MICROBIOLOGA INDUSTRIAL Introduccin

Microbiologa Industrial
1.- Introduccin En este captulo vamos a utilizar la produccin de vino como esquema para estudiar los principios bsicos de la microbiologa industrial y de la biologa de microorganismos. Ms adelante estudiaremos otros procesos de produccin industrial con un mayor detalle. La microbiologa industrial est dedicada a la utilizacin comercial de microorganismos e incluye procesos que tienen gran importancia econmica ambiental y social. !radicionalmente se "a utilizado la palabra fermentacin en microbiologa industrial para describir los procesos de cultivo de microorganismos con propsitos industriales. #in embargo no "ay que con$undir esta utilizacin del t%rmico con el proceso bioqumico de $ermentacin consistente en la regeneracin del poder reductor &'()*+ por un procedimiento no o,idativo &estos procesos se estudiarn ms adelante en el curso+. La $ermentacin que tiene lugar en la produccin del vino en este sentido comprende ambos signi$icados- por un lado se trata bioqumicamente de un proceso de $ermentacin &produccin de alco"ol a partir de glucosa en condiciones anaerobias+ y es una $ermentacin industrial en el sentido de que se trata de un proceso industrial llevado a cabo por microorganismos. El desarrollo de una $ermentacin industrial incluye dos tipos de procesos denominados por sus nombres en ingl%s procesos upstream y procesos downstream. Los procesos upstream comprenden la seleccin y preparacin del microorganismo la preparacin del medio de cultivo y de las condiciones de $ermentacin &cultivo+. Los procesos downstream incluyen la puri$icacin del producto y el tratamiento de los residuos de la $ermentacin. En el proceso de $ermentacin del mosto de uva para producir vino podemos distinguir los procesos upstream de la seleccin y preparacin de cepas de levadura tratamiento del mosto y acondicionamiento de loas condiciones de $ermentacin. Los procesos downstream comprenden en este caso el tratamiento del vino para su clari$icacin y el de los residuos del proceso. Los productos $abricados por $ermentaciones industriales pueden agruparse grosso modo en dos clases

GIGM

&1+ los productos de gran volumen y ba.o valor &en este grupo se incluyen los productos alimenticios bebidas aditivos alimentarios y algunos productos qumicos producidos por $ermentacin+ y

&/+ los productos de ba.o volumen y alto valor &los $rmacos por e.emplo+.

0or otro lado "ay que se1alar que tienen origen en $ermentaciones industriales un gran n2mero de productos de uso cotidiano que pertenecen a di$erentes grupos

&1+ alimentos &derivados lcteos y de vegetales $ermentados+ bebidas &vino cerveza etc.+ aditivos alimentarios &vinagre cido ctrico carotenos etc.+. &/+ productos $armac%uticos- antibiticos 3-lactmicos &penicilinas y ce$alosporinas+ antibiticos aminoglicsidos y tetraciclinas4 compuestos antitumorales y otros $rmacos &lovastatina por e.emplo utilizada para controlar la produccin de colesterol+. &5+ Enzimas microbianas tales como proteasas amilasas etc. &6+ 0roductos qumicos tales como alco"oles polisacridos disolventes &acetona+ lpidos productos base para la produccin de plsticos etc. &7+ 0roductos recombinantes dise1ados por ingeniera gen%tica.

(dems de estas utilidades los microorganismos se usan industrialmente en ciertos procesos de microbiologa ambiental tales como el tratamiento de residuos slidos y lquidos y en biorremediacin. Estos aspectos sern tratados ms adelante en este curso. /.- 0roduccin de vino #e trata de una $ermentacin para la $abricacin de un producto de gran volumen y ba.o valor a1adido. En el proceso un "ongo (Saccharomyces cerevisiae+ crece utilizando el az2car &glucosa+ presente en el mosto de uva para producir alco"ol. El proceso puede esquematizarse como sigue8amos a utilizar el estudio de la $ermentacin del vino para revisar los $actores que intervienen en un proceso industrial estudiando en los pr,imos apartados

El microorganismo &"ongos+ El crecimiento de microorganismos El medio de cultivo El proceso de $ermentacin

/.1.- El microorganismo- Saccharomyces cerevisiae. Los "ongos La levadura Saccharomyces cerevisiae es un "ongo ascomiceto unicelular. Los "ongos son organismos eucariticos &sus c%lulas tienen una organizacin interna en orgnulos membranosos+ quimio"etertro$os. ( continuacin vamos a e,plicar el concepto de quimio"etertro$o y a describir los principales grupos de "ongos. Los organismos necesitan carbono y energa para poder crecer. En la naturaleza las $uentes de energa pueden ser qumicas &energa presente en los enlaces de compuestos qumicos+ o lumnica &energa de la luz que se trans$orma en energa qumica+. 0or otra parte las reaccines de ,ido-reduccin que tienen lugar en los seres vivos requieren donadores de electrones que pueden ser orgnicos o inorgnicos. 0or 2ltimo el carbono puede encontrarse de dos $ormas como carbono orgnico y como carbono inorgnico &9:2+. La combinacin de estas posibilidades da lugar a las di$erentes categoras de microorganismos en $uncin de su nutricin-

!ipo de nutricin

;uente de energa qumica luz -

;uente de electrones comp.orgnico comp. inorgnico -

;uente de E.emplo carbono inorgnico orgnico bacterias "ongos animales

quimiotro$os $ototro$o organotro$o litotro$o autotro$o "eterotro$o

quimioorgano&"etro+tro$o qumica comp.orgnico orgnico

quimioliot&auto+tro$o

qumica

comp. inorgnico comp. inorgnico

inorgnico algunas bacterias inorgnico bacterias plantas algas algunas bacterias algas

$otolito&auto+tro$o

luz

$otoorgano&"etero+tro$o

luz

comp.orgnico orgnico

9omo puede verse las bacterias presentan una gran versatilidad metablica. Muc"o mayor que la que presentan plantas animales u "ongos. En cualquier caso los principales microorganismos de inter%s aplicado industrial pertenecen al grupo de los quimio"etertro$os. El microorganismo responsable de la $ermentacin alco"lica de la produccin del vino es la levadura S. cerevisiae. Las levaduras son "ongos unicelulares a di$erencia de otro tipo de "ongos a los que conocemos como $ilamentosos. #in embargo biolgicamente ambos tipos de "ongos &unicelulares o $ilamentosos+ son similares. Las levaduras se multiplican en los medios de cultivo como c%lulas aisladas individuales que se dividen y de esta $orma aumentan su n2mero. En el caso de los "ongos $ilamentoso sin embargo las c%lulas se encuentran contenidas dentro de unos tubos $ormados por la pared celular. Estos tubos se denominan "i$as y van creciendo por sus puntoas &crecimiento apical+ y rami$icndose para $ormar la colonia que denominamos micelio. 0or consiguiente los "ongos $ilamentosos tienen un crecimiento micelial mientras que las levaduras no.

Es importante tener en cuenta que en el crecimiento micelial slo el borde de la colonia &las puntas de las "i$as+ crece. La parte central de una colonia micelial est $ormada por c%lulas vie.as mientras que el borde de la colonia est $ormado por c%lulas .venes. Las c%lulas .venes se encuentran en tro$o$ase &$ase de alimentacin y crecimiento+ mientras que las c%lulas vie.as se encuentran en idio$ase &$ase de di$erenciacin+. 9uando observamos una colonia micelial &por e.emplo una colonia de mo"o sobre una naran.a+ el crecimiento de la colonia se produce slo por el borde de la parte mo"osa y en la parte central de la colonia se produce la di$erenciacin que dar lugar a la $ormacin de las esporas y a la aparicin del color verdoso caracterstico. Las c%lulas .venes desarrollan la mayora de la actividad metablica del "ongo liberando enzimas al medio y abosorbiendo los nutrientes. La zona central por otra parte tiene c%lulas en las que se acumulan las substancias de reserva que pueden ser necesarias para que el micelio colonice nuevas zonas pobres en nutrientes &por e.emplo cuando el mo"o de una $ruta comienza a e,tenderse por la $uente de plstico en la que se encuentra+ o cuando el "ongo se di$erencia &por e.emplo cuando produce esporas o cuerpos $ruct$eros+. El crecimiento de un "ongo como levadura o como "ongo $ilamentoso est en algunas ocasiones regulado por condiciones ambientales de $orma que un mismo "ongo puede crecer en ciertas situaciones como levadura y en otras como "ongo $ilamentoso &por e.emplo los "ongos patgenos ustilago maydis y Candida albicans+. :tro aspecto importante a tener en cuenta es que la pared celular de los "ongos &levaduras y $ilamentosos+ es di$erente de la de las bacterias y de la de las plantas. La pared celular de bacterias est $ormada por peptidoglicano mientras que la de "ongos por quitina y polisacridos &glcanos+ y la de las plantas por celulosa. 0or 2ltimo "ay que recordar que como organismos eucariticos que son los "ongos tienen su n2cleo di$erenciado en el interior de la c%lula tienen varios cromosomas la divisin celular se produce por mitosis &proceso que no ocurre en bacterias+ y la produccin de c%lulas se,uales por meiosis. La clasi$icacin de los "ongos es muy comple.a y aqu vamos a ver slo lo ms simple para poder seguir el curso. La clasi$icacin se basa en dos criterios- &1+ si las "i$as estn tabicadas &divididas en c%lulas+ o no y &/+ dentro de los "ongos con "i$as tabicadas en la organizacin de las esporas se,uales.

Los "ongos con "i$as no tabicadas se denominan Ficomicetos &esta nomenclatura y clsi$icacin repito puede encontrarse de $orma di$erente en distintos libros+. Los $icomiecots son "ongos in$eriores &en algunos casos se discute si son "ongos o no+ y viven en ambientes acuosos. )estacan los g%neros Mucor que participa en la produccin de algunos tipos de alimentos y Phytophthora alguno de cuyos miembros son patgenos vegetales &P. infestans por e.emplo+. Los "ongos superiores se pueden agrupar en tres clases o (scomicetos. En ellos las esporas se,uales &ascosporas+ se encuentran en el interior de una bolsa o asca. #on e.emplos de ascomicetos la levadura S. cerevissiae los "ongos $ilamentosos Neurospora y "ongos comestibles como las tru$as. #on el grupo de "ongos ms abundante.

<asidiomicetos. En ellos las esporas se,uales &basidiosporas+ se encuentran en el e,terior de unas estructuras com $orma de maza denominadas basidios. 0ertenecen a este grupo levaduras como el patgeno "umanoCryptococcus neoformans que produce meningitis en pacientes inmunodeprimidos el patgeno vegetal stilago maydis que produce tumores en los granos del maz "ongos superiores con cuerpos $ructi$eros comple.os &setas+ tales como el c"ampi1n &!garicus bisporus+ y la seta de c"opo &Pleurotus ostreatus+ etc. )euteromicetos. !radicionalmente se conocan como hongos imperfectos porque en ellos no se "aba podido encontrar la $orma se,ual y por consiguiente no se sabe si producen ascosporas o basidiosporas. (ctualmente y mediante el uso de t%cnicas de anlisi del ()' se "a podido determinar que la mayora de ellos pertenecen al grupo de los ascomicetos y por alguna razn "an perdido la posibilidad de realizar la reproduccin se,ual. (lguno de los "ongos ms importantes en microbiologa industrial son deuteromicetos- Penicillium productor de la penicilina !spergillus productor de cido ctrico y de lovastatina4 tambi%n se encuentran en este grupo "ongos patgenos vegetales como "richoderma y #erticillium y "ongos patgenos oportunistas animales tales como Candida albicans

/./.- 9recimiento celular En este apartado vamos a revisar el estudio de la cin%tica del crecimiento de microorganismos que crecen aislados. Esta es la $orma de crecimiento de la levadura &"ongo unicelular+ y de las bacterias. Es importante conocer la cin%tica de crecimiento de los cultivos microbianos porque es necesario poder predecir cmo va a evolucionar un cultivo cmo va a ir consumi%ndose el substrato y cmo se va a ir acumulando el producto de una $ermentacin. #in conocer estos $actores es muy imprudente iniciar el cultivo en un $ermentador de 1=.=== litros por e.emplo con el coste que ello supone puesto que no podemos predecir qu% va a pasar cundo va a completarse el crecimiento cmo se va a acumular el producto etc. Las c%lulas aisladas cultivadas en un volumen $inito de medio de cultivo apropiado van utilizando los nutrientes que tienen disponibles con la mayor e$iciencia y rapidez que pueden sintetizando sus propios componentes celulares y dividi%ndose en cuanto "an podido duplicar su masa y su material gen%tico. El tiempo que tarda una c%lula en "acer todo lo anterior es lo que conocemos como tiempo de generacin y puede variar desde unos /= minutos en condiciones ptimas "asta varios meses en condiciones del suelo.9ada vez que transcurre un tiempo de generacin el n2mero de c%lulas se duplica siguiendo por tanto un incremento e,ponencial. #i llamamos N$ al n2mero de c%lulas inicial y g al n2mero de generaciones transcurridas el n2mero de c%lulas $inal &N+ ser-

Llamando " al tiempo de generacin y t al tiempo de cultivo transcurrido la ecuacin anterior puede trans$ormarse en la siguienteLas ecuaciones e,ponenciales son muy di$ciles de mane.ar gr$icamente por ello es me.or trans$ormarlas en algo ms simple como puede ser una recta.

0ara trans$ormar las ecuaciones anteriores en una recta tomamos logaritmos en los dos t%rminos y resultaEsto es- el logaritmo del n2mero de c%lulas crece linealmente con el tiempo a razn de una constante igual a ln/>!. #i el tiempo de generacin ! es muy grande el crecimiento tendr poca pendiente &ser lento+ y si ! es peque1o el crecimiento ser rpido. En un crecimiento equilibrado todos los parmetros de crecimiento evolucionan en paralelo. Esto es- el incremento en el n2mero de c%lulas en la biomasa de cultivo y en la acumulacin de metabolitos primarios protenas cidos nucleicos etc. es paralelo. 0or tanto en la ecuacin anterior ' puede representar cualquiera de estos $actores.

:tra $orma de representar la cin%tica es considerando el incremento en el n2mero de c%lulas &dN+ en un intervalo corto de tiempo &dt+. En este caso la ecuacin que describe la cin%tica es la siguienteesto es- el incremento del n2mero de c%lulas &d'+ por unidad de tiempo &dt+ es proporcional al n2mero de c%lulas presentes en el cultivo &'+. ( la constante de proporcionalidad &?+ se le denomina tasa de crecimiento y puede considerarse algo as como la probabilidad de que una c%lula se divida en un tiempo determinado.

Integrando la ecuacin anterior durante el tiempo de cultivo se trans$orma en la siguiente $uncin e,ponencialla trans$ormacin de esta ecuacin en una recta &tomando logaritmos+ rinde lo siguiente-

esto es- el incremento del logaritmo del n2mero de c%lulas aumenta linealmente con el tiempo siendo la constante de proporcionalidad ?. 9omparando esta ecuacin con la similar presentada ms arriba podemos concluir que ? @ ln/>! y por consiguiente que ! @ ln/>?. Es decir que "ay una correlacin inversa entre el valor de la tasa de crecimiento &?+ y el tiempo de generacin. Estas ecuaciones nos permiten predecir cul ser el n2mero de c%lulas masa celular etc. despu%s de un cierto tiempo de cultivo &t+ si conocemos ?4 o bien poder calcular la tasa de crecimiento ? a partir de medidas e,perimentales del incremento en el n2mero de c%lulas biomasa etc.

El gr$ico representa la variacin de la biomasa &o n2mero de c%lulas etc.+ de un cultivo &lnea ro.a+ a lo largo del tiempo. En este cultivo se va consumiendo un substrato cuya concentracin &lnea azul+ decrece de $orma proporcional al crecimiento de la biomasa. Esta relacin de proporcionalidad puede e,presarse de la $orma siguiente-

donde d# indica la variacin de la concentracin del substrato. (l valor %s lo denominamos rendimiento de utilizacin del substrato ya que mide la cantidad de biomasa que puede producirse por unidad de substrato consumido-

El rendimiento de utilizacin de di$erentes substratos puede ser di$erente &"ay substratos o alimentos que AengordanA ms que otros+ vara entre di$erentes microorganismos &en un smil antropomr$ico- "ay personas que engordan ms que otras comiendo lo mismo+ y vara tambi%n en $uncin de otras condiciones ambientales o $isiolgicas &no engorda lo mismo uno al comer algo si est sano o en$ermo o si est

en verano o en invierno+. !ambi%n vara el rendimiento en $uncin de que el metabolismo sea o,idativo o $ermentativo &estos conceptos sern revisados ms adelante+. 0odemos calcular el rendimiento de la utilizacin del substrato en $uncin de la cantidad de substrato a1adido al cultivo o en $uncin de la cantidad de carbono presente en ese substrato &por e.emplo+. (simismo podemos calcular la cantidad de biomasa total Bgramos de c%lulas por e.emplo+ o de carbono presente en las c%lulas &apro,imadamente el 7=7 de la masa celular corresponde a carbono+.

*aciendo las trans$ormaciones que se indican a la derec"a sobre la $rmula que relaciona la variacin de biomasa con la de substrato llegamos a la de$inicin de un nuevo concepto &sdenominado tasa espec'fica de consumo de substrato por el organismo. La tasa espec$ica de consumo de substrato la podemos considerar la AvelocidadA con la que el organismo consume el substrato. Evidentemente cuanto mayor sea la tasa de consumo mayor ser la velocidad de crecimiento &?+. (simismo cuanto mayor sea el rendimiento del substrato consumido tambi%n mayor ser la tasa de crecimiento. #in embargo "ay una cierta compensacin entre la tasa de consumo del substrato y el rendimiento de $orma que los microorganismos que tienen altas tasas de consumo de substrato tienen rendimiento ms ba.os &o cuando se dan las condiciones para una alta tasa el rendimiento disminuye+. ( esta correlacin inversa se le conoce con el nombre de efecto Pasteur. 0or 2ltimo nos $alta relacionar la tasa de crecimiento &?+ con la concentracin de substrato &#+. En condiciones de substrato abundante la concentracin de este no a$ecta al valor de ?4 pero cuando el substrato se "ace limitante s e,iste ese e$ecto. La e,presin matemtica que relaciona ambos parmetros se conoce con el nombre de ecuacin de Monod y es la siguiente-

En esta ecuacin la tasa de crecimiento &?+ depende de la m,ima que puede alcanzar el microorganismo de la concentracin de substrato y de un valor Cs que representa la concentracin de

substrato a la que se alcanza una tasa de crecimiento igual a la mitad de la m,ima. La ecuacin de Monod tendr muc"a importancia al tratar de cultivos continuos. 0ara que se cumpla esta ecuacin el rendimiento debe ser independiente de la concentracin de substrato. /.5.- ;ases del crecimiento de un cultivo En este apartado vamos a revisar el estudio de la cin%tica del crecimiento de microorganismos que crecen en un cultivo realizado en un volumen $inito. a esto se le denomina cultivo batch y podramos traducirlo por cutivo discontinuo por contraposicin con el cultivo continuo que desarrollaremos ms adelante. El desarrollo de un cultivo discontinuo se a.usta al representado en la siguiente $igura-

#e pueden distinguir cuatr $ases en el cult &1+ la fase lag e la que el microorganism se adpata a las nuevas condiciones y pone en marc" maquinaria metablica par poder crecer activamente. L duracin de est $ase es variable en general es mayor cuanto m grande sea el cambio en las condiciones en que se encuent el microorganism &/+ La fase e(ponencial cu cin%tica e,plicamos en pgina anterior &5+ La fase estacionariaen

que no "ay aumento neto d microorganism lo que no signi que no se divid algunos sinio q la aparicin de nuevos individ se compensa po la muerte de ot &6+ La fase de muerte en la qu el n2mero de microorganism vivos disminuy de $orma e,ponencial co una constante ) que depende de di$erentes circunstancias. En la fase de mmuerte decimos que el n2mero de microorganismos vivos disminuye e,ponencialmente. 0ero Dqu% es un microorganismo vivo en t%rminos microbiolgicosE. 9onsideramos vivo al microorganismo que puede multipicarse &dividirse+ y muerto al que "a perdido irreversiblemente la capacidad de dividirse. Es importante entender este concepto porque los microorganismos microbiolgicamente muertos no tienen porqu% estar metablicamente inactivos.

/.6.- Medida del crecimiento microbiano 0odemos medir el crecimiento microbiano siguiendo di$erentes parmetros algunos de los cuales presentar% a continuacin. 'o debemos olvidar que en condiciones de crecimiento e&uilibrado todos los parmetros del cultivo evolucionan de $orma proporcional y por consiguiente midiendo uno de ellos &el de medida ms $cil+ podemos medir el resto. En este apartado revisaremos los principales m%todos de recuento de microorganismos. Fna in$ormacin ms compl1eta puede encontrarse en la cone,in M%todos de recuento. Los m%todos para el seguimiento de la evoluciGpon de un cultivo microbiano pueden clasi$icarse en directos e indirectos. Los m%todos directos se basan en la medida de la evolucin del n2mero de c%lulas vivas &t%cnicas de plaqueo+ o del n2mero de partculas &t%cnicas microscpicas y de contadores de partcuas+. Ls m%todos indirectos se basan en la medida de alg2n parmetro del cultivo que nos permite deducir in$ormacin sobre

la evolucin del n2mero de microorganismos. La eleccin de un m%todo de seguimiento del cultivo en concreto depende de las caractersticas del cultivo y del proceso. Entre los m%todos principales de recuento de microrganismos podemos destacar1.- Las t%cnicas de recuento microscpico de c%lulas sin $i.ar usando microscopa de contraste de $ae. 0ara ello se cuenta el n2mero de partculas en un volumen determinado usando una c%lula de 0etro$$-*auser o de 'eubauer &portaob.etos modi$icado en e que una re.illa nos permite conocer el volumen que estamos observando+. El procedimiento es rpido y sencillo4 pero no permite distinguir c%lulas vivas inmviles de c%lulas muertas. /.- 9onta.e de partculas utilizando sistemas automticos del tipo 9oulter 9ounter. La operacin de estos sistemas es sencilla &m%todo de empleo+ y permite rpidamente determinar el n2mero de patculas presentes en una suspesin y la distribucin de sus tama1os. El problema es que no distingue entree c%lulas vivas y muertas ni entre c%lulas y agregados de material insoluble presente en la suspensin del cultivo. 5.- !%cnicas de recuento en placa basadas en colocar en un medio de cultuivo adecuado un volumen determinado de muestra. 9ada una de las c%lulas aisladas dar lugar despu%s de la incubacin correspondiente a una colonia de $orma que el n2mero de estas nos permitir estimar el n2mero de c%lulas presentes en la muestra plaqueada &sembrada+. El sistema es $cil de utilizar en el caso de c%lulas aisladas &no sirve en el caso de "ongos $ilamentosos por e.emplo+. 0uede realizarse sembrando en super$icie &e,tendiendo un volumen dado de muestra sobre el medio de cultivo slido+ o en pro$undidad &mezclando un volumen dado de muestra con el medio de cultivo antes que solidi$ique+. Esta 2ltima opcin permite realizar el recuendto de microorganismos microaer$ilos que no crecen bien en la super$icie de las placas de cultivo. 0ara que el sistema de recuento en placa tenga validez estadstica es necesario contar entre 5= y 5== colonias con ob.eto de disminuir el error de la medida. 6. !%cnicas turbidom%tricas basadas en la medida de la turbidez de los medios de cultivo en los que crecen microorganismos unicelulares. La turbidez es proporcional a la masa de las partculas en suspensin &c%lulas+ y su medida nos permite estimarla. 0ara ello se utiliza un equipo similar al que se emplea en la medida de la absorbancia de luz por disoluciones coloreadas &colormetro por e.emplo+. Las medidas se "acen a una longitud de onda adecuada &normalmente en el entorno de 77= nm+ y los valores se suelen denominar valores de densidad ptica. La limitacin de este sistema por otra parte muy sencillo es que no distingue c%lulas vivas de muerta y que normalmente no es capaz de detectar densidades celulares menores a 1=.=== c%lulas por mililitro. 7.- Medida de peso seco. El sistema consiste en la $iltracin del cultivo a trav%s de una membrana que retenga las c%lulas y su posterior desecacin "asta peso constant. El sistema obviamente no dis$erencia c%lulas vivas de muertas y su sensibilidad es limitada. H.- Medida del (!0. Es una medida relativamente sencilla basada en la emisiin de luz por la luci$erasa de luci%rnaga &Photimus pyralis+ en presencia de :/ y de (!0. )e esta $orma se puede medir la concentracin de (!0 en un volumen dado de cultivo. Esta

medida es interesante porque la concentracin de (!0 decae rpidamente en las c%lulas muertas de $orma que esa medida indirecta detecta 2nicamenta las c%lulas vivas. Los sistemas de medida del crecimiento celular se "an adaptado t%cnicamente para poder ser utilizados como sistemas online. En una opracin on line no es necesario e,traer la muestra del cultivo para realizar la medida. Esto es muy importante en el caso de $ermetaciones en gran volumen porque permite realizar medidas en tiempo real y disminuye los riesgos de contaminacin. (ntes de cerrar este apartado "ay que se1alar que en la naturaleza "ay muc"simos ms microorganismos de los que podemos detectar por la mayora de los sistemas de recuento. )e "ec"o se estima que en el suelo o en el agua podemos cultivar 2nicamete proporciones menores al 1I de los microorganismos vivos. Esto es debido a varias causas entre las que se cuenta la $alta de medios de cultivo adecuado la dependencia de otros microorganismos para el cultivo debido a procesos de sintro$a y la oligotro$a &in"ibicin por altas concentraciones de nutrientes+ que muestran algunos microorganismos. /.7.- ;actores ambientales que a$ectan al crecimiento de microorganismos Fna vez visto cmo podemos seguir la evolucin de un cultivo vamos a recordar que en un proceso de crecimiento equilibrado todos los parmetros del cultivo evolucionan manteniendo unas proporciones constantes. 0or tanto la medida &seguimiento+ de cualquiera de los $actores nos permite seguir la evolucin de los otros. DJu% $actores ambientales in$luyen en el crecimiento microbianoE. ( continuacin vamos a revisar los que son estrictamente ambientales y ms adelante revisaremos los relacionados con los nutrientes del cultivo. Entre los $actores ambinetales destacan los siguientes"emperatura 9ada microorganismo tiene una temperatura de crecimiento adecuada. #i consideramos la variacin de la velocidad de crecimiento &+ en $uncin de la temperatura de cultivo podemos observar una temperatura mnima por deba.o de la cual no "ay crecimiento &d*+dt , =+4 a temperaturas mayores se produce un incremento lineal de la velocidad de crecimiento con la temperatura de cultivo "asta que se alcanza la temperatura ptima a la que es m,ima &para las condiciones de concentracin de substrato en que se traba.a ver la discusin anterior al respecto+. 0or encima de esta temperatura ptima la velocidad de crecimiento decae bruscamente &? =+ y se produce la muerte celular. El incremento de ? con la temperatura se debe al incremeto generalizado de la velocidad de las reacciones enzimticas con la temperatura. #e denomina coeficiente de temperatura a la relacin entre el incremento de la velocidad de reaccin y el de tempertaura. En t%rminos generales la velocidad de las reacciones bioquicas suele aumentar entre 1.7 y /.7 veces al aumentar 1=K9 la temperatura a la que tienen lugar. La ausencia de crecimiento &?@=+ a temperaturas muy ba.as se debe a la reduccin de la velocidad de crecimeinto y al cambio de estado de los lpidos de la membrana celular que pasan de ser $luidos a cristalinos &algo parecido a la precipitacin del aceite a ba.as

temperaturas+ impidiendo el $uncionamiento de la membrana celular. La muerte celular a altas temperaturas se debe a la desnaturalizacin de protenas y a las alteraciones producidas en las membranas lipdicas a esas temperaturas. Es importante tener en cuenta que a temperaturas muy ba.as el metabolismo celular es muy ba.o y las c%lulas paran de crecer4 aunque no tienen porqu% comenzar a morir. #in embargo cuando la temperatura es superior a la ptima se produce la muerte celular rpidamente &como veremos ms adelante+ y las c%lulas no pueden recuperar su capacidad de divisin si ba.a posteriormente la temperatura. Esto permite esterilizar por calor y no por $ro. *ay varios tipos de microorganismos en $uncin de sus temperaturas de crecimiento mnima m,ima y ptima. !ipode !emp. !emp. !emp. microorganismo mnima ptima m,ima 0sicr$ilo 0sicrtro$o Mes$ilo !erm$ilo -7 L7 1/ - 17 17 - /= -7 L7 /7 - 5= 5= - 57 7 - 17 5= - 67 57 - 6M 6= - 67 77 - M7 H= - N=

(dems de los indicados e,isten organismos "iperterm$ilos que pueden crecer a temperaturas ceracnas o incluso superiores a 1==K9 en condiciones de alta presin. #on miroorganismos muy importantes desde el punto de vista ambiental4 pero no teienen aplicaciones actuales en agronoma o en microbiologa industrial. Los microorganismos psicrtro$os son mes$ilos que pueden crecer a temperaturas ba.as. Esto es importante desde el punto de vista aplicado porque cuando se encuentran contaminando alimentos son capaces de crcer en condiciones de re$rigeracin &6 - BK9+ y de producir in$ecciones en los consumidores del alimento &5= - 57 K9+. Los microorganismos deben ser cultivados a la temperatura adecuada para que su crecimiento sea el desaeado. En cualquier caso "ay que tener en cuenta los problemas derivados de las altas temperaturas y controlar la de los $erementadores para evitar la esterilizacin de los cultivos. Estas altas temperaturas por otro lado tienen inter%s aplicado en el campo de la termodestruccin de microorganismos y en algunos procesos de $ermentacin en los que el incremeto de temperatura que se produce es capaz de eliminar los microorganisos mes$ilos patgenos presentes. -mportancia de los microorganismos de ambientes e(tremos La mayor parte de los microorganismos de importancia aplicada tanto en microbiologa industrial como alimetaria son mes$ilos psicr$ilos o psicrtro$os. En los procesos de composta.e el papel de los term$ilos es importante y tambi%n "ay que conisderar la presencia de esporas termorresistentes en el estudio de los tratamientos t%rmicos de termodestruccin de microorganismos en alimentos.

#in embargo es creciente el n2mero de productos que se producen partiendo de microorganismos term$ilos porque producen protenas termorresistentes que tienen gran utilidad en procesos aplicados. Juiz el me.or e.emplo de esto es la ()' polimerasa "a& obtenida a partir de la eubacteria term$ila "hermus a&uaticus. Esta enzima permite sintetizar in vitro ()' a alata temperatura lo que "a sido esencial para el desarrollo de la tecnologa de la reaccin en cadena de la polimerasa &conocida por sus iniciales en ingl%s- 09O+ lo cual "a supuesto un avance en la biologa molecular el diagnstico y la deteccin de microorganismos en los ambientes ms variados. /.7.1. (plicacin de la temperatura en la termodestruccin de microorganismos Fn aspecto aplicado muy importante de la temperatura es su utilizacin para la esterilizacin por calor. Es necesario esterilizar ciertos ambientes o instrumentos o eliminar de ellos una parte muy importante de su carga microbiana. Esto se puede "acer con $acilidad y de $orma controlada mediante tratamientos t%rminos. En esta seccin veremos cmo se puede predecir cmno ser la evolucin de las poblaciones microbianas como consecuencia de su e,posicin a latas temperaturas. *abamos visto en su momento que durante la $ase de muerte la desaparicin de microorganismos segua la cin%tica descrita en la ecuacin siguiente-

esto es- la $ase de muerte tambi%n sigue una cin%tica e,ponencial y puede ser sometida a un tratamiento matemtico similar al usado para el tratamiento matemtico del crecimiento. #i representamos la variacin del logaritmo del n2mero de c%lulas supervivientes a un tratamiento t%rmico realizado a una temperatura dada en $uncin del tiempo de tratamiento se obtiene una gr$ica como la siguiente-

el descenso del logaritmo de supervivientes es lineal con el tiempo. La recta tiene una pendiente que permite calcular la velocidad de termodestruccin. #e de$ine el valor . como el tiempo necesario para que el n2mero de supervivientes caiga al 1=I del valor inicial &o lo que es lo mismo lara que el logaritmo del n2mero de supervivientes se reduzca en una unidad+. #i consideramos '= como el n2mero de c%lulas al inicio del tratamiento y ', el n2mero de c%lulas supervivientes despu%s de un tratamiento de ( minutos a una tempertatura t el tiempo de termodestruccin se calcula de la siguiente manera-

Las unidades del . son minutos.El tiempo de termodestruccin &.+ vara para cada temperatura &de a" el subndice t+ de $orma que a mayores temperaturas el valor de . es menor es di$erente para distintos microorganismos distintos entornos y di$erentes condiciones $isiolgicas. #i aumentamos la temperatura de tratamiento el valor de . disminuye de $orma logartmica tal y como se indica en la siguiente gr$ica-

)e manera anloga a como el valor . indicaba el tiempo necesario para lograr que el n2mero de supervivientes se redu.era al 1=I de la poblacin inicial el valor / indica el incremento en la temperatura &medida en n2mero de grados+ necesario para que el valor . se reduzca a la d%cima parte del inicial. La $rmulaincluida en la gr$ica permite calcular el valor / cuando conocemos el incremeto de temperatura &t/-t1+ y los respectivos valores .. Los valores d y / varan para cada microorganismo y para cada condicin. Las esporas por e.emplo tienen valores . muc"o ms altos que las c%lulas vegetaticas de los mismos microorganismos. Los microorganismos presentes en los alimentos por otra parte suelen tener valores . ms altos que cuando se cultivan en condiciones de laboratorio. 0ara poder determinar las condiciones en las que "acer un tratamiento

t%rmico para destruir microorganismos es necesario dominar los conceptos de los valores . y / &ver problemas+. :tro valor que tiene gran importancia aplicada en el estudio de la microbiologa de la termodestruccin es el parmetro F que corresponde al tiempo equivalente &medido en minutos de tratamiento a /7=K; o 1/1.1K9+ a todo el calor recibido considerando su capacidad de destruir microorganismos. (l valor de la integral del calor recibido se la denomina F$. 9uando consideramos que el calentamiento es un proceso instantneo se puede calcular usando la siguiente $rmula-

Es muy importante saber traba.ar correctamente con los conceptos anteriores. 0ara e.ercitarse "ay una coleccin de problemas en este enlace. :tros tratamientos tecnolgicos para destrucir microorganismos &radiacin por e.emplo+ son susceptibles de tratamientos matemticos similares a los descritos en esta seccin. /.7./. 9onsideraciones sobre las ba.as temperaturas Los microorganismos se comportan a ba.as temperaturas de $orma di$erente seg2n se trate de condiciones de re$irgeracin &=K9-BK9+ o de congelaciG=on &por deba.o de -/=K9+. En condiciones de re$rigeracin los microorganismos mes$ilos y term$ilos detienen su crecimiento &?@=+ y se mantienen durante largo tiempo sin morir. Los psicr$ilos y psicrtro$os pueden crecer en estas condiciones y llegar a producir poblaciones importantes &esta es una causa de deterioro de alimentos coinservados en re$rigeracin+. En conmdiciones de congelacin la $ormacin de cristales en el interior de las c%lulas produce unas altas mortalidades que reducen el tama1o de la poblacin. En el momento de la congelacin se produce la muerte rpida de muc"os microorganismos y a tiempos ms largos la tasa de muerte se reduce aunque el n2mero de viables sigue disminuyendo. En esta segunda $ase la mortalidad es ms rpida cuando la temperatura de congelacin es ms alta &ms pr,ima a valores de -/=K9+ qPue cuando es menor &valores de -B=K9+. La tolerancia a la congelacin de di$erentes microorganismos puede variar. 'o se puede considerar la congelacin un procedimiento de esterilizacin sinoi slo &en el caso de microbiologa de alimentos+ un procedimiento de conservacin. #e pueden conservar largo tiempo cultivos de microorganismos o de c%lulas eucariticas congelados en medios que contengan agentes crioprotectores como el glicerol. /.H. (ctividad de agua

#e denomina actividad de agua a la relacin entre la presin de vapor de agua del suubstrato de cultivo &0+ y la presin de vapor de agua del agua pura &0=+-

El valor de la actividad de agua nos da una idea de la cantidad de agua disponible metablicamente. 0or e.emplo- comparemos el agua pura donde todas las mol%culas de agua estn libremente disponibles para reacciones qumicas con el agua presente en una disolucin salurada de sal com2n &'a9l+ donde una parte importante de las mol%culas de agua participa en la solvatacin de los iones de la sal disuelta. En este 2ltimo caso la actividad de agua muc"o menor que en el primero. con$orme aumenta la cantidad de solutos en el medio disminuye su actividad de agua. El valor de la actividad de agua est relacionado con el de la "umedad relativa &*O+ de la siguiente $orma-

9uando un microorganismo se encuentra en un substrato con una actividad de agua menor que la que necesita su crecimiento se detiene. Esta detencin del crecimiento no suele llevar asociada la muerte del microorganismo sino que %ste se mantiene en condiciones de resistencia durante un tiempo ms o menos largo. En el caso de las esporas la $ase de resistencia puede ser considerada prcticamente ilimitada. La gran mayora de los microorganismos requiere unos valores de actividad e agua muy altos para poder crecer. )e "ec"o los valores mnimos de actividad para di$erentes tipos de microorganismos son a ttulo orientativo los siguientes- bacterias awQ=.N= levaduras awQ=.B7 "ongos $ilamentosos awQ=.B=. como puede verse los "ongos $ilamentosos son capaces de crecer en substratos con una actividad de agua muc"o menor &muco ms secos+ de la que permite el crecimiento de bacterias o de levaduras. 0or esta razn se puede producior deterioro de alimentos de ba.a actividad de agua &por e.emplo el queso o almbares+ por mo"os &"ongos $ilamentosos+ y no por bacterias. E,isten microorganismos e,tremadamente tolerantes a las actividades muy ba.as &toleran valores de aw@=.H=+. (lgunos de estos microorganismos pertenecen al grupo de las !r&ueas y pueden observarse en las salinas de desecacin $ormando manc"as coloreadas en los depsitos de sal. La reduccin de la actividad de agua para limitar el crecimiento bacteriano tiene importancia aplicada en industria alimentaria. La utilizacin de almbares salmueras y salazones reduce la actividad de agua del alimento para evitar su deterioro bacteriano. /.M. p* Es un parmetro crtico en el cultivo de microorganismos ya que estos slo pueden crecer en un rango estrec"o de p* $uera del cual mueren rpidamente. El p*

intracelular es ligeramente superior al del medio que rodea las c%lulas ya que en muc"os casos la obtencin de energa metablica depende de la e,istencia de una di$erencia en la concentracin de protones a ambos lados de la membrana citoplsmica.

9ada tipo de microorganismo tiene un rango de p* en el que puede vivir adecuadamente $uera de este rango muere. Los rangos de p* tolerables por di$erentes tipos de microorganismos son tambi%n distintos. *ay microorganismos acid$ilos que pueden vivir a p*@1.= y otros alcal$iclos que toleran p*@1=.= El p* interno en la mayora de los microorganismo est en el rango de H.= a M.=.

*ay que considerar que como consecuencia del metabolismo el p* del medio de cultivo suele tender a ba.ar durante el cultivo. 0or consiguiente es necesario controlar el p* de los cultivos industriales para evitar que un descenso e,cesivo pueda producir la autoesterilizacin del cultivo. 0or otra parte la ba.ada del p* del medio que producen ciertos microorganismos les con$iere una venta.a selectiva $rente a otros microorganismos competidores. (s por e.emplo las bacterias lcticas que producen grandes cantidades de cido lctico como consecuencia de su metabolismo primario reducen el p* del medio de cultivo a valores in$eriores a los soportables por otras bacterias competidoras &llegan a ba.ar el p* del medio "asta 6.7+. )e esta $orma las bacterias competidoras mueren y las lcticas se convierten en la poblacin dominante. La ba.ada del p* se puede deber a varios $actores uno de los cuales es la liberacin de cidos orgnicos de cadena corta &$rmico ac%tico lctico+ por ciertas bacterias. En este sentido "ay que tener en cuenta que la accin bactericida de estos cidos orgnicos de cadena corta es ms potente que la debida 2nicamente a la ba.ada del p* que producen. Esto es los cidos orgnicos de cadena corta son t,icos para algunas bacterias por s mismos. En resumen es necesario controlar el p* de los cultivos y de las $ermentaciones industriales para que se mantenga en los niveles adecuados para el crecimiento y metaboismo correcto del microorganismo con el que se traba.a. 0or otro lado el e$ecto letal del p* cido sobre los microorganismos tiene aplicacin en la conservacin de lalimentos acidi$icndolos. )e esta $orma la adicin de cido ac%tico en $orma de vinagre permite la conservacin de alimentos perecederos &escabec"es por e.emplo+ y la produccin de cidos en el curso de $ermentaciones naturales permite alargar la vida de los alimentos &coles $ermentadas por e.emplo+. /.M. 0otencial redo, concentracin de o,geno Este es otro $actor determinante del crecimiento y del metabolismo del cultivo. El potencial redo, del medio de cultivo nos indica su capacidad para aceptar o donar electrones esto es- sus caractersticas o,idantes o reductoras. Fno de los $actores que intervienen en el potencial redo, aunque no el 2nico es la concentracin de o,geno R:/S.

*ay microorganismos que requieren ambientes o,idantes para crecer mientras que otros necesitan ambientes reductores. El metabolismo de ambos tipos de microorganismos presenta di$erencias notables como veremos ms adelante. El requerimiento de condiciones o,idantes o reductoras no debe con$undirse con la necesidad de presencia o ausencia de o,geno para que se produzca el crecimiento.

En general cuando un microorganismo requiere un ambiente o,idante se dice que desarrolla un metabolismo oxidativo &o respirativo+ mientras que los microorganismos que requieren ambientes reductores &o menos o,idantes+ realizan un metabolismo fermentativo. Fn microorganismo es aerobio cuando necesita o,geno para vivir y es anaerobio cuando o bien no lo necesita &anaerobios $acultativos como las bacterias ent%ricas o como Saccharomyces cerevisiae4 o anaerobios aerotolerantes como las bacterias lcticas+ o cuando muere en presencia de o,geno &anaerobios estrictos como los clostridios+. *ay microorganismos que viven en ambientes carentes de o,geno &anaerobios+ que sin embargo llevan a cabo un metabolismo o,idativo porque usan otro aceptor $inal de electrones que act2a como o,idante ambiental. 0or e.emplo las bacterias que ArespiranA nitratos &':5-+ sul$atos &#:6/-+ u otros compuestos orgnicos o,idados. *ay microorganismos que aunque viven en presencia de o,geno no son capaces de utilizarlo como aceptor $inal de electrones y deben desarrollar un metabolismo $ermentativo &las bacterias lcticas por e.emplo+. 0or otra parte "ay microorganismos que pueden desarrollar ambos tipos de metabolismo. Esto es- en presencia de o,geno desarrollan un metabolismo o,idativo y en su ausencia $ermentativo. El rendimiento &Ts+ de los procesos $ermentativos es menor que el de los respirativos- las bacterias y las levaduras producen menos biomasa cuando crecen $ermentando que cuando lo "acen respirando.

La levadura Saccharomyces cerevisiae desarrolla ambos tipos de metabolismo4 pero slo produce etanol en condiciones de crecimiento anaerobio &$ermentativo+. 0or consiguiente y en general al preparar un cultivo industrial debemos saber &1+ en qu% condiciones metablicas se produce lo que nos interesa $abricar y &/+ controlar la $ermentacin industrial para que se produzca en esas condiciones deseadas. En el curso de ciertas reacciones metablicas redo, se $orman compuestos altamente reactivos &radicales libres $ormas super,ido+ que pueden da1ar las protenas membranas y cidos nucleicos produciendo la muerte de las c%lulas. Estas $ormas reactivas son un subproducto del metabolismo respirativo &algo as como el precio que "ay que pagar por ser ms e$icientes y tener un Ts mayor.Las c%lulas se de$ienden de estos compuestos reactivos mediante las enzimas siguientes-

los organismos aerobios tienen #:) y muc"os de ellos catalasa. Los anaerobios estrictos carecen de #:) y de catalasa o tienen niveles muy ba.os de estas enzimas de $orma que no pueden sobrevivir en presencia de o,geno. /.M. Oadiacin Las radiaciones ultravioleta &uv+ Oayos U y radiacin producen e$ectos esterilizantes &destruccin de microorganismos+ al alterar las protenas membranas cidos nucleicos y al generar radicales libres del tipo :* y *. El tratamiento matemtico de la destruccin de microorganismos por estos procedimientos es similar al descrito para el uso de altas temperaturas. *ay que considerar sin embargo los poderes de penetracin de los di$erentes tipos de radiacin. (s por e.emplo la radiacin uv tiene un poder de penetracin muy ba.o y por consiguiente se utiliza para esterilizar super$icies mientras que la radiacin U o la tiene poderes de penetracin muc"o mayores. La resistencia de di$erentes tipos de microorganismos a las radiaciones varan. Las esporas bacterianas las bacterias levaduras "ongos $ilamentosos y otras c%lulas eucariticas son progresivamente ms sensibles a las radiaciones. *ay algunos microorganismos especialmente resistentes a las radiaciones entre ellos destaca .einococcus radiodurans. /.B. 0resin "idrosttica Las altas presiones in"iben el crecimiento de los microorganismos. Esto limita la altura de los $ermentadores que se pueden utilizar sin que las altas presiones "idrostticas del $ondo in"iban el crecimiento. La altura de los $ermentadores por tanto se suele limitar a un m,imo de 16.7m &lo que genera una presin de 1.7 atm+. La razn por la que las altas presiones in"iben el crecimiento no est clara aunque se "a visto que se detiene la sntesis de protenas y los procesos catablicos. !ambi%n en este caso "ay una gran variabilidad en la tolerancia de los microorganismos s las altas presiones. En este sentido "ay que se1alar a los microorganismos bar$ilos que "an sido aislados de $osas ocenicas y que crecen sometidos a presiones e,traordinariamente elevadas. )esde el punto de vista aplicado y a parte de la consideracin "ec"a sobre el tama1o de los $ermentadores el e$ecto de la presin sobre el crecimiento de los microorganismos tiene importancia en el desarrollo de sistemas de eliminacin de microorganismos en alimentos mediante altas presiones y en la consideracin de los microorganismos que participan en procesos en los que aumenta la presin tales como la $abricacin de vinos espumosos.