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REPLICACIN DEL ADN

INTRODUCCIN La unidad bsica de informacin en los seres vivos es el gen, definido en clulas eucariotas como un segmento de ADN que lleva la informacin necesaria para la sntesis de una protena o de un ARN. La cantidad, tamao y distribucin de los genes vara segn la especie analizada. En el hombre, el nmero de genes que codifican protenas se calcula que es tan slo el 3 % del ADN; siendo el resto, secuencias reguladoras y estructurales. La comprensin de los mecanismos de almacenamiento y de las formas de utilizacin de la informacin ha servido para poder aclarar muchas de las incgnitas planteadas sobre la estructura y la funcin celular. La clula realiza esta actividad a travs de las rutas de la informacin gentica; estas vas constituyen el principio fundamental de la gentica molecular. Son tres procesos denominados: a) Replicacin o copia del ADN paterno para formar molculas de ADN hijas idnticas a su progenitor, e idnticas entre s. b) Transcripcin o copia de la informacin de una parte del ADN a molculas de ARN. c) Traduccin o copia de la informacin gentica del ARN a la secuencia aminoacdica especfica de una protena.

REPLICACIN DEL ADN Las propiedades de la replicacin son bsicamente iguales en todos los seres vivos, y siendo as que la mayora de los estudios se han realizado en Escherichia coli, se describir el proceso a nivel del organismo bacteriano; y a continuacin, se indicarn algunas caractersticas propias de organismos eucariotas.

Principales caractersticas de la replicacin 1) La replicacin es un proceso semiconservador. Cada cadena de la molcula de ADN parental acta de molde para la sntesis de una nueva cadena producindose dos nuevas molculas de ADN, cada molcula nueva posee una cadena vieja y una nueva.

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!"#$#%&"'()*%+,'"-%.%&/'0/%!*#,%1*'("2/%3*'2"% 2) La replicacin comienza en un punto del ADN.

Las dos cadenas de ADN se replican al mismo tiempo y comienzan en un punto denominado origen. En dicho punto el ADN parental se desenrolla y forma una estructura de lazo cuyos extremos se denominan horquillas de replicacin. En el caso del cromosoma circular bacteriano, el punto inicial de la replicacin es un gen denominado oriC. 3) La replicacin es bidireccional. Comenzada en un punto de la molcula de ADN el proceso se desarrolla hacia los dos extremos de la cadena; en cada lazo, los extremos u horquillas de replicacin avanzan en el proceso de sntesis hasta completar la copia. 4) La sntesis de ADN se desarrolla en direccin 5' ! 3'. La direccin en que actan las enzimas es fija y nica de 5' a 3'. Esto determina que la cadena molde ha de tener la direccin 3'!5', para que la nueva cadena en formacin, complementaria y antiparalela tenga la direccin 5' !3' coincidente con el sistema de trabajo de la enzima. Al ser la horquilla de replicacin bidireccional, el sistema descrito implicara que la otra cadena parental 5'!3' debera estar siendo copiada en direccin 3'!5', situacin imposible debido a la limitacin de las enzimas sintticas. Este problema es obviado debido a que, 5) La sntesis de ADN es semidiscontinua.

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!"#$#%&"'()*%+,'"-%.%&/'0/%!*#,%1*'("2/%3*'2"% En una cadena, la inicialmente comentada en el punto anterior, la replicacin es continua y en la segunda la sntesis es discontinua. Esta solucin fue descrita por Reiji Okazaki quien encontr que en el procedimiento de copia de las dos cadenas del ADN parental, se formaba una cadena nueva continua (tambin denominada conductora) en la que la sntesis se desarrolla en la misma direccin de la enzima o de la horquilla de replicacin; mientras que la otra cadena nueva era discontinua (tambin denominada cadena rezagada o retrasada) ya que su sntesis se realizaba en contra de la direccin de la horquilla mediante fragmentos, los fragmentos de Okazaki, secuencias formadas por unos centenares o miles de nucletidos dependiendo de la clula.

ENZIMAS QUE PARTICIPAN EN LA REPLICACIN ADN polimerasas La reaccin bsica que tiene lugar en la replicacin es una reaccin de polimerizacin, de formacin de un enlace fosfodister entre nucletidos. En una cadena de ADN en crecimiento se incorpora un nucletido cuya base es la complementaria a la de la cadena molde. Los nucletidos que se incorporan han de hacerlo en su forma activada o uncletido trifosfatados (dNTP). La reaccin que tiene lugar es la siguiente: ADN
(n nucletidos)

+ dNTP ! ADN

(n+1 nucletidos)

+ PPi

La reaccin de polimerizacin es termodinmicamente favorable por la hidrlisis del pirofosfato; pero no slo por el desdoblamiento del pirofosfato, sino tambin por las interacciones no covalentes que se establecen entre las bases. Esta reaccin es catalizada por varias enzimas, las ADNpolimerasas, cada una con un tipo de actividad muy especfica pero con una serie de requisitos de funcionamiento comunes, que son: 1) Necesitan una cadena de ADN molde, el proceso de replicacin es dirigido por la cadena de ADN molde, y sigue el principio de complementariedad de bases fijando el nucletido que debe incorporarse a la cadena en formacin segn tal regla.

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!"#$#%&"'()*%+,'"-%.%&/'0/%!*#,%1*'("2/%3*'2"% 2) Necesitan un cebador, la polimerizacin que realizan estas enzimas requiere que exista una cadena previa inicial (cebador) ya que son incapaces de coger sobre su centro activo dos nucletidos individuales y comenzar la sntesis. Uno de los sustratos necesarios de la reaccin es, por tanto, una cadena preexistente, y ninguna de estas enzimas es capaz de iniciar la sntesis de una cadena nueva desde su primer nucletido. 3) Su direccin de sntesis es fija de 5'! 3', esto significa que adicionan nucletidos a la cadena siempre por un extremo fijo, el extremo 3'. O bien, que de los dos extremos del nucletido libre que se va a incorporar, utilizan su grupo fosfato o extremo 5' para aadirlo a la cadena en crecimiento. 4) La velocidad con que adicionan nucletidos, o procesividad, se mide como el nmero de nucletidos incorporados en la unidad de tiempo y es una caracterstica propia de cada polimerasa. Una cualidad de todas las ADN-polimerasas es la precisin con que realizan la replicacin, estimndose en Escherichia coli que se comete un error en uno de cada 109 a 1010 nucletidos, lo cual en el cromosoma de Escherichia coli supone un error cada 1.000 a 10.000 replicaciones. Estos errores son corregidos por las mismas polimerasas mediante una actividad enzimtica independiente, la actividad exonucleasa 3'!5'; esta actividad les permite eliminar el ltimo nucletido incorporado si ste es errneo, para a continuacin, seguir con la polimerizacin. Esta capacidad de correccin, mediante la discriminacin entre bases correctas e incorrectas, mejora la precisin de la replicacin. Si se aade el hecho de que, adems, existen otros sistemas de correccin que actan despus de acabada la replicacin, puede observarse la fidelidad y garanta del proceso. Existen tres polimerasas denominadas ADN polimerasa I (la primera que se describi), ADN polimerasa II y ADN polimerasa III. Si se comparan algunas caractersticas diferenciales entre ellas, se puede observar que la ADN polimerasa III es la ms compleja. Est formada por diez subunidades diferentes y tiene una capacidad de polimerizacin infinitamente superior a cualquiera de las otras dos, siendo, por tanto, la principal enzima de la replicacin. La ADN polimerasa I es importante por su tarea de correccin, capaz de realizarla tanto en la direccin descrita como en la direccin contraria, debido a que posee la actividad exonucleasa 5'!3', careciendo de la misma el resto de polimerasas.

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!"#$#%&"'()*%+,'"-%.%&/'0/%!*#,%1*'("2/%3*'2"% Otros enzimas que participan en el proceso de replicacin Para la replicacin se necesitan, aparte de las ADN polimerasas descritas, alrededor de 20 protenas diferentes, el conjunto de las mismas se denomina sistema ADN replicasa o replisoma ya que aunque no formen una unidad fsica, constituyen una unidad funcional. Dentro de las enzimas que participan estn: 1) Helicasas, enzimas que separan las dos cadenas de la molcula de ADN parental. Desplazndose a lo largo de la molcula de ADN eliminan los enlaces entre las cadenas consumiendo en el proceso ATP. 2) Topoisomerasas, enzimas que desenrollan el ADN y lo relajan. Existen cuatro topoisomerasas (I a IV) que actan eliminando superenrollamientos negativos; o bien inducindolos, dependiendo del grado de plegamiento que tenga el ADN en su estado natural. 3) Protenas fijadoras de ADN, protenas que estabilizan las cadenas separadas unindose a ellas. 4) Primasas, enzimas que sintetizan el cebador, ste suele ser un corto fragmento de ARN, necesario para que pueda comenzar la ADN polimerasa III, y que posteriormente ser eliminado y sustituido por un fragmento de ADN por la ADN polimerasa I. 5) ADN ligasas, enzimas que se encargan de unir trozos formados de cadenas, realizando un enlace fosfodister entre los nucletidos pertenecientes a dos segmentos de una cadena. Todas estas enzimas participan en el proceso de la replicacin de forma coordinada, permitiendo que se desarrolle de una manera secuencial y organizada.

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!"#$#%&"'()*%+,'"-%.%&/'0/%!*#,%1*'("2/%3*'2"% FASES DE LA REPLICACIN Se pueden distinguir tres fases segn las enzimas que participan en las mismas: 1. Fase de inicio El origen de la replicacin es una porcin de ADN que contiene una secuencia caracterstica de bases. Este segmento es reconocido por una protena denominada ADN-A. 2. Fase de elongacin La elongacin consiste en la formacin del cebador y la sntesis de la cadena de ADN. El proceso se caracteriza por no desarrollarse de forma idntica en ambas hebras. La sntesis en la cadena conductora o continua requiere nicamente que acte la primasa formando un cebador de ARN de unos 10 a 60 nucletidos, para a continuacin penetrar la ADN polimerasa III y realizar la polimerizacin de desoxirribonucletidos. En la cadena retrasada se forma un conjunto proteico en el que se localizan siete protenas distintas adems de la primasa (primosoma). Este grupo se desplaza a lo largo del molde de la hebra retrasada en direccin 5' !3' sintetizando a intervalos un corto cebador de ARN, al que se unir ADN formado por la ADN polimerasa III. El hecho de que las direcciones de trabajo de la primasa y la polimerasa sean contrarias a la direccin de crecimiento de la hebra, y de que el proceso sea uniforme en ambas hebras, viene justificado por el hecho de que la ADN polimerasa III es una protena dimrica. Esta enzima obliga a la cadena molde de la hebra retrasada a formar un bucle sobre la misma. De esta forma, la direccin de sntesis es la misma en ambas hebras. Al ir desarrollndose la polimerizacin el bucle aumenta hasta contactar con el fragmento de Okazaki previo, forzando a la polimerasa a separarse o disociarse y a recomenzar de nuevo el proceso dnde se ha formado el nuevo cebador y ella crear el nuevo bucle. En una fase posterior se eliminan los segmentos de ARN cebador, por accin de la actividad exonucleasa 5'!3' de la ADN polimerasa I, quien tambin se encarga de rellenar los trozos ocupados por el cebador. Por ltimo, la ADN ligasa une los segmentos catalizando la formacin de un enlace fosfodister. 3. Fase de terminacin En el caso de Escherichia coli con un cromosoma circular, las dos horquillas de la replicacin se encuentran en el extremo contrario al origen terminando as la replicacin y necesitando, nicamente, la presencia de una topoisomerasa para la separacin de las dos molculas.

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!"#$#%&"'()*%+,'"-%.%&/'0/%!*#,%1*'("2/%3*'2"% REPLICACIN EN CLULAS EUCARIOTAS Las molculas de ADN en clulas eucariotas son mucho mayores y ms complejas ya que el proceso de la replicacin es bastante ms complicado. Los orgenes de la replicacin son secuencias mayores, en levaduras de unos 400 pares de bases, que se presentan en varios puntos de los cromosomas. La velocidad de desplazamiento de la horquilla de replicacin es de unos 50 nucletidos por segundo, una velocidad relativamente baja si se compara con la de los procariotas (10 veces mayor). Para incrementar la velocidad global del proceso, en eucariotas existen varios puntos de origen sobre la misma molcula de ADN, estando separados entre 30.000 y 300.000 pares de bases. La presencia de mltiples horquillas de replicacin acelera el proceso, y permite que la replicacin en eucariotas se desarrolle a velocidades mayores que en los procariotas. Los fragmentos de Okazaki en el ADN eucariota son ms cortos, generalmente contienen 135 nucletidos, debido a que la horquilla de replicacin se mueve ms despacio. Tambin se han descrito diferencias respecto a las ADN polimerasas en eucariotas, la ADN polimerasa ! es una protena oligomrica, en la que una de sus subunidades tiene accin primasa. Por ltimo, el ADN eucariota est unido a las histonas y empaquetado en los nucleosomas. El proceso de replicacin ha de ir acompaado por el proceso de sntesis de histonas, ya que en cada ciclo de replicacin no slo se ha de duplicar el ADN sino tambin las histonas. Las enzimas que desarrollan ambos procesos son distintas pero han de ir coordinadas, ya que la velocidad debe ser igual. Las histonas recin sintetizadas se incorporan a la molcula de ADN que lleva la hebra retrasada, mientras que las viejas histonas permanecen en el dplex que lleva la hebra conductora.

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!"#$#%&"'()*%+,'"-%.%&/'0/%!*#,%1*'("2/%3*'2"% MECANISMOS DE REPARACIN DEL ADN El mantenimiento de la informacin codificada en el ADN es absolutamente imprescindible para la clula, ya que stas son molculas insustituibles. Una alteracin en la molcula de ADN produce un cambio en la secuencia de bases, que en el caso de que la molcula se replique se transmite a las generaciones futuras. Los cambios permanentes se denominan mutaciones. Si la mutacin se produce sobre ADN que no es relevante, o bien tiene un efecto pequeo sobre un gen, la mutacin se denomina silenciosa, por carecer de efectos aparentes. Si la mutacin es favorable aporta ventajas adaptativas a las clulas o al organismo que la desarrolla, y si bien estas mutaciones son raras, por lo estables que son las molculas de ADN y por los mecanismos de reparacin existentes, su existencia ha permitido la variacin necesaria para el desarrollo de la evolucin de las especies. Sin embargo, la mayora de las mutaciones son deletreas para la clula, y en los mamferos est comprobada una estrecha correlacin entre la acumulacin de mutaciones y el cncer. A lo largo de tan solo un da se acumulan gran cantidad de lesiones sobre el genoma celular; se estima que cada veinticuatro horas se pierden alrededor de 5000 bases pricas por destruccin de sus enlaces glicosdicos con la desoxirribosa. Sin embargo, gracias a los mecanismos de reparacin, estas lesiones son eliminadas prcticamente en su totalidad, las que no lo son se convierten en mutaciones. Existen varios tipos de mutaciones, clasificadas segn el tipo de cambio que se produce sobre la molcula de ADN: 1) Sustitucin de una base por otra: a) Transicin si el cambio es de una base por otra del mismo grupo, base prica por base prica o pirimidnica por pirimidnica. b) Transversin, si el cambio es de base prica a pirimidnica, o a la inversa. 2) Insercin de un par de bases, o adicin de nucletidos. 3) Deleccin de un par de bases o eliminacin de nucletidos.

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!"#$#%&"'()*%+,'"-%.%&/'0/%!*#,%1*'("2/%3*'2"% La reparacin del ADN es posible debido a la existencia de hebras dobles que funcionan como moldes ya que en caso de que una de ellas sufra algn tipo de lesin, puede eliminarse y sustituirse por una correcta, utilizando la informacin de la hebra complementaria. a) Reparacin de apareamientos incorrectos. b) Reparacin por corte de base. c) Reparacin de grandes lesiones.

d) Reparacin directa. e) Reparacin por rcombinacin.

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