCR, los dos primers se unen a su secuencia especifica del amplicn; a continuacin el sistema excita el FAM, el cual transmite su energa al otro fluorforo mediante quenching FRET, observndose un incremento de la seal de fluorescencia proporcional al incremento del nmero de amplicones. Esta tecnologa permite no solo realizar PCR cuantitativas sino la deteccin de mutaciones puntuales, para lo cual se hbrida uno de los primers sobre el punto de polimorfismo. El mal apareamiento del primer provocado por la mutacin ocasiona que la sonda se disocie a una temperatura diferente que la sonda completamente complementaria del amplicn; esta disociacin ocasiona una disminucin de la fluorescencia ya que el quenching FRET no se produce. Sondas Eclipse. Son pequeas sondas lineales que incorporan la tecnologa del Minor Groove Binder (MGB) y el quencher en el extremo 5 y el fluorforo en el 3. Se piensa que el MGB protege a la sonda de la actividad exonucleasa de la Taq. En la forma libre de la sonda, el quencher y el fluorforo quedan prximos por lo que no se observa emisin de fluorescencia. Cuando la sonda se une a su diana, se linealiza, por lo que desaparece el quenching y se observa un aumento de la fluorescencia.

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